CN113933129B - 子痫前期诊断试剂盒以及荧光染料的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种子痫前期诊断试剂盒以及尼罗蓝的应用。子痫前期诊断试剂盒包括：用于对孕妇血液样本进行染色的荧光染料。这种子痫前期诊断试剂盒通过荧光染料对孕妇血液样本进行染色，结合实施例部分的测试，通过荧光染料分别对正常孕妇血液样本和子痫前期孕妇患者血液样本进行处理，结合FLIM技术，可以明显将正常孕妇血液样本和子痫前期孕妇患者血液样本进行区分，从而可以对子痫前期形成诊断。
Description
技术领域
本发明涉及诊断试剂盒领域，尤其是涉及一种子痫前期诊断试剂盒以及荧光染料的应用。
背景技术
子痫前期(Preeclampsia，PE)以高血压和水肿为特征，是一种严重的妊娠并发症，可导致孕产妇和围产儿死亡。研究表明，胎盘发育不良及某些致病因素的出现可能导致子痫前期。以往的研究都很关注诱发子痫前期的致病因素，认为在这些研究的基础上，通过检测孕妇血液中的特定生物标记物，可以开发出子痫前期的早期诊断方法。G.J.Burton等建立的胎盘模型表明，螺旋动脉发育不良会导致过多的血液流入母胎界面，导致胎盘绒毛损伤和炎症因子的产生。然而，对子痫前期胎盘结构和内部微环境的研究往往被忽视，这是因为H&E常规染色的胎盘切片在亮场成像或荧光强度成像上没有明显差异，这给胎盘病变与子痫前期关系的深入研究带来了挑战。
胎盘主要包括隔膜和绒毛。隔膜将胎盘分成不同的小空间，在那里胎盘绒毛被滋养细胞浸润到母体血液中。与胎儿血液循环有关的毛细血管分布于胎盘绒毛内，毛细血管与滋养细胞之间的结构为蛋白质纤维。一般认为，螺旋动脉的病理改变是子痫前期发生的重要因素，导致血压升高。母体血液以极高的速度进入胎盘，对胎盘绒毛造成损伤，阻碍胎儿的血氧交换。然而，之前的研究过于关注与子痫前期相关的特定蛋白质或因子，而忽略了对胎盘病理变化的基础性研究。
众所周知，荧光寿命与周围微环境有关，如浓度、温度、极性等，猝灭时不受激发光强度或荧光团浓度的影响，这使荧光寿命成像成为研究生命活动的有效手段，并被广泛应用于涉及组织或体液的疾病诊断。尤其是基于荧光显微寿命成像(Fluorescence lifetimeimaging microscopy，FLIM)技术的癌症诊断已经被广泛报道。FLIM通过测量外源性或内源性荧光基团发出的荧光的衰减时间来分析荧光团的时间特性。由于微环境差异导致的正常组织和异常组织之间客观存在荧光寿命的差异，因此可以用FLIM来区分正常与异常的样本。
发明内容
基于此，有必要提供一种基于FLIM的子痫前期诊断试剂盒以及尼罗蓝的应用。
一种子痫前期诊断试剂盒，包括：用于对孕妇血液样本进行染色的荧光染料。
一种荧光染料在制备子痫前期诊断产品领域的应用。
这种子痫前期诊断试剂盒通过荧光染料对孕妇血液样本进行染色，结合实施例部分的测试，通过荧光染料分别对正常孕妇血液样本和子痫前期孕妇患者血液样本进行处理，结合FLIM技术，可以明显将正常孕妇血液样本和子痫前期孕妇患者血液样本进行区分，从而可以对子痫前期形成诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
其中：
图1为N1-全血、M-全血、S-全血的亮场图像、荧光寿命图像、荧光寿命假彩色图像。
图2为N1-全血、M-全血、S-全血的荧光寿命分布直方图。
