CN101353704B - 一种检测银屑病易感基因lce的试剂盒 - Google Patents
一种检测银屑病易感基因lce的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种检测银屑病易感基因的方法和试剂盒及LCE易感基因，检测方法为：基因组DNA的提取；PCR扩增反应；纯化反应；单碱基延伸反应；在质谱仪中进行扫描，扫描的结果LCE基因序列中rs4112788多态性位点为T，rs4085613多态性位点为A，rs4845454多态性位点为C，rs1886734多态性位点为T的试验者为银屑病易感性高者，试剂盒包括检测LCE基因序列的引物；PCR扩增酶；dNTP；单碱基延伸反应酶及相应的缓冲液。本发明的目的是提供与银屑病发病相关的SNP阳性位点，从而发现疾病的易感基因，为最终明确银屑病的发病机理以及进行有效防治、预后判断、新药研发等奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种疾病易感基因的检测方法及试剂盒，具体涉及一种检测银屑病LCE易感基因的方法及试剂盒。
背景技术
在皮肤病领域，银屑病(psoriasis)是一种常见的以红斑，鳞屑为主要表现的，最为常见的慢性复发性复杂疾病，被世界卫生组织列为20世纪人类皮肤病领域两大顽症之一，本病发病率在白种人中高达2％，而在中国人群中为0.123％，国内约有500万的个体罹患，并以每年净增10万病例的速度递增。银屑病该病俗称“牛皮癣”，易复发难根治并且迁延不愈，而且患者容易出现关节损害，造成运动障碍。随着社会经济的日益发展，皮肤病的危害越来越受到社会各界的关注，广大患者迫切需要得到有效的治疗。目前认为银屑病是遗传与环境相互作用的多基因病，其中遗传因素在银屑病的发病中起到重要作用。因此，银屑病易感基因的研究是阐明银屑病致病机理最重要的线索。
迄今为止，在复杂疾病及其复杂生理过程相关基因的识别和定位方面取得的成绩尚不明显。原因主要在于复杂疾病具有较强的遗传异质性，遗传模式的不确定性，环境和基因的交互作用的复杂性，辅以目前对于复杂疾病认识的局限性等。随着科技的进步，人们越来越认识到基因缺陷是许多复杂疾病产生的重要原因，人在遇到心理和社会环境压力时，那些携带疾病易感基因的人比不携带疾病易感基因的人更可能罹患银屑病。遗传因素还基本上得到家系、双生子及寄养子的流行病学调查结果的支持。在科技日益发展的今天，如何从遗传角度检测易感基因以及个体的疾病易感性，以至于进行进一步风险预测和诊断，成为广大皮肤科技人员和医疗卫生人员面临的严峻问题。尽管国内外疾病易感基因研究开展多年，但尚未取得突破性进展，鲜有价值的研究结果。对于怎样鉴定遗传易感基因以及鉴定试验者的遗传易感性，本领域一直缺乏全面、系统、有效的识别方法。
发明内容
本发明的目的是提供与银屑病发病相关的SNP阳性位点，从而发现疾病的易感基因，为最终明确银屑病的发病机理以及进行有效防治、预后判断、新药研发等奠定基础。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于检测银屑病易感性的方法，包括以下步骤实现：
(1)、基因组DNA的提取；
(2)、PCR扩增反应；
(3)、纯化反应；
(4)、单碱基延伸反应；
(5)、在质谱仪中进行扫描，扫描的结果LCE基因序列中rs4112788多态性位点为T，rs4085613多态性位点为A，rs4845454多态性位点为C，rs1886734多态性位点为T的试验者为银屑病易感性高者。
一种用于检测银屑病易感性的方法，所述PCR扩增反应中包括有rs4112788，rs4085613，rs4845454，rs1886734四对扩增多态性位点的引物。
一种用于检测银屑病易感性的方法，所述PCR扩增反应中退火温度为52～62度，延伸时间为30～90秒。
一种用于检测银屑病易感性的方法，所述单碱基延伸反应包括有rs4112788，rs4085613，rs4845454，rs1886734四条单碱基延伸多态性位点的引物。
一种用于检测银屑病易感性的方法，所述PCR扩增反应中退火温度为56度，延伸时间为60秒。
一种用于鉴定银屑病LCE基因序列中SNP分子标记的试剂盒，由以下试剂组成，保存温度为-20℃，包括：
