CN103038645A - 用于妊娠的高血压疾病的生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本申请披露了用于妊娠的高血压疾病、尤其是先兆子痫的新的生物标志物;基于测量所述生物标志物来诊断、预测、预后和/或监测所述疾病的方法;以及用于测量所述生物标志物和/或进行所述方法的试剂盒和装置。
Description
技术领域
本发明涉及生物标志物(生物标志),特别是基于蛋白和/或肽的生物标志物,其可用于受试者(主体,对象)的疾病和病症的诊断、预测、预后和/或监测,尤其是妊娠的高血压疾病(高血压性障碍),更特别是先兆子痫;以及涉及相关的方法、用途、试剂盒和装置。
背景技术
在许多疾病和病症中,预防性和/或治疗性治疗的有利的结果强烈地与疾病或病症的早期和/或准确预测、诊断、预后和/或监测相关。因此,持续需要用于疾病和病症的早期和/或准确预测、诊断、预后和/或监测的另外的和优选改善的方式来指导治疗方法的选择。
在妊娠期间发生的高血压疾病是全世界产妇的发病率和死亡率的主要原因,并且还伴随增加的围产期死亡率。
在妊娠的高血压疾病中的显著位置属于先兆子痫(PE),其在约5%至10%的怀孕女性中会发生(Solomon & Seely 2006,Endocrinol Metab ClinNorth Am 35(1):157-71,vii)。
PE可以被描述为在以前血压正常怀孕女性中在20周妊娠以后的新发作高血压和蛋白尿,其可以是轻度或严重的。患有轻度疾病的患者显示>140/90的血压和具有>300mg蛋白的蛋白尿(在20周妊娠以后的24小时尿中注意到),并且通常近期助产而没有显著的复合病变。然而,约25%的PE倾向于是严重的,涉及中枢神经系统功能障碍的症状和体征、肝细胞损伤、减少的尿输出和显著升高的血压(收缩压>160mmHg或舒张压>110mmHg)。严重的PE通常发生在最后第二个和早期第三个三个月并且伴随增加的产妇和围产期发病率和死亡率。
PE的严重并发症包括1)HELLP综合征,其特征在于溶血、升高的肝酶和低血小板,和2)子痫,其特征在于癫痫发作的发展。鉴于上述两种病症均是罕见的,它们与较差的预后相关(Solomon & Seely 2006,在上文中)。
先兆子痫还与胎儿并发症如宫内发育迟缓(IUGR)和小孕龄(SGA)相关。
用于PE的仅有的疗法是婴儿和胎盘的分娩。超过37周的妊娠,可以保证分娩。在小于34周的孕龄,高血压的治疗和严密的胎儿监视可以防止脑血管意外和延长妊娠,而没有治愈潜在的疾病过程。还保证分娩,以发展严重的PE或子痫(Sibai & Barton 2007,Am J Obstet Gynecol 196(6):514.e1-9)。
PE的病因学和病理生理学仍然很大程度上未解决并且它的诊断目前完全是基于在疾病展开以后的临床标准(Roberts et al.2003,Hypertension41(3):37-45)。然而,最近的数据表明,导致PE的事件可以早在第一三个月就潜在地开始和进展。
因而,对于妊娠的高血压疾病(尤其包括PE)的成功的治疗干预,可靠和早期预测和/或诊断是关键的。因此,仍然是最重要的是,提供用于妊娠的高血压疾病的诊断、预测、预后和/或监测的另外的、可替换的和优选改善的标记和工具。
用来预测PE的发展的临床上有用的筛选试验是稀少的(Conde-Agudelo et al.2004,Obstet Gynecol 104:1367-91)。依赖于危险因子也是不够标准的,因为(虽然已确定了PE的许多危险因子)50%以上的病例以其他方式发生于年轻的、低风险的、未经产女性。因此,妊娠的高血压疾病并且尤其是PE在它们的发作和疾病进展方面很大程度上仍是不可预测的。
最近的报告表明,血管活性胎盘肽的不平衡,更具体地说可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1,sVEGFR-1)(Maynard et al.2003,J Clin Invest 111(5):649-58)、内皮糖蛋白(Levine et al.2006,N Engl J Med 355:992-1005)、胎盘生长因子(PIGF)和血管内皮生长因子(VEGF)(Polliottiet al.2003;Obstet Gynecol 101:1266-74),可以用于先兆子痫的早期预测。尤其是,sFlt-1和内皮糖蛋白是在发展PE以前约2-3个月过量产生的抗血管生成肽。PIGF和VEGF是促血管生成肽,其显示在随后发展严重PE的女性的第二三个月产妇血清中被减少。
授权给Proteogenix Inc.的WO2009/097584A1和授权给AucklandUniservices Ltd的WO2009/108073A1还披露了PE生物标志物。
通过确定用于妊娠的高血压疾病(尤其用于先兆子痫)的生物标志物,本发明解决了本领域中的上述需要,并提供了其应用。
发明内容
通过进行大量的实验和测试,本发明的发明人确定了33种生物标志物,其水平可以密切预测和/或指示妊娠的高血压疾病,更具体地说,先兆子痫。为了简明起见,在整个本说明书中,妊娠的一种或多种高血压疾病和先兆子痫此后分别缩写为HDP和PE。
尤其是,利用1)在妊娠的22周和26周获自10位孕妇(病例)(其将发展临床上明显的PE,如自妊娠的28周或以后)的样品,和2)在妊娠的22周和26周获自孕妇(对照)(其将在她们的妊娠期间不会发展PE)的样品,本发明的发明人认识到,在所述样品中以下基于蛋白和/或肽的标记(标志物,标志)的量显示PE的行为预测和/或指示:胰岛素样生长因子-结合蛋白复合物酸不稳定链(ALS)、包含分解素和金属蛋白酶域的蛋白12(ADA12)、血管生成素(ANG1)、钙蛋白酶-1催化亚单位(CAN1)、巨噬细胞集落刺激因子1受体(CSF1R)、C-反应蛋白(CRP)、绒毛膜生长催乳激素(CSH)、营养不良蛋白聚糖(DAG1)、二肽酶2(DPEP2)、桥粒芯蛋白-2(DSG2)、细胞外基质蛋白质1(ECM1)、内皮糖蛋白(EGLN)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员2(ENPP2)、扣针蛋白-1(FBLN1)、原纤蛋白-2(FBN2)、疑似G蛋白偶联受体126(GP126)、肝细胞生长因子样蛋白(HGFL)、细胞间粘附分子3(ICAM3)、转移抑制基因KiSS-1(KISS1)、亮氨酰-胱氨酰氨基肽酶(亮氨酰-半胱氨酰氨基肽酶)(LCAP)、磷脂酰胆碱-甾醇酰基转移酶(LCAT)、基底膜-特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白(基底膜-特异性硫酸类肝素蛋白多糖核心蛋白)(PGBM)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(PGRP2)、磷脂酰肌醇-聚糖-特异性磷脂酶D(PHLD)、过氧化物还原酶(过氧化物酶,过氧化还原酶)1(PRDX1)、过氧化物还原酶2(PRDX2)、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶S(PTPRS)、回旋同系物(环形交叉同系物)4(ROBO4)、蛋白S100-A9(S10A9)、血清淀粉样A-4蛋白(SAA4)、腱生蛋白-X(TENX)、三叶因子3(TFF3)、血管内皮生长因子受体3(VGFR3)。这些蛋白可以分别由IGFALS、ADAM12、ANG、CAPN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENG、ENPP2、FBLN1、FBN2、GPR126、MST1、ICAM3、KISS1、LNPEP、LCAT、HSPG2、PGLYRP2、GPLD1、PRDX1/2、PTPRS、ROBO4、S100A9、SAA4、TNXB、TFF3和FLT4基因来编码。
因此,提供了ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3的任何一种或多种作为生物标志物的用途,更特别地作为用于HDP的生物标志物,甚至更特别地作为用于所述HDP的诊断、预测、预后和/或监测的生物标志物。优选地,所述HDP疾病(障碍)是PE。
还提供了ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3中的任何一种或多种用于HDP的诊断、预测、预后和/或监测的用途。优选地,所述HDP障碍是PE。
另外提供了用于在受试者中诊断、预测、预后和/或监测HDP的方法,该方法包括在来自所述受试者的样品中测量ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3的任何一种或多种的水平。优选地,所述HDP疾病(障碍)是PE。
如在整个本说明书中所使用的,在来自受试者的样品中测量任何一种或多种生物标志物的水平尤其可以表示,方法的检查阶段包括在来自受试者的样品中测量所述一种或多种生物标志物的量。应当理解,用于诊断、预测、预后和/或监测疾病和病症的方法通常包括检查阶段,其中数据收集自和/或关于受试者。
在一种实施方式中,用于在受试者中诊断、预测和/或预后HDP如优选PE的方法包括以下步骤:(i)在来自受试者的样品中测量任何一种或多种标记(标志物)的量,上述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;(ii)比较在(i)中测得的一种或多种标记的量与所述一种或多种标记的量的参比值(参考值),所述参比值表示HDP的已知的诊断、预测和/或预后;(iii)发现在(i)中测得的一种或多种标记的量与参比值的偏差或没有偏差;以及(iv)将偏差或没有偏差的所述发现归因于在受试者中HDP的特定的诊断、预测和/或预后。
用于诊断、预测和/或预后HDP如优选PE的方法,以及尤其是在前面段落中阐述的包括步骤(i)至(iv)的方法,可以在两个或更多连续时间点用于受试者并可以比较在所述连续时间点的各自的结果,借此可以确定在所述连续时间点处在HDP的诊断、预测和/或预后之间是否发生变化。因而该方法便于随着时间的推移在受试者中监测HDP的诊断、预测和/或预后的变化。
在妊娠和/或产后期间,如本文教导的生物标志物的量可以变化。因此,为了改善本文教导的应用和方法的诊断、预测和/或预后的可靠性,使在检查的受试者中在妊娠或产后的给定年龄测得的给定标记的量优选与在妊娠或产后的基本上相同的年龄下建立的所述标记的量的参比值进行比较(例如,在+/-约3周内,优选在+/-约2周内,更优选在+/-约1周内,还更优选在+/-约0.5周内。)
也应理解,当在妊娠或产后期间在一个或多于一个时间点加以评估时,给定标记可以显示其诊断、预测和/或预后值。例如,当基本上遍及妊娠和/或产后加以评估时,或仅当在部分妊娠期内(例如,在第一、第二和/或第三三个月内)或产后加以评估时,或仅当在妊娠的一个或多个可比短时间内或产后(例如,在约10、8、6、4或2周内)加以评估时,标记可以是有用的信息。在本文中,所有这样的标记是有用的和合适的。
因而,与参比值(其表示没有HDP如优选没有PE(即,健康状态)的预测或诊断或表示HDP如优选PE的良好预后)相比,在来自受试者的样品中,选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何一种或多种标记的提高量或减少量(即,偏差)可以分别表示,受试者具有或可能有具有HDP的危险或表示在受试者中HDP的较差预后(如,例如,PE将恶化或进展到HELLP综合征或子痫的预后)。
通过仅实例而非限制性的方式,与参比值(其表示没有HDP如优选没有PE(即,健康状态)的预测或诊断或表示HDP如优选PE的良好预后)相比,在来自受试者的样品中,(a)选自由ALS、ADA12、CRP、CSH、DAG1、ENPP2、GP126、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PHLD、PRDX1和/或PRDX2、S10A9、SAA4和TFF3组成的组中的任何一种或多种标记的提高量(即,偏差)和/或(b)选自由ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、FBLN1、FBN2、HGFL、ICAM3、LCAP、PGBM、PGRP2、PTPRS、ROBO4、TENX和VGFR3组成的组中的任何一种或多种标记的减少量(即,偏差)可以分别表示受试者具有或可能有具有HDP的危险或表示在受试者中HDP的较差预后(如,例如,PE将恶化或进展到HELLP综合征或子痫的预后)。
如实验所表示的,和在以下实施方式中反映的,通过仅实例而非限制性的方式,优选地在怀孕人类女性中:
-相对于参比值,选自由ALS、CRP、ENPP2、GP126、KISS1、LCAT、PHLD、PRDX1和/或PRDX2、S10A9、SAA4和TFF3组成的组中的标记的量的提高可以在妊娠的约15到约23或24周之间加以评估,更优选在妊娠的约18到约23或24周之间,甚至更优选在妊娠的约20到约23或24周之间,以及最优选在妊娠的约22周;和/或
-相对于参比值,选自由ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、FBLN1、FBN2、HGFL、ICAM3、LCAP、PGBM、PGRP2、PTPRS、ROBO4、TENX和VGFR3组成的组中的标记的量的减少可以在妊娠的约15到约23或24周之间加以评估,更优选在妊娠的约18到约23或24周之间,甚至更优选在妊娠的约20到约23或24周之间,以及最优选在妊娠的约22周;和/或
-相对于参比值,选自由ALS、ADA12、CRP、CSH、DAG1、ENPP2、GP126、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PHLD、PRDX1、和/或PRDX2、S10A9、SAA4和TFF3组成的组中的标记的量的提高可以在妊娠的约24或25到约37周之间加以评估,更优选在妊娠的约24或25到约34周之间,甚至更优选在妊娠的约24或25到约30周之间,还更优选在妊娠的约24或25到约28周之间,以及最优选在妊娠的约26周;和/或
-相对于参比值,选自由ANGI、CAN1、CSF1R、DPEP2、DSG2、ECM1、FBLN1、FBN2、HGFL、PGBM、PGRP2、PTPRS、ROBO4、TENX和VGFR3组成的组中的标记的量的减少可以在妊娠的约24或25到约37周之间加以评估,更优选在妊娠的约24或25到约34周之间,甚至更优选在妊娠的约24或25到约30周之间,还更优选在妊娠的约24或25到约28周之间,以及最优选在妊娠的约26周。
本发明的用于HDP和优选PE的诊断、预测、预后和/或监测的方法还可以评估在受试者中的如本文教导的两种或更多种生物标志物。可以分开和独立地评估每种如此测量的生物标志物,或可以按照所述两种或更多种生物标志物的量来产生生物标志物分布。
因此,还披露了用于在受试者中HDP如优选PE的诊断、预测和/或预后的方法,该方法包括以下步骤:(i)在来自受试者的样品中,测量任何两种或更多种标记的量,上述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;(ii)利用(i)的测量结果来建立两种或更多种标记的量的受试者分布;(iii)比较(ii)的所述受试者分布与所述两种或更多种标记的量的参比分布(参考分布),所述参比分布表示HDP的已知的诊断、预测和/或预后;(iv)发现(ii)的受试者分布与参比分布的偏差或没有偏差;(v)将偏差或没有偏差的所述发现归因于HDP的特定的诊断、预测和/或预后。
在两个或更多连续时间点应用上述方法可以便于监测HDP。
在妊娠和/或产后期间,如本文教导的生物标志物的量可以变化。因而,为了改善本文教导的应用和方法的诊断、预测和/或预后的可靠性,在检查的受试者中,将在妊娠或产后的给定年龄建立的两种或更多种标记的量的受试者分布优选与在妊娠或产后的基本上相同的年龄建立的所述两种或更多种标记的量的参比分布进行比较(例如,在+/-约3周内,优选在+/-约2周内,更优选在+/-约1周内,还更优选在+/-约0.5周内)。
也应理解,当在妊娠或产后期间在一个或多于一个时间点加以评估时,给定标记分布可以显示它的诊断、预测和/或预后价值。例如,当基本上遍及妊娠和/或产后加以评估时,或仅当在部分妊娠期内(例如,在第一、第二和/或第三三个月内)或产后加以评估时,或仅当在妊娠的一个或多个可比短时间内或产后(例如,在约10、8、6、4或2周内)加以评估时,标记分布可以是有用的信息。在本文中,所有这样的标记分布和构成标记是有用的和合适的。
因此,相比于参比分布,其表示没有HDP如优选没有PE(即,健康状态)的预测或诊断或表示HDP如优选PE的良好预后,利用在来自受试者的样品中如本文教导的两种或更多种标记的测量的量建立的并且包括任何一种或多种标记(其选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组)的提高量或减少量(即,偏差)的生物标志物分布可以分别表示受试者具有或可能有具有HDP的危险或表示在受试者中HDP的较差预后(如,例如,PE将恶化或进展到HELLP综合征或子痫的预后)。
通过仅实例而非限制性的方式,相比于参比分布,其表示没有HDP如优选没有PE(即,健康状态)的预测或诊断或表示HDP如优选PE的良好预后,利用在来自受试者的样品中如本文教导的两种或更多种标记的测量量建立的并且包括(a)任何一种或多种标记(其选自由ALS、ADA12、CRP、CSH、DAG1、ENPP2、GP126、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PHLD、PRDX1和/或PRDX2、S10A9、SAA4和组成的组)的提高量(即,偏差)和/或(b)任何一种或多种标记(其选自由ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、FBLN1、FBN2、HGFL、ICAM3、LCAP、PGBM、PGRP2、PTPRS、ROBO4、TENX和VGFR3组成的组)的减少量(即,偏差)的生物标志物分布可以分别表示受试者具有或可能有具有HDP的危险或表示在受试者中HDP的较差预后(如,例如,PE将恶化或进展到HELLP综合征或子痫的预后)。
如实验所表示的、以及在以下实施方式中反映的,通过仅实例而非限制性的方式,优选地在怀孕人类女性中:
-相对于参比分布,包括选自由ALS、CRP、ENPP2、GP126、KISS1、LCAT、PHLD、PRDX1和/或PRDX2、S10A9、SAA4和TFF3组成的组中的标记的量的提高的生物标志物分布可以在妊娠的约15到约23或24周之间加以评估,更优选在妊娠的约18到约23或24周之间,甚至更优选在妊娠的约20到约23或24周之间,以及最优选在妊娠的约22周;和/或
-相对于参比分布,包括选自由ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、FBLN1、FBN2、HGFL、ICAM3、LCAP、PGBM、PGRP2、PTPRS、ROBO4、TENX和VGFR3组成的组中的标记的量的减少的生物标志物分布可以在妊娠的约15到约23或24周之间加以评估,更优选在妊娠的约18到约23或24周之间,甚至更优选在妊娠的约20到约23或24周之间,以及最优选在妊娠的约22周;和/或
-相对于参比分布,包括选自由ALS、ADA12、CRP、CSH、DAG1、ENPP2、GP126、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PHLD、PRDX1、和/或PRDX2、S10A9、SAA4和TFF3组成的组中的标记的量的提高的生物标志物分布可以在妊娠的约24或25到约37周之间加以评估,更优选在妊娠的约24或25到约34周之间,甚至更优选在妊娠的约24或25到约30周之间,还更优选在妊娠的约24或25到约28周之间,以及最优选在妊娠的约26周;和/或
-相对于参比分布,包括选自由ANGI、CAN1、CSF1R、DPEP2、DSG2、ECM1、FBLN1、FBN2、HGFL、PGBM、PGRP2、PTPRS、ROBO4、TENX和VGFR3组成的组中的标记的量的减少的生物标志物分布可以在妊娠的约24或25到约37周之间加以评估,更优选在妊娠的约24或25到约34周之间,甚至更优选在妊娠的约24或25到约30周之间,还更优选在妊娠的约24或25到约28周之间,以及最优选在妊娠的约26周。
在一种实施方式中,用于监测HDP如优选PE(或用于监测发展HDP如优选PE的可能性)的方法包括以下步骤:(i)在来自受试者的样品中从两个或更多连续时间点测量任何一种或多种标记的量,上述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;(ii)在如在(i)中测量的样品之间比较一种或多种标记的量;(iii)在如在(ii)中比较的样品之间发现(确定)一种或多种标记的量的偏差或没有偏差;以及(iv)将偏差或没有偏差的所述发现归因于在受试者中在两个或更多连续时间点之间HDP的变化(或归因于发展HDP的可能性的变化)。因而上述方法便于在受试者中随着时间的推移监测HDP或发展HDP的风险。
在另一种实施方式中,用于监测HDP如优选PE(或用于监测发展HDP如优选PE的可能性)的方法包括以下步骤:(i)在来自受试者的样品中从两个或更多连续时间点测量任何两种或更多种标记的量,上述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;(ii)利用(i)的测量结果来建立在两个或更多连续时间点处两种或更多种标记的量的受试者分布;(iii)比较如在(ii)中建立的受试者分布;(iv)发现在如在(iii)中比较的受试者分布之间的偏差或没有偏差;以及(v)将偏差或没有偏差的所述发现归因于在受试者中在两个或更多连续时间点之间HDP的变化(或归因于发展HDP的可能性的变化)。因此上述方法便于在受试者中随着时间的推移监测HDP或发展HDP的风险。
非限制性地,这样的连续时间点可以相隔约2周以上,优选相隔约4周以上,例如,相隔约6或8周,或还优选相隔约10周以上,例如,相隔约12周或15周。
