CN101517078A - 诊断和治疗妊娠并发症的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了采用改变可溶内皮糖蛋白、内皮一氧化氮合酶、PGI2、TGF－β1、TGF－β3、激活蛋白A、BMP2、BMP7和sFlt－1表达水平或生物活性的化合物的组合治疗妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫和子痫的方法。也公开了诊断妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫和子痫的方法，该方法包括测量以下任意一种或多种：可溶内皮糖蛋白、内皮一氧化氮合酶、PGI2、TGF－β1、TGF－β3、激活蛋白A、BMP2、BMP7和sFlt－1表达水平或生物活性。

Description

诊断和治疗妊娠并发症的方法
发明领域
总体地说，本发明涉及患有妊娠相关的高血压病症的受试者的检测和治疗。
发明背景
先兆子痫是高血压、水肿和蛋白尿的综合征，其影响5-10％的妊娠，并导致显著产妇和胎儿发病率及死亡率。先兆子痫造成全世界每年至少200,000名产妇死亡。先兆子痫的症状一般地在妊娠第20周后出现，且通常是通过常规测量妇女的血压和尿而检测出来的。然而，这些监控方法不能有效诊断早期综合征，如果采取有效的治疗，所述诊断就可减少对受试者或发育中胎儿的危险。
目前还没有已知的先兆子痫疗法。先兆子痫的严重程度可从轻度直至威胁生命。轻度形式的先兆子痫可通过卧床休息和经常监控来治疗。对于中度至严重的病例，建议住院并接受血压药物治疗或抗惊厥剂药物治疗，以防止癫痫发作。如果状况威胁到母亲或婴儿的生命，则要终止妊娠并在预产期前分娩出婴儿。
胎儿和胎盘的正确发育是由几种生长因子或血管发生因子介导的。这些血管发生因子中的一种是内皮糖蛋白，其也称作CD105。内皮糖蛋白是一种同二聚体细胞膜糖蛋白，其主要在内皮细胞(如合胞滋养层、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和血管内皮细胞)上表达。内皮糖蛋白与β聚糖，即一种III型转化生长因子(TGF)-β受体共有序列同一性。已经表明，内皮糖蛋白是TGF-β受体复合物的调节组分，其调节血管发生、增殖、分化和细胞凋亡。内皮糖蛋白也结合TGF-β超家族的几种其它成员，包括激活蛋白-A、骨形态发生蛋白(BMP)-2和BMP-7。具体地，内皮糖蛋白以高亲和力结合TGF-β1和TGF-β3，并与TGF-β信号传导受体I和II型形成异三聚体缔合。内皮糖蛋白基因的编码区的突变造成1型出血性毛细管扩张(HHT1)，这是一种显性遗传的血管病症，其特征在于多系统的血管发育异常和复发性出血。尽管以前已经在转移性乳腺癌和结肠直肠癌患者的血浆中检测到增高水平的内皮糖蛋白免疫反应性，但还没有确定其生化特征，并且其在癌症的发病机理中的确切功能作用还不清楚。尚未报道可溶内皮糖蛋白生成与先兆子痫或正常妊娠有关。
已经报道几种因子与胎儿和胎盘发育有关，且更具体地与先兆子痫有关。它们包括血管内皮生长因子(VEGF)、可溶的Flt-1受体(sFlt-1)和胎盘生长因子(PlGF)。VEGF是内皮细胞特异性的促分裂原、血管发生诱导物和血管通透性的介质。已经表明VEGF对于肾小球毛细血管修复是重要的。VEGF作为同二聚体与两种同源跨膜酪氨酸激酶受体(fms-样酪氨酸激酶(Flt-1)和激酶结构域受体(KDR))之一结合，所述受体在从很多不同组织获得的内皮细胞中差别表达。Flt-1(而不是KDR)由促成胎盘形成的滋养层细胞高度表达。PlGF是VEGF家族成员，其也参与胎盘发育。PlGF由细胞滋养层及合胞滋养层表达，且能够诱导内皮细胞的增殖、迁移及活化。PlGF作为同二聚体与Flt-1受体结合，但不与KDR受体结合。PlGF和VEGF均可对促有丝分裂活性和血管发生作出贡献，后者对于发育中的胎盘是至关重要的。
近来已经在人脐静脉内皮细胞的培养基中鉴别了sFlt-1，其缺少受体的跨膜和胞质结构域，并随后在胎盘组织中证实了体内表达。sFlt-1以高亲和力与VEGF结合，但不会刺激内皮细胞的有丝分裂发生。小心地调节血管发生和促有丝分裂信号传导途径对于由发育中的胎盘的滋养层细胞维持适宜的增殖、迁移和血管发生是至关重要的。
需要准确诊断有风险患有或患有先兆子痫或子痫的受试者的方法，特别是在发作最严重的症状之前。还需要进行治疗。
发明概述
我们已经发现了诊断和治疗妊娠相关的高血压病症(包括先兆子痫和子痫)的方法。
利用基因表达分析，我们已经发现在来自患有与高血压有关的妊娠并发症(包括先兆子痫)的孕妇的胎盘组织样品中，可溶内皮糖蛋白(sEng)的水平显著提高。采用蛋白印迹，我们也发现可溶内皮糖蛋白水平在获自患有妊娠相关高血压病症，如先兆子痫和子痫的女性的血清样品中提高。可溶内皮糖蛋白可以由蛋白水解酶切割膜结合形式的胞外部分而形成。我们发现在这些样品中检测到的可溶内皮糖蛋白最少含有全长内皮糖蛋白的氨基末端部分的前381个氨基酸(排除前导肽，包括前导肽则是406个)。如本文描述的，先兆子痫中的过量可溶内皮糖蛋白可以通过阻止TGF-β1与内皮细胞上的TβRII结合而导致信号传递减少，从而从胎盘消耗必要量的这些必须血管发生和促有丝分裂因子。我们也发现了可溶内皮糖蛋白干扰内皮细胞中的TGF-β1信号传递和内皮一氧化氮合酶(eNOS)激活，从而破坏维持血管健康所必须的关键平衡机制。我们证明了可溶内皮糖蛋白阻止TGF-β1与内皮细胞上的TβRII结合而导致信号传递减少。由于循环TGF-β1与潜伏相关肽和潜伏TGF-β1结合蛋白复合，它不能结合其受体，除非被激活。因此，可溶内皮糖蛋白可能仅仅在产生活性TGF-β1的部位局部抑制TGF-β1作用。综合考虑，这些数据提示了内皮糖蛋白在联系TGF-β受体激活与一氧化氮(NO)合成中的关键作用。此外，我们的功能研究提示可溶内皮糖蛋白和sFlt1分别通过干扰TGF-β1和VEGF信号传递而协同诱导血管破坏和HELLP综合征，这可能是通过抑制NOS的下游激活。
在本发明中，使用结合或中和可溶内皮糖蛋白的化合物来降低提高的水平的可溶内皮糖蛋白并且治疗与高血压相关的妊娠并发症，包括先兆子痫或子痫。例如，也提供了可溶内皮糖蛋白的抗体以及用于降低生物活性可溶内皮糖蛋白的水平的RNA干扰和反义核碱基(nucleobase)寡聚体。本发明也涉及任何降低可溶内皮糖蛋白的水平或生物活性，或提高可溶内皮糖蛋白结合蛋白(如可溶内皮糖蛋白结合蛋白(如TGF-β1，TGF-β3，激活蛋白A，骨形态发生蛋白(BMP)-2和BMP-7)、NOS和前列环素的水平或生物活性的化合物(如多肽、小分子、抗体、核酸和模拟物)在治疗或预防受试者中的妊娠相关高血压病症，如先兆子痫或子痫中的用途，上述化合物是单独的或与彼此组合，或与任何降低sFlt-1的水平或提高VEGF或PlGF的水平或活性的化合物(参见例如美国专利申请公开号20040126828，20050025762，和20050170444以及PCT公开号WO 2004/008946和WO2005/077007)组合。本发明也涉及测量单独的或与sFlt-1、VEGF、PlGF、TGF-β、eNOS或PGI2组合的可溶内皮糖蛋白的水平的方法，作为早期诊断和控制妊娠相关高血压病症，包括先兆子痫和子痫的检测工具。
因此，第一方面，本发明涉及治疗或预防受试者中的妊娠相关的高血压病症的方法，该方法包括给受试者施用(i)能够降低可溶内皮糖蛋白表达水平或生物活性的化合物，和(ii)能够降低sFlt-1表达水平或生物活性的化合物，施用的时间和量足以治疗或预防妊娠相关的高血压病症。妊娠相关的高血压病症包括例如先兆子痫、子痫、妊娠高血压、慢性高血压、HELLP综合征和具有小于胎龄(small for gestationalage，SGA)婴儿的妊娠。优选地，妊娠相关的高血压病症是先兆子痫或子痫。
可溶内皮糖蛋白或sFlt-1表达水平或生物活性的测定是本领域已知的。优选的化合物将使可溶内皮糖蛋白或sFlt-1表达水平或生物活性降低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。能够降低可溶内皮糖蛋白表达水平或生物活性的化合物的非限制性实例包括任何特异性结合可溶内皮糖蛋白的化合物，例如纯化的可溶内皮糖蛋白抗体、可溶内皮糖蛋白抗原结合片段，或可溶内皮糖蛋白结合蛋白(例如TGF-β1，TGF-β3，激活蛋白A，BMP-2和BMP-7)。
能够降低可溶内皮糖蛋白表达水平或生物活性的化合物的其它实例包括任何抑制蛋白水解酶(如基质金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶和弹性蛋白酶)的化合物或提高能够结合可溶内皮糖蛋白的生长因子水平的化合物。生长因子如TGF-β1，TGF-β3，激活蛋白A，BMP-2，BMP-7或其片段是提高能够结合可溶内皮糖蛋白的生长因子水平的化合物的实例，环孢菌素、α生育酚、美西麦角、溴隐亭和爱道美也是这样的化合物。
能够降低sFlt-1表达水平或生物活性的化合物的非限制性实例包括能够特异性结合sFlt-1的化合物，例如纯化的sFlt-1抗体或sFlt-1抗原结合片段；提高能够结合sFlt-1的生长因子水平的化合物，如烟碱，茶碱，腺苷，硝苯地平，米诺地尔和硫酸镁，VEGF(如VEGF121，VEGF165，或VEGF的修饰形式)，PlGF，或其片段。
在上述方法的优选实施方案中，能够降低可溶内皮糖蛋白表达水平或生物活性的化合物，或能够降低sFlt-1表达水平或生物活性的化合物，或这两者，也能够使一氧化氮合酶(NOS)活性提高至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。NOS活性的测定是本领域已知的，并且在本文中描述。
第二方面，本发明涉及治疗或预防受试者中的妊娠相关高血压病症的方法，该方法包括给受试者施用能够提高NOS的表达水平或生物活性的化合物的步骤，施用的时间和量足以治疗或预防受试者中的妊娠相关的高血压病症。理想地，NOS是eNOS。在一个实施方案中，所述化合物是增加eNOS的Ser 1177的磷酸化的化合物，如VEGF(如VEGF121，VEGF165，或VEGF的修饰形式)或其生物活性片段，或PlGF或其生物活性片段。在另一实施方案中，所述化合物是增加eNOS的Thr495的去磷酸化的化合物，如TGF-β1或TGF-β3、激活蛋白A、BMP-2和BMP-7。在另一实施方案中，所述化合物是阻止eNOS的水平降低或增加eNOS的稳定性的化合物。
任选地，该方法进一步包括给受试者施用能够降低可溶内皮糖蛋白表达水平或生物活性的化合物，其中所述施用足以治疗或预防受试者中的妊娠相关的高血压病症。能够降低可溶内皮糖蛋白表达水平或生物活性的化合物的非限制性实例包括特异性结合可溶内皮糖蛋白的纯化抗体或可溶内皮糖蛋白抗原结合片段或抑制选自基质金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶和弹性蛋白酶的蛋白水解酶的化合物，或生长因子如TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白A、BMP-2、BMP-7或其片段。特异性结合可溶内皮糖蛋白的示例性抗体包括结合可溶内皮糖蛋白多肽的抗体，所述多肽包括选自图30B所示人内皮糖蛋白序列的氨基酸26-437、40-406或26-587的氨基酸序列。用于本发明的方法中的其它示例性抗体包括结合人内皮糖蛋白上的表位的抗体，所述表位包括图30B所示人内皮糖蛋白序列的氨基酸40-86、144-199、206-222、289-304或375-381。
在一个实施方案中，妊娠相关的高血压病症的特征在于与正常参照相比提高的sFlt-1多肽水平。任选地，该方法进一步包括给受试者施用能够降低sFlt-1表达或生物活性的化合物，其中所述施用足以治疗或预防受试者中的妊娠相关的高血压病症。能够降低可溶sFlt-1表达或生物活性的化合物的非限制性实例包括特异性结合sFlt-1的纯化抗体或sFlt-1抗原结合片段，或生长因子如VEGF(如VEGF121、VEGF165或VEGF的修饰形式)、PlGF或其结合sFlt-1的片段。
对于任何上述方法，该方法可进一步包括给受试者施用抗高血压化合物的步骤。在任何上述方法的优选实施方案中，受试者是妊娠的人、分娩后的人或非人(如牛、马、绵羊、猪、山羊、狗和猫)。
对于任何上述方法，该方法可以进一步包括监测受试者中妊娠相关的高血压病症的步骤，其中所述监测包括测量来自受试者的血清或血浆样品中可溶内皮糖蛋白多肽的水平。如果测定可溶内皮糖蛋白的绝对水平，低于25ng/ml的可溶内皮糖蛋白多肽的水平表明妊娠相关的高血压病症的改善。或者或此外，可以在两种或多种场合下测量可溶内皮糖蛋白水平或与阳性参照样品(例如来自患有妊娠相关的高血压病症的受试者)比较，其中测量值之间或与阳性参照相比可溶内皮糖蛋白的减少是妊娠相关的高血压病症改善的指标。可溶内皮糖蛋白水平的测量可以包括使用免疫学测定。可溶内皮糖蛋白可以包括游离的、结合的或总的可溶内皮糖蛋白或降解或酶切得到的内皮糖蛋白多肽的水平。监测方法也可以包括本文描述的用于诊断先兆子痫或子痫的任何度量标准。例如，监测方法可以包括测量受试者中妊娠的前三个月和妊娠的次三个月中sFlt-1和可溶内皮糖蛋白的水平，并且用以下公式计算每个三月期中sFlt1 x可溶内皮糖蛋白(sEng)的δ乘积：[d乘积(dproduct)＝妊娠的次三个月中的(sFlt1xsEng)-妊娠的前三个月中的(sFlt1xsEng)]，其中大于0、1、2或更高的值，包括其分数，(例如正值)是先兆子痫或子痫的诊断指标。该值随时间的减少表明妊娠相关的高血压病症的改善。在另一实例中，计算妊娠的前三个月和妊娠的次三个月之间sFlt-1水平(dsFlt-1)或sEng水平(dsEng)之间的δ乘积，并且对于(dsFlt-1)或(dsEng)，大于0、1、2或更高的值，包括其分数，(例如正值)是先兆子痫或子痫的诊断指标。该值随时间的减少表明妊娠相关的高血压病症的改善。
对于任何所述监测方法，该方法可以用于确定化合物的治疗剂量。该方法也可以进一步包括测量来自受试者的样品中sFlt-1、VEGF或PlGF多肽中至少一种多肽的水平，这些水平之间的关系也可以，但不是必须用度量标准计算。示例性度量标准包括[(sFlt-1+0.25可溶内皮糖蛋白)/PlGF]、[(可溶内皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF]、[sFlt-1x可溶内皮糖蛋白]，和上文描述的[d乘积＝妊娠的次三个月中的(sFlt1xsEng)-妊娠的前三个月中的(sFlt1xsEng)]。
另一方面，本发明涉及特异性结合可溶内皮糖蛋白多肽的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合人内皮糖蛋白上的表位，所述表位包括图30B所示人内皮糖蛋白序列的氨基酸40-86、144-199、206-222、289-304或375-381。在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段防止生长因子(如TGF-β1，TGF-β3，激活蛋白A，BMP-2和BMP-7)与可溶内皮糖蛋白结合。
所述抗体可以是任何类型的抗体或抗体片段，包括单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、缺乏Fc部分的抗体，是F(ab’)2、Fab或Fv结构。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段存在于药学可接受的载体中。
另一方面，本发明涉及诊断患有妊娠相关的高血压病症或具有患所述病症的倾向的受试者的方法，该方法包括测量来自受试者的样品中可溶内皮糖蛋白多肽和至少一种另外的多肽的水平，所述至少一种另外的多肽选自可溶内皮糖蛋白结合蛋白(如TGF-β1，TGF-β3，激活蛋白A，BMP2和BMP7)和可溶内皮糖蛋白信号传递的下游介质(如eNOS和PGI2)，其中与正常参照样品、标准或水平相比，可溶内皮糖蛋白水平的提高和至少一种另外的多肽的水平的降低，是妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向的诊断指标。
另一方面，本发明涉及诊断患有妊娠相关的高血压病症或具有患所述病症的倾向的受试者的方法，该方法包括测量来自受试者的可溶内皮糖蛋白多肽和sFlt-1多肽的水平，并且用[可溶内皮糖蛋白x sFlt-1]度量标准计算可溶内皮糖蛋白和sFlt-1水平之间的关系，其中相对于正常参照样品，受试者样品中该度量标准的增加是受试者中妊娠相关的高血压病症的诊断指标。
另一方面，本发明涉及诊断患有妊娠相关的高血压病症或具有患所述病症的倾向的受试者的方法，该方法包括测量受试者妊娠的前三个月和妊娠的次三个月中sFlt-1和可溶内皮糖蛋白的水平，并且用以下公式计算每个三月期中sFlt1 x可溶内皮糖蛋白(sEng)的δ乘积：[d乘积＝妊娠的次三个月中的(sFlt1xsEng)-妊娠的前三个月中的(sFlt1xsEng)]，其中大于0、1、2或更高的值，包括其分数(例如正值)，是先兆子痫或子痫的诊断指标。正值也可以是早发先兆子痫的指标。可以在妊娠的前三个月和妊娠的次三个月的许多场合下进行所述测量，并且可以随时间跟踪d乘积。
另一方面，本发明涉及诊断患有妊娠相关的高血压病症或具有患所述病症的倾向的受试者的方法，该方法包括测量受试者中妊娠的前三个月和妊娠的次三个月中sFlt-1和可溶内皮糖蛋白的水平，并且计算妊娠的前三个月和妊娠的次三个月之间sFlt-1水平(dsFlt-1)或sEng水平(dsEng)的δ乘积，其中对于(dsFlt-1)或(dsEng)，大于0、1、2或更高的值，包括其分数(例如正值)，是先兆子痫或子痫的诊断指标。
对于本发明的任何诊断方法，该测量可以包括利用免疫学测定，如ELISA。在一个实施方案中，正常参照样品是来自患者的先前的样品。在另一实施方案中，度量标准也包括母亲的体重指数或胎儿的胎龄。样品可以是受试者的体液(例如，尿、羊水、血液、血清和血浆)、细胞(如内皮细胞、白细胞、单核细胞和来源于胎盘的细胞)或组织(如胎盘组织)，其中可溶内皮糖蛋白通常是可检测的。受试者可以是非妊娠的人、妊娠的人、产后的人，或非人类(例如，牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫)，并且该方法可以用于诊断妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向(例如，在症状发作前至少4周)。
另一方面，本发明涉及用于诊断受试者中的妊娠相关的高血压病症的试剂盒，该试剂盒包含：(i)可溶内皮糖蛋白结合剂，和(ii)至少一种另外的结合剂，其结合选自TGF-β1、TGF-β3、eNOS和PGI2的多肽；和(iii)使用(i)的结合剂和(ii)的至少一种结合剂来诊断妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向的说明书。结合剂可以是特异性结合可溶内皮糖蛋白的抗体或其抗原结合片段，或特异性结合TGF-β1、TGF-β3、eNOS或PGI2的抗体或其抗原结合片段。
任选地，该试剂盒也包含VEGF、sFlt-1或PlGF结合分子。
另一方面，本发明涉及鉴定改善妊娠相关的高血压病症的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使细胞与可溶内皮糖蛋白化合物接触；
(b)在与可溶内皮糖蛋白化合物接触后确定细胞中eNOS的Thr495的磷酸化状态；
(c)使细胞与候选化合物接触；
(d)在细胞与候选化合物接触后确定细胞中eNOS的Thr495的磷酸化状态；和
(e)比较步骤(b)和步骤(d)中确定的磷酸化状态，其中与步骤(b)相比，步骤(d)中eNOS的Thr495的去磷酸化的增加，鉴定候选化合物为改善妊娠相关的高血压病症的化合物。
另一方面，本发明涉及鉴定改善妊娠相关的高血压病症的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使细胞与Smad2/3依赖性报道构建体和可溶内皮糖蛋白化合物接触；
(b)确定步骤(a)的细胞中Smad2/3报道构建体的激活水平；
(c)使步骤(a)的细胞与候选化合物接触；
(d)确定步骤(c)的细胞中Smad2/3报道构建体的激活水平；和
(e)比较步骤(b)和步骤(d)中确定的Smad2/3报道构建体的激活水平，
其中与步骤(b)相比，步骤(d)中Smad2/3报道构建体的激活水平的增加，鉴定候选化合物为改善妊娠相关的高血压病症的化合物。
对于任何上述方面，妊娠相关的高血压病症可以是先兆子痫、子痫、妊娠高血压、慢性高血压、HELLP综合征，和具有SGA婴儿的妊娠。在一个实施方案中，妊娠相关的高血压病症是先兆子痫或子痫。
如下文所述，我们发现可溶内皮糖蛋白/TGF-β和sFlt-1/VEGF/PlGF信号传递途径这两者的下调可以一起作用于妊娠相关的高血压病症的病理。因此，本发明也涉及本文描述的方法与美国专利申请公开号20040126828，20050025762，20050170444，2006/0067937和20070104707以及PCT公开号WO 2004/008946，WO2005/077007和WO 06/034507中描述的任何治疗、诊断或监测方法的组合。
就本发明的目的而言，在下面定义了下列缩写和术语。
“改变”指一种变化(提高或降低)。改变可以包括通过诸如下文描述的标准技术已知方法检测的基因或多肽的表达水平的改变。如本文所使用的，改变包括表达水平10％的改变、优选表达水平25％的改变、更优选表达水平40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的改变。“改变”还指本发明任意多肽(例如，可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF、PlGF、eNOS或TGFβ家族成员)的生物活性的改变(提高或降低)。如本文所使用的，改变包括生物活性10％的改变、优选生物活性25％的改变、更优选生物活性40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的改变。可溶内皮糖蛋白的生物活性的实例是血管发生和与诸如激活蛋白-A、BMP2、BMP-7、TGF-β1和TGF-β3的底物的结合。通过本领域标准的或本文所述的配体结合测定、免疫测定和血管发生测定，可以测量可溶内皮糖蛋白的生物活性。这样的测定的一个实例是，体外matrigel内皮管形成测定，其中内皮糖蛋白信号传递的拮抗作用导致毛细管形成的大量丧失(Li等，Faseb Journal 14：55-64(2000))。eNOS的生物活性的实例是本领域已知的，并且包括催化从氧和精氨酸形成一氧化氮或“NO”。TGF-β的生物活性的实例包括调节许多细胞类型的生长、分化、运动性、组织重塑、神经发生、创伤修复、凋亡和血管发生。可以通过本领域已知或本文描述的测定方法测量所述活性。TGF-β也抑制很多细胞类型的细胞增殖并且可以刺激基质蛋白的合成。PlGF或VEGF的生物活性的其它实例包括通过免疫测定、配体结合测定或Scatchard印迹分析测量的与受体的结合，和通过BrdU标记法、细胞计数实验或DNA合成的定量测定，如3H-胸苷掺入而测量的细胞增殖或迁移的诱导。sFlt-1的生物活性的实例包括通过免疫测定、配体结合测定或Scatchard印迹分析测量的与PlGF和VEGF的结合。本文描述了每种多肽的生物活性测定的其它实例。
“反义核碱基寡聚体”指核碱基寡聚体，不管多长，其与内皮糖蛋白基因的编码链或mRNA互补。“核碱基寡聚体”指包括至少8个核碱基、优选至少12个、且最优选至少16个碱基的链的化合物，它们通过连接基团连接在一起。在此定义中包括天然的和非天然的寡核苷酸，它们是修饰和未修饰的，以及寡核苷酸模拟物，如蛋白核酸、锁定核酸和阿糖核酸。很多核碱基和连接基团都可用于本发明的核碱基寡聚体中，包括在引入本文作为参考的美国专利公开号20030114412(见例如，公开文本的27-45段)和20030114407(见例如，公开文本的35-52段)中描述的那些。所述核碱基寡聚体还可靶向翻译起始和终止位点。优选地，反义核碱基寡聚体包含约8-30个核苷酸。反义核碱基寡聚体还可包含至少40、60、85、120或更多个连续的核苷酸，它们与内皮糖蛋白mRNA或DNA互补，且可像全长mRNA或基因一样长。
“结合”表示将两个分子保持在一起的非共价或共价相互作用，优选非共价相互作用。例如，两个这样的分子可以是配体及其受体、酶和该酶的抑制剂、酶及其底物，或抗体和抗原。非共价相互作用包括但不限于氢键键合、带电基团之间的离子相互作用、范得华相互作用和非极性基团之间的疏水相互作用。这些相互作用中的一种或多种可以介导两个分子彼此结合。结合可以显示区别特性，如特异性或选择性。
“体重指数”指使用身高和体重测量产生的数字，它会给出体重是否属于健康范围的一般信息。通常用于确定体重指数的公式是，以千克计的人体重除以以米计的人身高的平方，或体重(kg)/(身高(m))2。
“化合物”指任意的小分子化合物(肽基或非肽基)、抗体、核酸分子、多肽，或其片段。特别用于本发明的治疗方法的化合物可以使可溶内皮糖蛋白的水平或生物活性改变(优选降低)至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
“嵌合抗体”指一种多肽，其至少含有与另一种蛋白的至少部分(通常，免疫球蛋白的恒定区)相连的抗体分子的抗原结合部分。
“双链RNA(dsRNA)”指包含有义和反义链这两者的核糖核酸分子。dsRNA通常用于介导RNA干扰。
“内皮糖蛋白”或“Eng”也称作CD 105，指具有内皮糖蛋白生物活性的哺乳动物生长因子(见Fonsatti等，Oncogene 22：6557-6563，2003；Fonsatti等，Curr.Cancer Drug Targets 3：427-432，2003；和Cheifetz等，J.Biol.Chem.267：19027-19030(1992))，且与下述GenBank编号中的任一个定义的蛋白同源：AAH29080和NP_031958(小鼠)；AAS67893(大鼠)；NP_000109，P17813，VSP_004233，CAA80673(猪)；以及CAA50891和AAC63386(人)，或记载在美国专利号6,562,957中。内皮糖蛋白是同二聚体细胞膜糖蛋白，其在来自胎盘的增殖中的血管内皮细胞和合胞滋养层中高水平地表达。内皮糖蛋白存在两种不同的同工型，即L和S，它们的不同之处是在胞质尾的47个氨基酸。两种同工型都包含在本文使用的术语内皮糖蛋白中。内皮糖蛋白结合TGF-β家族成员，且在有TGF-β存在下，内皮糖蛋白可以缔合TGF-β信号传递受体RI和RII，并加强对生长因子的反应。内皮糖蛋白生物活性包含：结合底物，如TGF-β家族成员，如激活蛋白-A、BMP2、BMP-7、TGF-β1和TGF-β3；诱导血管发生，调节细胞增殖、附着、迁移、侵入；和激活内皮细胞。内皮糖蛋白生物活性的测定是本领域已知的，且包括配体结合测定或斯卡查德图分析；用于测量细胞增殖的BrdU标记、细胞计数实验或DNA合成的定量测定(如3H-胸苷掺入)；和血管发生测定，如在本文或在McCarty等，Intl.J.Oncol.21：5-10，2002；Akhtar等Clin.Chem.49：32-40，2003；和Yamashita等，J.Biol.Chem.269：1995-2001，1994中所述的那些。