图3为N1-全血、M-全血、S-全血的荧光寿命拟合曲线。
图4为N1.1-血清、N2.1-血清、N3.1-血清、M1-血清、S1-血清的荧光寿命图像、荧光寿命假彩色图像。
图5为N1.1-血清、N2.1-血清、N3.1-血清、M1-血清、S1-血清的荧光寿命分布直方图。
图6为N1.1-血清、N2.1-血清、N3.1-血清、M1-血清、S1-血清的荧光寿命拟合曲线。
图7为N1.2-血清、N2.2-血清、N3.2-血清、M2-血清、S2-血清的荧光寿命图像、荧光寿命假彩色图像。
图8为N1.2-血清、N2.2-血清、N3.2-血清、M2-血清、S2-血清的荧光寿命分布直方图。
图9为N1.2-血清、N2.2-血清、N3.2-血清、M2-血清、S2-血清的荧光寿命拟合曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明公开了一实施方式的子痫前期诊断试剂盒，包括：用于对孕妇血液样本进行染色的荧光染料。
这种子痫前期诊断试剂盒通过荧光染料对孕妇血液样本进行染色，结合实施例部分的测试，通过荧光染料分别对正常孕妇血液样本和子痫前期孕妇患者血液样本进行处理，结合FLIM技术，可以明显将正常孕妇血液样本和子痫前期孕妇患者血液样本进行区分，从而可以对子痫前期形成诊断。
优选的，本实施方式中，荧光染料为尼罗蓝。
结合具体实施例部分的结果，本申请中通过选择尼罗蓝作为荧光染料，不仅可以对正常孕妇血液样本和子痫前期孕妇患者血液样本进行区分，还可以对轻度子痫前期和重度子痫前期进行区分。
更优选的，孕妇血液样本为孕妇全血或孕妇血清。
结合实施例部分的结果，通过孕妇全血配合尼罗蓝，结合FLIM技术，可以对子痫前期进行部分筛查。
结合实施例部分的结果，通过孕妇血清配合尼罗蓝，结合FLIM技术，不仅可以对正常孕妇血液样本和子痫前期孕妇患者血液样本进行区分，还可以对轻度子痫前期和重度子痫前期进行区分，从而完全实现对子痫前期的筛查。
具体来说，孕妇全血为孕妇外周血全血，孕妇血清为孕妇外周血血清。
优选的，尼罗蓝为尼罗蓝溶液，尼罗蓝溶液用于与孕妇血液样本混合后染色并制成封片。
具体来说，尼罗蓝溶液与孕妇血液样本的体积比为0.5～2：9。
更优选的，尼罗蓝溶液与孕妇血液样本的体积比为1：9。
本发明中，尼罗蓝溶液为直接购买得到，使用时未经稀释。
具体来说，尼罗蓝溶液用于与孕妇血液样本混合后染色并制成封片的操作为：将尼罗蓝溶液与孕妇血液样本混合后，将混合物均匀涂覆于玻片上，干燥后用中性树脂密封，得到封片。
混合物均匀涂覆于玻片上中，可以选择厚涂或薄涂。结合实施例部分的结果，薄涂后的检测效果较好。
具体来说，均匀薄涂为：将0.1mL的混合物均匀涂覆于载玻片上50×24mm的区域内，均匀厚涂：将0.2mL的混合物均匀涂覆于载玻片上50mm×24mm的区域内。
本发明还公开了一种上述荧光染料在制备子痫前期诊断产品领域的应用。
优选的，荧光染料为尼罗蓝。
以下为具体实施例。
实施例中，尼罗蓝染料为瑞楚生物公司的Heinz小体染色液(耐尔蓝法)，FLIM系统为Bercker&Hickl GmbH公司的DCS-120荧光寿命成像系统，正常孕妇外周血、轻度子痫前期孕妇患者外周血和重度子痫前期孕妇患者外周血均来自广东省深圳市光明新区人民医院。
实施例1
分别提供三个正常孕妇外周血、轻度子痫前期孕妇患者外周血和重度子痫前期孕妇患者外周血，分别记为N1(正常孕妇外周血1)、N2(正常孕妇外周血2)、N3(正常孕妇外周血3)、M(轻度子痫前期孕妇患者外周血)、S(重度子痫前期孕妇患者外周血)。