在整个本披露内容中,用于监测如本文教导的任何一种疾病或病症的方法特别可以便于预测疾病或病症的发生,或监测疾病或病症的进展、加重、缓解或复发、或对治疗或对其它外部或内部因素、情况或应激物的反应等。有利地,如本文教导的监测方法可以应用于受试者的医疗过程,优选旨在减轻如此监测的疾病或病症的医疗。例如,在患者是否可以出院、需要治疗的变化或需要进一步住院治疗的决策中,可以包括这样的监测。如本文中使用的,提及疾病或病症的监测还特别包括受试者发展疾病或病症的可能性、风险或机会的监测,即,随着时间的推移监测所述可能性、风险或机会的变化。
类似地,在整个本披露内容中,用于如本文教导的任何一种疾病或病症的预测或预后的方法特别可以便于预测或预后疾病或病症的发生,或预测或预后疾病或病症的进展、加重、缓解或复发,或对治疗或对其它外部或内部因素、情况或应激物的反应等。
本发明的发明人进一步认识到,在妊娠或产后期间,在连续时间点处如本文教导的生物标志物的评估还可以便于HDP并且优选PE的诊断、预测和/或预后。例如,在所述连续时间点处标记的量之间的差异偏离在相应时间点处在将不发展HDP或PE的妇女中测得的所述标记的量之间的差异的情况下,这样的偏差可以表示受试者具有或可能有发展HDP或PE的危险。
因此,还提供了用于在受试者中诊断、预测和/或预后HDP如优选PE的方法,该方法包括以下步骤:(i)在来自受试者并来自第一时间点的样品中测量任何一种或多种标记的量,上述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;(ii)在来自受试者并来自连续的第二时间点的样品中测量所述一种或多种标记的量;(iii)计算在如在(i)和(ii)中测得的所述一种或多种标记的量之间的差异;(iv)比较如在(iii)中计算的差异与在所述第一和第二时间点处所述一种或多种标记的量之间的差异的参比值,所述参比值表示HDP的已知的诊断、预测和/或预后;(v)发现如在(iii)中计算的差异与参比值的偏差或没有偏差;以及(iv)将偏差或没有偏差的所述发现归因于在受试者中HDP的特定的诊断、预测和/或预后。
还披露了用于在受试者中诊断、预测和/或预后HDP如优选PE的方法,该方法包括以下步骤:(i)在来自受试者并来自第一时间点的样品中测量任何两种或更多种标记的量,上述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;(ii)利用(i)的测量结果来建立在所述第一时间点处两种或更多种标记的量的受试者分布;(iii)在来自受试者并来自连续的第二时间点的样品中测量所述两种或更多种标记的量;(iv)利用的(iii)的测量结果来建立在所述第二时间点处两种或更多种标记的量的受试者分布;(v)计算如在(ii)和(iv)中建立的受试者分布之间的差异;(vi)比较如在(v)中计算的差异与在所述第一和第二时间点处所述两种或更多种标记的量之间的差异的参比分布,所述参比分布表示HDP的已知的诊断、预测和/或预后;(vii)发现如在(v)中计算的差异与参比分布的偏差或没有偏差;以及(viii)将偏差或没有偏差的所述发现归因于在受试者中HDP的特定的诊断、预测和/或预后。
例如,在所述第一和第二时间点处在受试者中测得的给定标记的量之间计算的差异(Ds)偏离如在正常妊娠中观测到的相应差异(DN)的情况下,上述偏差可以表明,受试者具有或可能有具有HDP如PE的危险。非限制性地,偏差可以是明显的,其中Ds>DN或其中Ds<DN或其中Ds>0而DN<0,或其中Ds<0而DN>0。上述差异可以适当表示为算术运算,如,例如,减法或除法(例如,斜率、比率)。
非限制性地,这样的连续时间点可以是相隔约2周以上,优选相隔约4周以上,例如,相隔约6或8周,或还优选相隔约10周以上,例如,相隔约12周或15周。
同样非限制性地,第一时间点可以是在妊娠的约15到约23或24周之间,优选在妊娠的约18到约23或24周之间,更优选在妊娠的约20到约23或24周之间,甚至更优选在妊娠的约22周。第二时间点可以是在妊娠的约24或25到约37周之间,优选在妊娠的约24或25到约34周之间,更优选在妊娠约24或25到约30周的之间,还更优选在妊娠的约24或25到约28周之间,以及甚至更优选在妊娠的约26周。
还披露了用来确定受试者是否(如,例如,仍然、或不再)需要HDP如优选PE的治疗性或预防性治疗的方法,该方法包括:(i)在来自受试者的样品中测量任何一种或多种标记的量,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;(ii)比较在(i)中测得的一种或多种标记的量与所述一种或多种标记的量的参比值,所述参比值表示HDP的已知的诊断、预测和/或预后;(iii)发现在(i)中测得的一种或多种标记的量与所述参比值的偏差或没有偏差;(iv)根据所述发现,推断是否需要HDP如优选PE的治疗性或预防性治疗。
还披露了用来确定受试者是否(如,例如,仍然、或不再)需要HDP如优选PE的治疗性或预防性治疗的方法,该方法包括:(i)在来自受试者的样品中测量任何两种或更多种标记的量,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;(ii)利用(i)的测量结果来建立两种或更多种标记的量的受试者分布;(iii)比较(ii)的所述受试者分布与所述两种或更多种标记的量的参比分布,所述参比分布表示HDP的已知的诊断、预测和/或预后;(iv)发现(ii)的受试者分布与参比分布的偏差或没有偏差;(v)根据所述发现,推断是否需要HDP如优选PE的治疗性或预防性治疗。
在上述方法便于得出结论受试者:具有或可能有具有HDP的危险或具有HDP的较差预后的情况下,可以特别指定一种治疗。非限制性地,可以测试(如本文教导的)入院以后或在留在医疗保健中心期间的具有HDP的患者继续所述HDP的治疗的必要性,并且当不再需要或仅在有限程度上需要这样的治疗时,则可以出院。HDP如PE的示例性的治疗和预防性治疗包括但不限于抗高血压治疗(特别使用β-阻断剂、钙通道阻断剂、血管舒张剂和/或DOPA脱羧酶抑制剂,如,例如,甲基多巴、拉贝洛尔、醋丁洛尔、美托洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、硝苯地平、伊拉地平和/或肼屈嗪、和/或MgS04治疗)、流产、和分娩如通过引产或剖腹产手术。
涉及如本文教导的一种或多种生物标志物的评估的应用和方法可以主要用于妊娠或产后胎生动物女性受试者。优选地,所述受试者是哺乳动物,更优选人。
涉及如本文教导的一种或多种生物标志物的评估的应用和方法可以优选用于妊娠或产后人类女性受试者,如从妊娠的任何年龄并可达约产后12周,如但不限于:
-其中,妊娠的人类女性受试者是妊娠约5或更多周,或妊娠约10或更多周,或优选妊娠约15或更多周,或更优选妊娠约20或更多周,例如,妊娠约21、22、23或24周,或甚至更优选妊娠约25或更多周,例如,妊娠约26、27、28或29周;和/或
-其中,妊娠的人类女性受试者是妊娠约40或更少周,例如,妊娠约39或38周,或妊娠约37或更少周,例如,妊娠约36或35周,或妊娠约34或更少周,例如,妊娠约33、32、31或30周;和/或
-其中,妊娠的人类女性受试者是妊娠约10周至约40周,优选妊娠约15周至约37周,或还优选妊娠约20周至34周;或
-其中,产后人类女性受试者是产后约12周或更少周,例如,产后约11或10周,或产后约9周或更少周,例如,产后约8或7周,或产后约6周或更少周,例如,产后约5或4周,或产后约3周或更少周,例如,产后约2或1周。
另外,本发明的实施例表明,如本文教导的生物标志物便于在怀孕女性(当评估生物标志物时,其尚未患有临床上明显的HDP或PE)中预测HDP和优选PE的潜在(即,未来或即将)发生。
因而,涉及如本文教导的一种或多种生物标志物的评估的应用和方法可以在受试者中,尤其是在没有临床上明显的(即,有效的)HDP或PE的受试者中优选用来预测HDP和优选PE。这样的预测可以优选指明被测受试者将发展临床上明显的HDP或PE的可能性、机会或风险,例如在一定的时间段内或在妊娠或产后的给定年龄。
例如,涉及如本文教导的一种或多种生物标志物的评估的应用和方法,以及尤其是用来预测HDP和优选PE的应用和方法,可以用于妊娠的人类女性受试者,其中妊娠的人类女性受试者优选为:
-妊娠约37或更少周,例如,妊娠约36或35周,或妊娠约34或更少周,例如,妊娠约33、32或31周,或妊娠约30或更少周,例如,妊娠约29、28或27周,或优选妊娠约26或更少周,例如,妊娠约25、24或23周,或更优选妊娠约22或更少周,例如,妊娠约21周,或还优选妊娠约20或更少周,例如,妊娠约19、18、17或16周,或还优选妊娠约15或更少周,例如,妊娠约14、13、12、11或10周;和/或
-妊娠约10周至约37周,优选妊娠约15周至约34周,更优选妊娠约20至约30周,甚至更优选妊娠约22至约26周;以及
其中,妊娠的人类女性受试者优选并不具有有效的HDP或PE,例如受试者并不表现便于诊断HDP或PE的临床症状和体征。
另外披露了如本文教导的应用和方法,借此,可以预测发作的孕龄或产后年龄和/或到HDP如优选PE的发作的剩余时间。这样的应用和方法可以有利地比较生物标志物量或分布与参比值或参比分布,其表示HDP的发作的已知的孕龄或产后年龄和/或到HDP的发作的已知的剩余时间。在这方面,选自HGFL、PTPRS、ROBO4和VGFR3的任何一种或多种标记可以是特别有用的。
另外披露了如本文教导的应用和方法,借此,上述方法便于区别具有或具有患有早期发作先兆子痫的风险(即,妊娠<34周的临床表现)、早产PE(即,妊娠>34并<37周的临床表现)、以及足月PE(即,妊娠≥37周的临床表现)的受试者。
因而,还披露了,本发明的应用和方法用于HDP的诊断、预测、预后和/或监测,其中HDP是早期发作PE或早产PE或足月PE。
在已知或预期具有发展HDP或PE的风险的受试者中,利用本文披露的标记用于HDP和优选PE可以是特别有用的。非限制性地,与HDP和优选PE有关的危险因子包括未经产、多次妊娠、在妊娠之间延长的时间间隔、在先前妊娠中HDP或PE的历史或HDP或PE的家族史、极端的年龄(<20岁和>40岁)、肥胖、慢性高血压、慢性肾病、偏头痛、头痛、(妊娠)糖尿病、多囊卵巢综合征、自身免疫病如狼疮、类风湿性关节炎、结节病或MS、血管或结缔组织疾病、维生素D缺乏、抗磷脂抗体综合征或遗传性易栓症、以前的伙伴具有HDP或PE的男性伴侣、胎儿水肿和不明原因的胎儿宫内生长受限。
因而,本发明的诊断、预测、预后和/或监测方法可以优选用于具有一种或多种上述危险因子的受试者和受试者群体。在一种实施方式中,本发明的诊断、预测、预后和/或监测方法可以优选进一步包括在受试者中确定HDP如优选PE的一种或多种危险因子的存在或不存在和/或水平。
如本文教导的任何一种预测、诊断、预后和/或监测应用或方法可以优选便于至少50%的敏感性和/或特异性(优选地,敏感性和特异性),至少60%,至少70%或至少80%,例如,≥85%或≥90%或≥95%,例如,约80%至100%或约85%至95%。
在整个本说明书中提及“疾病和/或病症”涵盖如本文披露的任何这样的疾病和病症,只要符合特定详述的上下文,更具体但非限制性地包括妊娠的高血压疾病(HDP)并优选先兆子痫(PE)。
本文教导的用于疾病和病症的诊断、预测、预后和/或监测的应用和方法可以用于还没有被诊断为患有上述疾病和病症(例如,预防性筛查)的受试者,或已被诊断为患有上述疾病和病症的受试者,或被怀疑患有上述疾病和病症(例如,显示一种或多种特征性体征和/或症状)的受试者,或具有发展上述疾病和病症的风险(例如,遗传易感性;一种或多种发展、环境或行为危险因子的存在)的受试者。上述应用和方法还可以用来检测疾病和病症的进展的不同阶段或严重性。上述应用和方法还可以用来检测疾病和病症对预防性或治疗性治疗或其它干预措施的反应。上述应用和方法可以另外用来帮助医生基于受试者的疾病和病症的恶化、维持现状、部分恢复、或完全恢复,来决定进一步治疗或观察或患者从医疗保健中心出院。
此外,本文教导的用于疾病和病症的诊断、预测、预后和/或监测的应用和方法可以用于群体筛查,如,例如,一般群体的筛查或基于一个或多个标准划分的群体的筛查,例如,年龄、血统、职业、相应疾病和病症的危险因子的存在或不存在,等。
在本文教导的用于疾病和病症(尤其是HDP和优选PE)的预测、诊断、预后和/或监测的应用和方法中,选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何一种或多种标记的测量结果可以结合于与相应疾病和病症有关的一种或多种另外生物标志物或临床参数的评估。
因而,还提供了如上文教导的在受试者中用于HDP如优选PE的诊断、预测、预后和/或监测的方法,其进一步包括在来自受试者的样品中测量一种或多种上述其它标记的存在或不存在和/或水平。特别提供了这样的方法,其中方法的检查阶段进一步包括在来自受试者的样品中测量一种或多种上述其它标记的存在或不存在和/或量。可以使用任何已知或未知的适宜标记。
在整个本说明书中,"其它(生物)标记"通常是指包括这样的其它标记,其可用于如本文披露的疾病和病症的诊断、预测、预后和/或监测。通过实施而不是限制性的方式,可用于评估HDP和优选PE的生物标志物包括可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1,sVEGFR-1)(Maynard et al.2003,上文)、内皮糖蛋白(Levine et al.2006,上文)、胎盘生长因子(PIGF)和血管内皮生长因子(VEGF)(Polliotti et al.2003,上文)。另外的生物标志物可以包括那些生物标志物,它们披露在授权给Proteogenix Inc.的WO2009/097584A1和授权给Auckland Uniservices Ltd.的WO2009/108073A1中,其以引用方式结合于本文。
应当理解,可以各自分开和独立地评估上述其它生物标志物的存在或不存在和/或量,或可以将上述其它生物标志物的存在或不存在和/或量包括在用本文披露的方法建立的受试者分布或参比分布内。
可以按照先前用于其它生物标志物的已知程序来建立如本文采用的参比值。可以在如本文教导的方法以内(即,构成一步骤)或以外(即,不构成一步骤)来建立上述参比值。因此,本文教导的任何一种方法可以包括建立如本文教导的一种或多种标记的量的参比值的步骤,所述参比值表示(a)如本文教导的疾病或病症的不存在或其良好预后的预测或诊断,或(b)如本文教导的疾病或病症或其较差预后的预测或诊断。
另一方面提供了用于建立用于任何一种或多种标记的量的参比值的方法,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组,所述参比值表示:
(a)如本文教导的疾病或病症的不存在或其良好预后的预测或诊断,或
(b)如本文教导的疾病或病症或其较差预后的预测或诊断,
所述方法包括:
(i)在以下样品中测量所述一种或多种标记的量:
(ia)来自不患有相应疾病或病症或不具有患有相应疾病或病症的风险或具有相应疾病或病症的良好预后的一个或多个受试者的一个或多个样品,或
(ib)来自患有相应疾病或病症或具有患有上述相应疾病或病症的风险或具有上述相应疾病或病症的较差预后的一个或多个受试者的一个或多个样品,以及
(ii)存储所述一种或多种标记的量:
(iia)如在(ia)中测得的作为参比值,其表示不存在相应疾病或病症的预测或诊断,或表示其良好预后,或
(iib)如在(ib)中测得的作为参比值,其表示相应疾病或病症的预测或诊断,或表示其较差预后。
本发明的方法可以以其他方式采用任何一种、两种或更多种标记的量的参比分布,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组,以及可选地一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量,其可以按照先前用于其它生物标志物的已知程序来建立。可以在本发明的方法以内(即,构成一步骤)或以外(即,不构成一步骤)来建立上述参比分布。因此,本文教导的方法可以包括以下步骤:建立如本文教导的任何一种、任何两种或更多种标记的量的参比分布,以及可选地一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量,所述参比分布表示(a)因此不存在如本文教导的疾病或病症或其良好预后的预测或诊断,或因此(b)如本文教导的疾病或病症或其较差预后的预测或诊断。
另一方面提供了一种用于建立用于任何一种、两种或更多种标记的量的参比分布的方法,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组,以及可选地可用于如本文教导的疾病或病症的诊断、预测、预后和/或监测的一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量,所述参比分布表示:
(a)相应疾病或病症的不存在或因此其良好预后的预测或诊断,或
(b)相应疾病或病症或因此其较差预后的预测或诊断,
所述方法包括:
(i)在以下样品中,测量如本文教导的所述一种、两种或更多种标记的量以及所述一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量:
(ia)来自不患有相应疾病或病症或不具有患有上述相应疾病或病症的风险或具有上述相应疾病或病症的良好预后的一个或多个受试者的一个或多个样品;或
(ib)来自患有相应疾病或病症或具有患有上述相应疾病或病症的风险或具有上述相应疾病或病症的较差预后的一个或多个受试者的一个或多个样品;
(ii)
(iia)利用(ia)的测量结果来产生如本文教导的所述一种、两种或更多种标记的量的分布以及所述一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量;或
(iib)利用(ib)的测量结果来产生如本文教导的所述一种、两种或更多种标记的量的分布,以及所述一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量;
(iii)
(iiia)将(iia)的分布存储为参比分布,其表示不存在相应疾病或病症的预测或诊断或因此表示其良好预后;或
(iiib)将(iib)的分布存储为参比分布,其表示相应疾病或病症的预测或诊断或因此表示其较差预后。
另外提供了用于在受试者中建立基线或参比值的方法,该方法包括:(i)在来自受试者并来自不同时间点的样品中测量任何一种或多种标记的量,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组,其中受试者并不患有如本文教导的疾病或病症,以及(ii)计算受试者的范围或平均值,其是用于所述受试者的基线或参比值。可以通过任何适宜的技术如可以是本领域已知的技术来测量任何一种或多种标记的量和/或一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组。
例如,可以采用能够特异性地结合于各自的生物标志物和/或其片段的结合剂(binding agents)。结合剂特别可以是抗体、适体、光适体、蛋白质、肽、肽模拟物或小分子。例如,可以采用免疫检测技术或质谱分析法或色谱法、或所述方法的组合。
另外披露了用于在受试者中诊断、预测、预后和/或监测如本文教导的疾病或病症的试剂盒,该试剂盒包括(i)装置,该装置用于在来自受试者的样品中测量任何一种或多种标记的量,上述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组,以及可选地和优选地(ii)所述一种或多种标记的量的参比值或用于建立所述参比值的装置,其中所述参比值表示相应疾病或病症的已知的诊断、预测和/或预后。该试剂盒因而便于:通过装置(i),在来自受试者的样品中测量所述一种或多种标记的量;比较通过装置(i)测得的所述一种或多种标记的量与(ii)的或通过装置(ii)建立的参比值;发现通过装置(i)测得的所述一种或多种标记的量与(ii)的参比值的偏差或没有偏差;因此将偏差或没有偏差的所述发现归因于在受试者中相应疾病或病症的特定的诊断、预测和/或预后。
另一种实施方式提供了用于在受试者中诊断、预测、预后和/或监测如本文教导的疾病或病症的试剂盒,该试剂盒包括(i)装置,该装置用于在来自受试者的样品中测量任何一种、两种或更多种标记的量,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组,和(ii)可选地,用于在来自受试者的样品中测量一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量的装置,和可选地并优选地(iii)装置,该装置用于建立如本文教导的所述一种、两种或更多种生物标志物的量的受试者分布和可选地所述一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量,以及可选地并优选地(iv)如本文教导的所述一种、两种或更多种生物标志物的量的参比分布和可选地所述一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量,或用于建立所述参比分布的装置,所述参比分布表示相应疾病或病症的已知的诊断、预测和/或预后。因而这样的试剂盒便于:在来自受试者的样品中,分别通过装置(i)和(ii)来测量任何一种、两种或更多种标记的量,和可选地一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;基于所述测量结果,建立(例如,利用包括在试剂盒中的装置或利用适宜的外部装置)如本文教导的所述一种、两种或更多种标记的量的受试者分布和所述一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量;比较受试者分布与(iv)的或通过装置(iv)建立的参比分布;发现所述受试者分布与所述参比分布的偏差或没有偏差;以及因此将偏差或没有偏差的所述发现归因于在受试者中的相应疾病或病症的特定的诊断、预测和/或预后。
在本发明的试剂盒中的用于测量任何一种或多种标记(其选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组)的量和/或一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量的装置可以分别包括能够特异性地结合于如本文教导的所述一种或多种标记和/或其片段的一种或多种结合剂,和能够特异性地结合于所述一种或多种其它生物标志物的一种或多种结合剂。结合剂特别可以是抗体、适体、光适体、蛋白质、肽、肽模拟物或小分子。可以有利地将结合剂固定在固相或载体上。本发明的试剂盒可以采用免疫检测技术或质谱分析技术或色谱技术、或所述技术的组合。
