KR20090040874A - 임신 합병증의 진단 및 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명에는 가용성 엔도글린, 내피세포 산화질소 합성효소, PGI₂, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP2, BMP7 및 sFlt-1 발현 농도 또는 생물학적 활성을 변경시키는 화합물들의 조합을 사용하는, 전자간증 및 자간증과 같은 임신관련 고혈압 질환의 치료 방법들이 설명되어 있다. 또한 하나 이상의 임의의; 가용성 엔도글린, 내피세포 산화질소 합성효소, PGI₂, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP2, BMP7 및 sFlt-1 발현 농도 또는 생물학적 활성의 측정을 포함하는, 전자간증 및 자간증과 같은 임신관련 고혈압 질환의 진단 방법들이 설명되어 있다.

Description

임신 합병증의 진단 및 치료 방법 {METHODS OF DIAGNOSING AND TREATING COMPLICATIONS OF PREGNANCY}

일반적으로, 본 발명은 임신관련 고혈압 질환을 갖는 환자들의 검출 및 치료에 관한 것이다.

전자간증(pre-eclampsia)은 고혈압, 부종(edema), 및 단백뇨(proteinuria)의 증상을 보이며 임신 5 내지 10%에 영향을 미치는데, 상당한 모체 및 태아의 질병률(morbidity) 및 사망률(mortality)을 야기한다. 전자간증은 전세계적으로 해마다 200,000명 이상의 모체의 사망을 일으킨다. 전자간증의 증상들은 전형적으로 임신 20주 후에 나타나며, 보통 여성의 혈압 및 소변의 정기적인 측정에 의해 검출된다. 그러나, 이러한 모니터링 방법들은 증상의 초기 단계에서의 진단에는 비효과적이나, 효과적인 치료를 이용할 수 있다면 환자의 위험을 감소시키거나 태아 분만시의 위험을 감소시킬 수 있다.

현재 전자간증에 대한 알려진 치료법은 없다. 전자간증은 경증에서 생명을 위협할 정도의 증상까지 그 질병의 경중도가 다양할 수 있다. 전자간증의 경증상은 침상 안정(bed rest) 및 잦은 모니터링으로 치료될 수 있다. 심각한 증상들을 완화시키기 위해서, 입원이 권유되고 발작 예방을 위해 혈압 약물처치(blood pressure medication) 또는 항경련제 투여(anticonvulsant medications)가 처방된다. 모체 또는 태아의 생명을 위협할 정도의 증상인 경우에는 임신 상태가 종결되고 태아는 조산된다.

태아 및 태반(placenta)의 적절한 발생은 몇 가지 성장 인자들(growth factors) 또는 혈관형성인자들(angiogenic factors)에 의해 매개된다. 이러한 혈관형성인자들 중 하나는 CD105로도 알려진, 엔도글린(endoglin)이다. 엔도글린은 동종이량체의 세포막 당단백질(homodimeric cell membrane glycoprotein)인데 융합세포영양막(syncytiotrophoblasts), 제대혈관내피세포(human unbilical vein endothelial cells:HUVEC)와 같은 내피 세포 및 혈관내피 세포에서 주로 발현된다. 엔도글린은 베타글리칸(betaglycan), 전환성장인자(TGF)-β 수용체 타입 III와 서열 상동성(sequence identity)을 공유한다. 엔도글린은 TGF-β 수용체 복합체의 조절 성분으로 입증되었고, TGF-β 수용체는 혈관형성(angiogenesis), 증식(proliferation), 분화(differentiation) 및 세포사멸(apoptosis)를 조절한다. 또한 엔도글린은 액티빈-A(activin-A), 골형태형성단백질(bone morphogenic protein:BMP)-2 및 BMP-7을 포함하여 TGF-β 수퍼패밀리의 다른 몇몇 멤버들에 결합한다. 특히, 엔도글린은 TGF-β1 및 TGF-β3에 고친화도로 결합하고, TGF-β 시그널링 수용체 타입 I 및 II와 이종삼량체의 결합(heterotrimeric associations)을 형성한다. 엔도글린 유전자의 코딩 영역에서의 돌연변이들은 출혈성 모세혈관확장 증 타입 1(haemorrhagic telangiectasia type 1:HHT1), 다발적 혈관 형성이상(multisystemic vascular dysplasia) 및 재발성 출혈(recurrent hemorrhage)로 특징지워지는 우성 유전 혈관 질환(dominantly inherited vascular disorder)의 원인이 된다. 엔도글린 면역반응성(immunoreactivity)은 전이성 유방암(metastatic breast cancer) 및 전이성 대장암(metastatic colorectal cancer)을 앓는 환자에게 높은 농도로 존재함을 앞서 확인되었으나, 암의 발병기전(pathogenesis)에 있어서 가용성 엔도글린의 정확한 기능적 역할은 명확하지 않다. 가용성 엔도글린의 생산이 전자간증 또는 정상임신에 관련된다고 보고되고 있지는 않다.

몇 가지 인자들은 태아 및 태반의 발생, 더욱 상세하게는, 전자간증에 관련된다는 보고가 있어 왔다. 이들은 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor:VEGF), 가용성 Flt-1 수용체(sFlt- 1) 및 태반 성장 인자(placental 성장 인자:PlGF)를 포함한다. VEGF는 내피 세포-특이성 분열촉진 물질(endothelial cell-specific mitogen)이고, 혈관형성 유발인자(angiogenic inducer)이면서, 혈관 투과성 매개인자(mediator of vascular permeability)이다. 또한 VEGF는 사구체 모세혈관 복원(glomerular capillary repair)에 중요하다고 여겨지고 있다. VEGF는 많은 다른 조직들로부터 얻은 내피 세포에서 다르게 발현되는 두 개의 동종의 막-스패닝(spanning) 티로신 키나아제 수용체들, 즉, fms-유사 티로신 키나아제(Flt-1) 및 키나아제 도메인 수용체 (KDR) 중 하나에 동종이량체로서 결합한다. KDR은 아니지만, Flt-1은 태반의 형성에 기여하는 영양막 세포들(trophoblast cells)에 의해 고발현된다. PlGF는 VEGF 패밀리 멤버로 또한 태반의 발생에 관여한다. PlGF 는 세포영양막 및 융합세포영양막에 의해 발현되고, 내피 세포의 증식, 이동(migration) 및 활성화를 유발할 수 있다. PlGF는 Flt-1 수용체에 동종이량체로서 결합하나, KDR 수용체에는 그러하지 아니하다. PlGF 및 VEGF 둘다는 태반 발생에 결정적으로 작용하는 유사분열촉진활성(mitogenic activity) 및 혈관 형성에 기여한다.

수용체의 막통과 및 세포질 도메인들이 없는 sFlt-1은, 최근 인간의 제대 정맥 내피세포의 배양 배지로 확인되었고 이어서 생체 내(in vivo) 발현이 태반의 조직에서 증명되었다. sFlt-1은 고친화도로 VEGF에 결합하나 내피 세포의 유사분열유도(mitogenesis)를 자극하지는 않는다. 혈관형성 및 유사분열촉진 시그널링 경로들의 주요한 조절은 발생 단계의 태반의 영양막 세포들에 의한 절절한 증식, 이동 및 혈관 형성을 유지하는 데 결정적으로 작용한다.

전자간증 또는 자간증(eclampsia)을 앓고 있거나 발병 위험이 있는 환자에 대한 정확한 진단방법에 대한 요구가 있으며, 특히 가장 심각한 증상이 발병하기 전에 더욱 그러하다. 또한 치료방법도 요구된다.

발명의 요약

본 발명자들은 전자간증(pre-eclampsia)과 자간증(eclampsia)을 포함하여 임신관련 고혈압 질환의 진단 및 치료 방법을 발견하였다.

유전자 발현 분석(gene expression analysis)을 사용하여, 본 발명자들은 전자간증을 포함하여 고혈압과 관련된 임신 합병증으로 고통받고 있는 임신한 여성으로부터 얻은 태반 조직 샘플에서 가용성 엔도글린(soluble endoglin, sEng)의 농도가 현저하게 상승되는 것을 발견하였다. 또한 웨스턴 블롯팅을 사용하여, 본 발명자들은 가용성 엔도글린 단백질 농도가 전자간증 또는 자간증과 같은 임산관련 고혈압 질환을 가진 여성으로부터 채취된 혈청 샘플에서 증가되는 것을 발견하였다. 가용성 엔도글린은 단백분해 효소에 의해 형성되는 막 결합 형태인 세포외 부분의 분해에 의해 형성될 수 있다. 본 발명자들은 이러한 샘플에서 검출된 가용성 엔도글린이 전장 엔도글린의 아미노 터미널 부분(amino terminal portion)의 최소한 처음 381개의 아미노산(선도 펩티드(leader peptide)는 제외함, 선도 펩티드를 포함하면 406)을 포함한다는 것을 발견하였다. 본 명세서에 기술한 바와 같이, 내피세포(endothelial cells) 상에 존재하는 TβRII에 TGF-β1의 결합을 차단하여 감소된 시그널링(signaling)을 유도함으로써 전자간증에서 과잉의 가용성 엔도글린은 태반의 필요한 양의 필수 혈관형성 및 유사분열촉진 인자들을 고갈시킬 수 있다. 또한 본 발명자들은 가용성 엔도글린이 내피세포에서 TGF-β1 시그널링(TGF-β1 signaling)과 내피세포 산화질소 합성효소(endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 활성화를 방해하고, 그로 인해 혈관 건강(vascular health)의 유지에 필수적인 중요 항상성 메카니즘(homeostatic mechanism)을 교란시킨다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 가용성 엔도글린이 내피세포 상에 존재하는 TβRII에 TGF-β1의 결합을 차단하여 감소된 시그널링을 유도함을 설명한다. 순환 TGF-β1(circulating TGF-β1)은 LAP(latency associated peptide) 및 잠재성 TGF-β1 결합 단백질(latent TGF-β1 binding protein)과 복합체를 형성하게 되므로, 활성화되지 않는 한, 순환 TGF-β1는 그 수용체와 결합할 수 없다. 따라서 가용성 엔도글린은 단지 활성 TGF-β1이 생성되는 곳에서 국지적으로 TGF-β1 효과를 저해하는 것으로 보인다. 종합하면, 이러한 데이터는 TGF-β1 수용체 활성화와 산화질소 합성을 연결하는데 있어서 엔도글린의 결정적인 역할을 시사한다. 또한 본 발명은 NOS의 하류 활성화(downstream activation)의 저해에 의한 것과 유사하게, TGF-β1과 VEGF 시그널링을 방해함으로써 혈관 손상과 HELLP 증후군을 각각 유도하기 위해 가용성 엔도글린과 sFlt1이 동시에 작용한다는 것을 시사한다.

본 발명에서, 가용성 엔도글린에 결합하거나 이를 중화시키는 화합물은 가용성 엔도글링의 증가된 농도를 감소시켜 전자간증 또는 자간증을 포함한 임신관련 고혈압 질환을 치료하는데 사용된다. 예들 들어, 생물학적 활성의 가용성 엔도글린의 농도를 낮추도록 지시받은 RNA 간섭(RNA interference) 및 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머들뿐 아니라 가용성 엔도글린에 대한 항체들이 또한 제공된다. 또한 본 발명은 환자의 전자간증 또는 자간증과 같은 임산관련 고혈압 질환의 치료하거나 예방하기 위한, 가용성 엔도글린 농도 또는 생물학적 활성을 감소시키거나 가용성 엔도글린 결합 단백질 (예컨대, 가용성 엔도글린 결합 단밸질 (예컨대, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A(activin A), BMP(Bone Morphogenic Protein)-2 및 BMP-7), NOS 및 PGI₂(prostacyclin) 단독 또는 이들 각각의 혼합물(combination) 또는 sFlt-1의 농도를 감소시키거나 VEGF 또는 PlGF의 농도 또는 활성을 증가시키는 임의의 화합물과의 혼합물)(참조예, U.S. Patent Application Publication Numbers 20040126828, 20050025762 및 20050170444, 및 PCT Publication Numbers WO 2004/008946 및 WO 2005/077007)의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있는 임의의 화합물 (예컨대, 폴리펩티드, 저분자, 항체, 핵산 및 미메틱(mimetic))을 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명은 전자간증 및 자간증을 포함한 임신관련 고혈압 질환의 조기 진단 및 관리를 위한 검출 수단(detection tool)으로서, 가용성 엔도글린, 단독 또는 sFlt-1, VEGF, PlGF, TGF-β, eNOS 또는 PGI₂와의 복합체(combination)의 농도를 측정하는 방법인 것을 특징으로 한다.

따라서 첫 번째 양태에서, 본 발명은 환자의 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 환자에게 (i) 가용성 엔도글린 발현 농도 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물 및 (ii) sFlt-1 발현 농도 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물을 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는데, 상기 투여는 상기 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 시간 및 양으로 투여되는 것을 특징으로 한다. 임신관련 고혈압 질환은, 예컨대 전자간증(pre-eclampsia), 자간증(eclampsia), 임신성 고혈압(gestational hypertension), 만성 고혈압(chronic hypertension), HELLP 증후군(HELLP syndrome) 및 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신을 포함한다. 바람직하게는 상기 임신관련 고혈압 질환은 전자간증 또는 자간증이다.

가용성 엔도글린 또는 sFlt-1 발현 농도 또는 생물학적 활성에 대한 분석 방법들은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있다. 바람직하게는, 화합물들은 가용성 엔도글린 또는 sFlt-1 발현 농도 또는 생물학적 활성을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상까지 감소시킬 것이다. 가용성 엔도글린 발현 농도 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물의 비-제한적인 예들은 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 임의의 화합물, 예를 들어 정제된 가용성 엔도글린 항체, 가용성 엔도글린 항원-결합 단편, 또는 가용성 엔도글린 결합 단백질 (예컨대, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP-2 및 BMP-7)을 포함한다.

가용성 엔도글린 발현 농도 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물의 추가적인 예들은 단백분해효소 (예컨대, 기질 메탈로프로테이나제(MMP), 카텝신 및 엘라스타제) 또는 가용성 엔도글린에 결합 가능한 성장인자의 농도를 증가시키는 화합물을 저해하는 임의의 화합물을 포함한다. TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP-2, BMP-7 또는 그의 단편들과 같은 성장인자들은 사이클로스포린(cyclosporine), 알파 토코페롤(alpha tocopherol), 메티세르자이드(methysergide), 브로모크립틴(bromocriptine) 및 알도메트(aldomet)와 같은 가용성 엔도글린에 결합 가능한 성장인자의 농도를 증가시키는 화합물의 예이다.

sFlt-1 발현 농도 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물의 비-제한적인 예들은 정제된 sFlt-1 항체 또는 sFlt-1 항원-결합 단편과 같은 sFlt-1에 특이적으로 결합 가능한 화합물을 포함한다; 이러한 화합물들은 니코틴(nicotine), 테오필린(theophylline), 아데노신(adenosine), 니페디핀(nifedipine), 미녹시elf(minoxidil) 및 황산 마그네슘(magnesium sulfate)과 같은 sFlt-1에 결합 가능한 성장인자, VEGF (예컨대, VEGF121, VEGF165 또는 VEGF의 변형된 형태), PlGF 또는 그의 단편들의 농도를 증가시킨다.

상기 방법의 바람직한 구현예에 있어서, 가용성 엔도글린 발현 농도 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물이거나, sFlt-1 발현 농도 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물, 또는 둘 모두는, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상까지 산화질소 합성효소(NOS) 활성을 또한 증가시킬 수 있다. NOS 활성에 대한 분석 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있으며 본 명세서에 개시되어 있다.

두 번째 양태에서, 본 발명은 환자의 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법으로서, 환자에게 NOS의 발현 농도 또는 생물학적 활성을 증가시킬 수 있는 화합물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 투여 단계는 환자에 있어서 상기 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 시간 및 양으로 투여되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 NOS는 eNOS이다. 하나의 구현예에서, 상기 화합물은 VEGF (예컨대, VEGF121, VEGF165 또는 VEGF의 변형된 형태) 또는 그의 생물학적 활성 단편들이거나, PlGF 또는 그의 생물학적 활성 단편과 같은 eNOS의 Ser1177의 인산화를 증가시키는 화합물이다. 다른 구현예에서, 상기 화합물은 TGF-β1 또는 TGF-β3, 액티빈 A, BMP-2 및 BMP-7와 같은 eNOS의 Thr495의 탈인산화를 증가시키는 화합물이다. 다른 구현예에서, 상기 화합물은 eNOS의 농도의 감소를 방지하거나 eNOS의 안정성을 증가시키는 화합물이다.

선택적으로, 상기 방법은 환자에게 가용성 엔도글린 발현 농도 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물을 투여하는 것을 더 포함하는데, 상기 투여는 환자에 있어서 상기 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 것을 특징으로 한다. 가용성 엔도글린 발현 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물의 비-제한적인 예들은 엔도글린에 특이적으로 결합하는 정제된 항체 또는 가용성 엔도글린 항원-결합 단편, 또는 기질 메탈로프로테이나제(MMP), 카텝신 및 엘라스타제로 구성된 군에서 선택된 단백분해효소를 저해하는 화합물, 또는 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP-2, BMP-7 또는 그의 단편들과 같은 성장인자를 포함한다. 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 대표적인 항체들은 도 30B에 보여지는 인간 엔도글린 서열의 26 내지 437, 40 내지 406, 또는 26 내지 587 아미노산들로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 결합하는 항체들을 포함한다. 본 발명의 상기 방법에 사용될 수 있는 추가적인 대표적 항체들은 도 30B에 보여지는 인간 엔도글린 서열의 40 내지 86, 144 내지 199, 206 내지 222, 289 내지 304, 또는 375 내지 381 아미노산들을 포함하는 인간 엔도글린의 에피토프(epitope)에 결합하는 항체를 포함한다.

다른 구현예에서, 상기 임신관련 고혈압 질환은 정상 기준(normal reference)과 비교하여 sFlt-1 폴리펩티드의 증가된 농도에 의해 특징되어 진다. 선택적으로, 상기 방법은 환자에게 sFlt-1 발현 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물을 투여하는 것을 더 포함하는데, 상기 투여는 환자에 있어서 상기 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 것을 특징으로 한다. 가용성 sFlt-1 발현 또는 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물의 비-제한적인 예들은 sFlt-1에 특이적으로 결합하는 정제된 항체 또는 sFlt-1 항원 결합 단편, 또는 VEGF (예컨대, VEGF121, VEGF165 또는 VEGF의 변형된 형태), PlGF 또는 sFlt-1에 결합하는 그의 단편들과 같은 성장인자를 포함한다.

상기 방법들 중 어느 하나를 위해, 상기 방법은 환자에게 항-고혈압 화합물을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법들 중 어느 하나의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 환자는 임신한 사람, 분만 후의 사람(post-partum human) 또는 비-인간 (예컨대, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 개 및 고양이)이다.

상기 방법들 중 어느 하나를 위해, 상기 방법은 상기 환자의 상기 임신관련 고혈압 질환을 모니터링하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 상기 모니터링은 환자로부터 얻은 혈청 또는 혈장에서 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도를 측정하는 것을 포함한다. 만약 상기 가용성 엔도글린의 절대 농도(absolute level)가 결정되면, 25 ng/ml 이하의 가용성 폴리펩티드의 농도는 상기 임신관련 고혈압 질환의 개선을 나타낸다. 선택적 또는 추가적으로, 상기 가용성 엔도글린 농도는 2 이상의 경우(occasion)에서, 또는 양성 기준 샘플 (예컨대, 임신관련 고혈압 질환으로 고통받는 환자로부터 얻은 것)과 비교하여 측정될 수 있는데, 여기서 상기 각 측정값들 사이 또는 상기 양성 기준과 비교한 것에서 상기 가용성 엔도글린의 농도의 감소는 상기 임신관련 고혈압 질환의 개선의 인디케이터(indicator)인 것을 특징으로 한다. 상기 가용성 엔도글린 농도의 측정은 면역학적 분석(immunological assay)의 사용을 포함할 수 있다. 상기 가용성 엔도그린은 유리(free), 결합(bound) 또는 전체(total) 가용성 엔도글린이거나 분해(degradation) 또는 효소적 절단(enzymatic cleavage)에 기인한 엔도글린 폴리펩티드의 농도를 포함할 수 있다. 또한 상기 모니터링 방법은 전자간증 또는 자간증의 진단을 위해 본 명세서에 기술된 메트릭(metrics)의 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 모니터링 방법은 환자에 있어서 3기로 나눠진 임신기간의 1기 및 2기(first and second trimesters)에서 상기 sFlt-1 및 가용성 엔도글린의 농도를 측정하여 다음의 식(equation)을 사용한 각 시기(trimester)에서 sFlt1 × 가용성 엔도글린(sEng)의 델타 값(delta value)을 계산하는 것을 포함할 수 있다: [dproduct = 2기에서 (sFlt1 × sEng) - 1기에서 (sFlt1 × sEng)], 여기서 그 프랙션(fractions)을 포함한 0, 1, 2 또는 그 보다 큰 값 (예컨대, 양의 값(positive value))은 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터이다. 상기 초과한 값(the value over time)에서 감소는 상기 임신관련 고혈압 질환의 개선을 나타낸다. 다른 예에서, 상기 1기 및 2기 사이의 상기 sFlt-1 농도(dsFlt-1) 또는 sEng 농도(dsEng)에 대한 상기 델타 product 값은 계산되며, 그 프랙션을 포함한 0, 1, 2 또는 그 보다 큰 값, 예컨대 (dsFlt-1) 또는 (dsEng)에 대한 양의 값(positive value)은 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터이다.

상기 임의의 모니터링 방법들에 있어서, 상기 방법은 상기 화합물의 치료 용량(therapeutic dosage)을 결정하는데 사용될 수 있다. 또한 상기 방법은 상기 환자로부터 얻은 샘플에서 적어도 하나의 sFlt-1, VEGF 또는 PlGF 폴리펩티드의 농도 및 이들을 측정하는 것을 더 포함할 수 있으며, 또한 이들 농도 사이의 관계는, 필수는 아니지만, 메트릭을 사용하여 계산될 수 있다. 대표적인 메트릭은 상기 기술된 바와 같이, [(sFlt-1 + 0.25 가용성 엔도글린)/PlGF], [(가용성 엔도글린 + sFlt-1)/PlGF], [sFlt-1 × 가용성 엔도글린], 그리고 상기 dsFlt-1, dsEng 및 [dproduct = 2기에서 (sFlt1 × sEng) - 1기에서 (sFlt1 × sEng)]를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 특징으로 하는데, 여기서 상기 항체는 도 30B에 보여지는 인간 엔도글린 서열의 40 내지 86, 144 내지 199, 206 내지 222, 289 내지 304, 또는 375 내지 381 아미노산들을 포함하는 인간 엔도글린의 에피토프에 결합한다. 하나의 구현예에서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 가용성 엔도글린에 성장인자 (예컨대, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP-2 및 BMP-7)의 결합을 차단한다.

상기 항체는 모노클로날 항체(monoclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체(human antibody)를 포함한 항체 또는 항체 단편의 임의의 타입일 수 있으며, 항체는 Fc부가 결여되고 F(ab')2, Fab 또는 Fv 구조이다. 하나의 구현예에서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 약학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)에 존재한다.

다른 양태에서, 본 발명은 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인(predisposition)을 갖는 환자의 진단 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자로부터 얻은 샘플에서 가용성 엔도글린 폴리펩티드, 및 가용성 엔도글린 결합 단백질들 (예컨대, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP2 및 BMP 7)과 가용성 엔도글린 시그널링의 하류 매개인자(downstream mediators) (예컨대, eNOS 및 PGI₂)로 구성된 군에서 선택된 추가적인 폴리펩티드의 농도를 측정하는 것을 포함하는데, 여기서 정상 기준 샘플, 표준(standard) 또는 농도와 비교하여 상기 가용성 엔도글린 농도의 증가 및 상기 적어도 하나의 추가적인 폴리펩티드 농도의 감소는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 가능성(propensity)의 진단 인디케이터인 것을 특징으로 한다.

다른 양태에서, 본 발명은 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자로부터 얻은 가용성 엔도글린 폴리펩티드 및 sFlt-1 폴리펩티드의 농도를 측정하고 [가용성 엔도글린 × sFlt-1] 메트릭을 사용하여 상기 가용성 엔도글린 및 sFlt-1의 농도 사이의 관계를 계산하는 것을 포함하는데, 여기서 정상 기준 샘플에 비해 상기 환자 샘플에서 상기 메트릭의 증가는 환자의 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터인 것을 특징으로 한다.

다른 양태에서, 본 발명은 임신관련 질환 또는 그 발병소인을 갖는 환자의 진단 방법으로서, 상기 방법은 환자에 있어서 임신 1기(first trimester)와 2기(second trimester)에서 sFlt-1 및 가용성 엔도글린의 농도를 측정하여 다음의 메트릭을 사용하여 각 시기(trimester)에서 sFlt1 × 가용성 엔도글린(sEng)의 델타 값을 계산하는 것을 포함하는데: [dproduct = 임신 2기에서 (sFlt1 × sEng) - 임신 1기에서 (sFlt1 × sEng)], 여기서 그 프랙션을 포함한 0, 1, 2 또는 그 보다 큰 값 (예컨대, 양의 값(positive value))은 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터인 것을 특징으로 한다. 또한 양의 값은 조기 전자가증(pre-term pre-eclampsia)의 인디케이터일 수 있다. 그러한 측정은 임신 1기와 2기 동안 다수의 경우(occasion)에서 수행될 수 있으며 상기 dproduct는 그 이상이 더 수행될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법으로서, 상기 방법은 환자에 있어서 상기 임신 1기와 2기에서 sFlt-1과 가용성 엔도글린의 농도를 측정하여 상기 임신 1기와 2기 사이의 상기 sFlt-1 농도(dsFlt-1) 또는 sEng 농도(dsEng)에 대한 delta product를 계산하는 것을 포함하는데, 여기서 (dsFlt-1) 또는 (dsEng)에 대한, 그 프랙션(fractions)을 포함한 0, 1, 2 또는 그 이상 보다 큰 값 (예컨대, 양의 값(positive value))은 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 진단 방법 중 하나를 위해, 상기 측정은 ELISA와 같은 면역학적 분석법의 사용을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 정상 기준 샘플은 상기 환자로부터 얻은 이전 샘플(prior sample)이다. 다른 구현예에서, 상기 메트릭은 또한 모체의 체질량지수(body mass index) 또는 태아의 재태기간(gestational age)을 포함한다. 상기 샘플은 상기 가용성 엔도글린이 정상적으로 검출될 수 있는 환자의 체액 (예컨대, 소변, 양수, 혈액, 혈청 및 혈장), 세포 (예컨대, 내피세포, 백혈구, 단핵구 및 태반에서 유래된 세포) 또는 조직 (예컨대, 태반 조직)일 수 있다. 상기 환자는 임신하지 않은 사람, 임신한 사람, 분만 후의 사람 또는 비-인간 (예컨대, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 개 또는 고양이)일 수 있으며 상기 방법은 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 가능성 (예컨대, 증상이 나타나기 적어도 4주전)을 진단하기 위해 사용될 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 (i) 가용성 엔도글린 결합제 및 (ii) TGF-β1, TGF-β3, eNOS 및 PGI₂로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 결합하는 적어도 하나의 추가적인 결합제, 및 (iii) 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 가능성의 진단을 위한 (i)의 상기 결합제와 (ii)의 상기 적어도 하나의 결합제의 사용설명서를 포함하는 대상의 임신관련 고혈압 질환의 진단용 키트인 것을 특징으로 한다. 상기 결합제들은 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이거나, TGF-β1, TGF-β3, eNOS 또는 PGI₂에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다.

선택적으로, 상기 키트는 또한 VEGF, sFlt-1 또는 PlGF 결합 분자를 포함할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물의 동정 방법으로서, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다: (a) 세포를 가용성 엔도글린 화합물과 접촉시키는 단계; (b) 상기 가용성 화합물과 접촉시킨 후 상기 세포에서 eNOS의 Thr495의 인산화 상태를 결정하는 단계; (c) 상기 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계; (d) 상기 후보 화합물과 접촉시킨 후 상기 세포에서 eNOS의 Thr495의 인산화 상태를 결정하는 단계; 및 (e) (b)단계와 (d)단계에서 결정된 인산화 상태를 비교하는 단계. 여기서 (b)단계와 비교하여 (d)단계에서 eNOS의 Thr495의 탈인산화의 증가는 상기 후보 화합물을 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물로서 동정한다.

다른 양태에서, 본 발명은 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물의 동정 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다: (a) 세포를 Smad2/3 의존적 리포터 구조체(Smad2/3 dependent reporter construct) 및 가용성 엔도글린 화합물과 접촉시키는 단계; (b) (a)단계의 상기 세포에서 상기 Smad2/3 리포터 구조체의 활성화 농도를 결정하는 단계; (c) (a)단계의 상기 세포를 후보물질과 접촉시키는 단계; (d) (c)단계의 상기 세포에서 Smad2/3 리포터 구조체의 활성화 농도를 결정하는 단계; 및 (e) (b)단계 및 (d)단계에서 결정된 Smad2/3 리포터 구조체의 활성화 농도를 비교하는 단계. 여기서 , (b)단계와 비교하여 (d)단계에서 상기 Smad2/3 리포터 구조체의 활성화 농도의 증가는 상기 후보 화합물을 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물로서 동정하다.

상기 양태들 중 하나를 위해, 상기 임신관련 고혈압 질환은 전자간증, 자간증, 임신성 고혈압, 만성 고혈압, HELLP 증후군 및 재태기간에 비해 작은 태아를 갖는 임신일 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 임신관련 고혈압 질환은 전자간증 또는 자간증이다.

이하 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 상기 임신관련 고혈압 질환의 병리학(pathology)을 발전시키기 위해, 가용성 엔도글린/TGF-β와 sFlt-1/VEGF/PlGF 시그널링 경로(signaling pathways) 모두의 조절이상(deregulation)이 함께 일어날 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명은 또한 U.S. Patent Application Publication Numbers 20040126828, 20050025762, 20050170444, 2006/0067937 및 20070104707, 그리고 PCT Publication Numbers WO 2004/008946, WO 2005/077007 및 WO 06/034507에 개시된 치료, 진단 또는 모니터링 방법 중 어느 하나와 본 명세서에 기술된 상기 방법들의 조합들인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 목적에 따라, 다음의 약어 및 용어가 아래와 같이 정의된다.

“변경(alteration)”은 변화(증가 또는 감소)를 의미한다. 변경은 후술하는 바와 같이 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 방법에 의해 검출되는 유전자 또는 폴리펩티드의 발현 농도의 변화를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 변경은 발현 농도의 10%의 변화, 바람직하게는 25%의 변화, 더욱 바람직하게는 발현 농도의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 변화를 포함한다. 또한 “변경(alteration)”은 본 발명의 임의의 폴리펩티드들(예컨대, 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, PlGF, eNOS 또는 TGF family member)의 생물학적 활성의 변화(증가 또는 감소)를 나타낼 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 변경은 생물학적 활성의 10% 변화, 바람직하게는 25% 변화, 더욱 바람직하게는 생물학적 활성의 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 변화를 포함한다. 가용성 엔도글린에 대한 생물학적 활성의 예들은 혈관형성(angiogenesis) 및 액티빈 A, BMP 2, BMP-7, TGF-β1 및 TGF-β3와 같은 기질들과의 결합(binding to substrates)이다. 이러한 분석법의 예는 엔도글린 시그널링(endoglin signaling)의 길항작용(antagonism)이 모세관 형성시 질량 손실을 초래하는 시험관내 매트리겔 내피 튜브 형성 분석법(in vitro matrigel endothelial tube formation assay)이 있다 (Li et al., Faseb Journal 14:55-64 (2000)). eNOS에 대한 생물학적 활성의 예들은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있으며 산소와 아르기닌(arginine)으로부터 산화질소(nitric oxide) 또는 “NO"의 형성을 촉매하는 것을 포함한다. TGF-β에 대한 생물학적 활성의 예들은 많은 세포 타입에서 성장, 분화, 운동성(motility), 조직재건(tissue remodeling), 신경생성(neurogenesis), 상처 복구(wound repair), 세포사멸(apoptosis) 및 혈관형성의 조절을 포함한다. 이러한 활성들은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있거나 본 명세서에 기술된 분석법들에 의해 측정될 수 있다. 또한 TGF-β는 많은 세포 타입에서 세포 증식을 저해하고 기질 단백질들(matrix proteins)의 합성을 자극할 수 있다. PlGF 또는 VEGF에 대한 생물학적 활성의 다른 예들은 PlGF 또는 VEGF의 생물학적 활성의 다른 예들은 면역 분석법, 리간드 결합 분석법 또는 Scatchard plot 분석법에 의해 측정되는 바와 같은 수용체들에 대한 결합 및 BrdU 라벨(BrdU labeling), 세포 계수 실험법(cell counting experiments), 또는 ³H-티미딘 편입 분석법(³H-thymidine incorporation)과 같은 DNA 합성에 대한 정량 분석법(quantitative assays)에 의해 측정되는 바와 같은 세포 증식 또는 이동의 유발을 포함한다. sFlt-1에 대한 생물학적 활성의 예들은 면역 분석법, 리간드 결합 분석법, 또는 Scatchard plot 분석법에 의해 측정되는 바와 같은 PlGF 및 VEGF에 대한 결합을 포함한다. 각각의 폴리펩티드들에 대한 생물학적 활성 분석법의 추가적인 예들은 본 명세서에 개시되어 있다.

"안티센스 뉴클레오베이스 올리고머(antisense nucleobase oligomer)"는 길이에 무관하게, 엔도글린 유전자의 mRNA 또는 코드화 가닥(coding strand)에 상보적인 뉴클레오베이스 올리고머를 의미한다. "뉴클레오베이스 올리고머(nucleobase oligomer)"는 연결기들(linkage groups)에 의해 서로 연결된, 8 이상의 뉴클레오베이스들, 바람직하게는 12 이상, 그리고 가장 바람직하게는 16 이상의 염기들의 사슬을 포함하는 화합물을 의미한다. 이러한 정의에 포함되는 것은 단백질 핵산(Protein Nucleic Acids), 록 핵산(locked nucleic acids) 및 아라비노 핵산(arabinonucleic acids)과 같은 올리고뉴클레오티드 미메틱(oligonucleotide mimetics)뿐 아니라, 변형된 및 변형되지 않은 것 모두, 자연의 및 비-자연의 올리고뉴클레오티드들을 모두이다. 다수의 뉴클레오베이스들 및 연결기들은 참조로서 본 명세서에 편입된, U.S. Patent Publication Nos. 20030114412 (예를 들어 공개문 단락 27-45 참조) 및 20030114407 (예를 들어 공개문 단락 35-52 참조)에 개시된 것들을 포함하여, 본 발명의 뉴클레오베이스 올리고머들로 이용될 수 있다. 또한 뉴클레오베이스 올리고머는 번역의 개시 및 종결 사이트로 표적화 될 수 있다. 바람직하게는 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머는 약 8 내지 30 뉴클레오티드들을 포함한다. 또한 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머는 엔도글린 mRNA 또는 DNA에 상보적인 적어도 40, 60, 85, 120 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드들을 포함할 수 있고, 전장(full-length) mRNA 또는 유전자일 수 있다.

“결합(binding)”은 두 분자들이 서로 붙잡고 있는 비-공유 또는 공유 결합, 바람직하게는 비-공유결합을 의미한다. 예를 들어, 이러한 두 분자들은 리간드와 그의 수용체, 효소와 그의 저해제, 효소와 그의 기질, 또는 항체 및 항원일 수 있다. 비-공유 결합들은 수소결합(hydrogen bonding), 전하기들 사이의 이온결합들(ionic interactions), 반 데르 발스 결합(van der Waals interactions) 및 비-극성기 사이의 소수성 결합(hydrophobic interactions)을 포함하는데, 이에 한정되지는 않는다. 하나 이상의 이러한 상호작용들은 각각에 대한 두 분자들의 결합을 매개할 수 있다.

"체질량 지수(body mass index)"는 키 및 체중을 이용하여 구해지는, 체중이 건강 범위 내에 포함되는지 아닌지를 일반적으로 나타내주는 수를 의미한다. 체질량 지수를 결정하는데 일반적으로 사용되는 공식은 인간의 체중(kg)을 키(m)의 제곱으로 나눈 값, 즉 체중(kg)/(키(m))² 이다.

"화합물(compound)"은 임의의 저분자 화학적 화합물 (peptidyl 또는 non-peptidyl), 항체, 핵산 분자, 폴리펩티드, 또는 그의 단편들을 의미한다. 본 발명의 치료 방법들에 특히 유용한 화합물들은 가용성 엔도글린의 농도 또는 생물학적 활성이 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 변경되거나, 바람직하게 감소될 수 있다.

"키메라 항체(chimeric antibody)"는 하나 이상의 다른 단백질의 부분(전형적으로 면역글로불린 불변 도메인(immunoglobulin constant domain))에 연결된 항체 분자의 하나 이상의 항원-결합부(antigen-binding portion)를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.

"이중-가닥 RNA(double-stranded RNA: dsRNA)"은 센스 및 안티-센스 가닥을 둘 다 포함하는 리보핵산 분자(ribonucleic acid molecule)를 의미한다. dsRNAs는 전형적으로 RNA 간섭(RNA interference)을 매개하는 데 사용된다.

