CN103205505B - 一种诊断妊娠糖尿病的microRNA分子标志物及其检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于诊断妊娠糖尿病的miRNA分子标记物，其为hsa-miR-508-3p，其序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述miRNA分子标记物在妊娠糖尿病孕妇的胎盘组织中异常高表达，并通过组织的主动分泌过程分泌到血清中。本发明还提供了用于诊断妊娠糖尿病的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含用于检测血清中hsa-miR-508-3p水平的试剂，其中所述hsa-miR-508-3p的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
Description
技术领域：
本发明涉及一种诊断妊娠糖尿病的microRNA分子标志物及用于诊断妊娠糖尿病的试剂盒。
背景技术：
在妊娠中晚期，随着孕周的增加，孕妇体内抗胰岛素样物质(如：胎盘生乳素，雌激素、孕酮等)的分泌也不断升高，这直接导致了孕妇对于胰岛素的敏感性也随之下降，为了维持正常的糖代谢水平，胰岛素分泌量必须相应增加，对于那些胰岛素分泌受限的孕妇，由于不能正常代谢这一生理变化而最终导致血糖升高。我们将这种怀孕前未患有糖尿病，而在怀孕时才出现高血糖的临床症状称妊娠糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)，它是糖尿病的一种特殊类型。妊娠糖尿病是高危妊娠，严重危害了母儿的健康。如果对于妊娠糖尿病不加以任何治疗与控制，那么妊娠糖尿病患者的胎儿围产期死亡率则会大于40％。
随着人们生活水平的提高以及生育年龄的推迟等综合社会因素的影响，妊娠糖尿病的发病率正在急剧上升。最新的调查数据显示我国妊娠糖尿病患者的发病率已经达到了6.6％。虽然随着胰岛素的问世和围产医学的发展，妊娠糖尿病患者的胎儿围产期死亡率已经大大的降低了，但是妊娠糖尿病依然会带来许多不良的妊娠结局。其中，巨大儿(出生体重超过4000克的婴儿)的分娩就是妊娠糖尿病患者最主要的不良妊娠结局。巨大儿在分娩过程不仅自身面临的危险要比正常体重儿高，而且也容易对母体造成创伤。同时有研究资料显示，巨大儿中发生心脏畸形的比例要高于一般正常体重儿，并且在长大后患肥胖症的几率也会升高，将成为糖尿病、高血压等多种疾病的易患人群。
众所周知，在孕妇妊娠期间，胎盘是一个重要的器官，是连接母婴生命的桥梁。对胎盘结构与功能的研究是认识母体疾病对胚胎影响的关键环节。在过去的一段时间里，研究者们已经对于“为何妊娠糖尿病患者分娩巨大儿的几率会明显增高”这一科学问题已经进行了初步的探讨，普遍的观点认为，母体的高血糖环境会诱导胎盘中某些生长因子异常表达，最终导致巨大儿的产生。microRNAs(miRNAs)是一类由大约22个核苷酸组成的单链非编码的小分子RNA，这类小分子广泛的存在于动植物中并承担了重要的生物学功能。miRNAs主要是通过在后转录水平上对基因的表达调控来实现其相应的生物学功能的，在很多疾病的发生和发展过程中扮演了极其重要的角色，其不但可以成为预测某些疾病发生的分子标志物而且还有可能成为治疗某些疾病的分子靶点。越来越多的研究证据已经表明miRNA作为一种调控因子在糖尿病以及糖尿病的并发症中均扮演了重要的角色。有研究结果表明，血清中的miRNA分子是由组织中的miRNA主动分泌而获得的，因此，分析组织中miRNA的表达谱对血清中的miRNA筛选也具有指导意义。
对妊娠糖尿病的诊断可以尽早的对患者的饮食和生活规律进行科学的调控，必要时，还可以对患有妊娠糖尿病的孕妇使用胰岛素进行治疗，所有这些措施，都为了将孕妇的血糖调控在合适的生理范围内，降低巨大儿产生的机率，提高我国的人口质量。目前，对于妊娠糖尿病的诊断只能依靠“糖耐量”检测进行，这种检测手段需要连续4次对孕妇吸取静脉血进行，给孕妇带来了一定的痛苦。因此研发一种可以减轻孕妇痛苦，并可以准确预测或者诊断妊娠糖尿病的分子标志物至关重要。本发明提供了一种miRNA分子作为妊娠糖尿病预测或诊断的分子标志物，通过现代生物学技术检测微量血清样品中这种分子标志物的表达水平来诊断妊娠糖尿病具有重要意义。