(1)、检测LCE基因序列的引物；
(2)、PCR扩增酶，纯化PCR产物的纯化酶及相应缓冲液；
(3)、dNTP；
(4)、单碱基延伸反应酶及相应的缓冲液。
一种用于鉴定银屑病LCE基因序列中SNP分子标记的试剂盒，所述的检测基因序列的引物包括扩增基因序列多态性位点的引物，以及单碱基延伸基因序列多态性位点 的延伸引物。
一种用于鉴定银屑病LCE基因序列中SNP分子标记的试剂盒，所述的基因序列的分子标记为rs4112788，rs4085613，rs4845454和rs1886734。
一种用于鉴定银屑病LCE基因序列中SNP分子标记的试剂盒：所述的扩增rs4112788多态性位点的引物：
5’-ATGAGGATTACAGACAGCTGAGG-3’
5’-ACGTTGGATGGCAAGGCTGAAAACCTTTAG-3’
所述的扩增rs4085613多态性位点的引物：
5’-ACGTTGGATGCAGAGATTTTAGAAATCCTG-3’
5’-ACGTTGGATGTTTGAAAACGTCAAACTGCC-3’
所述的扩增rs4845454多态性位点的引物：
5’-ACGTTGGATGGCTCCAATCAACATCTGACG-3’
5’-ACGTTGGATGGGGTCACAAATTCAGAAAGG-3’
所述的扩增rs1886734多态性位点的引物：
5’-ACGTTGGATGCATAAGGAGCTTGCCCATC-3’
5’-ACGTTGGATGCATGCTTGGGAAGTACTTTT-3’。
一种用于鉴定银屑病LCE基因序列中SNP分子标记的试剂盒：所述的单碱基延伸rs4112788多态性位点的引物：
5’-TTGCCATGTTTTTCTTTACCC-3’
所述的单碱基延伸rs4085613多态性位点的引物：
5’-ATCCTGAGTTCTTAGACTT-3’
所述的单碱基延伸rs4845454多态性位点的引物：
5’-GACAAATGCATGAAATGAGAATT-3’
所述的单碱基延伸rs1886734多态性位点的引物：
5’-TGCCCATCCTTTTCCTT-3’。
本发明通过大样本的统计分析，研究了LCE基因序列的rs4112788，rs4085613，rs4845454和rs1886734多态性位点在银屑病核心家系的等位基因频率，并根据父母基因型在患病子女中的传递情况，进行传递不平衡检验(TDT)和单体型分析。结果发现，全部样本的基因型分布和等位基因频率均符合Hardy-Weinburg平衡；经过 Bonferroni法矫正后，四个多态性位点的TDT分析仍然有显著的统计学显著性；证明了LCE基因序列的易感性，其中，LCE基因序列中rs4112788多态性位点为T，rs4085613多态性位点为A，rs4845454多态性位点为C，rs1886734多态性位点为T的试验者为银屑病易感性高者。
本发明提供一种检测中国人群银屑病易感基因的方法和试剂盒，从而满足了本领域对于正确识别银屑病易感基因的需求，为银屑病的深入研究和防治，甚至诊断治疗提供了新的思路。本发明的优点：首次发现中国人群中存在LCE基因SNP标记，提供了一种高通量快速筛选分型此SNP标记的方法，直接应用于或构建单体型后应用于中国人群中开展银屑病的致病基因定位筛选，并可能运用于评价银屑病的个体患病风险，以利于开展银屑病的早期干预和治疗。
具体实施方式
1、研究对象
所有的研究对象均被2个以上的皮肤科专家诊断的、符合国际皮肤病诊断标准的中国汉族人患者，这些患者均接受了结构式临床访谈。
2、方法
2、1血液标本的采集及处理
所有患者和正常对照都抽取了外周静脉血5ml，置于0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，直接用于提取基因组DNA，或者-80℃冻存备用。
2、2基因组DNA的提取及鉴定
提取用基因组DNA抽提纯化试剂盒，方法如下：
(1)吸取1.0ml细胞裂解液(FG1)于做好标记的2.0ml离心管中，取400ul血样加入对应离心管，颠倒混匀20-30次，直到无血凝块出现，16,000g离心4分钟。
