CN103760342A

CN103760342A - 检测妊娠子痫前期的免疫层析试纸

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Publication number: CN103760342A
Application number: CN201410042477.6A
Authority: CN
Inventors: 关祥乾; 胡怀忠
Original assignee: ORIGISSAY DIAGNOSTICS Ltd
Current assignee: ORIGISSAY DIAGNOSTICS Ltd
Priority date: 2014-01-28
Filing date: 2014-01-28
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2034-01-28
Also published as: CN103760342B

Abstract

本发明公开一种疾病检测工具，具体涉及一种检测妊娠子痫前期疾病的免疫层析试纸。所述检测妊娠子痫前期疾病的免疫层析试纸，所述试纸设置有检测区和质控区；所述检测区设置有主检测线和副检测线，所述主检测线由鼠抗人Adipsin抗体包被形成，所述副检测线为由一种或两种不同的抗体包被形成的一条或两条，所述副检测线中包被的抗体为选自鼠抗人Acrp30抗体和鼠抗人FLRG抗体中的任意一种或两种；所述质控区内设置有质控线，所述质控线为由羊抗鼠IgG多克隆抗体包被形成。本发明免疫层析试纸在检测妊娠的子痫前期疾病可以更加便利化，从而避免血液采集的繁琐步骤；同时该免疫层析试纸检测妊娠子痫前期疾病的灵敏度和特异性均可达到90%。

Description

检测妊娠子痫前期的免疫层析试纸

技术领域

本发明涉及疾病检测工具，具体涉及一种检测妊娠子痫前期疾病的免疫层析试纸。

背景技术

高血压是妊娠期间遇到的最常见的医疗问题，使2-3%的妊娠复杂化。妊娠期间的高血压疾病被分为4类：1、慢性高血压；2、先兆子痫；3、先兆子痫加慢性高血压以及4、妊娠期或妊娠性高血压。慢性高血压被定义为在妊娠前或怀胎20周之前，血压超过140/90mmHg。在妇女妊娠期间首次鉴定到高血压而且怀胎不足20周的时候，血压升高通常表示慢性高血压。相反，在怀胎20周后新发的血压读数升高则要求考虑并排除先兆子痫，也即子痫前期。子痫前期以高达所有妊娠的5%、首次妊娠的10%以及有慢性高血压史的妇女的20-25%的比率发生。妊娠时的高血压疾病可能造成母体和胎儿的发病率，并且它们仍然是母体死亡率的主要来源。

妊娠期高血压所指的是高血压出现在妊娠后半部分（怀胎>20周），没有任何其他子痫前期的特征，并且随后是产后血压正常化。在起初表现出明显的妊娠期高血压的妇女中，约三分之一发展出子痫前期综合症。正因为如此，应该密切观察这些患者这方面的进展。妊娠期高血压的病理生理学是未知的，但在没有子痫前期的特征的情况下，母体和胎儿的结果一般是正常的。但是妊娠期高血压可能是以后生命中高血压的先兆。

子痫前期是妊娠中的多系统疾病，主要在于先前血压正常的妇女在怀胎20周后发展出的新发高血压（收缩压和舒张压分别≥140和90mmHg）以及蛋白尿（在24小时的尿液收集中蛋白排泄≥300mg，或者浸量尺≥2+）。子痫前期还可分为轻度子痫前期和重度子痫前期（收缩压≥160mmHg或舒张压≥110mmHg，蛋白尿>5g/24小时），并且在最严重的情况下可以发展成为子痫。

尽管目前仍未清楚的了解先兆子痫确切的病理生理机制，但其主要是一种胎盘功能障碍疾病，导致伴随有血管痉挛的内皮功能障碍综合征。

虽然缺乏针对子痫前期的预防和治疗方法，但是寻求可以预测该危及生命的妊娠疾病的发展或者有助于该疾病的检测的非侵入性生物标志物仍然是最重要的。

现有技术中已有多种可用于预测子痫前期该种疾病的生物标志物，例如在专利申请号为CN201180019135.7、CN201180030104.1的专利文件中公开了多种可用于诊断、预测、预后和/或监测该种疾病的生物标志物，同时还公开了将各种生物标志物制备成的可检测子痫前期疾病的检测工具，例如试剂盒。

