CN102031261B - 一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用。该标志物为miR-132、miR-29a和miR-222的组合。该标志物及其引物可用于制备诊断试剂盒，用于妊娠期糖尿病的辅助早期诊断。

Description

一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用

发明领域

本发明属于基因工程及生殖医学领域，涉及一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用。

背景技术

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期发生或首次发现的不同程度的葡萄糖耐量异常，若发生在妊娠早期不排除葡萄糖耐量异常在妊娠前就已经存在的可能性。GDM是最常见的妊娠期合并症之一，约有3％-8％的孕妇在妊娠期间出现GDM，尤为值得关注的是，随着育龄妇女肥胖率的增加，GDM的发生率不断上升。

GDM可给母体及胎儿带来一系列的并发症，如增加自然流产发生率、妊娠高血压综合征、羊水过多等，也增加了巨大儿、胎儿发育异常、胎儿宫内窘迫、死胎、死产发生率；并使新生儿易发生低血糖症、高胆红素血症，呼吸窘迫综合征、红细胞增多症等。如果不及时进行诊断和治疗，不仅孕产妇及胎婴儿患病率和病死率将明显上升，产妇及其后代远期糖尿病患病率也将上升。因此，早期诊断、早期干预、及时合理治疗是预防GDM、减少母婴合并症的关键，是亟待解决的重大科学问题。

目前国际上对GDM的筛查和诊断方法及标准尚未完全统一，通常GDM需在第2孕期晚期或第3孕期才能进行诊断，根据美国糖尿病协会(American Diabetes Association，ADA)和美国妇产科学会(American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG)指南，GDM的血清学筛查在24-28孕周进行，这样可用于干预时间少之又少。因此，我们亟需发现更加明确而有效的生物标志物，对GDM做出辅助早期诊断，这将有助于早期干预，减少不良妊娠结局。

MicroRNAs(即miRNAs)是近年来分子生物学研究领域的一个热点，它的成熟状态是一类长约19-23个核苷酸的小单链RNA分子，进化上具有高度保守性。MiRNA的主要功能是调节生物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的基因的表达。自从参与调控线虫时序发育的lin-4与let-7被发现以来，miRNA分别在2002年和2003年两度入选Science杂志年度十大科技突破。2005年预测miRNAs至少能调控5300个人类基因，即所有基因的30％。随着研究的深入，越来越多的miRNAs不断被发现。聚光灯下的miRNA已经逐步摆脱了DNA光芒的掩盖，从“配角”变成“主角”，并且对DNA的中心地位提出了新的挑战。近年来，miRNA与疾病的关系已经成为研究的热点和重点，已经发现miRNA通过负调控基因的表达与肿瘤，糖尿病等，心脏病的发病高度相关。

研究已经证实血清/血浆中存在几百种的miRNAs，这些小分子RNAs性质稳定、含量丰富、易于定量检测，且存在显著的疾病特异性。现有的成熟的技术，包括定性和定量miRNA分子的技术，表明利用血清miRNAs作为分子生物标志物的方法比传统的特异蛋白分子标记方法将更加有效，为生物标志物开拓了新境界。

然而，目前还没有用于GDM辅助早期诊断的较为稳定的生物标志物的报道，若能筛选出GDM特异或异常表达的血清/血浆miRNAs作为生物标志物，并研制相应的辅助早期诊断试剂盒，对我国GDM的诊断现状必将是一次有力的推动。

发明内容

本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与GDM相关的血清/血浆miRNA标志物。

本发明的第二个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物的引物。

本发明的第三个目的是提供上述血清/血浆miRNA标志物及其引物在制备GDM辅助早期诊断试剂盒中的应用。

本发明第四个目的是提供用于GDM辅助早期诊断的试剂盒。

发明人通过分离和研究GDM病例发病前及与其年龄匹配的健康孕妇对照血清/血浆中的miRNAs，寻找一组与GDM发病高度相关的高特异性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于临床应用的GDM辅助早期诊断试剂盒，为GDM的筛查和早期诊断提供数据支持，为GDM的干预提供数据支持。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种与GDM相关的血清/血浆miRNA标志物，该标志物为miR-132、miR-29a和miR-222的组合。