因此还披露了用于诊断、预测、预后和/或监测如本文教导的疾病或病症的试剂盒,该试剂盒包括:(a)能够特异性地结合于任何一种或多种标记和/或其片段的一种或多种结合剂,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;(b)优选地,已知量或浓度的任何一种或多种选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组的标记和/或其片段(例如,用作对照、标准和/或校准物);(c)优选地,所述一种或多种标记的量的参比值,或用于建立所述参比值的装置。如在本说明书中其它地方教导的,可以适当地标记在(a)和/或(c)中的所述成分。
还披露了用于诊断、预测和/或预后如本文教导的疾病或病症的试剂盒,该试剂盒包括:(a)能够特异性地结合于任何一种、两种或更多种标记和/或其片段的一种或多种结合剂,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;(b)可选地,能够特异性地结合于一种或多种其它生物标志物的一种或多种结合剂;(c)优选地,已知量或浓度的任何一种或多种标记和/或其片段,以及可选地,已知量或浓度的所述一种或多种其它生物标志物(例如,用作对照、标准和/或校准物),所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;(d)优选地,如本文教导的所述一种、两种或更多种标记的量的参比分布,和可选地,所述一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量,或用于建立所述参比分布的装置。如在本说明书中其它地方教导的,可以适当地标记在.(a)、(b)和/或(c)下的所述成分。
另外披露了如在本文中描述的试剂盒用于诊断、预测、预后和/或监测如本文教导的疾病或病症的应用。
还披露了可用于测量任何一种或多种标记和可选地本文关注的一种或多种其它生物标志物的试剂和工具,上述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组。
因此,披露了蛋白、多肽或肽阵列或微阵列,其包括(a)任何一种或多种标记和/或其片段,上述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组,优选已知量或浓度的所述一种或多种标记和/或其片段;以及(b)可选地并优选地,一种或多种其它生物标志物,优选已知量或浓度的所述一种或多种其它生物标志物。
还披露了结合剂阵列(binding agent array)或微阵列,其包括:(a)能够特异性地结合于任何一种或多种标记和/或其片段的一种或多种结合剂,上述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组,优选已知量或浓度的所述结合剂;以及(b)可选地并优选地,能够特异性地结合于一种或多种其它生物标志物的一种或多种结合剂,优选已知量或浓度的所述结合剂。
还披露了如上文教导的试剂盒,其被构造为便携式装置,如,例如,床侧装置,用于家里或临床设置。
因而一个相关方面提供了能够在来自受试者的样品中测量任何一种或多种选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组的标记和/或其片段的量的便携式测试装置,该便携式测试装置包括:(i)用于从受试者获得样品的装置,(ii)用于在所述样品中测量所述一种或多种标记和/或片段的量的装置,以及(iii)用于可视化在样品中测得的所述一种或多种标记和/或片段的量的装置。
在一种实施方式中,部分(ii)和(iii)的装置可以是相同的,从而提供了能够在来自受试者的样品中测量所述一种或多种标记和/或其片段的量的便携式测试装置,该便携式测试装置包括(i)用于从受试者获得样品的装置;以及(ii)这样的装置,其用于在所述样品中测量所述一种或多种标记和/或其片段的量以及用于可视化在样品中测得的所述一种或多种标记和/或片段的量。
在一种实施方式中,所述可视化装置能够指示在样品中所述一种或多种标记和/或片段的量是高于或低于一定的阈值水平,和/或在样品中所述一种或多种标记和/或片段的量是否偏离所述一种或多种标记和/或片段的量的参比值,所述参比值表示如本文教导的疾病或病症的已知的诊断、预测和/或预后。因此,便携式测试装置还可以适当地包括所述参比值或用于建立参比值的装置。
在一种实施方式中,选择阈值水平,使得在样品中高于或低于(取决于标记和疾病或病症)所述阈值水平的所述一种或多种标记和/或片段的量表明,受试者具有或可能有具有相应疾病或病症的危险,或表明,在受试者中上述相应疾病或病症的较差预后,并且在样品中低于或高于(取决于标记和疾病或病症)所述阈值水平的所述一种或多种标记和/或片段的量表明,受试者并不具有或并不具有患有如本文教导的疾病或病症的风险,或表明在受试者中上述疾病或病症的良好预后。
在一种实施方式中,便携式测试装置包括参比值(参考值),该参比值表示不存在如本文教导的疾病或病症的预测或诊断或表示上述疾病或病症的良好预后,或包括用于建立所述参比值的装置,以及与所述参比值相比,在来自受试者的样品中,任何一种或多种选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组的标记和/或其片段的升高或降低(取决于标记和疾病或病症)的量表明受试者具有或可能有患有相应疾病或病症的危险或表明在受试者中对于上述相应疾病或病症的较差预后。在另一种实施方式中,便携式测试装置包括参比值,该参比值表示如本文教导的疾病或病症的预测或诊断或表示对于上述疾病或病症的较差预后,或包括用于建立所述参比值的装置,以及与所述参比值相比,在来自受试者的样品中,如本文教导的所述一种或多种标记和/或片段的可比量表明受试者具有或可能有患有相应疾病或病症的危险或表明在受试者中对于上述相应疾病或病症的较差预后。
在另一种实施方式中,便携式测试装置的测量(和可选地可视化)装置可以包括具有近端和远端的载体(实心载体,solid support),包括:在近端附近的样品施加区;在样品施加区的远侧的反应区;和在反应区的远侧的检测区;可选的对照标准,该对照标准包括任何一种或多种选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的标记和/或其片段,借此所述载体具有毛细管性能,其引导在施加区中施加的流体样品在从近端到远端的方向上流动;以及可选地包括流体源,以改善更粘稠样品的毛细管流动。
反应区可以包括特异性结合分子的一个或多个带(bands),用于结合于检测剂的任何一种或多种标记(其选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组)和/或其片段,将上述特异性结合分子结合物(conjugate)设置在载体上,使得它可以连同流体的毛细管流动一起迁移;并且其中检测区包括一个或多个捕捉带(capture bands),该捕捉带包括固定在载体上的标记特异性分子的群体。
反应区可以另外包括足够量的捕捉特异性结合分子的一个或多个带,用于任何一种或多种标记(其选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS 1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组)和/或其片段,以防止阈值量的标记特异性结合分子结合物迁移到检测区。可替换地,所述装置另外包括用于比较捕获的标记特异性结合分子结合物的量与阈值的装置。
其它方面涉及以下认识:在如本文教导的疾病和病症,尤其是但非限制性地包括HDP和优选PE中,本文披露的标记可以是用于治疗性和/或预防性干预的有价值的靶。
因此,本文还披露了以下任何之一和全部:
(1)一种药剂(试剂,agent),该药剂能够调节选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何一种或多种核酸或蛋白质的水平和/或活性,其用作药物,优选用于如本文教导的任何一种疾病或病症的治疗;
(2)一种药剂在制造用于治疗如本文教导的任何一种疾病或病症的药物中的应用,所述药剂能够调节如上文在(1)中定义的所述一种或多种核酸或蛋白质的水平和/或活性;或一种制剂在用于治疗如本文教导的任何一种疾病或病症中的应用,所述药剂能够调节如上文在(1)中定义的所述一种或多种核酸或蛋白质的水平和/或活性;
(3)用于在需要治疗的受试者中治疗如本文教导的任何一种疾病或病症的方法,该方法包括将治疗或预防有效量的药剂给予所述受试者,所述药剂能够调节如上文在(1)中定义的所述一种或多种核酸或蛋白质的水平和/或活性;
(4)如在上文(1)至(3)的任何之一中阐述的主题,其中所述药剂能够降低或增加如上文在(1)中定义的所述一种或多种核酸或蛋白质的水平和/或活性;
(5)如在上文(1)至(4)的任何之一中阐述的主题,其中所述药剂能够特异性地结合于如上文在(1)中定义的所述一种或多种核酸或蛋白质;
(6)如在上文(1)至(5)的任何之一中阐述的主题,其中所述药剂是抗体或其片段或衍生物;多肽;肽;肽模拟物;适体;光适体;或化学物质,优选有机分子,更优选小有机分子;
(7)如在上文(1)至(4)的任何之一中阐述的主题,其中所述药剂能够减少或抑制如上文在(1)中定义的所述一种或多种核酸或蛋白质的表达,优选其中所述药剂是反义药剂、核酶、或能够引起RNA干扰的药剂;
(8)如在上文(1)至(4)的任何之一中阐述的主题,其中所述药剂能够减少或抑制如上文在(1)中定义的所述一种或多种核酸或蛋白质的水平和/或活性,优选地其中所述药剂是如上文在(1)中定义的所述一种或多种蛋白质的重组或分离的缺失构造物、相对于如上文在(1)中定义的一种或多种天然蛋白质具有显性负活性的多肽;
(9)一种测定(分析,assay),用来从一组测试药剂选择潜在地可用于治疗如本文教导的任何一种疾病或病症的候选药剂,所述测定包括确定测试药剂是否可以调节,如增加或减少并且优选减少如上文在(1)中定义的所述一种或多种核酸或蛋白质的水平和/或活性;
(10)如在上文(9)中阐述的测定,进一步包括使用所选的候选药剂来制备用于给予的组合物,以及在非人类动物模型,优选非人类哺乳动物模型中,监测其对于如本文教导的任何一种疾病或病症的预防和/或治疗效果;
(11)通过如在上文(10)中阐述的测定加以分离的药剂;
(12)一种药物组合物或配方,其包含预防和/或治疗有效量的如在上文(1)至(8)或(10)的任何之一中阐述的一种或多种药剂、或其药用N-氧化物形式、加成盐、前药或溶剂化物,并且进一步包含一种或多种药用载体;
(13)一种用于生产如在上文(12)中阐述的药物组合物或配方的方法,该方法包括混合所述一种或多种药剂与所述一种或多种药用载体。
如在上文(1)至(13)的任何之一中阐述的所述病症或疾病可以尤其选自HDP且优选PE。
因此还设想了一种方法(筛选测定),用于选择能够特异性地结合于选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何一种或多种核酸或蛋白质的药剂(例如,核酸如基因、或蛋白质),所述方法包括:(a)提供一种或多种,优选多种,测试结合剂;(b)从(a)的测试结合剂中选择那些结合于所述一种或多种核酸或蛋白质的测试结合剂;以及(c)从在(b)中选择的测试结合剂反选择(即,除去)那些结合于任何一种或多种其它的、意外或不希望的靶的测试结合剂。
可以通过在通常有利于这样的结合的条件下使所述一种或多种核酸或蛋白质与测试结合剂接触(即,结合、暴露或温育)来有利地测试在测试结合剂和所述一种或多种核酸或蛋白质之间的结合。例如并且非限制性地,可以适当地体外测试在测试结合剂和所述一种或多种核酸或蛋白质之间的结合;或可以在包含所述一种或多种核酸或蛋白质的宿主细胞或宿主生物体中进行测试并暴露于或配置成表达测试结合剂。
非限制性地,结合或调节剂能够体外、在细胞中、在器官中和/或在生物体中结合所述一种或多种核酸或蛋白质或调节所述一种或多种核酸或蛋白质的活性和/或水平。
在如在上文(9)和(10)的任何之一中阐述的筛选测定中,由测试调节剂对所述一种或多种核酸或蛋白质的活性和/或水平的调节可以有利地通过在通常有利于上述调节的条件下使所述一种或多种核酸或蛋白质(例如,基因或蛋白质)与测试调节剂接触(即,结合、暴露或温育)来测试。通过实施而不是限制性的方式,在所述一种或多种核酸或蛋白质的活性和/或水平的调节来自测试调节剂与所述一种或多种核酸或蛋白质的结合的情况下,所述条件可以通常有利于这样的结合。例如和非限制性地,由测试调节剂对所述一种或多种核酸或蛋白质的活性和/或水平的调节可以适当地在体外测试,或可以在包含所述一种或多种核酸或蛋白质并暴露于或被配置成表达测试调节剂的宿主细胞或宿主生物体中加以测试。
还设想:
-ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3中的任何一种或多种(例如,核酸如基因、或多肽或蛋白质)用作药物,优选用于治疗如本文教导的任何一种疾病或病症;
-所述一种或多种核酸或蛋白质在制造用于治疗如本文教导的任何一种疾病或病症的药物中的应用;
-所述一种或多种核酸或蛋白质用于治疗如本文教导的任何一种疾病或病症的应用;
-用于在需要上述治疗的受试者中治疗如本文教导的任何一种疾病或病症的方法,该方法包括给予所述受试者治疗或预防有效量的所述一种或多种核酸或蛋白质;
特别地,其中所述病症或疾病可以选自HDP且优选PE。
在本文披露的方面和实施方式中,如应用、方法、试剂盒、装置、试剂等,任何一种或多种标记、核酸或蛋白质可以以进一步优选的替换方式选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、ICAM3、KISS1、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PTPRS、ROBO4、S10A9、TENX、TFF3组成的组。
在又一进一步优选的替换方式中,尤其是在方面和实施方式涉及先兆子痫(PE)的情况下,任何一种或多种标记、核酸或蛋白质可以选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、TENX、TFF3组成的组。本发明的上述和另外的方面和优选实施方式描述在以下部分和所附权利要求中。所附权利要求1至26的主题由此具体地结合在本说明书。
附图说明
图1至11示出了在22周和26周孕龄时在病例(即,在妊娠期间以后将发展PE的妇女)与对照(即,在妊娠期间以后将不发展PE的妇女)中各自标记的量的箱须图。
图12和13示出了在病例中各自标记的量(Y轴)和到PE的发作(显示/诊断)的时间(X轴)之间的相关性。
图14是根据本发明的测试条的平面图(A)和侧面图(B)。
图15是根据本发明的测试盒的平面图。
图16A-B分别示出了与许多测试垫相比,根据本发明的试剂条的侧面图和顶视图。
图17示出了病例和对照的群体。◇妊娠22周:获得第一血浆样品;
具体实施方式
如本文中所使用的,除非上下文另外明确指出,否则“一个”、“一种”、和“该”的单数形式包括单数和复数指称。
如本文中所使用的,术语“包含”、“包括”和“由.....组成”与“包括”、或“含有”是同义的,并且是包容性的或开放式的并且并不排除另外的、非列举成员、要素或方法步骤。该术语还涵盖“由.....组成”和“基本上由.....组成”。
通过端点的数值范围的列举包括归入相应范围的所有数目和分数、以及列举的端点。
如本文中所使用的,当提及可测量值如参数、量、持续时间等时,术语“约”是指包括与指定值的变化,尤其是+/-10%或更小的变化,优选+/-5%或更小,更优选+/-1%或更小,以及还更优选+/-0.1%或更小,只要在所披露的发明中这样的变化适合于进行。可以理解的是,还具体和优选地披露了修饰语“约”涉及的数值本身。
而术语“一个或多个(一种或多种)”,如成员组的一个或多个成员,是本身明确的,通过进一步列举,该术语特别包括提及所述成员的任何一个,或所述成员的任何两个或更多个,如,例如,任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等的所述成员,并且可达所有所述成员。
在本说明书中引用的所有文献的全部内容以引用方式结合于本文。
除非另有规定,否则在披露本发明时所使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有如由本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导,可以包括术语定义以更好地理解本发明的教导。
本发明的发明人认识到,ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3中的任何一种或多种是尤其用于妊娠的高血压疾病(HDP)如优选先兆子痫(PE)的有价值的生物标志物。
术语“生物标志物”在本领域中是普遍的并且可以广泛地表示生物分子和/或其可检测部分,相对于受试者的表型和/或基因型的一个或多个方面,在受试者中它的定性和/或定量评估是预测或信息性的(例如,预测、诊断和/或预后性的),如,例如,相对于受试者的关于给定疾病或病症的状态。优选地,如本文中使用的,生物标志物是基于肽、多肽和/或蛋白质的。本文中可互换使用术语"生物标志物"和"标记"。
本文中提及“如本文教导的疾病和/或病症”或类似提及涵盖如本文披露的任何这样的疾病和病症,只要符合这样的列举的上下文,尤其是但非限制性地包括妊娠的高血压疾病且优选先兆子痫。
妊娠的高血压疾病(HDP)包括与在妊娠期间和/或产后(例如,可达产后12周)高血压有关的疾病和病症的异类集合。
HDP可以方便地分类如下:
I.由妊娠诱导的高血压
a.没有蛋白尿或(普遍的)水肿
b.具有蛋白尿或(普遍的)水肿(即,先兆子痫)
i.轻度
ii.严重
c.子痫
II.同步高血压(慢性高血压)
III.妊娠恶化的高血压(妊娠加重高血压)
a.叠加先兆子痫
b.叠加子痫
最近的研究可以不再将PE分类为轻度或严重的,而是可以基于妊娠时间来确定PE组,优选地:a.早期发作(即,<妊娠34周的临床表现);b.早产(即,>妊娠34并<37周的临床表现);c.足月(即,≥妊娠37周的临床表现)。
可以用其它方式将HPD归类为预先存在的或妊娠的,可选地对任何类型添加“具有先兆子痫”(如果产妇或胎儿症状、体征或测试结果有必要如此)。
可以方便地将妊娠的非蛋白尿高血压定义为收缩压BP≥140mmHg和/或舒张压BP≥90mmHg的血压,其是在两个分开的场合并相隔4小时以上测得,例如,相隔约4小时至约168小时。当以妊娠以前或在妊娠20周以前测得高血压时,可以通常表示这样的高血压为慢性高血压。当在先前血压正常的妇女中并在妊娠20周以后测得高血压时,可以表示这样的高血压为妊娠引起的高血压。通常,妊娠引起的高血压将在产后12周内消退。当测得至少140/90mmHg的血压但并不持续6小时以上时,可以表示这样的高血压为短暂性高血压。
妊娠的蛋白尿高血压可以如在前面段落中加以定义,进一步伴随在24小时尿收集中≥300mg的总蛋白。
HDP还涵盖这样的疾病和病症,其在本领域中通常表示为妊娠高血压、轻度先兆子痫、妊娠引起的高血压、妊娠的特异性高血压、妊娠的毒血症等。
术语“孕龄”、“妊娠的年龄”和类似术语在本领域中是普遍的并且通常表示时间,如自女性的末次月经期的第一天起以周为单位测得的。正常妊娠的人妊娠为约38至42周,优选约40周。
“先兆子痫”(PE或先兆子痫)通常表示妊娠相关的疾病或病症,其特征在于具有蛋白尿或水肿或两者的高血压。PE还可以伴随肾小球机能失调、脑水肿、肝水肿、凝血功能异常和/或其它并发症。
PE可以方便地定义为以下体征和症状的一些组合:
(1)在妊娠20周以后,收缩血压(BP)≥140mmHg和/或舒张压BP≥90mmHg(通常在两个场合并相隔4小时以上测得,例如,相隔约4至约168小时),
(2)在妊娠20周以后,新发作蛋白尿(1+,通过纤维素试纸并使用尿分析法,在24小时尿收集中≥300mg的蛋白,或单随机尿样品具有≥0.3的蛋白/肌酐比值),以及
(3)到产后12周,高血压和蛋白尿的消退,
如尤其是高血压和蛋白尿的组合。
严重PE可以方便地定义为:
(1)收缩压BP≥160mmHg或舒张压BP≥110mmHg(通常在两个场合并相隔4小时以上测得,例如,相隔约4至约168小时)或
(2)蛋白尿,其特征在于,在24小时尿收集中测得≥3.5g蛋白或两个随机尿样品具有至少3+蛋白(通过纤维素试纸)。
在PE中,高血压和蛋白尿通常在彼此7天内发生。在严重PE中,严重高血压、严重蛋白尿或HELLP综合征(溶血、升高的肝酶、低血小板)或子痫可以同时发生或每次仅一种症状。
偶尔,严重PE可以导致癫痫发作的发展,即,导致子痫。子痫还可以包括对许多器官或组织如肝(例如,肝细胞损害、门静脉周性坏死)和中枢神经系统(例如,脑水肿和脑出血)的功能障碍或损坏。
因此,HDP还涵盖这样的疾病和病症,其在本领域中通常表示为PE,特别包括轻度PE,严重PE和具有另外的并发症的PE,子痫和HELLP综合征。
在医疗和临床实践中,术语“正在预测”或“预测”、“正在诊断”或“诊断”和“正在预后”或“预后”是普通的和很好理解的。应当理解的是,短语“用于诊断、预测和/或预后”给定疾病或病症的方法还可以互换与短语如用于所述疾病或病症的“诊断、预测和/或预后的方法”或对所述疾病或病症“进行(或确定或建立)诊断、预测和/或预后的方法”等。
通过进一步的解释并且非限制性地,“正在预测”或“预测”通常是指在还未患有所述疾病或病症的受试者中疾病或病症的提前表明、指示或预言。例如,在受试者中疾病或病症的预测可以表明受试者将发展所述疾病或病症的可能性、机会或风险,例如在一定的时间段内或到一定年龄。所述可能性、机会或风险可以特别表示为绝对值、范围或统计数据,或可以相对于适宜的对照受试者或受试者群体(如,例如,相对于一般的、正常的或健康的受试者或受试者群体)来表示。因此,受试者将发展疾病或病症的可能性、机会或风险可以有利地表示为相对于适宜的对照受试者或受试者群体的增加或减少、或成倍增加或成倍减少。如本文中所使用的,术语在受试者中如本文教导的病症或疾病的“预测”还可以特别指受试者具有上述病症或疾病的'阳性'预测,即,受试者具有具有患有上述病症或疾病的风险(例如,相对于对照受试者或受试者群体,风险显著增加)。如在本文中描述的,术语在受试者中没有如本文教导的疾病或病症的“预测”可以特别指,受试者具有上述疾病或病症的'阴性'预测,即,相对于对照受试者或受试者群体,受试者患有上述疾病或病症的风险并没有显著增加。