但是现有已经公开的子痫前期检测工具的检测对象大多为血液样品，多数生物或化学标志物均存在于妊娠妇女的血液中。通过检测血液样品中的生物或化学标志物的方式往往比较费时费力。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种检测妊娠子痫前期疾病的免疫层析试纸，该免疫层析试纸在检测妊娠的子痫前期疾病可以更加便利化，从而避免血液采集的繁琐步骤；同时该免疫层析试纸检测妊娠子痫前期疾病的灵敏度和特异性均可达到90%。

为解决以上技术问题，本发明的技术方案是采用一种检测妊娠子痫前期疾病的免疫层析试纸，所述试纸设置有检测区和质控区；

所述检测区设置有主检测线和副检测线，所述主检测线由鼠抗人Adipsin抗体包被形成，所述副检测线为由一种或两种不同的抗体包被形成的一条或两条，所述副检测线中包被的抗体为选自鼠抗人Acrp30抗体和鼠抗人FLRG抗体中的任意一种或两种；所述质控区内设置有质控线，所述质控线为由羊抗鼠IgG多克隆抗体包被形成；

所述免疫层析试纸的检测对象为生物体的尿液；

所述主检测线对于检测对象中Adipsin的检测限浓度为10.5-11.5ng/mL；

所述副检测线对于检测对象中Acrp30的检测限浓度为10-12ng/mL，对于检测对象中FLRG的检测限浓度为10-12ng/mL。

优选的，所述免疫层析试纸的检测对象为妊娠妇女的尿液。

优选的，所述免疫层析试纸为检测妊娠的轻度子痫前期疾病的免疫层析试纸。

优选的，所述主检测线对于检测对象中Adipsin的检测限浓度为11ng/mL。

优选的，所述副检测线对于检测对象中Acrp30的检测限浓度为10ng/mL。

优选的，所述副检测线对于检测对象中FLRG的检测限浓度为10ng/mL。

优选的，所述免疫层析试纸为胶体金免疫层析试纸。

本发明与现有技术相比，其详细说明如下：

本发明采用的核心技术方案为：采用一种检测妊娠子痫前期疾病的免疫层析试纸，所述试纸设置有检测区和质控区；

所述免疫层析试纸的检测对象为生物体的尿液；

Adipsin，又称补体因子D或complement D，本发明人经过长期研究后发现该生物因子可存在于人尿液中，尤其是患有子痫前期的妊娠妇女和健康妊娠妇女的尿液中，该生物因子的含量差别较大。在患有子痫前期的妊娠妇女的尿液中，Adipsin的含量可高达806.75±1507.75ng/ml，而健康妊娠妇女的尿液中，Adipsin的含量通常为2.33±1.48ng/ml。这使得Adipsin可以作为区别子痫前期患者和健康人群的标志物之一。

Acrp30，又名adiponectin、AdipoQ、OBG3、apm1等；其是近年来发现的一种重要的脂肪细胞因子，由244个氨基酸组成，包括由1-17个氨基酸组成的信号肽、18-41位氨基酸组成的non-homologous区、42-107位氨基酸组成的胶原区和108-244位氨基酸组成的球状结构域（gAcrp30）。本发明人经过长期研究后发现该生物因子可存在于人尿液中，尤其是患有子痫前期的妊娠妇女和健康妊娠妇女的尿液中，该生物因子的含量差别较大。在患有子痫前期的妊娠妇女的尿液中，Acrp30的含量可高达23.94±15.69ng/ml，而健康妊娠妇女的尿液中，Acrp30的含量通常为1.06±2.61ng/ml。这使得Acrp30可以作为区别子痫前期患者和健康人群的标志物之一。