所述的血清/血浆miRNA标志物的引物，这些引物为：miR-132的引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；miR-29a的引物为SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8；miR-222的引物为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。

所述血清/血浆miRNA标志物在制备GDM辅助早期诊断试剂盒中的应用。

所述血清/血浆miRNA标志物的引物在制备GDM辅助早期诊断试剂盒中的应用。

一种GDM辅助早期诊断试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆中miRNA中miR-132、miR-29a和miR-222。

所述诊断试剂盒，该试剂盒含有血清/血浆中miRNA中miR-132、miR-29a和miR-222的引物。

所述的诊断试剂盒，该试剂盒含有的血清/血浆miRNA标志物的引物为：miR-132的引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；miR-29a的引物为SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8；miR-222的引物为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12。

所述诊断试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)血清/血浆miRNA差异表达谱分析：选择GDM病例、与GDM病例年龄匹配的健康女性对照，检测病例及对照16-19孕周血清/血浆miRNA表达谱及含量，分析GDM病例在发病前和健康女性对照间血清/血浆miRNA的共性和特性，筛选差异表达miRNAs，进行进一步多阶段验证。(3)筛选疾病特异血清/血浆miRNAs：对已筛选的血清/血浆差异表达miRNAs在大样本人群中进行定量分析，确定GDM特异性血清/血浆miRNAs(4)血清/血浆miRNA筛查和辅助早期诊断试剂盒的研制：根据GDM病例和健康女性对照的特异血清/血浆miRNA开发miRNAs诊断试剂盒。

本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等(这些资料可用于判断疾病进展，患者年龄等因素对于发病的影响)，并采用了RT-PCR、Real-time PCR方法、TaqMan Low Density Array(TLDA)芯片检测等。

具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：

1.研究样本的选择

(1)采集16-19孕周的健康孕妇的血清

(2)上述研究对象在24-28孕周GDM筛查时经OGTT确诊为GDM的孕妇定义为病例

(3)上述研究对象在24-28孕周GDM筛查时未发生GDM，与病例年龄、BMI、孕周匹配的健康孕妇定义为对照

本研究共采用120例符合标准的样本进行研究。

2.Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)和miRNeasy Mini Kit(QIAGEN公司)提取血清/血浆总RNA，按常规方法操作。通常能得到～5μg RNA/50ml血清或血浆。

3.TLDA(Applied Biosystems公司)芯片检测

(1)总RNA通过逆转录反应得到cDNA样品

(2)cDNA样品进行预扩增反应

(3)预扩增产物进行TLDA芯片检测，得到miRNA的表达谱

(4)数据分析与处理

4.Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法

(1)取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；

(2)设计引物；

(3)加入荧光探针或染料进行PCR反应；

(4)检测并比较GDM病例与健康对照血清/血浆样本中miRNA的量的变化。

5.诊断试剂盒制备方法

TLDA芯片检测方法综合确定GDM病例和健康对照中有表达差异的miRNA，通过qRT-PCR技术筛选在GDM病例和健康对照中表达量和差异程度大的一组血清/血浆miRNA，作为GDM早期诊断的指标。最后筛选出的与GDM发病有关的血清/血浆miRNA组成诊断试剂盒(miR-132、miR-29a和miR-222)。诊断试剂盒包括这些血清/血浆微小核糖核酸组合的引物，探针，以及Taq酶、dNTP等试剂。

6.统计分析方法

运用χ2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征，血糖水平和miRNA平均表达水平在研究对象组间分布的差异。

