BRPI0713122A2 - métodos de diagnóstico e tratamento de complicações de gravidez - Google Patents

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BRPI0713122A2
BRPI0713122A2 BRPI0713122-4A BRPI0713122A BRPI0713122A2 BR PI0713122 A2 BRPI0713122 A2 BR PI0713122A2 BR PI0713122 A BRPI0713122 A BR PI0713122A BR PI0713122 A2 BRPI0713122 A2 BR PI0713122A2
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preeclampsia
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S Ananth Karumanchi
Vikas P Sukhatme
Mourad Toporsian
Michelle V Letarte
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Beth Israel Hospital
Hospital For Sick Children
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Abstract

MéTODOS DE DIAGNóSTICO E TRATAMENTO DE COMPLICAçõES DE GRAVIDEZ. A presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, tal como pré-ecíampsia e eclampsia, usando combinações de compostos que alteram os níveis de expressão ou atividade biológica de endoglina solúvel, sintase de óxido nítrico endotelial, PGI~ 2~, TGF-<225>1, TGF-<225>3, activina A, BMP2, BMP7 e sFlt-1. Também divulgados são métodos de diagnóstico de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, tal como pré-eclampsia ou eclampsia, que incluem a medição de qualquer um ou mais dos seguintes: níveis de expressão ou atividade biológica de endoglina solúvel, sintase de óxido nítrico endotelial, PGI~ 2~, TGF-<225>1, TGF-<225>3, activina A, BMP2, BMP7 e sFIt-1.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE COMPLICAÇÕES DE GRAVIDEZ".
Camoo da Invenção
A presente invenção refere-se à detecção e tratamento de indi- víduos tendo um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez.
Antecedentes da Invenção
A pré-eclampsia é uma síndrome de hipertensão, edema e pro- teinuria que afeta 5 a 10% das gestacoes e resulta em morbidade e mortali- dade materna e fetal substanciais. A pré-eclampsia responde por pelo me- nos 200.000 mortes maternas no mundo todo por ano. Os sintomas de pré- eclampsia aparecem, tipicamente, após a 20ê semana de gravidez e são u- sualmente detectados através de medição de rotina da pressão sangüínea e urina da mulher. Contudo, esses métodos de monitoramento são ineficazes para diagnóstico da síndrome em um estágio precoce, o que poderia reduzir o risco para o indivíduo ou feto em desenvolvimento, se um tratamento efi- caz estivesse disponível.
Atualmente, não existem curas conhecidas para a pré- eclampsia. A pré-eclampsia pode variar, quanto à gravidade, branda a que ameaça a vida. Uma forma branda de pré-eclampsia pode ser tratada com repouso no leito e monitoramento freqüente. Para casos moderados a gra- ves, hospitalização é recomendada e medicação para a pressão sangüínea ou medicações anti-convulsivas para prevenir ataques são prescritas. Se a condição passa a ameaçar a vida da mãe ou do bebê, a gravidez é termina- da e o bebê nasce pré-termo.
O desenvolvimento apropriado do feto e da placenta é mediado por vários fatores de crescimento ou fatores angiogênicos. Um desses fato- res angiogênicos é a endoglina, também conhecida como CD105. A endogli- na é uma glicoproteína da membrana celular homodimérica que é predomi- nantemente expressa sobre células epiteliais, tais como sincitiotrofoblastos, células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e sobre células endo- teliais vasculares. A endoglina compartilha identidade de seqüência com a betaglicana, um receptor do fator de crescimento de transformação (TGF-β) (TpR) do tipo III. Foi mostrado que a endoglina é um componente regulatório do complexo do receptor de TGF-β, o qual modula a angiogênese, prolifera- ção, diferenciação e apoptose. A endoglina também se liga a vários outros membros da superfamília TGF-β, incluindo activina-A, proteína morfogênica ossea (BMP-2) e BMP-7. Em particular, a endoglina se liga ao TGF-βΙ e TGF-β3 com alta afinidade e forma associações heterotriméricas com recep- tores de sinalização ao TGF-β dos tipos I e II. Mutações na região de codifi- cação do gene da endoglina são responsáveis por telangiectasia hemorrági- ca do tipo I (HHT1), um distúrbio vascular dominantemente hereditário carac- terizado por displasia vascular multi-sistêmica e hemorragia recorrente. Em- bora a imuno-reatividade da endoglina tenha sido anteriormente detectada em níveis aumentados no plasma de pacientes com câncer de mama metas- tático e cólon-retal, suas características bioquímicas não foram determina- das e seu papel funcional exato na patogênese de câncer é desconhecido. Produção de endoglina solúvel não foi reportada como estando associada à pré-eclampsia ou gravidez normal.
Vários fatores foram reportados como tendo uma associação com o desenvolvimento fetal e placental e, mais especificamente, com a pré- eclampsia. Eles incluem fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), receptor de Flt-1 solúvel (sFlt-1) e fator de crescimento placental (PIGF). O VEGF é um mitógeno célula endotelial- específico, um indutor angiogênico e um mediador de permeabilidade vascular. Também foi mostrado que o VEGF é importante para o reparo de capilar glomerular. O VEGF se liga co- mo um homodímero a um de dois receptores de quínase de tirosina que a- brange a membrana homólogos, o receptor de quínase de tirosina seme- lhante a fms (Flt-1) e o receptor de domínio de guínase (KDR), os quais são diferencialmente expressos em células endoteliais obtidas de muitos tecidos diferentes. O Flt-1, mas não o KDR, é altamente expresso por células de trofoblasto, as quais contribuem para a formação de placenta. O PIGF é um membro da família VEGF que também está envolvido no desenvolvimento placental. O PLGF é expresso por citotrofoblastos e sincitiotrofoblastos e é capaz de induzir à proliferação, migração e ativação de células endoteliais. O PLGF se liga como um homodímero ao receptor Flt-1, mas não ao recep- tor KDR. O PLGF e o VEGF contribuem para a atividade mitogênica e angi- ogênese que são críticas para a placenta em desenvolvimento.
O sFlt-1, o qual carece dos domínios transmembrana e cito- plásmico do receptor, foi recentemente identificado em um meio cultivado de células endoteliais da veia umbilical humana e expressão in vivo foi subse- qüentemente demonstrada em tecido placental. O sFlt-1 se liga ao VEGF com um alta afinidade, mas não estimula a mitogênese de células endoteli- ais. Regulação cuidadosa das vias de sinalização angiogênica e mitogênica é crítica para manter proliferação, migração e angiogênese apropriadas por células de trofoblasto na placenta em desenvolvimento.
Há uma necessidade por métodos de diagnóstico preciso de in- divíduos em risco de ou tendo pré-eclampsia ou eclampsia, particularmente antes do início dos sintomas mais graves. Um tratamento também é neces- sário.
Sumário da Invenção
Descobriu-se métodos para o diagnóstico e tratamento de dis- túrbios hipertensivos relacionados à gravidez, incluindo pré-eclampsia e e- clampsia.
Usando análise de expressão de gene, descobriu-se que níveis elevados de endoglina solúvel (sEng) estão acentuadamente elevados em amostras de tecido placental de mulheres grávidas que sofrem de complica- ções de gravidez associadas à hipertensão, incluindo pré-eclampsia. Usando Western blotting, também descobriu-se que os níveis de proteína endoglina solúvel estão elevados em amostras de soro sangüíneo tomadas de mulhe- res com um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, tal como pré- eclampsia ou eclampsia. A endoglina solúvel pode ser formada através de clivagem da porção extracelular da forma ligada à membrana através de en- zimas proteolíticas. Descobriu-se que a endoglina solúvel detectada nessas amostras contém um mínimo dos primeiros 381 aminoácidos (excluindo o peptídeo líder, 406 incluindo o peptídeo líder) da porção amino terminal da —endoglina "de comprimento total. Endoglina solúvel em excesso em pré- eclampsia pode estar privando a placenta de quantidades necessárias des- ses fatores angiogênicos e mitogênicos essenciais impedindo a ligação de TGF-βΙ ao TpRII sobre células endoteliais, levando à sinalização diminuída, conforme descrito aqui. Também descobriu-se que a endoglina solúvel inter- fere com a sinalização ao TGF-βΙ e ativação de sintase de oxido nítrico en- dotelial (eNOS) em células endoteliais, desse modo, rompendo mecanismo homeostáticos chave necessários para manutenção da saúde vascular. De- monstrou-se que a endoglina solúvel impede a ligação de TGF-βΙ ao TpRII sobre células endoteliais, levando à sinalização diminuída. Uma vez que o TGF-βΙ em circulação está em complexo com um peptídeo latência- associado e proteína de ligação a TGF-βΙ latente, ele não pode se ligar aos seus receptores, a menos que ativado. Portanto, é provável que a endoglina solúvel iniba apenas os efeitos do TGF-βΙ localmente, onde TGF-βΙ ativo é gerado. Tomados juntos, esses dados sugerem um papel crucial para a en- doglina relacionado à ativação do receptor TGF-β para a síntese de oxido nítrico (NO). Além disso, nosso estudos funcionais sugerem que a endoglina solúvel e o sFlt-1 atuam em conjunto para induzir a dano vascular e síndro- me HELLP interferindo com a sinalização ao TGF-β 1 e VEGF, respectiva- mente, provavelmente via inibição da ativação a jusante de NOS.
Na presente invenção, compostos que se ligam a ou neutralizam a endoglina solúvel são usados para reduzir os níveis elevados de endoglina solúvel e tratar complicações da gravidez associadas à hipertensão, incluin- do pré-eclampsia ou eclampsia. Por exemplo, anticorpos dirigidos à endogli- na solúvel bem como RNA de interferência e oligômeros de nucleobase anti- senso dirigidos para diminuir os níveis de endoglina solúvel biologicamente ativa também são proporcionados. A invenção também se caracteriza pelo uso de qualquer composto (por exemplo, polipeptídeo, pequena molécula, anticorpo, ácido nucleico e mimético) que diminui os níveis de endoglina so- lúvel ou atividade biológica ou que aumentam o nível ou atividade biológica de uma proteína de ligação à endoglina solúvel (por exemplo, proteína de ligação à endoglina solúvel (por exemplo, TGF-βΙ, TGF^3, activina A, Pro- teína Morfogênica Óssea (BMP-2 e BMP-7), NOS e prostaciclina (PGI2)), quer sozinhos ou em combinação uns com os outros ou qualquer composto que diminui o nível de sFlt-1 ou aumentam o nível ou atividade de VEGF ou PIGF (veja, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente U.S. Números 20040126828, 20050025762 e 20050170444 e Publicações PCT Números WO 2004/008946 e WO 2005/077007) para tratar ou prevenir distúrbios hi- pertensivos relacionados à gravidez, tais como pré-eclampsia ou eclampsia , em um indivíduo. A invenção também se caracteriza por métodos para me- dição dos níveis de endoglina solúvel, quer sozinha ou em combinação com sFlt-1, VEGF, PIGF1 TGF-β, eNOS ou PGI2, como uma ferramenta de detec- ção para diagnóstico precoce e gerenciamento de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, incluindo pré-eclampsia e eclampsia.
Consequentemente, em um primeiro aspecto, a invenção se ca- racteriza por um método de tratamento ou prevenção de um distúrbio hiper- tensivo relacionado à gravidez em um indivíduo, que inclui administração ao indivíduo de (i) um composto capaz de diminuir os níveis de expressão de endoglina solúvel ou atividade biológica e (ii) um composto capaz de diminuir os níveis de expressão ou atividade biológica de sFlt-1, durante um tempo e em uma quantidade suficientes para tratar ou prevenir o distúrbio hipertensi- vo relacionado à gravidez. Distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez in- clui, por exemplo, pré-eclampsia, eclampsia, hipertensão gestacional, hiper- tensão crônica, síndrome HELLP e gravidez com um bebê pequeno para a idade gestacional (SGA). De preferência, o distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez é pré-eclampsia ou eclampsia.
Ensaios para os níveis de expressão ou atividade biológica de endoglina solúvel ou sFlt-1 são conhecidos na técnica. Compostos preferí- veis diminuirão os níveis de expressão ou atividade biológica de endoglina solúvel ou sFlt-1 em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. Exemplos não-limitativos de compostos capazes de di- minuir os níveis de expressão ou atividade biológica de endoglina solúvel incluem qualquer composto que se liga à endoglina solúvel, por exemplo, um anticorpo à endoglina solúvel purificado, um fragmento de ligação a antígeno de endoglina solúvel ou"uma proteína de ligação à endoglina solúvel (por exemplo, TGF-βΙ, TGF-p3, activina A1 BMP-2 e BMP-7).
Exemplos adicionais de um composto capaz de diminuir os ní- veis de expressão ou atividade biológica de endoglina solúvel incluem qual- quer composto que inibe uma enzima proteolítica (por exemplo, uma meta- Ioproteinase na matriz (MMP), catepsina e elastase) ou um composto que aumenta o nível de um fator de crescimento capaz de ligação à endoglina solúvel. Fatores de crescimento, tais como TGF-βΙ, TGF-P3, activina A, BMP-2, BMP-7 ou fragmentos dos mesmos são exemplos de compostos que aumentam o nível de um fator de crescimento capaz de ligação à endoglina solúvel, assim como ciclosporina, alfa tocoferol, metil-sergida, bromocriptina e aldomet.
Exemplos não-limitativos de um compostos de diminuir os níveis de expressão ou atividade biológica de sFlt-1 incluem um composto capaz de se ligar especificamente ao sFlt-1, tal como um anticorpo ao sFlt-1 purifi- cado ou um fragmento de ligação a antígeno sFlt-1; compostos que aumen- tam o nível de um fator de crescimento capaz de ligação ao sFlt-1, tais como nicotina, teofilina, adenosina, nifedipina, minoxidila e sulfato de magnésio, VEGF (por exemplo, VEGF121, VEGF165 ou uma forma modificada de VEGF), PIGF ou fragmentos dos mesmos.
Em modalidades preferidas do métodos acima, um composto capaz de diminuir os níveis de expressão ou atividade biológica de endoglina solúvel ou um composto capaz de diminuir os níveis de expressão ou ativi- dade biológica de sFlt-1, ou ambos, pode também aumentar a atividade de sintase de óxido nítrico (NOS) em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. Ensaios para a atividade de NOS são conhe- cidos na técnica e descritos aqui.
Em um segundo aspecto, a invenção se caracteriza por um mé- todo de tratamento ou prevenção de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez em um indivíduo, que inclui a etapa de administração ao indivíduo de um composto capaz de aumentar o nível de expressão ou atividade bio- lógica de NOS, durante um tempo e em uma quantidade suficiente para tra- ~tarou~prevenir o distúrbiohipertensivorelacionado à gravidez no indivíduo. Desejavelmente1 o NOS é eNOS. Em uma modalidade, o composto é um composto que aumenta a fosforilação de Ser 1177 de eNOS, tal com VEGF (por exemplo, VEGF121, VEGF165 ou uma forma modificada de VEGF) ou fragmentos biologicamente ativos do mesmo ou PIGF ou fragmentos biologi- camente ativos do mesmo. Em outra modalidade, o composto é um compos- to que aumenta a desfosforilação de Thr 495 de eNOS, tal como TGF-βΙ ou TGF-p3, activina A, BMP-2 e BMP-7. Em outra modalidade, o composto é um composto que previne a redução dos níveis de eNOS ou aumenta a es- tabilidade de eNOS.