卵泡抑素相关基因(follistatin related-gene，FLRG)，是一种富含半胱氨酸的单链糖基化蛋白，与卵泡抑素（follistatin，FS）具有高度的同源性，属于卵泡抑素家族。FLRG结构具有高度的保守性,全长约7kb，包括5个外显子和4个内含子,分别编码信号肽、N末端、两个FS区域、C末端。信号肽为23个氨基酸,含有两个起始密码子。在N末端存在两个糖基化位点使FLRG在成熟过程中N端发生糖基化。FLRG的基本结构域是FS区，由大约70个氨基酸组成，其中含有10个半胱氨酸残基。本发明人经过长期研究后发现该生物因子可存在于人尿液中，尤其是患有子痫前期的妊娠妇女和健康妊娠妇女的尿液中，该生物因子的含量差别较大。在患有子痫前期的妊娠妇女的尿液中，FLRG的含量可高达23.94±15.69ng/ml，而健康妊娠妇女的尿液中，FLRG的含量通常为1.06±2.61ng/ml。这使得FLRG可以作为区别子痫前期患者和健康人群的标志物之一。

本发明人还研究了患有子痫前期的妊娠妇女和健康妊娠妇女的血液中Adipsin、Acrp30以及FLRG的含量差异；通过研究显示，患有子痫前期的妊娠妇女和健康妊娠妇女的血液中Adipsin、Acrp30以及FLRG的含量差异较小；因此，采用血液作为检测对象并不能得到很好的检测效果。

通过本发明人的上述研究可知，Adipsin、Acrp30以及FLRG在作为预测、预后、诊断妊娠的子痫前期疾病的应用中，可优选采用将该上述三种生物标志物应用为制备成定性检测子痫前期的工具，也即快速检测工具，该工具可实现患者便利地自行对该疾病进行预测，从而可更加有效地确保母体和胎儿的安全。

另外，当将Adipsin、Acrp30以及FLRG作为生物标志物，并用于制备妊娠的子痫前期疾病的检测工具，所述检测工具的检测对象为生物体的尿液时，由于检测对象为生物体的尿液，特别是妊娠妇女的尿液，因而可实现无创检测的方法；并且该检测工具可实现对该疾病的定性检测，无需大型的医疗检测设备，因此其检测一个样品通常仅需要5-10分钟，操作简单，孕妇可自行操作，与现有的临床检测方式相比，其检测速度大幅度提高。

进一步的，本发明还在前述的定性检测工具上进一步研究，以达到更好的检测效果。现有定性检测工具中，最为常用的为免疫层析试纸，更优选可采用胶体金免疫层析试纸。当本发明所得的定性检测妊娠的子痫前期疾病的检测工具采用以下优选设置时：采用胶体金免疫层析试纸，其设置有检测区和质控区；

所述免疫层析试纸的检测对象为生物体的尿液；

本发明免疫层析试纸采用上述设置时，所得检测工具在检测妊娠的子痫前期疾病时的灵敏度和特异性均可达到90%以上。

本发明人在此基础上进一步研究了轻度子痫前期和重度子痫前期妊娠妇女患者的尿液中Adipsin、Acrp30以及FLRG的含量差异。

通过研究发现，虽然轻度子痫前期妊娠妇女患者中尿液中的Adipsin、Acrp30以及FLRG的含量与重度子痫前期妊娠妇女患者中Adipsin、Acrp30以及FLRG的含量差别不是特别明显，但通过进一步控制本申请应用方式中检测工具对于Acrp30的检测限浓度可以对轻度子痫前期妊娠患者达到更好的检测效果，其灵敏度和特异性也可达到90%以上。具体为控制检测工具中主检测线对于检测对象中Adipsin的检测限浓度为11ng/mL，控制副检测线对于检测对象中Acrp30的检测限浓度为10ng/mL，控制副检测线对于检测对象中FLRG的检测限浓度为10ng/mL。

本发明所述定性检测工具，其可以采用标志物Adipsin、Acrp30以及FLRG与反应底物反应后得到产物的颜色区别，或与底物结合后产物的颜色区别来定性区分子痫前期或健康妊娠妇女人群。