또한 CD105로도 알려진, "엔도글린(endoglin)"은 엔도글린의 생물학적 활성을 갖는 포유동물의 성장인자(Fonsatti et al., Oncogene 22:6557-6563, 2003; Fonsatti et al., Curr. Cancer Drug Targets 3:427-432, 2003)를 의미하고, 임의의 다음의 GenBank accession numbers 중 임의의 것으로 한정되는 단백질에 대해 상동성이 있다: AAH29080 및 NP_031958(마우스); AAS67893(랫트); NP_000109, P17813, VSP_004233 및 CAA80673(돼지); CAA50891 및 AAC63386(인간), 또는 U.S. P.N. 6,562,957에 개시된 것. 엔도글린은 태반으로부터의 융합세포영양막(syncytiotrophoblasts) 및 증식하는 혈관내피 세포들에서 높은 농도로 발현되는 동종이합체의 세포막 당단백질(homodimeric cell membrane glycoprotein)이다. 47개의 아미노산들에 의해 그들의 세포질 테일들(tails)에 차이가 있는 L 및 S, 두 가지의 별개의 엔도글린의 이소폼들(isoforms)이 있다. 이소폼들 둘 다는 본 명세서에서 사용된 바와 같이 엔도글린에 포함된다. 엔도글린은 TGF-β의 존재시, TGF-β 패밀리 멤버들에 결합하고, 엔도글린은 TGF-β 시그널링 수용체들 RI 및 RII에 관련될 수 있고, 성장 인자들에 대한 반응을 강화할 수 있다. 엔도글린의 생물학적 활성은 액티빈-A, BMP-2, BMP-7, TGF-βl 및 TGF-β3과 같은 TGF-β 패밀리 멤버들과 같은 기질들에 대한 결합; 혈관 형성의 유발, 세포 증식, 부착(attachment), 이동, 침입(invasion)의 유도; 및 내피 세포의 활성화를 포함한다. 엔도글린의 생물학적 활성의 분석법들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있고, 리간드 결합 분석법들 또는 Scatchard plot 분석법; BrdU 라벨, 세포 계수 실험법, 세포 증식의 측정시 사용되는 ³H-티미딘 편입 분석법과 같은 DNA 합성 분석을 위한 정량 분석법들; 및 본 명세서 또는 McCarty et al., Intl. J. Oncol. 21:5-10, 2002; Akhtar et al. Clin. Chem. 49:32-40, 2003; 및 Yamashita et al, J. Biol. Chem. 269:1995-2001, 1994에 개시된 바와 같은 혈관형성 분석법들을 포함한다.

"가용성 엔도글린 폴리펩티드(soluble endoglin polypeptide)" 또는 “sEng”는 엔도글린 단백질의 세포외부(extracellular portion)의 하나 이상의 부분을 포함하는 엔도글린의 임의의 순환하는(circulating), 막에 결합하지 않은 형태(non-membrane bound form)를 의미하고, 실질적으로 엔도글린 단백질의 세포외부를 코딩하는 아미노산 서열에 상동성(예컨대, 60%, 70%, 80%, 90%, 995%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)이 있다 (도 1 및 2B 참조). 가용성 엔도글린은 단백질 분해효소(proteolytic enzyme)에 의한 엔도글린의 막 결합 형태의 절단(cleavage)으로부터 기인할 수 있다. 하나의 잠재적인 절단 사이트(potential cleavage site)는 펩티드 선도 서열(peptide leader sequence)을 포함하는, 1-437 아미노산의 엔도글린 폴리펩티드를 포함하는 가용성 엔도글린 폴리펩티드를 생성하는 437 아미노산에 있으며, 이는 전형적으로 ER (도 3A 및 3B 참조) 또는 실질적으로 의 1-437 아미노산의 엔도글린 폴리펩티드에 상동성이 있는 단백질에서 절단된다. 본 발명에 의해 예상된 가용성 엔도글린의 추가적인 형태들은 도 30B에 보여지는 아미노산 40 (글리신) 내지 406 (아르기닌)의 인간 엔도글린에 실질적으로 상동성이고, 아미노산 1 내지 587의 인간 엔도글린 (R&D Systems, 카탈로그 넘버 1097-EN으로부터 상업적으로 입수 가능한, 펩티드 선도 서열을 포함하는 전체 세포외 도메인)에 실질적으로 상동성이며, 도 30B (이는 펩티드 선도 서열을 제외한 전체 세포외 도메인이다)에 보여지는 아미노산 40 내지 587의 인간 엔도그린에 실질적으로 상동성인 단백질, 도 30B에 볼드체 및 언더라인으로 확인되는 펩티드를 포함하는 임의의 폴리펩티드, 및 TGF-β 또는 TGF-β 수용체들에 결합하는데 필요한 가용성 엔도글린의 부위들(regions) 또는 도메인들을 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다.

엔도글린 및 가용성 엔도글린 둘 다의 넘버링(numbering)은 선도 펩티드 서열이 포함되는지에 달려있다는 것을 주목해야 한다. 도 30B에 보여지는 엔도글린의 넘버링은, 아미노산 26에서 시작된다 (여기서 삭제된 선도 펩티드 서열은 아미노산 1-25가 될 것이다). 또한 가용성 엔도글린은 엔도글린의 효소적 분해로부터 기인하고 엔도글린의 생물학적 활성을 유지하는 순환 분해 산물들(circulating degradation products) 또는 단편들을 포함할 수 있다. 바람직하게는 가용성 엔도글린 폴리펩티드들은 TGF-β 패밀리 멤버들 또는 TGF-β 수용체들과 같은 기질들에의 결합, TGF-β 패밀리 맴버들의 생물학적 활성의 저해, 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그이상의 혈관형성의 역행(reversing) 또는 저해와 같은 가용성 엔도글린 생물학적 활성을 가진다. 이러한 활성들에 대한 분석법의 예들은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있으며 참조로서 본 명세서에 편입된, 미국 특허 공개 제20060067937호, 제20050267021호 및 제20070104707호, 그리고 PCT 공개 WO 06/034507에 개시되어 있다. 예를 들어, 가용성 엔도글린의 생물학적 활성은 TGF-β에 의해 유도되는 혈관형성을 역행, 감소 또는 저해할 가능성, 또는 Smad 2/3 또는 Smad 2/3 의존적 전사 활성화(Smad 2/3 dependent transcriptional activation)의 활성화를 역행할 가능성을 포함할 수 있다. 가용성 엔도글린 폴리펩티드들은 포유동물 조직 또는 세포들 (예컨대, 태반 조직 또는 세포들)과 같은 다양한 근원(sources)으로부터 분리되거나 재조합 또는 합성 방법들에 의해 제조될 수 있다. 또한 용어 가용성 엔도글린은 폴리펩티드, 단편들, 유도체들(derivatives), 유사체들(analogs) 및 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 변이체(variants)에 대한 변형들, 예컨대 하기에 개시된 것의 예들을 포함한다.

“엔도글린 핵산(endoglin nucleic acid)”은 상기 기술된 엔도글린 단백질들을 코딩(encode)하는 핵산을 의미한다. 예를 들어, 인간 엔도글린에 대한 유전자는 14 엑손들(exons)로 구성되는데, 상기 엑손 1은 시그널 펩티드 서열(signal peptide sequence)을 코딩하고, 엑손들 2-12는 세포외 도메인(extracellular domain)을 코딩하고, 엑손 13은 막통과 도메인(transmembrane domain)을 코딩하고, 엑손 14는 C-터미널 세포질 도메인(C-terminal cytoplasmic domain)을 코딩한다 (도 1, 2A 및 2B 참조). 바람직하게는, 엔도글린 핵산은 상기 개시되거나 도 2A에 설명되어 있는 핵산 서열에 실질적으로 상동성 (60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)이 있는 임의의 가용성 엔도글린 폴리펩티드들을 코딩한다. 순환 단백질(circulating protein)은 펩티드 선도 서열(아미노산 1-25)이 없는 것으로 예측된다는 것을 주목해야 한다.

“에피토프(epitope)”는 선형 구조(linear structure) 또는 3차원 구조(three dimensional conformation)의 결과로서, 항체에 대한 결합 부위(binding site)를 형성하는 아미노산들의 서열을 의미한다.

“발현(expression)”은 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 방법에 의한 유전자 또는 폴리펩티드의 검출(detection)을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드 발현은 종종 웨스턴 블롯팅(western blotting)에 의해 검출되고, DNA 발현은 종종 서던 블롯팅(Southern blotting) 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해 검출되고, RNA 발현은 종종 노던 블롯팅(northern blotting), PCR 또는 RNAse 프로텍션 분석법들(RNAse protection assays)에 의해 검출된다. 단백질 발현 농도를 측정하는 방법들이 일반적으로 포함되나, 이에 한정되지는 않는다: 웨스턴 블롯(Western blot), 면역 블롯(immunoblot), 효소-결합 면역흡수 분석(enzyme-linked immunosorbant assay: ELISA), 방사선면역분석(radioimmunoassay: RIA), 면역침전(immunoprecipitation), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 화학발광(chemiluminescence), 형광편광(fluorescent polarization), 인광(phosphorescence), 면역조직화학적 분석(immunohistochemical analysis), 매트릭스-지원 레이저 이탈/이온화 비행시간형 질량분석장치(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry), 미세세포분석기(microcytometry), 마이크로어레이(microarray), 현미경(microscopy), 형광활성 세포분류기(fluorescence activated cell sorting: FACS) 및 유세포분석기(flow cytometry)뿐 아니라, 효소적 활성 또는 다른 단백질 파트너들과 상호작용에 제한되지 않는, 단백질의 특성에 기초한 분석법들. 전형적인 분석법들은 U.S. Patent Application Publication No. 2006/0067937 및 PCT Publication No. WO 06/034507에 상세하게 개시되어 있다. 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 또는 50%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 가용성 엔도글린 농도들을 감소시키는 임의의 화합물은 본 발명의 치료적 화합물로 간주된다.

“단편(fragment)”은 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 부분(portion)을 의미한다. 이러한 부분은 바람직하게는 기준 핵산 분자 또는 폴리펩티드 전장의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상을 포함한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 1750, 1800 또는 그 이상의 뉴클레오티드들 또는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 640 또는 그 이상의 아미노산들을 포함할 수 있다. 가용성 엔도글린의 전형적인 단편들은 1 내지 437 아미노산들 (선도 서열을 포함한), 26 내지 437 아미노산들(선도 서열을 제외한), 40 내지 406 아미노산들 또는 1 내지 587 아미노산들, 그리고 1 내지 1311, 10 내지 1311, 80부터 1030 또는 1 내지 1761 뉴클레오티드들을 포함한다.

"재태기간(gestational age)"은 보통 주(weeks)로써 언급되는 모체의 최종 월경기간의 첫날로부터 기산하는, 태아의 나이에 대한 기준을 의미한다.

“임신성 고혈압(gestational hypertension)”은 임신 20주 이후에 단백뇨(proteinuria) 없이 고혈압(high blood pressure)이 발병하는 것을 의미한다.

“전자간증 또는 자간증의 병력(history of pre-eclampsia or eclampsia)”은 환자 자신 또는 관련된 가족 구성원들이 이전에 전자간증 또는 자간증 또는 임신 유래 고혈압으로 진단받은 것을 의미한다.

“상동성(homologous)”은 비교 서열(comparison sequence)의 길이 전체에 걸쳐 알려진 유전자 또는 단백질 서열에 대해 30% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 및 가장 바람직하게는 90% 또는 그 이상의 상동성을 갖는 임의의 유전자 또는 단백질 서열을 의미한다. 또한 “상동성(homologous)” 단백질은 비교 단백질(comparison protein)의 적어도 하나의 생물학적 활성을 가질 수 있다. 일반적으로, 단백질에 대해서는, 비교 서열들의 길이는 적어도 10 아미노산 이상, 바람직하게는 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 437 또는 적어도 587 아미노산 또는 그 이상일 것이다. 핵산에 대해서는, 비교 서열들의 길이는 일반적으로 적어도 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1311 또는 적어도 1761 뉴클레오티드 또는 그 이상일 것이다. 또한 “상동성(homology)”은 항체들을 발생시키는데 사용되는 에피토프(epitope) 및 항체들이 지시받도록 하는 단백질 또는 그의 단편 사이에서의 실질적인 유사성을 나타낼 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 상동성은 문제가 되는 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 항체들의 생산을 유도하기에 충분한 유사성을 나타낸다.

“인간화 항체(humanized antibody)”는 미리 결정된 항원(predetermined antigen)에 결합 가능한 면역글로불린 아미노산 서열 변이체(immunoglobulin amino acid sequence variant) 또는 그의 단편을 의미한다. 보통, 항체는 적어도 중쇄(heavy chain)의 가변 도메인(variable domain)뿐 아니라 경쇄(light chain)도 모두 포함할 것이다. 또한 항체는 중쇄의 CH1, 힌지(hinge), CH2, CH3, 또는 CH4 영역들을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 실질적으로 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 프래임워크 영역(framework region:FR) 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린의 아미노산 서열("임포트(import)" 서열들)을 갖는 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)을 포함한다.

일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 근원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기들을 갖는다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDR 영역들 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 면역글로불린의 그것에 대응하고, FR 영역들 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 공통 서열(human immunoglobulin consensus sequence)의 그것들인, 가변 도메인들(Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv) 중 적어도 하나, 및 전형적으로 두 개를 실질적으로 모두 포함할 것이다. 인간화 항체는 최적으로 적어도 면역글로불린 불변 영역(Fc) 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 그것을 포함할 것이다. “상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)”은 각각의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄들 내에 가변 영역들에서 세 개의 과가변 서열들(hypervariable sequences)을 의미한다. “프래임워크 영역(framework region: FR)”은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄들 세 개의 과가변 서열들(CDR)의 양 측면에 위치한 아미노산들의 서열들을 의미한다.

인간화 항체의 FR 및 CDR 영역들은 정확하게 모 서열들(parental sequences)에 대응할 필요는 없으며, 예컨대 임포트 CDR 또는 공통 FR은 그 사이트에서 CDR 또는 FR 잔기가 공통 또는 임포트 항체 중 하나에 대응하지 않도록 적어도 하나의 잔기의 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)에 의해 돌연변이가 유발될 수 있다. 이러한 돌연변이들은, 그러나, 광범위하지는 않을 것이다. 보통, 인간화 항체 잔기들의 적어도 75%, 바람직하게는 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 95%가 모 FR 및 CDR 서열들의 그것들에 대응할 것이다.

“혼성화하다(hybridize)”는 다양한 엄격성(stringency)의 조건 아래에서, 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열들, 또는 그의 부분들 사이 쌍을 이루어 이중-가닥 분자(double-stranded molecule)를 형성하는 것을 의미한다 (예컨대, Wahl and Berger Methods Enzymol. 152:399, 1987; Kimmel, Methods Enzymol. 152:507, 1987참조). 예를 들어, 엄격한 염(stringent salt)의 농도는 보통 약 750 mM 이하의 NaCl 및 약 75 mM 이하의 트리소디움 시트레이트(trisodium citrate), 바람직하게는 약 500 mM 이하의 NaCl 및 약 50 mM 이하의 트리소디움 시트레이트, 및 가장 바람직하게는 약 250 mM 이하의 NaCl 및 약 25 mM 이하의 트리소디움 시트레이트일 것이다. 저엄격성 혼성화(Low stringency hybridization)는 예컨대, 포름아마이드(formamide)와 같은 유기 용매의 부존재시 얻을 수 있는 반면에, 고엄격성 혼성화(high stringency hybridization)는 약 35% 이상의 포름아마이드 및 가장 바람직하게 약 50% 이상의 포름아마이드의 존재시에 얻을 수 있다. 엄격한 온도 조건들(Stringent temperature conditions)은 적어도 보통 약 30℃, 더욱 바람직하게는 적어도 약 37 ℃, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 혼성화 시간(hybridization time), 세정제(detergent) (예컨대 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate: SDS)의 농도, 및 캐리어 DNA(carrier DNA)의 포함(inclusion) 또는 배제(exclusion)와 같은 추가 파라미터들을 변화시키는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 엄격성의 다양한 농도는 이러한 다양한 조건들을 필요에 따라서 조합함으로써 얻어진다. 바람직한 구현예에서, 혼성화는 30℃, 750 mM의 NaCl, 75 mM의 트리소디움 시트레이트 및 1% SDS에서 이루어질 것이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 혼성화는 37℃, 500 mM의 NaCl, 50 mM의 트리소디움 시트레이트, 1% SDS, 35% 포름아미드 및 100 μg/ml 변성된(denatured) 연어 정자 DNA(salmon sperm DNA: ssDNA)에서 이루어질 것이다. 가장 바람직한 구현예에서, 혼성화는 42℃, 250 mM의 NaCl, 25 mM의 트리소디움 시트레이트, 1% SDS, 50% 포름아미드 및 200 μg/ml ssDNA에서 이루어질 것이다. 이러한 조건들의 유용한 변형은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다. 대부분의 응용을 위해, 혼성화 뒤에 이어지는 세척 단계들(washing steps)도 엄격성에서 달라질 것이다. 세척 엄격성 조건들(Wash stringency conditions)은 염 농도 및 온도에 의해 제한될 수 있다. 상술한 대로, 세척 엄격성은 염 농도를 감소시키거나 또는 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 세정 단계들에 대한 엄격한 염 농도는 바람직하게는 약 30 mM 이하의 NaCl 및 약 3 mM 이하의 트리소디움 시트레이트, 및 가장 바람직하게는 약 15 mM 이하의 NaCl 및 약 1.5 mM 이하의 트리소디움 시트레이트일 것이다. 세척 단계들에 대한 엄격한 온도 조건들은 보통 적어도 약 25℃, 더욱 바람직하게는 적어도 약 42℃ 및 가장 바람직하게는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 바람직한 구현예에서, 세척 단계들은 25℃, 30 mM NaCl, 3 mM 트리소디움 시트레이트 및 0.1% SDS에서 이루어질 것이다. 더욱 바람직한 구현예에서, 세척 단계들은 42℃, 15 mM NaCl, 1.5 mM 트리소디움 시트레이트 및 0.1% SDS에서 이루어질 것이다. 가장 바람직한 구현예에서, 세척 단계들은 68℃, 15 mM NaCl, 1.5 mM 트리소디움 시트레이트 및 0.1% SDS에서 이루어질 것이다. 이러한 조건들의 추가적인 변형은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 혼성화 기술들(hybridization techniques)은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); 및 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York에 개시되어 있다.

“자궁내 태아 발육지연(intrauterine growth retardation: IUGR)”은 태아의 재태기간에 대해 예상된 체중의 10 퍼센타일(10^th percentile) 미만의 출생 체중을 초래하는 증후군을 의미한다. 저출생 체중(low birth weight )에 대한 현재의 세계보건기구 표준은 2,500 gm (5 lbs. 8 oz.) 미만의 체중이거나 또는 미국의 인종, 출산 경력(parity) 및 태아 성(sex)에 따른 재태기간에 대한 출생시 체중의 표에 따라 10th 퍼센타일(10th percentile) 미만이다 (Zhang and Bowes, Obstet. Gynecol. 86:200-208, 1995). 또한 이러한 저출생 체중 아기들은 “재태기간에 비해 작은 태아(SGA)”로 불린다. 전자간증은 IUGR 또는 SGA와 관련된다고 알려진 이상(condition)이다.

“메트릭(metric)”은 측정을 의미한다. 메트릭은, 예를 들어, 중요한 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 농도를 비교하는데 사용될 수 있다. 전형적인 메트릭들은 비(ratios)와 같은 수학적 공식 또는 알고리즘들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 사용되는 메트릭은 전자간증 또는 자간증과 같은 임신관련 고혈압 질환 발병 환자 및 정상 대조군(normal control subject)의 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, PlGF, 또는 이들의 임의의 조합의 농도들 사이를 가장 잘 구별하는 것이다. 이용되는 메트릭에 따라서 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터는 기준값 (예컨대, 임신관련 고혈압 질환이 발병하지 않은 대조군(control subject)으로부터)보다 현저히 높거나 낮을 수 있다. 가용성 엔도글린 농도는 유리되거나, 결합되거나 (예컨대, 성장 인자에 결합), 또는 전체 (유리된 것 + 결합된 것) 가용성 엔도글린의 양을 측정함으로써 결정된다. sFlt-1 농도는 유리되거나, 결합되거나 (예컨대, 성장 인자에 결합), 또는 전체 sFlt-1 (유리된 것 + 결합된 것)의 양을 측정함으로써 측정된다. VEGF 또는 PlGF 농도는 유리된 PlGF 또는 유리된 VEGF (예컨대, sFlt-1에 결합되지 않은)의 양을 측정함으로써 결정된다. 하나의 전형적인 메트릭은 전자간증 항-혈관형성 지수(pre-eclampsia anti-angiogenic index:PAAI)로도 표현되는, [sFlt-1/(VEGF + PlGF)]이다. 다른 예는 다음의 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(anti-angiogenic index)이다: (sFlt-1 + 0.25(가용성 엔도글린 폴리펩티드))/PlGF. 이미 다른 전형적인 메트릭은 다음과 같다: (가용성 엔도글린 + sFlt-1)/PlGF. 정상 기준과 비교하여 이러한 두 가지 전형적인 메트릭의 각 값의 증가는 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터가 된다. 다른 예는 환자의 임신 1기 및 2기에서 sFlt-1과 가용성 엔도글린 농도의 측정하고 다음의 식을 사용하여 각 기(trimester)에서 sFlt-1 × 가용성 엔도글린(sEng)의 델타 값을 계산하는 것을 포함한다: dproduct = 임신 2기에서 (sFlt1 × sEng) - 1기에서 (sFlt1 × sEng), 여기서 0, 1, 2 또는 그 이상 보다 큰 값 (예컨대, 양의 값)은 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터가 된다. 추가적인 메트릭들은 임신 1기 및 2기 사이의 sFlt-1 농도 및 sEng 농도의 dproduct (dsFlt-1 및 dsEng)를 포함하는데, 여기서 (dsFlt-1) 또는 (dsEng)에 대하여 0, 1, 2 또는 그 이상 보다 큰 값 (예컨대, 양의 값)은 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터가 된다.

본 발명의 임의의 메트릭들은 모체 BMI 또는 태아의 재태기간, 또는 출산 경력(parity)을 더 포함할 수 있다. 또한 임의의 메트릭들은 eNOS, TGF-β1 또는 β3 뿐 아니라 PGI₂ 농도도 포함할 수 있다.

“산화질소 합성효소(nitric oxide synthase)” 또는 “NOS"는 산소와 아르기닌으로부터 산화질소(NO)의 생성을 촉매하는 효소를 의미한다. NOS는 몇 가지 보조인자들(cofactors)로서, 촉매 부위(catalytic site)의 일부인 헴기(heme group), N-터미널 산소화효소 도메인(N-terminal oxygenase domain), 헴-티올레이트 단백질들의 클래스(class of haem-thiolate proteins)에 속하는 것 및 NADPH:P450 환원효소에 상동성이 있는 C-터미널 환원효소 도메인(C-terminal reductase domain)을 포함하는 복합 효소(complex enzyme)이다. NOS는 L-아르기닌(L-Arg)의 구아니디노 나이트로젠(guanidino nitrogen)의 5-전자 산화(five-electron oxidation)를 촉매함으로써 NO를 생산한다. L-시트룰린(L-citrulline)에 대한 L-Arg의 산화는 중간생성물(intermediate)로서 N-하이드록시-L-아르기닌(N-hydroxy-L-arginine)을 생산하는 두 개의 단산소화반응(monooxygenation)을 통해 일어난다. 산소화효소와 환원효소 도메인들 사이의 인터도메인 링커(interdomain linker)는 CaM-결합 서열(CaM-binding sequence)을 포함한다. NO는 낮은 농도에서는 혈압 조절, 신경 전달, 학습 및 기억과 같은 다양한 생리적인 과정에서 시그널로서 기능을 하고, 높은 농도에서는 방어적 세포독소(defensive cytotoxin)로서 기능을 한다.

포유동물에서, 세 개의 별개의 유전자들은 NOS 동질효소들(isozymes)을 코딩한다: 신경의(neuronal) (nNOS 또는 NOS-1), 사이토카인-유도성 (iNOS 또는 NOS-2) 및 내피세포의 (eNOS 또는 NOS-3). eNOS는 막 결합되며 내피세포 막들에 위치하는 eNOS는 N-터미널 미리스토이레이션(myristoylation) 및 전사 후 팔미토이레이션(palmitoylation)에 의해 조절된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 NOS는 eNOS이다.

“전자간증 항-혈관 형성 지수(pre-eclampsia anti-angiogenesis index: PAAI)”는 항-혈관형성 활성의 인디케이터로서 사용되는 sFlt-1/VEGF + PlGF의 비를 의미한다. 10 이상의, 더욱 바람직하게는 20 이상의 PAAI는, 전자간증 또는 전자간증의 위험과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 나타낸다.

“가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(soluble endoglin anti-angiogenic index)” (sFlt-1 + 0.25 가용성 엔도글린)/PlGF의 비를 의미한다. 예를 들어, 75 또는 그보다 높은, 바람직하게는 100 또는 그보다 높은, 또는 더욱 바람직하게는 200 또는 그보다 높은 값은 전자간증 또는 자간증과 같은, 고혈압과 관련된 임신 합병증을 나타낸다.

“작동가능하게 연결된(operably linked)”이라 함은 적합한 분자들 (예컨대, 전사 활성인자 단백질들)이 조절 서열(regulatory sequence(s))에 결합되는 경우 유전자 발현을 허용하기 위한 방식으로 유전자 또는 조절서열이 연결되는 것을 의미한다.

“약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)”는 치료받는 포유동물에게 약학적으로 허용가능하면서 그것과 함께 투여되는 화합물의 치료 특성을 보유하는 담체를 의미한다. 하나의 전형적인 약학적으로 허용가능한 담체 물질은 생리 식염수이다. 다른 생리학적으로 허용가능한 담체들 및 그들의 제형화는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA에 개시되어 있다.

“태반 성장 인자(placental growth factor: PlGF)”는 GenBank accession number P49763으로 한정되는 단백질에 상동성이 있으며 PlGF 생물학적 활성을 갖는 포유동물의 성장 인자를 의미한다. PlGF는 VEGF 패밀리에 속하는 글리코실화 동종이량체(glycosylated homodimer)이고, 다른 스플라이싱 메카니즘들(alternative splicing mechanisms)을 통해 두개의 별개의 이소폼들로 발견될 수 있다. PlGF는 태반에서 세포영양막 및 융합세포영양막에 의해 발현되고, PlGF 생물학적 활성들은 내피 세포, 특히 영양막 세포들의 증식, 이동 및 활성화 유도를 포함한다.

"다형성(polymorphism)"은 전자간증 또는 자간증의 발병 소인을 나타내는 가용성 엔도글린, sFlt-1, PlGF 또는 VEGF 핵산 분자의 유전적 다양성(genetic variation), 돌연변이, 결실 또는 부가를 의미한다. 이러한 다형성들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어, Raab et al. (Biochem. J. 339:579-588, 1999) 및 Parry et al. (Eur. J Immunogenet. 26:321-323, 1999)에 개시되어 있다. 다형성은 프로모터 서열(promoter sequence), 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 인트론 서열(intronic sequence), 또는 유전자의 비번역 3' 영역(untranslated 3' region of a gene)에 존재할 수 있다. 엔도글린 유전자에서 이러한 다형성들로 알려진 예들은 엑손 7의 3' 말단을 지나 26 염기들에서 인트론 7로 6 염기 GGGGGA의 삽입을 포함한다 (Ann. Neurol. 41:683-6, 1997).

“임신관련 고혈압 질환(pregnancy related hypertensive disorder)”은 혈압의 증가와 관련되거나 그것을 특징으로 하는 임신과 관련된 임의의 이상(condition) 또는 질병을 의미한다. 이러한 이상들에는 전자간증 (미성숙 전자간증(premature preeclampsia), 중증 전자간증(severe pre-eclampsia)을 포함하여), 자간증, 임신성 고혈압, HELLP 증후군 (용혈(hemolysis), 간 효소의 상승, 혈소판수의 감소), 태반조기박리(abruption placenta), 만성 고혈압, 자궁내 태아 발육지연을 갖는 임신(pregnancy with intra uterine growth restriction) 및 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신을 포함한다. SGA 태아를 갖는 임신이 종종 고혈압과 관련되지 않는 경우에도, 이러한 정의에 포함됨을 주의해야 할 것이다.

“전자간증(pre-eclampsia)”은 단백뇨 또는 부종, 또는 둘 다를 수반하는 고혈압, 사구체 기능 장애(glomerular dysfunction), 뇌부종(brain edema), 간부종(liver edema), 또는 임신 또는 최근 임신의 영향에 따른 응고 이상(coagulation abnormalities)을 특징으로 하는 전신 질환(multi-system disorder)을 의미한다. 미성숙(premature), 경증(mild), 중등도(moderate) 및 중증(severe) 전자간증과 같은 전자간증의 모든 형태들이 이러한 정의에 포함된다. 전자간증은 일반적으로 임신 20주 이후에 발생한다. 전자간증은 일반적으로 다음의 증상들의 몇 가지 조합으로 정의된다: (1) 임신 20주 이후에 수축기 혈압(systolic blood pressure: BP) > 140 mmHg 및 확장기 혈압(diastolic blood pressure: BP) > 90 mmHg (일반적으로 4-168 시간 떨어져, 두 가지 경우를 측정), (2) 새로운 단백뇨의 발병 (소변 검사시 딥스틱(dipstik)에 의할 경우 1+, 24 시간 소변 회수물에서 300mg을 초과하는 단백질, 또는 단백질/크레아티닌(creatinine) 비가 0.3을 초과하는 임의의 단일 소변 샘플) 및 (3) 분만후 12주에 고혈압 및 단백뇨의 소실. 중증 전자간증은 일반적으로 (1) 확장기 혈압 BP > 110 mmHg (일반적으로 4-168 시간 떨어져, 두 가지 경우를 측정) 또는 (2) 24 시간 소변 회수물에서 3.5g 이상의 단백질 측정값 또는 딥스틱에 의할 경우 최소한 3+ 단백질을 나타내는 두 개의 랜덤 요 샘플을 특징으로 하는 단백뇨로서 정의된다. 전자간증에서, 고혈압 및 단백뇨는 일반적으로 서로 7일 이내에 발생한다. 중증 전자간증에서, 중증 고혈압, 중증 단백뇨 및 HELLP 증후군 (용혈, 간 효소의 상승, 혈소판수의 감소) 또는 자간증은 동시에 또는 한 번에 하나씩 발생할 수 있다. HELLP 증후군은 저혈소판증 (<100000 세포들/μl), 증가된 LDH (>600 IU/L) 및 증가된 AST (>70 IU/L)의 출현으로 특징된다. 때때로, 중증 전자간증은 발작(seizures)을 초래할 수 있다. 이러한 증후군의 중증 형태는 "자간증(eclampsia)"으로서 언급된다. 또한 자간증은 간 (예컨대, 간세포 손상(hepatocellular damage), 문맥주위괴사(periportal necrosis)) 및 중추신경계 (예컨대, 뇌 부종 및 뇌 출혈(hemorrhage))와 같은 몇 가지 기관 또는 조직의 장애 또는 손상을 포함할 수 있다. 발작의 병인(etiology)은 뇌부종 및 신장내 작은 혈관의 국소 연축(focal spasm)의 발생의 이차적인 것으로 생각되고 있다.

“미성숙 전자간증(premature pre-eclampsia)”은 37주 미만 또는 34주 미만에 증상이 발병하는 경우의 전자간증을 의미한다.

“프로스타사이클린(prostacyclin)”또는 “PGI₂”는 에이코사노이드(eicosanoids)로 알려진 지질 분자의 패밀리 멤버이다. 프로스타사이클린 합성효소의 작용에 의해 프로스타글라딘 H2(prostaglandin H2: PGH2)로부터 내피 세포들에서 생산되고 혈관 내피 세포 및 평활근(smooth muscle)에 의해 주로 합성된다. PGI₂ 생물학적 활성은 혈소판 응집, 평활근의 이완, 직접적인 혈관확장에 의한 전신 및 폐 혈관 저항(systemic and pulmonary vascular resistance), 및 신장에서 나트륨뇨배설(natriuresis)의 저해를 포함한다.

“단백질(protein)” 또는 “폴리펩티드(polypeptide)” 또는 “폴리펩티드 단편(polypeptide fragment)”은 번역후 변형(posttranslational modification) (예컨대, 당화(glycosylation) 또는 인산화)과 상관없이, 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 또는 펩티드의 전부 또는 일부를 구성하거나, 또는 비-자연 발생의 폴리펩티드 또는 펩티드를 구성하는 임의의 둘 이상의 아미노산들의 사슬을 의미한다.

“기준 샘플(reference sample)”은 비교 목적으로 사용되는 임의의 샘플, 표준, 또는 농도를 의미한다. “정상 기준 샘플(normal reference sample)”은 동일한 환자로부터 이전에 채취한 샘플, 전자간증 또는 자간증과 같은 임신관련 고혈압 질환을 앓지 않는 임신한 환자로부터의 샘플, 임신한 환자이지만 샘플이 임신 초기 (예컨대, 임신 1기 또는 2기 또는 전자간증 또는 자간증과 같은 임신관련 고혈압 질환의 검출 이전의)에 채취된 샘플, 임신한 환자이지만 샘플이 전자간증 또는 자간증과 같은 임신관련 고혈압 질환의 병력이 없는 환자로부터 채취된 샘플, 임신하지 않은 환자이지만 알려진 정상 농도에서 정제된 기준 폴리펩티드의 샘플(예컨대, 전자간증 또는 자간증과 같은 임신관련 고혈압 질환은 나타나지 않음)일 수 있다. “기준 표준 또는 농도(reference standard or level)”은 기준 샘플로부터 유래된 값 또는 수를 의미한다. 정상 기준 표준 또는 농도는 다음 척도(criteria)들 중 적어도 하나에 의해 샘플 환자에 매치되는 정상 환자로부터 유래된 값 또는 수일 수 있다: 태아의 재태기간, 모체의 연령, 임신 전 모체의 혈압, 임신 중 모체의 혈압, 모체의 BMI, 태아의 체중, 전자간증 또는 자간증의 사전 검사(prior diagnosis) 및 전자간증 또는 자간증의 가족력. “양성 기준(positive reference)” 샘플, 표준 또는 값은 다음 척도(criteria)들 중 적어도 하나에 의해 샘플 환자에 매치되는, 전자간증 또는 자간증과 같은 임신관련 고혈압 질환이 발병한 것으로 알려진 환자로부터 유래된 샘플 또는 값 또는 수이다: 태아의 재태기간, 모체의 연령, 임신 전 모체의 혈압, 임신 중 모체의 혈압, 모체의 BMI, 태아의 체중, 임신관련 고혈압 질환의 사전 검사 및 임신관련 고혈압 질환의 가족력.

“감소하다 또는 저해하다(reduce or inhibit)"라 함은 치료받지 않은 샘플들과 비교할 때, 상기 언급한 분석법들 ("발현(expression)" 참조)에 의해 검출된, 단백질 또는 핵산 농도에서 바람직하게는 20% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 변화의 전체적인 감소를 일으키는 능력을 의미한다.

“샘플(sample)”은 환자로부터 얻은 조직 생검(tissue biopsy), 세포, 체액 (예컨대, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 침, 양수, 또는 뇌척수액) 또는 다른 표본을 의미한다. 바람직하게는, 생물학적 샘플은 가용성 엔도글린 핵산 분자들 또는 폴리펩티드들 또는 둘 다를 포함한다.

“작은 간섭 RNAs(small interfering RNAs: siRNAs)”는 분해되는 표적 유전자 또는 mRNA를 동정하는데 사용되는, 바람직하게는 길이가 10 뉴클레오티드(nt) 이상, 더욱 바람직하게는 길이가 15 뉴클레오티드들 이상 및 가장 바람직하게는 길이가 19 뉴클레오티드 이상인 분리된 dsRNA 분자를 의미한다. 19-25 뉴클레오티드의 범위는 siRNAs에 대한 가장 바람직한 크기이다. 또한 siRNAs는 단일의 RNA 분자 내에 포함된 siRNA 듀플렉스(duplex)의 양 가닥들 안에 짧은 헤어핀(hairpin) RNAs를 포함할 수 있다. siRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드들의 부가, 결실, 치환, 및/또는 변경에 의해 자연 발생한 RNA와는 차이가 있는 변경된 RNA 뿐 아니라 dsRNA의 임의의 형태 (대형 dsRNA, 부분적으로 정제된 RNA, 완전히 정제된 RNA, 합성 RNA, 재조합 생산된 RNA의 단백질 가수 분해 산물들)를 포함한다. 이러한 변경들은 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 nt RNA의 말단(들)에 대해 또는 (RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드들에서) 내부에서와 같은, 비-뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, RNA 분자들은 3' 하이드록실기를 포함한다. 또한 본 발명의 RNA 분자들의 뉴클레오티드들은 인공 뉴클레오티드들(non-naturally occurring nucleotides) 또는 디옥시리보뉴클레오티드들(deoxyribonucleotides)을 포함하여, 비-표준 뉴클레오티드들(non-standard nucleotides)을 포함할 수 있다. 총체적으로, 이러한 모든 변경 RNA들은 RNA의 유사체를 의미한다. 본 발명의 siRNA들은 RNA 간섭(RNAi)을 매개할 수 있는 능력을 갖는 자연 RNA에 충분히 유사할 것을 필요로 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, RNAi는 세포 또는 기관 내로 작은 간섭 RNAs 또는 dsRNAs의 도입을 통해 특이적 mRNA 분자의 ATP-의존적 표적화 절단(ATP-dependent targeted cleavage) 및 분해를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, “매개 RNAi(mediate RNAi)”는 분해되는 RNA들을 구별하거나 동정하는 능력을 의미한다.

“가용성 엔도글린 결합 분자(soluble endoglin binding molecule)”는 바람직하게는 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 저분자 화합물을 의미한다. 가용성 엔도글린 결합 분자는 예를 들어, 항체, 항체-관련 펩티드, 가용성 엔도글린 결합 항체의 하나 이상의 CDR 영역들, 또는 가용성 엔도글린 상호작용 단백질(soluble endoglin interacting protein)일 수 있다.