Opcionalmente, o método ainda inclui administração ao indivíduo de um composto capaz de reduzir os níveis de expressão ou atividade bioló- gica de endoglina solúvel, em que a administração é suficiente para tratar ou prevenir o distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez no indivíduo. Exem- plos não Iimitativos de um composto capaz de reduzir a expressão ou ativi- dade biológica de endoglina solúvel incluem um anticorpo purificado que se liga especificamente à endoglina solúvel ou um fragmento de ligação a antí- geno de endoglina solúvel ou um composto que inibe uma enzima proteolíti- ca selecionada do grupo consistindo de uma metaloproteinase na matriz (MMP), catepsina e elastase, ou fatores de crescimento, tais como TGF-βΙ, TGF-p3, activina A, BMP-2, BMP-7 ou fragmentos dos mesmos. Anticorpos exemplificativos que se ligam especificamente à endoglina solúvel incluem anticorpos que se ligam a um polipeptídeo de endoglina solúvel que inclui uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo dos amino- ácidos 26 a 437, 40 a 406 ou 26 a 587 da seqüência de endoglina humana mostrada na Figura 30B. anticorpos exemplificativos adicionais úteis nos métodos da invenção incluem um anticorpo que se liga a um epítopo sobre a endoglina humana que inclui os aminoácidos 40 a 86, 144 a 199, 206 a 222, 289 a 304 ou 375 a 381 da seqüência da endoglina humana mostrada na Figura 30B.
Em uma modalidade, o distúrbio hipertensivo relacionado à gra- videz é caracterizado por níveis elevados de polipeptídeo de sFlt-1 quando —comparado com uma referência normal. Opcionalmentero método ainda in- clui administração, ao indivíduo, de um composto capaz de reduzir a expres- são ou atividade biológica de sFlt-1, em que a administração é suficiente para tratar ou prevenir o distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez no in- divíduo. Exemplos não Iimitativos de um composto capaz de reduzir a ex- pressão ou atividade biológica de sFlt-1 solúvel incluem um anticorpo purifi- cado que se liga especificamente ao sFlt-1 ou um fragmento de ligação a antígeno de sFlt-1 ou um fator de crescimento, tal como VEGF (por exemplo, VEGF121, VEGF165 ou uma forma modificada de VEGF), PIGF ou fragmen- tos dos mesmos que se ligam ao sFlt-1 .
Para qualquer um dos métodos acima, o método pode ainda in- cluir a etapa de administração, ao indivíduo, de um composto anti- hipertensivo. Em modalidades preferidas de qualquer um dos métodos aci- ma, o indivíduo é uma mulher grávida, uma mulher em pós-parto ou um não- humano (por exemplo, uma vaca, um cavalo, uma ovelha, uma cabra, um cão e um gato).
Para qualquer um dos métodos acima, o método pode ainda in- cluir a etapa de monitoramento do distúrbio hipertensivo relacionado à gravi- dez no indivíduo, em que o monitoramento inclui medição do nível de poli- peptídeo de endoglina solúvel em uma amostra de soro ou plasma do indiví- duo. Se o nível absoluto de endoglina solúvel é determinado, um nível de polipeptídeo de endoglina solúvel de menos de 25 ng/ml indica uma melhora no distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez. Alternativa ou adicional- mente, o nível de endoglina solúvel pode ser medido em duas ou mais oca- siões ou comparado com uma amostra de referência positiva (por exemplo, de um indivíduo que está sofrendo de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez), onde uma diminuição no nível de endoglina solúvel, quer entre as medições ou quando comparado com a referência positiva, é um indica- dor de uma melhora no distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez. A me- dição dos níveis de endoglina solúvel pode incluir o uso de um ensaio imu- nológico. A endoglina solúvel pode incluir endoglina solúvel livre, ligada ou total, ou o nível de um polipeptídeo de endoglina resultante de degradação ou clivagem enzimática: Os métodos de monitoramento também podem in- cluir qualquer um dos sistemas métricos descritos aqui para o diagnóstico de pré-eclampsia ou eclampsia. Por exemplo, o método de monitoramento pode incluir medição dos níveis de sFlt-1 e de endoglina solúvel nos primeiro e segundo trimestres em um indivíduo e cálculo do valor delta de sFlt-1 x en- doglina solúvel (sEng) em cada trimestre usando a seguinte equação: dpro- duto = (sFItl x sEng) no segundo trimestre - (sFItl x sEng) no primeiro tri- mestre, onde um valor maior do que 0, 1, 2 ou mais, incluindo frações dos mesmos, (por exemplo, um valor positivo) é um indicador diagnóstico de pré- eclampsia ou eclampsia. Uma diminuição no valor ao longo do tempo indica uma melhora no distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez. Em outro e- xemplo, o delta produto para o nível de sFlt-1 (dsFlt-1) ou o nível de sEng (dsEng) entre os primeiro e segundo trimestres é calculado e um valor maior do que, 0, 1, 2 ou mais, inclui8ndo frações dos mesmos (por exemplo, um valor positivo) para (dsFlt-1) ou (dsEng) é um indicador diagnóstico de pré- eclampsia ou eclampsia. Uma diminuição no valor com o tempo indica uma melhora no distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez.
Para qualquer um dos métodos de monitoramento, o método pode ser usado para determinar a dosagem terapêutica do composto. O mé- todo também pode ainda incluir medição do nível de pelo menos um de poli- peptídeo de sFlt-1, VEGF ou PIGF em uma amostra do indivíduo e uma rela- ção entre esses níveis pode também, mas não precisa, ser calculada usando um sistema métrico. Sistemas métricos exemplificativos incluem (sFlt-1 + 0,25 endoglina solúvel)/PIGF, (endoglina solúvel + sFlt-1 )/PIGF, sFlt-1 x en- doglina solúvel e o dsFlt-1, dsEng e [dproduto = (sFItl x sEng) no segundo trimestre - (sFItl x sEng) no primeiro trimestre, conforme descrito acima.
Em outro aspecto, a invenção se caracteriza por um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a um polipeptídeo de endoglina solúvel, em que o anticorpo se liga a um epí- topo sobre a endoglina humana que inclui os aminoácidos 40 a 86, 144 a 199, 206 a 222, 289 a 304 ou 375 a 381 da seqüência da endoglina humana mostrada na Figura 30B. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligaçãO"a antígeno donnesmo"impede a ligação de um fator de crescimento (por exemplo, TGF-β1, TGF-p3, activina A, BMP-2 e BMP-7) à endoglina solúvel.
O anticorpo pode ser qualquer tipo de anticorpo ou fragmento de anticorpo, incluindo um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo que carece de uma porção Fc, uma estrutura F(ab')2, um Fab ou um Fv. Em uma modalida- de, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo está presente em um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em outro aspecto, a invenção se caracteriza por um método de diagnóstico de um indivíduo como tendo ou tendo uma pré-disposição a um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, que inclui medição do nível de um polipeptídeo de endoglina solúvel e pelo menos um polipeptídeo adicio- nal selecionado do grupo consistindo de proteínas de ligação à endoglina solúvel (por exemplo, TGF-β1, TGF-p3, activina A, BMP2 e BMP 7) e medi- adores a jusante da sinalização à endoglina solúvel (por exemplo, eNOS e PGl2) em uma amostra do indivíduo, em que um aumento no nível de endo- glina solúvel e uma diminuição no nível de pelo menos um polipeptídeo adi- cional quando comparado com uma amostra de referência, padrão ou nível normal é um indicador diagnóstico de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez ou uma propensão para desenvolver um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez.
Em outro aspecto, a invenção se caracteriza por um método de diagnóstico de um indivíduo como tendo ou tendo uma pré-disposição a um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, que inclui medição do nível de um polipeptídeo de endoglina solúvel e um polipeptídeo de sFlt-1 do indiví- duo e cálculo da relação entre os níveis de endoglina solúvel e sFlt-1 usando um sistema métrico endoglina solúvel χ sFlt-1, em que um aumento no sis- tema métrico na amostra do indivíduo com relação a uma amostra de refe- rência normal é um indicador diagnóstico de um distúrbio hipertensivo rela- cionado à gravidez no indivíduo.
Em outro aspecto, a invenção se caracteriza por um método de diagnostico de um indivídüO corno tendo ou tendo uma pré-disposição a um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez que inclui medição dos níveis de sFlt-1 e endoglina solúvel nos primeiro e segundo trimestres em um indi- víduo e cálculo do delta valor de sFlt-1 x endoglina solúvel (sEng) em cada trimestre usando a seguinte equação: dproduto = (sFItl x sEng) no segundo trimestre- (sFItl x sEng) no primeiro trimestre, onde um valor maior do que 0, 1, 2 ou mais, incluindo frações dos mesmos (por exemplo, um valor positivo) é um valor diagnóstico de pré-eclampsia ou eclampsia. Um valor positivo pode também ser um indicador de pré-eclampsia pré-termo. Tal medição pode ser tomada em numerosas ocasiões durante os primeiro e segundo trimestres e o dproduto pode ser acompanhado com o tempo.
Em outro aspecto a invenção se caracteriza por um método de diagnóstico de um indivíduo como tendo uma pré-disposição a um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez que inclui medição dos níveis de sFlt-1 e endoglina solúvel nos primeiro e segundo trimestres em um indivíduo e cál- culo do delta produto para o nível de sFlt-1 (dsFlt-1) ou o nível de sEng (dsEng) entre os primeiro e segundo trimestres, onde um valor maior do que 0, 1, 2 ou mais, incluindo frações dos mesmos (por exemplo, um valor positi- vo) para (dsFlt-1) ou (dsEng) é um indicador diagnóstico de pré-eclampsia ou eclampsia .
Para qualquer um dos métodos diagnósticos da invenção, a me- dição pode incluir o uso de um ensaio imunológico, tal como um ELISA. Em uma modalidade, a amostra de referência normal é uma amostra anterior do indivíduo. Em outra modalidade, o sistema métrico também inclui o índice de massa corporal da mãe ou a idade gestacional do feto. A amostra pode ser um fluido corporal (por exemplo, urina, fluído amniótico, sangue, soro e plasma), célula (por exemplo, uma célula endotelial, um leucócito, um monó- cito e uma célula derivada da placenta) ou um tecido (por exemplo, tecido placental) do indivíduo no qual a endoglina solúvel é normalmente detectá- vel. O indivíduo pode ser uma mulher não-grávida, uma mulher grávida, uma mulher em pós-parto ou um não-humano (por exemplo, vaca, cavalo, ovelha, um porco, uma cabra, um cão ou um gato) e o método pode ser usado para diagnosticar~um distúrbio~hipertensivo relacionado à gravidez ou uma pro- pensão para desenvolver um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez (por exemplo, pelo menos quatro semanas antes do início dos sintomas).
Em ainda um outro aspecto, a invenção se caracteriza por um kit para o diagnóstico de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez em um indivíduo que inclui (i) um agente de ligação à endoglina solúvel e (ii) pelo menos um agente de ligação adicional que se liga a um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo de TGF-βΙ, TGF-P3, eNOS e PGI2 e (iii) instruções para o uso de agente de ligação de (i) e de pelo menos um agen- te de ligação de (ii) para o diagnóstico de um distúrbio hipertensivo relacio- nado à gravidez ou uma propensão para desenvolver um distúrbio hiperten- sivo relacionado à gravidez. Os agentes de ligação podem ser um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmos que se liga especifica- mente à endoglina solúvel ou anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente ao TGF-βΊ, TGF-p3, eNOS ou PGI2.
Opcionalmente, o kit também pode incluir uma molécula de liga- ção a VEGF, sFlt-1 ou PIGF.
Em outro aspecto, a invenção se caracteriza por um método de identificação de um composto que alivia um distúrbio hipertensivo relaciona- do à gravidez, que inclui as seguintes etapas:
(a) contato de uma célula com um composto de endoglina solú- vel;
(b) determinação do estado de fosforilação de Thr495 de eNOS na célula após contato com o composto de endoglina solúvel;
(c) contato da célula com um composto candidato;
(d) determinação do estado de fosforilação de Thr495 de eNOS na célula após contato da célula com o composto candidato; e
(e) comparação do estado de fosforilação determinado na etapa (b) e etapa (d), em que um aumento na desfosforilação de Thr 495 de eNOS na etapa (d) quando comparado com a etapa (b) identifica o composto can- didato como um composto que alivia um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez.
Em ainda~outro aspecto, a invenção se caracteriza por um méto- do de identificação de um composto que alivia um distúrbio hipertensivo re- lacionado à gravidez, que inclui as seguintes etapas:
(a) contato de uma célula com uma estrutura repórter Smad2/3 dependente e um composto de endoglina solúvel;
(b) determinação do nível de ativação da estrutura repórter Smad2/3 na célu- la da etapa (a);
(c) contato da célula da etapa (a) com um composto candidato;
(d) determinação do nível de ativação da estrutura repórter
Smad2/3 na célula da etapa (c); e
(e) comparação do nível de ativação da estrutura repórter
Smad2/3 determinado na etapa (b) e na etapa (d),
em que um aumento no nível de ativação da estrutura repórter Smad2/3 na etapa (d) quando comparado com a etapa (b) identifica o com- posto candidato como um composto que alivia um distúrbio hipertensivo re- lacionado à gravidez.
Para qualquer um dos aspectos acima, o distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez pode ser pré-eclampsia, eclampsia, hipertensão ges- tacional, hipertensão crônica, síndrome HELLP e gravidez com um bebê SGA. Em uma modalidade, o distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez é pré-eclampsia ou eclampsia .
Conforme descrito abaixo, descobriu-se que desregulação das vias de sinalização de 2/TGF-p e sFlt-1/VEGF/PIGF podem atuar juntas para a patologia do distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez. Portanto, a in- venção também se caracteriza por combinações dos métodos descritos aqui com qualquer um dos métodos terapêuticos, diagnósticos ou de monitora- mento descritos nas Publicações de Pedido de Patente U.S. Números 20040126828, 20050025762, 20050170444, 2006/0067937 e 20070104707 e Publicações PCT Números WO 2004/008946, WO 2005/077007 e WO 06/034507.
Para fins da presente invenção, as seguintes abreviações e ter- mos são definidos abaixo.