“可溶内皮糖蛋白多肽”或“sEng”表示内皮糖蛋白的任何循环的、非膜结合形式，其包括内皮糖蛋白的胞外部分的至少一部分，并且与编码内皮糖蛋白的胞外部分的氨基酸序列基本相同(如60％，70％，80％，90％，995％，96％，97％，98％，99％或100％)(参见图1和2B)。可溶内皮糖蛋白可以通过蛋白水解酶切割内皮糖蛋白的膜结合形式而得到。一个可能的切割位点是在人内皮糖蛋白的氨基酸437，产生包括内皮糖蛋白多肽的氨基酸1-437的可溶内皮糖蛋白多肽，包括肽前导序列，其典型地在ER中切掉(参见图3A和3B)，或产生与内皮糖蛋白多肽的氨基酸1-437基本相同的蛋白。本发明考虑的可溶内皮糖蛋白的其它形式包括与图30B所示的人内皮糖蛋白的氨基酸40(甘氨酸)-406(精氨酸)基本相同的蛋白、与人内皮糖蛋白的氨基酸1-587基本相同的蛋白(整个胞外域，包括肽前导序列，可从R&DSystems商购，目录号1097-EN)、与图30B所示的人内皮糖蛋白的氨基酸40-587基本相同的蛋白(这是排除了肽前导序列的整个胞外域)、任何包括在图30B中以粗体和下划线标示的肽的多肽，和任何包括结合TGF-β或TGF-β受体所需的可溶内皮糖蛋白区域或结构域的多肽。应该注意，内皮糖蛋白和可溶内皮糖蛋白的编号都依赖于是否包括前导肽序列。图30B中所示内皮糖蛋白的编号从氨基酸26开始(其中缺失的前导肽序列应该是氨基酸1-25)。可溶内皮糖蛋白也可以包括由内皮糖蛋白的酶切得到，并且保持内皮糖蛋白生物活性的循环降解产物或片段。优选的可溶内皮糖蛋白多肽具有可溶内皮糖蛋白的生物活性，如与诸如TGF-β家族成员或TGF-β受体的底物结合、抑制TGF-β家族成员的生物活性，或逆转血管发生，或使血管发生抑制至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多。测量这些活性的测定的实例是本领域已知的，并且描述于美国专利申请公开号20060067937，20050267021和20070104707和PCT公开号No.WO06/034507，在此引入作为参考。例如，可溶内皮糖蛋白生物活性可以包括逆转、减少或抑制TGF-β诱导的血管发生的能力，或逆转Smad 2/3的激活或Smad 2/3依赖性转录激活的能力。也可以从多种来源分离可溶内皮糖蛋白多肽，例如哺乳动物组织或细胞(如胎盘组织或细胞)，或通过重组或合成方法制备。术语可溶内皮糖蛋白也包括对多肽的修饰、内皮糖蛋白多肽的片段、衍生物、类似物和变体，其实例描述于下文。
“内皮糖蛋白核酸”指编码任一种上述的内皮糖蛋白的核酸。例如，人内皮糖蛋白的基因由14个外显子组成，其中外显子1编码信号肽序列，外显子2-12编码胞外域(包括外显子9a和9b)，外显子13编码跨膜域，且外显子14编码C-末端胞质域(见图1、2A和2B)。理想地，内皮糖蛋白核酸编码上文描述的任何可溶内皮糖蛋白多肽或与图2A所示核酸序列基本相同(60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％)。应该注意，预测循环蛋白缺乏肽前导序列(氨基酸1-25)。
“表位”表示一种氨基酸序列，由于线性结构或三维构象，形成抗体的结合位点。
“表达”指通过标准的本领域已知的方法检测基因或多肽。例如，多肽表达常常通过蛋白印迹检测，DNA表达常常通过DNA印迹或聚合酶链反应(PCR)检测，而RNA表达常常通过RNA印迹、PCR、或RNA酶保护测定检测。测量蛋白表达水平的方法通常包括但不限于：蛋白印迹、免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、表面等离子共振、化学发光、荧光极化、磷光、免疫组化、基质辅助的激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱、显微细胞计数、微阵列、显微术、荧光激活的细胞分选(FACS)和流式细胞术，以及基于蛋白特性的测定，所述特性包括但不限于酶活性或与其它蛋白配偶体的相互作用。示例性测定详细描述于美国专利申请公开号2006/0067937和PCT公开号WO 06/034507。任何使可溶内皮糖蛋白水平降低至少10％，20％，优选30％，更优选至少40％或50％，最优选至少60％，70％，80％，90％或更多的化合物都认为是本发明的治疗性化合物。
“片段”指多肽或核酸分子的一部分。优选地，该部分含有参照核酸分子或多肽的整个长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、1750、1800或更多个核苷酸，或10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、640或更多个氨基酸。可溶内皮糖蛋白的示例性片段包括1-437个氨基酸(包括肽前导序列)、26-437个氨基酸(排除前导序列)、40-406个氨基酸，或1-587个氨基酸，以及1-1311、10-1311、80-1030或1-1761个核苷酸。
“胎龄”指胎儿年龄，其从母亲的最后一次月经期的第一天开始计起，通常按周计。
“妊娠高血压”指妊娠20周后没有蛋白尿的高血压的发展。
“先兆子痫或子痫史”指以前在受试者自身或相关家族成员中诊断的先兆子痫或子痫或妊娠诱发的高血压。
“同源的”指在比较序列的长度上，与已知基因或蛋白序列具有至少30％同源性、更优选40％、50％、60％、70％、80％、且最优选90％或更高同源性的任何基因或蛋白序列。“同源的”蛋白还可具有比较蛋白的至少一种生物活性。通常，就蛋白而言，比较序列的长度为至少10个氨基酸，优选地20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、437或至少587个氨基酸或更多。就核酸而言，比较序列的长度通常为至少25、50、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1311或至少1761个核苷酸或更多。“同源性”还指用于产生抗体的表位与抗体针对的蛋白或其片段之间的相当大相似性。在该情况下，同源性指足以引发可以特异性地识别讨论中的蛋白的抗体产生的相似性。
“人源化抗体”指能够结合预定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段。通常，抗体至少包含轻链和重链的可变区。抗体还可以包含重链的CH1、铰链、CH2、CH3或CH4区。人源化抗体包含主要具有人免疫球蛋白氨基酸序列的构架区(FR)和主要具有非人免疫球蛋白氨基酸序列(“输入”序列)的互补决定区(CDR)。
通常，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。通常，人源化抗体基本上包含至少一个、且通常两个可变区(Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv)的全部，其中全部或基本上全部CDR区与非人免疫球蛋白的那些相对应，且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最优地将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的部分。“互补决定区(CDR)”指在每个免疫球蛋白轻链和重链中的可变区的3个高变序列。“构架区(FR)”指位于免疫球蛋白轻链和重链的3个高变序列(CDR)的任一侧的氨基酸序列。
人源化抗体的FR和CDR区不需要与亲代序列准确对应，例如，输入CDR或共有FR可以通过取代、插入或缺失至少一个残基来诱变，从而使得在该位点的CDR或FR残基不与共有或输入抗体相对应。然而，这种突变将不是广泛的。通常，至少75％、优选90％、且最优选95％的人源化抗体残基将与亲本FR和CDR序列的残基相对应。
“杂交”指在各种严格性条件下，在互补多核苷酸序列或其部分之间配对以形成双链分子(见，例如，Wahl和Berger，Methods Enzymol.152：399，1987；Kimmel，Methods Enzymol.152：507，1987)。例如，严格的盐浓度通常低于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选低于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，且最优选低于约250mMNaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可在没有有机溶剂(例如甲酰胺)存在的条件下获得，而高严格性杂交可在有至少约35％甲酰胺、且最优选至少约50％甲酰胺存在下获得。严格的温度条件通常包括至少约30℃、更优选至少约37℃、且最优选至少约42℃的温度。各种其它参数，如杂交时间，去污剂如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度，以及包含或排除载体DNA，都是本领域技术人员熟知的。通过根据需要组合这些不同条件，实现各种严格性水平。在一个优选的实施方案中，杂交在30℃，在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中进行。在一个更优选的实施方案中，杂交在37℃，在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑精DNA(ssDNA)中进行。在一个最优选的实施方案中，杂交在42℃，在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中进行。对这些条件的有用变化对于本领域技术人员是显而易见的。
对于绝大多数应用而言，杂交之后的洗涤步骤还可在严格性方面有变化。洗涤严格性条件可由盐浓度和温度来限定。如上所述，洗涤严格性可通过降低盐浓度或提高温度来提高。例如，洗涤步骤的严格盐浓度优选低于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，且最优选低于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包含至少约25℃、更优选至少约42℃、且最优选至少约68℃的温度。在一个优选的实施方案中，洗涤步骤将在25℃，在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在一个更优选的实施方案中，洗涤步骤将在42℃，在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在一个最优选的实施方案中，洗涤步骤将在68℃，15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。这些条件的其它变化对于本领域技术人员是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员熟知的，且在下面描述，例如Benton和Davis(Science 196：180，1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 72：3961，1975)；Ausubel等(CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，New York，2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques，1987，Academic Press，New York)；和Sambrook等，Molecular Cloizing：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York。
“子宫内发育迟缓(IUGR)”指导致出生重量比胎儿胎龄的预测胎儿重量低10％的综合征。目前世界卫生组织有关低出生重量的标准是重量低于2,500gm(5 lbs.8 oz.)，或根据美国通过种族、经产数和婴儿性别得出的胎龄出生重量表，低于胎龄的第10个百分位(Zhang和Bowes，Obstet.Gynecol 86：200-208，1995)。这些低出生重量的婴儿还被称作“小于胎龄(SGA)”。已知先兆子痫是与IUGR或SGA有关的状况。
“度量标准”指一种测量。度量可用于，例如，比较目标多肽或核酸分子的水平。示例性的度量标准包含但不限于，数学公式或算法，如比值。所用度量标准是这样的，其可最好地区别患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的受试者与正常对照受试者之间的可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF、PlGF的水平，或其任意组合。根据所用度量标准，妊娠相关的高血压病症的诊断指标可显著高于或低于参照值(例如，来自未患妊娠相关的高血压病症的对照受试者)。通过测量游离的、结合的(即，结合于生长因子)或总的(即，游离的+结合的)可溶内皮糖蛋白的量，可以确定可溶内皮糖蛋白水平。通过测量游离的、结合的(即，结合于生长因子)或总的sFlt-1(游离的+结合的)的量，可以测量sFlt-1水平。通过测量游离PlGF或游离VEGF(即，未结合于sFlt-1)的量，可以确定VEGF或PlGF水平。一个示例性的度量是[sFlt-1/(VEGF+PlGF)]，也称作先兆子痫抗血管发生指数(PAAI)。另一个实例是下面的可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数：(sFlt-1+0.25(可溶内皮糖蛋白多肽))/PlGF。另一个示例性的度量如下：(可溶内皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF。与正常参照相比，这两个示例性度量标准的任意一个的值的增加，是先兆子痫或子痫的诊断指标。另一个实例包括测量受试者中妊娠的前三个月和妊娠的次三个月中的sFlt-1和可溶内皮糖蛋白水平，并且用以下公式计算每个三月期中sFlt1x可溶内皮糖蛋白(sEng)的δ乘积：[d乘积＝妊娠的次三个月中的(sFlt1xsEng)-妊娠的前三个月中的(sFlt1xsEng)]，其中大于0、1、2或更高的值(例如正值)，是先兆子痫或子痫的诊断指标。另一度量标准包括妊娠的前三个月和妊娠的次三个月之间sFlt-1水平(dsFlt-1)和sEng水平(dsEng)的d乘积，其中对于(dsFlt-1)或(dsEng)，大于0、1、2或更高的值(例如正值)，是先兆子痫或子痫的诊断指标。
本发明的任何度量标准可以进一步包括母亲的BMI或婴儿的胎龄，或经产数。任何度量标准也可以包括eNOS、TGF-β1或β3或PGI2水平。
“一氧化氮合酶”或“NOS”表示催化从氧和精氨酸形成一氧化氮(NO)的酶。NOS是一种复合酶，其包含一些辅因子、作为催化位点的一部分的血红素基团、N末端加氧酶结构域(其属于血红素-硫醇盐蛋白类)和与NADPH:P450还原酶同源的C末端还原酶结构域。NOS通过催化L-精氨酸(L-Arg)的胍基氮的5-电子氧化而产生NO。通过两个连续单加氧反应发生L-Arg向L-瓜氨酸的氧化，产生N-羟基-L-精氨酸作为中间体。加氧酶和还原酶结构域之间的结构域间接头含有CaM结合序列。NO在低浓度作为很多不同的生理过程中的信号而起作用，所述过程例如血压控制、神经传递、学习和记忆，并且在高浓度下作为防御性细胞毒素。
在哺乳动物中，三种独特的基因编码NOS同工酶：神经元型(nNOS或NOS-1)、细胞因子诱导型(iNOS或NOS-2)和内皮型(eNOS或NOS-3)。eNOS是膜结合的，并且eNOS向内皮膜的定位是通过共翻译N末端豆蔻酰化和翻译后棕榈酰化介导的。在本发明的优选实施方案中，NOS是eNOS。
“先兆子痫抗血管发生指数(PAAI)”是指用作抗血管发生活性指标的sFlt-1/VEGF+PlGF的比值。大于10，更优选大于20的PAAI，指示妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或先兆子痫的风险。
“可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数”指(sFlt-1+0.25可溶内皮糖蛋白)/PlGF比值。例如，75或更高、优选地100或更高、或更优选地200或更高的值，是与高血压相关的妊娠并发症(如先兆子痫或子痫)的指示。
“可操作地连接的”指在适宜的分子(例如，转录激活蛋白)与调节序列结合时，基因和调节序列以允许基因表达的方式连接。
“药学可接受的载体”指对于所治疗的哺乳动物而言生理学上可接受的且仍然保留与其一起施用的化合物的治疗性质的载体。一种示例性的药学可接受的载体物质是生理盐水。其它生理学上可接受的载体和它们的制剂是本领域技术人员已知的，且在下列文献中描述，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，(第20版)，ed.A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，PA。
“胎盘生长因子(PlGF)”指哺乳动物生长因子，它与GenBank编号P49763限定的蛋白同源，且具有PlGF生物活性。PlGF是属于VEGF家族的糖基化同二聚体，且可通过可变剪接机理以两个不同的同工型发现。PlGF由胎盘中的细胞滋养层及合胞滋养层表达，且PlGF生物活性包含诱导内皮细胞(特别是滋养层细胞)的增殖、迁移及活化。
“多态性”指可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸分子中的基因变异、突变、缺失或添加，它是发展先兆子痫或子痫的素因的指示。这样的多态性是熟练的技术人员已知的，且记载在，例如，Raab等(Biochem.J.339：579-588，1999)和Parry等(Eur.J Immunogenet.26：321-323，1999)。多态性可以存在于基因的启动子序列、可读框、内含子序列或非翻译3′区中。内皮糖蛋白基因的这样的多态性的已知实例包括内含子7中的6碱基GGGGGA插入，该插入在超过外显子7的3′末端26个碱基处(Ann.Neurol.41：683-6，1997)。
“妊娠相关的高血压病症”指与血压提高有关或特征在于血压提高的任何状况或疾病或妊娠。这些状况中包括先兆子痫(包括过早先兆子痫、重度先兆子痫)、子痫、妊娠高血压、HELLP综合征(溶血、提高的肝酶、低血小板)、胎盘早剥、慢性高血压、具有子宫内发育限制的妊娠和具有小于胎龄(SGA)婴儿的妊娠。应当指出，尽管具有SGA婴儿的妊娠并非经常与高血压有关，但它也包含在该定义中。
“先兆子痫”指多系统病症，其特征在于具有蛋白尿或水肿或两者的高血压、肾小球功能障碍、脑水肿、肝水肿或凝血异常，这是由于妊娠或新近妊娠的影响。所有形式的先兆子痫，如过早的、轻度的、中度的和重度先兆子痫，都包含在该定义中。先兆子痫通常发生在妊娠第20周后。先兆子痫通常被定义为下列症状的一些组合：(1)妊娠20周后，收缩压(BP)＞140mmHg且舒张压＞90mmHg(通常测量2次，间隔4-168小时)，(2)新发作的蛋白尿(利用浸渍片进行尿分析为1+，24小时尿收集中的蛋白＞300mg，或单次随机的尿样的蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)到产后12周，高血压及蛋白尿消除。重度先兆子痫通常被定义为：(1)舒张压＞110mmHg(通常测量2次，间隔4-168小时)或(2)蛋白尿，其特征在于24小时尿收集中的蛋白测量值为3.5克或更高，或利用浸渍片测量，2份随机的尿样具有至少3+蛋白。在先兆子痫中，高血压和蛋白尿通常彼此在7天内发生。在重度先兆子痫中，可同时出现严重高血压、严重蛋白尿和HELLP综合征(溶血、提高的肝酶、低血小板)或子痫，或每次仅出现一个症状。HELLP综合征的特征在于血小板减少症(＜100000细胞/μl)、提高的LDH(＞600IU/L)和提高的AST(＞70IU/L)的迹象。有时候，重度先兆子痫可导致癫痫发作的发展。这种严重的综合征形式被称作“子痫”。子痫还可包含几种器官或组织的功能障碍或损害，如肝脏(例如，肝细胞损害、门静脉周坏死)和中枢神经系统(例如，脑水肿和脑出血)。认为癫痫发作的病因是由脑水肿和肾脏小血管局灶痉挛的发展继发的。
“早发先兆子痫”指在＜37周或＜34周发作症状的先兆子痫。
“前列环素”或“PGI2”是指已知为类二十烷酸的脂质分子家族成员。其在内皮细胞中通过酶-前列环素合酶的作用从前列腺素H2(PGH2)产生，并且主要由血管内皮和平滑肌合成。PGI2生物活性包括血小板聚集的抑制、平滑肌的松弛、通过直接血管舒张导致的全身和肺血管阻力减少，以及肾脏中的尿钠排泄。
“蛋白”或“多肽”或“多肽片段”指任何多于两个氨基酸的链，不管翻译后的修饰如何(例如，糖基化或磷酸化)，其构成天然存在的多肽或肽的全部或部分，或构成非天然存在的多肽或肽。
“参照样品”指用于比较目的的任何样品、标准或水平。“正常的参照样品”可以是从相同受试者采取的在先样品、来自不患有任何妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的妊娠受试者的样品、来自妊娠且在妊娠早期(例如，在妊娠的前三个月或妊娠的次三个月，或在检测到妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)之前)采取样品的受试者、妊娠且不具有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)史的受试者、未妊娠的受试者、在已知正常浓度(即，不指示妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或子痫)的纯化参照多肽的样品。“参照标准或水平”指源自参照样品的值或数字。正常的参照标准或水平可以是源自正常受试者的值或数字，所述正常受试者与样品受试者在至少一项下面的标准方面匹配：胎儿的胎龄、母亲年龄、妊娠之前的母亲血压、妊娠过程中的母亲血压、母亲的BMI、胎儿体重、先兆子痫或子痫的以前诊断，和先兆子痫或子痫的家族史。“阳性参照”样品、标准或值是源自已知患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的受试者的样品或值或数字，所述受试者与样品受试者在至少一项下面的标准方面匹配：胎儿的胎龄、母亲年龄、妊娠之前的母亲血压、妊娠过程中的母亲血压、母亲的BMI、胎儿体重、妊娠相关的高血压病症的以前诊断，和妊娠相关的高血压病症的家族史。
“降低或抑制”指通过前述测定(见“表达”)检测的，与未处理的样品相比，引起蛋白或核酸水平总体降低优选20％或更多、更优选40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的变化的能力。
“样品”指组织活检物、细胞、体液(例如，血液、血清、血浆、尿、唾液、羊水或脑脊液)或从受试者得到的其它样品。合意地，生物样品包括可溶内皮糖蛋白核酸分子或多肽或二者。
“小干扰RNA(siRNA)”指分离的dsRNA分子，优选长度超过10个核苷酸(nt)，更优选长度超过15个核苷酸，且最优选长度超过19个核苷酸，其用于鉴别将要降解的靶基因或mRNA。19-25个核苷酸是siRNA的最优选大小。siRNA还可包含短发夹RNA，其中siRNA双链体的两个链都包含在单一RNA分子中。siRNA包含任何形式的dsRNA(更大dsRNA的蛋白酶剪切产物、部分纯化的RNA、基本纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA)，以及与天然存在的RNA不同之处在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/或变化的改变的RNA。这种改变可包含非-核苷酸物质的添加，例如向19、20、21、22、23、24或25nt RNA的末端添加或内部添加(在RNA的一个或多个核苷酸上)。在优选的实施方案中，RNA分子包含3′羟基。本发明RNA分子中的核苷酸还可包含非链的核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脱氧核糖核苷酸。共同地，将所有这种改变的RNA称作RNA的类似物。本发明的siRNA只需与具有介导RNA干扰(RNAi)的能力的天然RNA充分相似。如本文所使用的，RNAi指通过向细胞或生物中引入小干扰RNA或dsRNA所致的特定mRNA分子的ATP-依赖性的靶向切割和降解。如本文所使用的，“介导RNAi”指区别或鉴别要降解哪个RNA的能力。
“可溶内皮糖蛋白结合分子”指结合，优选特异性结合可溶内皮糖蛋白多肽的蛋白或小分子化合物。可溶内皮糖蛋白结合分子可以是，例如，抗体、抗体相关肽、可溶内皮糖蛋白结合抗体的一个或多个CDR区或可溶内皮糖蛋白相互作用蛋白。
“可溶Flt-1(sFlt-1)”(也称作sVEGF-R1)指可溶形式的Flt-1受体，其与GenBank编号U01134定义的蛋白同源，且具有sFlt-1生物活性。sFlt-1多肽的生物活性可使用任何标准方法测定，例如，通过测定与VEGF结合的sFlt-1。sFlt-1缺少Flt-1受体的跨膜结构域和胞质酪氨酸激酶结构域。sFlt-1可以以高亲和力结合VEGF和PlGF，但不能诱导增殖或血管发生，并因此与Flt-1和KDR受体在功能上有所不同。sFlt-1最初从人脐内皮细胞纯化，且随后表明在体内由滋养层细胞产生。如本文所使用的，sFlt-1包含任何sFlt-1家族成员或同工型。sFlt-1也可以指源自Flt-1受体的酶切割且保留sFlt-1生物活性的降解产物或片段。在一个实例中，从胎盘释放出的特定金属蛋白酶可以切割Flt-1受体的胞外域，以将Flt-1N-末端部分释放到循环中。
“特异性结合”指识别并结合本发明的多肽、但基本上不识别并结合样品(例如生物学样品)中的其它分子的化合物或抗体，其自然包含本发明的多肽。在一个实例中，特异性结合可溶内皮糖蛋白的抗体不结合膜结合的内皮糖蛋白。在另一个实例中，特异性结合可溶内皮糖蛋白的抗体结合内皮糖蛋白的胞外域内的表位，特别是氨基酸26-437(排除肽前导序列)、人内皮糖蛋白的氨基酸40-406(参见图30B)，或氨基酸26-587(排除肽前导序列)内的表位，所述表位可能是或不是可溶内皮糖蛋白独特的(例如在可溶内皮糖蛋白的三维结构中)。在另一实例中，特异性结合可溶内皮糖蛋白的抗体识别图30B中以粗体和下划线显示的一个或多个氨基酸序列。
“受试者”指哺乳动物，包括但不限于，人或非人哺乳动物，如牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫。在该定义中包含妊娠的、产后的和未妊娠的哺乳动物。