“가용성 Flt-1(soluble FIt-1: sFlt-1)” (또한 sVEGF-R1로도 알려진)은 GenBank accession number UOl134로 한정되는 단백질에 상동성이 있고, sFlt-1 생물학적 활성을 갖는, Flt-1 수용체의 가용성 형태를 의미한다. sFlt-1 폴리펩티드의 생물학적 활성은 임의의 표준 방법, 예를 들어, VEGF에 대한 sFlt-1 결합을 분석하는 방법을 사용함으로써 분석될 수 있다. sFlt-1은 막통과 도메인(transmembrane domain) 및 Flt-1 수용체의 세포질 티로신 키나아제 도메인(cytoplasmic tyrosine kinase domain)이 결여된다. sFlt-1은 VEGF 및 PlGF에 고친화도로 결합할 수 있으나, 증식 또는 혈관 형성을 유발할 수는 없고, 따라서 Flt-1 및 KDR 수용체들과는 기능적으로 차이가 있다. sFlt-1은 초기에 인간의 제대 내피 세포(human umbilical endothelial cells)로부터 정제되고, 이후에 생체 내의 영양막 세포들에 의해 생성된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, sFlt-1은 임의의 sFlt-1 패밀리 멤버 또는 이소폼을 포함한다. 또한 sFlt-1은 Flt-1 수용체의 효소적 절단에 의해 생성되고 sFlt-1 생물학적 활성을 유지하는 분해 산물들 또는 단편들도 의미할 수 있다. 하나의 예에서, 태반으로부터 분비된 특이성 메탈로프로테이나제들(metalloproteinases)은 Flt-1 수용체의 세포외 도메인을 절단하여 순환계(circulation) 내로 Flt-1의 N-터미널 부를 방출시킬 수 있다.

“특이적으로 결합한다(specifically binds)”라 함은 화합물 또는 항체가 본 발명의 폴리펩티드는 인식하여 결합하지만, 본래부터 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는, 생물학적 샘플과 같은, 샘플의 다른 분자들은 인식하여 결합하지 않는 것을 의미한다. 하나의 예에서, 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체는 막 결합 엔도글린에는 결합하지 않는다.

다른 예에서, 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체는 엔도글린의 세포외 도메인내 에피토프, 특히 아미노산들 26 내지 437 (펩티드 선도 서열을 제외한), 인간 엔도글린의 아미노산들 40 내지 406 (도 30B 참조), 또는 26 내지 587 (펩티드 선도 서열을 제외한)에 결합하는데, (예컨대, 가용성 엔도글린의 3차원 구조에서) 가용성 엔도글린에 유일하거나 그러하지 않을 수 있다. 다른 예에서, 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체는 도 30B에 볼드체 및 언더라인으로 보여지는 아미노산 서열들의 하나 이상을 인식한다.

“환자(subject)”는 인간 또는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 개, 또는 고양이와 같은 비-인간 포유동물을 포함하는 포유동물을 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 제한에는 임신의, 분만후의(post-partum) 및 임신하지 않은 포유동물들도 포함된다.

“실질적으로 동일한(substantially identical)”이라 함은 예를 들어 하기 기술된 방법들을 사용하여, 최적으로 정렬시, 예컨대, 엔도글린 또는 가용성 엔도글린 서열 같은 제 2 핵산 또는 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 상동성을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열을 의미한다. “실질적인 상동성(substantial identity)”은 전장 서열(full-length sequence), 에피토프들(epitopes) 또는 면역원성 펩티드들 (immunogenic peptides), 기능성 도메인들(functional domains), 코딩(coding) 및/또는 조절 서열들(regulatory sequences), 엑손들(exons), 인트론들(introns), 프로모터들(promoters) 및 유전자 서열들(genomic sequences)과 같은, 서열의 다양한 타입들 및 길이들을 나타내기 위해 사용된다. 두 개의 폴리펩티드들 또는 핵산 서열들 사이의 퍼센트 상동성은 예를 들어, GeneMatcher Plus™로서 편입된 Smith Waterman Alignment (Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J MoI Biol 147:195-7); "BestFit" (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)), Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed pp 353-358; BLAST program (Basic Local Alignment Search Tool; (Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10), BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL, 또는 Megalign (DNASTAR) software와 같은 공개적으로 시판되는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 본 발명이 속하는 기술분야 내의 다양한 방식으로 결정된다. 또한, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 비교되는 서열들의 길이를 넘어 최대 정렬(alignment)을 이루는 데 필요한 임의의 알고리즘들을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적합한 파라미터들을 결정할 수 있다. 일반적으로, 단백질에 있어서, 비교 서열들의 길이는 적어도 10 아미노산, 바람직하게는 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 13O, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 적어도 437 아미노산들 또는 그 이상일 것이다. 핵산에 있어서, 비교 서열들의 길이는 일반적으로 적어도 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1311, 또는 적어도 1761 뉴클레오티드들 또는 그 이상일 것이다. 서열 상동성의 측정 목적을 위해 DNA 서열과 RNA 서열을 비교하는 경우, 티민 뉴클레오티드는 우라실 뉴클레오티드와 균등한 것으로 이해해야 할 것이다. 보존적 치환들(conservative substitutions)은 전형적으로 다음의 군내에서 치환을 포함한다: 글라이신(glycine), 알라닌(alanine); 발린(valine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine); 아스파라긴산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine); 세린(serine), 트레오닌(threonine); 라이신(lysine), 아르기닌(arginine); 및 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine).

“전자간증의 증상(symptoms of pre-eclampsia)”은 다음 중 임의의 것을 의미한다: (1) 임신 20주 이후의 수축기 혈압 (BP) >140 mmHg 및 확장기 혈압 (BP) >90 mmHg, (2) 새로운 단백뇨의 발병 (소변 검사시 딥스틱에 의할 경우 1+, 24시간 회수물에서 300mg을 초과하는 단백질, 또는 단백질/크레아티닌 비가 0.3을 초과하는 임의의 단일 소변 샘플) 및 (3) 분만후 12주에 고혈압 및 단백뇨의 소실. 또한 전자간증의 증상들은 신장 기능장애(renal dysfunction) 및 사구체 내피증식(glomerular endotheliosis) 또는 비대(hypertrophy)를 포함할 수 있다. “자간증의 증상(symptoms of eclampsia)”은 임신 또는 최근 임신의 영향에 따라 다음의 증상들 중 어느 하나가 발생함을 의미한다: 발작(seizures), 혼수(coma), 저혈소판증(thrombocytopenia), 간부종(liver edema), 폐부종(pulmonary edema) 및 뇌부종(cerebral edema).

“전환성장인자 β(transforming growth factor β:TGF-β)”는 TGF-β 생물학적 활성을 가지고 모든 척추 동물들에서 발견되는 측분비(paracrine) 폴리펩티드들과 구조적으로 관련된 패밀리 멤버이고 후생동물의 성장(metazoan growth), 분화 및 형태형성 인자들(morphogenesis factors)의 대형 패밀리의 원형인 포유동물의 성장 인자를 의미한다(Massaque et al. Ann Rev Cell Biol 6:597-641 (1990); Massaque et al. Trends Cell Biol 4:172-178 (1994); Kingsley Gene Dev. 8:133-146 (1994); 및 Sporn et al. J Cell Biol 119:1017- 1021 (1992)을 재참조). Kingsley의 상술한 문헌에 개시된 바와 같이, TGF-β 수퍼패밀리는 25 이상의 멤버들을 가지고 고도로 관련된 서열들을 갖는 상이한 서브-패밀리들(subfamilies)로 그룹지워질 수 있다. 가장 명확한 서브-패밀리들은 다음을 포함한다: TGF-β 수퍼패밀리의 다른 멤버들보다 TGF-β1에 더 유사한 적어도 네 개의 유전자들을 포함하는 TGF-β 서브-패밀리; 뼈 형성단백질(bone morphogenetic proteins); 동종- 또는 이종-이량체들 또는 두 개의 서브-단위, 인히빈(inhibin)β-A 및 인히빈 β-B를 포함하는 액티빈 서브-패밀리. 포유동물 인자들 BMP2 및 BMP4를 포함하는 디카펜타플레직(decapentaplegic) 서브-패밀리는, 피하에 또는 근육 내로 이식시 이소성 뼈(ectopic bone) 및 연골(cartilage)의 형성을 유도할 수 있다. 6OA 서브-패밀리는, BMP5-8를 포함하여, 골유도 활성(osteoinductive activity)을 가지는 다수의 포유동물의 동종체(homologs)를 포함한다. TGF-β 수퍼패밀리의 다른 멤버들은 성장 분화 인자 1(gross differentiation factor 1: GDF-1), GDF-3/VGR-2, 도살린(dorsalin), 노달(nodal), 뮬러관 억제 물질(mullerian-inhibiting substance: MIS) 및 신경교세포-유래 신경영양인자(glial-derived neurotrophic growth factor:GDNF)를 포함한다. DPP 및 6OA 서브-패밀리들은 TGF-β 수퍼패밀리의 다른 멤버들보다 서로 더 가깝게 관련되어 있고, 종종 DVR(dpp 및 vgl 관련)이라 불리는 더 큰 분자들의 컬렉션의 일부로서 함께 분류됨을 주의해야 할 것이다. 그것이 사용된 문맥상 다른 의미가 명백하지 않는 한, 용어 TGF-β는 본 발명의 명세서 전반에서 사용될 때 일반적으로 TGF-β 수퍼패밀리의 멤버들을 의미하는 것으로 이해해야 할 것이다. (Massague et al, Annu. Rev. Biochem. 67:753-91, 1998; Josso et al, Curr. Op. Gen. Dev., 7:371-377, 1997). TGF-β는 많은 세포 타입들에서 성장, 분화, 운동성(motility), 조직 리모델링, 신경발생(neurogenesis), 상처 회복, 세포사멸 및 혈관 형성을 조절하도록 기능한다. 또한 TGF-β는 많은 세포 타입들에서 세포 증식을 저해하고, 기질 단백질(matrix proteins)들의 합성을 자극할 수 있다.

“치료량(therapeutic amount)”은 본 명세서에 개시된 바와 같이, 환자에 직접적으로 투여하거나 생채외 접근(ex vivo approach)에 의해, 전자간증 또는 자간증으로 고통받는 환자들에게 투여하는 경우에 전자간증 또는 자간증 증상의 질적 또는 양적인 감소를 유발하기에 충분한 양을 의미한다. 또한 “치료량 ”은 환자에 직접적으로 투여하거나 생채외 접근에 의해, 전자간증 또는 자간증으로 고통받는 환자들에게 투여시 엔도글린 또는 sFlt-1의 발현 농도의 감소 또는 본 명세서에 개시된 분석법들에 의해 측정된 바와 같이 VEGF 또는 PlGF의 발현 농도의 증가를 유발하기에 충분한 양을 의미할 수 있다.

“치료(treating)”는 화합물 또는 약학적 조성물을 치료 목적으로 투여하는 것을 의미한다. "질병을 치료한다(treat disease)" 또는 "치료적 처치(therapeutic treatment)"를 위해 사용하는 것은 환자의 이상을 개선시키기 위해 이미 병으로 고통받는 환자에게 투여 치료를 행하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 환자는 후술하는 임의의 특징적인 증상들의 확인 또는 본 명세서에 개시된 진단 방법들의 사용에 기초하여, 전자간증 또는 자간증과 같은, 고혈압과 관련된 임신성 합병증을 앓는 것으로서 진단된다. “질병을 예방한다(prevent disease)”라 함은 특정 질환으로 발병할 가능성이나 그 밖의 위험이 있으나, 아직 발병하지 않은 환자의 예방적 처리(prophylactic treatment)를 의미한다. 바람직하게는 환자에게 본 명세서에 개시된 진단 방법들을 사용하여 전자간증 또는 자간증의 발병 위험이 있음을 확인하는 것이다. 따라서, 청구항 및 구현예들에서, 처리는 치료 또는 예방 목적 중 하나로 포유동물에게 투여하는 것을 의미한다.

“영양막(trophoblast)”은 자궁 점막층(uterine mucosa)을 통해 배아가 모체로부터 영양분을 받고; 세포들이 태반의 형성에 기여하게 되는데, 이러한 자궁 점막층을 침식시키는 포배(blastocyst)를 덮고 있는 신경능선조직의 세포 층(mesectodermal cell layer)을 의미한다.

“혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor: VEGF)"는 U.S. Patent Nos. 5,332,671; 5,240,848; 5,194,596; 및 Charnock- Jones et al. (Biol Reproduction, 48: 1120-1128, 1993)에 개시된 성장 인자에 대해 상동성이 있고, VEGF 생물학적 활성을 갖는 포유동물의 성장 인자를 의미한다. VEGF는 글리코실화 동종이량체로서 존재하고, 적어도 네 개의 다른 스프라이싱 이소폼들(spliced isoforms)을 포함한다. 고유한 VEGF(native VEGF)의 생물학적 활성은 혈관 내피 세포 또는 제대정맥 내피 세포의 선택적 성장의 증진(promotion) 및 혈관 형성의 유도를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, VEGF는 임의의 VEGF 패밀리 멤버 또는 이소폼 (예컨대, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF189, VEGF165, 또는 VEGF 121)을 포함한다. 바람직하게는, VEGF는 VEGF121 또는 VEGF165 이소폼 (Tischer et al., J. Biol. Chem. 266, 11947-11954, 1991 ; Neufed et al. Cancer Metastasis 15:153- 158, 1996)인데, 이는 in U.S. Patent Nos. 6,447,768; 5,219,739; 및 5,194,596에 개시되어 있으며, 참조로서 본 명세서에 편입된다. 또한 Gille et al. (J. Biol. Chem. 276:3222-3230, 2001)에 개시된 KDR-선택적 VEGF 및 Flt-선택적 VEGF와 같은 VEGF의 돌연변이 형태들(mutant forms)이 포함된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 또한 VEGF는 LeCouter et al. (Science 299:890-893, 2003)에 개시된 바와 같은 VEGF의 임의의 변형된 형태들(modified forms)을 포함한다. 인간 VEGF가 바람직하나, 본 발명이 인간 형태로 제한되는 것은 아니며 VEGF의 다른 동물 (예컨대 마우스, 랫트, 개, 또는 닭) 형태들을 포함할 수 있다.

“벡터(vector)”는 보통 플라스미드(plasmid) 또는 박테리오파지(bacteriophage)로부터 유래되는데, 그 안으로 DNA의 단편들이 삽입되거나 또는 클론(cloned)되는 DNA 분자를 의미한다. 재조합 벡터(recombinant vector)는 하나 이상의 독특한 제한 사이트들(restriction sites)을 포함하고, 클론된 서열이 복제(reproducible)되도록 제한된 숙주 또는 비히클 생명체(vehicle organism) 내에서 자가 복제(autonomous replication)할 수 있다. 벡터는 숙주 세포(recipient cell) 내로 형질감염(transfection)이 되자마자, RNA가 발현되도록 유전자 또는 코딩 영역에 작동적으로 연결되는 프로모터를 포함한다.

본 발명의 다른 특성 및 이점들은 다음의 바람직한 구현예들에 대한 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백할 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명자들은 가용성 엔도글린 농도가 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환을 가진 여성으로부터 채취한 혈액 혈청 샘플들에서 상승함을 발견하였다. 가용성 엔도글린은 단백질 분해효소들에 의한 막 결합 형태의 세포외 부분의 절단에 의해 형성될 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은, 태반의 선택적 스플라이싱 변이체들(alternate splice variants) 및 정제된 가용성 엔도글린의 부분적 펩티드 서열이 검출되지 않는 것은, 그것이 전장 엔도글린의 N-터미널 절단 산물임을 나타낸다. 과잉의 가용성 엔도글린은 태반에서 필요한 양의 혈관형성 및 유사분열촉진 인자들을 고갈시킬 수 있다. 본 발명자들은 전자간증을 가진 환자에서 가용성 엔도글린 및 sFlt1의 과잉의 순환성 농도들이 전자간증 및 다른 임신 관련 고혈압 질환들의 발병(pathogenesis)의 원인이 됨을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 가용성 엔도글린이 내피 세포들에서 eNOS 활성화의 감소와 같은, 감소된 시그널을 초래하는 그 수용체에 대한 TGF-β1 및 TGF-β3의 결합을 저해함으로써, 혈관 건강의 유지에 필수적인 중요 항상성 메커니즘(homeostatic mechanisms)을 교란시킨다는 것을 발견하였다. 이러한 데이터는 TGF-β 수용체 활성화와 NO 합성을 연결하는데 있어서 엔도글린의 결정적인 역할을 시사한다. 또한, 본 발명자들은 eNOS의 하류 활성화(downstream activation)의 저해에 의한 것과 유사하게, 가용성 엔도글린 및 sFlt1이 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환 및 혈관 손상을 각각 유도하기 위해 동시에 작용한다는 것을 발견하였다. 본 발명은 성장인자들에 대한 가용성 엔도글린의 결합을 방해하는 치료 약제들, 가용성 엔도글린 발현 또는 생물학적 활성을 감소시키는 약제들, 또는 성장인자들의 농도를 증가시키는 약제들의 사용을 특징으로 하는데, 환자의 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다. 이러한 약제들은 가용성 엔도글린에 결합하여 가용성 엔도글린 생물학적 활성을 저해하는 항체들, 가용성 엔도글린의 농도를 감소시키는 안티센스 또는 RNAi에 대한 올리고뉴클레오티드들, 가용성 엔도글린에 결합하는 성장인자들의 농도를 증가시키는 화합물들, 엔도글린의 막 결합 형태의 단백질 가수분해로 절단되는 것(proteolytic cleavage)을 방해함으로써 가용성 엔도글린의 방출을 방지하는 화합물, 및 가용성 엔도글린에 결합하여 성장인자 결합 사이트를 차단(block)하는 저분자들(small molecules)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 추가적 또는 선택적으로, 본 발명은 환자의 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방을 위한, TGF-β, eNOS 및 PGI₂의 농도 또는 생물학적 활성을 증가시키는 임의의 화합물 (예컨대, 폴리펩티드, 저분자, 항체, 핵산, 및 미메틱)의 사용을 특징으로 한다. 추가적으로, 본 발명은 환자의 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방을 위해, 상기 다음에 개시된 임의의 치료 화합물들 (예를 들어, U.S. Patent Application Publication Numbers 20040126828, 20050025762 및 20050170444, 및 PCT Publication Numbers WO 2004/008946 및 WO 2005/077007 참조)과 조합으로, sFlt-1의 농도를 감소시키거나 VEGF 또는 PlGF의 농도 또는 활성을 증가시키는 임의의 화합물의 사용을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 전자간증 및 자간증을 포함하여, 임신관련 고혈압 질환의 진단 마커로서, 가용성 엔도글린, eNOS, TGF-β 또는 PGI₂의 단독 또는 조합으로 사용을 특징으로 한다.

본 발명의 상세한 설명은 특히 가용성 엔도글린, TGF-β1, eNOS, sFlt-1, VEGF 또는 PlGF에 대해 상세하게 설명하는 것이나, 또한 상세한 설명이 가용성 엔도글린, TGF-β1, eNOS, sFlt-1, VEGF 또는 PlGF의 패밀리 멤버들, 이소폼들, 및/또는 변이체들에도 적용될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명할 것이다.

진단 (Diagnostics)

본 발명은 가용성 엔도글린 농도가 전자간증 또는 자간증과 같은 임신관련 고혈압 질환을 가진 여성으로부터 채취한 혈액 혈청 샘플들에서 상승됨을 발견하였다. 가용성 엔도글린은 전자간증의 임상 징후 6-10주 전에 나타나기 시작한다. 따라서, 혈청에서 선택적으로 유리 PlGF와 조합으로, 가용성 엔도글린 및 sFlt1을 측정하는 진단 테스트는 감수성(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 증가시켜, 전자간증으로 유발되는 사망(preeclampsia-induced mortality)을 방지하는데 강력한 수단으로서 제공될 것이다. 또한 진단 테스트는 유리 VEGF; TGF-β 패밀리 멤버들, 바람직하게는 TGF-β1, TGF-β3, 유리 액티빈-A, BMP2, BMP7; NOS, 바람직하게는 eNOS; 또는 PGI₂, 단독 또는 그들의 임의의 조합에서의 농도를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 임의의 단백질들의 농도에서의 변경은 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 진단을 의미한다. 하나의 예에서, 유리 BMP2, BMP7 또는 액티빈 A의 농도의 감소는 전자간증 또는 자간증과 같은, 임신관련 고혈압 질환의 진단을 의미한다.

본 명세서에 개시된 방법들은 특히 전자간증 및 자잔증에 대해 언급하고 있으나, 본 발명의 진단 및 모니터링 방법들은 임신성 고혈업, 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신, HELLP, 만성 고혈압, 전자간증 (경증, 중등도(moderate) 및 중증) 및 자간증을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 임신관련 고혈압 질환에 적용될 수 있음을 이해해야 할 것이다.

유리되거나, 결합되거나 또는 전체 농도 중 어느 하나의 가용성 엔도글린의 농도는, 환자 샘플에서 측정되고 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인의 인디케이터로서 사용된다.

전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자는 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 발현의 증가를 보일 것이다. 가용성 엔도글린 폴리펩티드는 전장 가용성 엔도글린, 분해 산물들, 가용성 엔도글린의 다른 스플라이싱 이소폼들, 가용성 엔도글린의 효소적 절단 산물들 등을 포함할 수 있다.

가용성 엔도글렌에 특이적으로 결합하는 항체는 전자간증 또는 자간증의 진단을 위해, 또는 이러한 이상들의 발병 위험에 있는 환자를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 방법들에 사용되는 하나의 예는 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (cat # sc-20072)에 의해 시판되는 엔도글린의 N-터미널 영역에 대한 모노클로날 항체이다. 추가적인 예들은 엔도글린의 세포외 도메인 (예컨대, 엔도글린의 아미노산 1 내지 437, 엔도글린의 아미노산 1 내지 587, 또는 도 30B에 볼드체 및 언더라인으로 보여지는 임의의 아미노산 서열들)에 특이적으로 결합하는 항체들을 포함한다. 이러한 폴리펩티드들의 발현에서의 변경을 측정하기 위한 다양한 프로토콜들이, 면역학적 방법들(ELISAs 및 RIAs와 같은)을 포함하여 알려져 있으며, 전자간증 또는 자간증 또는 이러한 이상들의 발병 위험을 진단하기 위한 기초를 제공한다.

가용성 엔도글린의 증가된 농도는 전자간증 또는 자간증의 양성 인디케이터(positive indicator)가 된다. 예를 들어, 가용성 엔도글린의 농도가 기준에 비해 증가된 경우 (예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상) 또는 환자로부터 얻은 하나 이상의 샘플들에서 기준초과(over time)되어 증가된 경우, 전자간증 또는 자간증의 양성 인디케이터로 고려될 수 있다. 또한, 정상 농도에 비해 가용성 엔도그린, sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF의 농도에서 임의의 검출가능한 변경은 자간증, 전자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 나타낸다. 정상적으로, 가용성 엔도글린의 순환 혈청 농도는 비임신의 상태 중에는 2-7 ng/ml 및 정상임신 상태 중에는 10-20 ng/ml 범위를 가진다. 15 ng/ml 이상, 바람직하게는 20 ng/ml 이상, 가장 바람직하게는 25 ng/ml 이상의, 가용성 엔도글린의 상승된 혈청 농도는 전자간증 또는 자간증의 양성 인디케이터로 고려된다.

하나의 구현예에서, 가용성 엔도글린의 농도는 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF 폴리펩티드 또는 핵산, 또는 그들의 임의의 조합의 농도를 조합하여 측정된다. sFlt-1, VEGF 및 PlGF의 측정 방법들은 U.S. Patent Application Publication Numbers 20040126828, 20050025762 및 20050170444, 및 PCT Publication Numbers WO 2004/008946 및 WO 2005/077007에 개시되어 있으며, 본 명세서에 참조로서 완전히 편입된다. 추가의 바람직한 구현예에서, 또한 체질량지수(BMI) 및 태아의 재태기간이 측정되고 진단 메트릭이 포함된다.

하나의 구현예에서, TGF-β1, TGF-β3, 또는 eNOS 폴리펩티드 또는 핵산의 농도는 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF 폴리펩티드 또는 핵산의 농도와 조합하여 측정된다. TGF-β1 및 β3 폴리펩티드 농도의 측정에 유용한 항체들은, 예를 들어, Abcam, Abgent, BD Biosciences Pharmingen, Chemicon, GeneTex 및 R&D Systems로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 또한 PGI₂의 농도는 상기 임의의 폴리펩티드들의 농도와 조합하여 사용될 수 있다. PGI₂ 농도는, 예를 들어 상기 개시된 임의의 진단 분석법들의 결합분자인 PGI₂ 수용체를 사용하거나, 또는 예를 들어 urinary prostacyclin colorimetric ELISA 키트 (Assay Designs)를 사용하여 결정될 수 있다. eNOS 폴리펩티드 농도의 측정에 유용한 항체들은, 예들 들어 Research Diagnostics Inc., Santa Cruz, Cayman Chemicals 및 BD Biosciences로부터 상업적으로 구입할 수 있다.

다른 구현예에서, 임의의 하나 이상의 TGF-β1, TGF-β3, 또는 eNOS 폴리펩티드의 생물학적 활성은 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF 폴리펩티드의 생물학적 활성과 조합하여 측정되고 생물학적 활성에서의 감소는 전자간증 또는 자간증의 양성 인디케이터가 된다. 생물학적 활성은, 예를 들어 효소적 활성에 대한 또는 하류 시그널링 활성(ownstream signaling activity)에 대한 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 하나의 예에서, eNOS의 효소적 활성은 시트룰린 전환(citrulline conversion)을 측정함으로써 결정되고 eNOS의 효소적 활성의 감소는 전자간증 또는 자간증의 양성 인디케이터가 된다.

하나의 구현예에서, 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF 또는 PlGF, 또는 그들 사이의 임의의 조합을 통합한 메트릭은, 적어도 두 개의 단백질들의 농도 사이의 관계가 전자간증 또는 자간증을 나타내는지를 결정하는데 사용된다. 하나의 예에서, 메트릭은 PAAI (sFlt-1/ VEGF + PlGF)인데, 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 진단하는 항-혈관형성 지수로서, 가용성 엔도글린 측정과 조합하여 사용된다. 가용성 엔도글린의 농도가 기준 샘플에 비해 증가하는 경우 (예컨대, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 또는 심지어 10-배 또는 그 이상), PAAI는 10이상, 더욱 바람직하게는 20이상이 되며, 이 후에 환자는 전자간증, 자간증, 또는 동일한 질병으로 발병할 급박한 위험을 갖는 것으로 고려된다. PAAI (sFlt-1/ VEGF + PlGF) 비는 단지 진단 인디케이터로서 사용될 수 있는 유용한 메트릭의 하나의 예이다. 본 발명이 이에 제한되는 것으로 의도하지는 않는다. 실제로, 정상 대조군에 비해 환자에 있어서, 가용성 엔도글린, sFlt-1, PlGF, 또는 VEGF, 또는 그들의 임의의 조합의 농도의 변경을 검출하는 임의의 메트릭은 진단 인디케이터로서 사용될 수 있다. 다른 예는 다음의 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수이다: (sFlt-1 + 0.25(가용성 엔도글린 폴리펩티드))/PlGF. 기준초과(over time)되거나 기준 샘플 또는 값과 비교하여 가용성 엔도글린 메트릭 값의 증가는 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터가 된다. 가용성 엔도글린 지수 100이상, 바람직하게는 200이상인 경우는 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터가 된다. 추가 예들은 다음의 지수들을 포함한다: (가용성 엔도글린 + sFlt-1)/PlGF 또는 sFlt-1 × 가용성 엔도글린.

다른 예는 환자의 임신 1기 및 2기에서 sFlt-1 및 가용성 엔도글린의 농도의 측정 및 다음의 식을 사용하여 각 기에서 sFlt1 x soluble endoglin (sEng)의 델타 값을 계산하는 것을 포함한다: [dproduct = 임신 2기에서 (sFlt1 × sEng) - 1기에서 (sFlt1 x sEng)], 여기서 그 프랙션들을 포함하여, 0, 1, 2 또는 그 이상의 값(예컨대, 양의 값)은 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터가 된다. 또한 양의 값은 조기 전자간증(pre-term pre-eclampsia)의 인디케이터가 될 수 있다. 이러한 측정은 임신 1기 및 2기 동안 다수의 경우(occasions)에서 수행될 수 있으며 dproduct는 그 이상이 더 수행될 수 있다. 또한, sFlt-1 농도(dsFlt-1) 및 sEng 농도(dsEng) 단독의 dproduct는 임신 1기 및 2기 사이에서 계산될 수도 있는데, 여기서 (dsFlt-1) 또는 (dsEng)에 대한 프랙션을 포함하여 0, 1, 2, 또는 그 이상의 값(예컨대, 양의 값)은 전자간증 또는 자간증의 진단 인디케이터가 된다.

또한, 메트릭은 TGF-β1, TGF-β3, PGI₂, 또는 eNOS 폴리펩티드의 농도를 더 포함할 수 있다. 임의의 매트릭은 모체의 BMI 또는 태아의 GA를 더 포함할 수 있다.

표준 방법들은 소변, 혈청, 혈장, 침, 양수, 또는 뇌척수액을 포함하나, 이에 한정되는 것이 아닌, 임의의 체액에서 가용성 엔도글린, 유리 VEGF, 유리 PlGF, sFlt-1, TGF-β1, TGF-β3, PGI₂, 또는 eNOS 폴리펩티드의 농도를 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 가용성 엔도글린, 유리 VEGF, 유리 PlGF, sFlt-1, TGF-β1, TGF-β3, PGI₂, 또는 eNOS 폴리펩티드에 직접 작용하는 항체들을 사용하는 면역분석법, ELISA, 웨스턴 블로팅, 및 Ong et al. (Obstet. Gynecol. 98:608-611, 2001) 및 Su et al. (Obstet. Gynecol., 97:898-904, 2001)에 개시된 바와 같은 정량 효소 면역분석 기술들(quantitative enzyme immunoassay techniques)을 포함한다. ELISA는 가용성 엔도글린, VEGF, PlGF, sFlt-1, TGF-β1, TGF-β3, PGI₂, 또는 eNOS 폴리펩티드의 농도를 측정하는 바람직한 방법이다. 바람직하게는, 가용성 엔도글린은 하나 이상의 임의의 잔류 폴리펩타이드들(remaining polypeptides)과 단독 또는 조합으로 측정된다.

엔도글린, sFlt-1, PlGF, 또는 VEGF 핵산 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오티드들 또는 그보다 긴 단편들은 발현을 모니터할 뿐 아니라, 전자간증 또는 자간증의 발병 가능성을 나타내는 엔도글린, sFlt-1, PlGF, 또는 VEGF 핵산 분자에서의 유전적 다양성(genetic variation), 돌연변이(mutation), 또는 다형성(polymorphism)을 갖는 환자를 동정하는데 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 Abdalla et al., Hum. Mutat. 25:320-321 (2005), U.S. Patent Application Publication No. 2006/0067937 및 PCT Publication No. WO 06/034507에 상세히 개시되어 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드들은 가용성 엔도글린의 세포외 도메인 또는 도 30B에서 볼드체 및 언더라인으로 보여지는 임의의 펩티드들을 코딩하는 임의의 핵산 서열에 고엄격성(high stringency)에서 혼성화될 것이다.

본 명세서에 개시된 임의의 핵산들 또는 폴리펩티드들의 측정은 적어도 두 개의 서로 다른 경우(different occasions)에서 수행될 수 있으며 정상 기준 농도 초과(normal reference levels over time)와 비교하여 농도의 변경은 전자간증, 자간증, 또는 이러한 질환 발병 소인의 인디케이터로서 사용된다.

하나의 예에서, 전자간증, 자간증, 또는 이러한 질환의 발병 소인을 갖는 환자의 체액에 존재하는 가용성 엔도글린 폴리펩티드 또는 핵산의 농도는 정상 대조군 환자 또는 동일한 환자의 동일한 체액으로부터 이전에 얻은 샘플에서의 농도와 비교하여 적게는 10%, 20%, 30%, 또는 40%, 또는 많게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상 증가될 수 있다. 다른 실시예에서, 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상의 발병 소인을 갖는 환자의 체액에 존재하는 가용성 엔도글린 폴리펩티드 또는 핵산의 농도는 1회 측정 후 다음의 측정시까지의 시간에 걸쳐 적게는 10%, 20%, 30%, 또는 40%, 또는 많게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 변경될 수 있다.

전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자의 체액에서 가용성 엔도글린의 농도와 조합으로 측정된 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF의 농도는 정상 대조군에서의 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF의 농도에 비해 작게는 10%, 20%, 30%, 또는 40%, 또는 많게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상 변경될 수 있다. 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자의 체액에서 가용성 엔도글린의 농도와 조합으로 측정된 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF의 농도는 1회 측정 후 다음 측정시까지의 시간에 걸쳐 적게는 10%, 20%, 30%, 또는 40%, 또는 많게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 변경될 수 있다.

하나의 구현예에서, 체액(예컨대, 소변, 혈장, 혈청, 양수, 또는 뇌척수액)의 환자 샘플은 전자간증 증상들의 발병 전 임신 초기에 수집된다. 다른 예에서, 샘플은 전자간증 증상들의 발병 전 임신 초기에 수집된 조직 또는 세포일 수 있다. 조직들 및 세포들의 제한되지 않는 예들은 태반의 조직, 태반 세포들, 순환성 내피 세포들, 및 단핵구와 같은 백혈구을 포함한다. 인간에 있어서, 예를 들어, 모체의 혈액 혈청 샘플들은 임신의 1, 2, 또는 3기 동안 임신한 여성의 전주정맥(antecubital vein)으로부터 수집된다. 바람직하게는, 분석은 임신 1기 동안에는, 예를 들어 4, 6, 8, 10, 또는 12주, 또는 그 가운데의 임의의 간격으로 수행되고, 또는 임신 2기 동안에는, 예를 들어 14, 16, 18, 20, 22, 또는 24주, 또는 그 가운데 임의의 간격으로 수행된다. 하나의 예에서, 분석은 임신의 13 및 16주 사이에 수행된다. 또한 이러한 분석들은 임신 2기의 말기 또는 3기, 예를 들어 26, 28, 30, 32, 34, 36, 또는 38주, 또는 그 가운데 임의의 간격으로 수행될 수 있다. 가용성 엔도글린 및/또는 본 명세서에 개시된 추가적인 폴리펩티드들의 농도는 이러한 기간 동안 두 번 측정하는 것이 바람직하다. 분만 후의 전자간증 또는 자간증의 진단에 있어서, 가용성 엔도글린에 대한 분석법들은 분만 후에 수행될 수 있다. 전자간증 또는 자간증에 대한 발병 소인의 진단에 있어서, 분석은 임신의 시작 전 또는 전자간증 또는 자간증의 증상 발병 전에 수행된다. 하나의 예에서, 모니터링 및 치료의 관리를 위해, 분석은 전자간증의 진단 후 임신 중, 및/또는 치료 중에 수행된다.

하나의 특별한 예에서, 일련의 혈액 심플들은 임신 중에 수집될 수 있고 ELISA에 의해 본 발명의 가용성 엔도글린 폴리펩티드 및/또는 임의의 추가적인 폴리펩티드들의 농도가 결정될 수 있다. 다른 예에서, 샘플은 임신의 2기 및 3기의 초기 동안 수집되고 제 1 샘플링에서부터 다음까지 가용성 엔도글린 또는 본 발명의 임의의 다른 폴리펩타이드들의 농도에서의 증가는 전자간증 또는 자간증, 또는 각각의 발병 소인을 나타낸다.

또한 본 발명은 환자로부터 얻은 체액, 바람직하게는 소변에서 임의의 가용성 엔도글린 결합 단백질(에컨대, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP-2, 및 BMP-7) 또는 가용성 엔도글린 시그널링의 하류 매개인자들(예컨대, PGI₂ 및 eNOS)의 측정을 포함하고, 가용성 엔도글린 결합 단백질의 농도의 변경(예컨대, 증가 또는 감소)은 전자간증 또는 자간증을 나타낸다. 또한 본 명세서에 개시된 가용성 엔도글린의 측정에 대한 방법들 및 타이밍(timing)은 임의의 가용성 엔도글린 결합 단백질, PGI₂ 또는 eNOS의 측정에 사용될 수 있다.

수의학적 적용에서, 분석들은 임신 중 임의의 시간에 수행될 수 있으나, 바람직하게는 전자간증 증상들의 발병 전, 임신 초기에 수행된다. 임신 기간은 종들 사이에서 광범위하게 다양하기 때문에, 분석의 타이밍은 수의사에 의해 결정될 것이나, 일반적으로 인간의 임신 중 분석의 타이밍에 대응될 것이다.

본 명세서에 개시된 진단 방법들은 전자간증 또는 자간증 발병의 존재, 임각성, 예상 발병 시기의 정확한 진단을 위해 본 명세서에 개시되거나 또는 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 임의의 다른 진단 방법과 개별 또는 조합으로 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 진단 방법들은 전자간증 또는 자간증 발병의 존재, 임각성, 예상 발병 시기의 정확한 진단에 유용한 것으로 확인된 임의의 다른 진단 방법들과 함께 사용될 수 있다.

또한 본 명세서에 개시된 진단 방법들은 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증을 모니터하고 관리하는데 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 치료요법은 혈액, 혈장, 또는 혈청 가용성 엔도글린 농도가 25 ng/ml 미만이 될 때까지, 또는 혈청 가용성 엔도글린 농도들 (또는 가용성 엔도글린 결합 단백질, PGI₂ 또는 eNOS 농도)이 전자간증 또는 자간증의 발병 전에 정해진 기준 농도(baseline level)로 돌아갈 때까지 투여된다. 다른 예에서, 환자가 정상 대조군에 비해 증가된 농도의 가용성 엔도글린의 농도를 갖는 것으로 측정되는 경우, 이후의 치료요법은 혈청 PlGF 농도가 대략 400 pg/mL로 증가할 때까지, 또는 전자간증 또는 자간증의 발병 전 기준 농도로 돌아갈 때까지 투여될 수 있다. 이러한 구현예에서, 가용성 엔도글린, sFlt-1, PlGF, VEGF, 가용성 엔도글린 결합 단백질, PGI₂, eNOS, 또는 이들 중 임의의 것 또는 모든 것의 농도는, 질병을 진단할 뿐 아니라 전자간증 및 자간증의 치료 및 관리를 모니터링하는 방법으로서 반복적으로 측정된다.