我们在探索性样本人群(24例GDM病例和24例健康对照)中运用TLDA芯片的研究结果发现有11种miRNAs与GDM发病情况有显著关联。个体miRNAs检测的不同表达水平以2^-ΔCt表示，其中ΔCt＝C_T样本-C_T内参，我们在每一个样本提取时加入cel-mir-39的RNA作为参照，计算相对表达量。对有统计学显著差异的miRNAs在另外36例GDM病例和36例对照中进行进一步验证，进而观察本研究结果的稳定程度。

统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(SAS，v.9.1.3)。统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。

以下是本发明进一步的说明：

在上述24例符合条件的GDM病例及24例健康对照中，两组年龄按个体精确匹配。我们将这两组人群作为探索性样本经TLDA芯片检测获得相关结果。

根据TLDA芯片检测，本发明人检测到在“妊娠期糖尿病病例”组和“健康女性对照”组的血清中存在差异表达(ΔΔCT＞3)的微小核糖核酸包括：hsa-miR-103、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-125b、hsa-miR-127-3p、hsa-miR-128、hsa-miR-130a、hsa-miR-132、hsa-miR-141、hsa-miR-1、hsa-miR-145*、hsa-miR-148b、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-18a、hsa-miR-196b、hsa-miR-200b、hsa-miR-203、hsa-miR-206、hsa-miR-211、hsa-miR-212、hsa-miR-22*、hsa-miR-221、hsa-miR-222、hsa-miR-26b*、hsa-miR-27a*、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29c*、hsa-miR-302d、hsa-miR-31、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-378、hsa-miR-411*、hsa-miR-433、hsa-miR-491-5p、hsa-miR-493*、hsa-miR-495、hsa-miR-513-3p、hsa-miR-516b、hsa-miR-517a、hsa-miR-518d-3p、hsa-miR-518e*、hsa-miR-518f、hsa-miR-519a、hsa-miR-524-3p、hsa-miR-525-3p、hsa-miR-539、hsa-miR-543、hsa-miR-545、hsa-miR-548c-3p、hsa-miR-564、hsa-miR-571、hsa-miR-584、hsa-miR-604、hsa-miR-629、hsa-miR-632、hsa-miR-635、hsa-miR-636、hsa-miR-639、hsa-miR-640、hsa-miR-642、hsa-miR-644、hsa-miR-650、hsa-miR-660、hsa-miR-661、hsa-miR-671-3p、hsa-miR-744、hsa-miR-768-3p、hsa-miR-801、hsa-miR-9*、hsa-miR-923、hsa-miR-92a-1*、hsa-miR-93*、hsa-miR-95、hsa-miR-99a。

根据上述两种方法检测的结果，选择TLDA芯片中两组研究对象的CT值均不大于35的miRNAs用qRT-PCR方法进一步的验证，以提高检测效率。

满足上述条件的miRNAs包括：miR-1、miR-125b、miR-132、miR-29a、miR-203、miR-222、miR-378、miR-518d-3p、miR-632、miR-923、miR-99a。

探针法和染料法qRT-PCR结果均发现在24例GDM病例和24例健康对照中，有3种miRNAs(miR-132、miR-29a、miR-222)在“GDM病例”组和“健康对照”组中的表达情况存在显著性差异。

多因素Logistic回归分析结果表明，这3种miRNAs的表达水平均与GDM的发病存在着显著关联：3种miRNAs均在对照中高表达。

根据上述结果，将这3个与妊娠期糖尿病发病相关的miRNAs在另外36例GDM病例和与其年龄、BMI、孕周匹配的36例健康女性对照进行进一步验证。我们发现血清/血浆低表达miR-132、miR-29a、miR-222均与妊娠期糖尿病发病相关联，染料法的结果与探针法一致。

根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于GDM辅助早期诊断的试剂盒，包含测定受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的成熟miR-132、miR-29a和miR-222的引物和其他检测试剂。

具体而言，这3种miRNAs的组合，或者这3种miRNAs的引物组合构成的相关诊断试剂盒有助于GDM的早期诊断，为临床医生准确预测孕妇的GDM发病结局，及时采取更具个性化的防治方案提供支持，从而最大限度的降低GDM的发病率，减少不良妊娠结局。

