CN102021167B - 一种用于检测隐匿性乙型肝炎的血清miRNA组合物及其应用 - Google Patents
一种用于检测隐匿性乙型肝炎的血清miRNA组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种用于检测隐匿性乙型肝炎的血清miRNA组合物及其应用。本发明血清miRNA组合物选自下列miRNA：hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122或hsa-miR-150中的至少两种。本发明还提供一种用于隐匿性乙型肝炎检测的TaqMan探针组合物，包括本发明所述miRNA的TaqMan探针。本发明所述的miRNA组合物可在制备检测OBI的试剂或工具中应用。通过本发明血清microRNA生物标志物和检测试剂盒的研制和应用，使得OBI的检测方便易行，为临床医生快速发现隐匿性乙型肝炎患者、及时采取有效的防治方案提供支持。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测隐匿性乙型肝炎的血清miRNA组合物及其应用。
背景技术
隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult HBV infection，OBI)是指血清HBsAg阴性，但血清和(或)肝组织中HBV-DNA阳性，并有慢性乙型肝炎的临床表现，患者可伴有血清抗-HBs、抗-HBe和(或)抗-HBc阳性，另约20％隐匿性乙型肝炎患者除HBV-DNA阳性外，其余HBV血清学标志均为阴性。OBI与许多临床情况有关，由于用常规方法难以检出，所以成为较复杂的流行病学和临床问题。
OBI的发生因素目前尚不十分清楚，可能与下列因素有关。(1)HBV低水平复制，(2)HBV基因变异，(3)HBV与宿主染色体整合，(4)HBsAg的表达和分泌被抑制，(5)宿主免疫应答异常，(6)国产试剂的灵敏度和质量问题。
乙型肝炎疫苗接种人群，一般先做HBV筛选，但不能除去HBsAg阴性的潜在HBV感染。正常人群疫苗无应答占6％～12％，可能HBsAg阴性HBV感染是HB(乙型肝炎)免疫失败的主要原因之一。Brechotc等对不明原因慢性肝病患者进行肝组织及血清荧光定量PCR测HBV-DNA，发现隐匿性乙型病毒性肝炎是不明原因肝病的主要病因之一。此外，由于OBI中虽然HBsAg是阴性，但病毒仍低水平复制，炎症仍可低水平活动，部分OBI病例可能发展成HCC，尤其是与HCV重叠感染时。
OBI不仅对患者本身的诊断和治疗造成一定的困难，还可引发临床一系列不良后果，包括HBV母婴垂直传播、输血后肝炎、器官移植失败等。
目前，我国常见的体检项目中针对乙型肝炎感染的检查项目只有肝功能13项(TBIL、DBIL、IBIL、TP、ALB、GLO、A/G、ALT、AST、GGT、TBA、LDH、ALP)和乙肝5项(HbsAg，HbsAb，HbeAg，HbeAb，HbcAb)，而这两种检查都无法有效地检出OBI感染的患者。
综上所述，OBI无论是对患者本身还是对乙肝病毒传播途径的控制都有很大的危害，但是目前的体检方法无法有效地检出OBI感染的患者，要有效地治疗隐匿性肝炎病毒感染，加强对HBV传播途径的控制监管，就需要获得灵敏、特异、易于检测的标志物。
微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是近年的一个研究热点，它是一类长约19-23个核苷酸的单链RNA分子，位于基因组非编码区，进化上高度保守，可在翻译水平对基因表达进行调节，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等密切相关，同时也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。近来研究表明血清/血浆微小核糖核酸可以用于多种癌症的前期诊断和治疗指导，但还没有关于血清/血浆微小核糖核酸用于检测隐匿性乙型肝炎方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种用于检测隐匿性乙型肝炎的血清miRNA组合物。
本发明的另一目的是提供一种用于隐匿性乙型肝炎检测的TaqMan探针组合物。
本发明的又一目的是提供所述血清miRNA组合物和TaqMan探针组合物的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种血清miRNA组合物，该血清miRNA组合物选自下列血清miRNA：hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122或hsa-miR-150中的至少两种。