진단 키트 (Diagnostic Kits)

또한 본 발명은 진단 테스트 키트를 제공한다. 예를 들어, 진단 테스트 키트는 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 결합제들(예컨대, 폴리펩타이드들 또는 항체들) 및 결합제 및 가용성 엔도글린 폴리펩티드 사이의 결합을 검출하고, 더욱 바람직하게는 평가하기 위한 수단들을 포함할 수 있다. 검출을 위해, 결합체 또는 가용성 엔도글린 폴리펩티드 중 하나는 라벨링되고, 결합제 또는 가용성 엔도글린 폴리펩티드 중 하나는 기질-결합되어, 결합제와 가용성 엔도글린 폴리펩티드 사이의 결합 후 기질에 부착된 라벨의 양을 측정함으로써 가용성 엔도글린 폴리펩티드-결합제 상호작용이 확인될 수 있다. 종래의 ELISA는 항체-기질 상호작용을 검출하기 위한 공지의, 잘 알려진 방법이며, 본 발명의 키트에 제공될 수 있다. 가용성 엔도글린 폴리펩티드들은 소변, 혈청, 혈장, 침, 양수, 또는 뇌척수액을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 사실상 모든 체액에서 검출될 수 있다. 또한 본 발명은 가용성 엔도글린 핵산의 농도를 검출하고 측정하는데 사용될 수 있는 가용성 엔도글린 핵산을 포함하는 진단 테스트 키트를 제공한다. 정상 대조군에 존재하는 농도와 같은, 기준에 비해 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도의 변경, 예를 들어, 증가를 측정하는 키트는, 본 발명의 방법들의 진단 키트로서 유용하다.

본 발명의 진단 키트들은 U.S. Patent Application Publication Numbers 20040126828, 20050025762, 및 20050170444 및 PCT Publication Numbers WO 2004/008946 및 WO 2005/077007에 개시된 바와 같이 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF 폴리펩티드들 또는 핵산들의 검출을 위한 항체들 또는 핵산들을 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 키트는 또한 TGF-β1, TGF-β3, 또는 PGI₂ 또는 eNOS 폴리펩티드들을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 가용성 엔도글린 리간드들의 검출을 위한 결합제들을 포함할 수 있다. TGF-β1 및 β3 폴리펩티드 농도의 측정에 유용한 항체들은, 예들 들어, Abcam, Abgent, BD Biosciences Pharmingen, Chemicon, GeneTex, 및 R&D Systems로부터 상업적으로 구입할 수 있다. eNOS 폴리펩티드 농도의 측정에 유용한 항체들은, 예들 들어, Research Diagnostics Inc., Santa Cruz, Cayman Chemicals, 및 BD Biosciences로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 또한 PGI₂ 농도의 측정을 위한 결합제들이 포함될 수 있고, 상기 개시되거나 또는, 예들 들어, urinary prostacyclin colorimetric ELISA kit (Assay Designs)에 사용하는, 임의의 진단 분석법들의 결합 분자로서, 예를 들어 PGI₂ 수용체, 또는 그 단편들을 포함할 수 있다. 정상 대조군에 존재하는 농도와 같은, 정상 기준 또는 표준 또는 농도에 비해 변경, 예들 들어, eNOS, TGF-β1 또는 β3 폴리펩티드 또는 PGI₂의 농도의 감소를 측정하는 키트는, 본 발명의 방법들에 있어서 진단 키트로서 유용하다. 양성 기준 표준 또는 농도에 비해 변경, 예를 들어, 가용성 엔도글린의 농도에서의 감소 또는 가용성 엔도글린 결합 단백질(예컨대, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP2, 및 BMP 7) 또는 가용성 엔도글린 시그널링(예컨대, eNOS 및 PGI₂)의 하류 매개인자들의 농도에서의 증가를 측정하는 키트는, 전자간증 또는 자간증의 치료를 모니터링하는데 유용하다.

바람직하게는, 상기 키트는 상기 개시된 임의의 진단 방법들을 수행하는데 필요한 임의의 구성요소들을 포함한다. 예를 들어, 상기 키트는 바람직하게는 막(membrane)을 포함하는데, 상기 가용성 엔도글린 결합제 또는 상기 가용성 엔도글린 결합제에 결합하는 약제가 막에 고정된다. 딥스틱(dipstick) 구조를 샘플 내에 위치시킴으로써 샘플이 막 상에 놓이는 딥스틱 구조 상에 지지되거나, 상기 막은 카세트(cassette)의 개방부를 통해 샘플이 막 위에 놓이는 측면 흐름 카세트(lateral flow cassette) 내에 지지될 수 있다.

또한 상기 진단 키트들은 일반적으로 표준 커브(standard curve)를 확인하는데 사용되도록 상기 키트 구성 요소들 및 기준 샘플 또는 정제된 단백질들의 의도된 사용에 대한 라벨 또는 설명서들을 포함한다. 하나의 예에서, 상기 키트는 전자간증, 자간증, 또는 전자간증 또는 자간증의 발병 소인의 진단용 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함한다. 이미 다른 예에서, 상기 키트는 전자간증 또는 자간증의 치료에 적합한 치료요법(therapeutic treatment) 또는 용량 계획(dosage regimens)을 모니터하기 위한 키트의 사용에 대한 설명서들을 포함한다. 또한 상기 진단 키트는 환자 샘플의 PAAI 또는 가용성 엔도글린 항-혈관 형성 지수를 측정하고 기준 샘플 값에 대한 PAAI 또는 가용성 엔도글린 항-혈관 형성 지수를 비교하기 위한 키트의 사용에 대한 라벨 또는 설명서들을 포함할 수 있다. 기준 샘플 값들이 상기 키트의 의도된 사용에 의존함을 이해해야 할 것이다. 예들 들어, 샘플은 정상 기준값에 비교될 수 있는데, 상기 PAAI 또는 가용성 엔도글린 항-혈관 형성 지수의 증가 또는 가용성 엔도글린 값의 증가는, 전자간증 또는 자간증, 또는 전자간증 또는 자간증 발병 소인을 나타낸다. 다른 예에서, 치료 모니터링에 사용되는 키트는 전자간증 또는 자간증을 나타내는 기준 PAAI 또는 가용성 엔도글린 항-혈관 형성 지수 값 또는 가용성 엔도글린 값을 가질 수 있는데, 상기 PAAI 또는 가용성 엔도글린 항-혈관 형성 지수 값의 감소 또는 기준 샘플에 비해 환자의 샘플의 가용성 엔도글린 값의 감소는 치료 화합물들의 치료 효능 또는 유효 용량을 나타내는데 사용될 수 있다. 또한 상기 키트의 사용에 의존하는, 정상 또는 양성 기준 범위 내 정제된 단백질의 농도의 표준 커브가, 포함될 수 있다.

치료 (Therapeutics)

본 발명은 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증을 치료 또는 예방하기 위한 방법들 및 조성물들을 특징으로 한다. 가용성 엔도글린의 농도는 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상들의 발병 소인을 갖는 환자에 있어 증가되기 때문에, 가용성 엔도글린 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 발현 농도 및/또는 생물학적 활성을 감소시키는 임의의 화합물은 본 발명의 방법들에 유용하다. 이러한 화합물들은 리간드에 대한 가용성 엔도글린 결합을 파괴할 수 있는 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, 또는 BMP7; 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 정제된 항체 또는 항원-결합 단편; 및 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머들; RNA 간섭을 조절하는데 사용되는 dsRNAs를 포함한다. 추가적인 유용한 화합물들은 가용성 엔도글린의 생물학적 활성을 변경시킬 수 있는, 예들 들어 혈관 형성 분석법에 의해 측정되는, 임의의 화합물들을 포함한다. 전형적인 화합물들 및 방법들은 이하 상세히 설명한다. 또한 이러한 방법들은 PCT Publication Number WO 2004/008946 및 U.S. Patent Publication Nos. 20040126828 및 20050170444에 개시된 바와 같이 sFlt-1 농도를 감소시키거나 VEGF 또는 PlGF 농도를 증가 또는 sFlt-1 농도를 감소시키는 방법들과 조합될 수 있다. 또한, TGF-β1 또는 3, eNOS, 또는 PGI₂의 농도 또는 생물학적 활성을 증가시키는 임의의 화합물이 본 발명의 방법들에 사용된다. 전형적인 화합물들 및 방법들은 이하 상세히 설명한다.

본 발명자들이 가용성 엔도글린 및 sFlt-1 경로가 전자간증 또는 자간증의 발병(pathogenesis)을 진행시키기 위해 공동 방식(cooperative manner)으로 작용할 수 있음을 발견하였다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 본 발명은 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방을 위한 본 명세서에 개시된 임의의 방법들 또는 조성물들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 가용성 엔도글린 경로를 표적화하는 화합물 (예컨대, 가용성 엔도글린 발현 또는 생물학적 활성을 하향조절(downregulate)하거나 TGF-β, eNOS, 또는 PGI₂ 발현 또는 생물학적 활성을 상향조절(upregulate)한다)은 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방을 위해 sFlt-1 경로를 표적화하는 화합물 (예컨대, sFlt-1 발현 또는 생물학적 활성을 하향조절하거나 VEGF 또는 PlGF 발현 또는 생물학적 활성을 상향조절한다)과 조합으로 사용될 수 있다.

TGF-β 시그널링 경로를 표적화하는 치료 (Therapeutics targeting the TGF-β signaling pathway)

TGF-β는 많은 세포 타입들에서 성장, 분화, 운동성, 조직 리모델링, 신경발생, 상처 회복, 세포사멸 및 혈관 형성을 조절하는 적어도 25개의 성장 인자들의 패밀리의 원형(prototype)이다. 또한 TGF-β는 많은 세포 타입들에서 세포 증식을 저해하고 기질 단백질들의 합성을 자극할 수 있다. 그것이 사용된 문맥으로부터 달리 확인되지 않는 한, 본 명세서 전반에 사용된 용어 TGF-β는 일반적으로 적합한 TGF-β 수퍼패밀리의 임의의 및 모든 멤버들을 가리키는 것으로 이해되어야 할 것이다. 가용성 엔도글린은 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈, BMP-2 및 BMP-7을 포함하는 TGF-β 패밀리의 몇몇 특이적 멤버들에 결합하고, 태아 또는 태반의 이러한 필수 유사분열 및 혈관형성 인자의 발생을 감소시키는데 도움이 될 수 있다. 본 발명은 가용성 엔도글린에 결합하여 가용성 엔도글린의 효과들을 중화시키는 이러한 리간드들의 농도를 증가시키는 방법들을 특징으로 한다.

치료 화합물로서 가용성 엔도글린 리간드들 (Soluble endoglin ligands as therapeutic compounds)

본 발명의 바람직한 구현예에서, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, 및 BMP7을 포함하나, 이에 한정되지 않는, TGF-β 패밀리 단백질들과 같은 임의의 가용성 엔도글린 리간드의 정제된 형태들은, 전자간증 또는 자간증을 치료 또는 예방하기 위해 환자에 투여된다.

정제된 TGF-β 패밀리 단백질들은 상동성이 있는, 더욱 바람직하게는, 혈관형성을 유도할 수 있는, TGF-β1 또는 TGF-β3, 또는 임의의 알려진 TGF-β 패밀리 멤버의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한, 아미노산 서열을 갖는 임의의 단백질을 포함한다. 비-제한적 예들은 R & D Systems, MN에서 시판되는 인간 TGF-β1 (Cat #240-B-002) 및 인간 TGF-β3 (Cat #243-B3-002)을 포함한다. 본 발명의 방법들에 유용한 바람직한 TGF-β 패밀리 단백질들은 가용성 엔도글린에 결합하는 능력을 가진다 (예컨대, Barbaraet al, J. Biol. Chem. 274:584-94 (1999)).

엔도글린의 단백질분해적 절단을 저해하는 치료 화합물 (Therapeutic compounds that inhibit proteolytic cleavage of endoglin)

본 발명자들은 단백질 분해 효소가 엔도글린 막 결합 형태를 절단하여, 세포외 도메인을 가용성 형태로서 방출시키는, 엔도글린의 세포외 도메인에 있는 잠재적인 절단 사이트(potential cleavage site)를 확인하였다. 절단 사이트의 서열 정렬은 기질 메탈로프로테이나제(MMP)가 가용성 엔도글린의 절단 및 방출을 담당할 수 있음을 보여준다. 다른 방법으로서, 카뎁신(cathepsin) 또는 알라스타제(elastase)가 절단 이벤트에 포함될 수 있다. 또한 MMPs는 콜라게나제(collagenases), 젤라티나제(gelatinases), 및 스트로멜리신(stromelysins)으로서 알려져 있고, 현재 26 패밀리 멤버들이 알려져 있다 (Whittaker and Ayscough, Cell Transmissions 17:1 (2001)을 재참조). 바람직한 MMP는 MMP9인데, 이는 전자간증 환자들로부터 얻은 태반에서 상향조절(up-regulate)된다고 알려져 있다 (Lim et al., Am. J. Pathol. 151:1809-1818, 1997). MMPs의 활성은 프로-효소(pro-enzymes)의 활성화 및 메탈로프로티나제들의 조직 저해제(tissue inhibitors of metalloproteinases:　TIMPS)와 같은 내인성 저해제들（endogenous inhibitors)에 의한 저해를 통해 제어된다. MMPs의 저해제들은 아연 결합 단백질들(zinc binding proteins)이다. 4개의 알려진 내인성 저해제들(TIMP 1-4)이 있는데, 이는 Whittaker 등의 상술한 문헌에 개시되어 있다. 하나의 바람직한 MMP 저해제는 엔도글린과 유사성을 공유하는 분자인, 베타글리칸(betaglycan)을 절단하는 것으로 확인된 막 타입-MMP1의 저해제이다 (Velasco-Loyden et al., J. Biol. Chem. 279:7721-7733 (2004)). 또한, 다양한 천연-발생 및 합성의 MMP 저해제들이 동정되었고 또한 Whittaker 등의 상술한 문헌에 개시되어 있다. 예들은 MMPs에 직적 작용하는 항체들 및 마리마스태트(marimastat), 바티마스태트(batimastat), CT1746, BAY 12-9566, 프리노마스태트(Prinomastat), CGS-27023A, D9120, BMS275291 (Bristol Myers Squibb), 및 트로케이드(trocade)를 포함하는 다양한 화합물들을 포함하며, 이들 중 일부는 현재 임상 시도가 있다. 가용성 엔도글린의 방출 및 농도의 상향 조절에 있어서 MMPs, 카뎁신, 또는 엘라스타제들의 잠재적인 역할을 감안할 때, 본 발명은 또한 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증의 치료 또는 예방을 위해, 가용성 엔도글린의 절단 및 방출과 관련된 임의의 MMP, 카뎁신, 또는 엘라스타제의 활성을 저해하는 것으로 알려진, 상기 개시된 바와 같은 임의의 화합물의 사용을 위해서도 제공한다.

가용성 엔도글린 결합 단백질들을 증가시키는 치료 화합물 (Therapeutic compounds that increase soluble endoglin binding proteins)

본 발명은 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2 및 BMP7를 포함하나 이에 한정되지는 않는, 환자에 있어서 전자간증의 치료 또는 예방을 위한, 가용성 엔도글린 단백질들의 혈액 혈청 농도를 자극시키거나 증가시키는 것으로 알려진 임의의 화합물의 사용을 위해 제공한다. 이러한 화합물들은 상기 개시된 정제된 단백질들과 단독 또는 조합으로 사용될 수 있거나 또는 임의의 다른 방법들이 본 명세서에 개시된 TGF-β 패밀리 단백질들 농도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 사이클로스포린(cyclosporine)은 하루에 두 번 100-200 mg의 용량으로 사용된다.

가용성 엔도글린의 항-혈관 형성 활성을 변경시키는 치료 화합물 (Therapeutic compounds that alter the anti-angiogenic activity of soluble endoglin)

추가적인 치료 화합물은 혈관 형성 분석법들을 사용하여 동정될 수 있다. 예를 들어, 가용성 엔도글린의 상승된 농도를 갖는 전자간증 혈청이 매트리겔 튜브 형성 분석에 가해지면 항-혈관형성 상태가 유도될 것이다. 그 후, 테스트 화합물들이 분석법에 첨가될 수 있고 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상에 의한 항-혈관형성 상태의 복귀(reversion)는 상기 화합물이 가용성 엔도글린의 생물학적 활성을 감소시키고 치료 화합물로서 유용함을 나타낸다.

NOS의 농도 또는 생물학적 활성을 증가시키는 치료 화합물 (Therapeutic compounds that increase the levels or biological activity of NOS)

NOS는 몇몇 보조인자들(cofactors)로서, 촉매 부위(catalytic site)의 일부인 헴기(heme group), N-터미널 산소화효소 도메인(N­terminal oxygenase domain), 헴-티올레이트 단백질들의 클래스(class of haem-thiolate proteins)에 속하는 것, 및 NADPH:P450 환원효소에 상동성이 있는 C-터미널 환원효소 도메인(C-terminal reductase domain)을 포함하는 복합 효소이다. NOS는 L-아르기닌의 구아니디노 나이트로젠(guanidino nitrogen)의 5-전자 산화(five-electron oxidation)를 촉매함으로써 NO를 생산한다.

eNOS 활성화는 Ser1177 인산화 및 Thr495 탈인산화에서 조화된 증가(coordinated increase)에 영향을 미친다. 본 발명자들은 TGF-β1이 Thr495에서 eNOS를 탈인산화시킨다는 것을 발견하였는데, 이는 Ca²⁺ 감수성 및 효소 활성을 증가시키는데 필수적이고 VEGF와 상승적으로 작용할 수 있으므로 Ser1177을 인산화함으로써 eNOS를 활성화시킨다.

따라서, NOS, 특히 eNOS의 농도 (예컨대, 안정성, 전사 또는 번역을 증가시키거나, 또는 단백질 분해를 감소시킴으로써) 또는 생물학적 활성을 증가시키는 임의의 화합물 (예컨대, 폴립펩티드, 핵산 분자, 저분자 화합물 또는 항체) 또는 eNOS 활성의 하향조절을 차단하는 임의의 화합물은 본 발명의 방법들에 유용하다. 이러한 화합물들은 정제된 NOS, 바람직하게는 eNOS, 또는 그들의 생물학적 활성 단편들, NOS를 코딩하는 핵산들, 바람직하게는 eNOS, 또는 그들의 생물학적 활성 단편들, 스타틴(statins), 바나데이트(vanadate), 헤마토사이트 성장인자(hepatocyte growth factor), 포스포이노시티드 3-키나제(phosphoinositide 3-kinase: PI3K), Akt, VEGF, TGF-β1, 또는 Ser1177 인산화 또는 Thr495 탈인산화를 증가시키는 임의의 화합물을 포함한다. 산화질소(nitric oxide)는 내피세포 및 다른 세포들에 위치된 산화질소 합성효소에 의해 L-아르기닌으로부터 합성된다. 또한 산화질소는 소디움 니트로프루시드(sodium nitroprusside), 니트로글리세린(nitroglycerin), SIN-1, 이소솔비드 모노니트레이트(isosorbid mononitrate), 이소솔비드 디니트레이트(isosorbid dinitrate) 등과 같은 다양한 산화질소 공여체들(nitric oxide conors)의 이용으로 생성될 수 있다. 따라서, NOS의 농도 또는 생물학적 활성을 증가시키는 (예컨대, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상) 화합물들은 L-아르기닌 또는 산화질소 공여체(예컨대, 소디움 니트로프루시드, 니트로글리세린, 이소솔비드 모노니트레이트, 및 이소솔비드 디니트레이트)와 조합하여 선택적으로 투여될 수 있다. NOS 활성은 시트룰린 분석법(citrulline assay) 및 U.S. Patent Application Publication No. 20050256199에 개시된 다른 분석법들을 포함하여, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 표준 방법들에 의해 분석될 수 있으며, 이는 참조로서 본 명세서에 완전히 편입된다. eNOS의 Thr495 잔기는 eNOS의 칼로둘린(calmodulin: CaM)-결합 도메인 내 위치된다. Thr495에서 eNOS의 작용제-유도 탈인산화(agonist-induced dephosphorylation)는 효소에 CaM의 결합을 증가시켜(Fleming et al., Circ Res. 2001, 88: E68-75), 그것의 칼슘 감수성 및 활성화을 증가시킨다. 본 명세서에 개시된 TGF-β1에 더하여, eNOS의 Thr495 탈인산화를 유발하기 위해 개시되어 있는 다른 작용제(agonists)들은 브래디키닌(bradykinin), 히스타민(histamine) 및 VEGF를 포함한다. Thr495 탈인산화는 단백질 키나제 C 저해제(protein kinase C (PKC) inhibitor) Ro 31-8220 (Calbiochem)에 의하거나 또는 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate: PMA)(Sigma Aldrich)를 사용하여 PKC 하향조절 후 강화될 수 있다. 더욱이, Thr495의 작용제-유도 탈인산화는 캘리큘린 A(calyculin A)(Sigma Aldrich)인, 단백질 포스파타제 1(protein phosphatase 1: PP1) 저해제에 의해 Ca²⁺/칼모둘린-의존적 및 억제가능(Ca²⁺/calmodulin-dependent and inhibitable)한 것으로 나타났다 (Fleming I, et al. Circ Res. 2001, 88: E68-75). Thr495에서 eNOS 탈인산화에 영향을 주는 추가적인 화합물은 히스타민 및 브래디키닌(Sigma Aldrich)을 포함한다.

PGI ₂ 의 농도 또는 생물학적 활성을 증가시키는 치료 화합물 (Therapeutic compounds that increase the levels or biological activity of PGI ₂ )

프로스타시클린(prostacyclin)은 에이코사노이드(eicosanoids)로 알려진 지질 분자들의 패밀리의 한 멤버이다. 프로스타시클린 합성효소의 작용에 의해 프로스타글란딘 H2(prostaglandin H2: PGH2)로부터 내피세포에서 생산된다. PGI₂ 생물학적 활성은 혈소판 응집, 평활근의 이완, 직접적인 혈관확장에 의한 전신 및 폐 혈관 저항, 및 신장에서 나트륨뇨배설의 저해를 포함한다.

PGI₂는 VEGF 및 TGF-β1 둘 모두에 의해 자극되는 항-혈전성 인자(anti-thrombotic factor)이다. PGI₂ 생물학적 활성은 혈소판 응입, 혈관 평활근(vascular smooth muscle)의 이완의 저해를 포함하고 PGI₂ 생물학적 활성의 분석법들은 임의의 혈소판 분석 또는 Jakubowski et al., Prostaglandins 47:404(1994)에 개시된 바와 같이 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 다른 PGI₂ 분석법을 포함한다. 본 발명은 PGI₂ 미메틱(mimetics), 일로프로스트(iloprost), 시사프로스트(cicaprost), 및 아스피린(aspirin)을 포함하나 이에 한정되지 않는, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 표준 분석법들에 의해 측정되는, PGI₂의 농도 또는 활성을 증가시키는 (예컨대, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상) 임의의 화합물의 사용을 특징으로 한다. 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 추가적인 화합물들 및 예들은 U.S.P.N. 5,910,482에 개시되어 있으며, 이들은 참조로서 본 명세서에 완전히 편입된다.

정제된 단백질들 (Purified proteins)

임의의 정제된 단백질들, 또는 그 단편에 있어서, 상기 단백질들은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 표준 방법들을 사용하여 제조될 수 있다. 또한 상기 개시된 임의의 치료 단백질들의 유사체(analogs) 또는 동종체(homologs)이 포함되며, 예를 들어 잔기들 또는 서열들을 다양하게 치환(substitutions)하거나, 생물학적 활성에 필요없는 내부의(internal) 잔기들 또는 서열들을 제거하거나, 또는 생물학적 활성을 강화시킬 수 있는 말단 또는 내부의 잔기들을 부가함으로써 구성될 수 있다. 아미노산 치환(substitutions), 결실(deletions), 부가(additions) 또는 돌연변이(mutations)는 다양한 발현 시스템들에서 단백질의 발현, 안정성, 또는 가용성을 개선하기 위해 수행될 수 있다. 일반적으로, 치환은 보존적(conservatively)으로 수행되며 생물학적 활성에 미치는 영향을 고려한다. 유사체 단백질들 또는 그 단편들의 발현에 대한 뉴클레오티드 서열들의 돌연변이, 결실, 또는 부가는 당연히 코딩 서열의 리딩 프레임(reading frame)을 보존하여야 하고 바람직하게는 mRNA의 번역에 불리한 영향을 줄 수 있는 루프들(loops) 또는 헤어핀들(hairpins)과 같은 이차적 mRNA 구조들를 유도하기 위한 혼성화가 가능한 보존 영역들(complementary regions)을 야기하지 않아야 한다.

또한 본 발명의 임의의 치료 화합물들(예컨대, 폴리펩티드, 항체들, 저분자 화합물들)은 임의의 변형된 형태들을 포함할 수 있다. 번역 후(post-translational) 변형들의 예들은, 인산화, 당화(glycosylation), 히드록시화(hydroxylation), 설페이션(sulfation), 아세틸화(acetylation), 이소프레닐화(isoprenylation), 프롤린 이성질화(proline isomerization), 서브유닛 이량체화(subunit dimerization) 또는 다량체화(multimerization), 및 임의의 다른 단백질들에의 교차-연결(cross-linking) 또는 부착, 또는 그 단편들, 또는 막 구성요소들, 또는 그 단편들(예컨대, 부착된 막 지질 구성요소를 갖는 막으로부터 단백질의 절단)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 증가된 친화력(affinity), 감소된 소멸률(off-rate), 가용성(solubility) 및 생체내 또는 시험관내 폴리펩티드의 순환 시간, 또는 감소된 면역원성(immunogenicity)과 같은 추가적인 이점들을 제공하고, 예를 들어, 아세틸화, 아실화(acylation), ADP-리보실레이션(ADP-ribosylation), 아미드화(amidation), 플라빈의 공유부착(covalent attachment of flavin), 헴 모이티(heme moiety)의 공유부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유부착, 포스포티딜리노시톨(phosphotidylinositol)의 공유부착, 교차-연결(cross-linking), 고리화(cyclization), 이황화결합 형성(disulfide bond formation), 탈메틸화(demethylation), 공유 교차-연결의 형성(formation of covalent cross-links), 시스테인(cysteine)의 형성, 피로글루타메이트(pyroglutamate)의 형성, 포밀화(formylation), 감마-카르복실화(gamma-carboxylation), 당화, GPI 앵커(GPI anchor) 형성, 히드록시화, 요오드화(iodination), 메틸화(methylation), 미리스토이레이션(myristoylation), 산화(oxidation), 페그화(pegylation), 단백질 분해 프로세싱(proteolytic processing), 인산화, 프레닐화(prenylation), 라세미화(racemization), 셀레노이레이션(selenoylation), 설페이션, 아르기닐레이션(arginylation)과 같은 단백질들에 아미노산들의 트랜스퍼-RNA 매개된 부가(transfer-RNA mediated addition) 및 유비퀴틴화(ubiquitination)를 포함하는 변형들도 포함된다 (예로서, Creighton, “Proteins: Structures and Molecular Properties,” 2d Ed., W. H. Freeman and Co., N.Y., 1992; “Postranslational Covalent Modification of Proteins,” Johnson, ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol., 182:626-646, 1990; Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci., 663:48-62, 1992 참조). 또한 본 발명의 펩티딜(peptidyl) 치료 화합물은 와일드 타입(wild type) 서열에 대하여 치환, 결실 또는 삽입(insertions)과 같은 1, 2, 3, 4, 5, 5보다 크거나, 또는 10보다 큰 아미노산 변경들을 포함하는 변이체들(variants)과 같은 임의의 화합물의 서열 변이체들를 포함할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 치료 화합물은 하나 이상의 비-전형적(non-classical) 아미노산들을 포함할 수 있다. 비-전형적 아미노산들은 일반적으로 보통의 아미노산들의 D-이성체들, 2,4-디아미노부티르산(2,4-diaminobutyric acid), α-아미노 이소부티르산(α-amino isobutyric acid), 4-아미노부티르산(4-aminobutyric acid), Abu, 2-아미노 부티르산(2-amino butyric acid), g-Abu, e-Ahx, 6-아미노 헥사논산(6-amino hexanoic acid), Aib, 2-아미노 이소부티르산(2-amino isobutyric acid), 3-아미노 프로피온산(3-amino propionic acid), 오미딘(omithine), 노르류신(norleucine), 노르발린(norvaline), 히드록시프롤린(hydroxyproline), 사르코신(sarcosine), 시트룰린(citrulline), 호모시트룰린(homocitrulline), 시스테인산(cysteic acid), t-부틸글리신(t-butylglycine), t-부틸알라닌(t-butylalanine), 페닐글리신(phenylglycine), 시클로헥실알라닌(cyclohexylalanine), β-알라닌(β-alanine), 플루오르화-아미노산들(fluoro-amino acids), β-메틸 아미노산들(β-methyl amino acids), Ca-메틸 아미노산들, Na-메틸 아미노산들과 같은 디자인된 아미노산들(designer amino acids), 및 아미노산 유사체들(analogs)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 아미노산은 D (우선성(dextrorotary)) 또는 L (좌선성(levorotary))일 수 있다.

본 발명에 의해 귀속되는 추가적인 번역 후 변형들은, 예를 들어, 예컨대, N-연결된 또는 O-연결된 당쇄(N-linked or O-linked carbohydrate chains), N-터미널 또는 C-터미널의 프로세싱(processing of N-terminal or C-terminal ends), 아미노산 백본에의 화학적 모이티의 부착(attachment of chemical moieties to the amino acid backbone), N-연결된 또는 O-연결된 당쇄의 화학적 변형들, 및 N-터미널 메티오닌 잔기의 부가 또는 결실을 포함한다.

또한, 증가된 가용성, 안정성 및 폴리펩티드의 순환 시간, 또는 증가된 면역원성과 같은 추가적인 이점을 제공할 수 있는 (U.S. Pat. No. 4,179,337 참조), 본 명세서에 개시된 치료 화합물들의 화학적으로 변형된 유도체들도 포함된다. 유도체화(derivitization)에 대한 화학적 모이티들은, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 코폴리머들(ethylene glycol/propylene glycol copolymers), 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethylcellulose), 덱스트란(dextran), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol) 등과 같은 수용성 폴리머들에서 선택될 수 있다. 상기 화합물은 분자 내 임의의 위치(random positions) 또는 분자 내 계획된 위치(predetermined positions)에서 변형될 수 있으며, 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 부착된 화학적 모이티들을 포함할 수 있다.

폴리머는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 곁가지를 가지거나 또는 곁가지를 가지지 않을 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜에 있어서, 바람직한 분자량은 취급과 제조에 용이하도록 약 1 kDa 내지 100 kDa 사이이다 (용어, "약"은 폴리에틸렌 글리콜의 제조물들에 있어서, 정해진 분자량 보다 많거나 약간 적을 것을 나타냄). 다른 크기들은 원하는 치료 프로파일(예컨대, 지속된 방출을 원하는 시간, 임의의 생물학적 활성의 경우, 그 효과들, 취급에 있어서 용이성, 항원성(antigenicity)의 정도 또는 결핍 및 치료 단백질 또는 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 다른 알려진 효과들)에 따라 사용될 수 있다. 상술한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 곁가지 구조를 가질 수 있다. 곁가지의 폴리에틸렌 글리콜들은, 예들 들어, U.S. Pat. No. 5,643,575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72, (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750, (1999); 및 Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646, (1999)에 개시되어 있으며, 이들은 참조로서 본 명세서에 완전히 편입된다.

또한 본 발명의 임의의 치료 화합물들(예컨대, 폴리펩티드, 항체들 또는 저분자 화합물들)은, Fc 서열, 검출가능한 라벨 또는 추가적인 치료 분자와 같은 이종의(heterologous) 폴리펩티드 또는 아미노산 서열인, 다른 화합물과 융합된 치료 화합물을 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방법으로 변형될 수 있다. 하나의 예에서, 항-가용성 엔도글린 항체는 Fc 융합 단백질에 융합된 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명의 방법들에 사용되는 항체들을 포함하여, 임의의 폴리펩티드들에 있어서, 폴리펩티드들 또는 항체들을 코딩하는 핵산들, 또는 그 단편들은, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있고 본 명세서에 개시된 유전자 치료를 위한 표준 기술들을 사용하는 본 발명의 방법들에도 유용하다. 또한 본 발명은 폴리펩티드 또는 펩티드 단편의 3-차원 구조의 모델링(modeling)에 기초하고 특별한 분자 모양, 크기 및 전하 특성(charge characteristics)을 갖는 잠재적 저해제 화합물들을 제공하기 위해 합리적인 약물 디자인을 이용한, 미메틱(mimetics)을 포함한다. 치료 화합물에 대한 다음의 동정, 즉 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 적합한 모델링 기술들은 기능적 상호작용들을 연구하여 이러한 상호작용들을 재연할 수 있는 그런 방법으로 배열된 작용기들(functional groups)을 포함하는 미메틱 화합물들을 디자인하는데 사용될 수 있다. 약학적으로 알려진 활성 화합물에 대하여 미메틱을 디자인하는 것은 리드 화합물(lead compound)에 기초한 약제(pharmaceuticals)의 개발을 위한 공지의 접근이다. 이는 활성 화합물이 합성하는데 까다롭거나 비용이 많이 드는 경우 또는 예컨대, 펩티드들은 소화관(alimentary canal)에서 프로테아제들에 의해 빠르게 분해되는 경향을 보이는 경구용 조성물들에 대한 활성제들로서 별로 적합하지 않는 등 특별한 투여 방법에 적합하지 않는 경우에 바람직하다. 미메틱 디자인, 합성 및 테스트 하는 것은 타겟 특성을 위해 많은 수의 분자들을 닥치는 대로 스크리닝하는 것을 피하는데 사용될 수 있다. 이 후, 미메틱 또는 미메틱들은 가용성 엔도글린 농도들 또는 생물학적 활성을 감소시키는지 또는 저해하는지를 확인하기 위하여 스크리닝될 수 있으며, 다음으로 그 이상의 최적화 또는 변형은 생체내 또는 임상 시험을 위한 하나 이상의 최종 미메틱들에 도달하기 위해 수행될 수 있다.

치료 핵산 (Therapeutic nucleic acids)

최근 연구는 혈관 손상 사이트에 대한 VEGF와 같은 내피세포 미토겐(mitogen)을 발현 가능한 핵산(DNA 또는 RNA)의 전달이 증식 및 손상된 혈관의 내피세포재증식(reendothelialization)을 유도할 것임을 보여준다. 본 발명은 혈관 손상에 관련되지는 않으나, 내피세포에 대한 핵산의 전달을 위한 이러한 일반적인 기술들은 본 발명에서 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2와 BMP7 또는 eNOS과 같은 가용성 엔도글린 결합 단백질들을 코딩하는 핵산들의 전달을 위해서 사용될 수 있다. 또한 상기 기술들은 환자에 있어서 전자간증 또는 자간증의 치료 또는 예방을 위해서, 가용성 엔도글린의 절단 및 방출과 관련된 임의의 MMP, 카텝신 또는 알라스타제의 활성을 저해하는 것으로 알려진, 상술한 바와 같은, 단백질들을 코딩하는 핵산들의 전달을 위해 사용될 수 있다. 이러한 일반적인 기술들은 U.S. Patent Nos. 5,830,879 및 6,258,787에 개시되어 있으며 참조로서 본 명세서에 편입된다.

본 발명에서, 상기 핵산은 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2 및 BMP7, 또는 eNOS와 같은 가용성 엔도글린 결합 단백질들을 코딩하는, 게노믹 DNA, cDNA 및 mRNA를 포함하는 임의의 핵산(DNA 또는 RNA)일 수 있다. 목적으로 하는 단백질을 코딩하는 핵산들은 본 발명이 속하는 기술분야의 일상적인 방법들, 예컨대 재조합 DNA, PCR 증폭을 사용하여 얻을 수 있다.

핵산 전달 모드 (Modes for delivering nucleic acids)

본 명세서에 개시된 임의의 핵산 적용을 위해서, 핵산들을 투여하기 위한 표준 방법들이 사용될 수 있다. 예들은 U.S. Patent Application Publication No. 20060067937 및 PCT Publication No. WO 06/034507에 개시되어 있다.

가용성 엔도글린 발현을 저해하는 치료 핵산 (Therapeutic nucleic acids that inhibit soluble endoglin expression)

또한 본 발명은 가용성 엔도글린 mRNA의 발현을 직접적으로 하향조절하기 위해 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머들의 사용을 특징으로 한다. 상보적인 핵산 서열(센스 또는 코딩 가닥)에 대한 결합으로 인해, 안티센스 뉴클레오베이스들은 추측컨대 RNase H에 의한 RNA 가닥의 효소적 절단을 통해 단백질 발현을 저해할 수 있다. 바람직하게는 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머는 증가된 농도의 가용성 엔도글린을 발현하는 세포에서 가용성 엔도글린 단백질 발현을 감소시킬 수 있다. 바람직하게는 가용성 엔도글린 단백질 발현의 감소는 대조군 올리고뉴클레오티드를 갖는 치료받은 세포들에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 20% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상이 된다. 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머들을 선택 및 제조 방법들은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다. VEGF 발현을 하향조절하기 위한 안티센스 뉴클레오베이스 올리고머들의 예는 U.S. Patent No. 6,410,322에 개시되어 있으며, 참조로서 본 명세서에 편입된다. 또한 단백질 발현의 농도를 분석하기 위한 방법들은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있으며 웨스턴 블롯팅, 면역침전법 및 ELISA를 포함한다.

또한 본 발명은 가용성 엔도글린의 발현을 저해하기 위한 RNA 간섭(RNAi)의 사용을 특징으로 한다. RNA 간섭(RNAi)은 대상 유전자 또는 mRNA에 상응하는 이중-가닥 RNA(dsRNA)가 생물 내로 도입되어 상응하는 mRNA의 분해를 초래하는, 전사 후 유전자 사일런싱(post-transcriptional gene silencing: PTGS)의 최근 발견된 메카니즘이다. RNAi 반응에 있어서, dsRNA 분자의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 다는 21 내지 23 뉴클레오티드(nt)의 길이의 범위를 갖고 20뉴클레오티드 3’테일들을 갖는 작은 RNA 단편들(fragments) 또는 분절들(segments) 내로 프로세싱된다. 다른 방법으로서, 합성의 dsRNA는, 21 내지 23 nt의 길이 및 2-뉴클레오티드 3’테일들을 갖는데, 합성되고, 반응에 사용될 수 있다. 이러한 21 내지 23 nt dsRNAs는 “가이드 RNAs(guide RNAs)”또는 “작은 간섭 RNAs(short interfering RNAs)”(siRNAs)로 알려져 있다.