术语“诊断”通常是指基于症状和体征和/或根据各种诊断程序的结果(如,例如,根据已知诊断的疾病或病症的特征性的一种或多种生物标志物的存在、不存在和/或量)以对受试者的疾病或病症得到认识、决定或作出结论的过程或行为。如本文中所使用的,在受试者中,如本文教导的疾病或病症的“诊断”可以特别指,受试者具有这样的疾病或病症,因此,被诊断为患有上述疾病或病症。在受试者中,没有如本文教导的疾病或病症的“诊断”可以特别指,受试者并不患有上述疾病或病症,因此,被诊断为并不患有上述疾病或病症。尽管显示暗示上述疾病或病症的一种或多种常规症状或体征,受试者也可以被诊断为并不患有上述疾病或病症。
术语“预示”或“预后”通常是指对疾病或病症的进展和恢复前景(例如,可能性、持续时间、和/或程度)的预期。本文教导的疾病或病症的良好预后可以通常涵盖自疾病或病症的满意的部分或完全恢复的预期,优选在可接受的时间段内。上述疾病或病症的良好预后可以更加通常地涵盖上述疾病或病症的不进一步恶化或加重的预期,优选在给定时间段内。如本文教导的疾病或病症的较差预后可以通常涵盖的上述疾病或病症的不够标准的恢复和/或不满意的缓慢恢复、或基本上没有恢复或甚至进一步恶化的预期。
如本文中所使用的,术语“受试者”或“患者”通常指人类,但还可以涵盖是指非人类动物,优选温血动物,更优选胎生动物,甚至更优选哺乳动物,如,例如,非人类灵长类动物、啮齿动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、绵羊、猪等。特别是女性受试者,更尤其是妊娠的或产后女性受试者。
如本文中所使用的,术语“样品”或“生物样品”包括获自受试者的任何生物样品。样品可以包括但不限于全血、血浆、血清、红细胞、白细胞(例如,外周血单核细胞)、唾液、尿、大便(即,粪便)、眼泪、汗液、皮脂、乳头抽吸物、导管灌洗物、肿瘤渗出物、滑液、脑脊液、淋巴样液、细针抽吸物、羊水、任何其它体液、细胞裂解液、细胞的分泌产物、炎症液、精液和阴道分泌物。优选的样品可以包括这样的样品,其包含可检测量的任何一种或多种标记如本文教导的蛋白。在优选的实施方式中,样品可以是全血或其部分成分如,例如,血浆、血清、或细胞沉淀物。优选地,样品可容易通过微创方法来获得,从而便于从受试者去除或分离出所述样品。样品还可以包括组织样品和活检、组织匀浆液等。优选地,用来检测如本文教导的任何一种或多种标记的水平的样品是血浆。术语“血浆”通常指血液的基本上无色的水样液体,其不包含细胞,但其中通常悬浮有血细胞(红细胞、白细胞、凝血细胞等),并且包含营养物、糖、蛋白质、矿物质、酶等。此外优选地,所述样品是尿。
当在样品中检测或确定所述分子或分析物或分子或分析物的所述组的存在或不存在和/或量时,在样品中,“测量”分子或分析物如蛋白、多肽或肽、或两种或更多种分子或分析物如两种或更多种蛋白质、多肽或肽的组,优选基本上排除其它分子和分析物。
术语“量”和“水平”在本领域中是同义的并且通常是很好理解的。如本文中所使用的,上述术语可以特别指样品中分子或分析物的绝对量,或样品中分子或分析物的相对量,即,相对于另一个值如相对于如本文教导的参比值,或相对于数值范围,其指出生物标志物的基线表达。这些值或范围可以获自单个患者或获自患者组。
样品中分子或分析物的绝对量可以有利地表示为重量或摩尔量,或更通常表示为浓度,例如,重量/体积或摩尔/体积。
在样品中分子或分析物的相对量可以有利地表示为相对于所述另一个值,如相对于如本文教导的参比值,的增加或减少、或倍数增加或倍数减少。在第一和第二参数(例如,第一和第二量)之间进行相对比较可以但不需要首先确定所述第一和第二参数的绝对值。例如,测量方法可以产生用于所述第一和第二参数的可量化读数(如,例如,信号强度),其中所述读数是所述参数的数值的函数,并且其中可以直接比较所述读数以产生第一参数与第二参数的相对值,而实际上不需要首先将读数转换成相应参数的绝对值。
如本文中所使用的,提及任何一种标记(生物标志物)、核酸、肽、多肽或蛋白对应于在本领域中在各自指定下通常已知的标记、核酸、肽、多肽或蛋白。上述术语涵盖任何生物体尤其在动物中发现的标记、核酸、蛋白和多肽,优选温血动物,更优选脊椎动物,更优选哺乳动物,包括人类和非人类哺乳动物,还更优选人类。上述术语尤其涵盖具有天然序列的这样的标记、核酸、蛋白和多肽,即,其主要序列相同于存在于或源于自然的标记、核酸、蛋白和多肽的序列。技术人员明了,由于在物种之间的遗传趋异,所以在不同物种之间天然序列可以不同。另外,由于在给定物种内的正常的遗传多样性(变异),所以在相同物种的不同个体之间或内,天然序列可以不同。此外,由于转录后或翻译后修饰,在相同物种的不同个体之间或甚至在相同物种的不同个体内,天然序列可以不同。本文包括标记、核酸、蛋白和多肽的任何上述变体或变异体。因此,存在于或源于自然的标记、核酸、蛋白和多肽的所有序列被认为是“天然的”。上述术语涵盖这样的标记、核酸、蛋白和多肽,其形成活生物体、器官、组织或细胞的一部分,其形成生物样品的一部分,以及其至少部分地分离自上述来源。上述术语还涵盖通过重组或合成方式产生的蛋白和多肽。
如本文教导的示例性的人标记、核酸、蛋白或多肽可以是如在NCBIGenbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或Swissprot/Uniprot(http://www.uniprot.org/)以下给出的登录号下所注解的。技术人员还可以理解,在一些情况下,所述序列可以是如本文教导的标记、核酸、蛋白或多肽的前体(例如,前体蛋白)并且可以包括处理自成熟分子的部分。技术人员可以进一步明了,虽然以下可以列出仅一种或多种变异体,但包括所有变异体。除非另有规定,否则以以下形式来提供下述条目:名称(代码;用于一种或多种代表性氨基酸序列(例如,变异体)的Genbank登录号,Genbank序列版本“v.”):
胰岛素样生长因子-结合蛋白复合物酸不稳定链(ALS;NP_004961,v.1)。以下再现在NP_004961下注解的序列:
MALRKGGLALALLLLSWVALGPRSLEGADPGTPGEAEGPACPAACVCSYDDDADELSVF
CSSRNLTRLPDGVPGGTQALWLDGNNLSSVPPAAFQNLSSLGFLNLQGGQLGSLEPQA
LLGLENLCHLHLERNQLRSLALGTFAHTPALASLGLSNNRLSRLEDGLFEGLGSLWDLNL
GWNSLAVLPDAAFRGLGSLRELVLAGNRLAYLQPALFSGLAELRELDLSRNALRAIKANV
FVQLPRLQKLYLDRNLIAAVAPGAFLGLKALRWLDLSHNRVAGLLEDTFPGLLGLRVLRLS
HNAIASLRPRTFKDLHFLEELQLGHNRIRQLAERSFEGLGQLEVLTLDHNQLQEVKAGAF
LGLTNVAVMNLSGNCLRNLPEQVFRGLGKLHSLHLEGSCLGRIRPHTFTGLSGLRRLFLK
DNGLVGIEEQSLWGLAELLELDLTSNQLTHLPHRLFQGLGKLEYLLLSRNRLAELPADAL
GPLQRAFWLDVSHNRLEALPNSLLAPLGRLRYLSLRNNSLRTFTPQPPGLERLWLEGNP
WDCGCPLKALRDFALQN PSAVPRFVQAICEGDDCQPPAYTYNN ITCASPPEVVGLDLRD
LSEAHFAPC(SEQ ID NO:33)
包含分解素和金属蛋白酶域的蛋白12(ADA12;NP_003465,v.3;NP_067673,v.2)
血管生成素(ANGI;NP_001091046,v.1;NP_001136,v.1)
钙蛋白酶-1催化亚单位(CAN1;NP_005177,v.2)
巨噬细胞集落刺激因子1受体(CSF1R;NP_005202,v.2)
C-反应蛋白(CRP;NP_000558,v.2)
绒毛膜生长催乳激素(CSH;NP_001308,v.1;NP_066271,v.1;NP_072166,v.1;NP_072167,v.1)
营养不良蛋白聚糖(DAG1;NP_001159400,v.1;NP_004384,v.3)
二肽酶2(DPEP2;NP_071750,v.1)
桥粒芯蛋白-2(DSG2;NP_001934,v.2)
细胞外基质蛋白质1(ECM1;NP_004416,v.2;NP_073155,v.2)
外核苷酸焦磷酸酶磷酸二酯酶家族成员2(ENPP2;NP_001035181,v.1;NP_001124335,v.1;NP_006200,v.3)
扣针蛋白-1(FBLN1;NP_001987,v.2;NP_006476,v.2;NP_006477,v.2;NP_006478,v.2)
原纤蛋白-2(FBN2;NP_001990,v.2)
疑似G蛋白偶联受体126(GP126;NP_001027566,v.1;NP_001027567,v.1;NP_065188,v.4;NP_940971,v.1)
肝细胞生长因子样蛋白(HGFL;NP_066278,v.3.)
细胞间粘附分子3(ICAM3;NP_002153,v.2)
转移抑制因子KiSS-1(KISS1;NP_002247,v.3)
亮氨酰-胱氨酰氨基肽酶(LCAP;NP_005566,v.2;NP_787116,v.2)
磷脂酰胆碱-甾醇酰基转移酶(LCAT;NP_000220,v.1)
基底膜-特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白(PGBM;NP_005520,v.4)
N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(PGRP2;NP_443122,v.3)
磷脂酰肌醇-聚糖-特异性磷脂酶D(PHLD;NP_001494,v.2;NP_803436,v.1)
过氧化物还原酶1(PRDX1;NP_002565,v.1;NP_859047,v.1;NP_859048,v.1)
过氧化物还原酶2(PRDX2;NP_005800,v.3)
受体型酪氨酸蛋白磷酸酶S(PTPRS;NP_002841,v.3;NP_570924,v.2;NP_570925,v.2)
回转同系物4(ROBO4;NP_061928,v.4)
蛋白S100-A9(S10A9;NP_002956,v.1)
血清淀粉样A-4蛋白(SAA4;NP_006503,v.1)
腱生蛋白-X(TENX;NP_061978,v.6;NP_115859,v.2)
三叶因子3(TFF3;Swissprot/Uniprot(http://www.uniprot.org/)登录号Q07654,序列版本1)
血管内皮生长因子受体3(VGFR3;NP_002011,v.2;NP_891555,v.2)
如本文教导的示例性的人的其它标记可以是如在以下给出的登录号下所注解的。技术人员还可以理解,在一些情况下,所述序列可以是标记的前体(例如,前体蛋白)并且可以包括处理自成熟分子的部分。除非另有规定,否则以以下形式来提供下述条目:名称(代码;用于一种或多种代表性的氨基酸序列(例如,变异体)的Swissprot/Uniprot登录号,Swissprot/Uniprot序列版本"v."):
可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1,sVEGFR-1;P17948,v.2,变异体P17948-2)
内皮糖蛋白(ENG;Genbank登录号NP_000109,v.1;NP_001108225,v.1)
胎盘生长因子(PLGF;P49763,v.2;Genbank登录号NP_002623,v.2)
血管内皮生长因子(VEGFA;P15692,v.2;例如,Genbank登录号NP_001020537,v.2(VEGFA变异体a))。
本文提及任何生物分子,如标记(生物标志物)、肽、多肽或蛋白还可以涵盖其片段。因此,本文提及测量(或测量的量)任何一种标记或生物分子可以涵盖测量标记或生物分子,如,例如,测量标记或生物分子的成熟和/或经处理的可溶性/分泌形式(例如,血浆循环形式),和/或测量其一种或多种片段。
例如,可以共同测量任何标记或生物分子和/或其一种或多种片段,使得测得的量对应于共同测得的物种的总量。在另一个实例中,可以各自独立地测量任何标记或生物分子和/或其一种或多种片段。优选地,所述片段可以是血浆循环(即,非细胞或膜结合的)形式。不希望受限于任何理论,这样的循环形式可以通过自然处理源自全长标记或生物分子,或可以来自在样品中发生的已知的降解过程。在某些情况下,循环形式还可以是全长标记或生物分子,发现其在血浆中循环。因此,所述"循环形式"可以是任何标记或生物分子或任何一种的任何经处理的可溶性形式或片段,其在样品中循环,即,其并不结合于所述样品的细胞或膜部分。
除非根据上下文另有指明,否则本文提及任何生物分子如标记、肽、多肽或蛋白涵盖这样的生物分子,其来自存在于其中的任何生物体,并且特别优选来自动物,优选温血动物,更优选脊椎动物,甚至优选哺乳动物,包括人类和非人类哺乳动物,还更优选来自人类。
另外,除非根据上下文另有指明,否则本文提及任何标记、肽、多肽或蛋白以及其片段还可以通常涵盖所述标记、肽、多肽或蛋白和片段的修饰形式如承载表达后修饰,其包括,例如,磷酸化、糖基化、脂化、甲基化、半胱氨酰基化、磺化、谷胱苷肽基化、乙酰化、甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸砜等。
在一种实施方式中,任何标记、肽、多肽或片段和其片段,或如本文采用的其它生物标志物和其片段,可以是人源的,即,它们的主要序列可以相同于天然存在的人标记、肽、多肽或蛋白的相应主要序列。因此,在这方面,修饰语"人"涉及各自的标记、肽、多肽、蛋白质或片段的主要序列,而不涉及它们的起源或来源。例如,这样的标记、肽、多肽、蛋白质或片段可以存在于人受试者的样品中或分离自人受试者的样品,或可以通过其它方式(例如,通过重组表达、无细胞翻译或非生物肽合成)来获得。
术语蛋白、多肽或肽的“片段”通常是指所述蛋白、多肽或肽的N端和/或C端缺失或截短形式。所述术语涵盖通过任何机制产生的片段,如但不限于,通过所述肽、多肽或蛋白的可变翻译、外和/或内切蛋白酶解和/或降解,如,例如,体内或体外,如,例如,通过通过物理、化学和/或酶蛋白水解。非限制性地,蛋白、多肽或肽的片段可以是所述蛋白、多肽或肽的氨基酸序列的至少约5%、或至少约10%,例如,≥20%、≥30%或≥40%,如≥50%,例如≥60%、≥70%或≥80%,或甚至≥90%或≥95%。
例如,片段可以包括相应全长蛋白的≥5个连续氨基酸的序列,或≥10个连续氨基酸,或≥20个连续氨基酸,或≥30个连续氨基酸,例如,≥40个连续氨基酸,如例如≥50个连续氨基酸,例如,≥60、≥70、≥80、≥90、≥100、≥200、≥300、≥400、≥500或≥600个连续氨基酸。
在一种实施方式中,与相应的成熟、全长蛋白或它的可溶性或血浆循环形式相比,片段可以是N端和/或C端截短1至约20个氨基酸,如,例如,1至约15个氨基酸,或1至约10个氨基酸,或1至约5个氨基酸。
在一种实施方式中,可以通过所述蛋白、多肽或肽的体外蛋白水解来获得给定蛋白、多肽或肽的片段,以从样品有利地获得可检测的一种或多种肽。例如,可以通过适宜的物理、化学和/或酶剂来实现这样的蛋白水解,例如,蛋白酶,优选内蛋白酶,即,在蛋白、多肽或肽链内内部剪切的蛋白酶。适宜的内蛋白酶的非限制性清单包括丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)、苏氨酸蛋白酶(EC 3.4.25)、半胱氨酸蛋白酶(EC 3.4.22)、天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23)、金属蛋白酶(EC 3.4.24)和谷氨酸蛋白酶。示例性的非限制性的内蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、产酶溶杆菌内蛋白酶Lys-C、金黄色葡萄球菌内蛋白酶Glu-C(内肽酶V8)或溶组织梭菌内蛋白酶Arg-C(梭菌蛋白酶)。可以使用另外已知的或尚未被识别的酶;技术人员可以基于它们的剪切特异性和频率来选择适宜的一种或多种蛋白酶以获得所期望的肽形式。优选地,可以通过胰蛋白酶类型(EC 3.4.21.4)的内肽酶来实现蛋白水解,优选胰蛋白酶,如但不限于来自牛胰腺、人胰腺、猪胰腺、重组胰蛋白酶、Lys-乙酰化胰蛋白酶、溶液中的胰蛋白酶、固定于载体的胰蛋白酶等的胰蛋白酶的制剂。胰蛋白酶是特别有用的,特别是由于剪切的高特异性和效率。本发明还设想使用任何胰蛋白酶样蛋白酶,即,具有和胰蛋白酶类似的特异性。另外,化学试剂可以用于蛋白水解。例如,CNBr可以在Met处剪切;BNPS-粪臭素可以在Trp处剪切。基于所采用的酶或化学试剂,技术人员可以确定用于处理的条件,例如,蛋白浓度、酶或化学试剂浓度、pH、缓冲剂、温度、时间。
因此还提供了任何一种选自由如上文定义的ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的标记、肽、多肽或蛋白的分离片段。这样的片段可以给出关于在生物样品中所述标记、肽、多肽或蛋白的存在和量的有用信息,借此,所述片段的检测是有益的。因此,本文披露的所述标记、肽、多肽或蛋白的片段是有用的生物标志物。
优选的片段可以包含、基本上由或由如在表1列出的SEQ ID NO:1至32中阐述的序列组成,其在实施例中用来提供关于各自标记的信息。
表1
代码 | 序列 | SEQ ID | 起始* |
ALS | ADPGTPGEAEGPACPAACVCSYDDDADELSVFCSSR | 3 | 28 |
ADA12 | QGKDLEKVKQR | 1 | 230 |
ANGI | LTSPCKDINTFIHGNKR | 2 | 58 |
CAN1 | PTELSNPQFIVDGATR | 4 | 88 |
CSF1R | IPVIEPSVPELVVKPGATVTELR | 5 | 20 |
CRP | FGQTDMSR | 6 | 17 |
CSH | VQTVPLSR | 7 | 27 |
DAG1 | HWPSEPSEAVR | 8 | 30 |
DPEP2 | QVYQKGLQDVNLR | 9 | 98 |
DSG2 | AWITAPVALR | 10 | 50 |
ECM1 | SEGGFTATGQR | 11 | 21 |
ENG | ETVHCDLQPVGPER | 12 | 26 |
ENPP2 | SMYDPVFDATFHLR | 13 | 232 |
FBLN1 | DVLLEACCADGHR | 14 | 30 |
FBN2 | CNCNSGYEPDASGR | 15 | 793 |
GP126 | THFGVLMDLPR | 16 | 841 |
HGFL | SPLNDFQVLR | 17 | 21 |
ICAM3 | QPAVEEPAEVTATVLASR | 18 | 164 |
KISS1 | EKVASVGNSR | 19 | 23 |
LCAP | ATNGKLFPWAQIR** | 20 | 155 |
LCAT | QPQAWKDR | 21 | 218 |
PGBM | SIVPQGGSHSLR | 22 | 1686 |
PGRP2 | AGLLRPDYALLGHR | 23 | 510 |
PHLD | CGLSTHVEIGHR | 24 | 24 |
PRDX1/2 | QITVNDLPVGR | 25 | 140 |
PTPRS | PTLSVQQTPEGSLLAR | 26 | 836 |
ROBO4 | QDSPPQILVHPQDQLFQGPGPAR | 27 | 28 |
S10A9 | TCKMSQLER | 28 | 2 |
SAA4 | SFFKEALQGVGDMGR | 29 | 23 |
TENX | AEGTTGLAPAGQTSEESRP | 30 | 3683 |
TFF3 | EEYVGLSANQCAVPAKDR | 31 | 22 |
VGFR3 | QQQDLMPQCR | 32 | 478 |
*起始表示在各自蛋白质中肽起始的位置。
**妊娠具体形式的真正的N端
相对于特定成分(如例如,蛋白、多肽、肽或其片段),术语“分离的”通常指这样的成分以分离形式存在,例如,已分离自它的自然环境的一种或多种其它成分或以分离形式制备自它的自然环境的一种或多种其它成分。例如,分离的人或动物蛋白、多肽、肽或片段以与它天然存在于其中的人体或动物体分离的形式存在。
如本文中所使用的,术语“分离的”还可以优选涵盖修饰语“纯化的”。如本文中所使用的,相对于一种或多种蛋白、一种或多种多肽、一种或多种肽和/或它们的一种或多种片段,术语“纯化的”并不需要绝对的纯度。相反,它指这样的一种或多种蛋白、一种或多种多肽、一种或多种肽和/或一种或多种片段是处于离散环境,其中相对于其它蛋白,它们的丰度(方便地以质量或重量或浓度来表达)大于在生物样品中的丰度。离散环境是指单一介质,如例如单一溶液、凝胶、沉淀物、冻干物等。可以通过已知方法,包括,例如,实验室或重组合成、层析法、制备电泳、离心分离、沉淀、亲和纯化等,来获得纯化肽、多肽或片段。
按重量计,纯化的一种或多种蛋白、一种或多种多肽和/或一种或多种片段可以优选构成按重量计≥10%的离散环境的蛋白含量,更优选≥50%,如≥60%,更优选≥70%,如≥80%,以及还更优选≥90%,如≥95%、≥96%、≥97%、≥98%、≥99%或甚至100%。可以例如通过劳里法(Lowry et al.1951.J Biol Chem 193:265)来确定蛋白含量,可选地如由Hartree 1972(AnalBiochem 48:422-427)所描述的。此外,可以通过在还原或非还原条件下的SDS-PAGE并利用考马斯蓝或,优选地,银染,来确定肽或多肽的纯度。
另外披露了任何分离的标记、肽、多肽或蛋白和其片段(如本文教导的),其包含可检测标记。这便于这样的片段的即时检测。如在整个本说明书中所使用的,术语“标记(label)”是指任何原子、分子、部分或生物分子,其可以用来提供可检测和优选可量化读数或性能,并且其可以连接于或构成感兴趣的实体的一部分,如肽或多肽或特异性结合剂。可以通过质谱法、光谱法、光学方法、比色法、磁法、光化学法、生化法、免疫化学方法或化学方法,来适当地检测标记。标记包括但不限于染料;放射性标记如32P、33P、35S、125l、1311;电子致密试剂;酶(例如,如通常用于免疫测定的辣根磷酸酶或碱性磷酸酶);结合部分如生物素-链霉亲和素;半抗原如异羟洋地黄毒甙元;发光、磷光或发荧光部分;质量标签;以及单独或连同通过荧光共振能量转移(FRET)可以抑制或转移发射光谱的部分一起的荧光染料。