“基本相同的”指，当最佳地比对时，例如，使用下述的方法，与第二个核酸或氨基酸序列(例如，内皮糖蛋白或可溶内皮糖蛋白序列)共有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸或氨基酸序列。“显著同一性”可以用于指各种类型和长度的序列，如全长序列、表位或免疫原性肽、功能结构域、编码和/或调节序列、外显子、内含子、启动子和基因组序列。通过属于本领域技术范围内的各种方式，可以确定两个多肽或核酸序列之间的百分比同一性，例如，使用可公开得到的计算机软件，如Smith Waterman Alignment(Smith，T.F.和M.S.Waterman(1981)J Mol Biol 147：195-7)；包含在GeneMatcher PlusTM中的“BestFit”(Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics，482-489(1981))，Schwarz和Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequenceand Structure，Dayhof，M.O.，Ed pp 353-358；BLAST程序(Basic LocalAliggnment Search Tool；(Altschul，S.F.，W.Gish，等(1990)J Mol Biol215：403-10)，BLAST-2，BLAST-P，BLAST-N，BLAST-X，WU-BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2，CLUSTAL，或Megalign(DNASTAR)软件。另外，本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在对比的序列长度上达到最大比对所需的任何算法。通常，就蛋白而言，对比序列的长度是至少10个氨基酸，优选地20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、437或至少587个氨基酸或更多。就核酸而言，对比序列的长度通常是至少25、50、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、1311或至少1761个核苷酸或更多。应当理解，为了确定序列同一性的目的，当对比DNA序列和RNA序列时，胸腺嘧啶核苷酸相当于尿嘧啶核苷酸。保守取代通常包含下列组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“先兆子痫的症状”指下列任何一个：(1)妊娠20周后，收缩压(BP)＞140mmHg且舒张压＞90mmHg，(2)新发作的蛋白尿(利用浸渍片进行尿分析为1+，24小时尿收集中的蛋白＞300mg，或随机尿蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)到产后12周，高血压及蛋白尿消除。先兆子痫的症状还可包含肾功能障碍和肾小球内皮增生或肥大。“子痫的症状”指由于妊娠或新近妊娠的影响所致的下列症状中任何一个的发展：癫痫发作、昏迷、血小板减少症、肝水肿、肺水肿和脑水肿。
“转化生长因子β(TGF-β)”指哺乳动物生长因子，其具有TGF-β生物活性，且是在脊椎动物中普遍存在的结构上有关的旁分泌多肽家族的成员，且是后生动物生长、分化和形态发生因子大家族的原型(综述见，Massaque等Ann Rev Cell Biol 6：597-641(1990)；Massaque等Trends Cell Biol 4：172-178(1994)；Kingsley Gene Dev.8：133-146(1994)；和Sporn等J Cell Biol 119：1017-1021(1992)。如上面的Kingsley所述，TGF-β超家族具有至少25个成员，且可以分成具有高度相关序列的不同亚家族。最明显的亚家族包含下面的这些：TGF-β亚家族，其包含至少4个与TGF-β1的相似性比与TGF-β超家族的其它成员更高的基因；骨形态发生蛋白；激活蛋白亚家族，其包含同或异二聚体或两个亚基抑制素β-A和抑制素β-B。包括哺乳动物因子BMP2和BMP4的decapentaplegic亚家族，当植入皮下或肌肉中时，可以诱导异位骨和软骨的形成。包括许多哺乳动物同源物成员的60A亚家族具有骨诱导活性，包括BMP5-8。TGF-β超家族的其它成员包括总分化因子1(GDF-1)、GDF-3/VGR-2、背蛋白、结节的(nodal)、苗勒氏(mullerian)抑制物质(MIS)和神经胶质衍生的神经营养生长因子(GDNF)。应当指出，DPP和60A亚家族的彼此相关性比与TGF-β超家族的其它成员的相关性更紧密，且经常一起归入称作DVR(dpp和vgl相关的)的更大分子集合的部分。除非在它使用的上下文中可以看出，在贯穿本说明书中使用的术语TGF-β应当理解为，通常指适合的TGF-β超家族的成员(Massague等，Annu.Rev.Biochem.67：753-91，1998；Josso等，Curr.Op.Gen.Dev.，7：371-377，1997)。TGF-β起调节许多细胞类型的生长、分化、运动性、组织重建、神经发生、创伤修复、细胞凋亡和血管发生的功能。TGF-β也抑制许多细胞类型的细胞增殖，并可以刺激基质蛋白的合成。
“治疗量”指通过直接施用于患者或通过离体方法给患有先兆子痫或子痫的患者施用时，足以引起本文所述先兆子痫或子痫症状的定性或定量减轻的量。“治疗量”还指当通过直接施用于患者或通过离体方法给患有先兆子痫或子痫的患者施用时，如通过本文所述的测定测得的，足以引起可溶内皮糖蛋白或sFlt-1表达水平降低、或VEGF或PlGF表达水平提高的量。
“治疗”指为了治疗目的，施用化合物或药物组合物。“治疗疾病”或用于“治疗性处理”指给已经患病的受试者施用治疗，以改善受试者状况。优选地，基于下述任何一个特征症状的鉴别，或使用本文所述的诊断方法，诊断受试者患有与高血压有关的妊娠并发症，如先兆子痫或子痫。“预防疾病”指预防性地处理还没有发病，但易感或另外有发展特定疾病风险的受试者。优选地，使用本文所述的诊断方法，确定受试者有发展先兆子痫或子痫的风险。因此，在权利要求和实施方案中，治疗是为了治疗或预防目的而施用于哺乳动物的。
“滋养层”指覆盖胚泡的中外胚层细胞层，其侵蚀子宫粘膜，且胚胎通过它从母体接受营养；该细胞有助于胎盘的形成。
“血管内皮生长因子(VEGF)”指哺乳动物生长因子，其与美国专利号5,332,671；5,240,848；5,194,596；和Charnock-Jones等(Biol.Reproduction，48：1120-1128，1993)中定义的生长因子同源，且具有VEGF生物活性。VEGF以糖基化同二聚体的形式存在，且包含至少4种不同的可变剪接的同工型。天然VEGF的生物活性包括，促进血管内皮细胞或脐静脉内皮细胞的选择性生长，并诱导血管发生。如本文所使用的，VEGF包含任何VEGF家族成员或同工型(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF189、VEGF165或VEGF121)。优选地，VEGF是VEGF121或VEGF165同工型(Tischer等，J.Biol.Chem.266，11947-11954，1991；Neufed等，Cancer Metastasis15：153-158，1996)，其在引入本文作为参考的美国专利号6,447,768；5,219,739；和5,194,596中描述。还包含VEGF的突变体形式，如在Gille等(J.Biol.Chem.276：3222-3230，2001)中描述的KDR-选择性VEGF和Flt-选择性VEGF。如本文所使用的，VEGF也包括任何修饰形式的VEGF，如LeCouter等(Science 299：890-893，2003)所述的那些。虽然优选人VEGF，但本发明不限于人形式，且包含VEGF的其它动物形式(例如，小鼠、大鼠、狗或鸡)。
“载体”指DNA分子，其通常来源于质粒或噬菌体，向其中可插入或克隆DNA片段。重组载体将包含一个或多个独特的限制位点，且能够在规定的宿主或载体生物中自主复制，从而使得克隆的序列可复制。载体包含与基因或编码区可操作地连接的启动子，这样，转染进受体细胞后，可表达RNA。
从其优选实施方案的下列描述以及权利要求中，可以明白本发明的其它特征和优点。
附图简述
图1是显示内皮糖蛋白蛋白的示意图。SP：信号肽(也称作肽前导序列)，ZP：透明带结构域，CL：潜在切割位点(氨基酸437)，以释放可溶内皮糖蛋白，TM：跨膜结构域，Cyto：胞质结构域。一旦信号肽被切除，剩余的成熟蛋白在氨基酸26的谷氨酸残基开始。
图2A显示了可溶内皮糖蛋白的预测的cDNA序列(SEQ ID NO：1)。图2B显示了可溶内皮糖蛋白的预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其包括信号肽(氨基酸1-25)。应该注意，该序列包括正常情况下将在ER中被切除的前导肽序列。
图3是显示来自正常妊娠的胎盘(N)、来自早产先兆子痫妊娠的胎盘(p)和来自足月先兆子痫妊娠的胎盘(P)的内皮糖蛋白mRNA水平的RNA印迹。
图4是显示胎盘中的内皮糖蛋白蛋白水平的蛋白印迹。样品来自两个先兆子痫患者p32和p36，其在2003提供给Beth Israel Deaconess医学中心，且产妇血清来自妊娠妇女。使用从Santa Cruz Biotechnology，Inc.，(Santa Cruz，CA)得到的N-末端抗体，探测蛋白印迹，其显示了胎盘中的110kD带和存在于胎盘和血清样品中的更小的63kD带。
图5中的图显示了可溶内皮糖蛋白在具有正常妊娠、轻度先兆子痫、重度先兆子痫和并发早产的无先兆子痫妊娠的妇女中的循环浓度。在分娩前24小时内，得到所有血液样品。使用购自R & D Systems，MN(目录号DNDG00)的ELISA试剂盒，测量可溶内皮糖蛋白。这些数据表明，在临床疾病时，先兆子痫患者中的可溶内皮糖蛋白水平显著提高。
图6中的图显示了在各个胎龄组窗口期间，5个不同研究组的妊娠妇女在整个妊娠中的平均可溶内皮糖蛋白浓度。
图7中的图显示了在各个胎龄组窗口期间，5个不同研究组的妊娠妇女在整个妊娠中的平均sFlt1浓度。
图8中的图显示了在各个胎龄组窗口期间，5个不同研究组的妊娠妇女在整个妊娠中的平均PlGF浓度。
图9中的图显示了在临床症状之前采取的样品的先兆子痫抗血管发生的可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数值。
图10中的图显示了根据临床过早的先兆子痫(PE＜37周)之前的周数的可溶内皮糖蛋白的平均浓度。
图11中的图显示了根据临床过早的先兆子痫(PE＜37周)之前的周数的可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数值。
图12中的图显示了对于在症状之前和之后的足月先兆子痫(PE＞37周)，整个妊娠过程中的可溶内皮糖蛋白水平的变化。
图13中的图显示了对于在症状之前和之后的足月先兆子痫(PE＞37周)，整个妊娠过程中的可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数水平的变化。
图14中的图显示了在妊娠高血压期间和在妊娠高血压之前(妊娠高血压前1-5周(在妊娠的33-36周))的妇女和血压正常对照中测得的可溶内皮糖蛋白水平。
图15中的图显示了在妊娠高血压期间和在妊娠高血压之前(妊娠高血压前1-5周(在妊娠的33-36周))的妇女和血压正常对照中测得的可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数水平。
图16中的图显示了在33-36周妊娠窗口期间，在患有重度SGA、轻度SGA的妇女和血压正常对照中测得的可溶内皮糖蛋白水平。
图17中的图显示了在33-36周妊娠窗口期间，在患有重度SGA、轻度SGA的妇女和血压正常对照中测得的可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数水平。
图18中的图显示了相同妊娠患者中的sFlt1和可溶内皮糖蛋白的浓度的彼此关系图。
图19显示了在25.2周采取的先兆子痫胎盘的内皮糖蛋白(红色)和平滑肌肌动蛋白(绿色)的双免疫荧光染色的显微照片。用于检测内皮糖蛋白的抗体将全长内皮糖蛋白和可溶内皮糖蛋白都染色。适当的妊娠窗口的对照胎盘源自早产患者。
图20显示了在41.3周采取的先兆子痫胎盘的内皮糖蛋白(红色)和平滑肌肌动蛋白(绿色)的双免疫荧光染色的显微照片。用于检测内皮糖蛋白的抗体将全长内皮糖蛋白和可溶内皮糖蛋白都染色。适当的妊娠窗口的对照胎盘源自早产患者。
图21A显示使用先兆子痫胎盘和血清两者进行内皮糖蛋白的免疫沉淀法和蛋白印迹实验得到的放射自显影图。图21B显示使用先兆子痫胎盘进行内皮糖蛋白的免疫沉淀法和蛋白印迹实验得到的放射自显影图。3种不同的N和P样品代表着单个的患者。就两幅图而言，使用商业上可得到的单克隆抗体进行免疫沉淀法，并使用多克隆抗体进行蛋白印迹。产生的这两种抗体都针对内皮糖蛋白蛋白的N-末端区，并检测全长和截短的可溶内皮糖蛋白蛋白两者。
图22中的图显示了使用在生长因子减少的matrigel中的HUVEC进行血管发生测定的结果。在有可溶内皮糖蛋白或sFlt1或二者存在下，进行血管发生测定，并定量内皮管长度。C-代表对照，E-代表1μg/ml的可溶内皮糖蛋白，且S代表1μg/ml的sFlt1。E+S代表1μg/ml E+1μg/ml sFlt1的组合。数据代表着3个独立实验的平均值。
图23中的图显示了如材料和方法中所述，使用伊文思蓝(Evansblue)渗漏，在小鼠中评估的几种器官床中的微血管通透性。C-对照(GFP)，E-可溶内皮糖蛋白，S-sFlt1，且S+E-sFlt1+可溶内皮糖蛋白。数据代表着4个独立实验的平均值。
图24中的图显示了在有剂量范围为200pg/ml-200ng/ml的TGF-β1(B1)和TGF-β3(B3)存在下，进行微血管反应性实验的大鼠肾微血管直径的百分比变化。在有1μg/ml可溶内皮糖蛋白(E)存在下，重复这些相同的实验。显示的这些数据代表着4个独立实验的平均值。
图25中的图显示了在有1ng/ml VEGF(V)、TGF-β1(B1)和组合(V+B1)存在下，肾微血管的血管直径的百分比变化。还显示了在有各1μg/ml的sFlt1(S)和可溶内皮糖蛋白(E)(V+B1+S+E)存在下，该组合的作用。数据代表着4个独立实验的平均值。
图26A是在处死时从注射了sFlt1和对照腺病毒(CMV)的组合的妊娠大鼠采取的血液样品的外周涂片的照片。图26B是在处死时从注射了sFlt1和表达可溶内皮糖蛋白的腺病毒的组合的妊娠大鼠采取的血液样品的外周涂片的照片，并表现出活性溶血，如由裂红细胞和提高的网状细胞计数所证实的。箭头代表裂红细胞。
图27A-D的一系列显微照片显示了表8所述的各种动物组的肾组织学(H&E染色)。图27A显示了对照组的肾组织学，没有肾小球内皮增生的迹象。图27B显示了可溶内皮糖蛋白注射组的肾组织学，没有肾小球内皮增生的迹象。图27C显示了sFlt1注射的大鼠的肾组织学，显示出中等内皮增生(用箭头指示)。图27D显示了可溶内皮糖蛋白和sFlt1注射的大鼠的肾组织学，显示出非常肿胀的肾小球和严重的肾小球内皮增生，在足细胞内存在蛋白再吸收小滴。在60X(原始放大率)拍摄所有光显微照片。
图28中的图显示实施例3中描述的具有各种程度的先兆子痫患者、对照妊娠和4个非妊娠健康志愿者的血清中可溶内皮糖蛋白(sEng)和sFlt1的ELISA结果。*与早产对照相比P＜0.05，#与重度先兆子痫相比P＜0.05。
图29中的图显示实施例3中描述的、在产前(0-12小时)和产后(48小时取血的一个亚组的妊娠患者的可溶内皮糖蛋白ELISA结果(正常：n＝6；先兆子痫：n＝11)。*与T＝0样品相比P＜0.05。
图30A是显示纯化先兆子痫患者血清后的可溶内皮糖蛋白的蛋白印迹。在还原条件下在SDS-PAGE上对从44G4-IgG(抗-Eng)琼脂糖凝胶洗脱的级分4和5进行电泳，并且采用内皮糖蛋白的多克隆抗体通过蛋白印迹进行测试。对洗脱的级分进行质谱分析(3次运行)。图30B显示人内皮糖蛋白的序列(SEQ ID NO：5)。通过质谱鉴定的肽以粗体和下划线显示。加下划线的氨基酸代表人细胞表面内皮糖蛋白的跨膜域。注意氨基酸序列编号从26开始，因为氨基酸1-25代表前导肽。注意序列表中列为SEQ ID NO：5的序列从氨基酸1开始，因此图中的氨基酸26是序列表中的氨基酸1，图中的氨基酸658是序列表中的氨基酸633。根据参照序列调整氨基酸编号(即图30B中序列的氨基酸26-658与SEQ ID NO：5所示序列的氨基酸1-633相同)。
图31显示一系列显微照片，其中显示可溶内皮糖蛋白抑制毛细血管形成并且增加血管通透性。在1μg重组可溶内皮糖蛋白、sFlt1或这两者存在下，在生长因子减少的MatrigelTM中，用HUVEC进行血管发生测定，并且对内皮管长度进行定量。显示了代表性实验(n＝4)，其中在图片下面指出了以像素表示的管长度。
图32是一系列图，其中显示通过可溶内皮糖蛋白抑制肠系膜血管中TGF-β1介导的血管反应性。在200pg/ml-200ng/ml的TGF-β1或TGF-β3存在下，测量大鼠肠系膜微血管的微血管反应性。在1μg/ml重组可溶内皮糖蛋白存在下重复实验。显示了4次独立实验的平均值±SE(上图)。也显示了1ng/ml的L-NAME对TGFβ1的阻断作用(下图)。
图33是一系列显微照片，其中显示妊娠大鼠的肾小球内皮增生。显示了来自对照妊娠大鼠(上图)、可溶内皮糖蛋白(sEng)处理的妊娠大鼠(中图)和组合组-可溶内皮糖蛋白(sEng)+sFlt1(下图)的肾小球的电子显微照片(EM)。这些照片对于上图和中图是以6200X(原始放大)拍摄的，下图是以5000X(原始放大)拍摄的。
图34A-H是一系列显微照片，其中显示可溶内皮糖蛋白和sFlt1处理后妊娠大鼠中的肾、胎盘和肝脏组织学改变和外周血涂片。对照(图34A)、sEng(图34B)、sFlt1(图34C)和sFlt1+sEng(图34D)组的胎盘组织学(H&E染色)。可溶内皮糖蛋白和sFlt1处理的动物都显示在对照中没有观察到的、在母体-胎儿连接处的弥漫性炎症(箭头)。在sFlt1+sEng处理的胎盘的蜕膜中(箭头)存在出血性梗塞和纤维蛋白样坏死，伴有母体血管腔阻塞(箭头)(图34D)。比例尺是200μm(图34E-H)。对照(图34E)、sEng(图34F)、sFlt1(图34G)和sFlt1+sEng(图34H)组中的肝脏组织学。在sFlt1+sEng组中注意到了具有多病灶坏死(箭头)的缺血性改变(图34H)。对照组和给予sEng或sFlt1的大鼠没有显示改变。比例尺是200μm。
图35A-D是一系列图和放射自显影照片，其中显示重组sEng减弱TGF-β1结合和活性以及它通过eNOS激活对血管舒张的作用。图35A的照片显示肾血管对1ng/ml VEGF、TGF-β1及其组合的微血管反应。显示了sFlt1和sEng各100ng/ml对组合反应的作用(n＝4)。也显示了L-NAME对TGFβ1和VEGF刺激的反应的阻断作用。图35B是[I125]TGF-β1与小鼠内皮细胞上的TβRII的结合的剂量依赖性增加的代表性放射自显影照片和图。用5nM重组可溶内皮糖蛋白处理，显著减少了在50pM和100pM的结合(*与未处理组相比P＜0.05)。在100pM[I125]TGF-β1处理的细胞中与40倍过量的冷TGF-β1的竞争，消除了受体结合，并且作为本底对照。图35C的图显示在HUVEC中转染的Smad 2/3依赖性CAGA-Luc报道构建体的显著增加的TGF-β诱导的激活和用sEng处理导致的抑制。(n＝3，**与sENg未处理组相比P＜0.01)。图35D是代表性蛋白印迹和图(n＝4)，显示用TGF-β1处理后eNOS Thr495上的显著去磷酸化和sEng导致的减弱(*与未处理组相比P＜0.05)。磷酸化在Ser1177未改变，实验过程中eNOS的总水平保持恒定。
图36显示大鼠血浆的两个蛋白印迹，证明重组sFlt1和可溶内皮糖蛋白的表达。上图：按照方法中的描述使用来自妊娠大鼠的血浆标本(在妊娠的前三个月的早期)。泳道1、2和3代表用作阳性对照的200pg、500pg和2ng重组小鼠Flt1-Fc蛋白。显示了来自一只对照大鼠和两只sFlt1处理的大鼠的20μl血浆标本。在sFlt1处理的大鼠中检测到了sFlt1(53kDa)条带。用商购ELISA进行sFlt1表达的定量(表8)。下图：用来自妊娠大鼠的血浆标本(在妊娠的前三个月的早期)检测sEng表达。泳道1代表500pg重组人可溶内皮糖蛋白，泳道2和3代表分别来自sEng处理的大鼠和对照大鼠的30μl血浆。印迹显示在对照大鼠中没有可溶内皮糖蛋白，但在处理的大鼠中有重组sEng的强表达。用商购ELISA进行可溶内皮糖蛋白的定量(表8)。
图37的图显示对照、所有先兆子痫和＜37周的先兆子痫中δsFlt1和δsEng(妊娠的前三个月-妊娠的次三个月的值)的分布。
图3 8的图显示对照、所有先兆子痫和＜37周的先兆子痫中妊娠的前三个月(乘积1)、妊娠的次三个月(乘积2)、δ乘积(乘积1-乘积2)的sFltxsEng乘积的分布。
图39的图显示根据δ乘积的三分位数(tertiles)的先兆子痫风险。与δ乘积小于-1的女性相比，δ乘积水平大于+1[aOR 5.5，95％CI1.4-22.4]的组中早产先兆子痫风险的增加是统计学显著的(P＜0.05)。
图40A是蛋白印迹，显示内皮糖蛋白是TGF-β1诱导的Thr495上的eNOS去磷酸化所必须的。图40B的图显示相对于总eNOS，eNOSThr495磷酸化的百分比。结果显示在可溶内皮糖蛋白存在下，在TGF-β1存在下磷酸化的Thr495的水平降低，而不存在可溶性内皮糖蛋白时并非如此。
详述
我们已经发现，在从患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的女性采集的血清样品中，可溶内皮糖蛋白水平提高。可溶内皮糖蛋白可以由蛋白水解酶切割膜结合形式的胞外部分来形成。胎盘中可变剪接变体和本文描述的纯化可溶内皮糖蛋白的部分肽序列检测的缺乏表明，它是全长内皮糖蛋白的N末端剪接产物。过量的可溶内皮糖蛋白可以耗尽胎盘中必须量的这些必须的血管发生和促有丝分裂因子。我们已经发现，患者中过量循环浓度的可溶内皮糖蛋白和sFlt1导致先兆子痫和其它妊娠相关高血压病症的致病。我们也发现，可溶内皮糖蛋白干扰TGF-β1和TGF-β3与其受体的结合，导致内皮细胞中信号传递的减少，例如eNOS激活的减少，从而破坏保持血管健康所必须的关键平衡机制。这些数据表明内皮糖蛋白在将TGF-β受体激活联系于NO合成方面的关键作用。此外，我们发现可溶内皮糖蛋白和sFlt1协同作用，可能通过抑制eNOS的下游激活而分别干扰TGF-β1和VEGF信号传递，从而诱导血管破坏和妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或子痫。
本发明涉及干扰可溶内皮糖蛋白与生长因子结合的治疗剂、降低可溶内皮糖蛋白表达或生物活性的试剂，或提高生长因子水平的试剂的用途，可以用于治疗或预防受试者中的妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或子痫。所述试剂包括但不限于，结合可溶内皮糖蛋白并且抑制可溶内皮糖蛋白生物活性的抗体、降低可溶内皮糖蛋白水平的反义寡核苷酸或RNAi、提高结合可溶内皮糖蛋白的生长因子水平的化合物、阻止膜结合形式的内皮糖蛋白的蛋白水解切割从而防止可溶内皮糖蛋白释放的化合物，和结合可溶内皮糖蛋白并阻断生长因子结合位点的小分子。此外或替代地，本发明涉及任何提高TGF-β、eNOS和PGI2的水平或生物活性的化合物(如多肽、小分子、抗体、核酸和模拟物)在治疗或预防受试者中的妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或子痫中的用途。此外，本发明涉及任何降低sFlt-1的水平或提高VEGF或PlGF的水平或活性的化合物(参见例如美国专利申请公开号20040126828，20050025762和20050170444以及PCT申请号WO2004/008946和WO 2005/077007)与上文描述的任何治疗性化合物组合用于治疗或预防受试者中的妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或子痫中的用途。此外，本发明涉及单独或组合的可溶内皮糖蛋白、eNOS、TGF-β或PGI2作为妊娠相关的高血压病症，包括先兆子痫和子痫的诊断标记的用途。
尽管本文提供的详细描述具体地涉及可溶内皮糖蛋白、TGF-β1、eNOS、sFlt-1、VEGF或PlGF，但本领域技术人员会明白，该详述也应用于可溶内皮糖蛋白、TGF-β1、eNOS、sFlt-1、VEGF或PlGF的家族成员、同工型和/或变体。
诊断
我们已经发现，在从患有妊娠相关的高血压病症(如先兆子痫或子痫)的女性采集的血清样品中，可溶内皮糖蛋白水平提高。可溶内皮糖蛋白在先兆子痫的临床症状出现前6-10周开始出现。因此，测量血清中的可溶内皮糖蛋白和sFlt1(任选与游离PlGF组合)的诊断测试将具有增强的敏感性和特异性，并且提供预防先兆子痫导致的死亡的强有力的工具。该诊断测试可以包括测量单独的游离VEGF；TGF-β家族成员，优选TGF-β1，TGF-β3，游离激活蛋白-A，BMP2，BMP7；NOS，优选eNOS；或PGI2的水平，或其任意组合。任何所述蛋白水平的改变可以诊断妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或子痫。在一个实例中，游离BMP2、BMP7或激活蛋白A水平的降低，可以诊断妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫或子痫。
尽管本文所述的方法具体地涉及先兆子痫和子痫，但应当理解，本发明的诊断和监测方法适用于任何妊娠相关的高血压病症，包括但不限于，妊娠高血压、具有小于胎龄(SGA)婴儿的妊娠、HELLP、慢性高血压、先兆子痫(轻度、中度和重度)和子痫。
在受试者样品中测量可溶内皮糖蛋白的水平，无论是游离的、结合的还是总的水平，并将其用作先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的指标。
患有先兆子痫、子痫或具有患所述状况的倾向的受试者，会表现出可溶内皮糖蛋白多肽的表达的增加。可溶内皮糖蛋白多肽可包含全长可溶内皮糖蛋白、降解产物、可溶内皮糖蛋白的可变剪接的同工型、可溶内皮糖蛋白的酶切割产物等。特异性结合可溶内皮糖蛋白多肽的抗体，可以用于诊断先兆子痫或子痫，或鉴别具有发展这样状况的风险的受试者。在本发明的方法中有用的抗体的一个实例是抗内皮糖蛋白的N-末端区的单克隆抗体，其在商业上可从Santa CruzBiotechnology，Inc.(目录号sc-20072)得到。另外的实例包括特异性结合内皮糖蛋白的胞外域(如内皮糖蛋白的氨基酸1-437、内皮糖蛋白的氨基酸1-587，或图30B中以粗体和下划线显示的任何氨基酸序列)的抗体。已知许多种测量这样的多肽的表达变化的规程，包括免疫学方法(如ELISA和RIA)，且其提供诊断先兆子痫或子痫或发展这样状况的风险的基础。
提高水平的可溶内皮糖蛋白是先兆子痫或子痫的阳性指标。例如，如果可溶内皮糖蛋白的水平相对于正常参照提高(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)，则认为这是先兆子痫或子痫的阳性指标。另外，可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的水平相对于正常水平的任何可检测的变化，是子痫、先兆子痫或发展这样状况的倾向的指标。通常，在非妊娠状态期间，可溶内皮糖蛋白的循环血清浓度范围是2-7ng/ml，而在正常妊娠期间，是10-20ng/ml。认为提高的可溶内皮糖蛋白的血清水平(大于15ng/ml、优选地大于20ng/ml、且最优选地大于25ng/ml或更高)，是先兆子痫的阳性指标。