Por "alteração" entenda-se uma mudança (aumento ou diminui- ção). Uma alteração pode incluir uma mudança nos níveis de expressão de um gene ou polipeptídeo conforme detectado através de métodos conheci- dos padrões, tais como aqueles descritos abaixo. Conforme usado aqui, uma alteração inclui uma mudança de 10% nos níveis de expressão, de preferên- cia uma mudança de 25%, mais preferivelmente uma mudança de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais nos níveis de expressão. "Alteração" também pode indicar uma mudança (aumento ou diminuição) na atividade biológica de qualquer um dos polipeptídeos da invenção (por exemplo, en- doglina solúvel, sFlt-1, VEGF, PIGF, eNOS ou um membro da família TGFP). Conforme usado aqui, uma alteração inclui uma mudança de 10% na ativi- dade biológica, de preferência, uma mudança de 25%, mais preferivelmente, uma mudança de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais na atividade biológica. Exemplos de atividade biológica para a endoglina solúvel são an- giogênese e ligação a substratos tais como activina-A, BMP 2, BMP-7, TGF- β1 e TGF-P3. A atividade biológica da endoglina solúvel pode ser medida através de ensaios de ligação a ligante, imunoensaios e ensaios de angio- gênese que são padrões na técnica ou são descritos aqui. Um exemplo de tal ensaio é o ensaio de formação de tubo endotelial em matrigel no qual antagonismo da sinalização à endoglina levou a uma perda massiva de for- mação de capilar (Li e colaboradores, Faseb Journal 14: 55-64 (2000)). E- xemplos de atividade biológica para eNOS são conhecidos na técnica e in- cluem catálise da formação de óxido nítrico ou "NO" a partir de oxigênio e arginina. Exemplos de atividade biológica para o TGF-β incluem regulação de crescimento, diferenciação, motilidade, remodelamento tecidual, neuro- gênese, reparo de ferimentos, apoptose e angiogênese em muitos tipos de célula. Tais atividades podem ser medidas através de ensaios conhecidos na técnica ou descritos aqui. O TGF-β também inibe a proliferação em mui- tos tipos de células e pode estimular a síntese de proteínas da matriz. Ou- tros exemplos de atividade biológica para o PIGF ou VEGF incluem ligação a receptores conforme medido através de imunoensaios, ensaios de ligação a ligante ou análise de plotagem de Scatchard e indução de proliferação ou migração celular, conforme medido através de rotulação com BrdU, experi- mentos de contagem de células ou ensaios quantitativos para síntese de DNA, tal como incorporação de 3H-timidina. Exemplos de atividade biológica para o sFlt-1 incluem ligação ao PIGF e VEGF1 conforme medido através de imunoensaios, ensaios de ligação a Iigante ou análise de plotagem de Scat- chard. Exemplos adicionais de ensaios para atividade biológica para cada um dos polipeptídeos são descritos aqui.
Por "oligômero de nucleobase anti-senso" entenda-se um oligô- mero de nucleobase, a despeito do comprimento, que é complementar à fita de codificação ou mRNA de um gene de endoglina. Por "um oligômero de nucleobase" entenda-se um composto que inclui uma cadeia de pelo menos oito nucleobases, de preferência, pelo menos doze nucleobases e, mais pre- ferivelmente, pelo menos dezesseis bases unidas juntas por grupos de liga- ção. Incluídos nesta definição estão oligonucleotídeos naturais e não natu- rais modificados e não modificados bem como miméticos de oligonucleotí- deo, tais como ácidos nucleicos de proteína, ácidos nucleicos bloqueados e ácidos arabinonucleicos. Numerosas nucleobases e grupos de ligação po- dem ser empregados nos oligômeros de nucleobase da invenção, incluindo aqueles descritos nas Publicações de Patente U.S. N9S 20030114412 (veja, por exemplo parágrafos 27-45 da publicação) e 20030114407 (veja, por e- xemplo parágrafos 35-52 da publicação), incorporadas aqui por referência. O oligômero de nucleobase anti-senso pode também ser objetivado aos locais de início e término de tradução. De preferência, o oligômero de nucleobase anti-senso compreende de cerca de 8 a cerca de 30 nucleotídeos. O oligô- mero de nucleobase anti-senso pode também conter pelo menos 40, 60, 85, 120 ou mais nucleotídeos consecutivos que são complementares ao mRNA ou DNA de endoglina e podem ser tão longos quanto o mRNA ou gene de comprimento total.
Por "ligação" entenda-se uma interação covalente ou não cova- lente, de preferência, não covalente, que mantém duas moléculas juntas. Por exemplo, duas de tais moléculas poderia ser um ligante e seu receptor, uma enzima e um inibidor dessa enzima, uma enzima e seu substrato ou um anticorpo e um antígenorInterações não-covalentes incluem, mas não estão limitadas a, ligação de hidrogênio, interações iônicas entre grupos carrega- dos interações de van der Waals e interações hidrofóbicas entre grupos não polares. Uma ou mais dessas interações podem mediar a ligação de duas moléculas uma à outra. A ligação pode exibir propriedades discriminatórias, tais como especificidade ou seletividade.
Por "índice de massa corporal" entenda-se um número, derivado usando medições da altura e do peso, que proporciona uma indicação geral se o peso cai ou não dentro de uma faixa saudável. A fórmula geralmente usada para determinar o índice de massa corporal de uma pessoa em quilo- gramas dividido pela altura da pessoa em metros quadrados ou o peso (kg)/ (altura (m))2.
Por "composto" entenda-se um composto químico de pequena molécula (peptidila ou não peptidila) anticorpo, molécula de ácido nucleico, polipeptídeo ou fragmentos dos mesmos. Compostos particularmente úteis para os métodos terapêuticos da invenção podem alterar, de preferência, diminuir os níveis ou atividade biológica de endoglina solúvel em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais.
Por "anticorpo quimérico" entenda-se um polipeptídeo compre- endendo pelo menos a porção de ligação a antígeno de uma molécula de anticorpo ligada a pelo menos parte de outra proteína (tipicamente um domí- nio constante de imunoglobulina).
Por "RNA fita dupla (dsRNA)" entenda-se uma molécula de áci- do ribonucléico compreendida de uma fita senso e uma anti-senso. dsRNAs são, tipicamente, usados para mediar a interferência de RNA.
Por "endoglina" ou "ENG", também conhecida como CD105, en- tenda-se um fator de crescimento de mamífero que tem atividade biológica de endoglina (veja, Fonsatti e colaboradores, Oncogene 22: 6557-6563, 2003; Fonsatti e colaboradores, Curr. Câncer Drug Targets 3: 427-432, 2003; e Cheifetz e colaboradores, J. Bioi Chem. 267: 19027-19030 (1992)) e seus homólogos à proteína definida por qualquer um dos seguintes números de acesso ao GenBank: AAH29080 e NP_031958 (camundongo); AAS67893 (rato); NP_000109, P17813, VSP_004233, CAA80673 (porco); e CAA50891 e AAC63386 (humana) ou descrito no U.S.P.N. 6.562.957. A endoglina é uma glicoproteína da membrana homodimérica a qual é expressa em altos níveis em células endoteliais vasculares em proliferação e nos sincitiotrofo- blastos de placentas. Existem duas isoformas de endoglina, L e S, as quais diferem quanto às suas caudas citoplásmicas em 47 aminoácidos. Ambas as isoformas estão incluídas no termo endoglina conforme usado aqui. A endo- glina se liga a membros da família TGF-β e, na presença de t e, na presença de TGF-β, a endoglina pode se associar aos receptores de sinalização a TGF-β Rl e Rll e potencializar a resposta aos fatores de crescimento. Ativi- dades biológicas de endoglina incluem ligação a substratos, tais como mem- bros da família TGF-β, tais como activina-A, BMP 2, BMP-7, TGF-βΙ e TGF- β3; indução de angiogênese, regulação de proliferação, fixação, migração e invasão celular; e ativação de células endoteliais. Ensaios para as atividades biológicas de endoglina são conhecidos na técnica e incluem ensaios de Ii- gação a Iigante ou análise de plotagem de Scatchard; rotulação com BrdU, experimentos de contagem celular ou ensaios quantitativos para a síntese de DNA, tal como incorporação de 3FMimidina usado para medir a prolifera- ção celular; e ensaios de angiogênese, tais como aqueles descritos aqui ou em McCarty e colaboradores, Intl. J. Oncol. 21: 5-10, 2002; Akhtar e colabo- radores Clin. Chem. 49: 32-40, 2003; e Yamashita e colaboradores, J. Biol. Chem. 269: 1995-2001, 1994).
Por "polipeptídeo de endoglina solúvel" ou "sEng" entenda-se qualquer forma não ligada à membrana, em circulação de endoglina a qual inclui pelo menos uma parte da porção extracelular da proteína endoglina e é substancialmente idêntica (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) à seqüência de aminoácido que codifica a porção extracelular endoglina (veja figuras 1 e 2B). Endoglina solúvel pode resultar da clivagem da forma de endoglina ligada à membrana por uma enzima pro- teolítica. Um sítio de clivagem potencial é no aminoácido 437 da endoglina humana que produz um polipeptídeo de endoglina solúvel que inclui os ami- noácidos 1-437 do polipeptídeo de endoglina, incluindo a seqüência do pep- tídeo líder a qual é, tipicamenterclivada no~ER"(veja figuras 3A e 3B) ou uma proteína que é substancialmente idêntica aos aminoácidos 1-437 do polipep- tídeo de endoglina. Formas adicionais de endoglina solúvel consideradas pela invenção incluem uma proteína substancialmente idêntica aos aminoá- cidos 40 (glicina) a 406 arginina da endoglina humana mostrada na figura 30B, substancialmente idêntica aos aminoácidos 1 a 587 da endoglina hu- mana (o domínio extracelular todo, incluindo a seqüência do polipeptídeo líder, comercialmente disponível da R&D Systems, número de catálogo 1097-EN), substancialmente idêntica aos aminoácidos 40 a 587 da endogli- na humana mostrada na figura 30B (esse é o domínio extracelular todo com a seqüência do peptídeo líder excluída), qualquer polipeptídeo que inclui os peptídeos identificados em negrito e sublinhados na figura 30B e qualquer polipeptídeo que inclui as regiões ou domínios da endoglina solúvel que são requeridos para ligação ao TGF-β ou receptores de TGF-β. Deverá ser nota- do que a numeração da endoglina e da endoglina solúvel depende se a se- quência do peptídeo líder está incluída ou não. A numeração da endoglina mostrada na figura 30B começa no aminoácido 26 (onde a seqüência do peptídeo líder ausente seria os aminoácidos 1-25). A endoglina solúvel tam- bém pode incluir produtos da degradação em circulação ou fragmentos que resultam de clivagem enzimática de endoglina e que mantém atividade bio- lógica de endoglina. Polipeptídeos de endoglina solúvel preferidos têm ativi- dade biológica de endoglina solúvel, tal como ligação a substratos tais como membros da família TGF-β ou receptores de TGF-β, inibição da atividade biológica de membros da família TGF-β ou reversão ou inibição de angiogê- nese em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. Exemplos de ensaios para medição dessas atividades são conhecidos na técnica e descritos nas Publicações de Pedido de Patente U.S. NQs 20060067937, 20050267021 e 20070104707 e Publicação PCT Nq WO 06/034507, incorporadas aqui por referência. Por exemplo, a atividade bioló- gica do endoglina solúvel pode incluir a capacidade de reverter, reduzir ou inibir a angiogênese induzida por TGF-β ou a capacidade de reverter a ati- vação de Smad 2/3 ou a ativação transcricional dependente de Smad 2/3. "polipeptídeos de endoglina solúvel podem ser isolados de uma variedade de fontes, tais como de tecidos ou células de mamífero (por exemplo, tecido ou células placentais) ou preparados através de métodos sintéticos ou recombi- nantes. O termo endoglina solúvel também abrange modificações no poli- peptídeo, fragmentos, derivados, análogos e variantes do polipeptídeo de endoglina, exemplos dos quais são descritos abaixo.
Por "ácido nucleico de endoglina" entenda-se um ácido nucleico que codifica qualquer uma das proteínas endoglina descritas acima. Por e- xemplo, o gene para a endoglina humana consiste de 14 éxons, onde o éxon 1 codifica a seqüência do peptídeo sinalizador, os éxons 2-12 codificam o domínio extracelular (inclui o éxon 9a e 9b), o éxon 13 codifica o domínio transmembrana e o éxon 14 codifica o domínio citoplásmico C-terminal (veja figuras 1, 2A e 2B). Desejavelmente, o ácido nucleico de endoglina codifica qualquer um dos polipeptídeos de endoglina solúvel descritos acima ou é substancialmente idêntico (60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) à seqüência de ácido nucleico apresentada na figura 2A. Deverá ser notado que a proteína em circulação é prevista co- mo carecendo da seqüência do peptídeo líder (aminoácidos 1-25).
Por "epítopo" entenda-se uma seqüência de aminoácidos a qual, quer como um resultado de estrutura linear ou de conformação tridimensio- nal, forma o sítio de ligação para um anticorpo.
Por "expressão" entenda-se a detecção de um gene ou polipep- tídeo através de métodos padrões conhecidos na técnica. Por exemplo, ex- pressão de polipeptídeo é freqüentemente detectada através de Western blotting, expressão de DNA é freqüentemente detectada através de Southern blotting ou reação em cadeia de polimerase (PCR) e expressão de RNA é freqüentemente detectada através de Northern blotting, PCR ou ensaios de proteção com RNAse. Métodos para medir os níveis de expressão de proteí- na geralmente incluem, mas não estão limitados a: Western blotting, imunob- lot, ensaio imuno-absorvente enzima-ligado (ELISA), radioimunoensaio (Rl- A), imunoprecipitação, ressonância de plasmônio em superfície, quimiolumi- nescência, polarização fluorescente, fosforescência, análise imunohistoquí- mica, espectrometria de massa por desabsorção a laser matriz- assistida/time-off-fiight de ionização (MALDI-TOF) microcitometria, microar- ranjo, microscopia, seleção de células ativada por fluorescência (FACS) e citometria de fluxo, bem como ensaios baseados em uma propriedade da proteína incluindo, mas não limitado a, atividade enzimática ou interação com outros parceiros de proteína. Ensaios exemplificativos são descritos em detalhes na Publicação de Pedido de Patente U.S. N9 2006/0067937 e Pu- blicação PCT N- WO 06/034507. Qualquer composto que diminui os níveis de endoglina solúvel em pelo menos 10%, 20%, de preferência 30%, mais preferivelmente pelo menos 40% ou 50% e, ainda mais preferivelmente pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou mais é considerado um composto terapêuti- co da invenção.
Por "fragmento" entenda-se uma porção de um polipeptídeo ou uma molécula de ácido nucleico. Essa porção contém, de preferência, pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% do comprimen- to todo da molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo de referência. Um fragmento pode conter 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 1750, 1800 ou mais nucleo- tídeos ou 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 640 aminoácido ou mais. Fragmentos exemplificati- vos da endoglina solúvel incluem de 1 a 437 aminoácidos (incluindo a se- qüência do peptídeo líder), 26 a 437 aminoácidos (excluindo a seqüência líder), de 40 a 406 aminoácidos ou de 1 a 587 aminoácidos e de 1 a 1311, 10 a 1311, 80 a 1030 ou 1 a 1761 nucleotídeos.
Por "idade gestacional" entenda-se uma referência à idade do feto, contando a partir do primeiro dia do último período menstrual da mãe, usualmente referido em semanas.
Por "hipertensão gestacional" entenda-se o desenvolvimento de pressão sangüínea elevada sem proteinúria após 20 semanas de gravidez.
Por "uma história de pré-eclampsia ou eclampsia " entenda-se um diagnóstico prévio de pré-eclampsia ou eclampsia ou hipertensão induzi- da por gravidez no indivíduo em si ou em um membro da família relacionado.
Por "homólogo" entenda-se qualquer seqüência de gene ou pro- teína que traz pelo menos 30% de homologia, mais preferivelmente, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% e, mais preferivelmente 90% ou mais de homologia a uma seqüência de gene ou proteína conhecida sobre o comprimento da se- qüência de comparação. Uma proteína "homóloga" pode também ter pelo menos uma atividade biológica da proteína de comparação. Em geral, para proteínas, o comprimento de seqüências de comparação será de pelo me- nos 10 aminoácidos, de preferência 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 437 ou pelo menos 587 amino- ácidos ou mais. Para ácidos nucleicos, o comprimento de seqüências de comparação geralmente será de pelo menos 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1311 ou pelo menos 1761 nucleotídeos ou mais. "Homologia" também pode se referir a uma similaridade substancial entre um epítopo usado para gerar anticorpos e a proteína ou fragmento dos mesmos aos quais os anti- corpos são dirigidos. Nesse caso, homologia se refere a uma similaridade suficiente para estimular a produção de anticorpos que podem reconhecer especificamente a proteína em questão.