例如,标记可以是质量改变标记。优选地,质量改变标记可以涉及相对于其相应的非标记肽在肽的一个或多个氨基酸中不同的稳定同位素的存在。在质谱应用中,质量标记肽尤其可用作阳性对照、标准和校准物。尤其是,包括一种或多种不同同位素的肽是化学上同样的,在色谱上和电泳上以相同方式分开,并且还以相同方式离子化和片段化。然而,在适当的质量分析器中,这样的肽和其可选选择的片段化离子将显示可区分的m/z比率,因而可以加以区别。可区分的稳定同位素对的实例包括H和D、12C和13C、14N和15N或16O和18O。通常,在本发明中分析的生物样品的肽和蛋白可以基本上仅包含在自然中具有较高流行的常见同位素,如例如H、12C、14N和16O。在这样的情况下,质量标记肽可以标记有一种或多种在自然中具有低流行的不常见同位素,如例如D、13C、15N和/或18O。还设想,在生物样品的肽或蛋白将包括一种或多种不常见同位素的情况下,质量标记肽可以包含各自的一种或多种常见同位素。
尤其可以通过合成或重组产生上述肽,其中利用一种或多种同位素标记的氨基酸底物,或通过化学或酶促修饰未标记肽以对其引入一种或多种不同同位素,来获得同位素标记的合成肽。通过实施而不是限制性的方式,可以在商用氘化L-甲硫氨酸CH3-S-CD2CD2-CH(NH2)-COOH或氘化精氨酸H2NC(=NH)-NH-(CD2)3-CD(NH2)-COOH存在的条件下,来合成或重组产生D-标记肽。应被理解的是,存在包含氘化或15N或13C形式的任何氨基酸可以被考虑用于标记肽的合成或重组生产。在另一个非限制性实例中,可以在H2 16O或H2 18O中用胰蛋白酶处理肽,导致在所述肽的COOH端加入两个氧(分别为16O或18O)(例如,US 2006/105415)。
因此,还设想任何(分离的)标记、肽、多肽或蛋白和其片段(如本文教导的),其可选地包含可检测标记,作为(阳性)对照、标准或校准物用于所述标记、肽、多肽或蛋白和其片段的定性或定量检测分析(测量方法)的应用,并且尤其用于在受试者中用来诊断、预测、预后和/或监测如本文教导的疾病或病症的方法中的应用。可以以任何形式来供给标记、蛋白、多肽或肽,特别是作为沉淀物、真空干燥的冷冻干燥物、在液体或冷冻的溶液中、或共价或非共价固定在固相,如例如,固定在固体色谱基质或玻璃或塑料或其它合适表面(例如,作为肽阵列和微阵列的一部分)。可以容易地制备肽,例如,分离自天然来源,或重组或合成地制备。
另外披露了结合剂,其能够特异性地结合于如本文教导的的任何一种或多种(分离的)标记、肽、多肽或蛋白和其片段。还披露了结合剂,其能够特异性地结合于如本文教导的(分离的)标记、肽、多肽或蛋白和其片段中的仅一种。如在整个本说明书中所预期的,结合剂可以尤其包括抗体、适体、光适体、蛋白质、肽、肽模拟物或小分子。
如在整个本说明书中所使用的,术语“特异性地结合”是指,一种药剂(在本文中还称作“特异性结合剂”)结合于一种或多种期望的分子或分析物,如结合于一种或多种感兴趣的蛋白、多肽或肽或其片段,基本上排除随机或无关的其它分子,并且可选地基本上排除结构相关的其它分子。术语“特异性地结合”并不一定需要一种药剂专门结合于它的一个或多个预期靶。例如,在结合的条件下,相比于对于非靶分子的亲和力,如果对于这样的一个或多个预期靶的亲和力是大至少约2倍,优选至少约5倍,更优选至少约10倍,更优选至少约25倍,还更优选至少约50倍,以及甚至更优选至少约100倍或更大,则可以说,制剂特异性地结合于感兴趣的一种或多种蛋白、一种或多种多肽、一种或多种肽和/或其一种或多种片段。
优选地,药剂可以以这样的结合KA≥1x106M-1的亲合常数(KA)结合于它的一个或多个预期靶,更优选KA≥1x107M-1,还更优选KA≥1x108M-1,甚至更优选KA≥1x109M-1,以及还更优选KA≥1x1010M-1或KA≥1x1011M-1,其中KA=[SBA_T]/[SBA][T],SBA表示特异性结合剂,T表示预期靶。可以通过本领域已知的方法,如例如,利用平衡透析和斯卡查德图分析,来确定KA。
如在整个本说明书中所使用的,特异性结合剂可以尤其包括抗体、适体、光适体、蛋白质、肽、肽模拟物或小分子。
如本文中所使用的,术语“抗体”是在它的最广泛意义上加以使用并且通常是指任何免疫结合剂。该术语特别包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、多价(例如,2价、3价或更多价)和/或多特异性抗体(例如,双或更多特异性抗体),其形成自至少两个完整的抗体,以及抗体片段,只要它们呈现期望的生物活性(尤其是特异性地结合感兴趣的抗原的能力),以及上述片段的多价和/或多特异性复合物。术语“抗体”不仅包括通过包括免疫法的方法产生的抗体,而且还包括任何多肽,例如,重组表达的多肽,其被制成包括至少一个互补决定区(CDR),该区能够特异性地结合于感兴趣的抗原上的表位。因此,上述术语适用于这样的分子而不论它们是否体外或体内产生。
抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类型中的任一种,并且优选IgG类型抗体。抗体可以是多克隆抗体,例如,从其纯化的抗血清或免疫球蛋白(例如,亲和纯化的)。抗体可以是单克隆抗体或单克隆抗体的混合物。单克隆抗体可以靶向特定抗原或在抗原内具有更大选择性和重现性的特定表位。通过实施而不是限制性的方式,可以通过首先由Kohler等人1975(Nature 256:495)描述的杂交瘤方法,或可以通过重组DNA方法(例如,如在US 4,816,567中描述的),来制作单克隆抗体。单克隆抗体还可以分离自噬菌体抗体文库,其中利用例如由Clackson等人1991(Nature 352:624-628)和Marks等人1991(J Mol Biol 222:581-597)描述的技术。
抗体结合剂可以是抗体片段。“抗体片段”包括完整抗体的一部分,其包含它的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和scFv片段;双体分子(diabodies);线性抗体;单链抗体分子;和多价和/或多特异性抗体,其形成自一个或多个抗体片段,例如,双体、三体、和多体。以上名称Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv等旨在具有它们的在本领域中建立的意义。
术语抗体包括这样的抗体,该抗体源自或包含一个或多个部分,上述部分则来自任何动物物种,优选脊椎动物物种,包括,例如,鸟类和哺乳动物。非限制性地,抗体可以是鸡、火鸡、鹅、鸭、珍珠鸡、鹌鹑或雉。同样非限制性地,抗体可以是人、鼠(,小鼠、大鼠等)、驴、兔、山羊、绵羊、豚鼠、骆驼(例如,西亚骆驼和单峰驼(Camelus dromaderius))、美洲驼(例如,羊驼(Lama paccos)、驼羊或瘦驼(Lama vicugna))或马。
技术人员将明了,抗体可以包括一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代(例如,保守性取代),只要这样的改变保存它与相应抗原的结合。抗体还可以包括其构成氨基酸残基的一个或多个天然或人工修饰(例如,糖基化等)。
用来生产多克隆和单克隆抗体以及其片段的方法在本领域中是众所周知的,如同用来生产重组抗体或其片段的方法(参见例如,Harlow andLane,"Antibodies:A Laboratory Manual",Cold Spring Harbour Laboratory,New York,1988;Harlow and Lane,"Using Antibodies:A Laboratory Manual",Cold Spring Harbour Laboratory,New York,1999,ISBN 0879695447;"Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques",by Zola,ed.,CRC Press1987,ISBN 0849364760;"Monoclonal Antibodies:A Practical Approach",byDean & Shepherd,eds.,Oxford University Press 2000,ISBN 0199637229;Methods in Molecular Biology,vol.248:"Antibody Engineering:Methods andProtocols",Lo,ed.,Humana Press 2004,ISBN 1588290921)。
术语“适体”是指单链或双链寡DNA、寡RNA或寡DNA/RNA或它们的任何类似物,其可以特异性地结合于靶分子如肽。有利地,相对于它们的靶,适体可以显示相当高的特异性和亲和力(例如,KA为约1x109M-1)。适体生产尤其是描述在US 5,270,163;Ellington & Szostak 1990(Nature 346:818-822);Tuerk & Gold 1990(Science 249:505-510);或"The Aptamer Handbook:Functional Oligonucleotides and Their Applications",by Klussmann,ed.,Wiley-VCH 2006,ISBN 3527310592中,将其以引用方式结合于本文。术语“光适体”是指这样的适体,该适体包含一个或多个可以共价结合于或交联于靶分子的光反应性官能团。术语“肽模拟物”是指非肽剂,其是相应肽的拓扑类似物。合理设计肽的肽模拟物的方法在本领域中是已知的。例如,基于硫酸化8聚体肽CCK26-33的三种肽模拟物的合理设计,和基于11聚体肽物质P的两种肽模拟物的合理设计,以及相关的肽模拟物设计原则描述在Horwell 1995(Trends Biotechnol 13:132-134)中。
术语“小分子”是指化合物,优选有机化合物,其大小相当于在制药中通常使用的那些有机分子。该术语排除生物大分子(例如,蛋白、核酸等)。优选的小有机分子的大小可达约5000Da,例如,可达约4000,优选可达3000Da,更优选可达2000Da,甚至更优选可达约1000Da,例如,可达约900、800、700、600或可达约500Da。
因此,还披露了用于免疫动物的方法,例如,非人类动物如实验室或农场动物,其中利用(即,用作免疫抗原)如本文教导的任何一种或多种(分离的)标记、肽、多肽或蛋白和其片段,其可选地连接于呈递载体。来自免疫血清的抗体试剂的免疫和制备本身是众所周知的并且描述于在本说明书的其它地方提及的文献中。待免疫的动物可以包括任何动物物种,优选温血物种,更优选脊椎动物物种,包括,例如,鸟类和哺乳动物。非限制性地,抗体可以是鸡抗体、火鸡抗体、鹅抗体、鸭抗体、珍珠鸡抗体、鹌鹑抗体或雉抗体。同样非限制性地,抗体可以是人抗体、鼠(例如,小鼠、大鼠等)抗体、驴抗体、兔抗体、山羊抗体、绵羊抗体、豚鼠抗体、骆驼抗体、美洲驼抗体或马抗体。术语“呈递载体”或“载体”通常是指免疫原性分子,其当结合于第二分子时,其增强对后者的免疫反应,通常通过提供另外的T细胞表位。呈递载体可以是(多)肽结构或非肽结构,特别是例如聚糖、聚乙二醇、肽模拟物、合成聚合物等。示例性的非限制性载体包括人B型肝炎病毒核心蛋白、多C3d域、破伤风毒素片段C或酵母Ty颗粒。
通过如本文教导的免疫法获得的或可获得的免疫血清特别可以用于产生抗体试剂,其特异性地结合于本文披露的任何一种或多种(分离的)标记、肽、多肽或蛋白和其片段。
在本文中,任何现有的、可用的或常规的分离、检测和量化方法可以用来测量在样品中标记、肽、多肽、蛋白和/或其片段以及可选地一种或多种其它生物标志物或其片段的存在或不存在(例如,读数为存在与不存在;或可检测量与不可检测量)和/或量(例如,读数为绝对或相对量,如,例如,绝对或相对浓度)(在样品中待如此测量的感兴趣的任何分子或分析物,包括如本文教导的任何一种或多种标记、肽、多肽、蛋白和其片段,在下文中可以统称为生物标志物)。
例如,这样的方法可以包括免疫测定方法、质谱分析法、或色谱法、或它们的组合。
术语“免疫测定”通常指已知的用于在样品中检测一种或多种感兴趣的分子或分析物的方法,其中对于感兴趣的一种或多种分子或一种或多种分析物的免疫测定的特异性来自在特异性结合剂,通常为抗体,和感兴趣的一种或多种分子或一种或多种分析物之间的特异性结合。免疫测定技术包括但不限于直接ELISA(酶联免疫吸附测定)、间接ELISA、夹心ELISA、竞争性ELISA、多重ELISA、放射性免疫测定(RIA)、ELISPOT技术、和本领域中已知的其它类似技术。这些免疫测定方法的原理在本领域中是已知的,例如John R.Crowther,"The ELISA Guidebook",1st ed.,HumanaPress 2000,ISBN 0896037282。
通过进一步的解释而不是限制性地,直接ELISA采用标记一抗来结合于并从而量化在样品中固定在载体如微孔板上的靶抗原。间接ELISA使用结合于靶抗原的非标记一抗以及标记二抗,其识别并允许量化抗原结合一抗。在夹心ELISA中,靶抗原捕捉自样品,其中利用固定的'捕捉'抗体,其结合于在抗原内的一个抗原位点,以及在除去未结合分析物以后,利用'检测'抗体(其结合于在所述抗原内的另一个抗原位点)来检测如此捕捉的抗原,其中检测抗体可以如上述被直接标记或可以是可间接检测的。竞争性ELISA使用标记的'竞争剂',其可以是一抗或靶抗原。在一个实例中,用样品温育非标记的固定的一抗,使该反应可以达到平衡,然后添加标记的靶抗原。当后者的结合部位还未被来自样品的非标记靶抗原占据时,后者将结合于一抗。因此,结合的标记抗原的检测量与样品中的非标记抗原的量呈负相关。多重ELISA便于在单室(例如,微孔板)内通常在多个阵列地址同时检测两种或多种分析物(关于进一步指导,参见例如,Nielsen & Geierstanger 2004.J Immunol Methods 290:107-20和Ling etal.2007.Expert Rev Mol Diagn 7:87-98)。如所理解的,在ELISA技术中的标记通常是通过酶(如,例如,辣根过氧化物酶)结合并且终点通常是比色、化学发光或荧光、磁、压电、热电和其它终点。
放射性免疫测定(RIA)是基于竞争的技术并且涉及混合已知量的带有抗体的放射性标记的(例如,125l-或131l-标记的)靶抗原和所述抗原,然后添加来自样品的非标记的或'冷'抗原,并测量替代的标记抗原的量(关于指导,参见例如,"An Introduction to Radioimmunoassay and RelatedTechniques",by Chard T,ed.,Elsevier Science 1995,ISBN 0444821198)。
通常,在本文中,任何质谱(MS)技术,其可以获得关于肽的质量、以及优选关于所选肽的片段化和/或(部分)氨基酸序列的精确信息(例如,在串联质谱法,MS/MS中;或在源后衰变,TOF MS中),是有用的。适宜的肽MS和MS/MS技术和系统本身是众所周知的(参见例如,Methodsin Molecular Biology,vol.146:"Mass Spectrometry of Proteins and Peptides",by Chapman,ed.,Humana Press 2000,ISBN 089603609x;Biemann 1990.Methods Enzymol 193:455-79;或Methods in Enzymology,vol.402:"Biological Mass Spectrometry",by Burlingame,ed.,Academic Press 2005,ISBN 9780121828073)并且可以用于本文。适用于生物标志物肽分析的MS装置、仪器和系统可以包括但不限于基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)MS;MALDI-TOF源后衰变(PSD);MALDI-TOF/TOF;表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF)MS;电喷雾电离质谱(ESI-MS);ESI-MS/MS;ESI-MS/(MS)n(n是大于零的整数);ESI3D或线性(2D)离子阱MS;ESI三重四极子MS;ESI四极正交TOF(Q-TOF);ESI傅里叶变换MS系统;硅上的解吸/电离(DIOS);次级离子质谱法(SIMS);大气压化学电离质谱法(APCI-MS);APCI-MS/MS;APCI-(MS)n;大气压光电离质谱法(APPI-MS);APPI-MS/MS;和APPI-(MS)n。可以利用本领域中建立的方式,如,例如,碰撞诱导解离(CID),来实现在串联MS(MS/MS)布置中的肽离子片段化。通过质谱法的生物标志物的检测和量化可以涉及多反应监测(MRM),如尤其由Kuhn等人2004(Proteomics 4:1175-86)所描述的。MS肽分析方法可以有利地结合于上游肽或蛋白分离或分级分离法,如例如结合于下文描述的色谱法和其它方法。
层析法也可以用于测量生物标志物。如本文中所使用的,术语“层析法”涵盖在本领域中如此称呼的和广泛可获得的用于分离化学物质的方法。在一种优选的方式中,层析法是指一种过程,其中,当在流动相和固定相之间在周围或超过固定液或固相(“固定相”)流动时,由液体或气体的移动流(“流动相”)携带的化学物质(分析物)的混合物被分离成成分(由于分析物的微分分布的结果)。固定相通常可以是细分固体、过滤材料片、或在固体表面上的液体薄膜等。层析法还广泛适用于分离生物起源的化合物,如,例如,氨基酸、蛋白、蛋白或肽的片段等。
如本文中所使用的,层析法可以优选是柱状层析法(即,其中将固定相沉积或填充在柱中),优选液相层析法,以及还更优选HPLC。虽然层析法的细节在本领域中是众所周知的,但关于进一步指导,参见例如,Meyer M.,1998,ISBN:047198373X,和"Practical HPLC Methodology andApplications",Bidlingmeyer,B.A.,John Wiley & Sons Inc.,1993。层析法的示例性类型包括但不限于高效液相色谱法(HPLC),正相HPLC(NP-HPLC),反相HPLC(RP-HPLC),离子交换色谱法(IEC),如阳离子或阴离子交换色谱法,亲水相互作用色谱法(HILIC),疏水性相互作用色谱法(HIC),尺寸排阻色谱法(SEC),其包括凝胶过滤色谱法或凝胶渗透色谱法,色谱聚焦,亲和色谱法如免疫亲和、固定金属亲和色谱法等。
色谱法,其包括单、两或更多维色谱法,可以用作肽分级分离法并连同另外的肽分析方法,如例如,连同如在本说明书的其它地方描述的下游质谱分析。
在本发明中,可选地连同任何上述分析方法一起,另外的肽或多肽分离、鉴别或量化方法可以用于测量生物标志物。这样的方法包括但不限于化学提取分配,等电聚焦(IEF),包括毛细管等电聚焦(CIEF),毛细管等速电泳(CITP),毛细管电色谱(CEC)等,一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE),毛细管凝胶电泳(CGE),毛细管区带电泳(CZE),胶束电动色谱(MEKC),自由流动电泳(FFE)等。
本文教导的各个方面和实施方式可以进一步依靠比较在样品中测得的任何一种或多种生物标志物的量与所述一种或多种生物标志物的量的参比值,其中所述参比值表示如本文教导的疾病或病症的已知的预测、诊断和/或预后。
例如,不同的参比值可以是相对于患有所述疾病或病症的没有或正常风险的预测,患有如本文教导的给定疾病或病症的风险(例如,异常升高的风险)的预测。在另一个实例中,不同的参比值可以表示患有上述疾病或病症的不同程度的风险的预测。
在另一实例中,不同的参比值可以表示,相对于没有上述疾病或病症的诊断(如,例如,健康、或康复自所述疾病或病症等的诊断),如本文教导的给定疾病或病症的诊断。在另一个实例中,不同的参比值可以表示不同严重性的上述疾病或病症的诊断。
在又一个实例中,不同的参比值可以表示,相对于所述疾病或病症的较差预后,如本文教导的给定疾病或病症的良好预后。在另一实施例中,不同的参比值可以表示上述疾病或病症的各种各样的有利或不利的预后。
这样的比较通常可以包括任何方式来确定至少一种差异的存在或不存在以及可选地在待比较的值或分布之间的这样的差异的大小。比较可以包括目视检查、测量结果的算术或统计比较。这样的统计比较包括但不限于运用规则。如果值或生物标志物分布包括至少一个标准,则用来确定在所述值或生物标志物分布的差异的比较还可以包括这些标准的测量结果,使得生物标志物的测量结果相关于内部标准的测量结果。
可以按照先前用于其它生物标志物的已知程序来建立用于任何一种或多种生物标志物的量的参比值。
例如,可以通过在来自一位个体或来自个体的群体的一个或多个样品中确定所述一种或多种生物标志物的量,来建立用于如本文教导的给定疾病或病症的特定的诊断、预测和/或预后的任何一种或多种生物标志物的量的参比值,其特征在于所述疾病或病症的所述特定的诊断、预测和/或预后(即,疾病或病症的所述诊断、预测和/或预后对谁成立)。这样的群体可以包括但不限于≥2、≥10、≥100、或甚至数百或更多个体。
因此,通过说明性实施例,相对于没有上述疾病或病症,可以通过在来自分别诊断为患有或不患有所述疾病或病症的一位个体或来自个体的群体(例如,基于其它适当结论性的方式,如,例如,临床体征和症状、成像、ECG等)的一个或多个样品中确定所述一种或多种生物标志物的量,来建立用于如本文教导的给定疾病或病症的诊断的任何一种或多种生物标志物的量的参比值。
在一种实施方式中,如本文中使用的一个或多个参比值可以表达任何一种或多种生物标志物的绝对量。在另一种实施方式中,可以相对于参比值,直接确定在来自被测受试者的样品中任何一种或多种生物标志物的量(例如,根据增加或减少、或倍数增加或倍数减少)。有利地,这可以便于比较在来自受试者的样品中的任何一种或多种生物标志物的量与参比值(换句话说,相对于参比值,测量在来自受试者的样品中的任何一种或多种生物标志物的相对量)而不需要首先确定所述一种或多种生物标志物的各自的绝对量。