在一个实施方案中，与sFlt-1、VEGF或PlGF多肽或核酸的水平、或其任意组合，结合测量可溶内皮糖蛋白的水平。测量sFlt-1、VEGF和PlGF的方法，记载在这里整体引作参考的美国专利申请公开号20040126828，20050025762和20050170444，以及PCT公开号WO2004/008946和WO 2005/077007中。在其它优选的实施方案中，还测量体重指数(BMI)和胎儿的胎龄，并包括诊断度量标准。
在另一实施方案中，与可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF多肽或核酸的水平组合测量TGF-β1、TGF-β3或eNOS多肽或核酸的水平。用于测量TGF-β1和β3多肽水平的抗体是可以商购的，例如，购自Abcam，Abgent，BD Biosciences Pharmingen，Chemicon，GeneTex和R&D Systems。PGI2的水平也可以与任何上述多肽的水平组合使用。例如，在上述任何诊断测定中用PGI2受体作为结合分子，或采用例如尿前列环素比色ELISA试剂盒(Assay Designs)，可以确定PGI2的水平。用于测量eNOS多肽水平的抗体是可以商购的，例如，购自ResearchDiagnostics Inc.，Santa Cruz，Cayman Chemicals和BD Biosciences。
在另一实施方案中，与可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的生物活性组合测量TGF-β1、TGF-β3或eNOS多肽中任何一种或多种的生物活性，并且生物活性的降低是先兆子痫或子痫的阳性指标。可以例如采用用于酶活性或用于下游信号传递活性的测定方法测量生物活性。在一个实例中，通过测量瓜氨酸转化确定eNOS的酶活性，并且eNOS的酶活性的降低是先兆子痫或子痫的阳性指标。
在一个实施方案中，使用包含可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF、或其中的任意组合的度量标准，来确定至少两种蛋白的水平之间的关系是否可指示先兆子痫或子痫。在一个实例中，度量标准是PAAI(sFlt-1/VEGF+PlGF)，其与可溶内皮糖蛋白测量组合，用作抗血管发生指数，后者可诊断先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向。如果可溶内皮糖蛋白的水平相对于参照样品提高(例如，1.5倍、2倍、3倍、4倍或甚至高达10倍或更高)，且PAAI大于10、更优选地大于20，则认为受试者患有先兆子痫、子痫，或处于发展它们的急迫风险中。PAAI(sFlt-1/VEGF+PlGF)比值仅仅是可以用作诊断指标的有用度量标准的一个实例。它无意限制本发明。基本上，可以检测受试者中相对于正常对照的可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF的水平的变化或其任意组合的任何度量标准，都可以用作诊断指标。另一个实例是下面的可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数：(sFlt-1+0.25(可溶内皮糖蛋白多肽))/PlGF。随时间或与参照样品或值相比可溶内皮糖蛋白度量标准的该值的增加，是先兆子痫或子痫的诊断指标。超过100、优选地超过200的可溶内皮糖蛋白指数是先兆子痫或子痫的诊断指标。其它实例包括下面的指数：(可溶内皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF或sFlt-1x可溶内皮糖蛋白。
另一实例包括测量受试者中妊娠的前三个月和妊娠的次三个月中sFlt-1和可溶内皮糖蛋白的水平，并且用以下公式计算每个三月期中sFlt1x可溶内皮糖蛋白(sEng)的δ乘积：[d乘积＝妊娠的次三个月中的(sFlt1xsEng)-妊娠的前三个月中的(sFlt1xsEng)]，其中大于0、1、2或更高的值，包括其分数(例如正值)是先兆子痫或子痫的诊断指标。正值也可以是早产先兆子痫的指标。所述测量可以在妊娠的前三个月和妊娠的次三个月的许多场合进行，并且可以随时间跟踪d乘积。此外，也可以计算妊娠的前三个月和妊娠的次三个月之间单独的sFlt-1水平(dsFlt-1)和sEng水平(dsEng)的d乘积，其中对于(dsFlt-1)或(dsEng)，大于0、1、2或更高的值，包括其分数(例如正值)是先兆子痫或子痫的诊断指标。
此外，该度量标准可以进一步包括TGF-β1、TGF-β3、PGI2或eNOS多肽的水平。任何度量标准都可以进一步包括母亲的BMI或婴儿的GA。
标准方法可用于测量任何体液(包含但不限于，尿、血清、血浆、唾液、羊水或脑脊液)中的可溶内皮糖蛋白、游离VEGF、游离PlGF、sFlt-1、TGF-β1、GF-β3、PGI2或eNOS多肽的水平。这类方法包含使用针对可溶内皮糖蛋白、游离VEGF、游离PlGF、sFlt-1、TGF-β1、GF-β3、PGI2或eNOS多肽的抗体的免疫测定，ELISA，蛋白印迹，以及定量酶免疫测定技术，如Ong等(Obstet.Gynecol.98：608-611，2001)和Su等(Obstet.Gynecol.，97：898-904，2001)描述的那些。ELISA是测量可溶内皮糖蛋白、VEGF、PlGF、sFlt-1、TGF-β1、GF-β3、PGI2或eNOS多肽的水平的优选方法。优选地，测量单独的或与其余多肽的任意一种或多种组合的可溶内皮糖蛋白。
源自内皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸序列的寡核苷酸或更长的片段，可以用作探针，来不仅监控表达，而且鉴别具有内皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸分子的遗传变异、突变或多态性的受试者，这些分子是发展先兆子痫或子痫的倾向的指示。所述方法详细描述于Abdalla等，Hum.Mutat.25：320-321(2005)，美国专利申请公开号2006/0067937和PCT公开号WO 06/034507。优选的寡核苷酸将在高度严格条件下与内皮糖蛋白的胞外域或编码图30B中以粗体和下划线显示的任何肽的核酸序列杂交。
本文所述的任一种核酸或多肽的测量，可以发生在至少两个不同的场合，并将与正常参照水平相比随时间的水平变化用作先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的指标。
在一个实例中，存在于患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者的体液中的可溶内皮糖蛋白多肽或核酸的水平，与正常对照受试者的水平相比，或与以前从相同受试者的相同体液得到的采样相比，可以增加少至1O％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。在另一实例中，从一次测量至下一次测量，存在于患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者的体液中的可溶内皮糖蛋白多肽或核酸的水平，可以随时间改变少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。
与患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者的体液中的可溶内皮糖蛋白的水平结合测量的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平，与正常对照中的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平相比，可以改变少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。从一次测量至下一次测量，与患有先兆子痫、子痫或发展这样状况的倾向的受试者的体液中的可溶内皮糖蛋白的水平组合测量的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平，可以随时间改变少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。
在一个实施方案中，在发作先兆子痫症状前的妊娠早期，收集受试者的体液(例如，尿、血浆、血清、羊水或脑脊液)样品。在另一实例中，样品可以是在发作先兆子痫症状前的妊娠早期收集的组织或细胞。组织和细胞的非限制性实例包含胎盘组织、胎盘细胞、循环内皮细胞和白细胞如单核细胞。在人类中，例如，在妊娠的前三个月、次三个月或第三个三个月期间，收集孕妇肘前静脉的产妇血清样品。优选地，在妊娠的前三个月(例如在4、6、8、10或12周)期间，或其中的任何时间间隔进行测定，或在妊娠的次三个月(例如在14、16、18、20、22或24周)期间，或其中的任何时间间隔进行测定。在一个实例中，该测定在妊娠的13-16周进行。这样的测定还可在妊娠的次三个月结束时或妊娠的第三个三个月时进行，例如，在26、28、30、32、34、36或38周，或其中的任何时间间隔。优选地，在该时间段内，将可溶内皮糖蛋白和/或本文描述的任何其它多肽的水平测量两次。就产后先兆子痫或子痫的诊断而言，可溶内皮糖蛋白的测定可在产后进行。就先兆子痫或子痫的倾向的诊断而言，在妊娠开始之前或在发展先兆子痫或子痫的症状之前进行测定。在一个实例中，就治疗的监测和控制而言，在诊断先兆子痫后、在妊娠过程中和/或在治疗过程中进行测定。
在一个特定的实例中，可在妊娠过程中收集系列血液样品，并通过ELISA测定可溶内皮糖蛋白多肽和/或本发明的任何其它多肽的水平。在另一个实例中，在妊娠的次三个月期间和第三个三个月的早期收集样品，且从第一次取样到下一次取样时可溶内皮糖蛋白或本发明的任何其它多肽的水平的增加，是先兆子痫或子痫或发展其中任一种的倾向的指示。
本发明也包含测量受试者体液(优选尿)中的任何可溶内皮糖蛋白结合蛋白(例如，TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP-2和BMP-7)或可溶内皮糖蛋白信号传递的下游介质(如PGI2和eNOS)，且可溶内皮糖蛋白结合蛋白水平的变化(例如，增加或减少)是先兆子痫或子痫的指示。测量本文描述的可溶内皮糖蛋白的方法和时间也可以用于测量任何可溶内皮糖蛋白结合蛋白、PGI2或eNOS。
在兽医实践中，可在妊娠过程中的任何时间进行测定，但优选地在妊娠早期、发作先兆子痫症状前进行。已知妊娠期限在物种之间广泛变化，测定时间选择将由兽医决定，但通常与人类妊娠过程的测定时间选择相对应。
可以单独地，或与本文所述的任何其它诊断方法组合使用本文所述的诊断方法，以更准确地诊断先兆子痫或子痫的存在、严重程度或估计的发作时间。此外，本文所述的诊断方法可与用于准确诊断先兆子痫或子痫的存在、严重程度或估计的发作时间的任何其它诊断方法组合使用。
本文所述诊断方法还可用于监测并控制受试者的先兆子痫或子痫。在一个实例中，施用治疗，直到血液、血浆或血清可溶内皮糖蛋白水平小于25ng/ml或直到血清可溶内皮糖蛋白水平(或可溶内皮糖蛋白结合蛋白、PGI2或eNOS水平)回到在先兆子痫或子痫发作前确定的基线水平。在另一个实例中，如果测得受试者具有相对于正常对照提高的可溶内皮糖蛋白水平，则可以施用治疗，直到血清PlGF水平提高到约400pg/mL或回到先兆子痫或子痫发作前的基线水平。在该实施方案中，重复测量可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF、VEGF、可溶内皮糖蛋白结合蛋白、PGI2、eNOS，或它们中的任一种或全部的水平，作为不仅诊断疾病，而且监测先兆子痫和子痫的治疗和控制的方法。
诊断试剂盒
本发明还提供诊断测试试剂盒。例如，诊断测试试剂盒可包含特异性结合可溶内皮糖蛋白的结合剂(如多肽或抗体)，和用于检测、且更优选用于评价结合剂与可溶内皮糖蛋白多肽之间的结合的工具。对于检测，对结合剂或可溶内皮糖蛋白多肽进行标记，且结合剂或可溶内皮糖蛋白多肽是结合基质的，这样在结合剂与可溶内皮糖蛋白多肽之间结合后，通过测定附着到基质上的标记的量，就可以确定可溶内皮糖蛋白多肽-结合剂的相互作用。常规的ELISA是本领域已知的检测抗体-基质相互作用的常见方法，且可以与本发明的试剂盒一起提供。实际上，可在任何体液(包含但不限于尿、血清、血浆、唾液、羊水或脑脊液)中检测可溶内皮糖蛋白多肽。本发明也提供了包含可溶内皮糖蛋白核酸的诊断测试试剂盒，所述可溶内皮糖蛋白核酸可以用于检测和确定可溶内皮糖蛋白核酸的水平。测定可溶内皮糖蛋白多肽的水平相对于参照(如存在于正常对照中的水平)的变化(例如提高)的试剂盒，可用作本发明方法中的诊断试剂盒。
本发明的诊断试剂盒可以包含用于检测美国专利申请公开号20040126828、20050025762和20050170444和PCT公开号WO2004/008946和WO 2005/077007所述的sFlt-1、VEGF或PlGF多肽或核酸的抗体或核酸。
在另一实施方案中，试剂盒也可以包括用于检测可溶内皮糖蛋白配体的结合剂，包括但不限于TGF-β1、TGF-β3、或PGI2或eNOS多肽。用于测量TGF-β1和β3多肽水平的抗体是可商购的，例如，购自Abcam，Abgent，BD Biosciences Pharmingen，Chemicon，GeneTex和R&D Systems。用于测量eNOS多肽水平的抗体是可商购的，例如，购自Research Diagnostics Inc.，Santa Cruz，Cayman Chemicals和BDBiosciences。也可以包括用于检测PGI2水平的结合剂，并且包括例如PGI2受体或其片段，作为上文描述的任何诊断测定中的结合分子，或采用例如尿前列环素比色ELISA试剂盒(Assay Designs)。测定相对于正常参照或标准或水平(如存在于正常对照中的水平)，eNOS、TGF-β1或β3多肽或PGI2水平的改变(例如降低)的试剂盒可以用作本发明方法中的诊断试剂盒。测定相对于阳性参照标准或水平，可溶内皮糖蛋白水平的改变(例如降低)或可溶内皮糖蛋白结合蛋白(如TGF-β1，TGF-β3，激活蛋白A，BMP2和BMP7)或可溶内皮糖蛋白信号传递的下游介质(如eNOS和PGI2)水平的提高的试剂盒可以用于监测先兆子痫或子痫的治疗。
合意地，试剂盒包含进行上述的任一种诊断方法必需的所有组分。例如，试剂盒合意地包含膜，其中在该膜上固定了可溶内皮糖蛋白结合剂或结合可溶内皮糖蛋白结合剂的试剂。该膜可以支持在浸渍片结构上，在那里通过将浸渍片结构置于样品中，将样品沉积于膜上，或该膜可以支持在侧向流盒中，在那里通过盒中的开口，将样品沉积于膜上。
诊断试剂盒通常还包含关于试剂盒组分的预期用途的标签或说明书，和用于确立标准曲线的参照样品或纯化的蛋白。在一个实例中，试剂盒含有关于使用试剂盒来诊断妊娠相关的高血压病症，如先兆子痫、子痫或发展先兆子痫或子痫的倾向的说明书。在另一个实例中，试剂盒含有关于使用试剂盒来监测治疗先兆子痫或子痫的治疗性处理或剂量方案的说明书。诊断试剂盒也可以包含关于使用试剂盒来确定受试者样品的PAAI或可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数、并将PAAI或可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数与参照样品值相比较的标签或说明书。应当理解，参照样品值将取决于试剂盒的预期用途。例如，可以将样品与正常参照值相对比，其中PAAI或可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数或可溶内皮糖蛋白值的增加，是先兆子痫或子痫或先兆子痫或子痫的倾向的指示。在另一个实例中，用于治疗性监测的试剂盒可以具有参照PAAI或可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数值或可溶内皮糖蛋白值，它是先兆子痫或子痫的指示，其中与参照样品相比受试者样品的PAAI或可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数值的降低或可溶内皮糖蛋白值的降低，可以用于指示治疗性化合物的疗效或有效剂量。取决于试剂盒的用途，也可以包括正常或阳性参照范围内的纯化蛋白水平的标准曲线。
治疗
本发明涉及用于治疗或预防受试者的先兆子痫或子痫的方法和组合物。假设患有先兆子痫、子痫或具有这样状况的倾向的受试者中的可溶内皮糖蛋白的水平提高，则降低可溶内皮糖蛋白多肽或核酸分子的表达水平和/或生物活性的任何化合物，都可以用于本发明的方法中。这样的化合物包含TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2或BMP7，其可以破坏可溶内皮糖蛋白与配体的结合；特异性结合可溶内皮糖蛋白的纯化的抗体或抗原结合片段；反义核碱基寡聚体；和用于介导RNA干扰的dsRNA。其它有用的化合物包括可以改变可溶内皮糖蛋白的生物活性的任意化合物，例如，如通过血管发生测定所测得的。下面详细描述了示例性的化合物和方法。这些方法也可以与如PCT公开号WO 2004/008946和美国专利公开号20040126828和20050170444所述的降低sFlt-1水平、或提高VEGF或PlGF水平、或降低sFlt-1水平的方法相组合。此外，任何提高TGF-β1或3、eNOS或PGI2的水平或生物活性的化合物都可以用于本发明的方法中。示例性化合物和方法在下文详细描述。
应该指出，我们发现，可溶内皮糖蛋白和sFlt-1途径可以协同方式起作用，促进先兆子痫或子痫的致病。因此，本发明包括本文描述的任何方法或组合物的组合，用于治疗或预防妊娠相关的高血压病症。例如，靶向可溶内皮糖蛋白途径(如下调可溶内皮糖蛋白表达或生物活性，或上调TGF-β、eNOS或PGI2表达或生物活性)的化合物可以与靶向sFlt-1途径(如下调sFlt-1表达或生物活性或上调VEGF或PlGF表达或生物活性)的化合物组合使用，用于治疗或预防妊娠相关的高血压病症。
靶向TGF-β信号传导途径的治疗
TGF-β是至少25种生长因子的家族的原型，所述生长因子在许多细胞类型中调节生长、分化、运动性、组织重建、神经发生、创伤修复、细胞凋亡和血管发生。TGF-β也抑制许多细胞类型的细胞增殖，并可以刺激基质蛋白的合成。除了在它使用的上下文中可以看出以外，在贯穿本说明书中使用的术语TGF-β应当理解为，通常指适合的TGF-β超家族的任一个或所有成员。可溶内皮糖蛋白结合TGF-β家族的几个特定成员，包括TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白、BMP-2和BMP-7，且可以用于消耗发育中的胎儿或胎盘的必需的促有丝分裂因子和血管发生因子。本发明涉及提高这些配体的水平来结合可溶内皮糖蛋白和中和可溶内皮糖蛋白的作用的方法。
作为治疗性化合物的可溶内皮糖蛋白配体
在本发明的一个优选的实施方案中，给受试者施用纯化形式的任何可溶内皮糖蛋白配体，如TGF-β家族蛋白，包含但不限于TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2和BMP7，以治疗或预防先兆子痫或子痫。
纯化的TGF-β家族蛋白包含任何下述的蛋白：其氨基酸序列与TGF-β1或TGF-β3或任何已知TGF-β家族成员的氨基酸序列同源，更合意地基本相同，其可诱导血管发生。非限制性实例包含来自R&DSystems，MN的人TGF-β1(目录号240-B-002)和人TGF-β3(目录号243-B3-002)。用于本发明的方法中的优选TGF-β家族蛋白将具有结合可溶内皮糖蛋白的能力(如Barbaraet al，J.Biol.Chem.274：584-94(1999))。
抑制内皮糖蛋白的蛋白酶切割的治疗性化合物
我们已经鉴别了内皮糖蛋白的胞外域中的潜在切割位点，蛋白水解酶会在这里切割膜结合形式的内皮糖蛋白，从而释放出可溶形式的胞外域。我们的切割位点的序列比对表明，基质金属蛋白酶(MMP)负责切割和释放可溶内皮糖蛋白。或者，组织蛋白酶或弹性蛋白酶也可以参与切割事件。MMP也称作胶原酶、明胶酶和溶基质素，且存在26个已知的家族成员(综述见Whittaker和Ayscough，Cell Transmissions17：1(2001))。优选的MMP是MMP9，已知它在先兆子痫患者的胎盘中受到上调(Lim等，Am.J.Pathol.151：1809-1818，1997)。通过酶原的激活和内源抑制剂(如金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPS))的抑制，控制MMP的活性。MMP的抑制剂是锌结合蛋白。存在4种已知的内源抑制剂(TIMP 1-4)，其综述见上面的Whittaker等。一种优选的MMP抑制剂是膜型-MMP1的抑制剂，已经表明它会切割β聚糖，即与内皮糖蛋白(enodglin)共有相似性的一种分子(Velasco-Loyden等，J.Biol.Chem.279：7721-7733(2004))。此外，已经鉴别出了许多种天然存在的和合成的MMP抑制剂，且其综述也见上面的Whittaker等。实例包含针对MMP的抗体，和各种化合物，包括马马司他、巴马司他、CT1746、BAY 12-9566、普马司他(prinomastat)、CGS-27023A、D9120、BMS275291(Bristol Myers Squibb)和trocade，其中的一些现在处于临床试验中。已知MMP、组织蛋白酶或弹性蛋白酶在释放和上调可溶内皮糖蛋白水平中的潜在作用，本发明也提供了已知抑制参与可溶内皮糖蛋白的切割和释放的任意MMP、组织蛋白酶或弹性蛋白酶的活性的任意化合物(如上述的那些)在治疗或预防受试者的先兆子痫或子痫中的用途。
增加可溶内皮糖蛋白结合蛋白的治疗性化合物
本发明提供了已知刺激或提高可溶内皮糖蛋白结合蛋白(包含但不限于TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2和BMP7)的血清水平的任意化合物在治疗或预防受试者的先兆子痫中的用途。可以单独地，或与上文描述的纯化的蛋白或用于提高本文所述的TGF-β家族蛋白蛋白水平的任何其它方法组合使用这些化合物。在一个实例中，以每天两次100-200mg的剂量，使用环孢菌素来刺激TGF-β1生产。
改变可溶内皮糖蛋白的抗血管发生活性的治疗性化合物
使用血管发生测定，可以鉴别其它治疗性化合物。例如，将具有提高水平的可溶内皮糖蛋白的先兆子痫血清加入matrigel管形成测定中，将诱导抗血管发生状态。然后，可以将测试化合物加入测定中，且抗血管发生状态逆转10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，表明该化合物可以降低可溶内皮糖蛋白的生物活性，且可用作治疗性化合物。
提高NOS的水平或生物活性的治疗性化合物
NOS是一种复合酶，其包含一些辅因子、作为催化位点的一部分的血红素基团、N末端加氧酶结构域(其属于血红素-硫醇盐蛋白类)和与NADPH:P450还原酶同源的C末端还原酶结构域。NOS通过催化L-精氨酸(L-Arg)的胍基氮的5-电子氧化而产生NO。
eNOS激活涉及Ser1177磷酸化和Thr495去磷酸化的协同增加。我们发现TGF-β1使eNOS在Thr495去磷酸化，这对于增加Ca2+敏感性和酶活性是必须的，并且可能与通过使Ser1177磷酸化而激活eNOS的VEGF协同起作用。
因此，任何提高NOS，特别是eNOS的水平(例如通过提高稳定性、转录或翻译或减少蛋白降解)或生物活性的化合物(如多肽、核酸分子、小分子化合物或抗体)或任何防止eNOS活性下调的化合物都可以用于本发明的方法中。所述化合物包括纯化的NOS，优选eNOS，或其生物活性片段、编码NOS，优选eNOS的核酸，或其生物活性片段、抑制素、钒酸盐/酯、肝细胞生长因子、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、Akt、VEGF、TGF-β1或任何增加Ser1177磷酸化或Thr495去磷酸化或这两者的其它化合物。通过位于内皮细胞和其它细胞中的一氧化氮合酶从L-精氨酸合成一氧化氮。也可以通过应用多种一氧化氮供体，如硝普钠、硝酸甘油、SIN-1、单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯等而产生一氧化氮。因此，使NOS的水平或生物活性提高(例如至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多)的化合物可以任选与L-精氨酸或一氧化氮供体(如硝普钠、硝酸甘油、SIN-1、单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯)组合施用。可以通过本领域已知的标准方法测定NOS活性，包括但不限于瓜氨酸测定和全文引入本文作为参考的美国专利申请公开号20050256199中描述的其它测定。eNOS的Thr495残基位于eNOS的钙调蛋白(CaM)结合域内。在Thr495上的eNOS的激动剂诱导的去磷酸化增加CaM与酶的结合(Fleming等，CircRes.2001，88：E68-75)，从而增加其钙敏感性和激活。除了本文描述的TGF-β1，已经显示了其它激动剂导致eNOS的Thr495去磷酸化，包括缓激肽、组胺和VEGF。可以通过蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220(Calbiochem)或在PKC下调后用佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)(Sigma Aldrich)增强Thr495去磷酸化。此外，已经显示了激动剂诱导的Thr495的去磷酸化是Ca2+/钙调蛋白依赖性的，并且可以被花萼海绵诱癌素A(Sigma Aldrich)，即一种磷酸酶1(PP1)抑制剂(FlemingI，等Circ Res.2001，88：E68-75)抑制。实现Thr495上的eNOS去磷酸化的其它化合物包括组胺和缓激肽(Sigma Aldrich)。
提高PGI2的水平或生物活性的治疗性化合物
前列环素是已知为类二十烷酸的脂质分子家族成员。其在内皮细胞中通过酶-前列环素合酶的作用从前列腺素H2(PGH2)产生。PGI2生物活性包括血小板聚集的抑制、平滑肌的松弛、通过直接血管舒张导致的全身和肺血管阻力减少，以及肾脏中的尿钠排泄。
PGI2是一种抗血栓形成因子，VEGF和TGF-β1都可以刺激它。PGI2生物活性包括抑制血小板聚集和松弛血管平滑肌，PGI2生物活性的测定包括任何血小板聚集测定或本领域已知的其它PGI2测定，如Jakubowski等，Prostaglandins 47：404(1994)中描述的那些。本发明涉及通过本领域已知的标准测定方法测量的、使PGI2的水平或活性提高(例如至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多)的任何化合物的用途，包括但不限于PGI2模拟物、伊落前列素、西卡前列素和阿司匹林。其它本领域已知的化合物和实例描述于U.S.P.N.5,910,482，在此引入其公开内容作为参考。