本发明所述对于Adipsin、Acrp30以及FLRG的检测限浓度应理解为，本发明检测工具在检测子痫前期疾病时，检测样品中Adipsin以及Acrp30和FLRG中的任意一种或两种的浓度高于或等于该检测限浓度时，定性检测结果为阳性，即患有子痫前期；当检测样品中Adipsin以及Acrp30和FLRG中的任意一种或两种的浓度低于该检测限浓度时，定性检测结果为阴性，即未患有子痫前期。上述说明意味着，当仅有副检测线发生颜色变化或仅有主检测线发生颜色变化时，检测结果为阴性；当主检测线发生颜色变化，并且副检测线任意一条或两条发生颜色变化时，检测结果才为阳性。

附图说明

图1是健康对照组与子痫前期组中各两例妊娠妇女的尿液样本的细胞因子/趋化因子抗体芯片检测结果图；其中，B、D为子痫前期组，A、C为健康对照组。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

以下实施例均为在华西第二医院采集的试验样品，

实施例1

子痫前期组：124例子痫前期妊娠妇女；

健康对照组：135例健康妊娠妇女；

实验对象临床筛选标准：

子痫前期组—（i）收缩压≥140mmHg；

（ii）舒张压≥90mmHg；

（iii）在24小时的尿液收集中蛋白排泄≥300mg，或者浸量尺≥2+。

健康对照组—（i）收缩压<140mmHg；

（ii）舒张压<90mmHg；

（iii）在24小时的尿液收集中蛋白排泄<300mg，或者浸量尺<2+。

实验对象年龄分布：124例子痫前期组妊娠妇女平均年龄28岁（年龄范围19-35岁），健康对照组平均年龄30岁（年龄范围18-43岁）。

样本收集方法：取各实验组的尿液样本。

A、实验方法：细胞因子/趋化因子抗体芯片定性检测

实验条件：

1)将预先标记有174个细胞因子抗体的膜（RayBiotech，美国）放入检测盒中，然后加入2ml封闭液，室温封闭6小时；

2)弃去封闭液，加入1.2ml待检样本1份，4℃过夜孵育；

3)弃去样本，用2ml洗涤缓冲液清洗5次；

4)加入1ml生物素偶联的检测抗体，室温孵育2小时；

5)弃去抗体，用2ml洗涤缓冲液清洗5次；

6)加入2ml辣根过氧化物酶（HRP）偶联的链霉素亲和素，室温孵育2小时；

7)弃去液体，用2ml洗涤缓冲液清洗5次；

8)在膜上加入化学发光试剂500μl，避光作用2分钟，观察结果。

从子痫前期组、健康对照组中各收集的待测样本均采用上述实验条件进行检测，所得结果如图1所示。

实验结果：图1中的标记1为Acrp30的表达信号，标记2为Adipsin的表达信号，标记3为FLRG的表达信号。

从图1中可以看出，子痫前期组中的Acrp30、Adipsin以及FLRG的表达较强，而健康对照组中上述三者的表达较弱。

B、实验方法：酶联免疫吸附法定量检测

实验条件：

实验材料：Adipsin、Acrp30以及FLRG的ELISA检测试剂盒（R&D公司）

1.试剂的配制

洗涤缓冲液（Wash Buffer）

底物溶液（Substrate Solution）：使用前，将试剂盒中的显色剂A和显色剂B等量、避光混合15分钟，每个孔需要两种显色剂的混合物200μl。

Adipsin、Acrp30以及FLRG标准品：用1ml去离子水分别将Adipsin、Acrp30以及FLRG标准品稀释。稀释后的标准品原液浓度为250ng/ml。为确保标准品充分混匀，在进一步稀释前，将标准品放于摇床上轻轻晃动混匀至少15分钟以上。

分别将250ng/ml的标准品配置成浓度为50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.13ng/ml、1.56ng/ml的Acrp30检测标准品；RD5-7校准稀释剂作为空白对照（0ng/ml）

2.检测程序

向每个微孔中单独分别加入100μl Adipsin、Acrp30以及FLRG的Conjugate；标准品、对照物、样本的加入量为100μl，并加入到对应的微孔中。将微孔用试剂盒提供的胶条盖好。将微孔板在室温条件下置于水平摇床上500±50转/分钟培育1.5小时。洗板；每孔加底物溶液（Substrate Solution）200μl，室温条件下，避光、平放培育30分钟；每孔加50μl终止液（Stop Solution）。孔中溶液的颜色将由蓝色变为黄色。如果孔中溶液颜色为绿色或颜色变化不一致，轻轻拍打平板，以确保溶液充分混匀；30分钟内测450nm吸光值。