在患者的样品中,生物标志物的表达水平或存在有时可以波动,即,显著增加或减少而没有症状的变化(出现、恶化、或改善)。在这样的情况下,标记变化先于症状变化,并成为比症状变化更加敏感的度量。与等待日益恶化的症状相比,可以更早和更有效地开始治疗性干预。可以在家中在更加良性状态下安全地进行早期干预,相比于在急诊室中治疗严重恶化的患者,其是一个主要改进。
因而,在这样的情况下,在不同的时间点,测量相同患者的任何一种或多种生物标志物的水平使得能够连续监测患者的状态并可以导致相对于如本文教导的给定疾病或病症,患者病症的恶化或改善的预测。如本文所指的家中或临床测试试剂盒或装置可以用于这种连续监测。对于这样的测试,相连于一定疾病状态的任何一种或多种生物标志物的水平的一个或多个参比值或范围,可以例如在所述受试者中事先或在监测过程的一段时间内加以确定。可替换地,可以通过许多具有高度类似疾病表型的患者,例如,来自健康受试者或并不患有感兴趣的疾病或病症的受试者的数据集,来建立这些参比值或范围。在实际可以感到或观察到(经常严重的)症状以前,任何一种或多种生物标志物的水平与所述参比值或范围的突然偏差可以预测患者病症的恶化(例如,在家中或在诊所)。
因此还披露了用于在某个患者中确定如本文教导的任何一种或多种生物标志物的水平的显著变化的方法或算法,上述显著变化表明临床状态的变化(恶化或改善)。另外,本发明便于建立以下诊断:受试者正恢复或已从如本文教导的给定疾病或病症康复。
在一种实施方式中,本发明的方法可以包括建立这样的一个或多个参比值的步骤。在一种实施方式中,本发明的试剂盒和装置可以包括这样的装置,该装置用来建立如本文教导的任何一种或多种生物标志物的量的参比值,其用于如本文教导的给定疾病或病症的特定的诊断、预测和/或预后。这样的装置可以例如包括来自一个或多个个体的一个或多个样品(例如,分开的或合并样品),上述个体的特征在于所述疾病或病症的所述特定的诊断、预测和/或预后。
本文教导的各种方面和实施方式可以进一步涉及在来自受试者的样品中测得的任何一种或多种生物标志物的量和给定参比值之间发现偏差或没有偏差。
第一数值与第二数值的“偏差”通常可以涵盖任何方向(例如,增加:第一数值>第二数值;或减小:第一数值<第二数值)以及任何程度的改变。
例如,相对于与其进行比较的第二数值,偏差可以涵盖第一数值非限制性地减少至少约10%(约0.9倍或更少),或至少约20%(约0.8倍或更少),或至少约30%(约0.7倍或更少),或至少约40%(约0.6倍或更少),或至少约50%(约0.5倍或更少),或至少约60%(约0.4倍或更少),或至少约70%(约0.3倍或更少),或至少约80%(约0.2倍或更少),或至少约90%(约0.1倍或更少)。
例如,相对于与其进行比较的第二数值,偏差可以涵盖第一数值非限制性地增加至少约10%(约1.1倍以上),或至少约20%(约1.2倍以上),或至少约30%(约1.3倍以上),或至少约40%(约1.4倍以上),或至少约50%(约1.5倍以上),或至少约60%(约1.6倍以上),或至少约70%(约1.7倍以上),或至少约80%(约1.8倍以上),或至少约90%(约1.9倍以上),或至少约100%(约2倍以上),或至少约150%(约2.5倍以上),或至少约200%(约3倍以上),或至少约500%(约6倍以上),或至少约700%(约8倍以上)等。
优选地,偏差可以指统计显著的观察到的改变。例如,偏差可以指观察到的改变,其在给定群体的参比值的误差容限的范围之外(如,例如,通过标准差或标准误差,或通过其预定倍数来表示,例如,±1xSD或±2xSD、或±1xSE或±2xSE)。偏差还可以指落在由给定群体的数值限定的参比范围以外的数值(例如,在包括在所述群体中≥40%、≥50%、≥60%、≥70%、≥75%或≥80%或≥85%或≥90%或≥95%或甚至≥100%的数值的范围以外)。
在另一种实施方式中,如果观察到的改变超过给定阈值或截止值,则可以认为是偏差。可以如本领域通常已知的来选择这样的阈值或截止值,以提供诊断、预测和/或预后方法的所选敏感性和/或特异性,例如,至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%的敏感性和/或特异性。
例如,在一种实施方式中,与表示没有如本文教导的给定疾病或病症的预测或诊断或表示所述疾病或病症的良好预后的参比值相比,在来自受试者的样品中,任何一种或多种生物标志物的提高量,优选至少约1.1倍升高,或至少约1.2倍升高,更优选至少约1.3倍升高,甚至更优选至少约1.4倍升高,还更优选至少约1.5倍升高,如约1.1倍至3倍升高,或约1.5倍至2倍升高,表明受试者具有或可能有患有所述疾病或病症的危险,或表明在受试者中对于疾病或病症的较差预后,或表明受试者并不患有或不具有患有所述疾病或病症的风险,或表明在受试者中对于疾病或病症的良好预后。
当在来自受试者的样品中的任何一种或多种生物标志物的量和参比值(其表示如本文教导的给定疾病或病症的一定诊断、预测和/或预后)之间发现偏差时,所述偏差指示或可以归因于以下结论:在所述受试者中,所述疾病或病症的诊断、预测和/或预后不同于由参比值表示的诊断、预测和/或预后。
当在来自受试者的样品中的任何一种或多种生物标志物的量和参比值(其表示如本文教导的给定疾病或病症的一定诊断、预测和/或预后)之间没有发现偏差时,上述偏差的不存在指示或可以归因于以下结论:在所述受试者中,所述疾病或病症的诊断、预测和/或预后基本上相同于由参比值表示的诊断、预测和/或预后。
上述考虑类似地适用于生物标志物分布。
当在受试者中确定两种或更多种不同生物标志物时,它们的各自的存在、不存在和/或量可以一起表示为生物标志物分布,每个测得的生物标志物的值构成所述分布的一部分。如本文中所使用的,术语“分布”包括任何数据集,其表示与感兴趣的病症、如与如本文教导的给定疾病或病症的特定的诊断、预测和/或预后有关的独特的特点或特征。该术语通常特别涵盖核酸分布,如例如基因型分布(基因型数据集,其表示与感兴趣的病症有关的一种或多种基因的基因型)、基因拷贝数分布(基因拷贝数数据集,其表示与感兴趣的病症有关的一种或多种基因的扩增或缺失)、基因表达分布(基因表达数据集,其表示与感兴趣的病症有关的一种或多种基因的mRNA水平)、DNA甲基化分布(甲基化数据集,其表示与感兴趣的病症有关的一种或多种基因的DNA甲基化水平),以及蛋白、多肽或肽分布,如例如蛋白表达分布(蛋白表达数据集,其表示与感兴趣的病症有关的一种或多种蛋白的水平)、蛋白活化分布(表示与感兴趣的病症有关的一种或多种蛋白的激活或失活的数据集)、蛋白质修饰分布(表示与感兴趣的病症有关的一种或多种蛋白的修饰的数据集)、蛋白质切割分布(表示与感兴趣的病症有关的一种或多种蛋白的蛋白酶剪切的数据集),以及它们的任何组合。
生物标志物分布可以以许多方式来产生并且可以是可测量生物标志物或生物标志物的一些方面的组合,其中利用方法如比率、或其它更加复杂的关联方法或算法(例如,基于规则的方法)。生物标志物分布包括至少两个测量结果,其中测量结果可以对应于相同或不同的生物标志物。生物标志物分布还可以包括至少3、4、5、10、20、30或更多个测量结果。在一种实施方式中,生物标志物分布包括数百、或甚至数千个测量结果。
因此,例如,相对于没有或具有患有所述疾病或病症的正常风险的预测,不同的参比分布可以表示患有给定疾病或病症的风险(例如,异常升高的风险)的预测。在另一个实施例中,不同的参比分布可以表示患有所述疾病或病症的不同程度的风险的预测。
在另一实施例中,相对于没有上述疾病或病症的诊断(如,例如,健康、康复自所述疾病或病症等的诊断),不同的参比分布可以表示如本文教导的给定疾病或病症的诊断。在另一个实施例中,不同的参比分布可以表示不同严重性的所述疾病或病症的诊断。
在又一个实施例中,相对于所述疾病或病症的较差预后,不同的参比分布可以表示如本文教导的疾病或病症的良好预后。在另一实施例中,不同的参比分布可以表示上述疾病或病症的各种各样的有利或不利的预后。
可以按照先前用于其它生物标志物的已知程序来建立本文使用的参比分布。
例如,可以通过在来自一个个体或来自个体群体的一个或多个样品中确定分布来建立用于如本文教导的给定疾病或病症的特定的诊断、预测和/或预后的任何两种或更多种生物标志物的量的参比分布,上述个体的特征在于所述疾病或病症的所述特定的诊断、预测和/或预后(即,所述疾病或病症的所述诊断、预测和/或预后对其成立)。这样的群体可以包括但不限于≥2、≥10、≥100、或甚至数百或更多个体。
因此,通过说明性实施例,相对于没有上述疾病或病症,用于如本文教导的给定疾病或病症的诊断的参比分布可以通过在来自一个个体或来自个体群体的样品中确定生物标志物分布来建立,其中上述个体分别诊断为患有或不患有所述疾病或病症。
在一种实施方式中,本发明的方法可以包括建立这样的参比分布的步骤。在一种实施方式中,本发明的试剂盒和装置可以包括这样的装置,其用来建立用于如本文教导的给定疾病或病症的特定的诊断、预测和/或预后的参比分布。这样的装置可以例如包括来自一个或多个个体的一个或多个样品(例如,分开的或合并样品),上述个体的特征在于所述疾病或病症的所述特定的诊断、预测和/或预后。
另外,本领域已知的多参数分析可以用来(在细节上已作必要的修改)确定在从其产生的数值和分布的组之间的偏差(例如,在样品和参比生物标志物分布之间)。
当在样品分布和参比分布(其表示如本文教导的给定疾病或病症的一定的诊断、预测和/或预后)之间发现偏差时,所述偏差指示或可以归因于以下结论:在所述受试者中所述疾病或病症的诊断、预测和/或预后不同于由参比分布表示的诊断、预测和/或预后。
当在样品分布和参比分布(其表示如本文教导的给定疾病或病症的一定诊断、预测和/或预后)之间没有发现偏差时,上述偏差的不存在指示或可以归因于以下结论:在所述受试者中所述疾病或病症的诊断、预测和/或预后基本上相同于由参比分布表示的诊断、预测和/或预后。
本发明进一步提供了用于如本文教导的任何一种疾病或病症的诊断、预测、预后和/或监测的试剂盒或装置,其包括用于在患者的样品中检测任何一种或多种生物标志物的水平的装置。在一种更优选的实施方式中,本发明的这样的一种或多种试剂盒可以用于临床环境(设置)或家中。根据本发明的试剂盒可以用于在所述受试者中诊断所述疾病或病症,用于监测用药剂治疗患有所述疾病或病症的受试者的有效性,或用于预防性筛查发生所述疾病或病症的受试者。
在临床环境中,试剂盒或装置可以具有床侧装置或应急小组设置的形式,例如,作为救护车或其它移动急救车辆的装备或团队装备的一部分或作为急救箱的一部分。诊断试剂盒或装置可以协助医生、急救助手、或护士来决定接受观察患者是否正发展如本文教导的疾病或病症,其后可以采取适当的行动或治疗。
家庭测试试剂盒给予患者读数,他可以将其传达给医生、急救助手或医院的急诊科,其后可以采取适当的行动。这样的家庭测试装置特别有利于具有病史或具有患有如本文教导的任何一种疾病或病症的风险的人。
根据本发明的典型的试剂盒或装置包括以下要素:
a)用于从受试者获得样品的装置
b)装置或设备,用于在所述样品中测量如本文教导的任何一种或多种标记的量和可视化在所述样品中一种或多种标记的量是否低于或高于一定的阈值水平或数值,从而表明受试者是否患有如本文教导的给定疾病或病症。
在本发明的任何实施方式中,试剂盒或装置可以另外包括c)用于直接与医生、医院急诊科或急救站通信的装置,从而表明人是否患有所述疾病或病症。
术语“阈值水平或数值”或“参比值”可作为同义词互换使用并且如在本文中所定义。它还可以是在个别患者或具有高度类似疾病状态的患者组中确定的基线(例如,“干重”)值的范围。
如本文定义的任何试剂盒可以用作床侧装置,由受试者自己或由临床从业者来使用。
在本发明的所述试剂盒中,用于从受试者获得样品的装置(a)可以是在本领域中已知的用于从受试者获得样品的任何装置。用于获得例如血液样品的实例在本领域中是已知的并且可以是任何各类的手指或皮肤点刺或基于柳叶刀的装置,其基本上刺穿皮肤并导致一滴血液释放自皮肤。当使用尿样品时,用于从受试者获得样品的装置可以具有吸收条的形式如在本领域中已知的家庭妊娠试验中所使用的吸收条。类似地,可以利用本领域中已知测定拭子来获得唾液样品。血液取样装置或其它取样装置的实例例如可以参见美国专利号4,802,493、4,966,159、5,099,857、6,095,988、5,944,671、4,553,541、3,760,809、5,395,388、5,212,879、5,630,828、5,133,730、4,653,513、5,368,047、5,569,287、4,360,016、5,413,006和美国专利申请2002/111565、2004/0096959、2005/143713、2005/137525、2003/0153900、2003/0088191、W09955232、WO2005/049107、WO2004/060163、WO02/056751、WO02/100254、WO2003/022330、WO2004/066822、W097/46157、WO2004/039429、或EP0364621、EP0078724、EP1212138、EP0081975、或EP0292928。提供或获得样品的方式决不是限制性的。
在本发明的所述试剂盒中,用于在所述样品中测量任何一种或多种标记的量的装置或设备(b)可以是任何装置或设备,其可以在样品中特异性地检测所述一种或多种标记的量。实例是这样的系统,该系统包括特异性结合分子,其用于连接于固相的所述一种或多种标记,例如,横流试纸或纤维素试纸装置以及本领域中众所周知的类似装置。用来进行生化分析的一个非限制性的实例是使用测试条和标记的抗体,该组合并不需要膜的任何洗涤。测试条是众所周知的,例如,在妊娠检测试剂盒领域,其中抗hCG抗体存在于载体上,并通过尿的流动复合于在固定二抗(其允许可视化)上的hCG。这样的家庭测试装置、系统或试剂盒的其它非限制性的实例可以参见例如以下美国专利:6,107,045、6,974,706、5,108,889、6,027,944、6,482,156、6,511,814、5,824,268、5,726,010、6,001,658,或美国专利申请:2008/0090305或2003/0109067。
在一种优选的实施方式中,本发明提供了横向流动装置或纤维素试纸(dipstick)。这样的纤维素试纸包括测试条,其允许样品(通过毛细管流动)从条的一端,其中将样品施加至这样的条的另一端,其中测量在所述样品中分析物的存在。
在另一种实施方式中,本发明提供了包括试剂条的装置。这样的试剂条包括一个或多个测试垫,当浸润有样品时,其提供颜色变化(在有分析物存在的条件下)和/或指示所述样品中蛋白的浓度。
在本发明的试剂盒的一种优选实施方式中,用于在样品(b)中测量蛋白的量的装置或设备(1)是具有近端(2)和远端(3)的载体(7),包括:
-在近端附近的样品施加区(4),
-在样品施加区(4)远侧的反应区(5),以及
-在反应区(5)远侧的检测区(6),
借此,所述载体具有毛细管性能,其引导在施加区中施加的流体样品从近端流向远端,
-可选地,装置或设备还包括流体源,例如在容器、滴液吸移管或小瓶中,从而使粘稠样品能够更容易流过条。
反应区(5)包括一个或多个结合分子的一个或多个带(10),用于结合至检测剂(例如胶体金)的任何一种或多种标记,所述结合分子结合物被设置在载体上,使得它可以借助于流体的毛细管流动进行迁移,即,它不是固定的。检测区(6)包括一个或多个捕捉带(11),其包含用于固定在载体上的任何一种或多种标记的结合分子的群体。
当样品被施加到样品施加区(4)时,通过毛细管流动,它向着反应区(5)迁移。在样品中存在的任何一种或多种标记与标记结合分子结合物反应,并且如此形成的复合物通过毛细管流动被携带到检测区(6)。具有永久固定于其上的结合分子的检测区(6)捕捉并固定任何复合物,从而导致可以被可视化的结合物的局部浓度。
如本文描述的两个区(5和6)(一个区具有非固定结合物以及一个区具有固定捕捉抗体)通常并不重叠。可以在不存在或存在缺乏带的载体的干预间隙的条件下,相邻地布置它们。可以通过任何方式将带设置在载体上,例如,吸收、吸附、涂层、共价键连接或干燥方式,这取决于是否需要试剂是流动的。
为了获得半定量测试条,其中仅在样品中的任何一种或多种标记的水平高于某个预定阈值水平或数值以后才形成信号,包含非固定共轭结合分子的反应区(5)还可以包含用于所述一种或多种标记的预定量的固定捕捉抗体。这使得能够捕捉一定量的存在于样品中的所述一种或多种标记,其对应于如预定的阈值水平或数值。然后可以允许由共轭或标记结合分子结合的所述任何一种或多种标记(如果有的话)的剩余量迁移到检测区(6)。在这种情况下,反应区(6)将仅接收标记结合分子-生物标志物复合物并且随后仅产生信号(如果在样品中所述一种或多种生物标志物的水平高于预定阈值水平或数值)。
用来确定在样品中的任何一种或多种标记的量是否低于或高于一定的阈值水平或数值的另一种可能性是,连同标记二抗一起,使用捕捉存在于样品中的所有所述一种或多种标记蛋白的捕捉一抗,从而当结合于固相时产生一定的信号或颜色。然后可以比较颜色或信号的强度和参比颜色或信号图,其指明,当信号的强度高于一定阈值信号时,测试是阳性的。可替换地,可以借助于包括例如光吸收传感器或光发射仪的电子设备来测量颜色或信号的量或强度,从而产生所形成的信号强度或颜色吸收的数值,然后其可以以阴性结果(如果所述数值低于阈值)或阳性结果(如果所述数值高于阈值)的形式显示给受试者。这种实施方式特别可用于在患者中在一段时间内监测所述一种或多种标记的水平。
可以例如,在受试者没有给定疾病或病症的期间内,并给予患者他的任何一种或多种标记的基线水平的指示,利用家用装置来确定参比值或范围。因而,定期使用家用测试装置将使受试者能够注意到所述一种或多种标记的水平的突然变化(相比于基线水平),其可以让他联系医生。
可替换地,可以在患有如本文教导的给定疾病或病症的受试者中确定参比值,于是其表示他个人的任何一种或多种标记的“风险水平”,即,所述一种或多种标记的水平,其表明他是或即将暴露于所述疾病或病症。这种风险水平可用于监测疾病进展或用于评估治疗的效果。
另外,可以通过在具有高度类似疾病状态或表型(例如,均没有如本文教导的疾病或病症或患有所述疾病或病症)的受试者中的结合测量结果来建立参比值或水平。
在本领域中已知的这样的半定量测试(其原理可以用于根据本发明的家用测试装置)的非限制性实例是HIV/AIDS测试或前列腺癌测试(由Sanitoets出售)。家用前列腺测试是快速测试,其用作最初的半定量测试来检测在全血中高于4ng/ml的PSA血液水平。典型的家用自测试试剂盒包括以下组件:测试装置,对其给予血液样品,并且当蛋白水平高于一定阈值水平时,其产生信号;一定量的稀释剂例如在滴液吸移管中以帮助将分析物(即感兴趣的蛋白)从样品施加区转移到信号检测区;可选地,用于血液样品收集的空吸移管;手指穿刺装置;可选地,用来清洗穿刺区域的无菌拭子;以及试剂盒的使用说明书。
类似测试还已知用于例如乳腺癌检测和CRP-蛋白水平检测,其考虑到心脏风险家用测试。后者测试包括将测试结果发送到实验室,此处由技术或医疗专家来解释结果。患者病症的上述基于电话或互联网的诊断当然是可能的并且适用于大多数试剂盒,因为测试结果的解释经常比进行测试更加重要。当使用如上文提及的电子设备时,上述电子设备给出存在于样品中的蛋白水平的数值,此数值当然可以容易地通过电话、移动电话、卫星电话、电子邮件、互联网或其它通信方式加以通信,以警告医院、医生或急救队:某人正患有如本文教导的疾病或病症、或具有患有如本文教导的疾病或病症的风险。在美国专利6,482,156中披露了这样的系统的一个非限制性实例。
在以下描述中参照附图,其举例说明本发明的具体实施方式,但它们不是限制性的。按照本领域技术人员的常见做法,技术人员可以适应上述装置以及替代的组件和特点。
图14A和B示出了本发明的测试条的优选实施方式。条(1)包括近端(2)和远端(3)。样品施加区(4)设置在近端(2),反应区(5)与其相邻并且检测区(6)是在远端(3)的附近。可以将样品设置在施加区(4)中的载体(7)上以通过毛细管作用转移到检测区(6)。除样品施加区(4)的区域之外,可以提供覆盖载体(7)的任一表面或两个表面的保护层(8)。这样的保护层可以保护条的样品和化学成分以避免污染和蒸发。毛细管接触与载体(7)的样品施加区(4)的一个或多个吸收垫(9)可以吸收和释放样品(必要时);通常将这样的垫(9)放置在载体(7)(其相同或相反于样品施加区(4))的表面上。在图14B中,吸收垫(9)是样品施加区(4)的一部分。可以使在毛细管中的一个或多个其它吸收垫(9')接触载体(7)的检测区(6),其是在任何捕捉带(11)、(14)的远侧。这些垫(9')可以吸收已穿过载体的流体;通常将这样的垫(9')放置在相同或相反于样品施加区(4)的载体(7)的表面上。载体(7)可以制备自任何适宜材料,其具有毛细管作用性能,并且可以具有如上所述的相同特性。它还应能够支持物质(例如用于任何一种或多种标记的非固定结合分子),当被水合时,其可以通过毛细管作用流体流动迁移穿过载体。
载体(7)还可以包括用于任何一种或多种标记的结合分子结合物的带(10),其位于反应区(5)中,并在在样品施加区(4)的远侧的位置。在样品中的任何所述一种或多种标记通过毛细管作用被带向该带(10),在此处它与永久固定的结合分子结合物反应。
结合分子结合物可以相关于或连接于检测剂以便于检测。实验室检测剂的实例包括但不限于发光标记;比色标记,如染料;荧光标记;或化学标记,如电活性剂(例如,氰亚铁酸盐);酶;放射性标记;或射频标记。更常见的是,检测剂是颗粒。可用于实施本发明的颗粒的实例包括但不限于胶体金颗粒;胶态硫颗粒;胶体硒颗粒;胶体硫酸钡颗粒;胶体硫酸铁颗粒;金属碘酸盐颗粒;卤化银颗粒;二氧化硅颗粒;胶体金属(含水)氧化物颗粒;胶体金属硫化物颗粒;胶体硒化铅颗粒;胶体硒化镉颗粒;胶体金属磷酸盐颗粒;胶体金属铁酸盐颗粒;涂布有有机或无机层的任何上述胶体颗粒;蛋白质或肽分子;脂质体;或有机聚合物乳胶颗粒,如聚苯乙烯乳胶珠。优选的颗粒是胶体金颗粒。可以通过任何常规方式来制备胶体金,如在G.Frens,1973 Nature Physical Science,241:20(1973)中概述的方法。替代方法可以描述在美国专利号5,578,577、5,141,850、4,775,636、4,853,335、4,859,612、5,079,172、5,202,267、5,514,602、5,616,467、5,681,775中。