纯化的蛋白
对于任何纯化的蛋白或其片段，蛋白是用本领域已知的标准方法制备的。也包括上文描述的任何治疗性蛋白的类似物或同源物，并且可以例如通过以下方式构建：制备残基或序列的多种取代、去除生物活性所不需要的末端或内部残基，或添加可能增强生物活性的末端或内部残基。可以进行氨基酸取代、缺失、添加或突变，从而改进多种表达系统中蛋白的表达、稳定性或溶解度。通常，进行保守取代并且考虑对生物活性的影响。构建用于表达类似物蛋白或其片段的核苷酸序列中的突变、缺失或添加当然必须保留编码序列的可读框，并且优选不会产生能够杂交的互补区从而产生二级mRNA结构，如环或发夹，这将不利地影响mRNA的翻译。
本发明的任何治疗性化合物(如多肽、抗体、小分子化合物)也可以包括任何修饰的形式。翻译后修饰的实例包括但不限于磷酸化、糖基化、羟化、硫酸化、乙酰化、异戊二烯化、脯氨酸异构化、亚基二聚化或多聚化，以及与任何其它蛋白或其片段或膜成分或其片段(如从附着了膜脂质成分的膜上切割蛋白)交联或附着。也包括提供额外的优点，如多肽的增加的亲和力、降低的解离速度、溶解度、稳定性和体内或体外循环时间，或降低的免疫原性，并且包括例如以下这些的修饰：乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联物的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸在蛋白上的添加，如精氨酰化，和遍在蛋白化(参见例如Creighton，“Proteins：Structures and Molecular Properties，”2d Ed.，W.H.Freeman和Co.，N.Y.，1992；“Postranslational Covalent Modification of Proteins，”Johnson，ed.，Academic Press，New York，1983；Seifter等，Meth.Enzymol.，182：626-646，1990；Rattan等，Ann.NYAcad.Sci.，663：48-62，1992)。本发明的肽基治疗性化合物也可以包括任何化合物的序列变体，如相对于野生型序列包括1、2、3、4、5、大于5或大于10个氨基酸改变的变体，所述改变如取代、缺失或插入。此外，本发明的治疗性化合物可以包含一个或多个非经典氨基酸。非经典氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨基、正亮氨酸、缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计氨基酸，如β-甲基氨基酸、Ca-甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸，和一般而言的氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)。
本发明所包含的其它翻译后修饰包括例如N-连接的或O-连接的碳水化合物链(N-末端或C-末端的加工)、化学部分连接于氨基酸主链、N-连接的或O-连接的碳水化合物链的化学修饰，和N-末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。
此外，也包括本文描述的治疗性化合物的化学修饰的衍生物，其可以提供额外的优点，如多肽的增加的溶解度、稳定性和循环时间，或降低的免疫原性(参见美国专利号4,179,337)。用于衍生的化学部分可以选自水溶性聚合物，如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇等。可以在分子内的随机位置，或在分子内的预定位置修饰化合物，并且可以包括一个、两个、三个或更多个连接的化学部分。
聚合物可以是任何分子量，并且可以是分支的或不分支的。对于聚乙二醇，优选的分子量是约1kDa-约100kDa(术语“约”表示在聚乙二醇的制剂中，一些分子的分子量将比指出的分子量更高或一定程度更低)，以便易于操作和制造。取决于需要的治疗谱(如需要的持续释放时间、对生物活性的任何影响(如果有)、易于操作、抗原性的程度或缺乏，和聚乙二醇对治疗性蛋白或类似物的其它已知影响)，可以采用其它大小。如上文所指出的，聚乙二醇可以具有分支的结构。分支的聚乙二醇描述于例如美国专利号5,643,575；Morpurgo等，Appl.Biochem.Biotechnol.56：59-72，(1996)；Vorobjev等，NucleosidesNucleotides 18：2745-2750，(1999)；和Caliceti等，Bioconjug.Chem.10：638-646，(1999)，上述每篇文献的公开内容都在此引入作为参考。
也可以采用形成嵌合分子的方式修饰本发明的任何治疗性化合物(如多肽、抗体或小分子化合物)，所述嵌合分子包含治疗性化合物，该化合物融合于另一异源多肽或氨基酸序列，如Fc序列、可检测标记物，或其它治疗性分子。在一个实例中，抗可溶内皮糖蛋白抗体可以是与Fc融合蛋白融合的肽。
对于本发明的方法中使用的任何多肽，包括抗体，采用本领域已知和本文描述的用于基因治疗的标准技术，编码所述多肽或抗体或其片段的核酸也可以用于本发明的方法中。基于多肽或肽片段的三维结构的模拟，并且采用合理药物设计，本发明也包括模拟物，以提供具有特定分子形状、大小和电荷特征的潜在抑制剂化合物。在鉴定治疗性化合物后，本领域已知的合适的模拟技术可以用于研究功能性相互作用，并且设计包含功能性基团的模拟化合物，所述功能性基团的排列方式使得它们能够复制这些相互作用。将模拟物设计为已知的药学活性化合物是用于基于前导化合物而开发药物的已知方法。在以下情况下上述方法可能是理想的，即当活性化合物难以合成，或合成太昂贵时，或对于特定施用方法不合适的时候，例如，肽不太适合作用口服组合物的活性剂，因为它们倾向于被消化道中的蛋白酶迅速降解。模拟物设计、合成和测试可以用于提供对大量分子的随机筛选，以得到靶特性。然后可以筛选模拟物，从而观察它们是否降低或抑制可溶内皮糖蛋白水平或生物活性，并且可以进一步优化或修饰，以便得到用于体内或临床测试的一种或多种最终的模拟物。
治疗性核酸
近来的工作表明，将能够表达内皮细胞促分裂原(如VEGF)的核酸(DNA或RNA)递送到血管损伤部位，将诱导受损血管的增殖和重新内皮化。虽然本发明不涉及血管损伤，但这些用于向内皮细胞递送核酸的普通技术也可用于本发明中，以用于递送编码可溶内皮糖蛋白结合蛋白(如TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2和BMP7)的核酸。该技术也可以用于递送编码蛋白的核酸，如上述的那些，所述蛋白已知抑制参与可溶内皮糖蛋白的切割和释放的任意MMP、组织蛋白酶或弹性蛋白酶的活性，以用于治疗或预防受试者的先兆子痫或子痫。这些普通技术在美国专利号5,830,879和6,258,787中描述，它们引入本文作为参考。
在本发明中，核酸可以是任何核酸(DNA或RNA)，包含编码可溶内皮糖蛋白结合蛋白(如TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2和BMP7)的基因组DNA、cDNA和mRNA。使用本领域的常规操作，例如，重组DNA、PCR扩增，可获得编码所需蛋白的核酸。
递送核酸的方式
对于本文所述的任一种核酸应用，可以使用标准的施用核酸的方法。实例描述于美国专利申请公开号20060067937和PCT公开号WO06/034507。
抑制可溶内皮糖蛋白表达的治疗性核酸
本发明还涉及反义核碱基寡聚体在直接下调可溶内皮糖蛋白mRNA的表达中的用途。通过结合互补核酸序列(有义或编码链)，反义核碱基寡聚体能够抑制蛋白表达，可能是通过RNA酶H对RNA链的酶促切割。优选地，反义核碱基寡聚体能够降低表达提高水平的可溶内皮糖蛋白的细胞中的可溶内皮糖蛋白的蛋白表达。优选地，与用对照寡核苷酸处理的细胞相比，可溶内皮糖蛋白蛋白表达降低了至少10％，优选地20％或更多，更优选地40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。选择和制备反义核碱基寡聚体的方法是本领域熟知的。使用反义核碱基寡聚体下调VEGF表达的实例，见美国专利号6,410,322，其引入本文作为参考。测定蛋白表达水平的方法也是本领域熟知的，且包含蛋白印迹、免疫沉淀法和ELISA。
本发明还涉及RNA干扰(RNAi)在抑制可溶内皮糖蛋白的表达中的用途。RNA干扰(RNAi)是近来发现的转录后基因沉默(PTGS)的机理，其中与目标基因或mRNA相对应的双链RNA(dsRNA)被引入到生物中，从而导致对应mRNA的降解。在RNAi反应中，dsRNA分子的有义和反义链被加工成长度为21-23个核苷酸(nt)且具有2个核苷酸的3’尾的小RNA片段或区段。或者，可以合成合成的dsRNA，它们长21-23nt，且具有2个核苷酸的3’尾，纯化，并用于反应中。这些21-23nt dsRNA被称作“指导RNA”或“短干扰RNA”(siRNA)。
然后，siRNA双链体与核酸酶复合物结合，该核酸酶复合物包含靶向且破坏内源mRNA的蛋白，所述内源mRNA与复合物内的siRNA具有同源性。虽然仍然不清楚复合物内的蛋白的特性，但复合物的功能是，通过siRNA链中的一条和内源mRNA之间的碱基配对相互作用，靶定同源的mRNA分子。然后，从siRNA的3’末端切割下约12nt的mRNA，并降解。以这种方式，可靶定特定基因并将其降解，由此导致靶定的基因的蛋白表达的丧失。也可以化学合成siRNA，或从化学合成siRNA的公司(例如，Dharmacon Research Inc.，Pharmacia或ABI)得到。
dsRNA的特殊要求和修饰描述于PCT公开号WO01/75164和美国专利申请公开号20060067937以及PCT公开号WO 06/034507，在此引入作为参考。
在早期妊娠中有用的基于可溶内皮糖蛋白的治疗性化合物
已经表明，全长内皮糖蛋白信号传递的抑制增强绒毛外植体培养物中的滋养层侵袭力(Caniggia I等，Endocrinology，1997，138：4977-88)。因此，可溶内皮糖蛋白可能增强早期妊娠过程中的滋养层侵袭力。因此，提高不患有妊娠相关的高血压病症或不具有妊娠相关的高血压病症的倾向的妇女在早期妊娠时的可溶内皮糖蛋白水平的组合物，对于促进胎盘形成是有益的。提高可溶内皮糖蛋白水平的组合物的实例包括纯化的可溶内皮糖蛋白多肽、可溶内皮糖蛋白编码核酸分子和提高可溶内皮糖蛋白的水平或生物活性的化合物或生长因子。
基因和蛋白表达的测定
下面的方法可以用于评价蛋白或基因表达，并确定任一种上述方法在提高可溶内皮糖蛋白结合蛋白水平、或降低可溶内皮糖蛋白蛋白水平中的效力。
使用诸如ELISA、蛋白印迹或使用特异性抗体的免疫测定的方法，测量受试者血清的可溶内皮糖蛋白的水平。也可以测量受试者血清的TGF-B1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2、BMP7或已知结合可溶内皮糖蛋白的任意蛋白配体的水平。用于测量蛋白的血清水平的方法包括ELISA、蛋白印迹或使用特异性抗体的免疫测定。此外，可以进行体外血管发生测定，以确定受试者的血液是否已经从抗血管发生状态转化成促血管发生状态。这样的测定记载在下文实施例4中。认为诊断先兆子痫或子痫的结果是可溶内皮糖蛋白的水平提高了至少10％、20％、优选地30％、更优选地至少40％或50％、且最优选地至少60％、70％、80％、90％或更多，表明先兆子痫或子痫改善的结果是可溶内皮糖蛋白的水平降低了至少10％、20％、优选地30％、更优选地至少40％或50％、且最优选地至少60％、70％、80％、90％或更多。或者或此外，认为诊断先兆子痫或子痫的结果是eNOS、PGI2、TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2、BMP7或任何已知与可溶内皮糖蛋白结合的蛋白配体的水平降低了至少10％、20％、优选地30％、更优选地至少40％或50％、且最优选地至少60％、70％、80％、90％或更多，表明先兆子痫或子痫改善的结果是eNOS、PGI2、TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2、BMP7或任何已知与可溶内皮糖蛋白结合的蛋白配体的水平提高了至少10％、20％、优选地30％、更优选地至少40％或50％、且最优选地至少60％、70％、80％、90％或更多。表明先兆子痫或子痫改善的结果也可以认为是采用体外血管发生测定测得，从抗血管发生状态至促血管发生状态转化了至少10％、优选地20％、30％、40％、50％、且最优选地至少60％、70％、80％、90％或更多。
也可以测量来自受试者的血清或尿样品中的编码eNOS、TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2、BMP7或可溶内皮糖蛋白的核酸或多肽的水平。存在几种本领域已知的测定基因表达的方法。一些实例包括，从受试者的血液样品制备RNA，并使用RNA进行RNA印迹、基于PCR的扩增、或RNA酶保护测定。认为阳性结果是可溶内皮糖蛋白、TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2、BMP7核酸的水平提高了至少10％、20％、优选地30％、更优选地至少40％或50％、且最优选地至少60％、70％、80％、90％或更多。
治疗性抗体
在从患有先兆子痫的孕妇采集的血清样品中发现的提高水平的可溶内皮糖蛋白，表明可溶内皮糖蛋白可起“生理学库”的作用，以结合胎儿或胎盘的正确发育和血管发生所需的滋养层细胞和母体内皮细胞的功能性生长因子，并将其耗尽。使用化合物(如抗体)来结合可溶内皮糖蛋白并中和可溶内皮糖蛋白的活性(例如，结合TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2、BMP7)，可以通过增加游离的TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2和BMP7，帮助预防或治疗先兆子痫或子痫。这种增加将使胎盘发育和胎儿营养所需的滋养层增殖、迁移和血管发生能够增加，且使全身的母体内皮细胞健康。
本发明提供了特异性结合可溶内皮糖蛋白的抗体。优选地，所述抗体结合内皮糖蛋白的胞外域或配体结合域。所述抗体用于中和可溶内皮糖蛋白的活性，且认为最有效的机理是通过直接封闭TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP2或BMP7的结合位点，然而，不排除其它机理。优选的抗体可以结合人内皮糖蛋白上的表位(由于线性结果或三维构象的结果)，所述表位包括图30B中以粗体和下划线表示的任何一个或多个肽序列(如氨基酸40-86、144-199、206-222、289-304或375-381)或结合可溶内皮糖蛋白的任何优选片段(如人内皮糖蛋白的氨基酸1-437、4-437、40-406或1-587)。用于治疗目的的抗体的制备和使用方法在几个专利中描述，包含美国专利号6,054,297；5,821,337；6,365,157；和6,165,464，美国专利申请公开号2006/0067937；和PCT公开号WO 06/034507，且它们引入本文作为参考。抗体可以是多克隆的或单克隆的；优选单克隆人源化抗体。本发明还包括结合可溶内皮糖蛋白的抗体，包括但不限于结合图30B中以粗体和下划线表示的任何一个或多个肽或结合可溶内皮糖蛋白的任何优选片段(如人内皮糖蛋白的氨基酸1-437、4-437、40-406或1-587)的抗体。
抗体的治疗用途
当体内用于治疗或预防先兆子痫或子痫时，将本发明的抗体以治疗有效量施用给受试者。优选地，肠胃外施用所述抗体或通过连续输注静脉内施用所述抗体。给药和剂量方案取决于疾病的严重程度和受试者的整体健康状况。施用的抗体的量通常为约0.001-约10mg/kg受试者体重、优选0.01-约5mg/kg受试者体重。
对于肠胃外施用，将抗体与药学可接受的肠胃外载体一起配制成单位剂量注射形式(溶液、悬浮液、乳状液)。这种载体本身是无毒且无治疗性的。这种载体的实例是水、盐水、林格液、葡萄糖溶液以及5％人血清白蛋白。还可使用不合水的载体，如固定的油以及油酸乙酯。可将脂质体用作载体。所述载体可包含少量添加剂，如提高等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲剂及防腐剂。通常以约1mg/ml-10mg/ml的浓度，在这种载体中配制抗体。
联合疗法
任选地，治疗可与任何其它标准的先兆子痫或子痫疗法联合施用；这样的方法是技术人员已知的，且包括美国专利申请公开号20040126828、20050025762、20050170444、20060067937和20070104707和PCT公开号WO 2004/008946、WO 2005/077007和WO 06/034507中所述的方法。
理想地，本发明涉及使用本文描述的任何一种或多种治疗剂的组合。由于我们发现了可溶内皮糖蛋白和sFlt-1可以协同作用，以通过分别干扰TGF-β1和VEGF信号传递途径，可能趋同作用于NOS信号传递途径，从而诱导血管损伤和妊娠相关的高血压病症，因此本发明的理想的治疗方法包括联合施用降低sFlt-1水平或活性，或提高VEGF或PlGF水平或活性的化合物和降低可溶内皮糖蛋白水平或活性或提高TGF-β、NOS或PGI2水平或活性的化合物。本领域技术人员可以理解，任何上述试剂的任何组合都可以用于此目的。例如，可以与VEGF联合施用特异性结合可溶内皮糖蛋白的抗体。在另一实例中，提高TGF-β1活性或水平的化合物可以与提高VEGF或PlGF的化合物联合施用，以便靶定内皮糖蛋白和VEGF途径两者。或者，抗可溶内皮糖蛋白和sFlt-1两者的抗体可以直接使用或用于离体方法中(例如，采用排列了抗可溶内皮糖蛋白或sFlt-1的柱，并且使患者的血液经该柱循环)。任何上述组合可以进一步包括施用提高NOS，优选eNOS水平或活性的化合物，以便调节各自受体下游的途径。
此外，本发明提供了任何慢性高血压药物与任何本文描述的治疗方法联合使用的用途。用于在妊娠过程中治疗高血压的药物包括甲基多巴、盐酸肼苯哒嗪或拉贝洛尔。这些药物中的每一种，施用方式和剂量可以由医生和制造商的说明书确定。
施用的剂量和方式
优选地，在妊娠过程中直接或采用离体方法施用治疗，以用于治疗或预防先兆子痫或子痫，或在妊娠后施用治疗，以治疗产后先兆子痫或子痫。施用技术和剂量依赖于化合物类型(例如，化合物、纯化的蛋白、抗体、反义、RNAi或核酸载体)而变化，且是本领域技术人员熟知的或容易确定的。
本发明的治疗性化合物可与药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起，以单位剂型施用。施用可以是肠胃外、静脉内、皮下、口服或通过直接注射到羊水中而局部施用。通过连续输注而静脉内递送，是施用本发明治疗性化合物的优选方法。治疗性化合物可以是溶液、悬浮液、乳状液、输注装置或用于植入的递送装置的形式，或它可以作为干粉存在，用于在使用前用水或其它合适的载体重配。
所述组合物的形式可以是口服施用的丸剂、片剂、胶囊、液体或持续释放的片剂；或用于静脉内、皮下或肠胃外施用的液体；或用于局部施用的聚合物或其它持续释放载体。
用于制备制剂的本领域熟知的方法见，例如，“Remington：TheScience and Practice of Pharmacy”(20th ed.，ed.A.R.Gennaro AR.，2000，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA)。用于肠胃外施用的制剂可包含，例如，赋形剂、无菌水、盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘。生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，可用于控制化合物的释放。纳米颗粒(nanoparticulate)制剂(例如，可生物降解的纳米颗粒、固体脂类纳米颗粒、脂质体)可用于控制化合物的生物分布。其它潜在有效的肠胃外递送系统包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统及脂质体。制剂中化合物的浓度取决于多种因素，包含所施用药物的剂量以及施用途径。
所述化合物可任选地作为药学可接受的盐(如制药工业通常使用的无毒酸加成盐或金属络合物)来施用。酸加成盐的实例包括，有机酸如乙酸、乳酸、双羟萘酸(pamoic)、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸等；聚合酸如鞣酸、羧甲基纤维素等；和无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等。金属络合物包括锌、铁等。
用于口服使用的制剂包括，含有与无毒的药学可接受赋形剂相混合的活性成分的片剂。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充物(例如，蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助流剂和抗结合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。
口服使用的制剂还可以咀嚼片剂的形式提供，或以硬胶囊的形式提供，其中将活性成分与惰性固体稀释剂混合，或以软胶囊的形式提供，其中将活性成分与水或油性介质混合。
施用化合物的剂量和时间选择取决于各种临床因素，包含受试者的整体健康状况和先兆子痫症状的严重程度。一般而言，一旦检测出先兆子痫或先兆子痫的倾向，则使用纯化蛋白的连续输注来治疗或预防所述状况的进一步发展。治疗可持续1-100天，更优选1-60天，且最优选1-20天时间段，或直到妊娠结束。剂量可根据每种化合物以及状况的严重程度而变化，并通过滴定来获得稳态的血清浓度，即10-20ng/ml可溶内皮糖蛋白；和/或1-500pg/mL游离VEGF或游离PlGF或二者，优选地1-100pg/mL，更优选地5-50pg/mL、且最优选地5-10pg/mL VEGF或PlGF或1-5ng sFlt-1。
本文所述的诊断方法可以用于监测在治疗过程中的先兆子痫或子痫，或确定治疗性化合物的剂量。在一个实例中，在治疗过程中施用治疗性化合物，并确定PAAI。如果PAAI小于20、优选地小于10，则认为治疗剂量是有效剂量。在另一个实例中，在治疗过程中施用治疗性化合物，并确定可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数。如果可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数小于200、优选地小于100，则认为治疗剂量是有效剂量。
受试者监测
使用本发明的诊断方法、试剂盒和组合物，可以监测患有先兆子痫、子痫或有这样的状况的倾向的受试者的疾病状况或治疗。例如，监测存在于体液(如血液、血清、尿、血浆、羊水或CSF)中的可溶内皮糖蛋白多肽的表达。可溶内皮糖蛋白监测可以与监测sFlt-1、VEGF或PlGF、TGF-β或eNOS多肽或核酸或PGI2的表达的方法相结合。这种监测可以用于，例如，评价特定药物在受试者中的效力或评价疾病进展。降低可溶内皮糖蛋白核酸分子或多肽的表达或生物活性的治疗在本发明中特别有用。
筛选测定
如上面所讨论的，可溶内皮糖蛋白核酸或多肽的水平在患有先兆子痫、子痫或有这样状况的倾向的受试者中提高。基于这些发现，本发明的组合物可用于候选化合物的高通量低成本筛选，以鉴别调节可溶内皮糖蛋白多肽或核酸分子的表达的那些，所述表达在患有先兆子痫或子痫的受试者中发生变化。
许多方法都可用于进行筛选测定，以鉴别改变可溶内皮糖蛋白核酸分子的表达的新候选化合物。其实例详细描述于美国专利申请公开号20060067937和PCT申请号WO 06/034507。
在一个工作实施例中，可筛选候选化合物中特异性结合可溶内皮糖蛋白多肽的那些。这种候选化合物的效力取决于它与这类多肽或其功能等价物相互作用的能力。使用任意数目的标准结合技术和功能测定，如免疫测定或基于亲和层析的测定(例如，上面的Ausubel等描述的那些)，可容易地测定这种相互作用。在一个实施方案中，可溶内皮糖蛋白多肽是固定的，并且用基于标准亲和层析的测定测试化合物结合固定的可溶内皮糖蛋白的能力。然后可以洗脱结合固定的可溶内皮糖蛋白的化合物并且纯化，并且进一步测试其在体内和体外结合可溶内皮糖蛋的能力，或其抑制可溶内皮糖蛋的生物活性的能力。
在另一实例中，可通过降低可溶内皮糖蛋白多肽与生长因子(如TGF-β、TGF-β3、激活蛋白-A、BMP-2和BMP-7)的结合，测试候选化合物降低可溶内皮糖蛋白多肽的生物活性的能力。这些测定可以在体内或体外进行，并且可以采用本领域已知或本文描述的任何可溶内皮糖蛋白的任何活性测定对可溶内皮糖蛋白多肽的生物活性进行测定。例如，可以将细胞与Smad2/3依赖性报道构建体一起温育。如果需要，细胞也可以在TGF-β存在下温育，以增强Smad2/3依赖性报道构建体上的信号。然后可以在可溶内皮糖蛋白存在下温育细胞，所述可溶内皮糖蛋白将减少Smad2/3依赖性报道构建体的TGF-β诱导的激活。可以在细胞中加入候选化合物，任何导致与未用化合物处理的细胞相比，可溶内皮糖蛋白处理的细胞中Smad2/3依赖性报道物的TGF-β诱导的激活增加的化合物被认为是可以用于治疗先兆子痫或子痫的化合物。
在另一实例中，eNOS的Thr495上的TGF-β诱导的去磷酸化也可以用作可溶内皮糖蛋白生物活性改变的测定。在该实例中，在可溶内皮糖蛋白的存在下温育细胞，这在下文描述的实验中显示，其抑制eNOS的Thr495的TGF-β1去磷酸化。然后在细胞中加入候选化合物，确定Thr495的磷酸化状态。与未用化合物处理的细胞相比，任何导致可溶内皮糖蛋白处理的细胞中Thr495去磷酸化的TGF-β诱导的激活增加的化合物被认为是可以用于治疗先兆子痫或子痫的化合物。
实施例
下面的实施例意在解释本发明。它们无意以任何方式限制本发明。
实施例1.先兆子痫孕妇中提高水平的内皮糖蛋白mRNA和蛋白
在鉴别在先兆子痫中起病理学作用的新的分泌因子的尝试中，我们使用Affymetrix U95A微阵列芯片进行了患有先兆子痫的17位孕妇和13位正常孕妇的胎盘组织的基因表达谱分析。我们发现，内皮糖蛋白的基因在患有先兆子痫的妇女中被上调。