发明内容
首先，本发明提供一种可用于诊断妊娠糖尿病的miRNA分子标记物。本发明提供的用于诊断妊娠糖尿病的miRNA为hsa-miR-508-3p(简称miR-508)，其序列为：5’-UGAUUGUAGCCUUUUGGAGUAGA-3’(SEQ ID NO：1)。本发明提供的miRNA分子在妊娠糖尿病孕妇的胎盘组织中异常高表达，并可以通过组织的主动分泌过程分泌到血清中。本发明提供的miRNA可用作妊娠糖尿病诊断的主要标志物。
本发明还提供所述RNA的编码分子，其序列为DNA：5’-TGATTGTAGCCTTTTGGAGTAGA-3’(SEQ ID NO：2)。
本发明还提供了所述miRNA分子标记物在诊断妊娠糖尿病中的应用。其中，胎盘中miRNA分子水平过高显示受试者患有妊娠糖尿病。
另一方面，本发明提供了用于诊断妊娠糖尿病的试剂盒，其中该试剂盒包含用于检测血清中hsa-miR-508-3p水平的试剂。在一个优选的实施方案中，该诊断试剂盒为实时定量PCR检测试剂盒。在一个更优选的实施方案中，该试剂盒包含实时定量PCR引物，其序列为5’-TGATTGTAGCCTTTTGGAGTAGA-3’(SEQ ID NO：2)
在再一方面，本发明提供了用于实时定量PCR检测血清中hsa-miR-508-3p水平的引物，其序列为5’-TGATTGTAGCCTTTTGGAGTAGA-3’(SEQ ID NO：2)。本发明还提供了如SEQID NO：2所示的引物在制备用于诊断妊娠糖尿病的试剂盒中的用途。
附图说明：
图1妊娠糖尿病孕妇以及正常对照孕妇胎盘中miRNA的表达分析。
图2妊娠糖尿病孕妇以及正常对照孕妇血清中miRNA的表达分析。
具体的实施方式
以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所有的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、芯片法分析妊娠糖尿病孕妇胎盘中miRNA表达谱变化。
取妊娠糖尿病患者胎盘20例，取正常孕妇胎盘20例作为对照。按照下述方法提取组织RNA。
①取新鲜胎盘样品，将20例混合，液氮冷冻，用研钵研磨至组织成粉末状(研磨过程中用液氮保持样品处于低温状态)，在1ml的TRIZOL中加入取适量样品粉末，室温放置1h。
②在TRIZOL中加入三氯甲烷200μl，剧烈震荡后，静置2min，4℃，12000rpm，离心15min。
③去上清，在上清液中加入等体积的异丙醇，剧烈震荡后，室温静置10min，4℃，12000rpm，离心10min。
④弃上清，将沉淀放置在通风处，晾干。
⑤加入10μlDEPC水65℃促溶。
将提取的RNA进行miRNA的表达芯片分析，结果见表1。由表1中发现，hsa-miR-508-3p在妊娠糖尿病样本中和正常样本中表达具有显著差异，所述hsa-miR-508-3p的序列如序列表序列1所示，其序列为：5’-UGAUUGUAGCCUUUUGGAGUAGA-3’(SEQ ID NO：1)。所述hsa-miR-508-3p的编码序列如序列表中序列2所示，其序列为：5’-TGATTGTAGCCTTTTGGAGTAGA-3’(SEQ ID NO：2)。
表1、芯片筛选妊娠糖尿病患者胎盘中miRNA表达谱的变化
实施例2用real-time PCR技术验证芯片的结果
分别取妊娠糖尿病患者胎盘18例，取正常孕妇胎盘18例作为对照。按照下述方法提取组织RNA。
①取新鲜胎盘样品，液氮冷冻，用研钵研磨至组织成粉末状(研磨过程中用液氮保持样品处于低温状态)，在1ml的TRIZOL中加入取适量样品粉末，室温放置1h。
②在TRIZOL中加入三氯甲烷200μl，剧烈震荡后，静置2min，4℃，12000rpm，离心15min。