载体(7)进一步包括在检测区(6)中的一个或多个捕捉带(11)。捕捉带包含永久固定于其上的用于任何一种或多种标记的结合分子的群体。在反应区(5)中形成的标记:结合分子结合物复合物迁移向着检测区(6),在此处所述带(11)捕捉迁移复合物,并浓缩它,从而使它可以被可视化(通过眼、或利用机器阅读器)。在反应区(5)和在检测区(6)中存在的结合分子可以与所述一种或多种标记的相同部分反应或可以与所述一种或多种标记的不同部分反应。
在载体(7)上可以存在一个或多个对照带(12)。例如,非固定肽(12)可以存在于样品施加区(4)中,上述肽并不与用于任何一种或多种标记的结合分子的任何带(13)或(14)交叉反应。当施加样品时,它迁移向着反应区(5),此处设置抗肽抗体结合物(13),以及此处形成肽-抗体复合物。所述复合物朝向检测区(6)迁移,此处抗肽抗体的捕捉带(14)被固定在载体上,以及其浓缩所述复合物,从而能够可视化。与用于任何一种或多种标记的捕捉带(11)分开地定位对照捕捉带(14),因而,如果测定正确工作,则可以看到不同于检测反应的阳性反应。
按照本发明的对照的特别的优点在于,它们是内部对照,即,可以相对于其来比较任何一种或多种标记的测量结果的对照是存在于单独的载体上。因而,按照本发明的对照可以用来校正例如载体的可变性。对于基于例如载体的统计采样的外部对照,这样的校正将是不切实际的。另外,通过使用根据本发明的对照结合剂和对照剂,可以最小化不同载体之间的逐批、和逐次运行变化。另外,可以减小非特异性结合的影响。利用外部非载体对照将难以完成所有这些校正。
在测定期间,来自样品的任何一种或多种标记和结合分子结合物结合并浓缩在载体(7)上。这种结合导致化合物的浓度,其可以被可视化(高于载体(7)的背景颜色)。化合物可以形成自上述化合物的组合,包括抗体、检测剂、以及与反应和检测区有关的其它颗粒。基于待进行的特定测定,可以选择性地实施反应和检测区以实现可以是线性或非线性的适当的动态范围。
可以将用于进行测定的载体(7)容纳在如例如图15所示的筒(20)内。除一个或多个开口之外,筒优选为不透水的。可以通过在筒中的开口(21)来暴露载体(7)以提供在近端(2)的施加区(4),以及另一开口(22)以能够阅读邻近远端(3)的检测区(6)。筒(20)可以包括用于与阅读装置通信的传感器代码(23)。
可以通过表面等离子体共振(SPR)并利用在其上固定有用于所述一种或多种标记的结合分子的芯片,荧光共振能量转移(FRET),生物发光共振能量转移(BRET),荧光猝灭,荧光偏振测量或本领域中已知的其它方式,来测量在样品中的任何一种或多种标记的存在和/或浓度。描述的任何结合测定可以用来确定在样品中任何一种或多种标记的存在和/或浓度。要做到这一点,使用于任何一种或多种标记的结合分子与样品反应,并测量所述一种或多种标记的浓度(如适用于待使用的结合测定)。为了验证和校准测定,可以进行对照反应,其中利用不同浓度的标准的一种或多种标记和/或用于所述一种或多种标记的结合分子。在采用固相测定的情况下,在温育以后,进行洗涤步骤以除去未结合标记。如适用于给定标记(例如,闪烁计数、荧光、抗体-染料等),则测量结合标记。如果希望获得定性结果,则对照和不同浓度可能是没有必要的。当然,可以切换所述一种或多种标记和结合分子的作用;技术人员可以适应上述方法,使得结合分子适用于不同浓度的样品。
如本文中使用的,结合分子是特异性地结合于任何一种或多种标记的任何物质。按照本发明有用的结合分子的实例包括但不限于抗体、多肽、肽、脂质、碳水化合物、核酸、肽-核酸、小分子、小有机分子、或其它候选药物。结合分子可以是天然或合成化合物,其包括,例如,合成小分子,在动物、植物、细菌或真菌细胞的提取物中、以及在来自上述细胞的条件培养基中包含的化合物。可替换地,结合分子可以是具有用于所述一种或多种标记的结合部位的工程蛋白。根据本发明的一个方面,在大于10-6M的亲和力下,结合分子特异性地结合于所述一种或多种标记。可以根据与所述一种或多种标记的标准样品的结合来确定适宜的结合分子。用于确定在结合分子和所述任何一种或多种标记之间的结合的方法是本领域已知的。如本文中所使用的,术语抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人源化或嵌合抗体、工程抗体、以及抗体片段足以结合于蛋白的生物功能性抗体片段(例如scFv、纳米抗体、Fv等)。这样的抗体可以是针对所述一种或多种标记的商用抗体,如,例如,小鼠、大鼠、人或人源化单克隆抗体。
结合分子可以标记有标签,其便于借助于另一种药剂(例如,借助于探针结合配偶体)进行检测。这样的标签可以是,例如,生物素、链霉亲和素、his标签、myc标签、麦芽糖、麦芽糖结合蛋白或本领域中已知的具有结合配偶体的任何其它种类的标签。在探针结合配偶体排列中可以采用的缔合的实例可以是任何缔合,并且包括,例如生物素:链霉亲和素、his标签:金属离子(例如Ni2+)、麦芽糖:麦芽糖结合蛋白。
另外披露了样品以及用于在样品中测量任何一种或多种标记的存在的准确的比色试剂条和方法。更具体地,本发明还涉及包括试剂条的装置。本发明的试剂条包括载体,该载体提供有至少一个测试垫,其用于在样品中测量任何一种或多种标记的存在。所述测试垫优选包含结合有试剂成分的载体基质,上述试剂成分能够用与所述一种或多种标记相互作以产生可测量反应,优选直观或仪器可测量反应。可以将试剂条制造成任何尺寸和形状,但通常试剂条的长度超过宽度。载体可以由任何适宜的材料构成并且优选由坚固或硬质材料如乙酸纤维素、聚对苯二甲酸乙二酯、聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯制成。通常,载体基质是吸收材料,其便于尿样品(响应于毛细力)移动穿过载体基质以接触试剂成分并产生可检测或可测量的彩色过渡。载体基质可以是任何物质,其能够结合为进行感兴趣的测定所需要的化学试剂,只要载体基质相对于化学试剂基本上是惰性的,以及相对于液体试样的可溶性组分是多孔或吸收性的。措辞"载体基质"是指吸水或非吸水基质,其不溶于水和其它生理液并且当暴露于水和其它生理液时保持它们的结构完整性。适宜的吸水基质包括滤纸、海绵材料、纤维素、木材、编织织物和无纺织物等。非吸水基质包括玻璃纤维、聚合物膜、和预制或微孔膜。其它适宜的载体基质包括亲水性无机粉末,如硅胶、氧化铝、硅藻土等;泥质物质;织物;亲水性的天然高分子材料,特别是纤维素材料如纤维素珠、以及尤其是含纤维纸如滤纸或色谱纸;合成或改性天然存在的聚合物,如交联明胶、乙酸纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酰胺、纤维素、聚乙烯醇、聚砜、聚酯、聚丙烯酸脂、聚氨基甲酸酯、交联葡聚糖、琼脂糖、以及其它这样的交联和非交联的不溶于水的亲水性聚合物。疏水性和不吸收的物质不适合用作本发明的载体基质。载体基质可以具有不同的化学成分或化学成分的混合物。基质还可以具有不同的平滑度和粗糙度以及硬度和软度。然而,在每种情况下,载体基质均包含亲水性或吸收性材料。载体基质最有利地构造自吸水滤纸或非吸水聚合物膜。优选的载体基质是亲水性的吸水基质,其包括纤维素材料,如纸,并且优选滤纸,或非吸水基质,其包括聚合物膜,如聚氨基甲酸酯或交联明胶。可以将试剂成分(当与样品中的任何一种或多种标记反应时其产生比色变化)均匀地加入载体基质中,然后载体基质在整个载体基质中均匀地保持试剂成分,同时保持测试样品的预定成分对载体基质的可渗透性。适宜的试剂成分的实例可以包括例如所述一种或多种标记的结合分子(在基于抗体的技术的情况下),或pH缓冲剂(在酶检测的情况下)。优选在粘附于载体的至少一端的测试垫上干燥和稳定试剂成分。其上吸收和干燥试剂成分的测试垫优选制备自显示最小背景颜色的膜材料。优选地,测试垫可以构造自酸或碱洗涤后的材料,以最小化背景颜色。在另一种实施方式中,被干燥到试剂条上的试剂成分进一步包括润湿剂以降低测试垫的脆性。优选的润湿剂的非限制性实例包括TritonX-100、Bioterg、甘油、吐温等。可以通过本领域已知的任何方法,将试剂成分施加于试剂条。例如,可以将从其制备测试垫的载体基质浸入到试剂成分的溶液中并干燥(按照本领域已知的技术)。按照本发明的试剂条可以提供有多个测试垫以测定在尿样品中的多于一种的分析物。
图16A-B概略地示出根据本发明的试剂条101的一种可能的实施方式。条101包括近端102和远端103。其上提供有试剂成分的各种测试垫109、109'、109"处于在试剂条的载体107上的近端102。必须以这样的方式来设计条,使得它可以浸润有足够大量的样品,可选地用生理液加以稀释,从而改善粘稠样品(如血液或唾液等)的毛细管流动。
如本文定义的试剂条的使用如下。简要地,将本发明的试剂条的一个或多个测试垫区浸入样品中,或将少量样品施加于在一个或多个测试垫区上的试剂条。在短时间内,通常在0.5至10分钟内,在试剂条上发生可以直观或通过反射测量术加以分析的显色。在与任何一种或多种标记反应以后,在测试垫上的试剂区的颜色变化优选直接正比于在患者样品中的所述一种或多种标记的浓度。可以直观地或通过例如基于反射的阅读器来确定在测试垫上显现的颜色强度。将在一个或多个测试垫区处的显色与参比颜色比较,以确定在样品中存在的所述一种或多种标记的估计量。将在测试垫上显现的颜色强度与至少一个,优选至少两个标准色度比较,其对应于通过施加校正系数确定的所述一种或多种标记的浓度范围。
试剂条可以进一步包括荧光或红外染料(其被施加于支撑条或加入测试垫),其可以确保在具有用于可检测或可测量反应的检测系统的器械中试剂条的适当对齐。
在另一种实施方式中,本发明还涉及用于在样品中测量任何一种或多种标记的存在的测试垫。优选地,所述测试垫包含结合有试剂成分的载体基质,上述试剂成分能够与所述一种或多种标记相互作用以产生可测量反应,优选直观或仪器可测量反应。在另一种优选的实施方式中,本发明提供了如本文定义的测试垫用于试剂条,优选用于如本文定义的试剂条。
在本发明的试剂盒中,特异性结合剂、肽、多肽、蛋白、生物标志物等可以具有各种形式,例如,冻干形式、游离在溶液中或固定于固相上。可以将它们,例如,提供在多孔板中或提供为阵列或微阵列,或可以分开和/或单独地包装它们。可以如本文教导的,适当地标记它们。所述试剂盒可以特别适用于进行本发明的测定方法,如,例如,免疫测定、ELISA测定、质谱测定等。
术语“调节”通常指定性或定量的改变、变动或变化,其特别涵盖待调节物的增加(例如,激活)或降低(例如,抑制)。该术语涵盖任何程度的上述调节。
例如,在调节会影响可确定或可测量变量的情况下,则与没有所述调节的参比情况相比,调节可以涵盖所述变量的值增加至少约10%,例如,至少约20%,优选至少约30%,例如,至少约40%,更优选至少约50%,例如,至少约75%,甚至更优选至少约100%,例如,至少约150%、200%、250%、300%、400%或至少约500%;或,与没有所述调节的参比情况相比,调节可以涵盖所述变量的值降低或减少至少约10%,例如,至少约20%,至少约30%,例如,至少约40%,至少约50%,例如,至少约60%,至少约70%,例如,至少约80%,至少约90%,例如,至少约95%,如至少约96%、97%、98%、99%或甚至100%。
优选地,一种或多种预期靶(例如,如本文教导的任何一种或多种标记、核酸、肽、多肽或蛋白)的活性和/或水平的调节可以是特异性的或选择性的,即,可以调节一种或多种预期靶的活性和/或水平而基本不改变随机的、无关的(无意识的、不想要的)靶的活性和/或水平。
提及靶的“活性”可以一般地涵盖靶的生物活性的任何一个或多个方面,如但不限于它的生化活性、酶活性、信号活性和/或结构活性的任何一个或多个方面,例如,在细胞、组织、器官或生物体内。
在靶的治疗性或预防性靶向的范围内,提及靶的“水平”可以优选涵盖靶的量和/或可用性(例如,可用于进行它的生物活性),例如,在细胞、组织、器官或生物体内。
例如,可以通过调节靶的表达和/或调节表达的靶来调节靶的水平。可以例如在异源核RNA(hnRNA)、前信使mRNA(前mRNA)、mRNA或cDNA(编码靶)的水平,来实现或观察靶的表达的调节。通过实例而不是限制性的方式,可以通过本领域中已知的方法来降低靶的表达,如,例如,通过转染(例如,通过电穿孔、脂质转染等)或借助于反义剂来转导(例如,利用病毒载体)细胞、组织、器官或生物体,如,例如,反义DNA或RNA寡核苷酸,编码反义剂的构建物,或RNA干扰剂,如siRNA或shRNA,或编码上述的核酶或载体等。通过实例而不是限制性的方式,可以通过本领域中已知的方法来增加靶的表达,如,例如,通过转染(例如,通过电穿孔、脂质转染等)或转导(例如,利用病毒载体)细胞、组织、器官或生物体,其中借助于重组核酸,其在调节序列的调控下编码所述靶,上述调节序列会影响在所述细胞、组织、器官或生物体中的适当的表达水平。通过实例而不是限制性的方式,可以经由改变靶的形成(如,例如,折叠、或相互作用,其导致复合物的形成),和/或靶的稳定性(例如,复合物成分缔合于复合物或解离自复合物的倾向)、降解或细胞定位等,来调节靶的水平。
术语“反义”通常是指设计成干扰基因表达并且能够特异性地结合于预期靶核酸序列的分子。反义剂通常包括能够特异性地杂交于靶序列的寡核苷酸或寡核苷酸类似物,并且通常可以包含、基本上由或由这样的核酸序列组成,其互补于或基本上互补于在基因组DNA、hnRNA、mRNA或cDNA,优选mRNA或cDNA内并对应于靶核酸的序列。本文适用的反义剂通常能够在高严格性条件下杂交于它们的相应的靶,并且可以在生理条件下特异性地杂交于靶。
术语“核酶”通常是指核酸分子,优选寡核苷酸或寡核苷酸类似物,其能够催化剪切多核苷酸。优选地,“核酶”能够切割给定靶蛋白的mRNA,从而减少其翻译。本文设想的示例性核酶包括但不限于锤头型核酶、发夹型核酶、δ型核酶等。关于核酶以及其设计的教导,参见例如,US 5,354,855、US 5,591,610、Pierce et al.1998(Nucleic Acids Res 26:5093-5101)、Lieberet al.1995(Mol Cell Biol 15:540-551)、以及Benseler et al.1993(J AmChem Soc 1 15:8483-8484)。
“RNA干扰”或“RNAi”技术是本领域中的常规技术,并且本文中使用的适宜的RNAi剂可以特别包括短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、和短发夹RNA(shRNA)分子,如本领域中已知的。关于RNAi分子以及其设计的教导,特别参见Elbashir et al.2001(Nature 41 1:494-501)、Reynolds et al.2004(NatBiotechnol 22:326-30),http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress,Wang& Mu 2004(Bioinformatics 20:1818-20)、Yuan et al.2004(Nucleic AcidsRes 32(Web Server issue):W130-4),by M Sohail 2004("Gene Silencingby RNA Interference:Technology and Application",1st ed.,CRC,ISBN0849321417)、U Schepers 2005("RNA Interference in Practice:Principles,Basics,and Methods for Gene Silencing in C.elegans,Drosophila,andMammals",1st ed.,Wiley-VCH,ISBN 3527310207)、以及DR Engelke & JJRossi 2005("Methods in Enzymology,Volume 392:RNA Interference",1sted.,Academic Press,ISBN 0121827976)。
如本文中所使用的,术语“药用的(药学上可接受的)”符合于本领域并且是指相容于药物组合物的其它组分并且对其接受者并不是有害的。
如本文中所使用的,“载体”或“赋形剂”包括任何及所有溶剂、稀释剂、缓冲剂(如,例如,中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、增溶剂、胶体、分散介质、载体、填充剂、螯合剂(如,例如,EDTA或谷胱甘肽)、氨基酸(如,例如,甘氨酸)、蛋白质、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、增香剂、芳化剂、增稠剂、用于实现长效效应的药剂、包衣剂、抗真菌剂、防腐剂、抗氧化剂、等渗控制剂、吸收延缓剂等。上述介质和药剂用于药物活性物质中的应用在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性物质不相容,则可以设想其用于治疗性组合物。
可以单独或连同本领域已知的用于如本文教导的疾病和病症的疗法一起(“联合疗法”)来使用目前的活性物质(药剂)。如本文设想的联合疗法可以包括给予本发明的至少一种活性物质以及至少一种其它药物或生物活性成分。可以以相同或不同的药物剂型,同时或以任何顺序依次地,给予所述目前的一种或多种活性物质和一种或多种所述药物或生物活性成分。
可选地连同待给予的一种或多种其它活性化合物一起,所使用的目前的一种或多种活性物质(药剂)的剂量或量取决于个体情况,并且,按照惯例,适应于个别情况,以实现最佳效果。因而,它取决于待治疗的病症的特性和严重性,还取决于待治疗的人或动物的性别、年龄、体重、一般健康状况、饮食习惯,给予的方式和时间,和个体反应,取决于所使用的化合物的给予途径、疗效、代谢稳定性和作用持续时间,取决于上述疗法是急性或慢性或预防性,或取决于除本发明的一种或多种药剂以外是否还给予其它活性化合物。
非限制性地,取决于疾病的类型和严重性,典型的每日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg体重或以上,其取决于上述因素。对于经数天或更长时间的重复给予,取决于病症,持续治疗直到发生疾病症状的所期望的抑制。本发明的活性物质的优选剂量可以为约0.05mg/kg至约10mg/kg体重。因此,可以将约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一个或多个剂量给予患者。可以间歇性地给予上述剂量,例如,每周或每两周或三周。
如本文中所使用的,短语如“需要治疗的受试者”包括将受益于如本文教导的给定疾病或病症的治疗的受试者。上述受试者可以包括但不限于那些已被诊断为患有所述病症的受试者,那些容易获得或发展所述病症的受试者和/或那些待预防所述病症的受试者。
术语“治疗”或“处理”是指已经发展的疾病或病症的治疗性治疗、以及预防性治疗,其中目的是预防或减少不希望的痛苦的发生的机会,如预防如本文教导的疾病或病症的获得和进展的机会。有益的或期望的临床结果可以包括但不限于一种或多种症状或一种或多种生物标记的缓解、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即,不恶化)状态、疾病进展的延迟或放缓、疾病状态的改善或缓解等。“治疗”还可以是指,与如果不接受治疗的预期生存期相比,延长生存期。
术语“预防有效量”是指活性化合物或药剂的量,其在受试者中抑制或延迟病症的发作,如由研究者、兽医师、医生或其他临床医生所寻求的。如本文中所使用的,术语“治疗有效量”是指活性化合物或药剂的量,其在受试者中诱发由研究者、兽医师、医生或其他临床医生寻求的生物或药物反应,其可以特别包括待治疗的疾病或病症的症状的缓解。用于确定本发明的化合物的治疗和预防有效剂量的方法在本领域中是已知的。
通过以下非限制性实施例来进一步说明上述方面和实施方式。
实施例
实施例1:用来发现用于PE的新生物标志物的MASSTERMIND发现平台
MASSTERMIND实验装置
为了发现生物标志物,利用蛋白水平的质谱检测并利用我们先前公布的COFRADICTM技术平台(基本上如特别在WO 02/077016和Gevaert et al.2003,Nat Biotechnol 21(5):566-9中描述的),我们分析了蛋白表达的变化。
利用商用的基于亲和力的层析柱(例如Agilent Technologies),除尽所有血浆样品的最丰富的蛋白。利用蛋白质印迹分析,检验了白蛋白和免疫球蛋白G(IgG)的排除效率。按照标准N端COFRADIC程序,制备用于MASStermind分析的样品。通过在每个胰蛋白酶肽的C端胰蛋白酶介导掺入18O/16O来差示标记样品和对照。在N端肽分选以后,进行NanoLC分离,接着直接点滴到MALDI靶上。MALDI-TOF/TOF仪器用来产生MS谱。利用自主开发的生物信息学工具,如用于峰识别和去同位素、在分析物和参比物之间的比率确定、群集、样品间校准和大量的样品质量控制的工具。来分析MS谱。在校准所有样品并控制质量发后,开始统计分析。
MASSTERMIND统计分析
为了选择区别两个群体的差分特点(或肽),使用了两个不同的统计度量:单规则分类和微阵列的显著性分析(SAM)。从概念上讲,用来发现差分特点的最简单的机器学习技术是单规则分类(oneR)。在这种方法中,对于每个特点,产生了形式的简单规则“如果比率<X,那么类型=A其它类型=B”。此规则对于数据的性能由留一交叉验证确定。在此分析中显示低差错率的特点是首要生物标志物候选物。SAM(Tusher et al.2001,PNAS 98:5116-5121)是选择大多数差分特点的方法,同时控制假发现率(FDR)。该方法最初开发用于微阵列实验并且证明适用于Pronota的数据矩阵。相对于单规则分类,此方法的主要优点在于,当在两类之间的比率的差异开始减小并且来自实验的随机噪声开始模糊候选标记的实际水平时,它将仍然便于得到有用的趋势。SAM计算在两类样品之间的特点的比率的相对差异。为了估计该得分的意义,通过置换所有样品的类分配并重新计分,来估计零分布。这给予我们假发现率(FDR)的置信估计,其是偶然确定的蛋白质或基因产物的百分比。为了最佳地说明MS信号的漏测值和强度,利用对这些值的不同截止,对数据的不同子集进行完全SAM分析。所有结果汇编在最终报告中。
实施例2:可用于PE的标记的鉴定
该研究设计旨在确定基于蛋白的生物标志物,其便于辨别在她们的妊娠后期注定会发展先兆子痫(PE)的孕妇(病例)与在她们的妊娠后期将不会发展PE的妇女(对照)。
血浆样品在她们的妊娠内(妊娠22和26周)的两个不同时间点获自孕妇,即获得两个样品/个体(图17)。在取样时,在病例中,后期PE的任何临床体征仍然未出现。