为了证实内皮糖蛋白在先兆子痫中的上调，我们进行RNA印迹以分析与血压正常的孕妇相比的先兆子痫孕妇中的胎盘内皮糖蛋白mRNA水平(图3)，并进行蛋白印迹以测量与血压正常的孕妇相比的先兆子痫孕妇中的内皮糖蛋白的血白蛋白水平(图4)。先兆子痫被定义为：(1)妊娠20周后，收缩压(BP)＞140mmHg且舒张压＞90mmHg，(2)新发作的蛋白尿(利用浸渍片进行尿分析为1+，24小时尿收集中的蛋白＞300mg，或随机尿蛋白/肌酸酐比＞0.3，和(3)到产后12周，高血压及蛋白尿消除。排除患基础高血压、蛋白尿或肾病的患者。基于是否存在肾炎范围的蛋白尿(24小时尿收集中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)，将患者分成轻度先兆子痫和重度先兆子痫。轻度先兆子痫组中的平均尿蛋白/肌酸酐比为0.94+/-0.2，而重度先兆子痫组为7.8+/-2.1。各组的平均胎龄如下：正常38.8+/-0.2周、轻度先兆子痫34+/-1.2周、重度先兆子痫31.3+/-0.6周和早产的29.5+/-2.0周。分娩后立即获得胎盘样品。从每个胎盘随机采集4份样品，放在RNA later稳定溶液(Ambion，Austin，TX)中，并在-70℃保存。使用QiagenRNAeasy Maxi试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行RNA分离。
用对应N-末端区(Genebank#BC014271)的内皮糖蛋白编码区中的400碱基对探针(Unigene Hs.76753)和作为标准化对照的18S探针探测的RNA印迹显示了胎盘内皮糖蛋白mRNA的增加(参见Knebelmann等，Cancer Res.58：226-231(1998))。用内皮糖蛋白氨基末端的抗体探测的蛋白印迹显示了与血压正常的孕妇相比，先兆子痫孕妇中内皮糖蛋白的胎盘和母体血清水平两者的增加。
实施例2.证实先兆子痫患者的胎盘和血清中的可溶内皮糖蛋白多肽
用于测量先兆子痫妇女的胎盘和血清中的内皮糖蛋白水平的蛋白印迹分析提示了更小的蛋白(约63-65kDa)的存在，它存在于先兆子痫孕妇的胎盘和血清中(图4和30A)。我们已经证实，该更小的片段是内皮糖蛋白的胞外域。该截短形式可能是从胎盘合胞滋养层和内皮细胞脱落的，并在先兆子痫患者中过量地循环。该可溶形式的内皮糖蛋白可以通过结合正常血管健康必需的循环配体，起抗血管发生剂的作用。
可溶形式的蛋白的预测长度是大约437个氨基酸(包括肽前导序列，没有前导序列是412个氨基酸)。从先兆子痫患者的血清纯化sEng。从44G4-IgG(抗-Eng)琼脂糖凝胶洗脱级分4和5，在还原条件下在SDS-PAGE上电泳，并且采用Eng的多克隆抗体通过蛋白印迹进行测试。对洗脱的级分进行质谱分析(3次运行)，并且示出了鉴定的肽(图30B)。通过质谱进行的纯化和分析发现从Gly40到Arg406的一些Eng特异性肽，表明了对应在人内皮糖蛋白的序列上以粗体表示的全长蛋白的N末端区域的可溶形式(可溶内皮糖蛋白)。
实施例3.具有正常妊娠的妇女与先兆子痫妊娠的妇女中的可溶内皮糖蛋白的循环浓度
为了对比正常的、轻度先兆子痫或重度先兆子痫妇女的血清中的循环的可溶内皮糖蛋白的水平，我们对取自这些妇女的血样进行了ELISA分析。该研究中的所有患者都在获得合适的IRB批准的同意书后在贝丝以色列女执事医疗中心招募。先兆子痫被定义为：(1)妊娠20周后，在以前正常血压的患者中收缩压＞140且舒张压＞90，(2)新发作的蛋白尿(利用浸渍片进行尿分析为1+，或24小时尿收集中的蛋白＞300mg，或随机尿蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)到产后12周，高血压及蛋白尿消除。排除患基础高血压、蛋白尿或肾病的患者。为此研究的目的，基于是否存在肾炎范围的蛋白尿(24小时尿收集中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)，将患者分成轻度先兆子痫和重度先兆子痫。HELLP综合征定义为患者出现血小板减少症(＜100000细胞/μl)、提高的LDH(＞600IU/L)和提高的AST(＞70IU/L)的迹象。引入健康孕妇作为对照。将8个由于其它医学原因而早产的患者引入作为额外的对照。分娩后立即获得胎盘样品。在获得知情同意书后，在分娩时(在胎盘分娩前0-12小时)从孕妇收集血清。这些实验获得贝丝以色列女执事医疗中心的制度评审委员会的批准。
采用来自表1描述的患者血清标本，我们测量了各组先兆子痫患者和对照妊娠患者的可溶内皮糖蛋白循环浓度。当先兆子痫患者进一步细分为具有和不具有HELLP的患者时，与胎龄匹配的早产对照相比，轻度、重度和HELLP综合征先兆子痫中的sEng浓度分别高3、5和10倍(图28)。妊娠患者中sEng的浓度与sFlt1的浓度相关(R2＝0.56)，除了在HELLP组中，sEng比sFlt1高。在患者的一个亚组中，在胎盘分娩后48小时获得的血样显示先兆子痫和正常妊娠患者中平均sEng循环水平减少70％(图29)。
表1：各个患者组的临床特征和循环可溶内皮糖蛋白
                     正常       轻度先兆子痫  无HELLP的            有HELLP的            早产
                     (n＝30)    (n＝11)       重度先兆子痫(n＝17)  重度先兆子痫(n＝11)  (n＝8)
母亲年龄(岁)         32.43      33.18         29.5                 33.73                31.88
                                                                                        30.99
胎龄(用)             38.65      31.91*        29.06*               26.52*               *
初次分娩(％)         43.3       63.6          47.1                 90.9                 62.5
收缩压(mmHg)         122        157*          170*                 166*                 123
舒张压(mmHg)         72         99*           104*                 103*                 77
蛋白尿(g蛋白/g肌酸酐)0.37       2.5*          8.64*                5.16*                0.6
尿酸(mg/dl)          5.27       6.24          7.29*                6.31                 7.35
血细胞比容(％)       35.5       33.6          33.7                 33.5                 34.3
血小板计数           238        230           249                  69.4*                229
肌酸酐(mg/dl)        0 55       0.62          0.62                 0.64                 0.67
可溶内皮糖蛋白(ng/ml)18.73      36.12*        52.55**              99.83***             10.9
*P＜0.05，**P＜0.005
在轻度先兆子痫中，可溶内皮糖蛋白的平均血清浓度至少高2倍，而在重度先兆子痫患者中高3-4倍。在并发HELLP综合征的先兆子痫患者中，可溶内皮糖蛋白浓度比胎龄匹配的对照标本高至少5-10倍。另外，妊娠患者中的可溶内皮糖蛋白水平与sFlt1水平相关联(图18)。关联的R2值是0.6。(应当指出，这里报道的sFlt-1循环浓度比以前公布的至少高4-5倍(Maynard等，同上)。这是由于来自R&D systems的新ELISA试剂盒的灵敏度的差异，其在测定稀释液中缺少尿素，因此总是产生比以前公布的更高的值)。换而言之，具有最高水平的可溶内皮糖蛋白的患者也具有最高循环水平的sFlt1。可溶内皮糖蛋白的起源最可能是胎盘的合胞滋养层，如在我们的胎盘免疫组织化学上看到的增强染色所证实的(图19和20)。这些图表明，内皮糖蛋白蛋白由合胞滋养层表达，并在先兆子痫中极大地上调。我们的蛋白印迹数据(图21A和21B)和缺乏通过RNA印迹可检测的可变剪接变体支持以下概念：可溶内皮糖蛋白可能是膜内皮糖蛋白的胞外域的脱落形式。其大小约65kDA，在先兆子痫胎盘中以提高的水平产生，且它在先兆子痫血清中以更高的量循环。该蛋白在正常孕妇的血清中以低得多的水平存在，并且在非孕妇中几乎不能检测到。先兆子痫胎盘中的可溶内皮糖蛋白表达比正常妊娠中高4倍(n＝1-/组，P＜0.01)。这些实验中sEng/Eng的定量显示正常(0.43)和先兆子痫(0.56)胎盘之间没有显著差异(n＝10/组，P＝0.4)，表明sEng来源于全长蛋白，并且在先兆子痫中Eng和sEng类似地增加。
以下方法用于本实施例中描述的一些实验。
免疫组织化学
按照(Leach等，Lancet 360：1215-1219(2002))的报道进行内皮糖蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(SMA)的胎盘样品的免疫组织化学。简言之，室温下将从无先兆子痫的患者(n＝10)和患有先兆子痫的患者(n＝10)获得的冷冻胎盘切片载玻片与不含血清的蛋白封闭溶液(DAKO)一起温育30分钟，然后在室温下与第一抗体(小鼠单克隆抗内皮糖蛋白：1∶50稀释；DAKO)2小时。然后用磷酸缓冲液洗涤载玻片10分钟。应用第二抗体，即罗丹明缀合的绵羊抗小鼠IgG，1∶200稀释(Biomeda)1小时。用磷酸缓冲液再次洗涤切片，随后室温下与FITC缀合的小鼠抗人SMA(Dako)的1∶400稀释液一起温育30分钟。由不知道临床诊断的病理学家采用SPOT高级成像系统(RT SLIDERDiagnostic Instruments，Inc)评价内皮糖蛋白的免疫反应性。
ELISA和蛋白印迹
用从R & D Systems，MN商购的ELISA试剂盒(例如目录号DNDG00)并且按照以前的描述(Maynard等，J.Clin.Invest.111：649-658，2003进行ELISA)。基本按照以前的描述进行蛋白印迹(Maynard等，同上，和Kuo等Proc.Natl.Acad.Sci.98：4605-4610(2001)))。
免疫沉淀(IP)实验
将随后为蛋白印迹的IP用于鉴别和表征先兆子痫患者的胎盘组织和血清标本中的可溶内皮糖蛋白。用冷PBS洗涤人胎盘组织，并在匀浆缓冲液[10mM Tris-HCl，pH7.4；15mM NaCl；60mM KCl；1mMEDTA；0.1mM EGTA；0.5％NonidetP-40；5％蔗糖；购自Roche(Indianapolis，IN)的蛋白酶混合物]中裂解10分钟。然后，用抗人单克隆小鼠内皮糖蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，对胎盘裂解物进行免疫沉淀。根据生产商的说明书，使用免疫纯的IgG定向试剂盒(Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，美国)，通过定向偶联3-5mg纯化的抗体到2ml A蛋白-琼脂糖凝胶上，制备免疫亲和柱。然后，用含有蛋白酶混合物的RIPA缓冲液充分洗涤柱，并用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液pH2.8洗脱结合的蛋白。将洗脱液收集在含有1mol/L Tris-HCl缓冲液的0.5-ml级分中。合并含有蛋白的级分，并用CENTRICON离心浓缩器(Millipore Corp.，Bedford，Massachusetts，美国)浓缩9至10倍。在4-12％梯度凝胶(Invitrogen)上分离免疫沉淀的样品，并将蛋白转移到聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜上。使用多克隆抗人兔内皮糖蛋白第一抗体(Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，通过蛋白印迹检测内皮糖蛋白蛋白。
纯化可溶内皮糖蛋白并且通过质谱分析
将来自先兆子痫患者的血清(10ml)依次加入CM Affi-凝胶蓝和蛋白A琼脂糖凝胶(Bio-Rad)柱上，以分别除去白蛋白和免疫球蛋白。将流通液缓慢加入缀合于琼脂糖凝胶的人Eng的mAb 44G4 IgG的2.5ml柱(Gougos等，Int.Immuno.4：83-92，(1992))。用0.02M二乙胺pH11.4洗脱结合的级分，立即用1M Tris pH7.8中和。合并280nm处的吸光度增加的级分4和5，57℃下用10mM DTT还原1小时，并且用0.055M碘乙酰胺烷基化。然后用胰蛋白酶(1∶100)完全消化样品。将冻干的样品重悬于0.1％三氟乙酸中，注入CapLC(Waters)仪器中。用75μm Nano Series柱(LC Packings)分离肽，并且用Qstar XL MS/MS系统分析。用Mascot检索引擎(Matrix Science)对人蛋白数据库NCBInr进行数据检索。
实施例4.血管发生的模型测定
内皮管测定可以用作血管发生的体外模型。将生长因子减少的Matrigel(7mg/mL，Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)放在预冷的48孔细胞培养平板的孔(100μl/孔)中，并在37℃温育25-30分钟，以允许聚合。用10％患者血清处理第3-5代人脐静脉内皮细胞(30,000+在300ul没有血清的内皮基础培养基中，Clonetics，Walkersville，MD)，铺板到Matrigel包被的孔上，并在37℃温育12-16小时。然后通过4X倒置相差显微镜(Nikon Corporation，Tokyo，日本)评价管形成，并使用Simple PCI成像分析软件进行分析(管面积和总长度)。
实施例5.作为妇女的先兆子痫和子痫的诊断指标的可溶内皮糖蛋白蛋白水平(Romero研究)
该研究设计用于评价在临床先兆子痫的过程中是否改变可溶内皮糖蛋白和它是否可以用于预测妇女的先兆子痫和子痫。
在Wayne州立大学/NICHD围产期学部门，底特律，MI的RobertoRomero博士的协助下，完成了该研究。如Chaiworapongsa等(TheJournal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine，January 2005，17(1)：3-18)以前所述，使用库存的生物学样品数据库，进行了回顾性纵向病例对照研究。所有妇女都在Sotero del Rio医院，圣地亚哥，智利登记产前临床，并直到分娩。在妊娠的前三个月和次三个月中，以4周时间间隔安排产前诊断，且在第三个三个月直至分娩，每2周安排产前诊断。对于下面的6个时间间隔中的每一个，只选择每位患者的血浆样品一次：妊娠的(1)7-16周，(2)16-24周，(3)24-28周，(4)28-32周，(5)32-37周，和(6)＞37周。对于每个先兆子痫病例，通过在临床诊断先兆子痫时的胎龄(+/-2周)匹配，选择一个对照。诊断先兆子痫的临床标准与上面的Chaiworapongsa等以前所述的相同。
血浆内皮糖蛋白水平的测量
将保存在-70℃的血浆样品解冻，并使用从R&D systems，Minneapolis，MN.(目录号DNDG00)商业上得到的ELISA试剂盒，测量一批血浆可溶内皮糖蛋白水平。
统计学分析
使用协方差分析来评价在调整血液取样的胎龄和样品保存时间间隔后，必然发展先兆子痫的患者和正常妊娠之间的可溶内皮糖蛋白的血浆浓度差异。使用卡方或Fisher准确检验来比较比例。使用的统计软件包是SPSS V.12(SPSS Inc.，Chicago，IL)。假定的显著性为p值小于0.05。
结果
在表2中描述了研究群体的临床特征。患有先兆子痫的组包括比对照组更多的未经产的妇女，且比对照组更早分娩。重要的是，先兆子痫组的胎儿出生重量更小，且存在更高比例的携带小于胎龄(SGA)婴儿的妇女。
表2.研究群体的临床特征
Figure A20078002685800701
将值表达为平均值±标准差或数字(％)
GA：胎龄
在表3中描述了患有先兆子痫的患者的临床特征。32位(72％)患者患有重度先兆子痫，而10位患者患有严重的早发先兆子痫，确定其发作＜34周。
表3.患有先兆子痫的患者的临床特征
Figure A20078002685800711
将值表达为平均值±标准差或数字(％)
α(n＝26)；β(n＝42)
在表4中显示了在6个胎龄窗中测量的对照和先兆子痫妇女的血清可溶内皮糖蛋白水平。在先兆子痫中，将她们的样品分成2组：临床先兆子痫(在先兆子痫症状时采取的样品)和临床前先兆子痫(在临床症状之前采取的样品)。数据表明，在中期妊娠(妊娠的24-28周)时，必然发展先兆子痫的妇女中的血清可溶内皮糖蛋白浓度开始提高，并且到妊娠28-32周变得比对照高至少3倍。当与胎龄匹配的对照相比较时，从患有临床先兆子痫的妇女采取的血液样品显示出非常急剧的(几乎10-15倍)提高。
表4.正常妊娠和先兆子痫的血浆可溶内皮糖蛋白浓度
Figure A20078002685800721
pβ：在先兆子痫的临床表现时和正常妊娠的样品之间比较
将值表达为平均值±标准差
δ2位先兆子痫患者在临床表现时不能获得血液样品
为了检查血浆可溶内皮糖蛋白浓度和临床诊断先兆子痫的时间间隔之间的关系，根据从血液采样到临床诊断的时间间隔，将处于不同胎龄的先兆子痫患者的血浆样品分成5组：(1)在临床诊断时，(2)临床表现前2-5.9周，(3)临床表现前6-10.9周，(4)临床表现前11-15.9周，和(5)临床表现前16-25周。表5中的数据证实，在必然发展先兆子痫的妇女中，在发作先兆子痫症状之前6-10.9周，血浆可溶内皮糖蛋白水平开始提高，且在出现症状之前2-5.9周，至少高3倍。
表5.正常和先兆子痫孕妇中的血浆可溶内皮糖蛋白浓度
Figure A20078002685800731
将值表达为平均值±标准差
δ2位先兆子痫患者在临床表现时不能获得血液样品
为了检查血浆可溶内皮糖蛋白浓度以鉴别必然发展先兆子痫的患者的诊断潜力，将患者分成早发先兆子痫(PE＜34周)和晚发先兆子痫(PE＞34周)。对于患有早发先兆子痫的患者，从妊娠的约16-24周开始，先兆子痫(临床诊断前)的平均血浆可溶内皮糖蛋白水平显著高于正常妊娠(表6)，其中在24-28周和28-32周妊娠窗口中具有非常大的不同。相反地，对于患有晚发先兆子痫的患者，仅仅在28-32周，临床前先兆子痫的血浆可溶内皮糖蛋白浓度显著高于正常妊娠，其中在妊娠的32-36周具有非常大的不同(表7)。
Figure A20078002685800741
Figure A20078002685800751
总结
这些实验的结果证实，当与胎龄匹配的对照相比较时，患有临床先兆子痫的妇女具有非常高水平的循环可溶内皮糖蛋白。结果还证实，必然发展先兆子痫(临床前先兆子痫)的妇女具有比预测正常妊娠的妇女更高的血浆可溶内皮糖蛋白水平。在发作临床症状前至少6-10周，可以检测到可溶内皮糖蛋白水平的增加。最后，这些结果证实，早发和晚发先兆子痫都具有提高的循环可溶内皮糖蛋白浓度，但是该变化在早发先兆子痫中更显著。
实施例6.作为妇女的先兆子痫和子痫的诊断指标的可溶内皮糖蛋白蛋白水平(CPEP研究)
如上所述，我们已经发现，在先兆子痫胎盘中，上调可溶内皮糖蛋白，即一种促血管发生蛋白TGF-β的细胞表面受体，并在内皮和合胞滋养层上表达。在上述实验中，我们已经表明，在先兆子痫中，过量的可溶内皮糖蛋白通过胞外域的脱落，从胎盘释放进循环中；可溶内皮糖蛋白然后可以与sFlt1(一种结合胎盘生长因子(PlGF)和VEGF的抗血管发生因子)协同作用，以造成内皮功能障碍。为了检验该假说，我们将发展先兆子痫的妇女和患有其它妊娠并发症(如妊娠高血压(GH)和并发小于胎龄(SGA)婴儿的妊娠)的那些妇女在整个妊娠过程中的可溶内皮糖蛋白、sFlt1和游离PlGF的血清浓度，与具有血压正常的对照妊娠的妇女的所述浓度进行了对比。在NIH的RichardLevine博士的协助下完成了该研究。
该研究有两个基本目的。第一个目的是，确定与血压正常的对照相比，在发作先兆子痫和其它妊娠病症(如妊娠高血压或并发小于胎龄(SGA)婴儿的妊娠)之前，是否可以检测到提高的可溶内皮糖蛋白、sFlt1的血清浓度，和降低的PlGF水平。第二个目的是，在患有先兆子痫、妊娠高血压或SGA的妇女中，其中分别检查在发作临床症状之前和之后得到的样品，和在血压正常对照中，描述可溶内皮糖蛋白、sFlt-1和游离PlGF的产妇血清浓度相对于胎龄的时间进程。
方法
临床信息
该研究是4,589位参与钙预防先兆子痫试验(Calcium forPre-eclampsia Prevention trial)(CPEP)的健康未经产妇女群体(cohort)中嵌套(nested)的妊娠并发症(过早的先兆子痫、足月先兆子痫、妊娠高血压、具有SGA婴儿的妊娠、血压正常的对照妊娠)的病例对照研究。从每个研究组中，选择120个随机病例。研究方法与最近进行的先兆子痫的嵌套病例对照研究相同(Levine等，N.Eng.J.Med.2004，350：672-83)。从每个妇女得到研究登记之前(13-21周)、在26-29周、在36周和在怀疑高血压或蛋白尿时的血液样品。在生产和分娩开始之前的妊娠过程中的任何时间收集的所有血清样品都适合用于研究。病例包括120位妇女，其发展足月先兆子痫、妊娠高血压或SGA，且其分娩活产或死产男婴(无已知的结构或染色体异常)，且从她们得到基线血清样品。对于过早的先兆子痫，研究了来自CPEP群体的定义为(PE＜37周)的所有72位患者。在上面的Levine等(2004)中，描述了诊断先兆子痫的临床标准。在从发作妊娠高血压前1天至随后7天的时间间隔中，要求所有妊娠高血压病例都具有正常的尿蛋白测量。使用Zhang & Bowes的胎龄出生重量表，它是种族、未经产和婴儿性别特异性的，将SGA定义为＜第10和＜第5(严重SGA)百分位。从分娩活产或死产婴儿(无已知的主要的结构畸形或染色体异常)的没有先兆子痫或妊娠高血压或SGA的妇女，随机地选择对照，并一个对照对应一个病例地匹配临床中心、在收集第一个血清样品时的胎龄(±1周)、冷冻贮藏时间(±1年)和冻融次数。共研究了1674个血清样品。进行胎龄的匹配，以控制sFlt-1、VEGF和PlGF水平的胎龄-相关的差异。进行冷冻贮藏时间的匹配，以使由冷冻贮藏过程中可能的降解引起的差异最小化。进行临床中心的匹配，以控制先兆子痫比值在不同中心之间显著不同的事实，这可能是由于疾病的病理生理学的差异。此外，中心可能使用略有不同的收集、制备和保存样品的方法。还进行融化次数的匹配，以确保病例和对照已经同等地进行冻融降解。
ELISA测量
由不知道临床结果的单个研究助理，在Karumanchi实验室中进行各种血管发生标记的ELISA。
从R&D systems(Minneapolis，MN)得到可溶内皮糖蛋白(DNDG00)、sFlt1(DVR100)、PlGF(DPG00)的商业上可得到的ELISA试剂盒。
统计学分析
使用T-检验来对比对数变换后的各种测量值，以确定显著性。认为P＜0.05是统计学上显著的。
结果
在图6-8中，显示了在如该方法中所述的各个胎龄组窗口期间，5个不同研究组的妊娠妇女在整个妊娠中的平均可溶内皮糖蛋白(图6)、sFlt1(图7)和PlGF(图8)浓度。对于先兆子痫组和妊娠高血压组，在这里未显示在发作临床症状后采取的样品。与胎龄-匹配的对照样品相比，从过早的先兆子痫前9-11周开始，可溶内皮糖蛋白和sFlt1提高，且游离PlGF降低，在先兆子痫发作后，分别达到高5倍(46.4vs 9.8ng/ml，P＜.0001)、3倍(6356vs 2316pg/ml，P＜.0001)和低4倍(144vs 546pg/ml，P＜.0001)的水平。对于足月先兆子痫，可溶内皮糖蛋白从12-14周开始提高，游离PlGF从9-11周开始降低，且sFlt1在先兆子痫发作前＜5周提高。在妊娠10-42周，sFlt1和游离PlGF的血清浓度在具有SGA或平均胎龄儿/大于胎龄儿(AGA/LGA)婴儿的妊娠之间没有显著差异。从17-20周开始，SGA妊娠的血清可溶内皮糖蛋白适度增加(7.2vs 5.8ng/ml，P＝.03)，与AGA/LGA妊娠中的12.9ng/ml相比，在轻度和严重SGA的37-42周，分别达到15.7和43.7ng/ml的浓度(严重SGA vs AGA/LGA，P＝.002)。在妊娠高血压研究中，与GA-匹配的对照样品相比，在妊娠高血压前＜1-5周，可溶内皮糖蛋白的适度增加是显而易见的，在发作妊娠高血压后，对于可溶内皮糖蛋白，达到高2倍的水平(29.7vs 12.5ng/ml，P＝.002)。在21-32周得到的样品的调整的随后早产PE的优势比(odds ratio)，与所有其它四分位相比，是对照可溶内皮糖蛋白浓度的最高四分位(＞7.2ng/ml)，为9.8(95％CI 4.5-21.5)。
将先兆子痫的可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数定义为(sFlt1+0.25可溶内皮糖蛋白)/PlGF。在贯穿5个不同研究组的各个胎龄组中，计算该指数。在图9中显示了在临床症状之前采取的样品的先兆子痫抗血管发生的可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数。早在妊娠17-20周时，观察到提高的可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数值，并似乎随着妊娠向严重过早的先兆子痫的发展，变得更急剧。在足月先兆子痫、SGA和GH中，当与对照妇女相比较时，在妊娠末期(33-36周)存在适度提高。
图10和11描述了根据临床过早的先兆子痫(PE＜37周)之前的周数，可溶内皮糖蛋白的平均浓度(图10)和可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数(图11)。甚至早在发作过早的先兆子痫之前的9-11周，必然发展先兆子痫的妇女的可溶内皮糖蛋白和可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数提高2-3倍，其中在临床症状之前的1-5周急剧提高(＞5倍)。
图12和13显示了在症状之前和之后，在贯穿足月先兆子痫(PE＞37周)的妊娠中，可溶内皮糖蛋白(图12)和可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数(图13)的变化。从妊娠33-36周开始，观察到可溶内皮糖蛋白和可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数的提高，在临床先兆子痫时达到平均高2倍的水平。
图14和15显示了当与血压正常的对照相比较时，在妊娠高血压期间、在妊娠高血压之前1-5周(在妊娠的33-36周期间)的妇女中测得的可溶内皮糖蛋白(图14)和可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数(图15)的适度提高。
图16和17显示了当与对照妊娠相比较时，在33-36周妊娠窗口期间，在患有严重SGA的妇女且不是所有患有SGA的妇女中测得的可溶内皮糖蛋白(图16)和可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数(图17)的适度提高。