Por "anticorpo humanizado" entenda-se uma variante de se- qüência de imunoglobulina ou fragmento da mesma que é capaz de ligação a um antígeno predeterminado. Comumente, o anticorpo conterá a cadeia leve, bem como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo pode também incluir as regiões CH1, de dobradiça, CH2, CH3 ou CH4 da cadeia pesada. O anticorpo humanizado compreende uma região de estrutura tendo substancialmente a seqüência de aminoácido de uma imu- noglobulina humana e uma região de determinação de complementaridade (CDR) tendo substancialmente a seqüência de aminoácido de uma imuno- globulina não-humana (as seqüências "importadas").
Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo a partir de uma fonte que é não- humana. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis ( Fab, Fab', F(ab')2, Fabcj Fv) no qual todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado compreende- rá, otimamente, pelo menos uma porção de uma região constante de imuno- globulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Por "re- gião de determinação de complementaridade (CDR)" entenda-se as três se- qüências hiper-variáveis nas regiões variáveis dentro de cada uma das ca- deias leve e pesada de imunoglobulina. Por "região de estrutura" entenda-se as seqüências de aminoácido localizadas sobre qualquer lado das três se- quências hiper-variáveis (CDR) das cadeias leve e pesada de imunoglobulina.
As regiões FR e CDR do anticorpo humanizado não precisam corresponder precisamente às seqüências precursoras, por exemplo, a CDR ou a FR de consenso importada pode sofrer mutação através de substitui- ção, inserção ou deleção de pelo menos um resíduo, de modo que o resíduo da CDR ou FR nesse sítio não corresponde ao mesmo no anticorpo de con- senso ou importado. Tais mutações, contudo, ao serão extensivas. Usual- mente, pelo menos 75%, de preferência 90% e, mais preferivelmente, pelo menos 95% dos resíduos no anticorpo humanizado corresponderão àqueles das seqüências de FR e CDR precursoras.
Por "hibridizar" entenda-se emparelhamento para formar uma molécula fita dupla entre seqüências de polinucleotídeo complementares ou porções das mesmas sob as várias condições de estringência. (veja, por exemplo, Wahl e Berger Methods Enzymol. 152: 399, 1987; Kimmel, Me- thods Enzymol. 152: 507, 1987). Por exemplo, uma concentração de sal es- tringente comumente será NaCI a menos do que cerca de 750 mM e citrato trissódico a 75 mM, de preferência NaCI a menos do que cerca de 550 mM e citrato trissódico a 50 mM e, mais preferivelmente NaCI a menos do que cer- ca de 250 mM e citrato trissódico a 25 mM. Hibridização de baixa estringên- cia pode ser obtida na ausência de solvente orgânico, por exemplo, forma- mida, enquanto que hibridização de alta estringência pode ser obtida na pre- sença de formamida a pelo menos cerca de 35% e, mais preferivelmente, formamida a pelo menos cerca de 50%. Condições de temperatura estrin- gente comumente incluirão temperaturas de pelo menos cerca 30 °C, mais preferivelmente de pelo menos cerca de 37°C e, ainda mais preferivelmen- te, de pelo menos cerca de 42°C. Variação de parâmetros adicionais, tais como tempo de hibridização, a concentração de detergente, por exemplo, dodecil sulfato de sódio (SDS) e a inclusão ou a exclusão de DNA veículo, são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Vários níveis de estringência são obtidos combinando essas várias condições conforme ne- cessário. Em uma modalidade preferida, hibridização ocorrerá a 30°C em NaCl a 750 mM, citrato trissódico a 75 mM e SDS a 1%. Em uma modalida- de mais preferida, hibridização ocorrerá a 37°C em NaCI a 500 mM, citrato trissódico a 50 mM, SDS a 1%, formamida a 35% e 100 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado (ssDNA). Em uma modalidade ainda mais preferida, hibridização ocorrerá a 42°C em NaCl a 250 mM, citrato trissódico a 25 mM, SDS a 1%, formamida a 50% e 200 μg/ml de ssDNA. Variações úteis dessas condições serão prontamente evidentes pára aqueles habilita- dos na técnica.
Para a maioria das aplicações, etapas de lavagem que seguem à hibridização também variarão quanto à estringência. Condições de estrin- gência para lavagem podem ser definidas pela concentração de sal e pela temperatura. Conforme acima, a estringência de lavagem pode ser aumen- tada diminuindo a concentração de sal ou aumentando a temperatura. Por exemplo, uma concentração de sal estringente para as etapas de lavagem será, de preferência, NaCl a menos do que cerca de 30 mM e citrato trissó- dico a 3 mM e, mais preferivelmente, NaCl a menos do que cerca de 15 mM e citrato trissódico a 1,5 mM. Condições de temperatura estringentes para as etapas de lavagem comumente incluirão uma temperatura de pelo menos cerca de 25°C, mais preferivelmente de pelo menos cerca de 42°C e, ainda mais preferivelmente, de pelo menos 68°C. Em uma modalidade preferida, as etapas de lavagem ocorrerão a 25°C em NaCl a 30 mM, citrato trissódico a 3 mM e SDS a 0,1%. Em uma modalidade mais preferida, as etapas de lavagem ocorrerão-a 42°C em NaCI a 15 mM; citrato trissódico a 1,5 mM e SDS a 0,1%. Em um modalidade ainda mais preferida, as etapas de lava- gem ocorrerão a 68 °C em NaCl a 15 mM, citrato trissódico a 1,5 mM e SDS a 0,1%. Variações adicionais dessas condições serão prontamente eviden- tes para aqueles habilitados na técnica. Métodos de hibridização são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e são descritos, por exemplo, em Benton e Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein e Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72: 3961, 1975); Ausubel e colaboradores (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger e Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); e Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Por "retardo de crescimento intra-uterino (IUGR)" entenda-se uma síndrome que resulta em um peso ao nascer o qual é menos do que 10 por cento do peso fetal previsto para a idade gestacional do feto. O critério atual da Organização Mundial de Saúde para baixo peso ao nascer é um peso de menos de 2.500 gm (5 libras ou 8 oz.) ou abaixo do 10- percentil para a idade gestacional de acordo com as tabelas Norte Americanas de peso ao nascer para a idade gestacional por raça, paridade e sexo do bebê (Zhang e Bowes, Obstet. Gynecol. 86: 200-208, 1995). Esses bebês com baixo peso ao nascer são também referidos como "pequenos para idade gestacional (SGA)". Pré-eclampsia é uma condição conhecida por estar as- sociada ao IUGR ou SGA.
Por "sistema métrico" entenda-se uma medida. Um sistema mé- trico pode ser usado, por exemplo, para comparar os níveis de um polipeptí- deo ou molécula de ácido nucleico de interesse. Sistemas métricos exempli- ficativos, mas não estão limitados a, fórmulas matemáticas ou algoritmos, tais como proporções. O sistema métrico a ser usado é aquele o qual discri- mina melhor entre os níveis de endoglina solúvel, sFlt-1, VEGF, PIGF ou qualquer combinação dos mesmos, em um indivíduo tendo distúrbio hiper- tensivo relacionado à gravidez, tal como pré-eclampsia ou eclampsia e um indivíduo de controle normal. Dependendo do sistema métrico que é usado, o indicador diagnóstico de distúrbio hipertensivo relacionado à~gravidez pode estar significativamente acima ou abaixo de um valor de referência (por e- xemplo, de um indivíduo de controle não tendo um distúrbio hipertensivo re- lacionado à gravidez). O nível de endoglina solúvel é determinado medindo a quantidade de endoglina solúvel livre, ligada (isto é, ligado a um fator de crescimento) ou total (livre + ligada). O nível de sFlt-1 é medido através de medição da quantidade de sFlt-1 livre, ligado, (isto é, ligado a um fator de crescimento) ou total (livre + ligado). Os níveis de VEGF ou PIGF são deter- minados através de medição da quantidade de PIGF livre ou VEGF livre (isto é, não ligado ao sFlt-1). Um sistema métrico exemplificativo é sFlt-1/(VEGF + PIGF), também referido como o índice anti-angiogênico pré-eclampsia (PAAI). Outro exemplo é o seguinte índice anti-angiogênico de endoglina solúvel: (sFlt-1 + 0.25(polipeptídeo de endoglina solúvel))/PIGF. Ainda outro sistema métrico exemplificativo é o seguinte: (endoglina solúvel + sFlt- 1)/PIGF. Um aumento no valor de qualquer um desses dois sistemas métri- cos exemplificativos quando comparado com uma referência normal é um indicador diagnóstico de pré-eclampsia ou eclampsia. Outro exemplo inclui a medição dos níveis de sFlt-1 e endoglina solúvel nos primeiro e segundo trimestres em um indivíduo e cálculo do delta valor de sFIt1 χ endoglina so- lúvel (sEng) em cada trimestre usando a seguinte equação: dproduto = (s- Flt1 χ sEng) no segundo trimestre- (sFIt1 χ sEng) no primeiro trimestre, onde um valor maior do que 0, 1, 2 ou mais (por exemplo, um valor positivo) é um indicador dia de pré-eclampsia ou eclampsia . Sistemas métricos adicionais incluem o dproduto do nível de sFlt-1 (dsFlt-1) e do nível de sEng (dsEng) entre os primeiro e segundo trimestres, onde um valor maior do que 0, 1, 2 ou mais (por exemplo, um valor positivo) para (dsFlt-1) ou (dsEng) é um in- dicador diagnóstico de pré-eclampsia ou eclampsia.
Qualquer um dos sistemas métricos da invenção pode ainda in- cluir o BMI da mãe ou idade gestacional do bebê ou paridade. Qualquer um dos sistemas métricos também pode incluir os níveis de eNOS, TGF-β1 ou β3 ou PGI2 também.
Por "sintase de óxido nítrico" ou "NOS" entenda-se uma enzima que catalisa a formação de óxido nítrico (NO) a partir de oxigênio e arginina. NOS é uma enzima complexa contendo vários co-fatores, um grupo heme o qual é parte do sítio catalítico, um domínio de oxigenase N-terminal o qual pertence à classe de proteínas de haem-tiolato e um domínio de reductase C-terminal o qual é homólogo à reductase NADPH: P450. NOS produz NO através de catálise de uma oxidação de cinco elétrons de um nitrogênio de guanidino de L-arginina (L-Arg). A oxidação de L-Arg em L-citrulina ocorre via duas reações de mono-oxigenação sucessivas que produzem N-hidróxi- L-arginina como um intermediário. O ligante interdomínio entre os domínios de oxigenase e reductase contém uma seqüência de ligação-CaM. NO fun- ciona em baixas concentrações como um sinal em muitos processos fisioló- gicos, tais como controle de pressão sangüínea, neurotransmissão, aprendi- zado e memória e, em altas concentrações, como uma citotoxina defensiva.
Em mamíferos, três genes distintos codificam isozimas NOS: neuronal (nNOS ou NOS-1), citocina-induzível (iNOS ou NOS-2) e endotelial (eNOS ou NOS-3). eNOS é membrana-associado e a localização de eNOS nas membranas endoteliais é mediada através de miristoilação N-terminal co-traducional e palmitoilação pós-traducional. Em modalidades preferidas da invenção, o NOS é eNOS.
Por "índice anti-angiogênico pré-eclampsia (PAAI)" entenda-se a proporção de sFlt-1/VEGF + PIGF usada como um indicador de atividade anti-angiogênica. Um PAAI maior do que 10, mais preferivelmente maior do que 20, é indicativo de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, tal como pré-eclampsia ou eclampsia.
Por "índice anti-angiogênico de endoglina solúvel" entenda-se a proporção de (sFlt-1 + 0.25 endoglina solúvel)/PIGF. Por exemplo, um valor de 75 ou maior, de preferência 100 ou maior ou, mais preferivelmente, 200 ou maior é indicativo de uma complicação da gravidez associada à hiperten- são, tal como pré-eclampsia ou eclampsia.
Por "operavelmente ligado" entenda-se que um gene e uma se- quência regulatória são conectados de uma forma tal a permitir expressão do gene quando as moléculas apropriadas (por exemplo, proteínas ativado- ras de transcrição) são ligados à(s) sequência(s) regulatória(s). Por "veículo farmaceuticamente aceitável" entenda-se um veícu- lo que é fisiologicamente aceitável para o mamífero tratado ao mesmo tempo em que retém as propriedades terapêuticas do composto com o qual ele é administrado. Uma substância veículo farmaceuticamente aceitável exempli- ficativa é solução salina fisiológica. Outros veículos fisiologicamente aceitá- veis e suas formulações são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, (20- edi- ção), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Filadélfia, PA.
Por "fator de crescimento placental (PIGF)" entenda-se um fator de crescimento de mamífero que é homólogo à proteína definida pelo núme- ro de acesso ao GenBank P49763 e que tem atividade biológica de PIGF. PIGF é um homodímero glicosilado que pertence à família VEGF e pode ser encontrado em duas isoformas distintas através de mecanismos de união alternativa. O PIGF é expresso por cito- e sincitiotrofoblastos na placenta e atividades biológicas do PIGF incluem indução de proliferação, migração e ativação de células endoteliais, particularmente células de trofoblasto.
Por "polimorfismo" entenda-se uma variação genética, mutação, deleção ou adição em uma molécula de ácido nucleico de endoglina solúvel, sFlt-1, PIGF ou VEGF que é indicativa de uma predisposição a desenvolver pré-eclampsia ou eclampsia. Tais polimorfismos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e são descritos, por exemplo, por Raab e colaborado- res (Biochem. J. 339: 579-588, 1999) e Parry e colaboradores (Eur. J Immu- nogenet. 26: 321-323, 1999). Um polimorfismo pode estar presente na se- qüência promotora, uma rede de leitura aberta, seqüência intrônica ou região 3' não traduzida de um gene. Exemplos conhecidos de tais polimorfismos no gene da endoglina incluem uma inserção de 6 bases de GGGGGA no íntron 7 a 26 bases além da extremidade 3' do éxon 7 {Ann. Neuro!. 41: 683-6, 1997).
Por "distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez" entenda-se qualquer condição ou doença ou gravidez que está associada a ou caracte- rizada por um aumento na pressão sangüínea. Incluídas dentre essas condi- "ções estão pré-eclampsia (incluindo pré-eclampsia prematura, pré-eclampsia grave), eclampsia, hipertensão gestacional, síndrome HELLP (hemólise, en- zimas elevadas no fígado, baixa contagem de plaquetas), ruptura de placen- ta, hipertensão crônica, gravidez com restrição de crescimento uterino e gra- videz com um bebê pequeno para a idade gestacional (SGA). Deve ser no- tado que, embora gravidez com um bebê SGA não esteja freqüentemente associada à hipertensão, ela está incluída nessa definição.