(2)小心倾倒上清，吸水纸沥干30秒后加入变性缓冲液/蛋白酶K(FG2/PK)溶液200ul，每加入一份需要立即震荡混匀，直到无细胞团块出现，待全部加完后仔细检查是否有裂解不完全样本。如有，应彻底震荡完全。
(3)短暂离心后，65℃水浴20分钟，水浴时需要将管口1/3左右留在液面以上，以防加热引起管盖打开，水分等杂质进入管内。
(4)短暂离心后，加入200ul异丙醇，上下颠倒数次，可见絮状DNA沉淀，如发现管内有黑绿色团块，一定要用力摇动，将团块摇成澄清液。
(5)16,000g离心4分钟，小心倾倒上清，吸水纸沥干30秒，可见管底有白色DNA沉淀。
(6)加入200ul70％乙醇，小心弹起片状沉淀，16,000g离心5分钟。
(7)小心倾倒上清，吸水纸沥干20分钟，加入110ul的水合缓冲液(FG3)，65℃水浴20分钟，摇床过夜，电泳和紫外分光光度计(NanodropSpectrophotometer，ND-1000)检测DNA质量，所有样本用FG1稀释成50ng/ml以备用。
2、3SNP检测实验
2.3.1PCR扩增反应
A、.配制0.5uM PCR引物池，包括相应重数的每一个阵列的F和R引物
B、按如下体系配制PCR Cocktail
| 试剂 | 浓度 | 1X |
| HPLC级别的水 | N/A | 1.75 |
| 含15mM MgCl2的10X PCR缓冲液 | 1.25x(1.875mM MgCl2) | 0.625 |
| 25mM MgCl2 | 1.625mM | 0.325 |
| 25mM dNTP混合液 | 500uM | 0.100 |
| 0.5uM SEQ ID No.5-12引物 | 0.1uM | 1.00 |
| 5U/μlHotStar DNA聚合酶 | 1Unit | 0.200 |
| 10ng/uL DNA | 10ng/rxn | 1.000 |
| 总体积[μL] | n/a | 5.000 |
C、加1ul10ng/ul DNA到一个新的384孔PCR板的每一个孔里(现称为样本板)。如果仪器和相应的方法可以使用的话，该步可以使用液体处理器。
加4ul的PCR Cocktai l到384孔PCR板里并且混匀。如果仪器和相应的方法可以使用的话，这一步可以使用液体处理器。当完成时，封住板子然后离心。
D、将384孔PCR板放到一个标准的PCR仪上并使用一下程序：
2.3.2SAP纯化实验
A、按照表三配制SAP混合液。
| 试剂 | 浓度 | 1X |
| 高压灭菌纯水 | n/a | 1.53 |
| SAP缓冲液 | 0.24x | 0.17 |
| SAP碱性磷酸酶(1.7U/ul) | 0.5U | 0.30 |
| 总体积[uL] | n/a | 2 |
B、吸取2ul SAP混合液到384孔PCR板。完成时，封板并离心。
C、按下表程序孵育：
37℃ 40min
85℃ 5min
4℃ ∞
2.3.3单碱基延伸反应
A、按照下列规则配制8/10/14uM iPLEX延伸引物混合池：
1)将多重反应除以3。
2)计算L0W Mass的寡核苷酸延伸引物终浓度为8uM
3)计算MEDIUM Mass的寡核苷酸延伸引物终浓度为10uM
4)计算HIGH Mass的寡核苷酸延伸引物终浓度为14uM
5)计算剩余水的体积
B、按照表三配制iPLEX延伸引物：
| 试剂 | 浓度 | 1X |
| 高压灭菌纯水 | N/A | 0.619 |
| iPLEX Buffer缓冲液 | 0.222X | 0.200 |
| iPLEX终止混合液 | 1X | 0.200 |
| iPLEX延伸引物混合液 | 0.84/1.04/1.25 | 0.940 |
| iPLEX延伸反应酶 | 1X | 0.041 |
| SAP+PCR混合液 | n/a | 7.000 |
| 总体积[uL] | n/a | 9.000 |
C、吸取2ul SAP混合液到384孔PCR板。完成时，封板并离心。
D、按下表程序孵育：
2.3.4树胶纯化
A、展开纯化树胶到一个384/6mg dimple板并且给最少10分钟的时间去干燥。
B、使用液体处理器加16ul水到384孔PCR板里。
C、加6mg纯化树胶到384孔PCR板里。旋转10分钟。
2.3.5点制芯片