이어서 siRNA 듀플렉스들은 복합체 내의 siRNA에 대한 상동성을 갖는 내인성 mRNAs를 표적으로 하여 파괴하는 단백질들로 구성된 뉴클레아제 복합체(nuclease complex)에 결합한다. 복합체 내의 단백질들의 동정이 명확하지는 않지만, 복합체의 기능은 siRNA 가닥들의 하나 및 내인성 mRNA 사이의 염기쌍 상호작용을 통해 상동성 mRNA 분자를 표적화한다. 다음으로 mRNA는 siRNA의 3’말단으로부터 약 12 nt가 절단되고 분해된다. 이러한 방식으로, 특이적 유전자들은 표적화되고 분해될 수 있고, 그에 의해 표적 유전자로부터 단백질 발현의 손실을 야기할 수 있다. 또한 siRNA는 화학적으로 합성되거나 또는 화학적으로 siRNAs를 합성하는 회사(예컨대, Dharmacon Research Inc., Pharmacia, 또는 ABI)로부터 얻을 수 있다.

sRNA의 특이적 요구들 및 변형들은 PCT Publication No. WO01/75164, 및 in U.S. Patent Application Publication No. 20060067937 및 PCT Publication No. WO 06/034507에 개시되어 있으며, 참조로서 본 명세서에 편입된다.

임신 초기에 유용한 가용성 엔도글린 기초 치료 화합물 (Soluble endoglin based therapeutic compounds useful in early pregnancy)

전장 엔도글린 시그널링(full-length endoglin signaling)의 저해는 융모성 체외이식조직 배양(villous explant cultures)에서 영양막 침습(invasiveness)을 증가시키는 것으로 확인되었다 (Caniggia I et al, Endocrinology, 1997, 138:4977-88). 그러므로 가용성 엔도글린은 임신 초기에 영양막 침습을 상승시킬 것이다. 따라서, 임신관련 고혈압 질환의 발병 또는 임신관련 고혈압 질환의 발병 가능성을 갖지 않는 여성에 있어서 임신 초기에 가용성 엔도글린 농도를 증가시키는 조성물들은 태반형성을 상승시키는데 유익할 수 있다. 가용성 엔도글린 농도를 증가시키는 조성물들의 예들은 정제된 가용성 엔도글린 폴리펩티드들, 가용성 엔도글린을 코딩하는 핵산 분자들 및 가용성 엔도글린의 농도 또는 생물학적 활성을 증가시키는 화합물들 또는 성장 인자들을 포함한다.

유전자 및 단백질 발현 분석 (Assays for gene and protein expression)

다음의 방법들은 단백질 또는 유전자 발현을 평가하고 가용성 엔도글린 결합 단백질 농도를 증가시키거나, 또는 가용성 엔도글린 단백질 농도를 감소시키는 상기 언급한 임의의 방법들의 효과를 측정하기 위해 사용될 수 있다.

환자로부터 얻은 혈액 혈청은 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 또는 특이적 항체들은 사용하는 면역 분석법들과 같은 방법들을 사용하여, 가용성 엔도글린의 농도가 측정된다. 또한 환자의 혈액 혈청은 TGF-β1 , TGF-β3 , 액티빈-A, BMP2, BMP7, 또는 가용성 엔도글린에 결합하는 것으로 알려진 임의의 단백질 리간드의 농도로 측정된다. 단백질의 혈청 농도를 측정하는 데 사용되는 방법들은 ELISA, 웨스턴 블롯팅, 또는 특이적 항체들을 사용하는 면역 분석법들을 포함한다. 또한, 생체 외 혈관 형성 분석법들(in vitro angiogenesis assay)은 환자의 혈액이 항-혈관형성 상태(anti-angiogenic state)에서 혈관형성-촉진 상태(pro-angiogenic state)로 전환하는지에 대해 측정하기 위해 수행될 수 있다. 이러한 분석법들은 이하 실시예 4에 개시되어 있다. 전자간증 또는 자간증의 진단 결과는 가용성 엔도글린의 농도에 있어서 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 또는 50%, 및 가장 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가가 고려되고 전자간증 또는 자간증의 개선을 진단하는 결과는 가용성 엔도글린의 농도에 있어서 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 또는 50%, 및 가장 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 감소가 된다. 선택적 또는 추가적으로, 전자간증 또는 자간증의 진단 결과는 eNOS, PGI₂, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, BMP7 또는 가용성 엔도글린에 결합하는 것으로 알려진 임의의 단백질 리간드의 농도에 있어서 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 또는 50% 및 가장 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가가 고려되고 전자간증 또는 자간증의 개선을 나타내는 결과는 eNOS, PGI₂, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, BMP7 또는 가용성 엔도글린에 결합하는 것으로 알려진 임의의 단백질 리간드의 농도에 있어서 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 또는 50% 및 가장 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가가 된다. 또한 전자간증 또는 자간증의 개선을 나타내는 결과가 생체 외 혈관 형성 분석법을 사용하여 적어도 10%, 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50% 및 가장 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 항-혈관형성 상태에서 혈관형성-촉진 상태로의 전환이 고려될 수 있다.

또한 환자로부터 얻은 혈액 혈청 또는 소변 샘플들은 eNOS, TGF-βl, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, BMP7 또는 가용성 엔도글린을 코딩하는 핵산들 또는 폴리펩티드들의 농도로 측정될 수 있다. 유전자 발현에 대한 분석을 위한 몇 가지 잘 알려진 방법들이 있다. 몇 가지 예들은 환자의 혈액 샘플들로부터의 RNA 제조 및 노던 블롯팅, PCR 기초 증폭, 또는 RNAse 프로텍션 분석법들에 대한 RNA의 사용을 포함한다. 긍정적인 결과는 가용성 엔도글린, TGF-βl, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, BMP7 핵산들의 농도에 있어서 적어도 10%, 20%, 바람직하게는 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 또는 50% 및 가장 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 증가가 고려된다.

치료 항체들 (Therapeutic antibodies)

전자간증으로 고통받고 있는 임신한 여성으로부터 채취한 혈청 샘플들에서 발견된 상승된 농도의 가용성 엔도글린은 가용성 엔도글린이 태아 또는 태반의 적절한 발생 및 혈관 형성을 위해 요구되는 영양막 세포들 및 모체 내피세포의 기능성 성장 인자들에 결합하여 이를 감소시키기 위한 “생리학적 싱크(physiologic sink)”로서 작용함을 보여준다. 가용성 엔도글린에 결합(예컨대, TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, BMP7에 대한 결합)하여 가용성 엔도글린의 활성을 중화시키는, 항체들과 같은, 화합물들의 사용은, 유리된 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2 및 BMP7의 증가를 유도함으로써 전자간증 또는 자간증의 예방 또는 치료에 도움을 줄 수 있다. 이러한 증가는 태반 발생 및 태아의 영양분을 위해서 및 전신 모체의 내피세포 건강을 위해서 요구되는 영양막 증식, 이동 및 혈관 형성의 증가를 허용할 것이다.

본 발명은 가용성 엔도글린의 리간드-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항체들을 제공한다. 바람직하게는, 항체들은 엔도글린의 세포외 도메인 또는 리간드 결합 도메인에 결합한다. 항체들은 가용성 엔도글린의 활성을 중화시키는 데 사용되고 가장 효과적인 메카니즘은 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP2, 또는 BMP7에 대한 결합 사이트의 직접적인 차단을 통해 이루어지나, 그러나, 다른 메카니즘도 배제되지는 않는다. 바람직한 항체들은 도 30B에 볼드체 또는 언더라인으로 표시된 임의의 하나 이상의 펩티드 서열들(예컨대, 아미노산 40 내지 86, 144 내지 199, 206 내지 222, 289 내지 304, 또는 375 내지 381)을 포함하는 인간 엔도글린 상의 에피토프(선형 구조 또는 3차원 구조 중 하나의 결과로서) 또는 가용성 엔도글린의 임의의 바람직한 단편들(예컨대, 인간 엔도글린의 아미노산 1 내지 437, 4 내지 437, 40 내지 406, 또는 1 내지 587)에 결합할 수 있다. 치료 목적을 위한 항체들의 제조 및 사용 방법들은 U.S. Patent Numbers 6,054,297; 5,821,337; 6,365,157; 및 6,165,464; U.S. Patent Application Publication No. 2006/0067937; 및 PCT Publication No. WO 06/034507을 포함한 몇 가지 특허들에 개시되어 있으며 참조로서 본 명세서에 편입된다. 항체들은 다중클론 또는 단일클론일 수 있으며; 단일클론 항체들이 바람직하다. 항체들은 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있으며; 모노클로날 인간화된 항체들이 바람직하다. 또한 본 발명은 도 30B에 볼드체 또는 언더라인으로 표시된 하나 이상의 펩티드 서열들 또는 가용성 엔도글린의 임의의 바람직한 단편들(예컨대, 인간 엔도글린의 아미노산 1 내지 437, 4 내지 437, 40 내지 406, 또는 1 내지 587)에 결합하는 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는, 가용성 엔도글린에 결합하는 항체들을 포함한다.

항체의 치료적 사용 (Therapeutic uses of antibodies)

전자간증 또는 자간증의 치료 또는 예방을 위해 생체 내(in vivo)에서 사용되는 경우, 본 발명의 항체들은 환자에게 치료상 유효량으로 투여된다. 바람직하게, 항체들은 비경구적으로 또는 정맥 내에 지속적인 주입(infusion)에 의해 투여된다. 투여량(dose) 및 용량(dosage) 요법은 질병의 심각성 및 환자의 총체적인 건강에 의존한다. 투여된 항체의 양은 전형적으로 환자 체중의 약 0.001 내지 약 10 mg/kg, 바람직하게 환자 체중의 약 0.01 내지 약 5 mg/kg의 범위에 있다.

경구 투여용으로, 항체들은 약학적으로 허용가능한 경구 비히클(pharmaceutically acceptable parenteral vehicle)과 함께 주사 가능한 단위 용량 형태(용액, 서스펜젼, 이멀젼)로 제형화된다. 이러한 비히클들은 원래 비독성이고, 비-치료성을 띤다. 이러한 비히클들의 예들는 물, 식염수(saline), 링거 용액(Ringer's solution), 덱스트로즈 용액 및 5% 인간 혈청 알부민이 있다. 또한 불휘발성유(fixed oils) 및 에틸 올레이트와 같은 비수성(Nonaqueous) 비히클들이 사용될 수 있다. 리포좀들은 담체로서 사용될 수 있다. 비히클은 등장성 삼투압(isotonicity) 및 화학적 안정성을 상승시키는 물질, 예컨대, 버퍼 및 보존제들과 같은, 미량의 첨가제를 포함할 수 있다. 항체들은 전형적으로 이러한 비히클 내에 약 1 mg/ml 내지 10 mg/ml의 농도로 제형화된다.

조합 치료요법 (Combination therapies)

선택적으로, 치료요법은 임의의 다른 표준 전자간증 또는 자간증의 치료요법과 조합으로 시행될 수 있는데; 이러한 방법들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려져 있으며 U.S. Patent Application Publication Numbers 20040126828, 20050025762, 20050170444, 20060067937, 및 20070104707 및 PCT Publication Numbers WO 2004/008946, WO 2005/077007, 및 WO 06/034507에 개시된 방법들을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 하나 이상의 치료적 약제들의 조합의 사용을 특징으로 한다. 가용성 엔도글린 및 sFlt-1이 각각 TGF-β1 및 VEGF 시그널링 경로를 방해함으로써 혈관손상 및 임신관련 고혈압 질환들을 유도하는데 협력하여 작용할 수 있다는 본 발명의 발견으로 인해, 아마 NOS 시그널링 경로에 집중하게 되기 때문에, 본 발명의 바람직한 치료 방법들은 가용성 엔도그린 농도 또는 활성을 감소시키거나 또는 TGF-β, NOS, 또는 PGI₂ 농도 또는 활성을 증가시키는 화합물과 조합으로, sFlt-1 농도 또는 활성을 감소시키거나 또는 VEGF 또는 PlGF 농도 또는 활성을 증가시키는 화합물의 투여를 포함한다. 임의의 약제들의 임의의 조합이 이러한 목적에 사용될 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체는 VEGF와 조합으로 투여될 수 있다. 다른 예에서, TGF-β1 농도 또는 활성을 증가시키는 화합물은 엔도글린과 VEGF 경로 둘 다를 표적화하기 위해 VEGF 또는 PlGF를 증가시키는 화합물과 조합으로 투여될 수 있다. 다른 방식으로, 가용성 엔도글린 및 sFlt-1 둘 다에 대한 항체들의 조합은 직접 또는 생체외 접근(ex vivo approach)(예컨대, 항-가용성 엔도글린 또는 sFlt-1로 채워진 칼럼을 사용하고 그 칼럼을 통해 환자의 혈액을 순환시키는 것) 중 하나로 사용될 수 있다. 임의의 이러한 조합들은 각각의 수용체들의 경로의 하류를 조절하기 위해, NOS, 바람직하게는 eNOS의 농도 또는 활성을 증가시키는 화합물의 투여를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 치료적 방법들과 조합으로 사용되는 임의의 만성 고혈압 약물들(medications)의 사용을 제공한다. 임신 중 고혈압의 치료에 사용되는 약물들은 메틸도파(methyldopa), 히드랄라진 히드로클로라이드(hydralazine hydrochloride), 또는 라베타롤(labetalol)을 포함한다. 이들 각각의 약물들에 대한, 투여방법 및 용량은 의사 및 제조사의 설명서에 의해 결정된다.

투여 용량 및 방법 (Dosages and Modes of Administration)

바람직하게는, 치료는 전자간증 또는 자간증의 치료 또는 예방을 위해 임신 중에 또는 분만 후의 전자간증 또는 자간증을 치료하기 위해 임신 후에 직접 또는 생체외 접근 중 하나를 사용하여 투여된다. 투여에 대한 기술들 및 용량은 화합물의 타입(예컨대, 화학적 화합물, 정제된 단백질, 항체, 안티센스, RNAi, 또는 핵산 벡터)에 따라 다양하며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있거나 또는 쉽게 결정된다.

본 발명의 치료 화합물들은 단위 용량 형태로, 약학적으로 허용가능한 희석제(diluent), 담체, 또는 부형제(excipient)와 함께 투여될 수 있다. 투여는 양수 내로 직접주입에 의한 경구, 정맥 내, 피하, 구강 또는 국소 투여일 수 있다. 지속적인 주입에 의한 정맥 내 전달은 본 발명의 치료 화합물들을 투여하기 위한 바람직한 방법이다. 치료 화합물은 용액, 서스펜젼, 에멀젼, 주입장치(infusion device), 또는 이식용 전달장치(delivery device for implantation)의 형태이거나, 또는 사용 전 물 또는 다른 적합한 비히클로 재구성되도록 건조 파우더로서 존재될 수 있다.

조성물은 구강 투여용 환(pill), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 액체, 또는 지효성 정제(sustained release tablet); 또는 정맥 내, 피하 또는 경구 투여용 액체; 또는 국소 투여용 폴리머 또는 다른 지효성 비히클의 형태일 수 있다.

제형화(formulations)를 위해 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법들은, 예를 들어, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy” (20th ed., ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)에서 찾을 수 있다. 경구 투여용 제형화는, 예를 들어, 부형제, 멸균수(sterile water), 식염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물성 오일, 또는 수소화 나프탈렌(hydrogenated napthalenes)을 포함할 수 있다. 생체 적합성, 생물분해성 락티드 폴리머, 락티드/글리콜리드 코폴리머, 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머들이 상기 화합물들의 방출을 제어할 수 있도록 사용될 수 있다. 나노입자성 제형화(예컨대, 생물분해성 나노입자들, 고형 지질 나노입자들, 리포좀)는 상기 화합물들의 생물학적 분포(biodistribution)를 제어하기 위해 사용될 수 있다. 다른 잠재적으로 유용한 경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 코폴리머 입자들, 삼투성 펌프(osmotic pumps), 이식성주입 시스템(implantable infusion systems) 및 리포좀(liposomes)을 포함한다. 제형화에 있어서 상기 화합물의 농도는 투여되는 약물의 용량 및 투여 루트를 포함하여, 여러 인자들에 따라 다양하다.

상기 화합물은 선택적으로 제약 산업에서 통상적으로 사용되는 비독성 산 첨가 염(non-toxic acid addition salts) 또는 금속 착화합물(metal complexes)과 같은 제약학적으로 허용가능한 염으로서 투여될 수 있다. 산 첨가 염의 예들에는 아세트(acetic), 젖(lactic), 파모인(pamoic), 말레인(maleic), 시트르(citric), 말(malic), 아스코르빈(ascorbic), 숙신(succinic), 벤조(benzoic), 팔미트(palmitic), 수베르(suberic), 살리실(salicylic), 타르타르(tartaric), 메탄설폰(methanesulfonic), 톨루엔설폰(toluenesulfonic), 또는 트리플루오르아세트 산 등과 같은 유기산; 탄닌산, 카르복시메틸 셀룰로오스 등과 같은 폴리머산; 및 하이드로클로로산, 하이드로브로모산, 황산 인산 등과 같은 무기산을 포함한다. 금속착화합물은 아연, 철 등을 포함한다.

구강 사용을 위한 제형화는 비독성 제약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합하여 활성 성분(active ingredients)을 함유하는 정제를 포함한다. 이러한 부형제는, 예를 들어, 불활성 희석제 또는 필러(fillers)(예컨대, 슈크로즈 및 소르비톨), 윤활 약제들(lubricating agent), 글리던트(glidants) 및 항-유착제(예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 아연 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 수소화 식물성 오일, 또는 활석(talc))일 수 있다.

또한 구강 사용을 위한 제형화는 씹을 수 있는 정제로서, 또는 활성 성분이 불활성 고형 희석제와 혼합되는 경성(hard) 겔라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 배지와 혼합되는 연성(soft) 겔라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.

상기 화합물의 투여 용량 및 시간은 환자의 총체적인 건강 및 전자간증의 증상의 심각성을 포함하는 다양한 임상의 인자들에 따른다. 일반적으로, 전자간증 또는 전자간증의 발병 가능성이 검출되는 경우, 정제된 단백질의 지속적인 주입은 이상의 더한 진행을 치료 또는 예방하는 데 사용된다. 치료는 1 내지 100일, 더욱 바람직하게는 1 내지 60일 및 가장 바람직하게는 1 내지 20일 범위의 기간 동안, 또는 임신이 완료될 때까지 지속될 수 있다. 용량은 각각의 화합물 및 이상의 심각성에 따라 다양하고 10 내지 20 ng/ml 가용성 엔도글린; 및/또는 1 내지 500 pg/mL 유리된 VEGF 또는 유리된 PlGF, 또는 둘다, 바람직하게는 1 내지 100 pg/mL, 더욱 바람직하게는 5 내지 50 pg/mL 및 가장 바람직하게는 5 내지 10 pg/mL VEGF 또는 PlGF, 또는 l-5 ng의 sFlt-1 범위의 항정-상태 혈액 혈청 농도(steady-state blood serum concentration)를 얻도록 적정된다.

본 명세서에 개시된 진단 방법들은 치료 중 전자간증 또는 자간증을 모니터하거나 또는 치료 화합물들의 용량을 결정하는 데 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 치료 화합물이 투여되고 치료요법의 진행 중 PAAI가 측정된다. PAAI가 20이하, 바람직하게는 10이하인 경우, 그러한 치료 용량은 유효 용량으로 인정된다. 다른 예에서, 치료 화합물이 투여되고 치료요법의 진행중 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수가 측정된다. 가용성 엔도글린 항-혈관형성의 지수가 200 이하, 바람직하게 100 이하인 경우, 그러한 치료 용량은 유효 용량으로 간주된다.

환자 모니터링 (Subject monitoring)

전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상의 발병 가능성을 갖는 환자의 질병 상태 또는 치료는 본 발명의 진단 방법, 키트 및 조성물들을 사용하여 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 소변, 혈장, 양수, 또는 CSF와 같은, 체액에 존재하는 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 발현이, 모니터링될 수 있다. 가용성 엔도글린 모니터링은 sFlt-1, VEGF, 또는 PlGF, TGF-β, 또는 eNOS 폴리펩티드 또는 핵산, 또는 PGI₂의 발현을 모니터링하기 위한 방법들과 함께 행해질 수 있다. 이러한 모니터링은, 예를 들어, 환자에 있어서 특정 약물의 효능을 평가하거나 또는 질병의 진행 정도를 평가하는 데 유용할 수 있다. 가용성 엔도글린 핵산 분자 또는 폴리펩티드의 발현 또는 생물학적 활성을 감소시키는 치료는 본 발명에서 특히 유용할 수 있다.

스크리닝 분석 (Screening Assays)

상술한 바와 같이, 가용성 엔도글린 핵산 또는 폴리펩티드의 농도는 전자간증, 자간증, 또는 이러한 이상의 발병 소인을 갖는 환자에서 증가된다. 이러한 발견들에 기초하여, 본 발명의 조성물들은 전자간증 또는 자간증을 갖는 환자에 있어서 발현이 변경되는, 가용성 엔도글린 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 발현을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 후보 화합물들의 고효율 저비용 스크리닝에 유용하다.

많은 방법들이 가용성 엔도글린 핵산 분자의 발현을 변경하는 신규한 후보 화합물들을 동정하기 위한 스크리닝 분석법들을 수행하는데 유용하다. 예들은 U.S. Patent Application Publication No. 20060067937 및 PCT Publication No. WO 06/034507에 상세히 개시되어 있다.

하나의 실시예에서, 후보 화합물들은 가용성 엔도그린 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 화합물로 스크리닝될 수 있다. 이러한 후보 화합물의 효능은 이러한 폴리펩티드 또는 그 기능적 등가물과 상호작용하는 그것의 능력에 달려있다. 이러한 상호작용은 많은 표준 결합 기술들 및 면역 분석법과 같은 기능적 분석법들 또는 친화성 크로마토그래피 기반 분석법(예컨대, Ausubel et al., supra에 개시된 것)을 사용하여 쉽게 분석될 수 있다. 하나의 구현예에서, 가용성 엔도글린 폴리펩티드가 고정화되고 화합물들은 고정화된 가용성 엔도글린에 결합하는 능력에 대해 표준 친화성 크로마토그래피 기반 분석법들을 사용하여 테스트된다. 다음으로 고정화된 가용성 엔도글린에 결합하는 화합물들은 용출되고 정제되어 생체내 및 시험관내 모두의 가용성 엔도글린에 결합하는 그것의 능력 또는 가용성 엔도글린의 생물학적 활성을 저해하는 그것의 능력에 대해 추가적으로 테스트된다.

다른 예에서, 후보 화합물은 가용성 엔도글린 폴리펩티드 및 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈-A, BMP-2 및 BMP-7과 같은 성장인자의 결합을 감소시킴으로써 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 생물학적 활성을 감소시키는 그것의 능력에 대해 테스트된다. 이러한 분석법들은 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있으며 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 생물학적 활성은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려지거나 또는 본 명세서에 개시된 가용성 엔도글린 활성들의 임의의 분석법들을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 세포들은 Smad2/3-의존적 리포터 구조체(Smad2/3-dependent reporter construct)와 배양될 수 있다. 원하는 경우, 세포들은 또한 Smad2/3 의존적 리포터 구조체에 대한 시그널을 상승시키는 TGF-β의 존재하에서 배양될 수 있다. 다음으로, 세포들은 Smad2/3 의존적 리포터 구조체의 TGF-β-유도된 활성화를 감소 또는 저해시킬 가용성 엔도글린의 존재하에서 배양될 수 있다. 후보 화합물들은 세포에 첨가될 수 있으며 화합물로 처리되지 않은 세포들에 비해 가용성 엔도글린 처리된 세포들에서 Smad2/3 의존적 리포터 구조체의 TGF-β-유도된 활성화의 증가를 초래하는 임의의 화합물은, 전자간증 또는 자간증의 치료에 유용할 수 있는 화합물로 고려된다.

다른 예에서, Thr495에서 eNOS의 TGF-β-유도된 탈인산화는 또한 가용성 엔도글린 생물학적 활성의 변화에 대한 분석으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 예에서, 세포들은 가용성 엔도글린의 존재하에서 배양되는데, 후술하는 실시예에 나타난 가용성 엔도글린은, eNOS의 Thr495의 TGF-β 탈인산화를 저해한다. 이어서 후보 화합물이 세포에 첨가되어 Thr495의 인산화 상태가 결정된다. 화합물로 처리되지 않은 세포들에 비해 가용성 엔도글린 처리된 세포들에서 Thr495 탈인산화의 TGF-β-유도된 활성화의 증가를 초래하는 임의의 화합물은, 전자간증 또는 자간증의 치료에 유용할 수 있는 화합물로 고려된다.

도 1은 엔도글린 단백질의 개략도이다. SP: 시그널 펩티드(Signal peptide) (펩티드 선도 서열이라고도 함), ZP: 조나 펠루시다 도메인(zona pellucida domain), CL: 가용성 엔도글린의 방출을 위한 잠재적인 절단 사이트 (아미노산 437), TM: 막통과 도메인(transmembrane domain), Cyto: 세포질 도메인(cytoplasmic domain). 일단 시그널 펩타이드가 절단되면, 남은 성숙한 단백질은 아미노산 26의 글루탐산(glutamic acid) 잔기에서 시작된다.

도 2A는 가용성 엔도글린의 예측 cDNA 서열 (서열번호 1)을 나타낸다. 도 2B는 시그널 펩티드 (아미노산 1-25)를 포함하는 가용성 엔도그린의 예측된 아미노산 서열 (서열번호 2)을 나타낸다. 상기 서열이 ER에서 정상적으로 절단된 선도 펩티드를 포함한다는 것을 주목해야 한다.

도 3은 정상 임신의 태반(N), 조기 전자간증 임신의 태반(p) 및 만기 전자간증 임신의 태반(P)에서 엔도글린 mRNA 농도를 보여주는 노던 블롯이다.

도 4는 태반에서 엔도글린 단백질 농도를 보여주는 웨스턴 블롯이다. 샘플들은 두 명의 전자간증 환자, p32 및 p36으로부터 얻는데, 이는 2003년에 Beth Israel Deaconess Medical Center에 제출된, 임신한 여성의 모체 혈청으로부터 얻는다. 웨스턴 블롯은 Santa Cruz Biotechnology, Inc., (Santa Cruz, CA)로부터 얻은 N-터미널 항체를 사용하여 프로브되는데, 태반에서 110 kD 밴드 및 태반 및 혈청 샘플들에서 존재하는 작은 63 kD 밴드 둘 다를 보여준다.

도 5는 정상 임신, 경증 전자간증, 중증 전자간증 및 조산(pre-term delivery)에 의한 합병증이 있는 비-전자간증 임신 여성에서의 가용성 엔도글린의 순환성 농도(circulating concentrations)를 보여주는 그래프이다. 모든 혈액 표본들은 분만 전 24시간 이내에 얻었다. 가용성 엔도글린은 R & D Systems, MN (Cat # DNDG00)의 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 이러한 데이터는 전자간증 환자들에 있어서 임상 질환(clinical disease)의 시기에 가용성 엔도글린 농도가 현저하게 상승됨을 보여준다.

도 5은 5개의 서로 다른 임신 여성의 연구 그룹에 대한 다양한 재태기간 그룹 윈도우(various gestational age group windows) 중의 임신 기간에 걸친 평균 가용성 엔도글린 농도(mean soluble endoglin concentration)를 보여주는 그래프이다.

도 7은 5개의 서로 다른 임신 여성의 연구 그룹에 대한 다양한 재태기간 그룹 윈도우 중의 임신 기간에 걸친 평균 sFlt 농도(mean sFlt1 concentrations)를 보여주는 그래프이다.

도 8은 5개의 서로 다른 임신 여성의 연구 그룹에 대한 다양한 재태기간 그룹 윈도우 중의 임신 기간에 걸친 평균 PlGF 농도(mean PlGF concentrations)를 보여주는 그래프이다.

도 9는 임상 증상이 나타나기 전에 채취한 샘플들의 전자간증 항-혈관형성에 대한 가용성 엔도글린 항-혈관형성의 지수(soluble endoglin anti-angiogenic index)의 값들을 보여주는 그래프이다.

도 10은 임상의 미성숙 전자간증 발병 이전(PE < 37주)의 주수에 따른 가용성 엔도글린의 평균 농도를 보여주는 그래프이다.

도 11은 임상의 미성숙 전자간증 발병 이전(PE < 37주)의 주수에 따른 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 값을 보여주는 그래프이다.

도 12는 증상이 나타나기 전 또는 후에 전자간증의 기간(PE < 37주) 동안 가용성 엔도글린의 변화를 보여주는 그래프이다.

도 13은 증상이 나타나기 전 또는 후에 전자간증의 기간(PE < 37주) 동안 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수의 변경을 보여주는 그래프이다.

도 14는 임신성 고혈압 중 및 임신성 고혈압 (1-5주 선행하는 임신성 고혈압 (임신 33-36주 동안)) 이전의 여성 및 정상혈압의(normotensive) 대조군들에서 검출된 가용성 엔도글린 농도를 보여주는 그래프이다.

도 15는 임신성 고혈압 중 및 임신성 고혈압 (1-5주 선행하는 임신성 고혈압 (임신 33-36주 동안)) 이전의 여성 및 정상혈압의 대조군들에서 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도를 보여주는 그래프이다.

도 16은 중증 SGA, 경증 SGA의 여성들 및 정상혈압의 대조군들에서 33-36주 임신 기간대에 검출된 가용성 엔도글린 농도를 보여주는 그래프이다.

도 17은 중증 SGA, 경증 SGA의 여성들 및 정상혈압의 대조군들에서 33-36주 임신 기간대에 검출된 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수를 보여주는 그래프이다.

도 18은 서로에 대해 플롯팅된 동일한 임신 환자에 있어서 sFlt-1 및 가용성 엔도글린의 농도를 보여주는 그래프이다.

도 19는 25.2주에 얻은 전자간증 태반의 엔도글린(빨강) 및 평활근 액틴(초록)의 이중 면역형광염색(double immunofluorescence staining) 사진을 나타낸다. 엔도글린을 검출하기 위해 사용되는 항체는 전장 엔도글린 및 가용성 엔도글린 둘 다를 염색한다. 적절한 임신 기간대의 태반 대조군들은 조기 산통을 갖는 환자로부터 유래된다.

도 20은 41.3주에 얻은 전자간증 태반의 엔도글린(빨강) 및 평활근 액틴(초록)의 이중 면역형광염색(double immunofluorescence staining) 사진을 나타낸다. 엔도글린을 검출하기 위해 사용되는 항체는 전장 엔도글린 및 가용성 엔도글린 둘 다를 염색한다. 적절한 임신 기간대의 태반 대조군들은 조기 산통을 갖는 환자로부터 유래된다.

도 21A는 전자간증의 태반 및 혈청 둘 다를 이용한 엔도글린에 대한 면역침 전법(immunoprecipitation) 및 웨스턴 블롯 실험의 방사선(autoradiogram) 사진이다. 도 21B는 전자간증 태반을 이용한 엔도글린에 대한 면역침전법 및 웨스턴 블롯 심험의 방사선 사진이다. 세 가지 다른 N 및 P 샘플들은 개개의 환자들을 나타낸다. 양 도면에서, 면역침전법에는 시판되는 단일클론 항체를 사용하고, 웨스턴 블롯의 경우에는 폴리클로날 항체를 사용하였다. 이러한 항체들 둘 다는 엔도글린 단백질의 N-터미널 영역에 대하여 형성되고 전장 및 절단(truncated)된 가용성 엔도글린 단백질을 검출한다.

도 22는 성장인자 감소 매트리겔에서의 HUVECs를 이용한 혈관형성 분석 결과를 보여주는 그래프이다. 혈관형성 분석법들은 가용성 엔도글린 또는 sFlt-1 또는 양자의 존재하에 수행되었고 내피관 길이(endothelial tube lengths)를 측정하였다. C-는 대조군(control)을 나타내고 E-는 1 μg/ml의 가용성 엔도글린을 나타내며 S는 1 μg/ml의 sFlt-1을 나타낸다. E + S는 1 μg/ml의 E + 1 μg/ml의 sFlt-1의 조합을 나타낸다. 데이터는 세 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.

도 23은 재료 및 방법에 설명된 바와 같이 마우스에서 에반스 블루 리키지(Evans blue leakage)를 사용하여 평가된 몇 가지 기관 베드(organ bed)에서 미세혈관 투과성(microvascular permeability)을 보여주는 그래프이다. C-대조군(GFP), E-가용성 엔도글린, S-sFlt1 및 S+E-sFlt1 + 가용성 엔도글린. 데이터는 네 개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.

도 24는 200 pg/ml - 200 ng/ml 범위의 용량의 TGF-β1 (B1) 및 TGF-β3 (B3)의 존재하에서 미세혈관 반응성 실험된 랫트의 신장 미세혈관 직경(rat renal microvessel diameter)의 퍼센트 변화를 보여주는 그래프이다. 1 μg/ml의 가용성 엔도글린(E)의 존재하에 동일한 실험을 반복하였다. 이러한 주어진 데이터는 4개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.

도 25는 1 ng/ml의 VEGF (V), TGF-β1 (B1) 및 그 조합 (V + B1)의 존재시 신장 미세혈관 직경의 퍼센트 변화를 보여주는 그래프이다. 또한 각각 1 μg/ml의 sFlt1 (S) 및 가용성 엔도글린(E)의 조합(V + B1 + S + E)의 효과를 보여준다. 데이터는 4개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.

도 26A는 sFlt1 및 대조군 아데노바이러스(CMV)를 함께 주입한 임신한 랫트의 치사시에 채취한 혈액 샘플들의 주변 스미어(peripheral smear)의 사진이다. 도 26B는 sFlt1 및 아데노바이러스 발현 가용성 엔도글린을 함께 주입한 임신한 랫트의 치사시에 채취한 혈액 샘플들의 주변 스미어 사진인데, 분열적혈구(schistocyes) 및 증가된 망상적혈구(reticulocyte) 수에 의해 증명되는 활성 용혈(active hemolysis)을 설명한다. 화살표(Arrowhead)는 분열적혈구를 나타낸다.

도 27A-D는 표 8에서 설명된 다양한 동물군들의 신장 조직구조(renal histology; H & E stain)를 보여주는 일련의 사진이다. 도 27A는 사구체 내피증식(glomerular endotheliosis)이 나타나지 않은 대조군에 대한 신장 조직구조를 보여준다. 도 27B는 사구체 내피증식이 나타나지 않은 가용성 엔도글린이 주입된 군에 대한 신장 조직구조를 보여준다. 도 27C는 적당한 내피증식을 보여주는 sFlt1이 주입된 랫트에 대한 신장 조직구조를 보여준다 (화살표 표시). 도 27D는 족세 포(podocytes)에서이 단백질 흡수 소적(resorption droplets)에 의해 중증 사구체 내피증식 및 심하게 부푼 사구염(swollen glomeruli)을 보이는 가용성 엔도글린 및 sFlt1 주입된 랫트에 대한 신장 조직구조를 보여준다. 모든 광학 현미경은 60X의 배율을 가진다 (original magnification).

도 28은 실시예 3에 나타난 바와 같이 전자간증의 다양한 정도를 갖는 환자들, 대조군 임산부 및 4명의 임신하지 않은 건강한 지원자의 혈청에서 가용성 엔도글린(sEng) 및 sFlt1에 대한 ELISA 결과를 보여주는 그래프이다. * 조기 대조군들과 비교할 때 P < 0.05 및 # 중증 전자간증와 비교할 때 P < 0.05.

도 29는 분만 전- (0-12 시간) 및 후- (48 시간)에 혈액 채취(blood drawn)한 실시예 3에 나타난 임신한 환자들(정상: n=6; 전자간증: n=11)의 군(subset)에서 가용성 엔도글린에 대한 ELISA 결과를 보여주는 그래프이다. * T=0 샘플들과 비교할 때 P < 0.05.

도 30A는 전자간증 환자들의 혈청 정제 후 가용성 엔도글린을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 44G4-IgG (anti-Eng) Sepharose로부터 용출된 프랙션(Fractions) 4 및 5는 감소 조건(reducing conditions)하에서 SDS-PAGE에 걸어 엔도그린에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 테스트되었다. 용출된 프랙션들은 질량 분석기 분석(mass spectrometry analysis)에 제공되었다. 도 30B는 인간 엔도글린의 서열을 나타낸다 (SEQ ID NO: 5). 질량 분석기에 의해 동정된 펩티드들은 볼드체 및 언더라인으로 나타난다. 언더라인된 아미노산들은 인간 세포 표면 엔도글린의 막통과 도메인(transmembrane domain)을 나타낸다. 아미노산 1-25는 선도 펩티드를 나타 내므로, 아미노산 서열 넘버링은 26에서 시작함을 주의한다. 서열 목록(sequence listing)에서 SEQ ID NO: 5로 되어 있는 서열은 아미노산 1에서 시작하는데, 도면에서 아미노산 26은 서열 목록에서 아미노산 1이며, 도면에서 아미노산 658은 서열 목록에서 아미노산 633임을 주의한다. 아미노산들의 넘버링은 기준 서열(reference sequence)에 따라 조정된다 (예컨대, 도 30B에 지시하는 서열들에 대한 아미노산들 26 내지 658은 SEQ ID NO: 5에서 지시하는 서열들에 대한 아미노산들 1 내지 633과 동일하다).

도 31은 가용성 엔도글린이 모세관 형성(capillary formation)을 저해하여 혈관 투과성(vascular permeability)을 증가시킴을 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 1 μg의 재조합 가용성 엔도글린, sFlt-1, 또는 둘 다의 존재하에 성장인자 감소 MatrigelTM에서 HUVEC를 사용하여 혈관형성 분석을 수행하고, 내피세포 튜브 길이를 측정하였다. 대표 실험(n=4)은 패널 아래 표시된 픽셀들의 길이로 나타내었다.