3.制作标准曲线，计算样本含量。

4.将计算所得的每个待测样本的含量统计并绘制成图表，并进行统计分析。

实验结果：Adipsin、Acrp30以及FLRG在子痫前期组尿液样本中的浓度最高，分别平均可达到740.04±1067.92ng/mL，23.94±15.69ng/mL和15.47±21.40ng/mL；Adipsin、Acrp30以及FLRG在健康对照组尿液样本中的浓度较低，分别平均为5.58±5.50ng/mL，1.06±2.61ng/mL和0.18±0.37ng/mL。

从实施例1的实验结果可知，发生子痫前期的妊娠妇女的尿液中含有大量的Adipsin、Acrp30以及FLRG，而健康对照组的妊娠妇女的尿液中的Adipsin、Acrp30以及FLRG含量较少。

并且从实施例1的实验结果可知，可将Adipsin、Acrp30以及FLRG作为生物标志物，并用于制备妊娠的子痫前期疾病的定性检测工具，所述定性检测工具为免疫层析试纸，其检测对象为生物体的尿液，特别是妊娠妇女的尿液。

所述试纸设置有检测区和质控区；

以下是以妊娠妇女尿液中Adipsin、Acrp30以及FLRG为检测目标分子，并按照不同方式制备所得的定性检测工具的对照例，各对照例的制备方法如下：

对照例1

免疫层析试纸，其检测对象为生物体的尿液，特别是妊娠妇女的尿液。

所述试纸设置有检测区和质控区；

所述检测区设置有主检测线和副检测线，所述主检测线由鼠抗人Adipsin抗体包被形成，所述副检测线为由鼠抗人Acrp30抗体包被形成；所述质控区内设置有质控线，所述质控线为由羊抗鼠IgG多克隆抗体包被形成；

所述免疫层析试纸中胶体金浓度设置为0.5g/100ml，主检测线中鼠抗人Adipsin抗体的浓度为0.3mg/ml；副检测线中鼠抗人Acrp30抗体的浓度为0.5mg/ml；所述控制线中羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.2mg/ml。

所述主检测线对于检测对象中Adipsin的检测限浓度为10.5ng/mL；

所述副检测线对于检测对象中Acrp30的检测限浓度为12ng/mL。

对照例2

所述试纸设置有检测区和质控区；

所述检测区设置有主检测线和副检测线，所述主检测线由鼠抗人Adipsin抗体包被形成，所述副检测线为由鼠抗人FLRG抗体包被形成；所述质控区内设置有质控线，所述质控线为由羊抗鼠IgG多克隆抗体包被形成；

所述免疫层析试纸中胶体金浓度设置为2g/100ml，主检测线中鼠抗人Adipsin抗体的浓度为2.0mg/ml；副检测线中鼠抗人FLRG抗体的浓度为3mg/ml；所述控制线中羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1.0mg/ml。

所述主检测线对于检测对象中Adipsin的检测限浓度为11.5ng/mL；

所述副检测线对于检测对象中FLRG的检测限浓度为12ng/mL。

对照例3

所述试纸设置有检测区和质控区；

所述检测区设置有主检测线和副检测线，所述主检测线由鼠抗人Adipsin抗体包被形成，所述副检测线为由鼠抗人Acrp30抗体和鼠抗人FLRG抗体分别包被形成两条副检测线；所述质控区内设置有质控线，所述质控线为由羊抗鼠IgG多克隆抗体包被形成；

所述免疫层析试纸中胶体金浓度设置为1.0g/100ml，主检测线中鼠抗人Adipsin抗体的浓度为1.5mg/ml；副检测线中鼠抗人Acrp30抗体的浓度为1.2mg/ml，鼠抗人FLRG抗体的浓度为1.2mg/ml；所述控制线中羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.5mg/ml。