在微量分液系统上进行点样体积优化来寻找样本的最优的点样速度。然后利用微量分液系统加样到SpectroCHIP上。
2.3.6MALDi TOF扫描和数据分析。扫描的结果LCE基因序列中rs4112788多态性位点为T，rs4085613多态性位点为A，rs4845454多态性位点为C，rs1886734多态性位点为T的试验者为银屑病易感性高者。
2.4统计学分析
作为质控的一部分，我们用plink软件对所有的分型样本进行IBD estimation，我们检查出具有潜在的亲缘关系样本对，并剔除其中call rate值低的样本。接下来通过两步对剩下的样本用主成分分析的方法进行人群分层估算，首先，所有的样本和206个hapmap样本(57个非洲样本，60个高加索样本，44个日本样本和45个中国样本)一起分析，有5个异常样本被剔除。然后我们又对所有样本进行主成分分析，在我们的样本中没有发现人群分层现象。经过SNP和样本质控后，我们对1144个病例和1141个对照的506685个SNP分型进行了全基因组关联分析。
我们进行了Cochran-Armitage trend检验，并计算了杂合和纯合OR值。我们用Q-Q图来估算全基因组关联分析的总体显著性和潜在的人群分层现象。我们画了剔除了MHC区域SNP的Q-Q图，图象显示观察到的p值并没有显示全基因组统计结果的膨胀。我们进一步计算了基因组控制的膨胀因子值很小，为1.09，所以所有报的统计结果并没有进行基因组控制校正。
验证分析首先在两个独立样本中进行，然后再把所有的样本用Cochran-MantelHanezel的方法联合起来分析。
结论：
从上述试验可以得出：LCE基因序列的rs4112788，rs4085613，rs4845454和rs1886734多态性位点影响银屑病的易感性，其中LCE基因序列中rs4112788多态性位点为T，rs4085613多态性位点为A，rs4845454多态性位点为C，rs1886734多态性位点为T为银屑病易感性高者。
其中体外检测银屑病易感基因的试剂盒为：
1)扩增多态性位点的引物
| 多态性位点 | 扩增引物序列(5’—3’) |
| rs4112788 | GAGGATTACAGACAGCTGAGG(SEQ ID No5) ACGTTGGATGGCAAGGCTGAAAACCTTTAG(SEQ ID No6) |
| rs4085613 | ACGTTGGATGCAGAGATTTTAGAAATCCTG(SEQ ID No7)ACGTTGGATGTTTGAAAACGTCAAACTGCC(SEQ ID No8) |
| rs4845454 | ACGTTGGATGGCTCCAATCAACATCTGACG(SEQ ID No9) ACGTTGGATGGGGTCACAAATTCAGAAAGG(SEQ ID No10) |
| rs1886734 | ACGTTGGATGCATAAGGAGCTTGCCCATC(SEQI DNo11) ACGTTGGATGCATGCTTGGGAAGTACTTTT(SEQ ID No12) |
2)PCR扩增酶，纯化PCR产物的纯化酶及相应缓冲液；
3)dNTP；
4)单碱基延伸rs4112788，rs4085613，rs4845454和rs1886734多态性位点的延伸引物；
| 多态性位点 | 延伸引物序列(5’—3’) |
| rs4112788 | TTGCCATGTTTTTCTTTACCC(SEQ ID No13) |
| rs4085613 | ATCCTGAGTTCTTAGACTT(SEQ ID No14) |
| rs4845454 | GACAAATGCATGAAATGAGAATT(SEQ ID No15) |
| rs1886734 | TGCCCATCCTTTTCCTT(SEQ ID No16) |
5)单碱基延伸反应酶及相应的缓冲液。
序列表
<110>安徽医科大学皮肤病研究所
<120>一种检测银屑病易感基因的方法和试剂盒及LCE易感基因
<160>16
<170>PatentIn Version3.1
<210>1
<211>252
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