本申请中“血清/血浆”中的“/”表示“和”及“或”的关系。

本发明的有益效果：

本发明提供的血清/血浆微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)标志物作为GDM早期诊断的标志物的优越性在于：

(1)血清/血浆miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发将为GDM的早期辅助诊断开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。

(2)血清/血浆miRNAs试剂盒是一种系统、全面的诊断和监测试剂盒，可用于GDM的早期诊断，为临床医生快速准确预测孕妇GDM结局、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。

(3)采用严密的设计和评价体系，本发明人初期采用TLDA芯片检测获取疾病特异和异常表达的血清/血浆miRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法在大样本中进行了验证，采用了两种不同的方法(荧光探针法和染料法)进行验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。

本发明通过控制年龄等对疾病发展的影响因素，研究血清/血浆miRNA在GDM早期诊断的应用前景，阐述异常表达的miRNAs对于GDM进展的影响，揭示其筛查和早期诊断价值。因此，本发明获得了GDM发病特异性血清/血浆miRNAs表达数据库和特异性标志物；通过血清/血浆miRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得GDM的早期诊断更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。

附图说明

图1.显示GDM病例组和健康对照组的miR-132的表达箱线图。

图2.显示GDM病例组和健康对照组的miR-29a的表达箱线图。

图3.显示GDM病例组和健康对照组的miR-222的表达箱线图。

图中

DS：探索性样本，IS：验证性样本，control：对照，case：病例

具体实施方式

实施例1样品的收集和样品资料的整理

发明人于2008年开始至今从南京市妇幼保健院收集了大量的16-19孕周孕妇的外周血样品(用于研究的样本为同期收取，采样、分装、保存条件均一)，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了120例符合下列标准的样本作为TLDA芯片检测和后续一系列qRT-PCR验证的实验样品：

1、采血时为16-19孕周健康孕妇

2、上述研究对象在24-28孕周GDM筛查时经OGTT确诊为GDM的孕妇定义为病例

3、上述研究对象在24-28孕周GDM筛查时未发生GDM，与病例年龄、BMI、孕周匹配的健康孕妇定义为对照

并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。

实施例2血清/血浆中miRNA的TLDA芯片检测

将上述符合条件的24例GDM病例和24例健康对照经TLDA芯片检测获得相关结果。具体步骤为：

1、分别取“妊娠期糖尿病病例”组和“健康女性对照”组患者的血清600μl，加入3倍体积的Trizol试剂；

2、相分离：室温放置15min，加入终浓度为10^-4pmol/μl的cel-39(TAKARA)作为内参，然后加入与血浆等体积的氯仿，震荡50s，室温15min，14,000rpm，4℃，离心15min；

3、RNA沉淀：将水相转移到新的15ml的离心管，加入1.5倍水相体积的无水乙醇，充分混匀；

4、用QIAGEN miRNeasy kit试剂盒富集RNA：每次吸取700μl样本至离心柱中，14,000rpm离心15s，弃去收集管中滤液，重复至样本均过柱；加入700μl试剂盒提供的洗液1，14,000rpm离心15s，弃收集管中滤液；加入500μl试剂盒提供的洗液2，14,000rpm离心15s，弃收集管中滤液；再加入500μl洗液2，14,000rpm离心2min，弃收集管中滤液；将离心柱放回空的收集管中，14,000rpm离心2min以干燥离心管；将离心管放入新的1.5ml管中，加入50μl无核酸酶水，10,000rpm离心1min；将管中的液体倒回离心柱中，14,000rpm离心1min，弃离心柱；

5、测量浓度：通常能得到～1250ng RNA/600μl血清；

6、用TLDA芯片配套的逆转录试剂盒通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括0.8μl逆转录引物(10×)、0.2μl 100mM dNTPs混合物、1.5μl逆转录酶(50U/μL)、0.8μl 10×逆转录缓冲液、0.9μl 25mM氯化镁、0.1μl RNA抑制剂以及0.2μl无核酸酶水。加入3μl(1-350ng)的总RNA。反应步骤为16℃孵育2分钟，42℃反应1分钟，50℃反应1秒，上述3步经40个循环反应，再85℃孵育5分钟；