所述主检测线对于检测对象中Adipsin的检测限浓度为10.5ng/mL；

所述副检测线对于检测对象中Acrp30的检测限浓度为12ng/mL，对于检测对象中FLRG的检测限浓度为12ng/mL。

对照例4

所述试纸设置有检测区和质控区；

所述免疫层析试纸中胶体金浓度设置为1.5g/100ml，主检测线中鼠抗人Adipsin抗体的浓度为1.8mg/ml；副检测线中鼠抗人Acrp30抗体的浓度为2.0mg/ml，鼠抗人FLRG抗体的浓度为2.0mg/ml；所述控制线中羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.5mg/ml。所述主检测线对于检测对象中Adipsin的检测限浓度为11.5ng/mL；

所述副检测线对于检测对象中Acrp30的检测限浓度为11ng/mL，对于检测对象中FLRG的检测限浓度为11ng/mL。

对照例5

所述试纸设置有检测区和质控区；

所述免疫层析试纸中胶体金浓度设置为1.7g/100ml，主检测线中鼠抗人Adipsin抗体的浓度为1.8mg/ml；副检测线中鼠抗人Acrp30抗体的浓度为2.5mg/ml，鼠抗人FLRG抗体的浓度为2.5mg/ml；所述控制线中羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为0.5mg/ml。

所述主检测线对于检测对象中Adipsin的检测限浓度为11ng/mL；

所述副检测线对于检测对象中Acrp30的检测限浓度为10ng/mL，对于检测对象中FLRG的检测限浓度为10ng/mL。

上述对照例1-5中的材料来源如下：

鼠抗人Adipsin抗体：RD公司，美国

鼠抗人Acrp30抗体：RD公司，美国

鼠抗人FLRG抗体：RD公司，美国

羊抗鼠IgG多克隆抗体：武汉博士德公司，中国

实施例2

将不同方法获得的对照例1-5子痫前期定性检测工具-免疫层析试纸分别用于检测实施例1中的妊娠妇女尿液的临床样本，包括有子痫前期组和健康对照组，其中子痫前期组中的124例根据收缩压和舒张压大小以及蛋白尿24小时量区分为重度子痫前期组（sPE，筛选标准：收缩压≥160mmHg，舒张压≥110mmHg，蛋白尿>5g/24小时）54例和轻度子痫前期组（mPE，收缩压≥140mmHg，舒张压≥90mmHg，在24小时的尿液收集中蛋白排泄≥300mg）70例。健康对照组为135例。

样本收集：取妊娠妇女尿液样本。

利用对照例1-5分别对所收集的259例样本进行检测，所得检测结果的阴性和阳性例数统计见表一：

表一

上表一中，对照例1-5本发明的子痫前期定性检测工具-免疫层析试纸的实施方式；特别的，对照例5为针对于轻度子痫前期的定性检测工具-免疫层析试纸的实施方式。

从实施例2的上表一数据可以得出，本发明可以获得直接对子痫前期进行定性检测的检测工具，并且优选的，通过本发明的进一步改进后，所获得的子痫前期定性检测工具可以明显提高其在检测轻度子痫前期患者的灵敏度和特异性，分别达到90%以上。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种检测妊娠子痫前期疾病的免疫层析试纸，所述试纸设置有检测区和质控区；其特征在于：

所述免疫层析试纸的检测对象为生物体的尿液；

2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于：所述免疫层析试纸的检测对象为妊娠妇女的尿液。

3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于：所述免疫层析试纸为检测妊娠的轻度子痫前期疾病的免疫层析试纸。

4.根据权利要求3所述的免疫层析试纸，其特征在于：所述主检测线对于检测对象中Adipsin的检测限浓度为11ng/mL。

5.根据权利要求3所述的免疫层析试纸，其特征在于：所述副检测线对于检测对象中Acrp30的检测限浓度为10ng/mL。

6.根据权利要求3所述的免疫层析试纸，其特征在于：所述副检测线对于检测对象中FLRG的检测限浓度为10ng/mL。

7.根据权利要求1所述的免疫层析试纸，其特征在于：所述免疫层析试纸为胶体金免疫层析试纸。