所述血清miRNA组合物优选包括：hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122和hsa-miR-150四种miRNA。
本发明所述的血清miRNA组合物在制备检测隐匿性乙型肝炎(OBI)的试剂或工具中的应用。
一种用于隐匿性乙型肝炎(OBI)检测的TaqMan探针组合物，该TaqMan探针组合包括本发明所述miRNA的TaqMan探针。
所述的TaqMan探针组合物优选包括：hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122及hsa-miR-150四种miRNA的TaqMan探针。
本发明所述的TaqMan探针组合物在制备检测OBI的试剂或工具中的应用。
一种用于OBI检测的试剂盒该试剂盒包含本发明所述的TaqMan探针组合。
所述试剂盒还可以包括Taq酶、dNTP、氯化镁和PCR缓冲液(不含Mg2+)。
本发明所述miRNA组合物的筛选方法包括以下步骤(见图1)：
(1)建立统一标准的标本库和数据库：从医院采集的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。
(2)血清miRNA差异表达谱分析：选择健康个体和慢性乙型肝炎患者的血清，提取总RNA，并采用Solexa测序技术(Solexa sequencing technology)，对上述总RNA中已知的人全部成熟miRNA(miRBase12.0，共692个)进行检测，筛选差异表达的miRNAs以备进一步大样本独立验证。
(3)用实时荧光定量PCR方法(TaqMan探针法)筛选可用作检测marker的血清miRNA：对已筛选的血清差异表达的miRNAs在大样本人群中进行定量分析验证，确定能够用于区分隐匿性乙型肝炎患者组、慢性乙型肝炎患者组和健康对照组的miRNAs：hsa-let-7c(SEQ ID NO.1)，hsa-miR-23b(SEQ ID NO.2)，hsa-miR-122(SEQ ID NO.3)及hsa-miR-150(SEQ ID NO.4)。
本发明使用的检测方法可以选自：RT-PCR方法、Solexa测序技术(Solexasequencing technology)、Real-time PCR方法中的一种或几种。
本发明的有益效果：
本发明所述microRNAs组合物、TaqMan组合物、检测试剂盒为OBI相关疾病的发生和进展机制的研究提供数据支持；通过血清microRNA生物标志物和检测试剂盒的研制和应用，使得OBI的检测方便易行，为临床医生快速发现隐匿性乙型肝炎患者、及时采取有效的防治方案提供支持，从而降低OBI发展成为HCC的风险，并有效地防止由于OBI感染难以检测而导致的HBV母婴垂直传播、输血后肝炎、器官移植失败等一系列不良后果。
血清miRNA是一种新型生物标志物，与传统生物标志物相比具有如下优势：1)血清容易取得，属于无创检查，对患者几乎没有伤害；2)miRNA在血清中表达稳定，因此对样本的储存条件要求不高；3)定量精确，对疾病诊断的敏感性和特异性很高；4)血清中的miRNA反映的是机体整体的病理、生理情况，其检测结果具有精确而详细的指导意义；5)血清miRNA检测能在分子水平上反映疾病发生过程中基因转录后调控状态，并为隐匿型乙型肝炎发病机理的研究的治疗提供了潜在靶点。因此，该类小分子RNA生物标志物的成功开发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆，将为OBI的防治开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
附图说明
图1本发明miRNA筛选及试剂盒制备的主要流程。
图2显示以hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122和hsa-miR-150四个microRNAs作为markers时对健康对照组(CTL)和隐匿性乙型肝炎患者组(OBI)进行聚类分析的结果。
图3显示以hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122和hsa-miR-150四个microRNAs作为markers时对健康对照组(CTL)和慢性乙型肝炎患者组(HBV)进行聚类分析的结果。
图4显示以hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122和hsa-miR-150四个microRNAs作为markers时对健康对照组(CTL)、隐匿性乙型肝炎患者组(OBI)和慢性乙型肝炎患者组(HBV)进行聚类分析的结果。