10、对芯片特异性的miRNA进行预扩增以增加表达所需的cDNA的量。预扩增的反应体系包括：12.5μl预扩增Master Mix(2×)、2.5μl预扩增引物(10×)、7.5μl无核酸酶水、2.5μl CDNA。反应步骤为：95℃10分钟→55℃2分钟→72℃2分钟→95℃15秒、60℃4分钟，12个循环→99.9℃10分钟；反应结束后加入75μl 0.1X TE稀释；

11、取9μl稀释后的预扩增产物，加入450μl基因表达Master Mix，441μl无核酸酶水，充分混匀后，在TLDA芯片上加入100μl/孔；1000rpm离心1min，离心2次。TLDA芯片实验使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪。选择384-well TaqMan Low DensityArray特定的程序进行反应；

12、数据分析与处理：用RQ-Manger软件进行数据处理，C_T阈值设为0.2，ΔC_T＝C_{T 样本}-C_T U6(U6为TLDA芯片中的内源性U6，用以控制板间差异)，两组样品血清miRNAs的表达量比值可用方程ΔΔC_T表示，ΔΔC_T＝ΔC_T病例-ΔC_T对照-ΔC_Tcel-39，其中ΔC_Tcel-39＝C_{Tcel-39 病例}-C_{Tcel-39对照}，(cel-39用以控制RNA提取时的差异)。运用TLDA芯片检测发现的“GDM病例”组和“健康女性对照”组中血清差异表达的微小核糖核酸在上文中已经罗列出。

实施例3血清/血浆中miRNA的qRT-PCR实验

根据上述TLDA结果，选择miR-1、miR-125b、miR-132、miR-29a、miR-203、miR-222、miR-378、miR-518d-3p、miR-632、miR-923、miR-99a等11个miRNAs设计逆转录和qRT-PCR的引物。对“GDM病例”组和“健康对照”组的血清单个个体进行miRNA的qRT-PCR检测，见表1。在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测三次。所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。分别用染料法和探针法两种方法进行qRT-PCR检测。

(1)制备RNA样品：a)取100μl血清；b)加3倍体积的Trizol室温放置15min，加入终浓度为10^-4pmol/μl的cel-39(TAKARA)作为内参，然后加入与血浆等体积的氯仿，震荡50s，室温15min，14，000rpm，4℃，离心15min；c)将水相转移到新的15ml的离心管，加入1.5倍水相体积的无水乙醇，充分混匀；d)用QIAGEN公司的miRNeasykit富集RNA：每次吸取700μl样本至离心柱中，14,000rpm离心15s，弃去收集管中滤液，重复至样本均过柱；加入700μl洗液1，14,000rpm离心15s，弃收集管中滤液；加入500μl洗液2，14,000rpm离心15s，弃收集管中滤液；再加入500μl洗液2，14,000rpm离心2min，弃收集管中滤液；将离心柱放回空的收集管中，14,000rpm离心2min以干燥离心管；将离心管放入新的1.5ml管中，加入50μl无核酸酶水，10,000rpm离心1min；将管中的液体倒回离心柱中，14,000rpm离心1min，弃离心柱，将管中的液体作为RNA样品；

cel-39正向引物：ACACTCCAGCTGGGTCACCGGGTGTAAATC，反向引物：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAAGCTGA。

(2)探针法：使用ABI试剂盒。

a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。探针法的逆转录反应体系包括0.15μl 100mMdNTPs混合物、1μl逆转录酶(50U/μL)、1.5μl 10X逆转录缓冲液、0.19μl RNA抑制剂以及3μl 5×逆转录引物(即表3中的反向引物)一种或几种的混合物。加入9.16μl的总RNA。反应步骤为16℃孵育30分钟，42℃反应30分钟，85℃孵育5分钟；

b)q-PCR：将cDNA加入5μl水稀释，取1μl稀释后的cDNA，加入0.25μl20×MicroRNA检测探针、2.5μl 2×基因表达Master Mix、1.25μl双蒸水，5μl体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行45个循环。