Por "pré-eclampsia" entenda-se o distúrbio multi-sistema que é caracterizado por hipertensão com proteinúria ou edema ou ambos, disfun- ção glomerular, edema cerebral, edema hepático ou anormalidades de coa- gulação em virtude da gravidez ou a influência de uma gravidez recente. To- das as formas de pré-eclampsia, tais como pré-eclampsia prematura, bran- da, moderada e grave, são incluídas nessa definição. Pré-eclampsia geral- mente ocorre após a 20ã semana de gestação. A pré-eclampsia é em geral definida como alguma combinação dos seguintes sintomas: (1) uma pressão sangüínea sistólica (BP) > 140 mmHg e uma BP diastólica > 90 mmHg após 20 semanas de gestação (geralmente medida em duas ocasiões, 4-168 ho- ras de distância), (2) novo início de proteinúria (1+ através da tira medidora quando de urinálise, >300 mg de proteína em uma coleta de urina de 24 ho- ras ou uma única amostra de urina aleatória tendo uma proporção de proteí- na/creatinina > 0,3) e (3) resolução de hipertensão e proteinúria em 12 se- manas pós-parto. A pré-eclampsia grave é geralmente definida como: (1) uma BP diastólica >110 mmHg (geralmente medida em duas ocasiões, 4- 168 horas de distância) ou (2) proteinúria caracterizada por uma medição de 3,5 gramas ou mais de proteína em uma coleta de urina de 24 horas ou duas amostras de urina aleatórias com pelo menos 3+ proteína através da tira medidora. Em pré-eclampsia, hipertensão e proteinúria geralmente ocorrem dentro de sete dias um do outro. Em pré-eclampsia grave, hipertensão gra- ve, proteinúria grave e síndrome HELLP (hemólise, enzimas elevadas no fígado, baixa contagem de plaquetas) ou eclampsia podem ocorrer simulta- neamente ou apenas um sintoma de cada vez. A síndrome HELLP é carac- terizada por evidência de trombocitopenia (<100000 células/μΙ), LDH aumen- tado (>600 IU/L) e AST aumentado (> 70 IU/L). Ocasionalmente, pré- eclampsia pode levar ao desenvolvimento de ataques. Essa forma grave da síndrome é referida como "eclampsia". A eclampsia pode também incluir dis- função ou dano a vários órgãos ou tecidos, tais como o fígado (por exemplo, dano hepatocelular, necrose periportal) e o sistema nervoso central (por e- xemplo, edema cerebral e hemorragia cerebral). Acredita-se que etiologia dos ataques seja secundária ao desenvolvimento de edema cerebral e es- pasmo focai de pequenos vasos sangüíneos no rim.
Por "pré-eclampsia prematura" entenda-se pré-eclampsia com início de sintomas < 37 semanas ou <34 semanas.
Por "prostaciclina" ou PGI2" entenda-se um membro da família de moléculas iipídicas conhecida como eicosanóides. Ela é produzida em células endoteliais a partir de prostaglandina H2 (PGH2) através da ação da enzima sintase de prostaciclina e é sintetizada principalmente pelo endotélio vascular e músculo liso. Atividade biológica de PGI2 inclui inibição de agre- gação plaquetária, relaxamento de músculo liso, redução de resistência vas- cular pulmonar e sistêmica através de vasodilatação direta e natriurese no rim.
Por "proteína" ou "polipeptídeo" ou "fragmento de polipeptídeo" entenda-se qualquer cadeia de mais de dois aminoácidos, a despeito de modificação pós-traducional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação), que constitui todo ou parte de um polipeptídeo ou peptídeo que ocorre natural- mente ou constitui um polipeptídeo ou peptídeo que não ocorre naturalmen- te.
Por "amostra de referência" entenda-se qualquer amostra, pa- drão ou nível que é usado para fins de comparação. Uma "amostra de refe- rência normal" pode ser uma amostra anterior tomada do mesmo indivíduo, uma amostra de uma mulher grávida não tendo um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, tal como pré-eclampsia ou eclampsia, uma mulher que está grávida mas a amostra foi tomada no início de gravidez (por exem- pio, nos primeiro ou segundo trimestres ou antes da detecção de um distúr- bio hipertensivo relacionado à gravidez, tal como eclampsia ou pré- eclampsia), uma mulher que está grávida e não tem história de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, tal como pré-eclampsia ou eclampsia, uma mulher que não está grávida, uma amostra de um polipeptídeo de refe- rência purificado em uma concentração normal conhecida (isto é, não indica- tiva de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, tal como pré- eclampsia ou eclampsia). Por "padrão ou nível de referência" entenda-se um valor ou número derivado de uma amostra de referência. Um padrão ou nível de referência normal pode ser um valor ou número derivado de um indivíduo normal que é equivalente ao indivíduo de amostra em pelo menos um dos seguintes critérios: idade gestacional do feto, idade materna, pressão san- guínea materna antes de gravidez, pressão sangüínea materna durante gra- videz, BMI da mãe, peso do feto, diagnóstico anterior de pré-eclampsia ou eclampsia e uma história familiar de pré-eclampsia ou eclampsia. Uma a- mostra, padrão ou valor de "referência positiva" é uma amostra ou valor ou número derivado de um indivíduo que se sabe ter um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, tal como pré-eclampsia ou eclampsia, que é equiva- lente ao indivíduo de amostra em pelo menos um dos seguintes critérios: idade gestacional do feto, idade materna, pressão sangüínea materna antes de gravidez, pressão sangüínea materna durante gravidez, BMI da mãe, pe- so do feto, diagnóstico anterior de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez e uma história familiar de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez.
Por "reduz ou inibe" entenda-se a capacidade de causar uma diminuição global, de preferência de 20% ou mais, mais preferivelmente of 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no nível de proteína ou ácido nu- cleico detectado através dos ensaios antes mencionados (veja "expressão"), quando comparado com uma amostra não tratada.
Por "amostra" entenda-se uma biópsia de tecido, célula, fluido corporal (por exemplo, sangue, soro, plasma, urina, saliva, fluido amniótico ou fluido cérebro-espinhal) ou outro espécime obtido de um indivíduo. Dese- javelmente, a amostra biológica inclui moléculas de ácido nucleico ou poli- peptídeos de endoglina solúvel ou ambos.
Por "pequenos RNA's de interferência (siRNAS)" entenda-se uma molécula de dsRNA isolada, de preferência de mais de 10 nucleotídeos (nt) de comprimento, mais preferivelmente de mais de 15 nucleotídeos de comprimento e, ainda mais preferivelmente, de mais de 19 nucleotídeos de comprimento que é usada para identificar o gene alvo ou mRNA a ser de- gradado. Uma faixa de 19-25 nucleotídeos é o tamanho mais desejado para siRNAs. siRNAs podem também incluir RNAs de hairpina curtos, nos quais ambas as fitas de uma dupla de siRNA são incluídas dentro de uma única molécula de RNA. siRNA inclui qualquer forma de dsRNA (produtos proteoli- ticamente clivados de dsRNA maiores, RNA parcialmente purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético, RNA recombinantemente produzido), bem como RNA alterado que difere do RNA que ocorre naturalmente através da adição, deleção, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Tais alterações podem incluir a adição de material de não-nucleotídeo, tal como à(s) extremidade(s) do RNA de 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nt ou in- ternamente (em um ou mais nucleotídeos do RNA). Em uma modalidade preferida, as moléculas de RNA contêm um grupo 3'-hidroxila. Nucleotídeos nas moléculas de RNA da presente invenção também podem compreender nucleotídeos não padrões, incluindo nucleotídeos ou desóxirribonucleotídeos que não ocorrem naturalmente. Coletivamente, todos de tais RNAs alterados são referidos como análogos de RNA. SiRNAs da presente invenção preci- sam apenas ser suficientemente similares ao RNA natural que tem a capaci- dade de mediar a interferência de RNA (RNAi). Conforme usado aqui, RNAi refere-se à clivagem e degradação objetivadas ATP-dependentes de uma molécula de mRNA específica através da introdução de pequenos RNAs de interferência ou dsRNAs em uma célula ou um organismo. Conforme usado aqui, "mediar RNAi" refere-se à capacidade de distinguir ou identificar quais RNAs têm de ser degradados.
Por "molécula de ligação à endoglina solúvel" entenda-se uma proteína ou composto de pequena molécula que se liga, de preferência se liga especificamente, a um polipeptídeo de endoglina solúvel. Uma molécula de ligação à endoglina solúvel pode ser, por exemplo, um anticorpo, peptí- deo anticorpo-relacionado, uma ou mais regiões de CDR de um anticorpo de ligação à endoglina solúvel ou proteína de interação com a endoglina solúvel.
Por "Flt-1 solúvel (sFlt-1)" (também conhecido como sVEGF-R1) entenda-se a forma solúvel do receptor Flt-1 que é homóloga à proteína de- tinida pelo número de acesso ao GenBank U01134 e tem atividade biológica de sFlt-1. A atividade biológica de um polipeptídeo de sFlt-1 pode ser ensai- ada usando qualquer método padrão, por exemplo, através de ensaio da ligação de sFlt-1 ao VEGF. O sFlt-1 carece do domínio transmembrana e do domínio de quínase de tirosina citoplásmica do receptor Flt-1. O sFlt-1 pode se ligar ao VEGF e PIGF com alta afinidade, mas não pode induzir à prolife- ração ou angiogênese e, portanto, é funcionalmente diferente dos receptores Flt-1 e KDR. O sFlt-1 foi inicialmente purificado de células endoteliais umbili- cais humanas e depois mostrado ser produzido por células de trofoblasto in vivo. Conforme usado aqui, sFlt-1 inclui qualquer membro ou isoforma da família sFlt-1. O sFlt-1 também pode significar produtos da degradação ou fragmentos que resultam de clivagem enzimática do receptor Flt-1 e que mantêm atividade biológica de sFlt-1. Em um exemplo, metaloproteinases específicas liberadas da placenta podem clivar o domínio extracelular do receptor Flt-1 para liberar a porção N-terminal do Flt-1 em circulação.
Por "se liga especificamente" entenda-se um composto ou anti- corpo o qual reconhece e se liga a um polipeptídeo da invenção, mas que não reconhece substancialmente e se liga à outras moléculas em uma a- mostra, por exemplo, uma amostra biológica, a qual inclui naturalmente um polipeptídeo da invenção. Em um exemplo, um anticorpo que se liga especi- ficamente à endoglina solúvel não se liga à endoglina ligada à membranas. Em outro exemplo, um anticorpo que se liga especificamente à endoglina solúvel se liga a um epítopo dentro do domínio extracelular da endoglina, particularmente um epítopo dentro dos aminoácidos 26 a 437 (excluindo a seqüência líder peptídica), aminoácidos 40 a 406 da endoglina humana (veja figura 30B) ou aminoácidos 26 a 587 (excluindo a seqüência líder peptídica), que pode ou não ser única à endoglina solúvel (por exemplo, na estrutura tridimensional da endoglina solúvel). ErTroutrcrexempIo, um anticorpo que se liga especificamente à endoglina solúvel reconhece uma ou mais das se- qüências de aminoácido mostradas em negrito e sublinhadas na figura 30B.
Por "indivíduo" entenda-se um mamífero incluindo, mas não limi- tado a, um ser humano ou mamífero não-humano, tal como uma vaca, um cavalo, uma ovelha, um porco, uma cabra, um cão ou um gato. Incluídos nessa definição estão mamíferos grávidos, pós-parto e não-grávidos.
Por "substancialmente idêntica" entenda-se uma seqüência de ácido nucleico ou aminoácido que, quando otimamente alinhada, por exem- plo, usando os métodos descritos abaixo, compartilham pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência com uma segunda seqüência de aminoácido ou ácido nucleico, por exemplo, uma seqüência de endoglina ou endoglina so- lúvel. "Identidade substancial" pode ser usado para se referir a vários tipos e comprimentos de seqüência, tal como a seqüência de comprimento total, epítopos e peptídeos imunogênicos, domínios funcionais, seqüências de co- dificação e/ou regulatórias, éxons, íntrons, promotores e seqüências genô- micas. A identidade percentual entre dois polipeptídeos ou seqüências de ácido nucleico é determinada de várias formas que estão dentro da capaci- dade daqueles habilitados na técnica, por exemplo, usando um software de computador comercialmente disponível, tal como Smith Waterman Alignment (Smith, T. F. e M. S. Waterman (1981) J Mol Bion 47: 195-7); "BestFit" (Smi- th e Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)) quando incorporado no GeneMatcher Plus®, Schwarz e Dayhof (1979) Atlas of Prote- in Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed páginas 353-358; o programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; (Altschul, S. F., W. Gish, e cola- boradores (1990) J Mol Biol 215: 403-10), BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL ou o software Mega- lign (DNASTAR). Além disso, aqueles habilitados na técnica podem determi- nar parâmetros apropriados para medição do alinhamento, incluindo quais- quer algoritmos necessários para obter alinhamento máximo sobre o com- primento das seqüências que estão sendo comparadas. Em geral, para pro- ternas, o comprimento paracom paraçãOde sequê nciasserá de pelo menos 10 aminoácidos, de preferência 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 437 ou pelo menos 587 aminoácidos ou mais. Para ácidos nucleicos, o comprimento para comparação de se- qüências geralmente será de pelo menos 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1311 ou pelo menos 1761 nucleotídeos ou mais. Deve ser entendido que, para fins de determinação da identidade de seqüência quando de compara- ção de uma seqüência de DNA com uma seqüência de RNA, um nucleotídeo timina é equivalente a um nucleotídeo uracila. Substituições conservativas incluem, tipicamente, substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, ala- nina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico, asparagi- na, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tirosina.
Por "sintomas de eclampsia" entenda-se qualquer um dos se- guintes: (1) uma pressão sangüínea sistólica (BP) > 140 mmHg e uma BP diastólica > 90 mmHg após 20 semanas de gestação, (2) novo início de pro- teinúria (1+ através da tira de medição quando de urinálise, > 300 mg de proteína em uma coleta de urina de 24 horas ou proporção aleatória de pro- teína/creatinina na urina > 0,3) e (3) resolução de hipertensão e proteinúria em 12 semanas pós-parto. Os sintomas de pré-eclampsia podem também incluir disfunção renal e endoteliose ou hipertrofia glomerular. Por "sintomas de eclampsia" entenda-se o desenvolvimento de qualquer uma dos seguin- tes sintomas em virtude de gravidez ou da influência de uma gravidez recen- te: ataques, coma, trombocitopenia, edema hepático, edema pulmonar e e- dema cerebral.
Por "fator β de crescimento de transformação (TGF-β)" entenda- se um fator de crescimento de mamífero que tem atividade biológica de TGF-β e é um membro de uma família de polipeptídeos parácrinos estrutu- ralmente relacionados encontrados abundantemente em vertebrados e pro- totípico de uma grande família de fatores de crescimento, diferenciação e morfogênese de metazoários (veja, para revisão, Massaque e colaboradores Ann. Rev. Cell. Biol. 6: 597-641 (1990); Massaque e colaboradores Trends Cell Biol 4: 172-178"(1994); Kingsley Gene Dev. 8: 133-146 (1994); e Sporn e colaboradores J. Cell. Biol. 119: 1017-1021 (1992). Conforme descrito em Kingsley, supra, a superfamília do TGF-β tem pelo menos 25 membros e pode ser agrupada em sub-famílias distintas com seqüências altamente re- lacionadas. As subfamílias mais óbvias incluem as seguintes: a subfamília TGF-β, a qual compreende pelo menos quatro genes que são muito mais similares ao TGF-β1 do que a outros membros da superfamília TGF-β; as proteínas morfogenéticas ósseas; a subfamília da activina, compreendendo homo- ou hetero-dímeros ou duas subunidades, inibina β-Α e inibina β-Β. A subfamília decapentaplégica, a qual inclui os fatores de mamífero BMP2 e BMP4, os quais podem induzir à formação de osso ectópico e cartilagem quando implantados sob a pele ou nos músculos. A subfamília 60A, a qual inclui uma série de homólogos de mamífero, com atividade osteoindutiva, incluindo BMP5-8. Outros membros da superfamília TGF-β incluem o fator 1 de diferenciação a grosso (GDF-1), GDF-3/VGR-2, dorsalina, nodal, subs- tância de inibição de muleriana (MIS) e fator de crescimento neurotrófico glial-derivado (GDNF). Deve ser notado que as subfamílias DPP e 60A estão relacionadas mais intimamente uma à outra do que a outros membros da superfamília TGF-β e freqüentemente têm sido agrupadas juntas como parte de uma maior coleção de moléculas denominadas DVR (dpp- e vg1- relacionadas). A menos que de outro modo evidenciado a partir do contexto no qual ele é usado, o termo TGF-β, conforme usado por toda a presente especificação, será entendido como se referindo, em geral, a membros da superfamília TGF-β, conforme apropriado. (Massague e colaboradores, An- nu. Rev. Biochem. 67: 753-91, 1998; Josso e colaboradores, Curr. Op. Gen. Dev., 7: 371-377, 1997). O TGF-β funciona para regular o crescimento, dife- renciação, motilidade, remodelamento tecidual, neurogênese, reparo de fe- rimentos, apoptose e angiogênese em muitos tipos de células. O TGF-β também inibe a proliferação celular em muitos tipos de células e pode esti- mular a síntese de proteínas da matriz.