③去上清，在上清液中加入等体积的异丙醇，剧烈震荡后，室温静置10min，4℃，12000rpm，离心10min。
④弃上清，将沉淀放置在通风处，晾干。
⑤加入10μl DEPC水65℃促溶。
分别将提取的RNA分子进行反转录获得cDNA(采用“天根”公司的反转录试剂盒miRcutemiRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR201)进行反转录)。
将提取的cDNA作为模板进行real-time PCR检测，其中采用的引物序列为：5’-TGATTGTAGCCTTTTGGAGTAGA-3’(SEQ ID NO：2)，进行荧光定量检测(使用“天根”公司的荧光定量检测试剂盒，miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(FP401)进行)。结果如表2所示：
表2real-time PCR检测妊娠糖尿病孕妇胎盘中hsa-miR-508-3p的表达水平
*表2中，“0”表示正常孕妇，“1”表示患有妊娠糖尿病(GDM)。
经SPASS软件进行统计分析，hsa-miR-508-3p在妊娠糖尿病(GDM)和正常对照组中的表达水平具有显著差异(P＜0.05)，结果如图1所示。
由此可以确定，hsa-miR-508-3p在妊娠糖尿病孕妇胎盘中存在显著差异，可以作为妊娠糖尿病的检测分子标记。
实施例3用real-time PCR技术检测孕妇血清中miR-508的表达水平
分别取妊娠糖尿病患者血清18例，取正常孕妇血清18例作为对照。按照下述方法提取RNA。
①取新鲜血清样品500ul，在血清中加入500ul的TRIZOL，剧烈震荡30s，室温放置5min。
②在TRIZOL中加入200ul异丙醇，颠倒混匀，剧烈震荡2min，直至液体透明，室温静置5min。
③4℃，12000rpm，离心10min，将上清液移至新的eppendorf管中。
④在上清中加入500ul三氯甲烷，颠倒混匀，剧烈震荡1min，室温静置5min。
⑤4℃，12000rpm，离心10min，将上清液移至新的eppendorf管中。
⑥加入0.75倍体积的异丙醇至上清中，混匀，室温静置10min。
⑦4℃，12000rpm，离心10min，沉淀RNA，吸弃上清。
⑧沉淀用75％的乙醇洗涤1次，4℃，7500rpm，离心5min，沉淀RNA，晾干。
⑨加入10μl DEPC水65℃促溶。
分别将提取的RNA分子进行反转录获得cDNA(采用“天根”公司的反转录试剂盒miRcutemiRNAcDNA第一链合成试剂盒(KR201)进行反转录)。
将提取的cDNA作为模板进行real-time PCR检测，其中采用的引物序列为：5’-TGATTGTAGCCTTTTGGAGTAGA-3’(SEQ ID NO：2)，进行荧光定量检测(使用“天根”公司的荧光定量检测试剂盒，miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒(FP401)进行)。结果如表3所示：
表3real-time PCR检测妊娠糖尿病孕妇血清中hsa-miR-508-3p的表达水平
*表3中，“0”表示正常孕妇，“1”表示患有妊娠糖尿病(GDM)。
经SPASS软件进行统计分析，hsa-miR-508-3p在妊娠糖尿病(GDM)和正常对照组中的表达水平具有显著差异(P＜0.05)，结果如图2所示。
由此可以确定，hsa-miR-508-3p在妊娠糖尿病孕妇血清中存在显著差异，可以作为妊娠糖尿病的检测分子标记。
Claims (2)
1.用于特异性检测血清中hsa-miR-508-3p水平的试剂在制备用于诊断妊娠糖尿病的试剂盒中的用途，其中所述特异性检测血清中hsa-miR-508-3p水平的试剂包含序列如SEQ ID NO：2所示的实时定量PCR检测引物。
2.序列如SEQ ID NO：2所示的PCR检测引物在制备用于诊断妊娠糖尿病的试剂盒中的用途。
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