도 32는 가용성 엔도글린에 의한 장간막맥관(mesenteric vessel)에서 TGF-β1-매개된 혈관 반응성(TGF-β1-mediated vascular reactivity)의 저해를 보여주는 일련의 그래프이다. 랫트 장간막 미세맥관(mesenteric microvessel)의 미세혈관 반응성은 200 pg/ml에서 200 ng/ml까지의 TGF-β1 또는 TGF-β3의 존재하에서 측정된다. 실험은 1 μg/ml에서 재조합 가용성 엔도글린의 존재하에 반복되었다. 4개의 독립된 실험들의 평균±SE을 나타내었다 (상부 패널). 또한 1 ng/ml에서 TGFβ1에 대한 L-NAME의 차단 효과를 나타낸다 (하부 패널).

도 33은 임신한 랫트에서 사구체 내피증식을 보여주는 일련의 현미경 사진들이다. 대조군 임신한 랫트(상부 패널), 가용성 엔도글린(sEng)-처리된 임신한 랫트(중간 패널) 및 조합한 그룹 - 가용성 엔도글린(sEng)+sFlt1(하부 패널)로부터 얻은 사구체의 전자 현미경 사진(EM)을 보여준다. 이러한 사진들의 상부 및 중간 패널은 6200X(실물 확대) 및 하부 패널은 5000X(실물 확대)로 찍었다.

도 34 A-H는 가용성 엔도글린 및 sFlt1 처리 후 임신한 랫트에서 신장, 태반 및 간의 조직학적 변화 및 말초 혈액 스미어를 보여주는 일련의 현미경 사진이다. 대조군(도 34A), sEng(도 34B), sFlt1(도 34C) 및 sFlt1+sEng(도 34D) 그룹들의 태반 조직학 (H &E 염색). 가용성 엔도글린 및 sFlt1 둘 다 처리된 동물들은 대조군들에서는 나타나지 않는, 모체-태아 연결부(maternal-fetal junction)에서 확산된 염증(화살표)을 나타낸다. sFlt1+sEng 처리된 태반(도 34D)의 데키두아(decidua)에서 모체의 맥관(maternal vessel)(화살표)의 관내 폐색(lumen obstruction)을 갖는 출혈경색(hemorrhagic infarction) 및 피브리노이드 괴사(fibrinoid necrosis)가 나타난다. 스케일 바, 200 μm (도 34E-H). 대조군(도 34E), sFlt1 (도 34G) 및 sFlt1+sEng (도 34H) 그룹들에서 간 조직학. 다발성 괴사(multifocal necrosis)(화살촉)를 갖는 허혈성 변화들(ischemic changes)은 sFlt1+sEng 그룹(도 34H)에서 나타난다. 대조군 및 sEng 또는 sFlt-1이 주어진 랫트들은 변화를 보이지 않았다. 스케일 바, 200 μm.

도 35A-D는 재조합 sEng가 TGF-β1 결합 및 활성, 및 eNOS 활성화를 통한 혈관확장(vasodilation)에 미치는 sEng의 영향을 약화시킴을 일련의 그래프들 및 오 토라이오그램(autoradiograms)이다. 도 35A는 1 ng/ml의 VEGF, TGF-β1 및 그 조합에 대한 신장의 미세맥관(microvessels)의 미세혈관 반응들을 보여주는 그래프이다. 조합된 반응에 대한 각각 100 ng/ml의 sFlt1 및 sEng의 효과를 보여주고 있다 (n=4). 또한 TGFβ1 및 VEGF 자극된 반응들에 대한 L-NAME의 차단 효과를 보여주고 있다. 도 35B는 마우스 내피세포들에서 TβRII에 결합하는 [I¹²⁵] TGF-β1의 투여량-의존적 증가의 대표 오토라디오그램 및 그래프이다. 5 nM 재조합 가용성 엔도글린 처리는 50 pM 및 100 pM에서 결합을 감소시켰다 (*P < 0.05 vs 비처리 그룹). 100 pM [I¹²⁵] TGF-β1로 처리된 세포들에서 40X 과잉의 저온성 TGF-β1(40X excess cold TGF-β1)을 가진 경쟁(competition)은 수용체 결합을 파괴하여 백그라운드 대조군으로서 제공하였다. 도 35C는 HUVECs에 트랜스펙션된 Smad 2/3-의존적 CAGA-Luc 리포터 구조체의 현저히 감소된 TGF-β-유도된 활성화 및 sEng로 처리에 의한 저해를 보여주는 그래프이다. (n=3, **P < 0.01 vs. sEng 비처리 그룹). 도 35D는 eNOS Thr495에서 현저한 탈인산화에 이은 TGF-β1로 처리 및 sEng에 의한 약화를 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯 및 그래프(n=4)이다 (*P < 0.05 vs. 비처리). 인산화는 Ser1177에서 불변하였고 전체 eNOS 농도는 실험 전반에 걸쳐 일정하게 유지되었다.

도 36은 재조합 sFlt1 및 가용성 엔도글린의 발현을 설명하는 랫트 혈장의 두 개의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 상부 패널: 임신한 랫트로부터 얻은 혈장 표본들(plasma specimens)이 개시된 방법에 사용되었다. 레인 1, 2 및 3은 양성 대조 군으로 사용된 재조합 마우스 Flt1-Fc의 200 pg, 500 pg 및 2 ng을 나타낸다. 1개의 대조군 랫트 및 2개의 sFlt1 처리된 랫트들에서 얻은 20 μl의 혈장 표본들을 나타낸다. sFlt1 (53 kDa) 밴드는 sFlt1 처리된 랫트들에서 검출되었다. sFlt1 발현의 정량은 상업적으로 이용할 수 있는 ELISA을 사용하여 수행되었다 (표 8). 하부 패널: 임신한 랫트들에서 얻은 혈장 표본들이 sEng 발현을 검출하는데 (임신 3기 초기에) 사용되었다. 레인 1은 500 pg의 재조합 인간 가용성 엔도글린을 나타내고 레인 2 및 3은 각가 sEng 처리된 및 대조군 랫트에서 얻은 30 μl의 혈장을 나타낸다. 블롯은 대조군에서 가용성 엔도글린이 없으나 처리된 랫트들에서는 재조합 sEng의 발현이 강함을 보여준다. 가용성 엔도글린의 정량은 상업적으로 이용할 수 있는 ELISA를 사용하여 수행되었다 (표 8).

도 37은 대조군들, 모든 전자간증 및 37주 이하 전자간증에서 델타 sFlt1 및 델타 sEng (임신 1기 - 2기 값)의 분포를 보여주는 그래프이다.

도 38은 임신 1기에서(산물 1), 임신 2기에서(산물 2), 대조군들에서 델타 산물(산물 1 - 산물 2), 모든 전자간증 및 37주 이하 전자간증에서 sFlt x sEng 산물의 분포를 보여주는 그래프이다.

도 39는 델타 산물의 3분위수들(tertiles)에 따른 전자간증의 위험도를 보여주는 그래프이다. -1 보다 작은 델타 산물을 갖는 여성들과 비교하여, +1 보다 큰 델타 산물 농도를 갖는 그룹에서의 조기 전자간증 위험의 증가[aOR 5.5, 95% CI 1.4 - 22.4]는 통계적으로 현저하였다.

도 40A는 엔도글린이 Thr495에서 eNOS의 TGF-β1 유도된 탈인산화에 필요함 을 보여주는 웨스턴 블롯이다. 도 40B는 전체 eNOS에 비례하여 eNOS Thr495 인산화의 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 그 결과는 인산화된 Thr495의 농도가 가용성 엔도글린의 부재가 아닌 가용성 엔도그린의 존재하에서 TGF-β1가 존재할 때 감소됨을 나타낸다.

이하 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 전자간증 발병한 임신한 여성에서의 엔도글린 mRNA 와 단백질의 상승된 농도 (Increased levels of endoglin mRNA and protein in pregnant women with pre-eclampsia)

전자간증에 있어서 병리학적 역할을 수행하는 신규한 분비 인자들을 동정하기 위해서, Affymetrix U95A 마이크로어레이 칩(chips)을 사용하여 17명의 전자간증인 임신한 여성 및 13명의 정상 임신 여성을 대상으로 태반 조직의 유전자 발현 프로파일링(profiling)을 수행하였다. 전자간증 발병 여성의 경우 엔도글린의 유전자가 상향조절됨을 발견하였다.

전자간증에 있어서 엔도글린의 상향조절을 확인하기 위해, 정상혈압의 임신한 여성과 비교하여 전자간증의 임신한 여성에 있어서, 노던 블롯을 하여 태반의 엔도글린 mRNA 농도을 분석하였고(도 3), 웨스턴 블롯 분석을 하여 엔도글린의 혈 청 단백질 농도를 측정하였다(도 4). 전자간증은 (1) 재태 20주 후에 수축기 혈압 (BP) >140 mmHg 및 확장기 혈압 BP >90 mmHg, (2) 새로운 단백뇨의 발병 (소변 검사시 딥스틱에 의할 경우 1+, 24 시간 소변 회수물에서 300mg을 초과하는 단백질, 또는 단백질/크레아티닌비가 0.3을 초과하는 임의의 단일 소변 샘플) 및 (3) 분만 후 12주에 고혈압 및 단백뇨의 소실로서 정의된다. 원래(underlying) 고혈압, 단백뇨, 또는 신장 질환이 있는 환자들을 배제하였다. 환자들을 신장염 범위의 단백뇨(nephritic range protanurea)(24시간 소변 수집으로 3g을 초과하는 단백질 또는 단백질/크레아티닌비가 3.0 이상인 소변)의 존재 또는 부존재에 기초하여 경증 및 중증 전자간증으로 분류하였다. 평균 소변 단백질/크레아티닌비는 경증 전자간증 군에서는 0.94 +/- 0.2이고 중증 전자간증 군에서는 7.8 +/- 2.1이었다. 다양한 군들의 평균 재태기간은 다음과 같다: 정상 38.8 +/-0.2주, 경증 전자간증 34 +/- 1.2주, 중증 전자간증 31.3 +/-0.6주 및 조산 29.5 +/- 2.0주. 분만 후 즉시 태반 샘플들을 얻었다. 각각의 태반으로부터 4개의 임의의 샘플들을 채취해, RNAlater 안정화 용액 (Ambion, Austin, TX) 안에 넣고 -70℃에서 보존하였다. Qiagen RNAeasy Maxi 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 RNA 분리를 하였다.

정상화 대조군이 태반 엔도글린 mRNA의 증가를 보임으로써 노던 블롯에 의해 N-terminal region (gene bank #BC014271) 에 해당되는 엔도글린(Unigene Hs.76753)의 코딩 영역에서의 400 염기쌍 프로브 및 18S 프로브를 가지고 프로브를 하였다. 웨스턴 블롯에서는 정상혈압의 임신한 여성과 비교하여 전자간증의 임신한 여성에 있어서 엔도글린 단백질의 태반 및 모체의 혈청 농도 둘다의 증가를 보이는 엔도글린의 아미노 터미널에 대한 항체를 가지고 프로브를 하였다 (see Knebelmann et al., Cancer Res. 58:226-231 (1998)). 엔도글린의 아미노 말단에 대한 항체로 프로브한 웨스턴 블롯 결과 정상 혈압 임신 여성과 비교하여 전자간증인 임신 여성의 경우 태반 및 모계 혈청 모두에서 엔도글린 농도가 증가하는 것을 알 수 있었다.

실시예 2. 전자간증 환자들의 태반 및 혈청에서의 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 증명(Demonstration of a soluble endoglin polypeptide in the placentas and serum of pre-eclamptic patients)

웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 전자간증 여성의 태반 및 혈청 내 엔도글린 단백질의 농도를 측정한 결과 전자간증의 임신한 여성의 태반 및 혈청 더 작은 단백질(63 -65 kDa)이 존재함을 알 수 있었다(도 4 및 30A). 이러한 더 작은 단편이 엔도글린의 세포외 도메인임을 증명하였다. 이러한 트렁케이티드 버젼(truncated version)은 전자간증 발병 환자들의 경우, 태반의 융합세포영양막 및 내피 세포로부터 흘러나와서 과잉의 양으로 순환할 것으로 예상된다. 이러한 엔도글린의 가용성 형태는 정상 혈관 건강에 필요한 혈중 리간드들(circulating ligands)에 결합함으로써 항-혈관형성제로서 작용할 수 있다.

상기 단백질의 가용성 형태의 길이는 약 437아미노산으로 이뤄져 있다(이는 펩티드 the leader sequence 을 포함한 것으로 the leader sequence 을 제외하면 412 아미노산으로 구성) sEng 은 전자간증 환자의 혈청에서 정제되었다. The 44G4- IgG (anti-Eng) Sepharose 에서 희석된 단편 4 및 5는 감소 조건(reducing conditions) 하에서 SDS-PAGE에 걸어주거나 Eng의 다중클로날항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 테스트하였다. 희석된 단편들은 질량분석 (mass spectrometry)을 하고 (3 runs) 이를 통해 분석된 펩티드들을 (도 30B)에 나타내었다. 질량 분석을 통한 정제와 분석 결과는 Gly40 내지 Arg406의 Eng-특이적 펩티드들은 인간 엔도글린의 서열에서 전체 단백질 중에 N-말단 구역에 해당하는 가용성 형태(가용성 엔도글린)를 나타낸다는 것을 보여준다.

실시예 3. 정상 및 전자간증의 임신 여성에 있어서 가용성 엔도글린의 혈중(circulating) 농도의 비교

정상, 경증 전자간증, 또는 중증 전자간증인 여성 혈청의 혈중, 가용성 엔도글린의 농도를 비교하기 위해서, 이러한 여성으로부터 채취한 혈액 샘플들의 ELISA 분석을 하였다. 이 연구를 위한 모든 환자들은 IRB-승인된 동의서를 받은 후 the Beth Israel Deaconess Medical Center 에서 모집하였다.

전자간증은 (1) 임신 20주 후에 수축기 혈압 (BP) >140 mmHg 및 확장기 혈압 BP >90 mmHg, (2) 새로운 단백뇨의 발병 (소변 검사시 딥스틱에 의할 경우 1+, 24 시간 회수물에서 300mg을 초과하는 단백질, 또는 단백질/크레아티닌비가 0.3을 초과하는 임의의 단일 소변 샘플) 및 (3) 분만 후 12주에 고혈압 및 단백뇨의 소실로서 정의된다. 원래(underlying) 고혈압, 단백뇨, 또는 신장 질환이 있는 환자들을 배제하였다. 환자들을 신장염 범위의 단백뇨(nephritic range protanurea)(24시 간 소변 수집으로 3g을 초과하는 단백질 또는 단백질/크레아티닌비가 3.0 이상인 소변)의 존재 또는 부존재에 기초하여 경증 및 중증 전자간증으로 분류하였다.

환자들을 신장염 범위(24시간 소변 수집으로 3g을 초과하는 단백질 또는 단백질/크레아티닌비가 3.0 이상인 소변)의 단백뇨의 존재 또는 부존재에 기초해 경증 및 중증 전자간증으로 분류하였다.

환자가 혈소판감소증(<100000 cells/㎕)), 증가된 LDH (>600 IU/L) 및 증가된 AST (>70 IU/L)의 증상을 보일 때 HELLP syndrome라고 판단된다. 건강한 임산부를 대조군으로 선택하였다. 다른 의학상 이유로 조기 분만한 8명의 환자는 추가 대조군으로 선택되었다. 태반 샘플들은 분만 후 즉시 수득되었다. 혈청은 동의서를 받아 임신한 환자들로부터 분만 중(태반 분산 하기 0-12시간 전)에 수득하였다. 이러한 실험들은 the Beth Israel Deaconess Medical Center의 the Institutional Review Board에 따라 수행하였다.

표 1에 기재된 바와 같이 환자에게서 수득한 혈청 표본을 사용하여, 전자간증인 환자들의 다양한 그룹들 및 대조군 임신한 환자들의 수용성 엔도글린의 혈중 농도를 특정하였다. 전자간증 환자들을 HELLP인 군과 그렇지 않은 군들로 세부 구분하였을 때, sEng의 농도가 재태기간을 맞춘 조기 분만한 대조군(gestational age-matched pre-term controls )과 비교하여 정상, 경증, HELLP syndrome전자간증에 비하여 3배, 5배,10배까지 높았다(도 28). sFlt1보다 sEng의 농도가 더 높은 HELLP 군을 제외하면 임신한 환자들의 sEng의 농도는 sFlt1의 농도와 상관관계가 있다(R2 = 0.56). 환자의 subset 에서 태반을 분만 후 48시간 이후에 수득한 혈액 샘플은 전자간증 환자 및 정상 임산부 환자들의 경우 평균 sEng 혈중(circulating) 농도에 비하여 70% 감소한 결과를 보였다(도 29).

표 1:다양한 환자군에서의 임상학적 특성 및 혈중 가용성 엔도글린 (Clinical characteristics and circulating soluble endoglin in the various patient grop)

^*P<0.05, ^**P<0.005

가용성 엔도글린의 평균 혈청 농도는 경증 전자간증는 적어도 2배이고, 중증 전자간증 환자는 3-4배 이다. HELLP syndrome 복합 pre-eclamptic 환자의 경우에 는, 가용성 엔도글린의 농도가 같은 재태기간의 대조군 표본과 비교하여 적어도 5-10배에 이르렀다. 추가적으로, 임신한 환자들의 가용성 엔도글린 농도는 sFlt-1 의 수준과 관련이 있다(도18). R2 값은 0.6이였다. (여기에 기록된 sFlt-1 혈중 농도는 이전에 기재된 것 (Maynard et al., supra)에 비해 적어도 4-5배에 달했다. ) 이것은 분석 디루언트(assay diluent)에서의 요소(urea)가 부족한 R&D systems의 새로운 ELISA kit의 민감도 차이 때문이므로 이전에 공개된 것보다 일관되게 높은 값을 준다. 다시말해서, 최고수준의 가용성 엔도글린을 가진 환자들은 또한 최고농도의 혈중(circulating) 수준을 가졌다. 태반 면역조직화학(immunohistochemistry )에서 보여지는 바에 따라 진하게 염색된 부분에 따르면, 가용성 엔도글린의 기원은 거의 대부분 태반의 syncitiotrophoblast 일 것이다(도 19,20).이러한 도면들은 엔도글린 단백질이 syncitiotrophoblast 에 의해 발현되고 전자간증의 경우 광범위하게 상향조절된다는 것을 보여준다. 웨스턴 블롯데이터(도면 21A 및 21B)와 노던 블랏으로 탐지되는 대체가능한 splice variants 의 부족현상은 가용성 엔도글린이 막 엔도글린 단백질 세포외 도메인의 shed form 일 가능성을 나타낸다. 그것은 대략 그 크기가 65 kDA 이고 전자간증인 태반에서 상향된 수준으로 생산되며 전자간증 sera에서 더 많은 양으로 순환한다. 이러한 단백질은 정상 임신 여성의 sera에서 보다 훨신 더 낮은 양으로 존재하고, 임신하지 않은 여성의 경우에는 거의 탐지 할 수 없다. 전자간증 태반에서 가용성 엔도글린은 평균 임신 여성의 경우와 비교해서 4배 이상의 발현양을 나타냈다(n=1-/group, P<0.01). 이러한 표본들에서 sEng/Eng 의 양은 정상 태반 (0.43) 과 전자간증의 태반 (0.56) 에서 상당할만한 차이가 없었는바 (n = 10/group, P = 0.4) 이는 sEng 가 전체 단백질에서 유래되었고 모든 Eng 및 sEng 은 전자간증에서 비슷하게 증가한다는 것을 암시한다.

이하 방법들은 본 실시예에서 기재된 실험들을 위해 사용된 것이다.

면역조직화학(Immunohistochemistry)

면역조직화학법을 이용한 태반 샘플의 엔도글린과 α-Smooth muscle actin (SMA)의 분석은 (Leach et al., Lancet 360:1215-1219 (2002))에 따라 수행하였다. 간단히 말해서, 전자간증이 아닌 환자 (n=10) 및 전자간증인 환자(n=10)로부터 수득한 냉동 태반 부분은 상온에서 30분 동안 a serum-free protein blocking solution (DAKO)와 함께 인큐베이션한 후 상온에서 2시간 동안 1차 항체와 반응시켰다(쥐 모노클로날 항-엔도글린(mouse monoclonal anti-Endoglin): 1:50 dilution; DAKO). 그 슬라이드를 10분 동안 염으로 버퍼된 인산염으로 세척하였다.

2차 항체, 로다민(Rhodamine)으로 컨쥬게이트된 sheep anti-mouse IgG , 1:200 dilution (Biomeda) 는 1시간 동안 적용시켰다. 이들을 다시 염으로 버퍼된 인산염으로 세척하고 상온에서 30분 동안 FITC-conjugated mouse anti-human SMA (Dako)의 1:400 dilution 와 함께 둔다. 엔도글린의 면역반응은 임상 진단 결과를 모르는 상태의 병리학자들이 SPOT 어드벤스드(advanced) 이미징 시스템 (RT SLIDER Diagnostic Instruments, Inc)을 사용하여 검토하였다.

ELISA 및 웨스턴 블롯(ELISA and Western blots)

R&D systems, MN (예를 들어, Cat # DNDG00)의 상업용 키트를 사용하여 제조자의 설명서(Maynard et al, J. Clin. Invest. 111:649-658, 2003)에 따라 다양한 단백질들(sFltl, 가용성 엔도글린)의 ELISA를 수행하였다. 웨스턴 블롯은 이전에 기재된 바대로 시행하였다 (Maynard et al, supra, and Kuo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 98:4605-4610 (2001))).

면역침전법(IP) 실험(Immunoprecipitation experiments)

웨스턴 블롯에 이어 전자간증 발병 환자들의 태반의 조직 및 혈청 표본들에서 가용성 엔도글린을 동정하고 특성화하는데 IP를 사용하였다. 인간 태반의 조직을 차가운 PBS로 세척한 후 균질화 버퍼[10 mM Tris-HCl, pH 7.4; 15 mM NaCl; 60mM KCl; 1 niM EDTA; 0.1 mM EGTA; 0.5% NonidetP-40; 5% 슈크로즈; Roche (Indianapolis, IN)의 프로테아제 혼합물]에서 10 분 동안 라이싱하였다. 이어서 태반 라이세이트를 항-인간 단일클론 마우스 엔도글린 항체로 면역침전하였다 (mAb P4A4, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). 제조자의 설명서에 따라 immunopure IgG 배향 키트(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)를 사용하여 3-5 mg의 정제된 항체를 2ml 단백질 A-세파로스(protein ASepharose)에 직접 결합하게 하여 면역친화성 칼럼(Immunoaffinity columns)을 제조하였다. 이어서 칼 럼을 프로테아제혼합물을 함유하는 RIPA 버퍼로 광범위하게 세척한 후, 결합된 단백질들을 pH 2.8, 0.1 mol/L 글라이신-HCl 버퍼로 녹여서 분리하였다. 용리액(eluent)을 1 mol/L Tris-HCl 버퍼를 함유하는 0.5-ml 분획물로 수집하였다. 단백질-함유 분획물(Protein-containing fractions)을 풀링(pool)하고 CENTRICON Centrifugal Concentrator(Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA)로 9- 내지 10-배로 농축하였다. 면역침전된 샘플들을 4-12% 구배 겔(Invitrogen)로 분리하고 단백질들을 폴리비닐리덴 디플로라이드(PVDF) 막에 전이시켰다. 엔도글린 단백질을 다중클론 항-인간 토끼 엔도글린 프라이머리 항체 H-300, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다.

가용성 엔도글린의 정제 및 질량 분석기에 의한 분석(Purification of soluble endoglin and analysis by mass spectrometry)

전자간증 환자로부터 채취한 혈청(10 ml)은 알부민과 이뮤노글로블린을 제거하기 위하여 계속하여 CM Affi-gel blue 및 protein A Sepharose (Bio-Rad) columns에 적용하였다. The flow through는 세파로즈(Sepharose)로 콘쥬게이트된 인간 Eng에 대한 mAb 44G4 IgG의 2.5 ml column에 천천히 적용되었다 (Gougos et al., Int. Immuno. 4:83-92, (1992)). 걸린(bound) 단편들은 0.02 M 디에틸라민(diethylamine) pH 11.4로 희석되고, 즉시 1 M Tris pH 7.8로 중성화되었다. 280 nm의 상승된 흡수도를 가지는 단편 4,5가 풀링되었고, 57℃ 1시간 동안 10 mM DTT로 감소시켰고, 0.055 M 아이오도아세토마이드(iodoacetomide)로 알킬화되었다. 그 다음에 샘플은 트립신(1:100)으로 완벽하게 분해되었다. 리소필라이즈(lysophilize)된 샘플은 0.1% tri-fluoroacetic acid 에 다시 걸어놓고 a CapLC (Waters) HPLC 기구 안에 주입되었다. 펩티드들은 75μm Nano Series column (LC Packings) 를 사용하여 분리하였고 a Qstar XL MS/MS system를 사용하여 분석하였다. 그 데이터는 인간 단백질 데이터 베이스 NCBInr를 기초하여 the Mascot search engine (Matrix Science)를 사용해 조사하였다.

실시예 4. 혈관 형성 모델 분석(Model assay for angiogenesis)

내피관 분석이 혈관 형성의 생체 외(인 비트로) 모델에 사용될 수 있다. 성장 인자 감소된 매트리겔(7 mg/mL, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)을 사전 동결된(pre-chilled) 48-웰 세포 배양 플레이트의 웰(100 μl/웰)에 넣고 37℃에서 25-30 분 동안 인큐베이션하여 중합시켰다. 3-5계대의 인간 제대정맥 내피 세포(무혈청의 내피의 기저 배지 300 μl에 30,000 +, Clonetics, Walkersville, MD)를 10% 환자 혈청으로 처리하고, 매트리겔 코팅된 웰 상에 플레이팅하고, 37℃에서 12-16 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 튜브 형성은 4X로 역 위상차 현미경(inverted phase contrast microscope)(Nikon Corporation, Tokyo, Japan)을 통해 평가하고 Simple PCI 영상화 분석법 소프트웨어를 사용하여 분석하였다(튜브 면적 및 총 길이) .

실시예 5. 전자간증 및 자간증 여성의 진단 인디케이터로서 가용성 엔도글린 단백질 농도(Soluble endoglin protein levels as a diagnostic indicator of pre-eclampsia and eclampsia in women; Romero Study)

이러한 연구는 가용성 엔도글린이 임상의 전자간증 중에 변경되는지와 여성의 전자간증 및 자간증을 예상하는 데 사용할 수 있는지를 평가하기 위해 고안되었다. 이러한 연구는 Wayne State University/NICHD Perinatology Branch, Detroit, MI의 Dr. Roberto Romero와 공동으로 진행하였다. 이전에 Chaiworapongsa et al.(The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine, January 2005, 17 (1):3- 18)에 개시된 바와 같이 저장된 생물학적 샘플 데이타베이스를 사용하여 후향의 장기적인 환자군-대조군 연구(case-control study)를 수행하였다. 모든 여성을 Sotero del Rio Hospital, Santiago, Chile의 출산 전 클리닉(prenatal clinic)에 등록하고, 분만할 때까지 관찰하였다. 출산 전 방문(Prenatal visits)을 제 1 및 제 2의 3개월에는 4주 간격으로, 제 3의 3개월에는 2주 간격으로 분만할 때까지 계획하였다. 혈장 샘플들을 다음의 6개의 간격 각각에서 단지 한번 각각의 환자로부터 선택하였다: 임신 기간의 (1) 7-16주, (2) 16-24주, (3) 24-28주, (4) 28-32주, (5) 32-37주 및(6) >37주. 각각의 전자간증의 경우에 있어서, 전자간증 임상 진단의 시기에 재태기간(+/- 2주)을 매칭함으로써 하나의 대조군을 선택하였다. 전자간증 진단의 임상의 척도(criteria)는 이전에 Chaiworapongsa 등 상술한 문헌에 개시된 것과 동일하다.

혈장 엔도글린 수준의 측정(Measurement of Plasma Endoglin Levels)

-70℃에서 저장한 혈장 샘플들을 녹이고 혈장 가용성 엔도글린 수준을 상업용으로 시판되는 R&D systems, Minneapolis, MN.( Catalog # DNDG00)사의 ELISA 키트를 사용하여 하나의 배치(batch)로 측정하였다.

통계 분석(Stastistical Analysis)

혈액 샘플링의 재태기간 및 샘플 저장의 간격을 조절한 후에 공분산(covariance) 분석법을 사용하여 전자간증 발병 예정 환자들 및 정상 임산부 사이의 가용성 엔도글린의 혈장 농도의 차이를 평가하였다. 비율(proportions) 비교를 위해 Chisquare또는 Fisher's exact tset를 이용하였다. 사용된 통계 패키지(statistics package)는 SPSS V.12(SPSS Inc., Chicago, IL)이었다. 통계학적 유의성(Significance)은 p 값이 0.05 이하로 하였다.

결과(Results)

연구 모집단(population)의 임상 특성을 표 2에 나타내었다. 전자간증을 갖는 군은 더 많은 미분만부(nulliparous) 여성을 포함하고 대조군보다 조기에 분만하였다. 중요한 점은, 태아의 출생시 체중이 전자간증의 군에서 더 작았고 재태 기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 여성의 비율이 더 높았다는 점이다.

표 2. 연구 모집단에서의 임상 특성

평균±표준편차 또는 수(퍼센트)로서 표현된 값

GA: 재태기간(gestational age)

전자간증 발병 환자들의 임상 특성을 표 3에 나타내었다. 환자들의 3분의 2(72%)가 중증 전자간증을 보였으나, 10명의 환자들은 발병 <34주의 중증의 조기 발병 전자간증을 보였다.

표 3. 전자간증 환자들에서의 임상 특성(Clinical characteristics of patients with pre-eclampsia)

평균±표준편차 또는 수(퍼센트)로서 표현된 값

^α(n=26); ^β(n=42)

6 개의 재태기간대에서 측정된 대조군 및 전자간증의 여성의 혈청 가용성 엔도글린 농도를 표 4에 도시하였다. 전자간증의, 그들의 표본들은 2개의 군들 - 임상의 전자간증(전자간증의 증상이 나타나는 시기에 채취한 샘플들) 및 임상전의 전자간증(임상의 증상들이 나타나기 이전에 채취한 샘플들)으로 분류하였다. 데이타는 중기-임신(재태 기간의 24-28주)에서, 혈청 가용성 엔도글린 농도가 전자간증 발병 예정된 여성에 있어서 상승하기 시작하고 임신 기간 28-32주의 대조군에 비해 적어도 3 배 이상 높아지는 것을 보여준다. 임상의 전자간증 발병 여성으로부터 채취한 혈액 샘플들은 대조군에 매칭되는 재태기간에 비교하는 경우 매우 극적인 상승(대략 10-15 배)을 보여준다.

표 4. 정상 임신 및 전자간증에서의 혈장 가용성 엔도글린의 농도(Plasma soluble endoglin concentrations in normal pregnancy and pre-eclampsia)

p^β:임상 소견에서 전자간증 및 정상 임신의 샘플 사이에서의 비교

평균±표준편차로서 표현된 값

δ:2명의 전자간증 환자들은 임상 소견에서 적용 가능한 혈액 샘플이 없음

혈장 가용성 엔도글린 농도 및 전자간증의 임상 진단 간격 사이의 관계를 시험하기 위해, 다른 재태기간에 있는 전자간증 환자들의 혈장 샘플들을 혈액 샘플링으로부터 임상 진단의 간격에 따라 5개의 군으로 나누었다: (1) 임상 진단시, (2) 임상 소견 전의 2-5.9주, (3) 임상 소견 전의 6-10.9주, (4) 임상 소견 전의 11-15.9주 및 (5) 임상 소견 전의 16-25주. 표 5에 나타난 데이타는 혈장 가용성 엔도글린 수준이 전자간증의 증상들 발병 이전의 6-10.9주에서 상승하기 시작하고 전자간증 발병 예정된 여성의 증상들 이전의 2-5.9주에서 3배 이상 높아짐을 증명한다.

표 5. 정상 임신 및 전자간증 임신 여성에서의 혈장 가용성 엔도글린 농도(Plasma soluble endoglin concentrations in normal and pre-eclamptic pregnant women)

평균±표준편차로서 표현된 값

δ:2명의 전자간증 환자들은 임상 소견에서 적용 가능한 혈액 샘플이 없음

혈장 가용성 엔도글린 농도의 진단의 가능성을 시험하여 전자간증 발병을 일으키는 농도를 확인하기 위하여, 환자들을 전자간증(PE<34주)의 조기 발병 및 전자 간증(PE>34주)의 만기 발병으로 나누었다. 조기-발병 전자간증을 갖는 환자들의 경우, 평균 혈장 가용성 엔도글린 수준이 정상임신에서보다 전자간증(임상의 진단 이전의)에서 현저하게 높았고 임신 기간 약 16-24주에서 시작하여(표 6) 24-28주 및 28-32주 임신 기간대에 매우 극적인 차이들을 보여주었다. 대조적으로, 후기 발병 전자간증을 갖는 환자들의 경우에, 임상 전의 전자간증에 있어서 혈장 가용성 엔도글린 농도가 재태 기간 32-36주에서의 매우 극적인 차이가 있으며 오직 28-32주에서만 정상임신에서보다 현저하게 높아짐을 보여주었다(표 7).

표 6. 재태 기간 34주 이하의 정상 임신 여성 및 임상의 전자간증 환자에서 혈장 가용성 엔도글린의 농도 (Plasma soluble endoglin concentrations in normal pregnant women and patients who developed clinical Pre-eclampsia at 34 weeks of gestation or less)

p^β:임상 소견에서 전자간증 및 정상 임신의 샘플 사이에서 비교

평균±표준편차로서 표현된 값

δ:2명의 전자간증 환자들은 임상 소견에서 적용 가능한 혈액 샘플이 없음

표 7. 정상 임신 및 전자간증에서의 혈장 가용성 엔도글린의 농도(재태 34주)

p^β:임상 소견에서 전자간증 및 정상 임신의 샘플 사이에서의 비교

평균±표준편차로서 표현된 값

요약(Summary)

이러한 실험의 결과는 임상적인 전자간증 발병 여성이 재태기간이 일치되는 대조군에 비하여 매우 높은 수준의 혈중(circulating) 가용성 엔도글린을 가짐을 증명한다. 또한 결과는 전자간증 발병 예정된 여성(임상전의 전자간증)이 정상임신으로 예상되는 여성들보다 더 높은 농도의 혈장 가용성 엔도글린을 가짐을 증명한다. 가용성 엔도글린 수준의 증가는 임상의 증상들이 발생하기 적어도 6-10주 전에 검출가능하다. 결국, 이러한 결과는 초기 발병 및 후기 발병 전자간증 둘다에서 혈중(circulating) 가용성 엔도글린 수준이 상승하나, 초기 발병 전자간증에서 변경들이 좀더 극적임을 증명한다.

실시예 6. 여성의 전자간증 및 자간증의 진단 인디케이터로서 가용성 엔도글린 단백질 수준(Soluble endoglin protein levels as a diagnostic indicator of pre-eclampsia and eclampsia in women; CPEP Study).

상술한 바와 같이, 혈관형성-촉진의 단백질인 TGF-β에 대한 세포 표면 수용체이면서 내피 및 융합세포영양막에서 발현되는, 가용성 엔도글린이, 전자간증의 태반에서 상향조절됨을 발견하였다. 상술한 실험에서, 전자간증에 있어서 과잉의 가용성 엔도글린이 세포외 도메인의 떨어져나감(shedding)을 통해 태반으로부터 순환계로 방출됨을 보여주었고; 이어서 가용성 엔도글린은 태반 성장 인자 (PlGF) 및 VEGF에 결합하는 항-혈관형성 인자인, sFltl와 공동 작용하여, 내피성 장애를 유발할 수 있다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 전자간증인 여성 및 임신성 고혈압 (GH), 작은 태아(SGA)의 합병증을 갖는 임신과 같은 다른 임신 합병증을 갖는 여성 과 정상혈압의 대조군 임신 여성을 통해 가용성 엔도글린, sFltl 및 유리된 PlGF의 혈청 농도를 비교하였다. 이러한 연구는 NIH의 Dr. Richard Levine과 공동으로 수행하였다.

이러한 연구에는 두 가지 주요한 목적이 있다. 제 1 목적은, 정상혈압의 대조군과 비교하여, 가용성 엔도글린, sFltl의 증가된 혈청 농도 및 PlGF의 감소된 농도를 전자간증 및 임신성 고혈압 또는 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)의 합병증을 갖는 임신과 같은 다른 임신성 질환들의 발병 이전에 검출할 수 있는지를 측정하고자 하는 것이다. 제 2 목적은 임상의 증상들의 발병 이전 및 이후에 및 정상혈압의 대조군에서 얻은 표본들의 별도의 시험을 통해 전자간증, 임신성 고혈압, 또는 SGA를 갖는 여성에 있어서 재태기간에 모체의 가용성 엔도글린, sFlt-1 및 유리된 PlGF의 혈청 농도의 추이를 설명하고자 하는 것이다.