图5显示健康对照组和隐匿性乙型肝炎患者组之间的ROC曲线。
图6显示健康对照组和慢性乙型肝炎患者组之间的ROC曲线。
图7显示隐匿性乙型肝炎患者组和慢性乙型肝炎患者组之间的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1样品的搜集和样品资料的整理
本发明人于2009年10月到2010年5月间从南京市第二医院搜集了大量的血清样品，通过对样品资料的整理，本发明人从中选择了30例健康对照者(平均年龄：35.60±15.27，年龄跨度：20-61，男性：14，女性：16)、29例慢性乙型肝炎患者(平均年龄：39.24±12.83，年龄跨度：14-67，男性：17，女性：12)、11例隐匿性乙型肝炎患者(平均年龄：42.82±17.96，年龄跨度：23-80，男性：5，女性：6)作为real-time PCR验证的实验样品。具体的样品归类标准如下：
Group CTL：健康对照组(n＝30)
(1)乙肝表面抗体、乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阴性
(2)ALT＜40IU/L，AST＜45IU/L
(3)HBV-DNA＜500copies/ml
(4)没有其它系统性疾病
(5)年龄≥20
Group OBI：隐匿性乙型肝炎患者组(n＝11)
(1)乙肝表面抗原阴性
(2)ALT＜40IU/L，AST＜45IU/L
(3)HBV-DNA水平高于正常值
(4)没有其它系统性疾病
(5)年龄≥20
Group HBV：慢性乙型肝炎患者组(n＝29)
(1)乙肝表面抗原和乙肝核心抗体阳性至少6个月
(2)ALT和/或AST水平高于正常值
(3)HBV-DNA水平高于正常值
(4)没有其它系统性疾病
(5)年龄≥14
实施例2慢性乙肝患者特异性miRNA表达谱初筛
使用Solexa测序技术发现并证明30个健康对照者和29个慢性乙肝患者血清/血浆中稳定存在88种差异表达的微小核糖核酸。具体步骤为：
(1)收集健康对照者和慢性乙肝病人的血清/血浆；
(2)分别取80-100ml的血清，加入等体积的Trizol Reagent；
(3)相分离：室温放置15min，然后按0.2ml了氯仿/1ml Trizol Reagent的体积比加入氯仿，教育列震荡15s，室温15min，12,000g，4℃，离心15min；
(4)将水相转移到新的50ml的离心管，3步苯酚/氯仿除去蛋白相；
(5)RNA沉淀：将水相转移到新的离心管中，按0.5ml异丙醇/1ml Trizol Reagent体积加入异丙醇，-20℃保存60min，12,000g，4℃，离心60min；
(6)用1ml Trizol重悬沉淀，将悬液转移到新的1.5ml的离心管中；
(7)重复2，4步(第四步离心改为15min)；
(9)RNA洗涤：去掉上清，加入75％DEPC-乙醇，12,000g，4℃离心5min；
(10)测量浓度：通常能得到5～10μg RNA/50～100ml血清；
(11)总RNA进行PAGE电泳回收17-27nt RNA分子；
(12)将adaptor prime酶联在小RNA分子的3′与5′端；
(13)进行RT-PCR反应后并进行测序；
(14)数据分析与处理。
具体实验结果见表2。根据表中的Solexa结果，我们选择在慢性乙肝病人中的拷贝数是健康对照者中拷贝数的20倍的microRNAs作为本发明中初步筛查的血清markers，并且这些microRNAs在慢性乙肝病人中的拷贝数都大于50拷贝，由于技术操作问题，我们舍弃了hsa-miR-221和hsa-miR-629。通过筛选，选择了hsa-miR-122a、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-92a、hsa-let-7c、hsa-miR-23a、hsa-miR-23b、hsa-miR-223、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a、hsa-miR-150、hsa-miR-125b、hsa-miR-10a 13个microRNAs(表2中加粗标记)作为初步筛查的markers，并订购相应的TaqMan探针(ABI公司)。
表2健康对照者和慢性乙肝病人血清Solexa测序结果
| miRNA | 健康对照者 | 慢性乙肝病人 | miRNA | 健康对照者 | 慢性乙肝病人 |
| hsa-miR-122a | 1 | 69501 | hsa-miR-374a | 8 | 2 |