Por "quantidade terapêutica" entenda-se uma quantidade que, quando administrada, quer através de administração diretamente ao pacien- te ou através de uma abordagem ex vivor a um paciente sofrendo de pré- eclampsia ou eclampsia é suficiente para causar uma redução qualitativa ou quantitativa nos sintomas de pré-eclampsia ou pré-eclampsia, conforme descrito aqui. Uma "quantidade terapêutica" pode também significar uma quantidade que, quando administrada, quer através de administração dire- tamente ao paciente ou através de uma abordagem ex vivo, a um paciente sofrendo de pré-eclampsia ou eclampsia, é suficiente para causar uma redu- ção nos níveis de expressão de endoglina solúvel ou sFlt-1 ou um aumento nos níveis de expressão de VEGF ou PIGF1 conforme medido através dedos ensaios descritos aqui.
Por "tratamento" entenda-se administração de um composto ou composição farmacêutica para fins terapêuticos. "Tratar uma doença" ou uso para "tratamento terapêutico" refere-se à administração de um tratamento a um indivíduo que já está sofrendo de uma doença para melhorar a condição do indivíduo. De preferência, o indivíduo é diagnosticado como sofrendo de uma complicação da gravidez associada à hipertensão, tal como pré- eclampsia ou eclampsia, baseado em identificação de qualquer um dos sin- tomas característicos descritos abaixo ou o uso dos métodos diagnósticos descritos aqui. "Prevenir uma doença" se refere ao tratamento profilático de um indivíduo que ainda não está doente, mas está suscetível a ou de outro modo em risco de desenvolver uma doença em particular. De preferência, um indivíduo é determinado como estando em risco de desenvolver pré- eclampsia ou eclampsia usando os métodos diagnósticos descritos aqui. Assim, nas reivindicações e modalidades, tratamento é a administração, a um mamífero, para fins terapêuticos ou profiláticos.
Por "trofoblasto" entenda-se a camada de célula mesoectodér- mica que cobre o blastocisto que se desprende da mucosa uterina e através da qual o embrião recebe nutrição da mãe; as células contribuem para a formação da placenta.
Por "fator de crescimento endotelial (VEGF)" entenda-se um fa- tor de crescimento de mamífero que é homólogo ao fator de crescimento definido nas Patentes U.S. N9S 5.332.671; 5.240.848; 5.194.596; e Char- nock-Jones e colaboradores (Biol. Reproduction, 48: 1120-1128, 1993) e tem atividade biológica de VEGF. O VEGF existe como um homodímero glicosi- lado e inclui pelo menos quatro isoformas com estrutura alternativa diferen- tes. A atividade biológica do VEGF nativo inclui a promoção de crescimento seletivo de células endoteliais vasculares ou células endoteliais da veia um- bilical e indução de angiogênese. Conforme usado aqui, o VEGF inclui qual- quer membro ou isoforma da família VEGF (por exemplo, VEGF-A1 VEGF-B1 VEGF-C1 VEGF-D, VEGF-E1 VEGF189, VEGF165 ou VEGF 121). De prefe- rência, VEGF é a isoforma VEGF121 ou VEGF165 (Tischer e colaboradores, J. Biol. Chem. 266, 11947-11954, 1991; Neufed e colaboradores CancerMe- tastasis 15: 153-158, 1996), a qual é descrita nas Patentes U.S. N9S 6.447.768; 5.219.739; e 5.194.596, aqui incorporadas por referência. Tam- bém incluídas são formas mutantes de VEGF, tais como o VEGF KDR- seletivo e o VEGF Flt-seletivo descritos em Gille e colaboradores (J. Biol. Chem. 276: 3222-3230, 2001). Conforme usado aqui, o VEGF também inclui quaisquer formas modificadas de VEGF, tais como aquelas descritas em LeCouter e colaboradores (Science 299: 890-893, 2003). Embora VEGF humano seja preferido, a invenção não está limitada às formas humanas e pode incluir outras formas animais de VEGF (por exemplo, camundongo, rato, cão ou galinha).
Por "vetor" entenda-se uma molécula de DNA, usualmente deri- vada de um plasmídeo ou bacteriófago, na qual fragmentos de DNA podem ser inseridos ou clonados. Um vetor recombinante conterá um ou mais sítios de restrição único e pode ser capaz de replicação autônoma em um hospe- deiro definido ou organismo veículo, de modo que a seqüência clonada seja reproduzível. Um vetor contém um promotor operavelmente ligado a um ge- ne ou região de codificação de modo que, quando de transfecção para uma célula recipiente, um RNA é expresso.
Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição a seguir das modalidades preferidas da mesma e das reivindicações.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 é um esquema mostrando a proteína endoglina. SP: peptídeo sinalizador (também referido como a seqüência de peptídeo líder). ZP: domínio da zona pelúcida, CL: sítio de clivagem potencial (aminoácido 437) para a liberação de endoglina solúvel, TM: domínio transmembrana, Cyto: domínio citoplásmico. Uma vez que o peptídeo sinalizador é clivado, a proteína madura restante começa no resíduo de ácido glutâmico no aminoá- cido 26.
A figura 2A mostra a seqüência de cDNA prevista (SEQ ID N9: 1) de endoglina solúvel. A figura 2B mostra a seqüência de aminoácido prevista (SEQ ID NQ: 2) de endoglina solúvel a qual inclui o peptídeo sinalizador (a- minoácidos 1-25). Deve ser entendido que a seqüência inclui a seqüência do peptídeo líder que normalmente seria clivada no ER.
A figura 3 é uma Northern blot mostrando os níveis de mRNA de endoglina em placentas de gestações normais (N), placentas de gestações pré-eclâmpticas pré-termo (p) e placentas de gestações pré-eclâmpticas a termo (P).
A figura 4 é uma western blot mostrando os níveis de proteína endoglina na placenta. Amostras são duas pacientes pré-eclâmpticas, p32 e p36, que se apresentaram ao Beth Israel Deaconess Medicai Center em 2003 e soro materno de uma mulher grávida. A Western blot foi hibridizada usando um anticorpo N-terminal obtido da Santa Cruz Biotechnology, Inc., (Santa Cruz, CA) que mostra a banda de 11 OkD na placenta e uma banda de 63 kDa menor que está presente na placenta e amostras de soro.
A figura 5 é um gráfico que mostra as concentrações em circula- ção de endoglina solúvel em mulheres com gravidez normal, pré-eclampsia branda, pré-eclampsia grave e gestações não pré-eclâmpticas complicadas por parto pré-termo. Todas as amostras de sangue foram obtidas dentro de 24 horas antes do parto. A endoglina solúvel foi medida usando um kit ELI- SA da R & D Systems, MN (Cat # DNDG00). Esses dados mostram que os níveis de endoglina solúvel estão significativamente elevados em pacientes pré-eclâmpticas no momento de doença clínica.
A figura 6 é um gráfico mostrando a concentração média de en- doglina solúvel para cinco grupos de estudo diferentes de mulheres grávidas por toda a gravidez durante as várias janelas de grupo de idade gestacional.
A figura 7 é um gráfico mostrando as concentrações médias de sFlt-1 para cinco grupos de estudo diferentes de mulheres grávidas por toda a gravidez durante as várias janelas de grupo de idade gestacional.
A figura 8 é um gráfico mostrando as concentrações médias de PIGF para cinco grupos de estudo diferentes de mulheres grávidas por toda a gravidez durante as várias janelas de grupo de idade gestacional.
A figura 9 é um gráfico mostrando os valores para o índice anti- angiogênico de endoglina solúvel para anti-angiogênese pré-eclampsia para amostras tomadas antes dos sintomas clínicos.
A figura 10 é um gráfico mostrando as concentrações médias de endoglina solúvel de acordo com o número de semanas antes de pré- eclampsia prematura clínica (PE <37 semanas).
A figura 11 é um gráfico mostrando os valores do índice anti- 15 angiogênico de endoglina solúvel de acordo com o número de semanas an- tes de pré-eclampsia prematura clínica (PE <37 semanas).
A figura 12 é um gráfico mostrando a alteração nos níveis de endoglina solúvel por toda a gravidez para pré-eclampsia pré-termo (PE>37 semanas) antes e após os sintomas.
A figura 13 é um gráfico mostrando a alteração nos níveis do índice anti-angiogênico de endoglina solúvel por toda a gravidez para pré- eclampsia a termo (PE>37 semanas) antes e após os sintomas.
A figura 14 é um gráfico mostrando os níveis de endoglina solú- vel detectados em mulheres durante hipertensão gestacional e antes de hi- pertensão gestacional (1-5 semanas que precedem a hipertensão gestacio- nal (durante as semanas 33-36 de gravidez)) e controles normotensos.
A figura 15 é um gráfico mostrando os níveis do índice anti- angiogênico de endoglina solúvel em mulheres durante hipertensão gesta- cional e antes de hipertensão gestacional (1-5 semanas que precedem a hipertensão gestacional (durante as semanas 33-36 de gravidez)) e contro- les normotensos.
A figura 16 é~um gráfico mostrando os níveis de endoglina solú- vel mostrando os níveis de endoglina solúvel detectados usando as janelas gestacionais de 33-36 semanas em mulheres com SGA grave, SGA branda e controles normotensos.
A figura 17 é um gráfico mostrando os níveis do índice anti- angiogênico de endoglina solúvel detectados durante as janelas gestacionais de 33-36 semanas em mulheres com SGA grave, SGA branda e controles normotensos.
A figura 18 é um gráfico mostrando a concentração de sFItl e endoglina solúvel nas mesmas pacientes grávidas plotado um contra o outro.
A figura 19 mostra fotomicrografias de coloração por imunofluo- rescência dupla de endoglina (vermelho) e actina de músculo liso (verde) para placentas pré-eclâmpticas tomadas a 25,2 semanas. O anticorpo usado para detectar endoglina cora a endoglina de comprimento total e a endoglina solúvel. Placentas de controle para as janelas gestacionais apropriadas fo- ram derivadas de pacientes com parto pré-termo.
A figura 20 mostra fotomicrografias de coloração por imunofluo- rescência dupla de endoglina (vermelho) e actina do músculo liso (verde) para placentas pré-eclâmpticas tomadas a 41,3 semanas. O anticorpo usado para detectar endoglina cora a endoglina de comprimento total e a endoglina solúvel. Placentas de controle para as janelas gestacionais apropriadas fo- ram derivadas de pacientes com parto pré-termo.
A figura 21A mostra um auto-radiograma a partir de imunopreci- pitação e experimentos de Western blotting para placentas pré-eclâmpticas e soro. A figura 21B mostra um auto-radiograma a partir de imunoprecipitação e experimentos de Western blotting para endoglina usando placentas pré- eclâmpticas. As três diferentes amostras NeP representam pacientes indi- viduais. Para ambas as figuras, anticorpos monoclonais comercialmente dis- poníveis foram usados para imunoprecipitação e anticorpos policlonais foram usados para as Western blots. Ambos esses anticorpos foram estimulados contra a região N-terminal da proteína endoglina e detectam a proteína en- doglina solúvel de comprimento total e truncada.
A figura 22 é um gráfico mostrando os resultados de ensaios de angiogênese usando HUVECs em matrigéis reduzidos com fator de cresci- mento. Ensaios de angiogênese foram realizados na presença de endoglina solúvel ou sFIt1 ou ambos e os comprimentos do tubo endotelial quantifica- dos. C- representa controle, E - representa 1 ug/ml de endoglina solúvel e S representa 1 ug/ml de sFItl. E + S representa a combinação de 1 pg/ml de E + 1 pg/ml de sFItl. Os dados representam a média de três experimentos independentes.
A figura 23 é um gráfico mostrando a permeabilidade microvas- cular em vários leitos de órgãos usando vazamento de azul de Evans em camundongos, conforme descrito em materiais e métodos. C - controle (GFP), E - endoglina solúvel, S-sFlt1 e S+E- sFIt1 + endoglina solúvel. Os dados representam uma média de 4 experimentos independentes.
A figura 24 é um gráfico mostrando a alteração percentual no diâmetro de microvasos renais de rato quando submetidos a experimentos de reatividade microvascular na presença de TGF-β1 (B1) e TGF-P3 (B3) a partir de doses oscilando de 200 pg/ml - 200 ng/ml. Esses mesmos experi- mentos foram repetidos na presença de endoglina solúvel (E) a 1 ug/ml. Es- ses dados apresentados são uma média de 4 experimentos independentes.
A figura 25 é um gráfico mostrando a alteração percentual no diâmetro vascular de microvasos renais na presença de 1 ng/ml de VEGF (V), TGF-β1 (B1) e da combinação (V+B1). Também mostrado é o efeito dessa combinação na presença de 1 pg/ml cada de sFIt1 (S) e endoglina solúvel (E) (V+B1+S+E). Os dados representam uma média de 4 experimen- tos independentes.
A figura 26A é uma fotografia de um esfregaço periférico de a- mostras de sangue tomadas no momento de sacrifício de ratos prenhes inje- tados com a combinação de sFlt1 e um adenovírus de controle (CMV). A figura 26B é uma fotografia de um esfregaço periférico de amostras de san- gue tomadas no momento de sacrifício de ratos prenhes injetados com a combinação de sFlt e adenovírus expressando endoglina solúvel e demons- tra hemólise ativa por esquistocistos e contagem aumentada de reticulócitos. As setas representam esquistocistos. As figuras 27A-D são uma série de fotomicrografias mostrando a histologia renal (corante H &E) dos vários grupos de animais descritos na Tabela 8. A figura 27A mostram a histologia renal para o grupo de controle sem evidência de endoteliose glomerular. A figura 27B mostra a histologia renal para o grupo injetado com endoglina solúvel sem evidência de endote- liose glomerular. A figura 27C mostra a histologia renal para ratos injetados com sFlt-1, mostrando endoteliose moderada (mostrada pela seta). A figura 27D mostra a histologia renal para os ratos injetados com endoglina solúvel e sFItl, mostrando glomérulos extremamente intumescidos e endoteliose glomerular grave com gotículas de reabsorção de proteína nos podócitos. Todas as micrografias foram tiradas a 60X (ampliação original).