总结
该研究的结果表明，当与正常对照妊娠相比较时，在妊娠33周之前测量时，在必然发展过早的先兆子痫的妇女和患有临床过早的先兆子痫(PE＜37周)的妇女中的可溶内皮糖蛋白水平和可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数水平急剧提高。因此可溶内皮糖蛋白水平和可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数水平(在33周之前)不仅可以用于诊断过早的先兆子痫，而且可以用于预测先兆子痫。似乎早在先兆子痫症状之前10-12周，可溶内皮糖蛋白水平和可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数水平就开始提高。
当在妊娠晚期(33-36周妊娠窗)测量时，可溶内皮糖蛋白水平和可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数水平在足月先兆子痫(PE＞37周)中也显著提高，并在妊娠高血压和严重SGA中适度提高。因此，当在妊娠33周之后测量时，可溶内皮糖蛋白水平和可溶内皮糖蛋白抗血管发生指数水平也可以用于鉴别其它妊娠并发症，如SGA和妊娠高血压。
实施例7.可溶内皮糖蛋白参与先兆子痫的发病机理
我们已经表明，在先兆子痫胎盘中，上调可溶内皮糖蛋白，即一种促血管发生蛋白TGF-β的细胞表面受体，并在内皮和合胞滋养层上表达。我们还已经表明，在先兆子痫中，过量的可溶内皮糖蛋白通过胞外域的脱落，从胎盘释放进循环中。下面所述的实验用于检验下述假说，即可溶内皮糖蛋白可以与sFlt1(一种结合胎盘生长因子(PlGF)和VEGF的抗血管发生因子)协同作用，以造成内皮功能障碍。
材料和方法
试剂
从R&D systems(Minneapolis，MN)得到重组人内皮糖蛋白、人sFlt1、小鼠内皮糖蛋白、小鼠sFlt1、人TGF-β1、人TGF-β3、小鼠VEGF。从Santa Cruz Biotechnology，Inc.得到针对人内皮糖蛋白N-末端区的小鼠单克隆抗体(目录号sc 20072)和多克隆抗体(sc 20632)。从R&D systems，MN得到人sFlt1、小鼠sFlt1和人可溶内皮糖蛋白的ELISA试剂盒。
腺病毒的产生
以前已经描述了针对sFlt1的腺病毒和对照腺病毒(CMV)(Maynard等，J.Clin.Invest.111：649：658(2003))，并在RichardMulligan博士的协助下，在Harvard Medical Core facility产生。为了产生可溶内皮糖蛋白腺病毒，我们使用了Adeasy试剂盒(Stratagene)。简而言之，使用人cDNA全长内皮糖蛋白克隆(Invitrogen，CA)作为模板，并使用下面的寡核苷酸作为引物，PCR扩增了人可溶内皮糖蛋白(编码内皮糖蛋白的整个胞外区)：正向5′-ACG AAG CTT GAAACA GTC CAT TGT GAC CTT-3′(SEQ ID NO：3)，和反向5′TTAGAT ATC TGG CCT TTG CTT GTG CAA CC-3′(SEQ ID NO：4)。将扩增的PCR片段首先亚克隆进pSecTag2-B(Invitrogen，CA)，并确认DNA序列。使用pSecTag2 B-可溶内皮糖蛋白作为模板，PCR扩增编码His-标记的人可溶内皮糖蛋白的哺乳动物表达构建体，并亚克隆进pShuttle-CMV载体(Stratagene；Kpn1和Sca1位点)，即一种腺病毒转移载体，以用于进行腺病毒产生。然后，使用根据生产商说明书的标准操作规程，产生表达可溶内皮糖蛋白(sE)的腺病毒，并通过蛋白印迹确认表达。然后，如以前所述的(Kuo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：4605-4610(2001))，在293细胞上扩增证实的克隆，并在CsCl2密度梯度上进行纯化。通过光学吸光度方法(Sweeney等，Virology，2002，295：284-288)，滴定最终产物。以从以前使用基于标准噬斑稀释的滴定测定试剂盒(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA，Cat.No.Kl 653-1)和光学吸光度方法滴定的病毒制备物(prep)衍生的公式为基础，将滴度表达为噬斑形成单位(pfu)/mL。
蛋白印迹
如别处所述(Maynard等，同上)，使用蛋白印迹来检查大鼠血浆中腺病毒感染的转基因的表达。
免疫沉淀(IP)实验
将随后为蛋白印迹的IP用于鉴别和表征先兆子痫患者的胎盘组织和血清样品中的可溶内皮糖蛋白。用冷PBS洗涤人胎盘组织，并在匀浆缓冲液[10mM Tris-HCl，pH7.4；15mM NaCl；60mM KCl；1mMEDTA；0.1mM EGTA；0.5％NonidetP-40；5％蔗糖；购自Roche(Indianapolis，IN)的蛋白酶混合物]中裂解10分钟。然后，用抗人单克隆小鼠内皮糖蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，对胎盘裂解物进行免疫沉淀。根据生产商的说明书，使用免疫纯的IgG定向试剂盒(Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，美国)，通过定向偶联3-5mg纯化的抗体到2ml A蛋白-琼脂糖上，制备免疫亲和柱。然后，用含有蛋白酶混合物的RIPA缓冲液充分洗涤柱，并用0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液pH2.8洗脱结合的蛋白。将洗脱液收集在含有1mol/L Tris-HCl缓冲液的0.5-ml级分中。合并含有蛋白的级分，并用CENTRICON离心浓缩器(Millipore Corp.，Bedford，Massachusetts，美国)浓缩9至10倍。在4-12％梯度凝胶(Invitrogen)上分离免疫沉淀的样品，并将蛋白转移到聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜上。使用抗人内皮糖蛋白的兔多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，SantaCruz，CA)，通过蛋白印迹检测内皮糖蛋白。
内皮管测定
将生长因子减少的matrigel(7mg/mL，Collaborative BiomedicalProducts，Bedford，MA)放在预冷的48孔细胞培养平板的孔(100l/孔)中，并在37℃温育30分钟，以允许聚合。用重组蛋白的各种组合(可溶内皮糖蛋白、sFlt1或二者)处理HUVEC细胞(30,000+在300μl没有血清的内皮基础培养基中，Clonetics，Walkersville，MD)，铺平板到Matrigel包被的孔上，并在37℃温育12-16小时。然后通过4X倒置相差显微镜(Nikon Corporation，东京，日本)评价管形成，并使用简单PCI成像分析软件进行定量分析(管面积和总长度)。
微血管通透性实验
经眶后静脉丛，给Balb-C小鼠注射1×108pfu表达GFP或可溶内皮糖蛋白或sFlt1或其组合的腺病毒，并在48小时后进行微血管通透性测定。通过腹膜内(IP)注射0.5ml阿佛丁，麻醉小鼠。将100ml 1％伊文思蓝染料(溶于PBS中)注射进尾静脉。40分钟后，通过心脏穿刺，给小鼠灌注含有2mM EDTA的PBS 20分钟。收获器官(脑、肺、肝、肾)，并在甲酰胺中温育3天，以洗脱伊文思蓝染料。使用620nm波长，测量甲酰胺溶液的OD。
肾微血管反应性实验
使用大鼠肾微血管(70-170μm内径)，如以前所述(Maynard等，同上)，进行微血管反应性实验。在所有实验组中，在用U46619(血栓烷激动剂)预收缩微血管至在40mmHg扩张压下的基线直径的40-60％后，检查肾微血管的松弛反应。一旦达到稳定状态张力，就以标准化的次序，检查对各种试剂(如TGF-β1或TGF-β3或VEGF)的反应。所有药物都是腔外施用的。
动物模型
通过尾静脉注射，给妊娠的和非妊娠的Sprague-Dawley大鼠注射2×109pfu腺病毒(Ad CMV或Ad sFlt1或Ad sE或Ad sFlt1+Ad sE)。在妊娠的第8-9天(次三个月早期)注射妊娠的大鼠，并在妊娠的第16-17天(第三个三个月早期)测量血压。用戊巴比妥钠(60mg/kg，腹膜内地(i.p.))麻醉之后，测量大鼠的血压。分离颈动脉，并插入与压力转换器(Millar Instruments，Houston，TX)相连的3-Fr高保真度微尖(microtip)导管。记录血压，并求10分钟时间段内的平均值。在安死术之前得到血液、组织和尿样品。在测量血压的当天(注射腺病毒后第8天)，测量血浆水平，从而认识到腺病毒注射后7-10天与这些蛋白的表达的峰水平相对应。通过蛋白印迹，初步证实了循环sFlt-1和可溶内皮糖蛋白水平，然后使用商业上可得到的鼠ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)进行定量。通过两个标准浸渍片，测量两种尿白蛋白，并使用商业上可得到的大鼠白蛋白ELISA试剂盒(Nephrat试剂盒，Exocell Inc，Philadelphia，PA)，通过竞争性酶联免疫测定进行定量。使用苦味酸比色方法试剂盒(Metra肌酸酐测定试剂盒，Quidel Corp，San Diego，CA)，测量尿肌酸酐。使用商业上可得到的试剂盒(Thermo Electron，Louisville，CO)，测量AST和LDH。使用自动血细胞计数器(Hemavet 850，Drew Scientific Inc，Oxford，CT)，测量来自大鼠血液的血小板计数。对血液外周涂片进行瑞特染色，以检测循环血液中的裂红细胞。测量血压和收集样品后，处死大鼠，并收获器官用于组织学。计数产仔数，并称量单个胎盘和胎儿的重量。将收获的肾置于布安氏液中，用石蜡包埋，切片，并用H&E、PAS或Masson氏三色染料染色。
统计学对比
将结果表达为平均值±平均值的标准误(SEM)，并通过使用ANOVA分析方差，进行多个组之间的对比。当p＜0.05时，报告显著差异。
结果
可溶内皮糖蛋白是抗血管发生分子，并诱导血管功能障碍
我们使用血管发生的体外模型来理解可溶内皮糖蛋白的功能。可溶内皮糖蛋白适当地抑制内皮管形成，sFlt1的存在会进一步对其进行强化(图22和图31)。在先兆子痫中，已经报道除了内皮功能障碍外，还存在增强的微血管通透性，如由水肿和增强的依文斯蓝结合的白蛋白胞外渗漏所证实的。为了观察可溶内皮糖蛋白是否诱导微血管渗漏，我们使用用可溶内皮糖蛋白和sFlt腺病毒处理了48小时的小鼠。可溶内皮糖蛋白和sFlt1的组合，诱发肺、肝和肾中白蛋白渗漏的急剧增加，和脑中的适度渗漏，如使用伊文思蓝测定所证实的(图23)。单独的可溶内皮糖蛋白诱发肝中的适度渗漏。重要的是，可溶内皮糖蛋白和sFlt-1的组合显示在肝中的叠加作用，表明这些可溶受体可以协同作用，用于破坏内皮完整性，并且诱导显著的血管损伤和渗漏。这些数据表明，可溶内皮糖蛋白和sFlt1组合是有效的抗血管发生分子，且可以诱发显著的血管渗漏。
为了评价可溶内皮糖蛋白的血流动力学作用，在大鼠肾微血管中进行了一系列微血管反应性实验。我们首先研究了TGF-β1和TGF-β3(内皮糖蛋白的两种已知的配体)的作用。TGF-β1和TGF-β3都诱发血管直径的剂量依赖性的增加。TGF-β1和β3都诱导动脉直径的剂量依赖性增加，而不作为内皮糖蛋白配体的TGF-β2未能产生任何显著的血管舒张(在0.1和1μg/ml＜2％)。重要的是，在过量可溶内皮糖蛋白存在下，两种TGF-β的作用都显著减弱(图24)。在肠系膜血管中也观察到了TGF-β1和TGF-β3同工型对血管张力的这种急性影响(图32)。最后，VEGF和TGF-β1的组合诱发血管舒张，后者受到过量可溶内皮糖蛋白和sFlt1的阻断(图25)。这表明，sFlt1和可溶内皮糖蛋白可以对抗血管发生生长因子(如VEGF和TGF-β1)诱发的生理性血管舒张，并诱发高血压。
可溶内皮糖蛋白和sFlt1的体内作用
为了评价可溶内皮糖蛋白和sFlt1对血管的作用，我们借助于妊娠大鼠中的腺病毒表达系统。在妊娠的第8天，通过尾静脉将编码对照基因(CMV)或可溶内皮糖蛋白或sFlt1或sFlt1+可溶内皮糖蛋白的腺病毒注射进Sprague-Dawley大鼠。在第17天，检查动物的先兆子痫表型。表8包括血流动力学和生物化学数据。
表8.腺病毒处理的大鼠动物模型的血流动力学和生物化学数据
  组   N   MAP(mm Hg)   尿Alb/肌酸酐μg/mg   血小板计数x1000/μl   LDHU/L   ASTU/L   胎儿重量(g)
  对照(CMV)   6   83±5   186±94   1,098±75   156±32   54±4   2.1±0.5
  sFlt1   6   117±7*   2,295±867*   1,131±91   172±53   94±4*   1.75±0.4
  SEng   6   104±6*   432±249   1,195±78   188±46   110±13*   1.6±0.4
  sFlt1+sEng   6   121±9*   9,029±4043*   615±67*   1,952±784*   210±92*   0.75±0.3*
数据表示为平均值±s.e.m。MAP-平均动脉压(舒张压+1/3脉压)；胎儿重量是以克表示的每组的同窝动物的平均重量；尿Alb/肌酸-白蛋白/肌酸酐比值；LDH-乳酸脱氢酶；AST-天冬氨酸转氨酶*与对照组相比P＜0.05。
首先通过蛋白印迹证实了大鼠血浆中sFlt1和sEng的表达(图36)，并且用商购ELISA试剂盒对循环浓度进行定量。
对照、sEng、sFlt1和sFlt1+sEng组中的sFlt1的平均血浆浓度分别是0.64ng/ml，0.66ng/ml，249ng/ml和204ng/ml。这四个组中的sEng浓度分别是0.39ng/ml，129ng/ml，0.37ng/ml和123ng/ml。
单独的可溶内皮糖蛋白诱发轻度高血压。sFlt1诱发高血压和蛋白尿两者，如以前所报道的。在sFlt1+sEng组出生的同窝动物中观察到了胎儿生长受限，可能与胎盘血管缺血和损伤有关。重要的是，sFlt1和可溶内皮糖蛋白的组合诱发严重的高血压、肾病范围的蛋白尿、胎儿的生长限制和发展HELLP综合征的生物化学迹象(提高的LDH、提高的AST和减少血小板计数)(表8)。通过揭示裂红细胞和网织细胞增多的外周涂片，证实了可溶内皮糖蛋白+sFlt1组中的溶血迹象(图26A-B)。最后，肾组织学也证实了可溶内皮糖蛋白组的局灶内皮增生和可溶内皮糖蛋白+sFlt1组的严重的肾小球内皮增生(图27A-D和33)。注意在图33中，对照组在正常限度内。注意具有有孔内皮的开放毛细血管环。可溶内皮糖蛋白组显示内皮肿胀，伴随孔的丧失和部分腔阻塞。注意红细胞经受损的腔挤压。尽管可溶内皮糖蛋白处理的大鼠的肾的光学显微术没有显示显著内皮增生，但电子显微术显示局灶内皮增生。重要的是，接受可溶内皮糖蛋白和sFlt-1这两者的动物具有严重的肾小球内皮增生。联合治疗组(下图)显示大量具有肿胀的内皮细胞的毛细血管内阻塞。注意尽管有严重的蛋白尿，但相对保留了足细胞足突(以箭头显示)。在Flt1+sEng组中观察到了母体-胎儿连接处的胎盘的广泛血管损伤，包括梗塞，但在对照大鼠中或用任一单独试剂处理的大鼠中没有观察到(图34A-H)。在Flt1和sEng组中注意到了巨细胞层(相应于人侵入性滋养层)的弥漫性炎症，并且比联合治疗组高。肝组织学显示了sFlt1+sEng组中的局部缺血的体征和坏死区，类似于具有HELLP综合征的患者中见到的那些(图34A-H)。当将sFlt1+sEng注射到非妊娠大鼠中时也见到了严重母体血管损伤的体征，表明在妊娠大鼠中观察到的表型是由于对母体血管的直接影响，并且不需要胎盘。
总结
这些结果证实，可溶内皮糖蛋白在先兆子痫胎盘中受到上调，且在先兆子痫患者中以非常高的水平存在。最高水平的可溶内皮糖蛋白存在于患有HELLP综合征的患者中，该HELLP综合征是先兆子痫的最严重形式之一。这些结果还证实，可溶内皮糖蛋白水平与妊娠患者中提高的sFlt1相关联，且在存在更高的循环sFlt1水平的那些患者中更高。此外，这些结果证实，可溶内皮糖蛋白是抗血管发生分子，并在许多内皮测定(如血管发生测定、微血管通透性测定和微血管反应性实验)中破坏内皮功能。重要的是，可溶内皮糖蛋白可以放大sFlt1在这些体外内皮测定中的毒性结果。而且，在体内测定中，可溶内皮糖蛋白的腺病毒表达诱发轻度高血压，而没有任何显著的蛋白尿。但是，在有sFlt1存在下，可溶内皮糖蛋白诱发显著的血管损伤，如由严重高血压、蛋白尿、肾小球内皮增生、HELLP综合征的发展和胎儿生长限制的存在所证实的。
可溶内皮糖蛋白释放的机理可能是内皮糖蛋白分子的胞外区的蛋白酶切割。在先兆子痫组织中受到上调的特定蛋白酶可以作为候选分子。一个实例是膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)，已经表明它切割β聚糖，即与内皮糖蛋白共有相似性的一种分子(Velasco-Loyden等，J.Biol.Chem.279：7721-33(2004))。因此，这些蛋白酶的抑制剂可以作为治疗先兆子痫的有价值的靶。
实施例8.可溶内皮糖蛋白抑制TGF-β1和TGF-β3介导的NOS依赖性血管舒张
eNOS是一种Ca2+/钙调蛋白调节的一氧化氮(NO)合酶，其可以由流体剪切应力和神经体液刺激激活。内皮来源的NOS是一种非常有效的血管松弛剂，导致系统血压调节、血管通透性和血管发生。实际上，VEGF对血管发生和血管张力的作用部分由eNOS的激活介导，这是通过增加的eNOS/Hsp90缔合和Ser1177上的Akt依赖性eNOS磷酸化。我们最近证明了先兆子痫患者血清中胎盘来源的sFlt1的增加是抗血管发生的，并且诱导高血压，这可能实际上反映了VEGF依赖性eNOS激活的受损(Maynard等，同上)。最近，已经显示eNOS Thr495的去磷酸化在Ser1177磷酸化之前，并且这些协调的事件决定了内皮细胞中的eNOS活性(Fleming等，Cir.Res.88：E68-75(2001))。考虑到VEGF对降低经eNOS激活的血管反应性的作用和最近证明了内皮糖蛋白调节eNOS依赖性血管舒缩活性(Toporsian等，Circ.Res.96：684-692(2005))，我们评估了TGF-β同工型的血液动力学作用和可溶内皮糖蛋白在分离的大鼠肾微血管中的作用。如实施例7和图24和25中的描述，TGF-β1和-β3都诱导动脉直径的剂量依赖性增加，这由可溶内皮糖蛋白显著减弱。以前没有认识到TGF-β1和-β3同工型对血管张力的急性作用，并且在肠系膜血管中也观察到了这种作用(图32)。在先兆子痫患者中，VEGF和TGF-β1对血管舒张具有叠加作用，这被指出浓度的sEng+sFlt1阻断(图25和35A)。L-NAME阻断TGF-β1和VEGF介导的血管舒张，表明NOS依赖性反应(图35A)。这些数据表明循环sFlt1和sEng可以对抗由这些血管发生生长因子诱导的生理性NO依赖性血管舒张，导致见于先兆子痫中的高血压的发展。
实施例9.可溶内皮糖蛋白抑制内皮细胞中的TGF-β1结合和信号传递
考虑到内皮糖蛋白是TGF-β1和-β3同工型的共同受体，我们假定可溶内皮糖蛋白通过干扰细胞表面受体结合而起作用。用重组可溶内皮糖蛋白预先温育放射性标记的TGF-β1，在50和100pM都显著减少了其与II型TGF-β受体(TβRII)的结合(图35B)。因此，可溶内皮糖蛋白与TGF-β1竞争结合内皮细胞上的其受体。为了测试这是否导致信号传递受损，在人内皮细胞中评估了CAGA-Luc报道构建体的活性。TGF-β1诱导Smad 2/3依赖性CAGA-Luc报道物的激活，并且，用可溶内皮糖蛋白处理消除了该反应(图35C)。
实施例10.可溶内皮糖蛋白阻断TGF-β1介导的eNOS激活
考虑到我们的发现，即TGF-β1诱导肾和肠系膜抗性血管中的NOS依赖性血管舒张，我们研究了它对eNOS激活的直接作用。尽管TGF-β1对eNOS Ser1177磷酸化没有作用，它诱导Thr495上的显著去磷酸化(图35D)，表明TGF-β调节eNOS激活中的关键残基的磷酸化状态。这种作用由可溶内皮糖蛋白显著减弱(图35D)。
综上所述，实施例8-10的结果证明了可溶内皮糖蛋白干扰内皮细胞中的TGF-β受体结合和下游信号传递，并且减弱eNOS激活。可溶内皮糖蛋白和sFlt-1可以协同作用，从而抑制VEGF和TGF-β信号传递途径导致的内皮细胞依赖性NO激活和血管舒缩作用。
实施例11.血管发生因子的顺序改变可以鉴定有先兆子痫或子痫风险的女性
在上文描述的实施例中，我们显示了sFlt1和可溶内皮糖蛋白(sEng)都与先兆子痫的致病密切相关。在下文描述的实施例中，我们测量了在妊娠期间前瞻性随访的女性的妊娠前三个月和次三个月采集的配对血清标本中sFlt1和sEng的浓度，详细鉴定了其妊娠结局，以确定妊娠前三个月和次三个月之间这些标记物的顺序改变是否与先兆子痫的发展相关。
材料和方法
研究群体
我们进行了在马萨诸塞普通医院产科孕妇研究(MOMS)中注册的女性的前瞻性、嵌套的病例-对照研究，这些方法以前已经有描述(Thadhani等，Obstet.Gynecol.97：515-20(2001)和Wolf等，Obstet.Gynecol.98：757-62(2001))。简言之，在1998年建立MOMS队列，用于妊娠早期危险因子的前瞻性研究，所述危险因子是针对妊娠晚期的不良结局。接受马萨诸塞普通医院和附属健康中心的产前护理的女性符合选入队列的条件。对于本研究，在妊娠的第12周或之前入选MOMS队列，并且在20周后分娩的、在2001年6月1日-2003年5月1日之间具有单一妊娠的连续女性符合入选标准。病例(n＝39)定义为在妊娠的前三个月和次三个月采血，随后发展先兆子痫的女性，对照(n＝147)是入选相同队列、足月分娩(＞37周)并且在妊娠过程中保持正常血压、正常血糖并且没有出现蛋白尿迹象的连续同时期女性。病例和对照是年龄(±岁)和体重指数(±1kg/m2)匹配的，考虑被这些暴露因素混淆的可能性(Thadhani等，Obstet.Gynecol.94：543-50(1999))。所有受试者提供了书面知情同意书，并且该研究得到马萨诸塞普通医院研究评审委员会的批准。
主要暴露
在所有女性中，第一次产前随访时(11-13周)采集血样，在妊娠的次三个月时(17-20周)再次采集血样。采集后，将样品保存在-80C下用于以后的分析。主要暴露是用商购ELISA试剂盒(R&Dsystems，Minneapolis，MN)测量的血清sFlt1和sEng(Maynard等，同上，和Venkatesha等，Nat Med.12：642-9(2006))。sFlt1和sEng的测定内精确变异系数分别是3.5和3.2％。sFlt1和内皮糖蛋白的测定间精确变异系数分别是8.1和9.5％。以双份测定所有样品，并且如果双份之间存在超过10％的变异，则重复测定，并且报告平均值。由对病例状况不了解的人进行所有测定。对样品随机排序，用于分析。
协变量和混淆因素
电子医学记录(EMR)，即在马萨诸塞普通医院使用的医学记录，提供了前瞻性详细描述妊娠到产后早期阶段的事件的临床和人口统计数据。在基线(第一次产前随访)和所有后续产前随访采集的获自EMR的特定信息包括年龄、种族、身高、体重、吸烟状况、从未次月经估计并且通过超声波证实的胎龄、血压以及尿分析和胎儿胎龄估计结果。所有妊娠结果信息也进入EMR中，包括葡萄糖耐受测试的结果和其它常规测量的实验室值，以及分娩特征，如出生体重、分娩途径和先兆子痫的诊断。
主要结果
通过详细检查医学记录而证实所有妊娠结果，包括产前流程表和实验室测量值。在每次产前随访时，用标准血压计从右臂获得血压，其中女性在静息3-5分钟后以坐位测量。对于每个患者，基于右中臂围，选择合适的袖带大小。记录与第一次(收缩)和第5次(舒张)Korotkoff音的时间符合的血压测量值。该研究的所有受试者都没有以前存在的高血压或糖尿病的病史，在MOMS网络内开始和完成她们的产前护理和妊娠，产下活婴儿，并且在分娩后6周没有高血压的迹象。
先兆子痫定义为妊娠20周后收缩压升高到至少140mm Hg或舒张压升高到至少90mm Hg，伴有蛋白尿，即通过浸渍片测量2+或更高，或不存在尿路感染的情况下至少300mg/24h(ACOG Committee onPractice Bulletins--Obstetrics.ACOG practice bulletin.diagnosis andmanagement of preeclampsia and eclampsia.33号，2002年1月.ObstetGynecol.99：159-67)。先兆子痫分析为足月先兆子痫(≥37周)和早产先兆子痫(＜37周)。
统计学分析
适当用卡方检验或斯氏t检验比较人口统计和临床特征。考虑到它们的倾斜分布，需要对主要暴露进行对数转换(Levine等，(2004)，同上，Levine等N.Engl.J.Med.355：992-1005(2006))。主要暴露作为连续变量检验，并且具有基于对照的天然分布的切割点和三级(tertile)分析，并且为临床解释而进行简化。用对数回归技术进行多次回归分析。所有P值都是双尾的，并且P值＜0.05被认为是统计学显著的。
CPEP研究中血管发生标记物的二级分析
在来自上文描述的CPEP队列内的最近公开的嵌套病例对照研究的早期妊娠期间，我们也进行了血管发生因子改变的二级分析。我们以三个不同的时间间隔，即10-12周、13-16周和17-20周，分析了来自正常血压的女性、在37周前发展先兆子痫的女性和在37周后发展先兆子痫的女性的样品。
结果
人口统计和临床特征
MOMS研究群体的基线和分娩特征展示于表9。两组之间的年龄和体重指数没有显著差异。随后发展先兆子痫的女性在第一次产前随访时具有更高的收缩压和舒张压。在表现先兆子痫时，如预期的，收缩压和舒张压在先兆子痫组中更高。
表9.人口统计
  变量 正常(n＝147)  先兆子痫(n＝39)  P值
  年龄(岁) 31.4±5.4  32.8±5.4  0.06
  BMI(kg/m2) 28.5±6.3  29.8±9.1  0.40
  吸烟(％从不吸烟) 47％  60％  0.21
  经产数 0.7±0.9  0.8±1.0  0.47
  基线特征
  DBP(mmHg) 70±7  75±8  ＜0.01
  SBP(mmHg) 113±7  120±13  ＜0.01
  UTP(mg/dl) NA  614±547
  分娩时的胎龄 39.3±1.9  37.2±2.3  ＜0.001
  出生体重 3444±532  3300±809  0.35
  表现时的特征
  最大DBP(mmHg) 78±5  93±7  ＜0.01
  最大SBP(mmHg) 122±7  147±10  ＜0.01
  最大SPOT(g/g) 0.6±0.3  1.4±0.9  ＜0.01
BMI＝体重指数；DBP＝舒张压；SBP＝收缩压
UTP＝以mg/L表示的尿总蛋白；SPOT＝尿蛋白/肌酸酐比值值是平均值±S.D.