| hsa-miR-423-5p | 40 | 5741 | hsa-miR-660 | 6 | 2 |
| hsa-miR-92a | 68 | 3356 | hsa-miR-424 | 5 | 2 |
| hsa-miR-451 | 11660 | 2194 | hsa-miR-532-3p | 1 | 2 |
| hsa-let-7c | 3 | 1073 | hsa-miR-193a | 0 | 2 |
| hsa-miR-23a | 3 | 530 | hsa-miR-20a | 297 | 0 |
| hsa-hsa-miR-16 | 1361 | 377 | hsa-miR-19b | 97 | 0 |
| hsa-let-7f | 402 | 250 | hsa-miR-144 | 64 | 0 |
| hsa-let-7g | 412 | 205 | hsa-miR-18a | 24 | 0 |
| hsa-miR-23b | 1 | 202 | hsa-miR-340 | 22 | 0 |
| hsa-miR-223 | 8 | 168 | hsa-miR-182 | 16 | 0 |
| hsa-miR-342-3p | 1 | 152 | hsa-miR-98 | 13 | 0 |
| hsa-miR-375 | 0 | 148 | hsa-miR-30e | 16 | 5 |
| hsa-miR-99a | 0 | 127 | hsa-miR-652 | 9 | 5 |
| hsa-miR-150 | 2 | 120 | hsa-miR-148b | 7 | 5 |
| hsa-miR-21 | 187 | 102 | hsa-miR-106b | 280 | 2 |
| hsa-miR-103 | 201 | 91 | hsa-miR-186 | 68 | 2 |
| hsa-miR-191 | 127 | 91 | hsa-miR-142-3p | 65 | 2 |
| hsa-miR-221 | 1 | 89 | hsa-miR-363 | 62 | 2 |
| hsa-miR-125b | 1 | 89 | hsa-miR-130a | 23 | 2 |
| hsa-let-7i | 215 | 86 | hsa-miR-29c | 21 | 2 |
| hsa-miR-93 | 102 | 70 | hsa-miR-20b | 20 | 2 |
| hsa-miR-185 | 370 | 61 | hsa-miR-130b | 12 | 2 |
| hsa-miR-378 | 34 | 61 | hsa-miR-146b | 9 | 2 |
| hsa-miR-629 | 1 | 59 | hsa-miR-142 | 110 | 14 |
| hsa-miR-222 | 3 | 57 | hsa-miR-486-3p | 0 | 14 |
| hsa-miR-10a | 1 | 52 | hsa-miR-455-3p | 0 | 11 |
| hsa-miR-885 | 0 | 48 | hsa-miR-101 | 502 | 9 |
| hsa-miR-99b | 0 | 48 | hsa-miR-30a | 0 | 9 |
| hsa-miR-193b | 0 | 43 | hsa-miR-197 | 0 | 9 |
| hsa-miR-27b | 2 | 41 | hsa-miR-574-3p | 0 | 9 |
| hsa-miR-15a | 93 | 39 | hsa-miR-532 | 6 | 7 |
| hsa-miR-26a | 110 | 36 | hsa-miR-923 | 6 | 7 |
| hsa-miR-107 | 109 | 34 | hsa-miR-365 | 0 | 7 |
| hsa-miR-27a | 0 | 34 | hsa-miR-7 | 95 | 5 |
| hsa-miR-128a | 2 | 25 | hsa-miR-106a | 32 | 5 |
| hsa-miR-483-3p | 0 | 25 | hsa-miR-1 | 1 | 20 |
| hsa-miR-483 | 0 | 25 | hsa-miR-146a | 22 | 18 |
| hsa-miR-139 | 0 | 23 | hsa-miR-26b | 57 | 16 |
| hsa-miR-17 | 111 | 20 | hsa-miR-151 | 40 | 16 |
| hsa-miR-128b | 2 | 20 | hsa-miR-92b | 0 | 16 |