A figura 28 é um gráfico mostrando os resultados de ELISA para endoglina solúvel (sEng) e sFItl em soro de pacientes com graus variados de pré-eclampsia, gestações de controle e quatro voluntárias saudáveis não grávidas, conforme descrito no Exemplo 3. *P < 0,05 comparado com contro- les pré-termo e # P < 0,05 comparado com pré-eclampsia grave.
A figura 29 é um gráfico mostrando os resultados de ELISA para endoglina solúvel em um subconjunto de pacientes grávidas (normal: η = 6; pré-eclampsia: η = 11) descrito no Exemplo 3 com sangue coletado pré- (0- 12 horas) e pós- (48 horas) parto. * P < 0,05 quando comparado com T = O amostras.
A figura 30A é uma western blot mostrando a endoglina solúvel após purificação do soro de pacientes pré-eclâmpticas. As frações 4 e 5 elu- ídas de 44G4-lgG (anti-Eng) Sepharose foram passadas sobre condições de redução de SDS-PAGE e testadas através de Western blot usando um anti- corpo policlonal à endoglina. As frações eluídas foram submetidas à análise de espectrometria de massa (3 operações). A figura 30B mostra a seqüência da endoglina humana (SEQ ID N-. 5). Peptídeos identificados através de espec de massa são mostrados em negrito e sublinhados. Os aminoácidos sublinhados representam o domínio transmembrana da endoglina na super- fície celular. Note que a numeração da seqüência de aminoácido começa em 26 porque os aminoácidos 1-25 representam o peptídeo líder. Note que a seqüência listada como SEQ ID N9: 5 na listagem de seqüência começa no aminoácido 1, de modo que o aminoácido 26 na figura é o aminoácido 11 na listagem de seqüência, o aminoácido 658 na figura é o aminoácido 633 na listagem de seqüência. A numeração dos aminoácidos é ajustada depen- dendo da seqüência de referência (isto é, aminoácidos 26 a 658 para se- qüências referentes à figura 30B são os mesmos que os aminoácidos 1 a 633 para seqüências referentes à SEQ ID N9: 5).
A figura 31 mostra uma série de fotomicrografias mostrando que a endoglina solúvel inibe a formação de capilar e aumenta a permeabilidade vascular. Ensaios de angiogênese foram realizados usando HUVEC em Ma- trigel® reduzida com fator de crescimento na presença de 1 pg de endoglina solúvel recombinante, sFItl ou ambos e os comprimentos do tubo endotelial foram quantificados. Um experimento representativo (n = 4) é mostrado com comprimentos de tubo em pixels, indicados abaixo dos painéis.
A figura 32 é uma série de gráficos mostrando a inibição de rea- tividade vascular TGF-β1-mediada em vasos mesentéricos pela endoglina solúvel. A reatividade microvascular de microvasos mesentéricos de rato foi medida na presença de TGF-β1 ou TGF-p3 de 200 pg/ml a 200 ng/ml. Os experimentos foram repetidos na presença de endoglina solúvel recombinan- te a 1 pg/ml. A média ± SE de 4 experimentos independentes é mostrada (painel superior). Também mostrado é o efeito de bloqueio de L-NAME sobre o TGFB1 a 1 ng/ml (painel inferior).
A figura 33 é uma série de fotomicrografias mostrando endoteli- ose glomerular em ratos prenhes. Micrografias eletrônicas (EM) de gloméru- los de um rato prenhe de controle (painel superior), ratos prenhes tratados com endoglina solúvel (sEng) (painel mediano) e o grupo combinado - en- doglina solúvel (sEng)+sFlt1 (painel inferior) são mostradas. Essas fotos fo- ram tiradas a 6200X (ampliação original) para o painel superior e mediano e 5000X (ampliação original) para o painel inferior.
As figuras 34 A-H são uma série de fotomicrografias mostrando alterações histológicas renal, placental e hepática e esfregaços de sangue periférico~em ratos prenhes após tratamento com endoglina solúvel e sFItl. Histologia placental (corante H &E) dos grupos de controle (figura 34A), sEng (figura 34B), sFItl (figura 34C) e sFItl+sEng (figura 34D). Os animais tratados com endoglina solúvel e sFItl mostram inflamação difusa (setas) na junção maternal-fetal não observada nos controles. Há enfarte hemorrágico e necrose fibrinóide com obstrução do lúmen de um vaso materno (seta) nos decíduos da placenta tratada com sFItl+sEng (figura 34D). Barra de esca- las, 200 pm (figura 34E-H). Histologia do fígado nos grupos de controle (figu- ra 34E), sEng (figura 34F), sFlt1 (figura 34G) e sFItl+sEng (figura 34H). Alte- rações isquêmicas com necrose multifocal (seta) são notadas no grupo com sFlt1+sEng (figura 34H). O grupo de controle e ratos aos quais foram forne- cidos sEng ou sFlt1 não mostraram alterações. Barra de escala, 200 pm.
As figuras 35A-D são uma série de gráficos e auto-radiogramas, mostrando que sEng recombinante atenua a ligação e atividade de TGF-βΙ e seus efeitos sobre a vasodilatação via ativação de eNOS. A figura 35A é um gráfico mostrando as respostas microvasculares de microvasos renais a 1 ng/ml de VEGF, TGF-βΙ e da combinação. Os efeitos de 100 ng/ml de cada um de sFlt-1 e sEng sobre a resposta combinada são mostrados (η = 4). Também mostrado é o efeito de bloqueio de L-NAME sobre as respostas TGFpi- e VEGF-estimuladas. A figura 35B é um auto-radiograma represen- tativo e um gráfico de aumento de dose-resposta na ligação de [I125] TGF-βΙ ao TpRII sobre células endoteliais de camundongo. Tratamento com endo- glina solúvel recombinante a 5 nM reduziu significativamente a ligação a 50 pM e 100 pM (*P < 0,05 vs. Grupo não tratado). Competição com um exces- so de 40X de TGF-pi gelado em células tratadas com 100 pM [I125] de TGF- p1 eliminou a ligação ao receptor e serviu como um controle de fundo. A fi- gura 35C é um gráfico mostrando ativação TGF-p-induzida significativamen- te aumentada da estrutura repórter CAGA-Luc Smad 2/3-dependente trans- fectada em HUVECs e inibição através de tratamento com sEng. (η = 3, **P < 0,01 vs. grupo não tratado com sEng). A figura 35D é uma Western blot representativa e um gráfico {n = 4) mostrando desfosforilação significativa em Thr495 de eNOS após tratamento com TGF-βΙ e atenuação por sEng (*P~< 0,05 vs. não tratado). Fosforilaçãoestava inalterada a Ser1177 e os níveis totais de eNOS permaneceram constantes no decorrer dos experi- mentos.
A figura 36 mostra duas westem blots de rato demonstrando a expressão do sFlt-1 recombinante e endoglina solúvel. Painel superior: a- mostras de plasma de ratos prenhes (no início do terceiro trimestre) foram usadas conforme descrito em Métodos. Fileiras 1, 2 e 3 representam 200 pg, 500 pg e 2 ng de proteína sFlt-1-Fc de camundongo recombinante usada como um controle positivo. 20 μl de amostras de placa de um rato de contro- le e dois ratos tratados com sFlt-1 são mostrados. A banda de sFlt1 (53 kDa) foi detectada nos ratos tratados com sFlt-1. Quantificação da expressão de sFlt-1 foi realizada usando ELISA comercialmente disponível (Tabela 8). Painel inferior: amostras de plasma de ratos prenhes foram usadas (no início do terceiro trimestre) para detectar a expressão de sEng. A fileira 1 repre- senta 500 pg de endoglina solúvel humana recombinante e as fileiras 2 e 3 representam 30 μl de plasma tratado com sEng e ratos de controle, respecti- vamente. A blot não mostra endoglina solúvel em ratos de controle, mas ex- pressão robusta de sEng recombinante em ratos tratados. Quantificação de endoglina solúvel foi realizada usando um ELISA comercialmente disponível (Tabela 8).
A Figura 37 é um gráfico mostrando a distribuição de delta sFlt1 e delta sEng (valores do primeiro trimestre - segundo trimestre) em contro- les, todos em pré-eclampsia e em eclampsia <37 semanas.
A Figura 38 é um gráfico mostrando a distribuição de produto de sFlt x sEng no primeiro trimestre (produto 1), no segundo trimestre (produto 2), produto delta (produto 1-produto 2) em controles, todos em pré-eclampsia e em pré-eclampsia <37 semanas.
A Figura 39 é um gráfico mostrando o risco de pré-eclampsia de acordo com tertil de produto delta. O risco aumentado de pré-eclampsia pré- termo no grupo cujos níveis de delta produto eram maiores do que +1 [aOR 5,5, Cl de 95% de 1,4- 22,4], comparado com mulheres cujo delta produto era menor do que -1 era estatisticamente significativo (P< 0,05).
A Figura 40A é uma western blot mostrando que a endoglina é necessária para desfosforilação TGF-βΙ-induzida de eNOS em Thr495.
A Figura 40B é um gráfico mostrando o percentual de fosforila- ção de Thr495 em eNOS com relação ao eNOS total. Os resultados mos- tram que o nível de Thr495 fosforilado diminui na presença de TGF-β1 na presença de endoglina solúvel, mas não na ausência de endoglina solúvel.
Descrição Detalhada
Descobriu-se que os níveis de endoglina solúvel estão elevados em amostras de soro sangüíneo tomadas de mulheres com um distúrbio hi- pertensivo relacionado à gravidez, tal como pré-eclampsia ou eclampsia. A endoglina solúvel pode ser formada através de clivagem da porção extrace- lular da forma ligada à membrana através de enzimas proteolíticas. A falta de detecção de variantes com estrutura alternativa na placenta e a seqüên- cia de peptídeo parcial de endoglina solúvel purificada conforme descrito aqui sugere que ela é um produto da clivagem N-terminal de endoglina de comprimento total. Endoglina solúvel em excesso pode estar privando a pla- centa de quantidades necessárias desses fatores angiogênicos e mitogêni- cos essenciais. Descobriu-se que concentrações em circulação de endoglina solúvel e sFlt-1 em excesso em pacientes com pré-eclampsia contribuem para a patogênese de pré-eclampsia e outros distúrbios hipertensivos rela- cionados à gravidez. Descobriu-se que a endoglina solúvel interfere com a ligação de TGF-βΙ e TGF-p3 a seu receptor, levando à sinalização diminuí- da, tal como uma redução na ativação de eNOS em células endoteliais, des- se modo, romper mecanismos homeostáticos chave necessários para manu- tenção de saúde vascular. Esses dados sugerem um papel crucial para a endoglina na ligação de ativação do receptor TGF-β para a síntese de NO. Além disso, descobriu-se que a endoglina solúvel e sFlt-1 atuam em conjun- to para induzir a dano vascular e distúrbios hipertensivos relacionados à gra- videz, tais como pré-eclampsia ou eclampsia, interferindo com a sinalização ao TGF-βΙ e VEGF, respectivamente, provavelmente via inibição da ativa- ção a jusante de eNOS.
A presente invenção se caracteriza pelo uso de agentes terapêu- ticos que interferem com a ligação da~endoglina solúvel a fatores de cresci- mento, agentes que reduzem a expressão ou atividade biológica de endogli- na solúvel ou agentes que aumentam os níveis de fatores de crescimento, que podem ser usados para tratar ou prevenir distúrbios hipertensivos rela- cionados à gravidez, tais como pré-eclampsia ou eclampsia em um indiví- duo. Tais agentes incluem, mas não estão limitados a, anticorpos que se ligam à endoglina solúvel e inibem a atividade biológica de endoglina solú- vel, oligonucleotídeos para anti-senso ou RNAi que reduz os níveis de endo- glina solúvel, compostos que aumentam os níveis de fatores de crescimento que se ligam à endoglina solúvel, compostos que impedem a clivagem pro- teolítica da forma ligada à membrana de endoglina, desse modo, impedindo a liberação de endoglina solúvel e pequenas moléculas que se ligam à en- doglina solúvel e bloqueiam o sítio de ligação de fator de crescimento. Adi- cional ou alternativamente, a invenção se caracteriza pelo uso de qualquer composto (por exemplo, poíipeptídeo, pequena molécula, anticorpo, ácido nucleico e mimético) que aumenta o nível ou atividade biológica de TGF-β, eNOS e PGI2 para tratar ou prevenir distúrbios hipertensivos relacionados à gravidez, tais como pré-eclampsia ou eclampsia em um indivíduo. Adicio- nalmente, a invenção se caracteriza pelo uso de qualquer composto que di- minui o nível de sFlt-1 ou aumenta o nível ou atividade de VEGF ou PIGF (veja, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente U.S. Números 20040126828, 20050025762 e 20050170444 e Publicações PCT Números WO 2004/008946 e WO 2005/077007) em combinação com qualquer um dos compostos terapêuticos descritos acima para tratar ou prevenir distúr- bios hipertensivos relacionados à gravidez, tais como pré-eclampsia ou e- clampsia, em um indivíduo. Além disso, a invenção se caracteriza pelo uso de endoglina solúvel, eNOS, TGF-β, of PGI2, quer sozinhos ou em combina- ção, como um marcador diagnóstico de distúrbios hipertensivos relacionados à gravidez, incluindo pré-eclampsia ou eclampsia.
Embora a descrição detalhada apresentada aqui se refira espe- cificamente à endoglina solúvel, TGF-β1, eNOS, sFlt-1, VEGF ou PIGF1 esta- rá claro para aqueles habilitados na técnica que a descrição detalhada pode também se aplicar a membros da família, isoformas e/ou variantes de endo- glina solúvel, TGF-β, eNOS, sFlt-1, VEGF ou PIGF. Diagnósticos
Descobriu-se que os níveis de endoglina solúvel estão elevados em amostras de soro sangüíneo tomadas de mulheres com um distúrbio hi- pertensivo relacionado à gravidez, tal com eclampsia ou pré-eclampsia. A endoglina solúvel começa a se elevar 6-10 semanas antes dos sintomas clí- nicos de pré-eclampsia. Consequentemente, um teste diagnóstico que mede a endoglina solúvel e sFlt-1, opcionalmente em combinação com PIGF livre no soro, terão sensibilidade e especificidade e proporcionarão uma ferra- menta poderosa na prevenção de mortalidade pré-eclampsia-induzida. O teste diagnóstico pode também incluir medição dos níveis de VEGF livre; membros da família TGF-β, de preferência TGF-βΙ, TGF- β3, activina-A li- vre, BMP2, BMP7; NOS, de preferência eNOS; ou PGI2, quer sozinhos ou em qualquer combinação dos mesmos. Uma alteração nos níveis de qual- quer uma dessas proteínas é diagnóstico de um distúrbio hipertensivo rela- cionado à gravidez, tal como pré-eclampsia ou eclampsia. Em um exemplo, uma diminuição nos níveis de BMP2, BMP7 ou activina A livre é um diagnós- tico de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, tal como pré- eclampsia ou eclampsia.
Embora os métodos descritos aqui refiram-se à eclampsia e pré- eclampsia especificamente, deve ser entendido que os métodos de diagnós- tico e monitoramento da invenção se aplicam a qualquer distúrbio hipertensi- vo relacionado à gravidez incluindo, mas não limitado a, hipertensão gesta- cional, gravidez com um bebê pequeno para a idade gestacional (SGA), HELLP, hipertensão crônica, pré-eclampsia (branda, moderada e grave) e eclampsia.