正常和先兆子痫妊娠中sFlt1和sEng在妊娠的前三个月和次三个月中的水平
在妊娠的前三个月，与具有正常妊娠的女性相比，患有先兆子痫的女性中sFlt1的平均血清水平更高，分别是3.49±0.35ng/ml与3.03±0.13ng/ml(P＝NS)。在妊娠的次三个月中，与正常组的3.10±0.15ng/ml相比，先兆子痫组中的sFlt1的平均血清水平显著更高，平均值是4.12±0.5ng/ml(P＜0.01)(表10)。
与正常女性相比，在患有先兆子痫的女性中，认为在妊娠的前三个月没有显著差异的平均血清sEng水平在次三个月中显著改变，分别是在前三个月中是6.9±0.32ng/ml与6.57±0.17ng/ml(P＝NS)，和在次三个月中是6.37±0.38ng/ml与5.23±0.12ng/ml(P＝0.004)(表10)。
表10.sFlt和sEng的血清水平
Figure A20078002685800921
图37图示了在正常、所有先兆子痫女性和具有少于37周的先兆子痫的女性中的δ或d(妊娠的前三个月和次三个月的sFlt1和sEng值之间的差异)。在正常妊娠中，妊娠的前三个月和次三个月之间sFlt1的改变非常小(dsFlt1＝0.05±0.15ng/ml)。dsFlt1在发展先兆子痫的女性中比正常女性中相对更高，分别是0.713±0.47ng/ml与0.0497±0.15ng/ml(P＝0.08)。类似地，在具有少于37周的先兆子痫的女性中，dsFlt1更高，是0.634±0.91ng/ml。
在正常妊娠中，妊娠的前三个月和次三个月之间sEng水平有下降(-1.322±0.18ng/ml)。该下降在患有先兆子痫的患者中减少，dsEng是-0.441±0.42ng/ml(P＝0.04)。在具有少于37周的先兆子痫的女性中，可溶内皮糖蛋白水平的下降减少，并且似乎是相反方向的趋势(0.732±0.77ng/ml，与对照相比P＜0.01)。
预测性算法
为了观察这些改变是否可以用作重度早发先兆子痫的预测性测试，我们观察了正常血压女性和发展先兆子痫，特别是早产先兆子痫的女性的乘积(sFlt1xsEng的值)，作为乘积-1(在妊娠的前三个月)和乘积-2(在妊娠的次三个月)。乘积-1和乘积-2在先兆子痫患者中都显著升高，并且重要的是与正常对照中的负值不同，δ乘积(d乘积)是显著正的(图38)。此外，与正常对照相比，患有早产先兆子痫的患者中d乘积显著增大(P＝0.004)。
为了评估血管发生因子的水平改变与早产先兆子痫风险之间的关系，我们在针对种族/种族划分、体重指数和采集标本时的胎龄进行校正后，在d乘积浓度分布的最高类别针对较低的两个类别计算了早产先兆子痫的校正的让步比(aOR)和95％置信区间(95％CI)(图39)。与δ乘积小于-1的女性相比，在δ乘积水平高于+1[aOR 5.5，95％CI 1.4-22.4]的组中观察到了早产风险的显著增加。
CPEP嵌套病例对照研究的二级分析
在CPEP试验的女性亚组中，在保持正常血压的女性队列中，在10-12周和13-16周之间sFlt1的平均值从3.68ng/ml增加到4.92ng/ml，并且在17-20周减少到4.29ng/ml，而在具有早产先兆子痫的女性中，在妊娠的10-12、13-16和17-20周，sFlt1的平均值从3.44ng/ml增加到4.22ng/ml，并且进一步增加到5.39ng/ml。在具有足月先兆子痫的女性中该模式不明显(表11)。
表11.CPEP试验中的sFlt和sEng血清水平
Figure A20078002685800931
在sEng的水平方面观察到了相似结果。在正常血压的女性中，在10-12周和13-16周sEng的水平从6.8ng/ml增加到7.07ng/ml，并且随后在17-20周减少到5.78ng/ml，而在具有早产先兆子痫的女性中，在10-12、13-16和17-20周，内皮糖蛋白的水平从7.15ng/ml增加到7.95ng/ml，并且进一步增加到10.19ng/ml。在具有足月先兆子痫的女性中注意到了相同趋势，其中在10-12、13-16和17-20周，sEng的平均水平从7.41ng/ml增加到7.80ng/ml再增加到8.34ng/ml。
总结
sFlt1和sEng在必然发展先兆子痫的患者的妊娠的次三个月期间都升高。正常妊娠的特征在于从妊娠的前三个月到次三个月sEng降低，而sFlt1没有显著改变。但是，在发展先兆子痫，特别是早产先兆子痫的患者中，sFlt1和sEng都继续从前三个月到次三个月增加。妊娠的前三个月和次三个月中sFlt1和sEng的改变都可以用于筛选对于随后发展早产先兆子痫具有高风险的患者。
这些发现对于预测早产先兆子痫具有重要意义。寻求安全、可靠的先兆子痫测试是研究者多年来的目标。以前的努力集中在检测疾病的早期表现，如微白蛋白尿、体重增加和血浆体积改变。在一个大的中间分析中，Conde-Agudelo A等分析了7,191篇潜在相关的文章中的87篇(211,369名女性)，以评估临床、生物物理和生化测试在预测先兆子痫中的有用性。他们得出结论，从2004年开始，没有用于预测先兆子痫发展的临床上有用的筛选测试(12)。在本研究中，我们证明了sFlt1和sEng的水平在必然发展先兆子痫的女性中，在她们的妊娠的前三个月和次三个月中，在临床发病前数周到数月升高(通过作为个体患者中的δ测量)。这些改变在发展早产先兆子痫的女性中更显著。
认为血管发生因子的不平衡在先兆子痫的致病中起密切作用。先兆子痫胎盘的特征在于植入浅和异常血管重塑，包括受损的假血管发生(Fisher等，Semin Cell Biol.4：183-8(1993))。认为这些胎盘改变发生在妊娠的12-18周，并且对于大多数重度早发先兆子痫的致病是重要的。认为这些胎盘形成异常导致诱导母体先兆子痫综合征的系统因素的确立。如本文和PCT申请公开号WO 2004/008946，WO2005/077007和WO 2006/034507中的描述，已经发现sFlt1和sEng这两种抗血管发生蛋白都在先兆子痫中升高，不仅在临床疾病期间，而且在症状发作前几周就升高(Levine等，(2006)，同上)。重要的是，这两种因子都参与诱导大鼠中的先兆子痫样综合征(Maynard等，同上，Venkatesha等，同上)。但是，由于血管发生因子在母体循环中的浓度的改变发生在妊娠相对晚期，这些抗血管发生因子的产生增加，可能是反应于异常胎盘形成而发生的继发现象。采用胎盘绒毛外植体的体外数据和原代细胞滋养层培养研究提示除了在诱导母体内皮功能障碍中的作用，抗血管发生因子可以参与细胞滋养层迁移和分化。我们发现正常妊娠中抗血管发生因子的水平从妊娠的前三个月到次三个月降低，但在后来发展早产先兆子痫的妊娠中不降低，这表明循环血管发生因子的异常与胎盘分化异常同时发生。
先兆子痫患者中循环sFlt1和sEng的浓度增加的病因学是未知的。认为缺氧、基因或免疫因素起作用。值得注意的是sFlt1和sEng的表达在体内和体外胎盘缺氧模型中都反应于缺氧而增加，其中HIF-1介导表达的增加(Nevo等，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.291：R1085-93(2006))。此外，认为在正常妊娠期间，胎盘在妊娠早期缺氧，这种缺氧随着妊娠的次三个月期间向胎盘的血流增加而消失。尽管在先兆子痫妊娠中从未正式记载缺氧，但认为缺氧对于大多数先兆子痫妊娠具有关键作用，这是基于增加的缺氧诱导转录因子表达和到达胎盘的多普勒血流受阻的替代证据。我们的发现，即sFlt1和sEng相对于正常妊娠(其中妊娠的前三个月和次三个月之间降低)在重度先兆子痫患者中都保持升高，提示胎盘局部缺血可能实际上在先兆子痫患者中这些抗血管发生蛋白的产生增加中起作用。
概括起来，sFlt1和sEng的顺序改变看起来能够鉴定必然发展先兆子痫的女性，特别是随后发展早产先兆子痫的女性。我们的发现在具有更大样本大小的代表性研究中得到再现(表11)。
实施例12.内皮糖蛋白是TGF-β1诱导的eNOS Thr495去磷酸化必须的
鼠内皮细胞来源于Eng+/+和Eng-/-小鼠胚胎(E8.5)，并且如Balconi等(Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.20：1443-51(2000))中的描述生长。使汇合的单层血清饥饿2小时，并且在有或无TGF-β1(125和250pM)的条件下刺激15分钟。立即在含10mM Tris-HCl的1％Triton X-100中制备细胞提取物，并且补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。对蛋白浓度进行定量，并且采用eNOS的Thr495的磷酸特异性pAbs(Cell Signaling)和总eNOS的mAb(BD Biosciences)通过蛋白印迹进行分析。
图40A所示的代表性蛋白印迹和图40B所示的相关图(n＝3次实验的平均值)证明小鼠Eng+/+内皮细胞而不是Eng-/-细胞中的TGF-β1诱导的(**与基线相比P＜0.01)eNOS Thr495去磷酸化。该结果提示了内皮糖蛋白在将TGF-β1信号传递连接于eNOS Thr495去磷酸化和激活中的关键作用。此外，考虑到该过程是内皮糖蛋白依赖性的，可以用可溶内皮糖蛋白抑制该过程，推定是通过结合并且抑制TGF-β1。
其它实施方案
为了解释的目的，提供了本发明的具体的实施方案的描述。它们不意欲是穷尽性的，也无意将本发明的范围限制为本文所述的具体形式。尽管已经参照几个实施方案描述了本发明，但本领域的技术人员应当理解，在不脱离如权利要求书所述的本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种修改。
本文中提到的所有专利、专利申请和出版物均引作参考，包括PCT申请公开号WO 2004/008946，WO 2005/077007和WO 2006/034507；美国专利申请公开号20060067937和20070104707；以及美国临时专利申请号60/852,761。
其它实施方案在权利要求书中。
序列表
<110>BETH ISRAEL DEACONESS MEDICAL CENTER et al.
<120>诊断和治疗妊娠并发症的方法
<130>01948/106WO3
<150>11/443,920
<151>2006-05-31
<150>60/852,761
<151>2006-10-19
<160>5
<170>PatentIn version                                                3.3
<210>1
<211>1311
<212>DNA
<213>人
<400>1
atggaccgcg gcacgctccc tctggctgtt gccctgctgc tggccagctg cagcctcagc    60
cccacaagtc ttgcagaaac agtccattgt gaccttcagc ctgtgggccc cgagagggac    120
gaggtgacat ataccactag ccaggtctcg aagggctgcg tggctcaggc ccccaatgcc    180
atccttgaag tccatgtcct cttcctggag ttcccaacgg gcccgtcaca gctggagctg    240
actctccagg catccaagca aaatggcacc tggccccgag aggtgcttct ggtcctcagt    300
gtaaacagca gtgtcttcct gcatctccag gccctgggaa tcccactgca cttggcctac    360
aattccagcc tggtcacctt ccaagagccc ccgggggtca acaccacaga gctgccatcc    420
ttccccaaga cccagatcct tgagtgggca gctgagaggg gccccatcac ctctgctgct    480
gagctgaatg acccccagag catcctcctc cgactgggcc aagcccaggg gtcactgtcc    540
ttctgcatgc tggaagccag ccaggacatg ggccgcacgc tcgagtggcg gccgcgtact    600
ccagccttgg tccggggctg ccacttggaa ggcgtggccg gccacaagga ggcgcacatc    660
ctgagggtcc tgccgggcca ctcggccggg ccccggacgg tgacggtgaa ggtggaactg    720
agctgcgcac ccggggatct cgatgccgtc ctcatcctgc agggtccccc ctacgtgtcc    780
tggctcatcg acgccaacca caacatgcag atctggacca ctggagaata ctccttcaag    840
atctttccag agaaaaacat tcgtggcttc aagctcccag acacacctca aggcctcctg    900
ggggaggccc ggatgctcaa tgccagcatt gtggcatcct tcgtggagct accgctggcc    960
agcattgtct cacttcatgc ctccagctgc ggtggtaggc tgcagacctc acccgcaccg    1020
atccagacca ctcctcccaa ggacacttgt agcccggagc tgctcatgtc cttgatccag    1080
acaaagtgtg ccgacgacgc catgaccctg gtactaaaga aagagcttgt tgcgcatttg    1140
aagtgcacca tcacgggcct gaccttctgg gaccccagct gtgaggcaga ggacaggggt    1200
gacaagtttg tcttgcgcag tgcttactcc agctgtggca tgcaggtgtc agcaagtatg    1260
atcagcaatg aggcggtggt caatatcctg tcgagctcat caccacagcg g             1311
<210>2
<211>437
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser
1               5                   10                  15
Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu
            20                  25                  30
Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln
        35                  40                  45
Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val
    50                  55                  60
His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu
65                  70                  75                  80
Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu
                85                  90                  95
Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu
            100                 105                 110
Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln
        115                 120                 125
Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr
    130                 135                 140
Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala
145                 150                 155                 160
Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln
                165                 170                 175
Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg
            180                 185                 190
Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His
        195                 200                 205
Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu
    210                 215                 220
Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu
225                 230                 235                 240
Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro
                245                 250                 255
Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp
            260                 265                 270
Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg
        275                 280                 285
Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg
    290                 295                 300
Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala
305                 310                 315                 320
Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr
                325                 330                 335
Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro
            340                 345                 350
Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met
        355                 360                 365
Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile
    370                 375                 380
Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly
385                 390                 395                 400
Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val
                405                 410                 415
Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser
            420                 425                 430
Ser Ser Pro Gln Arg
        435
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
acgaagcttg aaacagtcca ttgtgacctt             30
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
ttagatatct ggcctttgct tgtgcaacc              29
<210>5
<211>633
<212>PRT
<213>人
<400>5
Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu
1               5                   10                  15
Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala
            20                  25                  30
Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr
        35                  40                  45
Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly
    50                  55                  60
Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn
                85                  90                  95
Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg
        115                 120                 125
Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu
    130                 135                 140
Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro
                165                 170                 175
Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu
            180                 185                 190
Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr
        195                 200                 205
Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala
    210                 215                 220
Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala
225                 230                 235                 240
Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile
                245                 250                 255
Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln
            260                 265                 270
Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser
        275                 280                 285
Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser
    290                 295                 300
Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro
305                 310                 315                 320
Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr
                325                 330                 335
Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val
            340                 345                 350
Ala His Leu Lys Cys Thr Ile Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser
        355                 360                 365
Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr
    370                 375                 380
Ser Ser Cys Gly Met Gln Val Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala
385                 390                 395                 400
Val Val Asn Ile Leu Ser Ser Ser Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His
                405                 410                 415
Cys Leu Asn Met Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser
            420                 425                 430
Pro His Phe Leu Gln Ala Ser Asn Thr Ile Glu Pro Gly Gln Gln Ser
        435                 440                 445
Phe Val Gln Val Arg Val Ser Pro Ser Val Ser Glu Phe Leu Leu Gln
    450                 455                 460
Leu Asp Ser Cys His Leu Asp Leu Gly Pro Glu Gly Gly Thr Val Glu
465                 470                 475                 480
Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala Lys Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser
                485                 490                 495
Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro Arg Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr
            500                 505                 510
Thr Val Pro Ile Pro Lys Thr Gly Thr Leu Ser Cys Thr Val Ala Leu
        515                 520                 525
Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln Asp Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe
    530                 535                 540
Met Arg Leu Asn Ile Ile Ser Pro Asp Leu Ser Gly Cys Thr Ser Lys
545                 550                 555                 560
Gly Leu Val Leu Pro Ala Val Leu Gly Ile Thr Phe Gly Ala Phe Leu
                565                 570                 575
Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr
            580                 585                 590
Arg Ser Pro Ser Lys Arg Glu Pro Val Val Ala Val Ala Ala Pro Ala
        595                 600                 605
Ser Ser Glu Ser Ser Ser Thr Asn His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser
    610                 615                 620
Thr Pro Cys Ser Thr Ser Ser Met Ala
625                 630

Claims (57)

1.治疗或预防受试者中的妊娠相关高血压病症的方法，所述方法包括给所述受试者施用能够提高NOS的表达水平或生物活性的化合物的步骤，其中所述施用的时间和量足以治疗或预防所述受试者中的所述妊娠相关的高血压病症。
2.权利要求1的方法，其中所述NOS是eNOS。
3.权利要求2的方法，其中所述化合物增加eNOS的Ser 1177的磷酸化。
4.权利要求1的方法，其中所述化合物是VEGF或其生物活性片段。
5.权利要求4的方法，其中所述VEGF是VEGF121、VEGF 165或VEGF的修饰形式，或其生物活性片段。
6.权利要求25的方法，其中所述化合物是PlGF或其生物活性片段。
7.权利要求2的方法，其中所述化合物增加eNOS的Thr495的去磷酸化。
8.权利要求7的方法，其中所述化合物选自TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白A、BMP-2、BMP-7及其生物活性片段。
9.权利要求1的方法，进一步包括给所述受试者施用能够降低可溶内皮糖蛋白表达或可溶内皮糖蛋白生物活性的化合物，其中所述施用足以治疗或预防所述受试者中的所述妊娠相关的高血压病症。
10.权利要求9的方法，其中所述化合物是特异性结合可溶内皮糖蛋白的纯化抗体或可溶内皮糖蛋白抗原结合片段。
11.权利要求10的方法，其中所述抗体结合可溶内皮糖蛋白多肽或其片段，所述多肽或其片段包含选自图30B所示人内皮糖蛋白序列的氨基酸26-437、40-406或26-587的氨基酸序列。
12.权利要求10的方法，其中所述抗体结合可溶内皮糖蛋白上的表位，所述表位包含图30B所示人内皮糖蛋白序列的氨基酸40-86、144-199、206-222、289-304或375-381。
13.权利要求9的方法，其中所述化合物是抑制选自基质金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶和弹性蛋白酶的蛋白水解酶的化合物。
14.权利要求1的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症的特征在于与正常参照相比提高的sFlt-1水平。
15.权利要求1的方法，进一步包括给所述受试者施用能够降低sFlt-1表达水平或sFlt-1生物活性的化合物，其中所述施用足以治疗或预防所述受试者中的所述妊娠相关的高血压病症。
16.权利要求15的方法，其中所述化合物是结合sFlt-1的纯化的生长因子或抗体或抗原结合片段。
17.权利要求1的方法，其中所述受试者是妊娠的人、分娩后的人或妊娠的非人类。
18.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括监测所述受试者中的所述妊娠相关的高血压病症，其中所述监测包括测量来自所述受试者的血清或血浆样品中可溶内皮糖蛋白多肽的水平，其中低于25ng/ml的可溶内皮糖蛋白多肽的水平表明所述妊娠相关的高血压病症的改善。
19.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括监测所述受试者中的所述妊娠相关的高血压病症，其中所述监测包括测量来自所述受试者的样品中可溶内皮糖蛋白多肽的水平，其中测量所述水平是在两种或多种场合下完成，并且测量之间所述可溶内皮糖蛋白水平的降低是所述妊娠相关的高血压病症改善的指标。
20.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括监测所述受试者中的所述妊娠相关的高血压病症，其中所述监测包括测量来自所述受试者的样品中可溶内皮糖蛋白多肽的水平并且将所述水平与阳性参照样品比较，其中可溶内皮糖蛋白水平相对于所述阳性参照样品的降低，表明所述受试者中所述妊娠相关的高血压病症的改善。
21.权利要求18-20的任一项的方法，其中用所述监测来确定化合物的治疗剂量。
22.权利要求18-20的任一项的方法，其中所述测量包括采用免疫学测定。
23.权利要求18-20的任一项的方法，其中可溶内皮糖蛋白的水平是游离的、结合的或总的可溶内皮糖蛋白的水平或降解或酶切得到的内皮糖蛋白多肽的水平。
24.权利要求18-20的任一项的方法，其中所述监测进一步包括测量来自所述受试者的样品中sFlt-1、VEGF或PlGF多肽中至少一种多肽的水平。
25.权利要求24的方法，进一步包括用度量标准计算所述可溶内皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的水平之间的关系，其中受试者样品中所述水平之间的关系相对于参照样品的改变，表明所述受试者中所述妊娠相关的高血压病症的改善。
26.权利要求25的方法，其中所述度量标准选自[(sFlt-1+0.25可溶内皮糖蛋白)/PlGF]、[(可溶内皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF]和[sFlt-1x可溶内皮糖蛋白]。
27.权利要求25的方法，其中所述度量标准是[d乘积＝妊娠的次三个月中的(sFlt1 x sEng)-妊娠的前三个月中的(sFlt1x sEng)]，其中大于0的d乘积值，表明所述受试者中的妊娠相关的高血压病症，并且，与阳性参照样品相比，所述d乘积值的减少表明所述受试者中所述妊娠相关的高血压病症的改善。
28.特异性结合可溶内皮糖蛋白多肽的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体结合表位，所述表位包含图30B所示人内皮糖蛋白序列的氨基酸40-86、144-199、206-222、289-304或375-381。
29.权利要求28的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段防止生长因子与可溶内皮糖蛋白结合。
30.权利要求29的抗体或其抗原结合片段，其中所述生长因子选自TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白A、BMP-2和BMP-7。
31.权利要求28的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
32.权利要求28的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体缺乏Fc部分，是F(ab’)2、Fab或Fv结构。
33.权利要求28的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段存在于药学可接受的载体中。
34.诊断患有妊娠相关的高血压病症或具有患所述病症的倾向的受试者的方法，所述方法包括测量来自所述受试者的样品中可溶内皮糖蛋白多肽和至少一种另外的多肽的水平，所述至少一种另外的多肽选自TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白A、BMP2、BMP 7、eNOS和PGI2，其中与正常参照样品、标准或水平相比，可溶内皮糖蛋白水平的提高和所述至少一种另外的多肽的水平的降低，是妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向的诊断指标。
35.权利要求34的方法，其中所述测量包括采用免疫学测定。
36.权利要求35的方法，其中所述免疫学测定是ELISA。
37.权利要求34的方法，其中所述正常参照样品是来自所述受试者的先前的样品。
38.诊断患有妊娠相关的高血压病症或具有患所述病症的倾向的受试者的方法，所述方法包括测量来自所述受试者的可溶内皮糖蛋白多肽和sFlt-1多肽的水平，并且用[可溶内皮糖蛋白x sFlt-1]度量标准计算可溶内皮糖蛋白和sFlt-1水平之间的关系，其中相对于正常参照样品，受试者样品中该度量标准的增加是所述受试者中妊娠相关的高血压病症的诊断指标。
39.权利要求38的方法，其中所述度量标准进一步包含母亲的体重指数和胎儿的胎龄。
40.诊断患有妊娠相关的高血压病症或具有患所述病症的倾向的受试者的方法，所述方法包括测量所述受试者妊娠的前三个月和妊娠的次三个月中可溶内皮糖蛋白多肽和sFlt-1多肽的水平，并且用以下度量标准计算所述可溶内皮糖蛋白和sFlt-1水平之间的关系：[d乘积＝妊娠的次三个月中的(sFlt1 x sEng)-妊娠的前三个月中的(sFlt1 xsEng)]，其中大于0的d乘积值，是所述受试者中妊娠相关的高血压病症的诊断指标。
41.权利要求40的方法，其中大于1的d乘积值是所述受试者中妊娠相关的高血压病症的诊断指标。
42.权利要求41的方法，其中大于1的d乘积值是早产先兆子痫的诊断指标。
43.权利要求34、38或40的方法，其中所述样品是所述试者的体液、细胞或组织，其中所述可溶内皮糖蛋白通常是可检测的。
44.权利要求43的方法，其中所述体液选自尿、羊水、血液、血清和血浆。
45.权利要求43的方法，其中所述细胞选自内皮细胞、白细胞、单核细胞和来源于胎盘的细胞。
46.权利要求43的方法，其中所述组织是胎盘组织。
47.权利要求34、38或40的方法，其中所述受试者是非妊娠的人、妊娠的人、产后的人，或非人类，并且所述方法诊断发展妊娠相关的高血压病症的倾向。
48.权利要求47的方法，其中所述非人类选自牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫。
49.权利要求34、38或40的方法，其中所述方法用于在症状发作前至少4周诊断妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向。
50.权利要求1、34、38或40的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫、子痫、妊娠高血压、慢性高血压、HELLP综合征，和具有SGA婴儿的妊娠。
51.权利要求50的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫或子痫。
52.用于诊断受试者中的妊娠相关的高血压病症的试剂盒，该试剂盒包含：(i)可溶内皮糖蛋白结合剂，和(ii)至少一种另外的结合剂，其结合选自TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白A、BMP2、BMP7、eNOS和PGI2的多肽；和(iii)使用(i)的结合剂和(ii)的至少一种结合剂来诊断妊娠相关的高血压病症或发展妊娠相关的高血压病症的倾向的说明书。
53.权利要求52的试剂盒，其中(i)的所述结合剂是特异性结合可溶内皮糖蛋白的抗体或其抗原结合片段，并且(ii)的至少一种结合剂是特异性结合TGF-β1、TGF-β3、激活蛋白A、BMP2、BMP7、eNOS或PGI2的抗体或其抗原结合片段。
54.权利要求52的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含VEGF、sFlt-1或PlGF结合分子。
55.权利要求52的方法，其中所述妊娠相关的高血压病症是先兆子痫、子痫、妊娠高血压、慢性高血压、HELLP综合征，和具有SGA婴儿的妊娠。
56.鉴定改善妊娠相关的高血压病症的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使细胞与可溶内皮糖蛋白化合物接触；
(b)确定步骤(a)的所述细胞中eNOS的Thr495的磷酸化状态；
(c)使所述细胞与候选化合物接触；
(d)确定步骤(c)的所述细胞中eNOS的Thr495的磷酸化状态；和
(e)比较步骤(b)和步骤(d)中确定的磷酸化状态，其中与步骤(b)相比，步骤(d)中eNOS的Thr 495的去磷酸化的增加，鉴定所述候选化合物为改善妊娠相关的高血压病症的化合物。
57.鉴定改善妊娠相关的高血压病症的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使细胞与Smad2/3依赖性报道构建体和可溶内皮糖蛋白化合物接触；
(b)确定步骤(a)的细胞中Smad2/3报道构建体的激活水平；
(c)使步骤(a)的细胞与候选化合物接触；
(d)确定步骤(c)的细胞中Smad2/3报道构建体的激活水平；和
(e)比较步骤(b)和步骤(d)中确定的Smad2/3报道构建体的激活水平，
其中与步骤(b)相比，步骤(d)中Smad2/3报道构建体的激活水平的增加，鉴定候选化合物为改善妊娠相关的高血压病症的化合物。
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