방법(Methods)

임상정보(Clinical information)

이러한 연구는 Calcium for Pre-eclampsia Prevention trial(CPEP)에 참가하는 4,589명의 건강한 미분만부 여성의 코호트(cohort) 내에 네스팅된 임신합병증(미성숙 전자간증, 만기 전자간증(term pre-eclampsia), 임신성 고혈압, SGA 태아를 갖는 임신, 정상혈압의 대조군 임신)의 환자 대조군 연구(case-control study)이다. 120개의 랜덤 케이스를 각각의 연구 군들에서 선택하였다. 연구 방법들은 전 자간증에 대해 최근에 수행된 네스티드 환자 대조군 연구(nested case control study)(Levine et al, N. Eng. J. Med. 2004, 350:672-83)와 동일하게 하였다. 각각의 여성으로부터 연구 등록 이전에(13-21주), 26-29주에, 36주에 및 고혈압 또는 단백뇨의 의심이 드는 경우에 혈액 표본들을 얻었다. 산통의 시작 및 분만 이전의 임신 중 임의의 시간에 수집된 모든 혈청 표본들이 연구에 적합하다. 환자군은 만기 전자간증, 임신성 고혈압, 또는 SG가 발병하고, 알려진 중요한 구조적 또는 염색체 이상 없이 생산아(liveborn) 또는 사산아(stillborn)를 분만한 120 명의 여성을 포함하며 및 그들로부터 기저 혈청 표본을 얻었다. 미성숙 전자간증의 경우, CPEP 코호트로부터의 모든 72 환자들(PE<37주)로서 구성하여 연구하였다. 전자간증의 진단을 위한 임상의 척도는 Levine(2004) 등, 상술한 문헌에 개시되어 있다. 임신성 고혈압의 모든 환자군은 임신성 고혈압의 발병 이전 1일로부터 그 다음 7일간의 간격 내에 정상 소변 단백질 값을 가질 것이 요구되었다. SGA는 재태기간, 인종의 특이성, 미분만부 및 태아 성에 따른 출생시 체중에 대한 Zhang & Bowes' 표를 사용하여, <10th 및 <5th (중증 SGA) 퍼센타일로 정의되었다. 대조군은 잘 알려진 중요한 구조적 기형 또는 염색체 이상 없이 생산아 또는 사산아를 분만하고, 전자간증 또는 임신성 고혈압 또는 SGA를 갖지 않는 여성들로부터 무작위로 선택하여 임상 센터에 의해서, 제 1 혈청 표본 (± 1주)의 회수시의 재태기간, 냉동보관기간(± 1년) 및 냉동-해동 횟수별로 하나의 환자에 하나의 대조군을 매치시켰다. 총 1674 개의 혈청 표본들을 연구하였다. 재태기간에 의한 매칭은 sFlt-1, VEGF 및 PlGF의 수준에서 재태기간-관련 차이에 따라 대조군에 수행하였다. 냉동-보관기간 을 위한 매칭은 냉동 저장 중 분해로 인한 차이를 최소화하여 수행하였다. 임상 센터에 의한 매칭은 전자간증비(pre-eclampsia rates)가 센터별로 현저하게 차이가 나는 사실로부터 대조군에 대해 수행하였는데, 아마도 이 차이는 질병의 병태생리학에 기인할 것이다. 또한, 센터들은 표본들의 수집, 제조 및 저장을 위한 약간 다른 방법들을 사용할 수 있다. 또한 해동 횟수에 의한 매칭은 환자군 및 대조군이 균등하게 냉동 해동 분해되는 것을 보장하기 위해 수행하였다.

ELISA 측정(ELISA measurements)

다양한 혈관형성의 마커들에 대한 ELISA는 임상 결과를 모르는 단독 연구원(single research Assistant)에 의해 Karumanchi laboratory에서 수행되었다. 가용성 엔도글린(DNDGOO), sFltl(DVRlOO), PlGF(DPGOO)을 위해 상업적으로 시판되는 ELISA 키트들을 R&D systems, (Minneapolis, MN)으로부터 얻었다.

통계 분석(Statistical analysis)

통계학적 유의성을 결정하기 위한 대수적 형질전환(logarithmatic transformation) 이후에 다양한 측정의 비교를 위해 T-테스트를 사용하였다. P<0.05를 통계학적 유의성으로서 고려하였다.

결과(Results)

상기 방법들에 설명된 바와 같이 5개의 서로 다른 임신 여성의 연구 그룹의 다양한 재태기간 그룹 윈도우(various gestational age group windows) 중의 임신 기간에 걸친 평균 가용성 엔도글린(도 6), sFltl(도 7) 및 PlGF(도 8) 농도를 도 6-8에 도시하였다. 전자간증 군들 및 임신성 고혈압 군들의 경우에 있어서, 임상의 증상들의 발병 이후에 채취한 표본들은 본 명세서에 도시하지 않았다. 재태기간-매칭되는 대조군 표본들과 비교하여, 가용성 엔도글린 및 sFltl의 증가 및 유리된 PlGF의 감소가 조기 전자간증(preterm pre-eclampsia) 이전 9-11주에 시작하고, 전자간증발병 이후에, 각각의 농도가 5-배(46.4 vs 9.8 ng/ml, P<.0001) 및 3-배 높은 농도에(6356 vs 2316 pg/ml, P<.0001) 및 4-배 낮은 농도에(144 vs 546 pg/ml, P<.0001) 도달하였다. 만기 전자간증의 경우에 있어서, 가용성 엔도글린 증가가 12-14주에 시작되고, 유 리된 PlGF 감소가 9-11주에 시작되며, sFltl 증가가 전자간증 발병 이전의 <5주에 시작되었다. sFltl 및 유리된 PlGF의 혈청 농도는 임신 기간 10-42주로부터 GA 또는 재태기간에 비해 평균적인 태아/재태기간에 비해 큰 태아(AGA/LGA)를 갖는 임신들 사이에 현저하게 차이가 나지는 않았다. 혈청 가용성 엔도글린은 SGA 임신에 있어서 17-20주에 소폭으로 증가하기 시작하였고(7.2 vs 5.8 ng/ml, P=.03), 경증 및 중증 SGA, 각각의 경우에 있어서, 37-42주에는 15.7 및 43.7 ng/ml의 농도에 도달하였으며, AGA/LGA 임신에 있어서 2.9 ng/ml에 필적하였다(중증 SGA vs AGA/LGA, P=.OO2). 임신 기간 고혈압 연구에 있어서, GA-매칭 대조군 표본들과 비교하여, 가용성 엔도글린의 소폭 증가가 임신성 고혈압 이전의 <l-5주에 분명히 있었고, 임신성 고혈압의 발병 이후에 가용성 엔도글린의 농도가 2-배 높은 농도(29.7 vs 12.5 ng/ml, P=.OO2)에 도달하였다. 최고 사분위 수(quartile)의 대조군 가용성 엔도글린 농도(>7.2 ng/ml)에 있는 21-32주에 얻은 표본들에 대한 이후의 조기 PE의 조절 교차비(odds ratio)는 다른 모든 사분위수와 비교할 때, 이는 9.8(95% CI 4.5-21.5)이었다.

전자간증의 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수를 (sFltl + 0.25 가용성 엔도글린)/PlGF로서 정의하였다. 상기 지수를 5개의 다른 연구군들에 대해서 다양한 재태기간 군 전체에 대해서 측정하였다. 임상 증상들이 나타나기 이전에 채취된 샘플들의 전자간증 항-혈관 형성을 위한 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수를 도 9에 도시하였다. 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수의 상승 값이 임신 17-20주의 조기에 기록되었고 중증 미성숙 전자간증에 있어서 임신 기간이 진행함에 따라 극적으로 증가함이 확인되었다. 전자간증, SGA 및 GH에 있어서, 대조군 여성과 비교하는 경우 임신 말기(33-36주) 중 소폭의 상승이 있었다.

*도 10 및 11은 임상의 미성숙 전자간증 발병 이전(PE <37주)의 주수에 따른 가용성 엔도글린(도 10) 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(도 11)의 평균 농도를 도시한다. 미성숙 전자간증의 발병 이전의 조기 9-11주인 경우, 1-5주에 선행하는 임상의 증상들이 극적으로 상승(>5 배)하여 전자간증 발병 예정 여성에 있어서 가용성 엔도글린 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수의 2-3배의 상승이 있었다.

도 12 및 13은 증상들이 나타나기 이전 및 이후에 만기 전자간증의 임신(PE>37주) 동안의 가용성 엔도글린(도 12) 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(도 13)의 변경을 도시한다. 가용성 엔도글린 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수의 상승은 임신 33-36주에 시작하여 임상의 전자간증 기간에 평균 2-배 높은 값에 도달하였다.

도 14 및 15는 정상혈압의 대조군과 비교하는 경우 임신성 고혈압 및 1-5주 선행하는 임신성 고혈압(임신 33-36주 동안) 동안의 여성에서 검출된 가용성 엔도글린(도 14) 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(도 15)의 소폭의 상승을 도시한다.

도 16 및 17은 대조군 임신과 비교하는 경우 중증 SGA를 갖는 여성 및 SGA를 갖지 않는 모든 여성에 있어서 33-36주 임신 기간대에 검출된 가용성 엔도글린(도 16) 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수(도 17)의 소폭의 상승을 도시한다.

요약(Summary)

이러한 연구 결과는 가용성 엔도글린 농도 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도가, 임신 33주 이전에 측정되는 경우에 있어서, 정상 대조군 임신과 비교하는 경우 미성숙 전자간증 발병 예정 여성 및 임상의 미성숙 전자간증 (PE <37주)을 갖는 여성에서 극적으로 상승함이 확인되었다. 그러므로, 가용성 엔도글린 농도 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도(33주 이전)는 미성숙 전자간증의 진단 뿐 아니라, 전자간증의 예측에 사용될 수 있다. 가용성 엔도글린 농도 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도의 상승은 전자간증의 증상이 나타나기 이전의 10-12주만큼 조기에 시작되는 것이 명백하다.

또한 가용성 엔도글린 농도 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도는 만 기 전자간증 (PE >37주)에서 현저하게 상승하고 임신의 말기(33-36주 임신 기간대)에 측정하는 경우 임신성 고혈압 및 중증 SGA에서 소폭으로 상승하였다. 그러므로, 가용성 엔도글린 농도 및 가용성 엔도글린 항-혈관형성 지수 농도는 임신 33주 이후에 측정하는 경우 SGA 및 임신 기간 고혈압과 같은 다른 임신 합병증을 확인하는 데 사용할 수 있다.

실시예 7. 전자간증의 발병기전에 있어서의 가용성 엔도글린의 연관성(Involvement of soluble endoglin in the pathogenesis of pre-eclampsia).

혈관형성-촉진의 단백질인 TGF-β에 대한 세포 표면 수용체이면서 내피 및 융합세포영양막을 발현하는, 엔도글린이, 전자간증의 태반에서 상향조절됨이 확인되었다. 또한 전자간증에 있어서 과잉의 가용성 엔도글린이 세포외 도메인의 떨어져 나감(shedding)을 통해 태반으로부터 순환계로 분비됨이 확인되었다. 가용성 엔도글린은 태반 성장 인자 (PlGF) 및 VEGF에 결합하는 항-혈관형성 인자인, sFltl와 공동 작용하여, 내피성 장애를 유발할 수 있다는 가설을 시험하기 위해 실험을 고안하였다.

재료 및 방법(Materials and Methods)

시약(Reagents)

재조합 인간 엔도글린, 인간 sFltl, 마우스 엔도글린, 마우스 sFltl , 인간 TGF-β1 , 인간 TGF-β3 , 마우스 VEGF를 R&D systems(Minneapolis, MN)에서 얻었 다. 인간 엔도글린의 N-터미널 영역에 대한 마우스 단일클론 항체(catalog # sc20072) 및 다중클론 항체(sc 20632)를 Santa Cruz Biotechnology, Inc에서 얻었다. 인간 sFltl, 마우스 sFltl 및 인간 가용성 엔도글린용 ELISA 키트를 R&D systems, MN에서 얻었다.

*아데노바이러스의 생성(Generation of adenoviruses)

sFltl에 대한 아데노바이러스 및 대조군 아데노바이러스(CMV)는 앞에서 설명하였고(Maynard et al, J. Clin. Invest. 111:649:658 (2003)), Harvard Medical Core facility에서 Dr. Richard Mulligan의 도움으로 생성하였다. 가용성 엔도글린 아데노바이러스를 만들기 위해서, Adeasy Kit(Stratagene)를 사용하였다. 간단히 말해서, 인간 가용성 엔도글린(Thr 27- Leu 586)을 템플레이트로서 인간 cDNA 전장 엔도글린 클론(Invitrogen, CA)을 사용하고, 프라이머로서 다음의 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 PCR 증폭하였다: 전방으로 5'- ACG AAG CTT GAA ACA GTC CAT TGT GAC CTT-3 '(SEQ ID NO: 3) 및 역으로 5'TTA GAT ATC TGG CCT TTG CTT GTG CAA CC-3' (SEQ ID NO: 4). 증폭된 PCR 단편들을 먼저 pSecTag2-B (Invitrogen, CA)로 이차클로닝한 후 DNA 서열을 확인하였다. His-tagged 인간 가용성 엔도글린을 인코딩하는 포유동물의 발현 구조체(construct)는 템플레이트로서 pSecTag2 B-가용성 엔도글린을 사용하여 PCR 증폭하고, 아데노바이러스 생성을 위해, pShuttle-CMV 벡터(Stratagene; Kpn1 및 Sea1 사이트), 아데노바이러스 전이 벡터(adenovirus transfer vector)로 이차클로닝되었다. 이어서 제조자 설명서를 따라 가용성 엔도글린(sE)을 발현하는 아데노바이러스를 표준 프로토콜을 사용하여 만들고 웨스턴 블롯팅에 의해 발현을 확인하였다. 이어서 확인된 클론을 293개의 세포들로 증폭하고 상술한 바와 같이 CsCl2 밀도 구배로 정제하였다(Kuo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4605-4610 (2001)). 최종 산물들을 광학 흡광도 방법에 의해 적정하였다(Sweeney et al, Virology, 2002, 295:284-288). 적정값(titer)을 상기 바이러스 제조에서 유래된 공식에 기초한 플라크 형성 단위 (pfu)/mL로서 표현하고 표준 플라크 희석 기초 적정 분석법 키트(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, cat. No. Kl 1653-1) 및 광학 흡광도 방법을 사용하여 적정하였다.

웨스턴 블롯(ELISA and Western blots)

웨스턴 블롯을 그 밖에 개시된 바와 같이 랫트 혈장에서 아데노바이러스성-감염 전이유전자(adenoviral-infected transgenes)의 발현을 검사하는데 사용하였다(Maynard et al, supra).

면역침전법(IP) 실험(Immunoprecipitation experiments)

웨스턴 블롯에 이어 전자간증 발병 환자들의 태반의 조직 및 혈청 표본들에서 가용성 엔도글린을 동정하고 특성화하는데 IP를 사용하였다. 인간 태반의 조직을 차가운 PBS로 세척한 후 균질화 버퍼[10 mM Tris-HCl, pH 7.4; 15 mM NaCl; 60mM KCl; 1 niM EDTA; 0.1 mM EGTA; 0.5% NonidetP-40; 5% 슈크로즈; Roche (Indianapolis, IN)의 프로테아제 혼합물]에서 10 분 동안 라이싱하였다. 이어서 태반 라이세이트를 항-인간 단일클론 마우스 엔도글린 항체로 면역침전하였다(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). 제조자의 설명서에 따라 immunopure IgG 배향 키트(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)를 사용하여 3-5 mg의 정제된 항체를 2ml 단백질 A-세파로스(protein ASepharose)에 직접 결합하게 하여 면역친화성 칼럼(Immunoaffinity columns)을 제조하였다. 이어서 칼럼을 프로테아제 혼합물을 함유하는 RIPA 버퍼로 광범위하게 세척한 후, 결합된 단백질들을 pH 2.8, 0.1 mol/L 글라이신-HCl 버퍼로 녹여서 분리하였다. 용리액(eluent)을 1 mol/L Tris-HCl 버퍼를 함유하는 0.5-ml 분획물로 수집하였다. 단백질-함유 분획물(Protein-containing fractions)을 풀링(pool)하고 CENTRICON Centrifugal Concentrator(Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA)로 9- 내지 10-배로 농축하였다. 면역침전된 샘플들을 4-12% 구배 겔(Invitrogen)로 분리하고 단백질들을 폴리비닐리덴 디플로라이드(PVDF) 막에 전이시켰다. 엔도글린 단백질을 다중클론 항-인간 토끼 엔도글린 프라이머리 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다.

내피 튜브 분석(Endothelial tube assay)

성장 인자가 감소된 매트리겔(7mg/mL, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)을 사전 동결된 48-웰 세포 배양 플레이트의 웰(1001/웰)에 넣고 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하여 중합이 일어나게 하였다. HUVEC 세포들 (무혈청의 300 μl의 내피의 기저 배지에 30,000 + , Clonetics, Walkersville, MD)을 다양한 조합의 재조합 단백질(가용성 엔도글린, sFltl, 또는 둘다)로 처리한 후 매트리겔코팅된 웰에 플레이팅하여, 37℃에서 12-16 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 튜브 형성을 4X의 역 위상차 현미경(Nikon Corporation, Tokyo, Japan)으로 평가하고 Simple PCI 영상화 분석법 소프트웨어를 사용하여 정량 분석(튜브 면적 및 총 길이) 하였다.

미세혈관 투과성 실험(Microvascular permeability experiments)

BaIb-C 마우스들에게 눈뒤정맥얼기(retro-orbital venous plexus)를 통해 GFP 또는 가용성 엔도글린 또는 sFltl 또는 그의 조합을 발현하는 Ix 108 pfu의 아데노바이러스를 주입한 후 48 시간 후에 미세혈관 투과성 분석법을 수행하였다. 마우스들에게 0.5 ml Avertin을 복강 주사(IP injection)하여 마취시켰다. 100 ml의 1% Evans blue dye(in PBS)를 꼬리 정맥(tail vein) 내로 주입하였다. 40분 후, 마우스들을 PBS 함유 2 mM EDTA로 20분 동안 심장 천자(heart puncture)를 통해 관류시켰다. 기관(뇌, 폐, 간, 신장)을 수집하고 포름아미드로 3일 동안 인큐베이션하여 Evans blue dye를 용리시켰다. 포름아미드 용액의 OD를 620 nm 파장을 사용하여 측정하였다.

신장 미세혈관 반응성 실험(Renal microvascular reactivity experiments)

앞에서 설명한 바와 같이(Maynard 등의 상술한 문헌) 랫트의 신장 미세혈관(70-170 μm 내부 직경)을 사용하여 미세혈관 반응성 실험을 수행하였다. 모든 실험군들에서, 미세혈관의 전구 수축(pre-contraction) 후에 신장 미세혈관의 이완 반응을 40 mmHg의 팽창압(distending pressure)에서 40-60%의 그들의 기저 직경에 대해 U46619(트롬복세인 길항제)로 시험하였다. 정상-상태 톤(steady-state tone)에 도달한 후, TGF-βl 또는 TGF-β3 또는 VEGF와 같은 다양한 시약들에 대한 반응을 표준 순서로 시험하였다. 모든 약물들을 장관외로 적용하였다.

동물 모델(Animal models)

임신한 및 임신하지 않은 Sprague-Dawley 랫트 양자에게 꼬리 정맥 주사로 2 x 109 pfu의 아데노바이러스(Ad CMV 또는 Ad sFltl 또는 Ad sE 또는 Ad sFltl +Ad sE)를 주입하였다. 임신한 랫트에게 임신 8-9일에 주입한 후(제 2의 3개월의 초기) 임신 16-17일에 혈압을 측정하였다(제 3의 3개월의 초기). 랫트를 펜토바르비탈 소듐(60 mg/kg, i.p.)으로 마취한 후 혈압을 측정하였다. 경동맥(carotid artery)을 분리하고 압력변환기(pressure transducer, Millar Instruments, Houston, TX)에 연결된 3-Fr 고성능 마이크로팁 카테터(high-fidelity microtip catheter)로 캐뉼러를 하였다. 혈압을 기록하고, 10분 동안의 평균을 내었다. 이어서 안락 사(euthanasia) 이전에 혈액, 조직 및 소변 샘플들을 얻었다. 혈장 농도를 혈압측정일(아데노바이러스의 주사 후 8일)에 측정하였고, 이러한 단백질들의 발현의 최고치에 대응하여 아데노바이러스의 주사 후 7-10일에 인식하였다. 먼저 웨스턴 블롯팅에 의해 혈중(circulating) sFlt- 1 및 가용성 엔도글린 농도를 확인하고 이어서 시판되는 마우스의 ELISA 키트들(R & D systems, Minneapolis, MN)을 사용하여 정량하였다. 뇨 알부민을 표준 딥스틱 에 의해 측정하고 시판되는 랫트 알부민 ELISA 키트(Nephrat kit, Exocell Inc, Philadelphia, PA)를 사용하여 경쟁적 효소 면역 분석법(competitive enzyme-linked immunoassay)에 의해 정량하였다. 소변 크레아티닌을 피크린산 비색 방법 키트(Metra creatinine assay kit, Quidel Corp, San Diego, CA)에 의해 측정하였다. AST 및 LDH를 시판되는 키트들(Thermo Electron, Louisville, CO)을 사용하여 측정하였다. 랫트 혈액의 혈소판수를 자동 혈구계측기(automated hemocytometer, Hemavet 850, Drew Scientific Inc, Oxford, CT)를 사용하여 측정하였다. 순환 혈액의 분열적혈구들의 검출을 위해 혈액의 말초혈액바른표본(peripheral smear)을 Wright's stain으로 염색하였다. 혈압 측정 및 표본들의 수집 후에, 랫트를 치사시켜 조직학적 분석을 위해 기관을 회수하였다. 리터(litter)를 계산하고 개개의 태반 및 태아의 무게를 재었다. 회수된 신장을 Bouin's 용액에 넣고, 파라핀에 임베딩하여, 단편을 만든 후 H&E, PAS 또는 Masson's trichrome stain으로 염색하였다.

통계 비교(Statistical comparisons)

결과를 평균 ± 표준오차(standard error of mean, SEM)로 나타내고 다수의 군들 사이의 비교를 ANOVA를 사용하여 분산분석(analysis of variance)에 의해 수행하였다. p < 0.05인 경우의 현저한 차이를 기록하였다.

결과(Results)

가용성 엔도글린은 항-혈관형성의 분자이며 혈관 장애를 유발한다(Soluble endoglin is an anti-angiogenic molecule and induces vascular dysfunction )

가용성 엔도글린의 기능을 이해하기 위해 혈관 형성의 생체 외 모델을 사용하였다. 가용성 엔도글린은 소폭으로 내피 튜브 형성을 저해하는데, 이는 sFlt1의 존재에 의해 더욱 강화된다(도 22 및 도31). 전자간증에 있어서, 내피성 장애에 추가하여, 또한 부종에 의해 증명되듯이 미세혈관 투과성이 강화되고 세포 외로 Evan's blue 바운드 알부민의 유출이 강화됨이 기록되어 왔다. 가용성 엔도글린이 미세혈관 유출을 유발하는지를 보기 위해서, 마우스들을 48 시간 동안 가용성 엔도글린 및 sFlt로 처리하였다. 가용성 엔도글린과 sFltl의 조합은 Evan's blue 분석법(도 23)을 사용하여 증명되는 바와 같이 폐, 간 및 신장에서는 알부민 유출의 극적인 증가를 및 뇌에서는 소폭의 유출을 유발하였다. 가용성 엔도글린 단독으로는 간에서 소폭의 유출을 유발하였다. 이러한 데이타는 가용성 엔도글린 및 sFltl의 조합이 유효한 항-혈관형성 분자들이며 현저한 혈관 유출을 유발할 수 있음을 보여준다.

가용성 엔도글린의 혈역학적 효과(hemodynamic effects)를 평가하기 위해, 랫트의 신장 미세혈관에서 일련의 미세혈관 반응성 실험을 수행하였다. 우리들은 먼저 엔도글린의 TGF-βl 및 TGF-β3의 2개의 알려진 리간드들의 효과를 연구하였다. TGF-βl 및 TGF-β3 둘다는 혈관 직경에서 투여량-의존적 증가(dose-dependent increase)를 유발하였다. 반면, 엔도글린의 리간드가 아닌, TGF-β2는 상당한 혈관확장(vasodilation)은 하지 못한다.(<2% at 0.1 and 1 ㎍/ml) 중요한 점은 과잉의 가용성 엔도글린의 존재하에서, 모든 TGF들의 효과는 현저하게 약화되었다는 것이다(도 24). 이러한 혈관 긴장도(vascular tone)에 TTGF-βl 및 TGF-β3 이소폼들(isoforms)의 민감한 효과는 또한 장간막 혈관(mesenteric vessels) 에서도 나타난다(도 32). 결국, VEGF 및 TGF-βl의 조합은 과잉의 가용성 엔도글린 및 sFltl에 의해 차단되는 혈관확장(vasodilation)을 유발하였다(도 25). 이는 sFltl 및 가용성 엔도글린이 VEGF 및 TGF-βl와 같은 혈관형성의 성장 인자들에 의해 유발된 생리적 혈관확장에 대항하고 고혈압을 유발시킬 수 있음을 보여준다.

가용성 엔도글린 및 sFltl의 생체 내(인비보) 효과(In vivo effects of soluble endoglin and sFltl)

가용성 엔도글린 및 sFltl의 혈관 효과를 평가하기 위해, 임신한 랫트에서아데노바이러스성 발현 시스템에 따라 재분류하였다. Sprague Dawley 랫트에 대조군 유전자(CMV) 또는 가용성 엔도글린 또는 sFltl 또는 sFltl + 가용성 엔도글린을 인코딩하는 아데노바이러스를 임신 8일째에 꼬리 정맥으로 주입하였다. 17일째, 동물들을 전자간증 표현형(pre-eclampsia phenotype)으로 시험하였다. 표 8은 혈역학적 및 생화학적 데이타(hemodynamic and biochemical data)를 포함한다.

표 8. 아데노바이러스를 처리한 랫트 동물 모델에서의 혈역학적 및 생화학적 데이타(Hemodynamic and biochemical data for adenovirus treated rat animal models)

MAP-평균동맥압(확장기 혈압 + 1/3 맥박압); Alb/Creat-알부민/크레아티닌비; LDH- 젖산탈수소효소(Lactate dehyrogenase); AST-아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(Aspartate aminotransferase).

*P<0.05 대조군과 비교시 태아의 무게(Fetal weight)는 각 군마다 임의로 선택된 4명의 태아의 총합이다.

sFltl의 평균 혈중(circulating) 농도는 sFltl군에서는 410 ng/ml이고, sFltl + sE군에서는 430 ng/ml이다. sE의 평균 혈중(circulating) 농도는sE 군에서 는 318 ng/ml이고, sFltl + sE 군에서는 319 ng/ml이다.

가용성 엔도글린 단독으로는 경증 고혈압을 유발하였다. 이전에 기록된 바와 같이, sFltl는 고혈압 및 단백뇨 둘다를 유발하였다. 중요하게, sFltl 및 가용성 엔도글린의 조합은 중증 고혈압, 신장염 범위 단백뇨, 태아의 성장 제한 및 HELLP 증후군 발생의 생화학적 증거(상승된 LDH, 상승된 AST 및 감소된 혈소판수)를 유발하였다(표 8). 가용성 엔도글린 + sFltl 군에서 용혈의 증거는 분열적혈구 및 망상적혈구증식증(reticulocytosis)을 드러내는 말초혈액바른표본(peripheral smear)에 의해 확인되었다(도 26 A-B). 결국, 신장 조직구조(renal histology)는 또한 가용성 엔도글린 + sFltl 군에서 중증 사구체 내피증식(severe glomerular endotheliosis)을 확인하였다(도 27A-27D 및 도 33).

도 33에서 보시다시피, 대조군은 정상 제한 범위 내에 있다. 가용성 엔도글린 패널은 창(fenestrae)의 손실과 함께 내피 팽창 및 부분적 루미날 폐색(partial luminal occlusion)을 보여준다. The compromised lumen을 통해 스퀴징(squeezing) 하는 적혈구를 도시한다. 랫트에 처리한 가용성 엔도글린의 신장의 밝은 검경(light microscopy)은 상당한 내피증식(endotheliosis)을 위해 striking하지 않은 반면, 전자 검경은 focal endotheliosis 나타냈다. 중요한 점은 가용성 엔도글린과 sFlt-1 모두를 처리한 동물들은 중증 사구체 내피 증식(severe glomerular endotheliosis)을 한다는 것이다. 조합 치료 군(lower panel) 은 팽창한 외피 세포로 부푼 거대 모세혈관 내 폐색(massive endocapillary occlusion)을 보인다. 중증 단백뇨(proteinuria)에도 불구하고 포도싸이트 풋 과정들(podocyte foot processes)의 상대적 보존(shown as arrows)을 보여준다. 모체-태아 접합시 경색(infarction)을 포함하는 광범위한 태반 혈관 손상은 sFlt1+sEng 군에서 나타나나, 대조군에서는 나타나지 않거나 오직 일부 시약으로 처리한 경우에만 나타났다(도 34A-H). 거대 세포층에서의 전염 염증(Diffuse inflammation)(인간 침입 영양아층)은 sFlt1 및 sEng 군에서 보고되었고, 조합 군(combined group)에서는 더욱 상승하였다. 간 조직학(Liver histology)에 따르면 sFlt1+sEng 군에서는 HELLP syndrome인 환자들의 경우와 유사하게 허혈(ischemia)의 신호와 괴사 영역을 나타냈고(도 34A-H) 몇몇의 모체 혈관 손상의 신호는 또한 sFlt1+sEng가 비임신 랫트에 주입되었을때 나타나는 바, 이는 임신 랫트에서 관찰되는 현상들이 모체 혈관에 직접적으로 효과를 미치기 때문이며 태반은 필요로 하지 않았다.

요약(Summary)

이러한 결과는 가용성 엔도글린이 전자간증 태반에서 상향조절되고 전자간증 발병 환자들에서 극히 높은 농도로 존재함을 보여준다. 가용성 엔도글린의 가장 높은 농도는 전자간증의 가장 중증 형태의 하나인, HELLP 증후군 발병 환자들에게 나타난다. 또한 이러한 결과는 가용성 엔도글린 농도가 임신한 환자들의 상승된 sFltl와 상호관련되고 더 높은 혈중(circulating) sFltl농도를 갖는 환자들에서 더 높아짐을 보여준다. 또한, 이 결과는 가용성 엔도글린이 혈관 형성 분석법들, 미세혈관 투과성 분석법들 및 미세혈관 반응성 실험과 같은 다수의 내피 분석법들에서 항-혈관형성 분자이고 내피의 기능을 파괴함을 보여준다. 중요하게, 가용성 엔도글린은 이러한 생체 외 내피의 분석법들로 sFltl의 독성 예후를 증폭시킬 수 있다. 더욱이, 생체 내 분석법들에 있어서, 가용성 엔도글린의 아데노바이러스성 발현은 임의의 현저한 단백뇨 없이 경증 고혈압을 유발시킨다. 그러나, sFltl의 존재하에서, 가용성 엔도글린은 중증 고혈압, 단백뇨, 사구체 내피증식, HELLP 증후군의 발생 및 태아의 성장 제한의 존재에 의해 증명되는 바와 같이 현저한 혈관 손상을 유발시킨다. 이러한 데이타는 가용성 엔도글린이 전자간증 모체의 증후군의 인과율(causality)에서 중요한 역할을 하며 전자간증의 치료를 위해 가용성 엔도글린을 중화시키는 약제들의 필요성이 강조됨을 보여준다. 가용성 엔도글린 방출 메카니즘은 엔도글린 분자의 세포외 영역의 단백질분해적 절단과 같다. 전자간증의 조직에서 상향 조절된 특이적 프로테아제들은 후보 분자들로서 기능할 수 있다. 하나의 예로는 엔도글린에 대해 유사성을 공유하는 분자인, 베타글리칸을 절단하는 것으로 보이는 막 타입 기질메탈로프로테이나제-1(MTl-MMP)일 수 있다(Velasco-Loyden G et al, J. Biol. Chem. 279:7721-33 (2004)). 그러므로 이러한 프로테아제들의 저해제들은 전자간증의 치료를 위해 다양한 표적으로서 기능할 수 있다.

실시예 8. 가용성 엔도글린은 TGF-β1 및 TGF-β3이 매개하는 NOS-의존적 혈관확장( NOS-dependent vasodilation) 을 저해한다(Soluble endoglin inhibits TGF-β1 and TGF-β3 mediated NOS-dependent vasodilation).

eNOS 는 액상 전단력(fluid shear stress) 및 신경액 자극(neurohumoral stimuli)으로 활성화될 수 있는 Ca²⁺/카모듈린(calmodulin)-조절성 산화질소(nitric oxide (NO)) 합성효소이다. 내피-유도된 산화질소는 시스테믹 혈압 조절, 혈관 투과성 및 혈관형성에 기여하는 잠재적인 혈관이완제이다. 사실상, Ser1177에서 Akt-의존성eNOS 인산화 반응(phosphorylation) 및 증가된 eNOS/Hsp90 와의 연관성을 통한 혈관형성 및 혈관 긴장도(vascular tone)에서의 VEGF 의 효과는 eNOS 의 활성화에 의해 일부 매개된다. 전자간증 환자의 sera 에서 증가된 태반- 유도된 sFlt1은 항-혈관형성제이자 고혈압을 유도한다는 우리의 현재 논증은 사실상 손상된 VEGF -의존성 eNOS 활성을 반영한다(Maynard et al., supra). 더욱 최근에는, eNOS Thr495의 탈인산화(dephosphorylation) 는 Ser1177의 탈인산화에 선행하는 것으로 밝혀지고 이들 공동작용할 수 있는 것들은 내피 세포들 내(Fleming et al., Cir. Res. 88:E68-75 (2001))에 활성도를 결정짓는다는 것이 밝혀졌다. eNOS 활성을 통한 혈관 재활성도 감소에의 VEGF 의 공지된 효과 및 엔도글린이 혈관 운동 신경(vasomotor)-의존성 활성도를 조절한다는 최근의 논증을 (Toporsian et al., Circ. Res. 96:684-692 (2005)) 기초로, 우리는 TGF-β 이소폼들(isoforms) 및 단리된 쥐 신장 미세혈관에서의 가용성 엔도글린의 혈류역학 효과를 주장한 바 있다. 실시예 7 및 도 24, 25에서 개시된 바와 같이, TGF-β1 및 TGF-β3은 가용성 엔도글린에 의해 상당히 가늘어진 동맥 직경이 양에-의존하여 증가되도록 유도한다. . 이러한 TGF-β1 및 TGF-β3 이소폼들(isoforms)의 혈관 긴장도(vascular tone) 에서의 중요한 효과는 이전에는 인지되지 못했던 사항이고 장간막(mesenteric) 혈관 에서도 나타났다(도 32). VEGF 및 TGF-β1 은 혈관확장(vasodilation)에 추가 효과가 있는 바, 전자간증인 환자에서 기록된 농도의 sEng+sFlt1에 의해 차단되었다(도 25 및 35A). L-NAME 은 NOS 의존성 반응을 나타내면서 TGF-β1 및 VEGF 에 의해 매개된 혈관 확장을 차단하였다(도 35A) 이러한 데이터는 순환하는 sFlt1 및 sEng 이 전자간증에서 나타나는 고혈압의 진전에 기여하며, 이러한 혈관형성 성장 인자들(angiogenic growth factors )에 의해 생리적 (physiological) NO-의존성 혈관확장( NO-dependent vasodilatation) 을 저지할 수도 있음을 암시한다.

실시예 9. 가용성 엔도글린은 내피 세포에서 TGF-β1 의 결합 및 시그널링을 저해한다(Soluble endoglin inhibits TGF-β1 binding and signaling in endothelial cells).

엔도글린이 TGF-β1 및 TGF-β3 이소폼들(isoforms) 의 공동 수용체인바, 우리는 가용성 엔도글린이 세포 표면 수용체 결합에 방해가 된다는 가설을 세웠다. 사전인큐베이팅- 방사성-표지된 TGF-β1 (Pre-incubating radio-labeled TGF-β1 ) 은 재결합 가용성 엔도글린을 통해 50 및100 pM 모두에서 TGF-β receptor type II (TβR II)에 그것의 결합을 감소시켰다(도 35B). 그러므로 가용성 엔도글린은 내피 세포에 있는 수용체에 결합하는TGF-β1 을 위해 경쟁한다. 이것이 손상된 시그널링을 이끌어내는지 여부를 테스트하기 위해 인간 내피 세포 내에서 CAGA-Luc 수용체 컨스트럭트의 활성도를 평가했다. TGF-β1 는 the Smad 2/3-dependent CAGA-Luc 수용체의 활성을 유도했고 이러한 반응은 가용성 엔도글린에 의해 없어졌다(도 35C).

실시예 10. 가용성 엔도글린은 TGF-β1 이 매개하는 eNOS 활성을 차단한다( Soluble endoglin blocks TGF-β1 mediated eNOS activation).

TGF-β1 은 신장 및 장간막성 저항 혈관(mesenteric resistance vessels) 내에서 NOS- 의존성 혈관이완 (vasorelaxation)을 유도하는 바, 우리는 eNOS 활성도에 미치는 그것의 즉각적인 효과를 찾아냈다. TGF-β1 은 eNOS Ser1177 인산화(eNOS Ser11770)에는 효과가 없는 반면, TGF-β가 eNOS 활성화에 주요한 부분의 인산화 위치를 조절한다는 것을 암시하면서 Thr495 에서의(도 35D) 탈인산화를 유도하였다. 이러한 효과는 가용성 엔도글린에 의해 상당히 약화되었다(도 35D).

실시예 8-10에서의 결과들은 가용성 엔도글린이 수용체의 결합을 방해하고 및 내피 세포에서의 시그널링을 downstream 시키고 , 또한 활성도를 약화시킨다는 것을 입증한다. 가용성 엔도글린 및 sFlt-1은 VEGF 와 the TGF-β 시그널링 패스웨이에 의한 혈관운동신경 효과 및 내피 의존성 NO 활성화를 저해하기 위해 일제히 작동하고 있을 수도 있다.

실시예 11. 혈관 형성 인자들의 일련의 변화들은 전자간증이나 자간증의 위험에 있는 여성들을 구분해낼 수 있다(Sequential changes in angiogenic factos can identify women at risk for pre-eclampsia or eclampsia).

상기 기재한 실시예에서는, sFlt1 및 가용성 엔도글린은 전자간증의 병인과 밀접하게 관련되어 있음을 보여주었다. 하기 기재한 실시예에서 우리는 혈청 1기 및 2기(first and second trimesters) 임신 여성들에게서 수집한 페어 혈청(paired serum) 표본에서의 농도를 측정하였고, 1기 및 2기(first and second trimesters) 사이의 이러한 마커들의 일련의 변화들이 전자간증의 발달과 관련이 있는지 여부를 결정하기 위해서 세부적으로 그들의 임신결과들을 특징화하였다.