实施例3用定量PCR方法进行复筛并对血清microRNA在OBI检测中的临床价值进行评估
用探针对30例健康对照者、29例慢性乙型肝炎患者、11例隐匿性乙型肝炎患者的血清进行微小核糖核酸的qRT-PCR检验。
(1)酚/氯仿法提取血清总RNA
a)取100ul样品加入到300ul水中，充分混匀后加入200ul(PH＝4.7-5.5)酸性酚，剧烈震荡混匀，室温静置2min后加入200ul氯仿，再次充分震荡，室温静置5min后12000g室温离心15min；
b)小心吸取上清液(约400ul)加入到800ul异丙醇中，再加入PH＝5.2的3M醋酸钠40ul，充分混匀后-20℃静置30min，16000g，4℃离心20min；
c)充分弃上清后，加入75％DEPC-乙醇1ml，轻柔颠倒数次，16000g，4℃离心10min；
d)充分弃上清，室温干燥后，加入40ul DEPC水溶解沉淀，得到RNA样品。
(2)制备cDNA样品：将上一步得到的RNA样品通过RNA逆转录反应得到cDNA：
逆转录的反应体系包括2μl 5×AMV buffer、1μl 10mM each dNTP mixture(Takara公司)、0.5μl AMV(Takara公司)、4ulDEPC水、0.5μl反向引物(ABI公司)以及2ul RNA样品。反应步骤为16℃孵育30min，42℃反应30min，85℃孵育5分钟。
(3)qRT-PCR：用20μl体系进行qRT-PCR，体系包括14.77μl H2O，2μl10×PCR buffer(Takara公司)，1.2μl 25mM MgCl2(Takara公司)，0.4μl 10mMeach dNTP mixture(Takara公司)，0.3μl Taq酶(Takara公司)，0.33μl TaqMan探针(ABI公司)，1μl cDNA。所用的仪器是ABI Prism 7300荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是：95℃、5分钟进行1个循环→95℃、15秒，60℃、1分钟进行40个循环。
(4)标准曲线的制备：将合成的10nM hsa-miR-16的成熟体RNA(Takara公司)按(2)中相同的逆转录体系逆转录成cDNA。将所得hsa-miR-16的cDNA用水按10倍梯度稀释100倍、1000倍、10000倍、100000倍、1000000倍，得到一组cDNA。将这组cDNA按(3)中相同的qRT-PCR体系并且与(3)中的cDNA在同一块PCR板上进行荧光定量PCR。
(5)数据分析与处理：扩增结束后根据扩增曲线设定统一的阈值，然后根据标准品hsa-miR-16的浓度及每个浓度对应的CT值绘制标准曲线，并根据此标准曲线及待测样本的CT值计算出该样本所需测定的miRNA的绝对含量。依据qRT-PCR的结果，我们从前述的13个microRNAs中挑选了4个在健康对照组和隐匿性乙型肝炎患者组中表达差异最大且在健康对照组和慢性乙型肝炎患者组中表达差异明显的microRNAs：hsa-let-7c、hsa-miR-23b、hsa-miR-122和hsa-miR-150。以这4个microRNAs作为markers对数据结果用Cluster 3.0进行聚类分析，结果见图2、3、4。图2是30例健康对照者(CTL)和11例隐匿性乙型肝炎患者(OBI)聚类分析的结果，图3是30例健康对照者(CTL)和29例慢性乙型肝炎患者(HBV)聚类分析的结果，图4是30例健康对照者(CTL)、11例隐匿性乙型肝炎患者(OBI)和29例慢性乙型肝炎患者(HBV)聚类分析的结果。从三个图中可以看出，用hsa-let-7c、hsa-miR-23b、hsa-miR-122和hsa-miR-150作为markers，CTL组和OBI组、CTL组和HBV组聚类都可以分开。为了评估这4个microRNAs在OBI检测中的诊断能力，本发明人又对CTL组、HBV组、OBI组样品的qRT-PCR结果进行风险评分，以每个microRNA表达量的5％或95％的参考区间为风险值，通过绘制ROC曲线来评估预测的灵敏性和特异性，ROC分析结果见图5、6、7。当用hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122和hsa-miR-1504个markers来区分对照组和OBI组时，AUC为100.0％，灵敏度为100.0％，特异性为100.0％(图5)。当用hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122和hsa-miR-150 4个markers来区分对照组和HBV组时，AUC为98.9±1.0％，灵敏度为96.6％，特异性为96.7％(图6)。当用hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122 3个markers来区分OBI组和HBV组时，AUC为71.8％±10.1％，灵敏度为45.5％，特异性为96.6％(图7)，灵敏度不高，但是其较高的特异性提示所选择的markers可以在一定程度上将OBI组合HBV组分开。