进行的MASStermind发现研究是所谓的"参比设计",其中所有样品与共同的参比进行比较,其构成在研究中所使用的大多数样品的混合物。
定义了4个组的样品:组1(在妊娠的22周,注定患有PE的妇女,n=10),组2(在妊娠的26周,注定患有PE的妇女,n=10),组3(妊娠22周的对照孕妇,n=5),和组4(妊娠26周的对照孕妇,n=5)。组1和2的样品获自相同个体(即,成对的)。组3和4的样品获自不同个体(即,不成对的,除了1个之外)。从用于生物标志物候选选择的统计分析中排除几个样品,使得对于组1、2、3和4分别为n=9、10、5和4。
数据分析搜寻群体差异,即,作为整体来处理群体并在对照组和PE组之间的标记的平均量之间寻找差异,其中利用SAM和oneR统计方法。
进行了各种比较,包括组1+2与组3+4;组1与组3+4;组2与组3+4;组3与组4;组3与组1+2+3+4;组2和组1的成对比较(纵向趋势)。这些比较补充以对PE选择性的人工选择、妊娠选择性以及考虑到到诊断的时间分布。
图1至13示出标记的数据,其中上述标记在注定患有PE和正常妇女之间具有不同的表现,并且可用于诊断、预测、预后和/或监测PE。上述数据是基于如以上表1中所列的肽的评估。在多于1种的肽被确定为标记的情况下,它们呈现与保留的肽类似的行为。
本文确定的生物标志物显示各种有用的行为。与对照相比,在所考虑的2个妊娠时间点,在PE组中,一些标记被上调或下调。该效应可以独立于妊娠(例如,HGFL)或可以叠加在妊娠趋势(例如,ANGI)上。与对照相比,在所考虑的2个妊娠时间点之一时,在PE组之一中,一些标记被上调或下调(例如,FBN2)。与PE组相比,在2个妊娠时间点之一时,在对照组之一中,一些标记被上调或下调(例如,PGRP2)。当考虑2个妊娠时间点时,在相同个体内,一些标记显示一致的上调节或下调节(即,纵向趋势/斜率)(例如,LCAP)。一些标记显示有趣的到诊断的时间的行为;对于这些情况,在图12和13中,作图蛋白表达,其是作为在PE的实际诊断以前的时间(周数)的函数。一些标记显示上述行为的组合。
实施例3:MASSTERCLASS靶向蛋白量化
下文描述在样品中靶向蛋白量化的一种示例性方式。
MASSTERCLASS实验装置
MASSterclass测定使用靶向串联质谱法以及稳定同位素稀释作为末期肽定量系统(还称作多反应监测(MRM)和单反应监测(SRM))。靶向肽对于感兴趣的特定蛋白是特异的(即,蛋白水解的),即,测得的肽量直接相关于在原始样品中的蛋白量(参见例如,在表1中的肽)。为了实现在复合样品中生物标志物定量所需要的特异性和敏感性,肽分级先于末期定量步骤。
适宜的MASSTERCLASS测定可以包括以下步骤:
-血浆/血清样品
-除尽人白蛋白和IgG(在蛋白水平上复杂性降低),其中利用借助于抗白蛋白和抗lgG抗体的亲和捕捉并利用ProteoPrep离心柱(SigmaAldrich)
-掺加已知量的同位素标记肽。这种肽具有与感兴趣的蛋白水解肽相同的氨基酸序列,通常具有内置的一个同位素标记氨基酸以产生质量差异。在整个过程中,除了在末期定量步骤(其基于分子质量)期间,标记肽具有与内源性肽相同的化学和色谱行为。
-胰蛋白酶消化。利用胰蛋白酶,将在已除尽血清/血浆的样品中的蛋白消化成肽。这种酶从赖氨酸和精氨酸C端地切割蛋白,除了当脯氨酸是赖氨酸或精氨酸的存在C端时。在消化以前,通过煮沸来变性蛋白,其使得在37°C下的16h温育期间,蛋白质分子可以更方便地使用胰蛋白酶活性。
-基于第一肽的分级分离:自由流动电泳(FFE;BD Diagnostic)是无凝胶的、流体分离技术,其中通过垂直于流动方向的电场来分离在连续层流中移动的带电荷分子。电场引起带电荷分子在pH梯度中按照它们的等电点(pI)进行分离。只有包含监测肽的那些组分选择用于进一步分级分离和LC-MS/MS分析。以特定的馏分数,感兴趣的每种肽洗脱自FFE室,上述馏分数是在蛋白质检测显影期间利用合成肽同源物加以确定的。特定的组分或组分池(多路复用)进入分级分离的下一水平。
-基于第二肽的分级分离:按照在肽序列中存在的氨基酸的疏水性和芳族特性,Phenyl HPLC(XBridge Phenyl;Waters)分离肽。通过在增加的pH值(pH 10)下操作柱来实现与后段C18分离的正交性。如Gilar等2005,J Sep Sci 28(14):1694-1703)表明的,在RP-HPLC中,pH是迄今为止最激烈的用来改变肽选择性的参数。感兴趣的每种肽在特定的保留时间下洗脱自Phenyl柱,上述保留时间是在蛋白质检测显影期间利用合成肽同源物加以确定的。使用外部对照系统,其中在一批样品分离前期分离9种标准肽的混合物,便于调节馏分收集,以校正保留时间移动。分级分离的程度依赖于样品中蛋白质的浓度和样品的复杂性。
-基于LC-MS/MS的定量,包括在反相(C18)纳米LC(PepMap C18;Dionex)上的进一步分离和MS/MS:利用MRM(4000 QTRAP;ABI)/SRM(Vantage TSQ;Thermo Scientific)方式的串联质谱法。将LC柱连接于电雾化针,其连接于质谱仪的源头。当材料洗脱自上述柱时,分子被离子化并以气相进入质谱仪。基于质荷比(m/z),具体选择被监测的肽以穿过第一四极子(Q1)。然后在第二四极子(Q2)(其用作碰撞池)中片段化选择的肽。然后,获得的片段进入第三四极子(Q3)。取决于仪器设置(在测定显影阶段期间加以确定),仅一个或多个特异性肽片段(或所谓的转换)被选择用于检测。
-监测肽的m/z和该肽的监测片段的m/z的组合被称作转换。该过程可以用于在一个实验中的多种转换。内源性肽(分析物)和它的相应的同位素标记合成肽(内部标准)在相同的保留时间进行洗脱,并在相同的LC-MS/MS实验中加以测量。
-MASSTERCLASS读数被定义为分析物的峰下面积和合成的同位素标记类似物(内部标准)的峰下面积之间的比率。读数直接相关于样品中蛋白质的原有浓度。因而,可以在不同样品和样品组之间比较读数。
用于靶向肽定量的典型的MASSTERCLASS协议可以是如下:
-按照制造商的协议,除了20mM NH4HCO3用作结合/平衡缓冲液,除尽25μL血浆的人白蛋白和IgG(ProteoPrep离心柱;Sigma Aldrich)。
-在95°C下对除尽的样品(225μL)进行变性15分钟,然后在冰上立即冷却
-在样品中掺加500fmol同位素标记肽(客户定制的'Heavy AQUA'肽;Thermo Scientific)
-将20μg胰蛋白酶加入到样品中并允许在37°C下消化16h
-首先在溶剂A(0.1%甲酸)中1/8稀释消化的样品,然后在包含250amol/μL的感兴趣的所有同位素标记肽(客户定制的'Heavy AQUA'肽;Thermo Scientific)的相同溶剂中1/20稀释消化的样品。
-利用反相纳米LC以及MRM/SRM模式的在线MS/MS来分离最终稀释度的20μL:
-柱:PepMap C18,75μm I.D.x25cm L,孔径,5μm颗粒尺寸
-溶剂A:0.1%甲酸
-溶剂B:80%乙腈,0.1%甲酸
-梯度:30分钟;2%-55%溶剂B
-MS/MS(MRM模式):方法包括分析物以及合成的、标记肽的转换。
-在蛋白质检测显影期间实验上确定和选择所使用的转换
-测量每个感兴趣的转换一段时间:在感兴趣的肽的确定的保留时间开始以前3分钟和以后3分钟,以确保每个峰具有至少15个数据点。
-利用LCQuan软件(Thermo Scientific)来分析和量化原始数据:通过自动峰检测来确定在相同C18保留时间下的分析物峰下面积和内部标准峰下面积,然后对它们进行人工交叉检查。
-MASSterclass读数被定义为分析物峰面积和内部标准峰面积的比率。测得的比率是肽的差分定量。换句话说,比率是肽的归一化浓度。肽的浓度是正比于用质谱仪测得的比率。
Claims (26)
1.胰岛素样生长因子-结合蛋白复合物酸不稳定链(ALS)、包含分解素和金属蛋白酶域的蛋白12(ADA12)、血管生成素(ANGI)、钙蛋白酶-1催化亚单位(CAN1)、巨噬细胞集落刺激因子1受体(CSF1R)、C-反应蛋白(CRP)、绒毛膜生长催乳激素(CSH)、营养不良蛋白聚糖(DAG1)、二肽酶2(DPEP2)、桥粒芯蛋白-2(DSG2)、细胞外基质蛋白质1(ECM1)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员2(ENPP2)、扣针蛋白-1(FBLN1)、原纤蛋白-2(FBN2)、疑似G蛋白偶联受体126(GP126)、肝细胞生长因子样蛋白(HGFL)、细胞间粘附分子3(ICAM3)、转移抑制基因KiSS-1(KISS1)、亮氨酰-胱氨酰氨基肽酶(LCAP)、磷脂酰胆碱-甾醇酰基转移酶(LCAT)、基底膜-特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白(PGBM)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(PGRP2)、磷脂酰肌醇-聚糖-特异性磷脂酶D(PHLD)、过氧化物还原酶1(PRDX1)、过氧化物还原酶2(PRDX2)、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶S(PTPRS)、回旋同系物4(ROBO4)、蛋白S100-A9(S10A9)、血清淀粉样A-4蛋白(SAA4)、腱生蛋白-X(TENX)、三叶因子3(TFF3)、血管内皮生长因子受体3(VGFR3)中的任何一种或多种作为生物标志物,优选作为用于妊娠的高血压疾病的生物标志物的应用。
2.ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3中的任何一种或多种用于妊娠的高血压疾病的诊断、预测、预后和/或监测的应用。
3.一种用于在受试者中诊断、预测、预后和/或监测妊娠的高血压疾病的方法,其中,所述方法的检查阶段包括在来自所述受试者的样品中测量选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何一种或多种标记的量。
4.根据权利要求3所述的方法,用于在所述受试者中诊断、预测和/或预后妊娠的高血压疾病,所述方法包括:
(i)在来自所述受试者的样品中测量选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何一种或多种标记的量;
(ii)使在(i)中测得的一种或多种标记的量与所述一种或多种标记的量的参比值进行比较,所述参比值表示妊娠的高血压疾病的已知的诊断、预测和/或预后;
(iii)发现在(i)中测得的一种或多种标记的量与所述参比值的偏差或没有偏差;以及
(iv)将偏差或没有偏差的所述发现归因于在所述受试者中妊娠的高血压疾病的特定的诊断、预测和/或预后。
5.根据权利要求3所述的方法,用于在所述受试者中诊断、预测和/或预后妊娠的高血压疾病,所述方法包括:
(i)在来自所述受试者的样品中测量选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何两种或更多种标记的量;
(ii)利用(i)的测量结果来建立所述两种或更多种标记的量的受试者分布;
(iii)比较(ii)的所述受试者分布与所述两种或更多种标记的量的参比分布,所述参比分布表示妊娠的高血压疾病的已知的诊断、预测和/或预后;
(iv)发现(ii)的所述受试者分布与所述参比分布的偏差或没有偏差;以及
(v)将偏差或没有偏差的所述发现归因于妊娠的高血压疾病的特定诊断、预测和/或预后。
6.根据权利要求3所述的方法,用于监测妊娠的高血压疾病,所述方法包括:
(i)在来自受试者的来自两个或更多个连续时间点的样品中测量选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何一种或多种标记的量;
(ii)在如在(i)中测得的样品之间比较所述一种或多种标记的量;
(iii)在如在(ii)中比较的样品之间发现所述一种或多种标记的量的偏差或没有偏差;以及
(iv)将偏差或没有偏差的所述发现归因于妊娠的高血压疾病的变化或归因于在所述两个或更多个连续时间点之间在所述受试者中发展妊娠的高血压疾病的可能性的变化。
7.根据权利要求3所述的方法,用于监测妊娠的高血压疾病,所述方法包括:
(i)在来自受试者的来自两个或更多个连续时间点的样品中测量选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何两种或更多种标记的量;
(ii)利用(i)的测量结果来建立在所述两个或更多个连续时间点处所述两种或更多种标记的量的受试者分布;
(iii)比较如在(ii)中建立的所述受试者分布;
(iv)在如在(iii)中比较的所述受试者分布之间发现偏差或没有偏差;以及
(v)将偏差或没有偏差的所述发现归因于妊娠的高血压疾病的变化或归因于在所述两个或更多个连续时间点之间在所述受试者中发展妊娠的高血压疾病的可能性的变化。
8.根据权利要求3所述的方法,用于在所述受试者中诊断、预测和/或预后妊娠的高血压疾病,所述方法包括:
(i)在来自所述受试者并来自第一时间点的样品中测量选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何一种或多种标记的量;
(ii)在来自所述受试者并来自连续的第二时间点的样品中测量所述一种或多种标记的量;
(iii)计算如在(i)和(ii)中测得的所述一种或多种标记的量之间的差异;
(iv)比较如在(iii)中计算的所述差异与在所述第一时间点和第二时间点的所述一种或多种标记的量之间的差异的参比值,所述参比值表示妊娠的高血压疾病的已知的诊断、预测和/或预后;
(v)发现如在(iii)中计算的所述差异与所述参比值的偏差或没有偏差;以及
(iv)将偏差或没有偏差的所述发现归因于在所述受试者中妊娠的高血压疾病的特定诊断、预测和/或预后。
9.根据权利要求3所述的方法,用于在所述受试者中诊断、预测和/或预后妊娠的高血压疾病,所述方法包括:
(i)在来自所述受试者并来自第一时间点的样品中测量选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何两种或更多种标记的量;
(ii)利用(i)的测量结果来建立在所述第一时间点处所述两种或更多种标记的量的受试者分布;
(iii)在来自所述受试者并来自连续的第二时间点的样品中测量所述两种或更多种标记的量;
(iv)利用(iii)的测量结果来建立在所述第二时间点处所述两种或更多种标记的量的受试者分布;
(v)计算如在(ii)和(iv)中建立的所述受试者分布之间的差异;
(vi)比较如在(v)中计算的所述差异与在所述第一时间点和第二时间点处的所述两种或更多种标记的量之间的差异的参比分布,所述参比分布表示妊娠的高血压疾病的已知的诊断、预测和/或预后;
(vii)发现如在(v)中计算的所述差异与所述参比分布的偏差或没有偏差;以及
(viii)将偏差或没有偏差的所述发现归因于在所述受试者中妊娠的高血压疾病的特定诊断、预测和/或预后。
10.一种用来确定受试者是否(例如,仍然、或不再)需要妊娠的高血压疾病的治疗性或预防性治疗的方法,所述方法包括:
(i)在来自所述受试者的样品中测量选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何一种或多种标记的量;
(ii)将在(i)中测得的所述一种或多种标记的量与所述一种或多种标记的量的参比值进行比较,所述参比值表示妊娠的高血压疾病的已知的诊断、预测和/或预后;
(iii)发现在(i)中测得的所述一种或多种标记的量与所述参比值的偏差或没有偏差;以及
(iv)根据所述发现,推断是否需要妊娠的高血压疾病的治疗性或预防性治疗。
11.一种用来确定受试者是否(例如,仍然、或不再)需要妊娠的高血压疾病的治疗性或预防性治疗的方法,所述方法包括:
(i)在来自所述受试者的样品中测量选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何两种或更多种标记的量;
(ii)利用(i)的测量结果来建立所述两种或更多种标记的量的受试者分布;
(iii)比较(ii)的所述受试者分布与所述两种或更多种标记的量的参比分布,所述参比分布表示妊娠的高血压疾病的已知的诊断、预测和/或预后;
(iv)发现(ii)的所述受试者分布与所述参比分布的偏差或没有偏差;以及
(v)根据所述发现,推断是否需要妊娠的高血压疾病的治疗性或预防性治疗。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的方法,其中,用于妊娠的高血压疾病的疗法选自抗高血压治疗、流产和分娩。
13.根据权利要求3至12中任一项所述的方法,其中,所述受试者尚未遭受临床上明显的妊娠的高血压疾病,并且由此预测所述受试者将发展临床上明显的妊娠的高血压疾病的可能性、机会或风险。
14.根据权利要求3至13中任一项所述的方法,由此预测发作的孕龄或产后年龄和/或到妊娠的高血压疾病的发作的剩余时间。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的主题,其中,所述妊娠的高血压疾病是先兆子痫(PE)。
16.根据权利要求3至15中任一项所述的方法,其中,所述检查阶段还包括测量可用于妊娠的高血压疾病的诊断、预测和/或预后的一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量。
17.根据权利要求16所述的方法,其中,所述其它生物标志物选自由可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1,sVEGFR-1)、内皮糖蛋白、胎盘生长因子和血管内皮生长因子(VEGF)组成的组。
18.根据权利要求3至17中任一项所述的方法,还包括在所述受试者中确定HDP的一种或多种危险因子的存在或不存在和/或水平,优选地其中所述危险因子选自未经产、多次妊娠、在妊娠之间延长的时间间隔、在以前的妊娠中HDP或PE的历史或者HDP或PE的家族史、极端的年龄(<20岁和>40岁)、肥胖、慢性高血压、慢性肾病、偏头痛、头痛、(妊娠)糖尿病、多囊卵巢综合征、自身免疫病如狼疮、类风湿性关节炎、结节病或MS、血管或结缔组织疾病、维生素D缺乏、抗磷脂抗体综合征或遗传性易栓症、以前的伴侣患有HDP或PE的男性伴侣、胎儿水肿和不明原因的胎儿宫内生长受限。
19.根据权利要求3至18中任一项所述的方法,其中,利用能够特异性地结合于各自的生物标志物和/或其片段的结合剂来测量任何一种或多种标记的量和/或所述一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量,所述一种或多种标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组。
20.根据权利要求3至19中任一项所述的方法,其中,利用免疫测定技术、或利用质谱分析法、或利用色谱法、或使用所述方法的组合,来测量任何一种或多种标记的量和/或所述一种或多种其它生物标志物的存在或不存在和/或量,所述一种或多种标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组。
21.一种试剂盒,包括(i)用于在来自所述受试者的样品中测量任何一种或多种标记的量的装置,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;以及可选地和优选地(ii)所述一种或多种标记的量的参比值或用于建立所述参比值的装置,其中所述参比值表示妊娠的高血压疾病的已知的诊断、预测和/或预后。
22.一种蛋白、多肽或肽阵列或微阵列,包括(a)选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何一种或多种标记和/或其片段,优选已知量或浓度的所述一种或多种标记和/或其片段;以及(b)可选地和优选地,可用于妊娠的高血压疾病的诊断、预测和/或预后的一种或多种其它生物标志物,优选已知量或浓度的一种或多种其它生物标志物。
23.一种结合剂阵列或微阵列,包括:(a)能够特异性地结合于任何一种或多种标记和/或其片段的一种或多种结合剂,优选已知量或浓度的所述结合剂,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组;以及(b)可选地和优选地,能够特异性地结合于一种或多种可用于妊娠的高血压疾病的诊断、预测和/或预后的其它生物标志物的一种或多种结合剂,优选已知量或浓度的所述结合剂。
24.一种测试装置,能够在来自受试者的样品中测量选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、CSH、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、HGFL、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、SAA4、TENX、TFF3、VGFR3组成的组中的任何一种或多种标记和/或其片段的量,所述测试装置包括:
(i)用于从所述受试者获得样品的装置,
(ii)用于在所述样品中测量所述一种或多种标记和/或片段的量的装置,以及
(iii)用于可视化在所述样品中测得的所述一种或多种标记和/或片段的量的装置。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的主题,其中,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、ICAM3、KISS1、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PTPRS、ROBO4、S10A9、TENX、TFF3组成的组。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的主题,其中,所述标记选自由ALS、ADA12、ANGI、CAN1、CSF1R、CRP、DAG1、DPEP2、DSG2、ECM1、ENPP2、FBLN1、FBN2、GP126、ICAM3、KISS1、LCAP、LCAT、PGBM、PGRP2、PHLD、PRDX1、PRDX2、PTPRS、ROBO4、S10A9、TENX、TFF3组成的组。
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