Materials and Methods

연구 모집단(Study Population)

우리는 the Massachusetts General Hospital Obstetrical Maternal Study (MOMS) 에 등록된 여성들을 대상으로하여 이전에 기재된 바 있는 방법으로(Thadhani et al., Obstet. Gynecol. 97:515-20 (2001) and Wolf et al., Obstet. Gynecol. 98:757-62 (2001))네스티드 환자-대조군연구(nested case-control study)를 수행하였다. 간략히 말해서 the MOMS 코호트는 1998년에 임산 후기에 일어나는 반대 결과에 대한 초기 재태 위험 인자의 가능성있는 연구를 위해 설립되었다. 매사추세스 일반 병원(the Massachusetts General Hospital)에서 태아기 보호를 받고, 헬스 센터(health centers) 를 가입한 여성들은 the 코호트 에 포함되기 적격이다. 현재 연구에서, 2001. 6. 1과 2003.5.1 사이에 singleton 재태기간인 여성, 그 당시에 또는 재태기간 1주 전에 the MOMS 코호트에 등록하고 20주 후에 분만한 여성이 포함되기에 적격이다. 환자(n=39) 는 이어서 전자간증을 앓은 1기 및 2기 혈액군을 가진 사람들로 정의되고, 대조군(n=147)은 임신을 통해 당백뇨에 대한 증거 없이, 만기에(>37 weeks) , 정상혈압 및 정상혈당 (normoglycemic)으로 남은 된 동일한 cohort 에 등록한 동기간내 여성들이었다.

환자 및 대조군은 이들 익스포져(Exposures)에 의한 혼동 가능성 때문에 나이 (2 years) 및 체중 지수 (1 kg/m²) 를 매치시켰다 (Thadhani et al., Obstet. Gynecol. 94:543-50 (1999)). 모든 항목들은 기재된 공지 동의서에 제공되고 본 연구는 매사추세스 일반 병원(the Massachusetts General Hospital)의 the Institutional Review Board 에 의해 승인된 것이다.

초기 익스포져(Exposures)(Primary Exposures)

*혈액 샘플들은 모든 여성들 중에 1기 태아기 (11-13 wks) 및 2기(17-20 wks)에 다시 수집되었다. 다음 수집, 샘플들은 향후 분석을 위해 -80C 에서 저장하였다. 초기 익스포져(Exposures) 은 상업용 ELISA kits (R&D systems, Minneapolis, MN) 를 사용하여 측정된 혈청 sFlt1 및 sEng 이었다(Maynard et al., supra and Venkatesha et al., Nat Med. 12:642-9 (2006)). sFlt1 및 sEng 을 위한 변수의 내부 분석 정밀 계수(precision coefficients)는 각각 8.1 및 9.5% 였다. 모든 샘플들은 복제하여 운영되었고, 복제본들 사이에 10% 이상의 변이가 존재하면 분석을 되풀이하였으며, 그 평균을 보고하였다. 모든 분석들은 환자 상태를 모르는 사람에 의해 수행되었다. 분석을 위해 샘플은 무작위로 배열하였다.

Covariates 및 Confounder

매사추세스 일반 병원(the Massachusetts General Hospital)에서 사용되는 의료 기록인, The electronic medical record (EMR)는 초기 산후(postpartum) 기간을 통해 임신시 사건들을 세부화하는 임상학적 데이터 및 인구학적 데이터를 제공한다. 기저(baseline) (first prenatal visit) 및 모든 일련의 태아기(prenatal visits) 에 수집된 EMR 로부터 수득된 특이적 정보는 마지막 월경 기간(the last menstrual period)을 통해 추정된 나이, 인종, 키, 체중, 흡연 상태, 태아 재태기간을 포함하고, 초음파(ultrasound ), 혈압, 뇨(urine )분석 결과, 및 재태 기간 측정에 의해 입증된다. 모든 임신 결과 정보는 glucose tolerance tests, 기타 일상적으로 측정된 실험 값들, 출생시 체중과 같은 분만 특성, 분만 루트, 전자간증의 진단을 포함하는 에 입력된다.

1차 결과(Primary Outcomes)

모든 임신 결과들은 태아기 플로우 쉬트(prenatal flow sheets) 와 실험 측정치를 포함한 의료 기록들의 세부화된 검토에 의해 다양화되었다. 각 태아기( prenatal visit )에서 혈압은 standard sphygmomanometers 을 사용하여 3-5분간 휴식을 취한 앉은 상태의 여성 오른팔에서 측정하였다. 각 환자를 위해 적당한 cuff size가 right midarm 상태에 기초하여 선택되었다. 1번째(diastolic)와 5번 째(diastolic) Korotkoff 소리나는 타이밍에 일치하는 혈압 측정치를 기록하였다. 현재 연구를 위한 모든 대상들은 이전에 고혈압이나 당뇨병과 같은 병력이 없었고, MOMS 네트워크 내에서 분만 및 그들의 태아기 보호를 시작하고 완성하였으며, 살아있는 태아를 분만, 분만 이후에 6주 간 고혈압의 증거가 없었다.

전자간증은 20 주 재태기간 후에 적어도 140 mm Hg 의 혈압 상승 또는 적어도 90 mm Hg 의 심장 확장 혈압 으로 정의되고, 단백뇨(proteinuria)와 관련해서, 계량봉(dipstick)에 의해 2+ 혹은 그 이상, 또는 요로감염증(urinary tract infection)인 경우 적어도 300mg/24 h(ACOG Committee on Practice Bulletins--Obstetrics. ACOG practice bulletin. diagnosis and management of preeclampsia and eclampsia. Number 33, January 2002. Obstet Gynecol. 99:159-67)이다. 전자간증은 만기 전자간증(term preeclampsia (> 37 weeks)) 및 조기 전자간증(preterm preeclampsia (<37 weeks)으로 분석된다..

통계학적 분석(Statistical analysis)

인구학 및 임상학적 특성들은 Chi Square tests 또는 Student's t test 를 적합하게 사용하여 비교하였다. 로그 변환은 치우친 분포(skewed distribution)를 보이는 초기 익스포져(Exposures) 을 위해 필요했다(Levine et al., (2004), supra, Levine et al., N. Engl. J. Med. 355:992-1005 (2006)). 초기 익스포져(Exposures) 은 연속 변수(continuous variables )로서, 구분점(cut points) 및 대조군의 자연 분포(natural distribution)에 기초한 터틀 분석법(tertile analyse)으로 시험하였고 임상 해석을 위해 단순화하였다.

CPEP 연구에서 혈관형성 마커의 2차 분석(Secondary Analysis of angiogenic markers in the CPEP study )

우리는 또한 CPEP cohort 내에 연구를 조절한 최근 공개된 네스티드 환자로부터 초기 임신 기간 동안 2차 혈관형성 인자 변화들의 2차 분석을 수행하였다. 우리는 정상 혈압(normotensive)인 여성, 37주 이전에 전자간증을 앓아온 여성, 3가지 다른 시간 간격 - 10-12 주, 13-16 주, 17-20 주 에서 37주 동안 전자간증을 앓아온 여성으부터 채취한 샘플을 분석하였다.

결과(Results)

인구학 및 임상적 특징(Demographic and Clinical Characteristics)

MOMS 연구 대상군의 기본적, 분만 특성을 표 9에 도시하였다. 두 구룹 간에 연령과 체중 지수 간에는 상당한 별다른 차이가 없었다. 계속 전자간증을 앓아온 여성은 첫 태아기(prenatal visit )에서 수축기 혈압 및 확장기 혈압(systolic and diastolic blood pressures)이 더 높았다. 전자간증의 프리젠테이션(presentation) 당시에, 수축기 혈압 및 확장기 혈압은 예상했던 바와 같이 전자간증의 그룹에서 더 높았다.

표 9. 인구학

BMI = 체중 지수(body mass index); DBP = 확장기 혈압(diastolic blood pressure); SBP = 수축기 혈압(systolic blood pressure)

UTP = 소변 전체 단백질(urine total protein) in mg/L; SPOT = 소변 단백질(urine protein)/크레아틴(creatinine) 비율(ratio)

Values are mean ±S.D.

정상인과 전자간증 임산부 간에 1,2,,3기 sFlt1 및 sEng 의 수준(First and Second Trimester Levels of sFlt1 and sEng in Normal and Preeclamptic Pregnancy )

sFlt1의 평균 혈청 수준은 정상 임산부와 비교했을 때 전자간증인 여성에게서 더 높게 나타났는바, 1기(first trimester)에서 각각 3.49±0.35 ng/ml 대 3.03±0.13 ng/ml 였다 (P=NS). 2기(second trimester )에서, sFlt1의 평균 혈청 수준은 전자간증의 그룹에서 상당히 높게 높게 나타났는 바, 정상그룹 3.10±0.15 ng/ml (P<0.01)와 비교하여 평균 4.12±0.5ng/ml 을 보였다(표 10).

1기에서 상당한 차이를 보이지 않는다고 판단되었던 sEng의 평균 혈청 수준은 2기 전자간증인 여성에서는 상당히 변했는바, 각각 1기에서는 6.9±0.32 ng/ml 대 6.57±0.17 ng/ml 였고(P=NS), 2기에서는 6.37±0.38 ng/ml 대 5.23±0.12 ng/ml 였다(P=0.004) (표 10).

표 10. sFlt 및 sEng의 혈청 수준.

혈관형성 인자 간에 일련의 변화(Sequential changes in angiogenic factors

도 37 그래프로 정상인, 모든 전자간증인 여성, 37주 이하 동안 전자간증을 앓아온 여성의 the delta 또는 d (1기 및 2기 사이 기간 동안 sFlt1 및 sEng 의 수준 차이)를 도시한 것이다. 정상 인산부의 경우 1기 및 2기 사이의 기간 동안 (dsFlt1=0.05±0.15ng/ml)의 변화가 거의 없었다. dsFlt는 전자간증인 여성에게서 상대적으로 더 높았는 바 정상인의 경우와 비교하여 0.713±0.47ng/ml 대 0.0497±0.15ng/ml 였다(P=0.08). 37주차 이하 전자간증인 여성의 경우와 dsFlt1는 이와 비슷하게 0.634±0.91ng/ml 으로 높은 수치를 보였다.

정상 임산부의 경우 1기 및 2기 기간 동안 sEng 의 수준은 급락했다(-1.322 ±0.18ng/ml). 이러한 급락은 전자간증인 환자들의 경우는 dsEng이 -0.441±.42 ng/ml (P=0.04)으로 무뎌졌다. 37주 이하 차인 전자간증 여성의 경우에는 가용성 엔도글린의 수준의 급락이 무뎌졌고, 반대 방향으로 향하는 경향을 보였다(0.732±.77 ng/ml, P <0.01 대조군과 비교시).

예상 알고리즘 (Predictive Algorithms)

심한 조기 전자간증 예상 테스트로서 이들 변경들(alterations)이 사용될 수 있는지 알아보기 위해서, 우리는 정상혈압 여성 및 전자간증인 여성, 및 특히, 조기 전자간증인 여성에게서 product-1 (1 기) 및 product-2 (2 기)로서 sFlt1 x sEng의 값을 검토하였다. 전자간증인 환자의 product-1 (1 기) 및 product-2 (2 기) 모두 상당히 상승하였고, 중요한 점으로 산물의 delta 는 정상 대조군에서 음수를 나타낸 것과는 대조적으로 두드러지게 양수를 나타냈다(도 38). 게다가 d prodct는 정상 대조군과 비교하여 조기 전자간증인 환자의 경우 현저히 증폭되었다(P=0.004).

혈관형성 인자의 변경된 수준과 조기 전자간증의 위험 간 관계를 조사하기 위하여 우리는 표본 집단의 인종(race/ethnicity), 체중 지수, 재태기간으로 조정 후에 더 낮은 두개의 범주와 관련해서 D product 농도 분초에서 가장 높은 범주의 조기 전자간증에 대한 조절 오즈 비(adjusted odds ratios (aOR)) 95 퍼센트 신뢰 수간(95 percent confidence intervals (95% CI))을 계산하였다.

조기 위험도의 실질적인 상승은 delta product 가 -1이하인 여성과 비교하여 . delta product 가 +1 이상인 그룹 [aOR 5.5, 95% CI 1.4 - 22.4]에게서 나타났다.

CPEP 네스티드 환자 대조군 연구의 2차 분석(Secondary analysis of the CPEP nested case control study)

CPEP trial인 여성의 경우, 정상 혈압인 여성의 코호트 중에서 sFlt1의 평균 값은 10-12 주차에서 13-16 주차 사이에 3.68 ng/ml 에서 4.92 ng/ml 로 상승하였고, 17-20주차에는 4.29 ng/ml 로 감소하였는바, 조기 전자간증인 여성의 경우, sFlt1의 평균 값은 10-12, 13-16 , 17-20주차에서 3.44 ng/ml 에서 4.22 ng/ml 로 상승하였고 5.39 ng/ml 로 더 많이 상승하였다. 이러한 경향은 만기 전자간증인 여성의 경우는 뚜렷하지 않았다(표 11).

표 11. CPEP trial의 경우 sFlt 및 sEng 의 혈청 수준.

유사한 결과가 sEng 의 수준에서도 나타났다. 정상혈압의 여성들의 경우 sEng 의 수준은 10-12주 차 6.8 ng/ml 에서 13-16주 차 7.07 ng/ml 까지 증가했다가 17-20차 5.78 ng/ml 까지 감소한 반면, 조산 전자간증인 여성의 경우 엔도글린의 수준이 10-12주 차 7.15 ng/ml 에서 13-16주 차 7.95 ng/m까지 증가하였고, 17-20차 10.19 ng/ml 까지 추가 상승하였다. 이러한 경향은 각각 10-12주 차, 13-16주 차 , 17-20차 에 7.41 ng/ml , 7.80 ng/ml , 8.34 ng/ml 까지 상승한 전자간증인 여성과도 일치하였다. (표 11)

초기-전자간증이 발병할 환자들은 임신 2기에 모두가 상승했다. 일반적으로는 임신시에 sFlt1에는 뚜렷한 변화없이 임신 2기에 sEng 이 급격히 떨어지는 것이 특징이다. 그러나 초기-전자간증이 발병 예정인 환자들의 경우 특히 조산 전자간증인 환자의 경우에는 1기에서 2기까지 계속해서 sFlt1 및 sEng 모두가 상승했다. 1기와 2기 동안의 sFlt1 및 sEng 의 변화는 조산 전자간증 발병 위험이 높은 환자들을 스크리닝하는데 유용하다. 이러한 발견들은 조산 전자간증을 예견하기에 중요한 암시가 된다. 전자간증 여부에 대한 안전하고, 신뢰할만한 스크리닝 테스트를 할 수 있게 되는 것은 오랫동안 연구원들의 목표였다.

이전에는 단백뇨(microalbuminuria), 체중 증가, 혈청 부피 변화와 같은 병의 초기 발현을 탐지하는 데에만 초점을 맞췄다. 대량 분석에 있어서, Conde-Agudelo A et al 는 전자간증을 예견하기 위한 임상학, 생물리학 및 생화학 시험의 유용함을 주장하기 위해 잠재적으로 관련있는 7,191 항목들(211,369 women)중 87개를 분석하였다.

*그들은 2004년에 전자간증의 진행 예견하기 위해 임상적으로 유용한 스크리닝 테스트는 없다고 결론지었다(12). 본 연구에서는 명 주 내지 몇 달 이후에 임상적으로 전자간증을 앓게될 여성의 경우 1기 및 2기에 (각 환자마다 delta 로 특정한 바와 같이) sFlt1 and sEng 수준이 상승하였다. 이러한 변화들은 조기 전자간증을 앓는 여성의 경우에는 더 상당하다.

혈관형성 팩터들의 불균형은 전자간증의 병인에 중요한 역할을 한다고 판단된다. 전자간증 태반은 손상된 가상혈관형성(pseudo-vasculogenesis)을 포함하여 비정상적 혈관 리모델링 및 얕은 이식을 특징으로 한다(Fisher et al., Semin Cell Biol. 4:183-8 (1993)). 이러한 태반 상의 변화들은 임신 12-18주 사이에 일어나고, 심각한 조기 전자간증 대부분의 병인으로 중요하다. 이러한 태반 비정상성이 전자간증의 maternal syndrome을 유도하는 시스테믹한 인자들의 상승을 이끌어낸다고 생각돼왔다. PCT 출원 공개 번호 WO 2004/008946, WO 2005/077007, WO 2006/034507에서 기재되어 있듯이 임상학적 질환 시기에 뿐만 아니라 징후를 나타내기 몇 주전에도 전자간증의 경우 sFlt1 및 sEng 모두, 두가지 항-혈관 형성 단백질이 상승된다고 알려져 있다 (Levine et al., (2006), supra). 중요한 점은, 모든 인자들이 쥐에서 전자간증과 같은 신드롬을 유도하는데 관련되어 왔다는 것이다 (Maynard et al., supra, Venkatesha et al., supra). 그러나 모체 혈중의 혈관형성 인자 농도의 변경(alteration)이 상대적으로 임신 후기에 일어난 이래로 증가된 이들 항-혈관형성 인자들의 생산은 비이상적 태좌(placentation)에 응하여 일어나 는 2차 현상일 것이다. 태반 융모 이식(placental villous explants) 및 초기 영양막 세포(cytotrophoblast culture) 배양 연구를 이용한 인비트로 데이터는 항-혈관형성 인자들은 모계 내 혈관 장애(maternal endothelial dysfunction)를 유도하는 역할에 추가적으로, 영양막세포 이동 및 분화에 관련되어 있다는 것을 제시한다.

항-혈관형성 인자들의 수준은 정상 임산부의 경우 1기에서 2기 사이에 감소하지만 이후에 조기 전자간증을 앓게될 임산부들의 경우 그렇지 않다는 우리의 발견은 혈중(circulating) 혈관형성 인자들의 비이상성은 태아기 분화시 비이상성과 동시에 일어난다는 것을 보여준다.

전자간증 환자의 증가된 혈중(circulating) sFlt1 및 sEng 농도에 대한 원인은 밝혀지지않았다. 저산소증(Hypoxia), 유전자, 또는 면역학적 요인들은 제 역할을 한다고 믿어진다. 인비보 및 태반 저산소증 인 비트로 모델의 경우 sFlt1 및 sEng 의 발현이 저산소증에 반응하여 상승하고 상승 발현은 HIF-1에 의해 매개된다 사실은 것은 주목할만한 가치가 있다(Nevo et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 291:R1085-93 (2006)). 게다가 정상 임신기간 동안 태반은 임신 초기에 저산소증이고 이러한 저산소증은 2기에는 증가된 혈류량으로 사라지게 된다. 비록 저산소증이 형식적으로는 결코 전자간증 임산부에게서 기록된 적이 없었으나, 증가된 저산소증이 태반으로 가는 Doppler 혈류를 손상시키고 트랜스크립션(transcription) 인자 발현을 유도한다는 surrogate 증거에 기초하건대 저산소증은 대부분 전자간증 임산부들에 게 중요하다고 믿어지고 있다.정상 임산부의 경우에는 sFlt1 및 sEng 이 1기와 2기 사이에 급락하는 반면 심한 전자간증 환자의 경 우 상승된 상태로 남아있다는 우리의 발견을 기초로 태반허혈(placental ischemia)이 전자간증인 환자들의 경우 이들 항-혈관형성 단백질의 생산을 증가시키는 중요한 역할을 할 것이라는 제안을 한다.

요약하건대, 일련의 변화들은 전자간증을 앓게 될 여성 특히, 그 후에 조기 전자간증을 앓게 될 여성을 구별해내기 위한 것으로 판단된다. 우리의 발견들은 다 커다란 샘플크기를 이용한 단면 연구(cross-sectional studies) 에서 재생산되었다(표 11).

실시예 12. 엔도글린은 TGF-β1-유도성 eNOS Thr495 탈인산화(dephosphorylation)를 위해 필요하다(Endoglin is necessary for TGF-β1-induced eNOS Thr495 dephosphorylation).

뮤린 내피 세포들은(Murine endothelial cells) Eng ^+/+ 및 Eng ^-/- mouse 배아체에서 유래하였고, Balconi et al. (Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20:1443-51 (2000))에 기재한 방식대로 길렀다. 융합성 단일층(Confluent monolayers)은 2시간 동안 스탈빙한(starved) 혈청으로, 15분 동안 TGF-β1 (125 and 250 pM)를 넣어 자극하거나 또는 넣지 않았다. 세포 추출물은 1% Triton X-100를 함유하는 10mM Tris-HCl 안에 넣어 즉시 준비하였고 단백분해효소 및 탈인산가수분해효소(phosphatase) 저해제로 보충되었다. 단백질 농도가 정량되고, 샘플들은 인산 기(phospho)- 특이적 eNOS 의 Thr495(Cell Signaling) 다중클론항체 및 eNOS (BD Biosciences) 단일클론항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다.

도 40A에 나타난 대표 웨스턴 블롯 및 도 40B(n=3 실험의 평균) 에 도시된 관련 그래프는 TGF-β1는 (**P<0.01 versus baseline) mouse Eng^+/+ 내피 세포 내 에서는 eNOS Thr495 탈인산화(dephosphorylation)를 유도했으나 Eng ^-/- cells에서는 그렇지 못했다. 이러한 결과는 eNOS Thr495 탈인산화와 활성에 시그널링하는 링킹 TGF-β1 내 엔도글린의 역할이 중요하다는 것을 보여준다. 게다가 이러한 과정이 엔도글린-의존성인바, 가용성 엔도글린은 생각컨대 결합하여 TGF-β1을 저해함으로써, 그 과정을 저해하기 위해서도 사용될 수 있다.

다른 구현예들(Other Embodiments)

본 발명의 구체적인 구현예들에 대한 설명은 예시를 위한 것이다. 이는 본 명세서에 개시된 구체적 형태로 본 발명의 범위를 축소시키거나 제한되는 것을 의도하지는 않는다. 본 발명이 참조로서 몇 가지 구현예들을 설명하였으나, 청구범위에 설명된 바와 같이 다양한 변형들이 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않음이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 본 명세서에서 언급한 모든 특허, 특허출원 및 공개문헌은 참조에 의해 본 명세서의 내용으로 편입된다.

<110> BETH ISRAEL DEACONESS MEDICAL CENTER et al. <120> METHODS OF DIAGNOSING AND TREATING COMPLICATIONS OF PREGNANCY <130> PI080022 <150> 11/443,920 <151> 2006-05-31 <150> 60/852,761 <151> 2006-10-19 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1311 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggaccgcg gcacgctccc tctggctgtt gccctgctgc tggccagctg cagcctcagc 60 cccacaagtc ttgcagaaac agtccattgt gaccttcagc ctgtgggccc cgagagggac 120 gaggtgacat ataccactag ccaggtctcg aagggctgcg tggctcaggc ccccaatgcc 180 atccttgaag tccatgtcct cttcctggag ttcccaacgg gcccgtcaca gctggagctg 240 actctccagg catccaagca aaatggcacc tggccccgag aggtgcttct ggtcctcagt 300 gtaaacagca gtgtcttcct gcatctccag gccctgggaa tcccactgca cttggcctac 360 aattccagcc tggtcacctt ccaagagccc ccgggggtca acaccacaga gctgccatcc 420 ttccccaaga cccagatcct tgagtgggca gctgagaggg gccccatcac ctctgctgct 480 gagctgaatg acccccagag catcctcctc cgactgggcc aagcccaggg gtcactgtcc 540 ttctgcatgc tggaagccag ccaggacatg ggccgcacgc tcgagtggcg gccgcgtact 600 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Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu 20 25 30 Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln 35 40 45 Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val 50 55 60 His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu 65 70 75 80 Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu 85 90 95 Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu 100 105 110 Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln 115 120 125 Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr 130 135 140 Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala 145 150 155 160 Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln 165 170 175 Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg 180 185 190 Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His 195 200 205 Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu 210 215 220 Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu 225 230 235 240 Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro 245 250 255 Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp 260 265 270 Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg 275 280 285 Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg 290 295 300 Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala 305 310 315 320 Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr 325 330 335 Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro 340 345 350 Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met 355 360 365 Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile 370 375 380 Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly 385 390 395 400 Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val 405 410 415 Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser 420 425 430 Ser Ser Pro Gln Arg 435 <210> 3 <211> 30 <212> DNA 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575 Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr 580 585 590 Arg Ser Pro Ser Lys Arg Glu Pro Val Val Ala Val Ala Ala Pro Ala 595 600 605 Ser Ser Glu Ser Ser Ser Thr Asn His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser 610 615 620 Thr Pro Cys Ser Thr Ser Ser Met Ala 625 630

Claims (57)

1. 환자의 임신관련 고혈압 질환(pregnancy related hypertensive disorder)의 치료 또는 예방 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 NOS의 발현 농도 또는 생물학적 활성을 증가시킬 수 있는 화합물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 투여 단계는 상기 환자에게 상기 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 시간 및 양으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 NOS는 eNOS인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 화합물은 eNOS의 Ser1177의 인산화(phosphorylation)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 VEGF 또는 그의 생물학적 활성이 있는 단편인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 VEGF는 VEGF121, VEGF165 또는 VEGF의 변형된 형태, 또는 그들의 생물학적 활성이 있는 단편인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
6. 제 25항에 있어서, 상기 화합물은 PlGF 또는 그의 생물학적 활성이 있는 단편인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
7. 제 2항에 있어서, 상기 화합물은 eNOS의 Thr495의 탈인산화(dephosphorylation)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 화합물은 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A(activin A), BMP-2, BMP-7 및 그들의 생물학적으로 활성이 있는 단편으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
9. 제 1항에 있어서, 가용성 엔도글린(soluble endoglin)의 발현 또는 가용성 엔도글린의 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물을 상기 환자에게 투여하는 것을 더 포함하며, 상기 투여는 상기 환자에 있어서 임신관련 고혈압 질환을 치료 또는 예방에 충분한 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 화합물은 정제된 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 가용성 엔도글린 항원-결합 단편(soluble endoglin antigen-binding fragment)인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
11. 제 10항에 있어서, 상기 항체는 도 30B에 보여지는 인간 엔도글린 서열의 26 내지 437, 40 내지 406, 또는 26 내지 587 아미노산들로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 가용성 엔도글린 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
12. 제 10항에 있어서, 상기 항체는 도 30B에 보여지는 인간 엔도글린 서열의 40 내지 86, 144 내지 199, 206 내지 222, 289 내지 304, 또는 375 내지 381 아미노산을 포함하는 가용성 엔도글린의 에피토프(epitope)에 결합하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
13. 제 9항에 있어서, 상기 화합물은 기질 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase, MMP), 카텝신(cathepsin) 및 엘라스타제(elastase)로 구성된 군에서 선택된 단백질 분해효소를 저해하는 화합물인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
14. 제 1항에 있어서, 상기 임신관련 고혈압 질환은 정상 기준(normal reference)과 비교하여 sFlt-1의 농도가 증가되는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
15. 제 1항에 있어서, sFlt-1의 발현 농도 또는 sFlt-1의 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 화합물을 상기 환자에게 투여하는 것을 더 포함하며, 상기 투여는 환자에 있어서 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방에 충분한 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 화합물은 sFlt-1에 결합하는 정제된 성장인자 또는 항체이거나 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
17. 제 1항에 있어서, 상기 환자는 임신한 사람 또는 분만 후의 사람, 또는 임신한 비-인간인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
18. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 상기 환자의 상기 임신관련 고혈압 질환을 모니터링하는 것을 더 포함하고, 상기 모니터링은 상기 환자로부터 얻은 혈청(serum) 또는 혈장(plasma) 샘플에서 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도를 측정하는 것을 포함하며, 상기 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도는 25 ng/ml 이하로서 상기 임신관련 질환의 개선을 나타내는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
19. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 상기 환자의 상기 임신관련 고혈압 질환을 모니터링하는 것을 더 포함하고, 상기 모니터링은 상기 환자로부터 얻은 샘플에서 가용성 엔도글린 폴리펩티드의 농도를 측정하는 것을 포함하며, 상기 농도의 측정은 2 이상의 경우(occasion)에서 수행되고 측정값들 사이의 상기 가용성 엔도글린 농도의 감소는 상기 임신관련 고혈압 질환의 개선의 인디케이터(indicator)인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
20. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 상기 환자의 상기 임신관련 고혈압 질환을 모니터링하는 것을 더 포함하고, 상기 모니터링은 상기 환자로부터 얻은 샘플에서 가용성 엔도글린 폴리펩티드를 측정하여 양성 기준(positive reference) 샘플과 상기 농도를 비교하며, 상기 양성 기준 샘플에 비해 가용성 엔도글린 농도의 감소는 상기 환자의 상기 임신관련 고혈압 질환의 개선을 나타내는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
21. 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모니터링은 화합물의 치료 용량(therapeutic dosage)을 결정하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
22. 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정은 면역학적 분석(immunological assay)의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
23. 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 엔도글린의 농도는 유리(free), 결합(bound) 또는 전체(total) 가용성 엔도글린의 농도이거나 분해(degradation) 또는 효소적 절단(enzymatic cleavage)에 기인한 엔도글린 폴리펩티드의 농도인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
24. 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모니터링은 상기 환자로부터 얻은 샘플에서 적어도 하나의 sFlt-1, VEGF 또는 PlGF 폴리펩티드의 농도를 측정하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
25. 제 24항에 있어서, 메트릭(metric)을 사용하여 상기 가용성 엔도글린, sFlt-1, VEGF 또는 PlGF의 농도 사이의 관계를 계산하는 것을 더 포함하고, 상기 기준 샘플(reference sample)에 비해 상기 환자 샘플에서 상기 농도 사이의 관계의 변경은, 상기 환자의 임신관련 고혈압 질환의 개선을 나타내는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
26. 제 25항에 있어서, 상기 메트릭은 [(sFlt-1 + 0.25 가용성 엔도글린)/PlGF], [(가용성 엔도글린 + sFlt-1)/PlGF], 및 [sFlt-1 × 가용성 엔도글린]으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
27. 제 25항에 있어서, 상기 메트릭은 dproduct = 임신 2기에서 (sFlt1 × sEng) - 임신 1기에서 (sFlt1 × sEng)]이고, 0 보다 큰 상기 dproduct 값은 상기 환자의 임신관련 고혈압 질환을 나타내며 양성 기준 샘플과 비교하여 상기 dproduct 값의 감소는 상기 환자의 임신관련 고혈압 질환의 개선을 나타내는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환의 치료 또는 예방 방법.
28. 가용성 엔도글린 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항원은 도 30B에 보여지는 인간 엔도글린 서열의 40 내지 86, 144 내지 199, 206 내지 222, 289 내지 304, 또는 375 내지 381 아미노산을 포함하 는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
29. 제 28항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 가용성 엔도글린에 대한 성장인자의 결합을 차단하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
30. 제 29항에 있어서, 상기 성장인자는 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP-2 및 BMP-7로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
31. 제 28항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체(monoclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody) 또는 인간 항체(human antibody)인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
32. 제 28항에 있어서, 상기 항체는 Fc부가 결여되고, F(ab')₂, Fab 또는 Fv 구 조인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
33. 제 28항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)에 존재하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
34. 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인(predisposition)을 갖는 환자의 진단 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자로부터 얻은 샘플에서 가용성 엔도글린 폴리펩티드 및 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP2, BMP7, eNOS 및 PGI₂로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 추가적인 폴리펩티드의 농도를 측정하는 것을 포함하는데, 여기서 정상 기준 샘플, 표준(standard) 또는 농도와 비교하여 상기 가용성 엔도글린 농도의 증가 및 상기 적어도 하나의 추가적인 폴리펩티드 농도의 감소는 임신관련 고혈압 질환 또는 임신관련 고혈압 질환으로 발병 가능성(propensity)의 진단 인디케이터인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
35. 제 34항에 있어서, 상기 측정은 면역학적 분석의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
36. 제 35항에 있어서, 상기 면역학적 분석은 ELISA인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
37. 제 34항에 있어서, 상기 정상 기준 샘플은 상기 환자로부터 얻은 이전 샘플(prior sample)인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
38. 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자로부터 얻은 가용성 엔도글린 폴리펩티드 및 sFlt-1 폴리펩티드의 농도를 측정하고 [가용성 메트릭 × sFlt-1] 메트릭을 사용하여 상기 가용성 엔도글린 및 sFlt-1의 농도 사이의 관계를 계산하는데, 여기서 상기 정상 기준 샘플에 비해 상기 환자 샘플에서 상기 메트릭의 증가는 환자의 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
39. 제 38항에 있어서, 상기 메트릭은 모체의 체질량지수(body mass index) 또는 태아의 재태기간(gestational age)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
40. 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법으로서, 상기 방법은 임신 1기(first trimester)와 2기(second trimester) 동안 상기 환자로부터 얻은 가용성 엔도글린 폴리펩티드 및 sFlt-1 폴리펩티드의 농도를 측정하여 다음의 메트릭을 사용하여 상기 가용성 엔도글린 및 sFlt-1의 농도 사이의 관계를 계산하는 것을 포함하는데: [dproduct = 임신 2기에서 (sFlt1 × sEng) - 임신 1기에서 (sFlt1 × sEng)], 여기서 0 보다 큰 dproduct 값은 상기 환자의 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
41. 제 40항에 있어서, 1 보다 큰 상기 dproduct 값은 상기 환자의 임신관련 고혈압 질환의 진단 인디케이터인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
42. 제 41항에 있어서, 상기 1 보다 큰 상기 dproduct 값은 조기 전자간증(pre-term pre-eclampsia)의 진단 인디케이터인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
43. 제 34항, 제 38항 또는 제 40항에 있어서, 상기 샘플은 상기 가용성 엔도글린이 정상적으로 검출될 수 있는 환자의 체액, 세포 또는 조직인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
44. 제 43항에 있어서, 상기 체액은 소변, 양수(amniotic fluid), 혈액, 혈청 및 혈장으로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
45. 제 43항에 있어서, 상기 세포는 내피세포(endothelial cell), 백혈구(leukocyte), 단핵구(monocyte) 및 태반(placenta)에서 유래된 세포로 구성된 군 에서 선택된 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
46. 제 43항에 있어서, 상기 조직은 태반 조직인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
47. 제 34항, 제 38항 또는 제 40항에 있어서, 상기 환자는 임신하지 않은 사람, 임신한 사람, 분만 후의 사람 또는 비-인간이고, 상기 방법은 임신관련 고혈압 질환의 발병 소인을 진단하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
48. 제 47항에 있어서, 상기 비-인간은 소, 말, 양, 돼지, 염소, 개 또는 고양이로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
49. 제 34항, 제 38항 또는 제 40항에 있어서, 상기 방법은 적어도 증상들의 발 병 4주 이전에 임신관련 고혈압 질환 또는 임신관련 고혈압 질환의 발병소인을 진단하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
50. 제 1항, 제 34항, 제 38항 또는 제 40항에 있어서, 상기 임신관련 고혈압 질환은 전자간증(pre-eclampsia), 자간증(eclampsia), 임신성 고혈압(gestational hypertension), 만성 고혈압(chronic hypertension), HELLP 증후군(HELLP syndrome), 및 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신(pregnancy with a SGA infant)인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
51. 제 50항에 있어서, 상기 임신관련 고혈압 질환은 전자간증 또는 자간증인 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환 또는 그 발병 소인을 갖는 환자의 진단 방법.
52. (i) 가용성 엔도글린 결합제(binding agent)와 (ii) TGF-β1, TGF-β3, 액티 빈 A, BMP2, BMP7, eNOS 및 PGI₂로 구성된 군에서 선택된 폴리펩티드에 결합하는 적어도 하나의 추가적인 결합제, 및 (iii) 임신관련 고혈압 질환 또는 임신관련 고혈압 질환의 발병 소인의 진단을 위한 (i)의 상기 결합제와 (ii)의 상기 적어도 하나의 결합제의 사용 설명서를 포함하는 대상의 임신관련 고혈압 질환의 진단용 키트.
53. 제 52항에 있어서, 상기 (i)의 결합제는 가용성 엔도글린에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 상기 (ii)의 적어도 하나의 결합제는 TGF-β1, TGF-β3, 액티빈 A, BMP2, BMP7, eNOS 또는 PGI₂에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 대상의 임신관련 고혈압 질환의 진단용 키트.
54. 제 52항에 있어서, 상기 키트는 VEGF, sFlt-1 또는 PlGF 결합 분자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대상의 임신관련 고혈압 질환의 진단용 키트.
55. 제 52항에 있어서, 상기 임신관련 고혈압 질환은 전자간증, 자간증, 만성 고혈압, HELLP 증후군, 임신성 고혈압 또는 재태기간에 비해 작은 태아(SGA)를 갖는 임신인 것을 특징으로 하는 대상의 임신관련 고혈압 질환의 진단용 키트.
56. 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물의 동정 방법으로서, 상기 방법은

    (a) 세포를 가용성 엔도글린 화합물과 접촉시키는 단계;

    (b) (a)단계의 상기 세포에서 eNOS의 Thr495의 인산화 상태를 결정하는 단계;

    (c) 상기 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계;

    (d) (c)단계의 상기 세포를 eNOS의 Thr495의 인산화 상태를 결정하는 단계; 및

    (e) (b)단계와 (d)단계에서 결정된 인산화 상태를 비교하는 단계를 포함하는데,

    여기서 (b)단계와 비교하여 (d)단계에서 eNOS의 Thr495의 탈인산화의 증가는 상기 후보 화합물을 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물로서 동정하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물의 동정 방법.
57. 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물의 동정 방법으로서, 상기 방법은

    (a) 세포를 Smad2/3 의존적 리포터 구조체(Smad2/3 dependent reporter construct) 및 가용성 엔도글린 화합물과 접촉시키는 단계;

    (b) (a)단계의 상기 세포에서 상기 Smad2/3 리포터 구조체의 활성화의 농도를 결정하는 단계;

    (c) (a)단계의 상기 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계;

    (d) (c)단계의 상기 세포에서 상기 Smad2/3 리포터 구조체의 활성화의 농도를 결정하는 단계; 및

    (e) (b)단계와 (d)단계에서 결정된 상기 Smad2/3 리포터 구조체의 활성화의 농도를 비교하는 단계를 포함하는데,

    여기서 (b)단계와 비교하여 (d)단계에서 상기 Smad2/3 리포터 구조체의 활성화의 농도의 증가는 임신과련 고혈압 질환을 개선하는 화합물로서 상기 후보 화합물을 동정하는 것을 특징으로 하는 임신관련 고혈압 질환을 개선하는 화합물의 동정 방법.

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