实施例4用于OBI检测的血清/血浆microRNA检测试剂盒的制作
用于检测隐匿性乙型肝炎的血清miRNA试剂盒的制作工艺和操作流程是基于Solexa技术和定量PCR技术所测结果将hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122和hsa-miR-150 4个microRNA序列提供给ABI公司，由ABI公司合成相应的TaqMan探针。将这4种TaqMan探针收集到PCR试剂盒(RT-PCR或Real-time PCR)中制备特定TaqMan探针组合的OBI检测试剂盒。
所述试剂盒的具体组成(每份标本)如下：
PCR水 14.77μl
10×buffer 2μl
MgCl2 1.2μl
dNTP 0.4μl
Taq酶 0.3μl
TaqMan探针(含对应引物) 0.33μl
+cDNA(血样) 1μl
此外，所述试剂盒还应包括合成的hsa-miR-16的成熟体RNA和相应的TaqMan探针。
所制备试剂盒的具体操作流程如下：
(1)收集受试者的血清样本，提取RNA后逆转录制备cDNA样品；
(2)按照实施例3中所述的方法制备标准曲线；
(3)按照上述配方加样；
(4)进行PCR反应，条件为95℃ 5min，95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。
此试剂盒的价值在于只需要血清/血浆而不需要其它组织样品，通过最精简的探针库检测microRNA的变化趋势，再通过该变化趋势预测是否发生OBI感染。因此将此试剂盒投入实践，可以为临床医生快速发现OBI感染的患者、及时采取相应的防治方案提供支持，为控制HBV的传播途径提供有力的帮助。
实施例4中使用的TaqMan探针是从ABI公司订购的，其中包括做RT-PCR的引物和做qRT-PCR的引物，货号见表1，试剂盒组成部分所述的TaqMan探针0.33μl是包含了相应引物的量。
表1
本发明中所述的ABI公司全称为美国应用生物系统公司。
本发明所述的TaqMan探针并不局限于ABI公司设计合成的TaqMan探针，只要是针对本发明所述的hsa-let-7c，hsa-miR-23b，hsa-miR-122和hsa-miR-1504个microRNA序列合成的5’端含有荧光报告基团、3’端含有荧光淬灭基团(NFQ)和小构结合物(MGB)的，可用于上述4个microRNA定量检测的TaqMan探针都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种血清miRNA组合物，其特征在于该血清miRNA组合物由hsa-let-7c, hsa-miR-23b, hsa-miR-122及hsa-miR-150组成，或者由hsa-let-7c, hsa-miR-23b, hsa-miR-122组成。
2. 一种用于隐匿性乙型肝炎检测的TaqMan探针组合物，其特征在于该TaqMan探针组合物由hsa-let-7c, hsa-miR-23b, hsa-miR-122及hsa-miR-150 的TaqMan探针组成，或者由hsa-let-7c, hsa-miR-23b及hsa-miR-122的TaqMan探针组成。
3. 权利要求1所述的血清miRNA组合物在制备检测OBI的试剂或工具中的应用。
4. 权利要求2所述的TaqMan探针组合物在制备检测OBI的试剂或工具中的应用。
5. 一种用于隐匿性乙型肝炎检测的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含权利要求2所述的TaqMan探针组合。
6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还可以包括Taq酶、dNTP、氯化镁和不含Mg2+的PCR缓冲液。
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| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20130227 Termination date: 20161103 |