(3)染料法：

a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。染料法的逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合物(Takara公司)、0.5μl RNase抑制剂(Takara公司)、2μlAMV(Takara公司)以及1.5μl miRNA特异性反向引物一种或几种的混合物。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；

b)q-PCR：将cDNA按1/5体积稀释，取0.5μl稀释后的cDNA，加入0.15μl Taq酶(Takara公司)，0.5μl 20×EVA GREEN，0.1μl 10μM正向引物一种，0.1μl 10μM通用反向引物(URP：TGGTGTCGTGGAGTCG，SEQ ID No.25)，0.6μl 25mM MgCl₂，0.8μl 2.5mMdNTP混合物(Takara公司)，1μl 10×PCR缓冲液，6.75μl双蒸水，10μl体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行45个循环。

(4)数据处理与分析

两组样品血清miRNAs的表达量比值可用方程2^-ΔCt表示，其中ΔC_t＝C_T样本-C_T内参，我们在每一个样本提取时加入cel-39的RNA作为参照，计算相对表达量(cel-39：SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8)。

探针法和染料法qRT-PCR结果均发现在48例样本中，有3种miRNAs(miR-132、miR-29a和miR-222)在两组间的表达情况存在显著性差异，探针法结果见表1、表2、图1，染料法结果与探针法类似未列出。

实施例4血清中微小核糖核酸qRT-PCR实验的进一步研究

根据上述结果，将这3种与妊娠期糖尿病发病相关的miRNAs在另外36例GDM病例与36例匹配的健康对照中进行进一步检测。我们发现miR-132、miR-29a和miR-222在GDM病例组血清中的表达均显著低于对照组，探针法与染料法结果同样一致。

实施例5用于GDM辅助早期诊断的miRNA试剂盒的制作

miRNA试剂盒的制作和操作流程是基于TLDA芯片检测，RT-PCR和real-time PCR等技术。试剂盒包括血清/血浆miRNA引物(包括下列引物miR-132的引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；miR-29a的引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8；miR-222的引物为SEQ IDNo.11和SEQ ID No.12)，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，去核酸酶水，荧光染料或探针、Taq酶、通用反向引物(URP：TGGTGTCGTGGAGTCG)等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如定量标化的线虫mir-39样本等)及正常参考值。此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测miRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助早期诊断GDM，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断。

表1.病例组和对照组TLDA芯片检测结果比较

*TLDA芯片检测结果，ΔCT＝C_T样本-C_T内参(以U6作为内参)

ΔΔCT＝ΔCT病例-ΔCT对照-ΔCT_Cel-39

±Student′s t test

表2.验证样本表达结果

*Student′s t test

表3：引物序列

Claims (5)

1.一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物的引物组合，其特征在于该引物组合为下列3对引物：

miR-132的引物为SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；miR-29a的引物为SEQ ID No.7和SEQID No.8；miR-222的引物为SEQ ID No.11和SEQ ID No.12；所述与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物为miR-132、miR-29a和miR-222的组合。

2.一种与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物在制备妊娠期糖尿病辅助早期诊断试剂盒中的应用，所述与妊娠期糖尿病相关的血清/血浆miRNA标志物为miR-132、miR-29a和miR-222的组合。

3.权利要求1所述的血清/血浆miRNA标志物的引物组合在制备妊娠期糖尿病辅助早期诊断试剂盒中的应用。

4.一种妊娠期糖尿病辅助早期诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求1所述的引物组合，用于检测血清/血浆中miR-132、miR-29a和miR-222。

5.根据权利要求4所述诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括PCR反应常用的酶和试剂。