<210>2
<211>252
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
<210>3
<211>252
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>3
<210>4
<211>252
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>4
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成
<400>7
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成
<400>8
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成
<400>9
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成
<400>10
<210>11
<211>29
<212>DNA
<213>人工合成
<400>11
<210>12
<211>30
<212>DNA
<213>人工合成
<400>12
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>13
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>14
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>15
<210>16
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成
<400>16
Claims (1)
1.一种用于鉴定银屑病LCE基因序列中SNP分子标记的试剂盒，其特征在于：由以下试剂组成，保存温度为-20℃，包括：
(1)、检测LCE基因序列的引物；
(2)、PCR扩增酶，纯化PCR产物的纯化酶及相应缓冲液；
(3)、dNTP；
(4)、单碱基延伸反应酶及相应的缓冲液；
所述的检测基因序列的引物包括扩增基因序列多态性位点的引物，以及单碱基延伸基因序列多态性位点的延伸引物；
所述的基因序列的分子标记为rs4112788，rs4085613，rs4845454和rs1886734；
其中，扩增rs4112788多态性位点的引物：
5’-ATGAGGATTACAGACAGCTGAGG-3’
5’-ACGTTGGATGGCAAGGCTGAAAACCTTTAG-3’
扩增rs4085613多态性位点的引物：
5’-ACGTTGGATGCAGAGATTTTAGAAATCCTG-3’
5’-ACGTTGGATGTTTGAAAACGTCAAACTGCC-3’
扩增rs4845454多态性位点的引物：
5’-ACGTTGGATGGCTCCAATCAACATCTGACG-3’
5’-ACGTTGGATGGGGTCACAAATTCAGAAAGG-3’
扩增rs1886734多态性位点的引物：
5’-ACGTTGGATGCATAAGGAGCTTGCCCATC-3’
5’-ACGTTGGATGCATGCTTGGGAAGTACTTTT-3’；
单碱基延伸rs4112788多态性位点的引物：
5’-TTGCCATGTTTTTCTTTACCC-3’
单碱基延伸rs4085613多态性位点的引物：
5’-ATCCTGAGTTCTTAGACTT-3’
单碱基延伸rs4845454多态性位点的引物：
5’-GACAAATGCATGAAATGAGAATT-3’
单碱基延伸rs1886734多态性位点的引物：
5’-TGCCCATCCTTTTCCTT-3’。
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| 范星等.银屑病易感基因最新研究进展.《国外医学皮肤性病学分册》.2005,第31卷(第6期),364-366. * |
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