分别取部分N1、M、S外周血样品，分别加入抗凝剂(柠檬酸三钠)的后，分别滴于玻片上干燥，然后滴入未稀释的尼罗蓝染料染色，用逐渐扩散的染料对全血进行染色，干燥后，用中性胶涂片，得到全血检测样片，分别记为N1-全血、M-全血、S-全血。
采用FLIM系统分别对N1-全血、M-全血、S-全血进行诊断研究，得到图1和图2。
结合图1可以看出，尼罗蓝沉淀并聚集在血细胞周围，因此血细胞周围有许多亮点。
结合图2和图3可以看出，N1-全血、M-全血和S-全血相比较，N1-全血和S-全血可以彼此区分，M-全血区分度较差。
也就是说，采用全血和尼罗蓝结合的检测方式，可以部分实现子痫前期的筛查。
实施例2
分别取部分N1、N2、N3、M、S外周血样品在1500rpm离心10min，接着分别取血清，并记为N1-血清、N2-血清、N3-血清、M-血清、S-血清。
分别采用如下两种方法，对上述五组血清样品进行处理，得到血清检测样片。
第一种方法：将尼罗蓝和血清按体积比为1：9的比例混合，然后将其分别均匀薄涂于玻片上，干燥后，用中性树脂密封。
第二种方法：将尼罗蓝和血清按体积比为1：9的比例混合，然后将其分别均匀厚涂，干燥后，用中性树脂密封。
得到的血清检测样片分别记为N1.1-血清、N1.2-血清、N2.1-血清、N2.2-血清、N3.1-血清、N3.2-血清、M1-血清、M2-血清、S1-血清、S2-血清。
采用FLIM系统分别对上述血清检测样片进行诊断研究，得到图4、图5、图6、图7、图8和图9。
结合图4和图7可以看出，尼罗蓝均匀沉淀，在正常样品(N1.1-血清、N1.2-血清、N2.1-血清、N2.2-血清、N3.1-血清、N3.2-血清)、轻度子痫前期(M1-血清、M2-血清)和重度子痫前期(S1-血清、S2-血清)中表现略有差异。
结合图5、图6、图8和图9可以看出，正常样品(N1.1-血清、N1.2-血清、N2.1-血清、N2.2-血清、N3.1-血清、N3.2-血清)、轻度子痫前期(M1-血清、M2-血清)和重度子痫前期(S1-血清、S2-血清)均可以实现彼此区分。
也就是说，采用血清和尼罗蓝结合的检测方式，可以完全实现轻度子痫的筛查。
特别的，对比图5、图6和图8、图9，可以看出，薄涂后得到的血清检测样片，更适合于与FLIM系统配合实现诊断研究。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (2)
1.一种荧光染料用于制备子痫前期诊断试剂盒的应用，其特征在于，包括：所述试剂盒的检测样品为孕妇血液样本；
所述荧光染料为尼罗蓝溶液，将所述尼罗蓝溶液与所述孕妇血液样本混合后，将混合物均匀涂覆于玻片上，干燥后用中性树脂密封，得到封片；
所述尼罗蓝溶液与所述孕妇血液样本的体积比为0.5～2：9；
所述试剂盒用于通过FLIM系统检测所述封片的荧光寿命，根据所述封片的荧光寿命，对子痫前期进行诊断，并对轻度子痫前期和重度子痫前期进行区分；
其中，所述孕妇血液样本为孕妇外周血血清。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尼罗蓝溶液与所述孕妇血液样本的体积比为1：9。
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