Os níveis de endoglina solúvel, quer os níveis livres, totais ou ligados, são medidos em uma amostra do indivíduo e usados como um indi- cador de pré-eclampsia, eclampsia ou da propensão de desenvolver tais condições.
Um indivíduo tendo pré-eclampsia, eclampsia ou uma predispo- sição a tais condições mostrará um aumento na expressão de um polipeptí- deo de endoglina solúvel. O polipeptídeo de endoglina solúvel pode incluir endoglina solúvel de comprimento total, produtos da degradação, isoformas com estrutura alternativa de endoglina solúvel, produtos da clivagem enzi- mática de endoglina solúvel e semelhantes. Um anticorpo que se liga especi- ficamente a um polipeptídeo de endoglina solúvel pode ser usado para o diagnóstico de eclampsia ou pré-eclampsia ou para identificar um indivíduo em risco de desenvolver tais condições. Um exemplo de tal anticorpo útil nos métodos da invenção é um anticorpo monoclonal contra a região N-terminal de endoglina que está comercialmente disponível da Santa Cruz Biotechno- logy, Inc. (cat # sc-20072). Exemplos adicionais incluem anticorpos que se ligam especificamente ao domínio extracelular de endoglina (por exemplo, aminoácidos 1 a 437 de endoglina, aminoácidos 1 a 587 de endoglina ou qualquer uma das seqüências de aminoácido mostradas em negrito e subli- nhadas na figura 30B). Uma variedade de protocolos para medição de uma alteração na expressão de tais polipeptídeos são conhecidos, incluindo mé- todos imunológicos (tais como ELISAs e RIAs) e proporcionam uma base para diagnóstico de pré-eclampsia ou eclampsia ou um risco de desenvolvi- mento de tais condições.
Níveis aumentados de endoglina solúvel são um indicador posi- tivo de pré-eclampsia ou eclampsia. Por exemplo, se o nível de endoglina solúvel está aumentado com relação a uma referência normal (por exemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais) ou aumenta com o tempo em uma ou mais amostras de um indivíduo, isso é considerado como um indicador positivo de pré-eclampsia ou eclampsia. Adicionalmente, qualquer alteração detectável nos níveis de endoglina solúvel, sFlt-1, VEGF ou PIGF com relação os níveis normal é indicativa de pré-eclampsia, e- clampsia ou da propensão de desenvolver tais condições. Normalmente, as concentrações no soro de endoglina solúvel em circulação oscilam de 2-7 ng/ml durante estado sem gravidez e de 10-20 ng/ml durante gravidez nor- mal. Níveis elevados no soro, de mais de 15 ng/ml, de preferência de mais de 20 ng/ml e, ainda mais preferivelmente, mais de 25 ng/ml ou mais de en- doglina solúvel é considerado um indicador positivo de pré-eclampsia ou e- clampsia.
Em uma modalidade, o nível de endoglina solúvel é medido em combinação com o nível de polipeptídeo ou ácido nucleico de sFlt-1, VEGF ou PIGF ou qualquer combinação dos mesmos. Métodos para a medição de sFlt-1, VEGF e PIGF são descritos nas Publicações de Pedido de Patente Números 20040126828, 20050025762 e 20050170444 e Publicações PCT Números WO 2004/008946 e WO 2005/077007, aqui incorporadas por refe- rência em sua totalidade. Em modalidades adicionais preferidas, a índice de massa corporal (BMI) e a idade gestacional do feto também são medidos e incluídos no sistema métrico diagnóstico.
Em outra modalidade, o nível de polipeptídeo ou ácido nucleico de TGF-βΙ, TGF^3 ou eNOS é medido em combinação com o nível de poli- peptídeo ou ácido nucleico de endoglina solúvel, sFlt-1, VEGF ou PIGF. An- ticorpos úteis para a medição dos níveis de polipeptídeo de TGF-βΙ e β3 estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Abcam, Abgent, BD Bi- osciences Pharmingen, Chemicon, GeneTex e R&D Systems. O nível de PGI2 pode também ser usado em combinação com o nível de qualquer um dos polipeptídeos acima. Os níveis de PGI2 podem ser determinados, por exemplo, usando o receptor de PGI2 como uma molécula de ligação em qualquer um dos ensaios diagnósticos descritos acima ou usando, por e- xemplo, o kit ELISA colorimétrico de prostaciclina urinária (Assay Designs). Anticorpos úteis para a medição dos níveis de polipeptídeo de eNOS estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Research Diagnostics Inc., Santa Cruz, Cayman Chemicals e BD Biosciences.
Em outra modalidade, a atividade biológica de qualquer um ou mais de polipeptídeo de TGF-βΙ, TGF^3 ou eNOS é medida em combina- ção com a atividade biológica de polipeptídeo de endoglina solúvel, sFlt-1, VEGF ou PIGF e uma diminuição na atividade biológica é um indicador posi- tivo de eclampsia ou pré-eclampsia. A atividade biológica pode ser medida, por exemplo, usando um ensaio para atividade enzimática ou para a ativida- de de sinalização a jusante. Em um exemplo, a atividade enzimática de e- NOS é determinada através de medição da conversão de citrulina e uma diminuição na atividade enzimática de eNOs é um indicador positivo de e- clampsia ou pré-eclampsia.
Em uma modalidade, um sistema métrico incorporando endogli- na solúvel, sFlt-1, VEGF ou PIGF ou qualquer combinação dos mesmos é usado para determinar se uma relação entre os níveis de pelo menos duas das proteínas é indicativa de pré-eclampsia ou eclampsia. Em um exemplo, o sistema métrico é PAAI (sFlt-1/ VEGF + PIGF), o qual é usado, em combi- nação com medição de endoglina solúvel, como um índice anti-angiogênico que é diagnóstico de eclampsia, pré-eclampsia ou da propensão de desen- volver tais condições. Se o nível de endoglina solúvel está aumentado com relação a uma amostra de referência (por exemplo, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes ou mesmo em tanto quanto 10 vezes ou mais ) e o PAAI é maior do que 10, mais preferiveImente maior do que 20, então, o indivíduo é considerado como tendo pré-eclampsia, eclampsia ou estando em risco imi- nente de desenvolver as mesmas. A proporção de PAAI (sFlt-1/ VEGF + PIGF) é meramente um exemplo de um sistema métrico útil que pode ser usado como um indicador diagnóstico. Ele não se destina a limitar a inven- ção. Virtualmente qualquer sistema métrico que detecta uma alteração no nível de endoglina solúvel, sFlt-1, PIGF ou VEGF ou qualquer combinação dos mesmos, em um indivíduo com relação a um controle normal, pode ser usado como um indicador diagnóstico. Outro exemplo é o seguinte índice anti-angiogênico de endoglina solúvel: (sFlt-1 + 0,25(polipeptídeo de endo- glina solúvel))/PIGF. Um aumento no valor do sistema métrico de endoglina solúvel com o tempo ou comparado com uma amostra ou valor de referência é um indicador diagnóstico de pré-eclampsia ou eclampsia. Um índice de endoglina solúvel acima de 100, de preferência acima de 200, é um indica- dor diagnóstico de pré-eclampsia ou eclampsia. Exemplos adicionais inclu- em os seguintes índices: (endoglina solúvel + sFlt-1 )/PIGF ou sFlt-1 χ endo- glina solúvel.
Outro exemplo inclui a medição dos níveis de sFlt-1 e endoglina solúvel nos primeiro e segundo trimestres em um indivíduo e cálculo do delta valor de sFItl χ endoglina solúvel (sEng) em cada trimestre usando a seguin- te equação: [dproduto = (sFlt1 χ sEng) no segundo trimestre- (sFlt1 χ sEng) no primeiro trimestre], onde um valor maior do que 0, 1, 2 ou mais, incluindo frações dos mesmos (por exemplo, um valor positivo) é um indicador diag- nóstico de pré-eclampsia ou eclampsia. Um valor positivo pode também ser um indicador de eclampsia pré-termo. Tal medição pode ser tomada em nu- merosas ocasiões durante os primeiro e segundo trimestres e o dproduto pode ser acompanhado com o tempo. Além disso, o dproduto do nível de sFlt-1 (dsFlt-1) e do nível de sEng (dsEng) sozinho pode também ser calcu- lado entre os primeiro e segundo trimestres, onde um valor maior do que 0, 1, 2 ou mais, incluindo frações dos mesmos (por exemplo, um valor positivo) para (dsFlt-1) ou (dsEng) é um indicador positivo de pré-eclampsia ou eclampsia.
Além disso, o sistema métrico pode ainda incluir o nível de poli- peptídeo de TGF-β1, TGF-p3, PGl2 ou eNOS. Qualquer um dos sistemas métricos pode ainda incluir o BMI da mãe ou o GA do bebê.
Métodos padrões podem ser usados para medir os níveis de po- lipeptídeo de endoglina solúvel, VEGF livre, PIGF livre, sFlt-1, TGF-β1, TGF- β3, PGI2 ou eNOS em qualquer fluido corporal incluindo, mas não limitado a, urina, soro, plasma, saliva, fluido amniótico ou fluido cérebro-espinhal. Tais métodos incluem imunoensaio, ELISA, Western blotting usando anticorpos dirigidos ao polipeptídeo de endoglina solúvel, VEGF livre, PIGF livre, sFlt-1, TGF-β1, TGF-B3, PGl2 ou eNOS e técnicas de imunoensaio enzimático quantitativo, tais como aquelas descritas em Ong e colaboradores (Obstet. Gynecol. 98: 608-611, 2001) e Su e colaboradores (Obstet. Gynecol., 97: 898-904, 2001). ELISA é o método preferido para medição dos níveis de po- lipeptídeo de endoglina solúvel, VEGF, PIGF, sFlt-1, TGF-β1, TGF-B3, PGl2 ou eNOS. De preferência, endoglina solúvel é medida sozinha ou em combi- nação com qualquer um ou mais dos polipeptídeos restantes.
Oligonucleotídeos ou fragmentos mais longos derivados de uma seqüência de ácido nucleico de endoglina, sFlt-1, PIGF ou VEGF podem ser usados como uma sonda não apenas para monitorar a expressão, mas tam- bém para identificar indivíduos tendo uma variação genética, mutação ou polimorfismo em uma molécula de ácido nucleico de endoglina, sFlt-1, PIGF ou VEGF que são indicativos de uma predisposição para desenvolver a pré- eclampsia ou eclampsia. Tais métodos são descritos em detalhes em Abdal- la e colaboradores, Hum. Mutat. 25: 320-321 (2005), Publicação de Pedido de Patente U.S. Ng 2006/0067937 e Publicação PCT N5 WO 06/034507. Oli- gonucleotídeos preferidos se hibridizarão em alta estringência ao domínio extracelular de endoglina ou qualquer seqüência de ácido nucleico que codi- fica qualquer um dos peptídeos mostrados em negrito e sublinhados na figu- ra 30B.
A medição de qualquer um dos ácidos nucleicos ou polipeptí- deos descritos aqui pode ocorrer em pelo menos duas ocasiões diferentes e uma alteração nos níveis, quando comparado com níveis de referência nor- mais, com o tempo é usada como um indicador de eclampsia, pré-eclampsia ou da propensão de desenvolver tais condições.
Em um exemplo, o nível de um polipeptídeo ou ácido nucleico de endoglina solúvel presente nos fluidos corporais de um indivíduo tendo e- clampsia, pré-eclampsia ou a propensão de desenvolver tais condições pode ser aumentado em tão pouco quanto 10%, 20%, 30% ou 40% ou em tanto quanto 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais com relação aos níveis em um indivíduo de controle normal ou com relação a uma amostragem anterior obtida dos mesmos fluidos corporais do mesmo indivíduo. Em outro exemplo, o nível de um polipeptídeo ou ácido nucleico de endoglina solúvel nos fluidos corporais de um indivíduo tendo pré- eclampsia, eclampsia ou a propensão de desenvolver tais condições pode estar alterado em tão pouco quanto 10%, 20%, 30% ou 40% ou em tanto quanto 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% durante o tempo de uma medição para a próxima.
O nível de sFlt-1, VEGF ou PIGF medido em combinação com o nível de endoglina solúvel nos fluidos corporais de um indivíduo tendo pré- eclampsia, eclampsia ou a propensão de desenvolver tais condições pode ser alterado em tão pouco quanto 10%, 20%, 30% ou 40% ou em tanto quanto 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais com relação ao nível de sFlt-1, VEGF ou PIGF em um controle normal. O nível de sFlt-1, VEGF ou PIGF medido em combinação com o nível de endo- glina solúvel nos fluidos corporais de um indivíduo tendo pré-eclampsia, e- clampsia ou a propensão de desenvolver tais condições pode ser alterado em tão pouco quanto 10%, 20%, 30% ou 40% ou em tanto quanto 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% durante o momento de uma medição para a próxima.
Em uma modalidade, uma amostra do indivíduo de um fluido corporal (por exemplo, urina, plasma, soro, fluido amniótico ou fluido cére- bro-espinhal) é coletada no início de gravidez antes do início dos sintomas de pré-eclampsia. Em outro exemplo, a amostra pode ser um tecido ou célu- la coletada no início de gravidez antes do início de sintomas de pré- eclampsia. Exemplos não Iimitativos de tecidos e células incluem tecido pla- cental, células placentais, células endoteliais em circulação e leucócitos, tais como monócitos. Em seres humanos, por exemplo, amostras de soro san- güíneo materno são coletadas da veia antecubital de mulheres grávidas du- rante os primeiro, segundo ou terceiro trimestres da gravidez. De preferên- cia, o ensaio é realizado durante o primeiro trimestre, por exemplo, a 4, 6, 8, 10 ou 12 semanas ou em qualquer intervalo no mesmo ou durante o segun- do trimestre, por exemplo, a 14, 16, 18, 20, 22 ou 24 semanas ou qualquer intervalo no mesmo. Em um exemplo, o ensaio é realizado entre 13 e 16 semanas de gravidez. Tais ensaios podem também ser conduzidos no final do segundo trimestre ou no terceiro trimestre, por exemplo, a 26, 28, 30, 32, 34, 36 ou 38 semanas ou qualquer intervalo entre o mesmo. É preferível que os níveis de endoglina solúvel e/ou qualquer um dos polipeptídeos adicionais descritos aqui seja medido duas vezes durante esse período de tempo. Para o diagnóstico de pré-eclampsia ou eclampsia pós-parto, ensaios de endogli- na solúvel podem ser realizados pós-parto. Para o diagnóstico de uma pré- disposição à pré-eclampsia ou eclampsia, o ensaio é realizado antes do iní- cio de gravidez ou antes do desenvolvimento de sintomas de pré-eclampsia ou eclampsia. Em um exemplo, para o monitoramento e gerenciamento de terapia, o ensaio é realizado durante a gravidez após o diagnóstico de pré- eclampsia e/ou durante terapia.
Em um exemplo particular, amostras de sangue podem ser cole- tadas durante gravidez e os níveis de polipeptídeo de endoglina solúvel e/ou qualquer um dos polipeptídeos adicionais da invenção determinado através de ELISA. Em outro exemplo, uma amostra é coletada durante o segundo trimestre e início do terceiro trimestre e um aumento no nível de endoglina solúvel de qualquer um dos outros polipeptídeos da invenção a partir da pri- meira amostragem para a próxima é indicativo de pré-eclampsia ou eclamp- sia ou da propensão de desenvolver qualquer uma.
A invenção também inclui a medição de qualquer proteína de ligação à endoglina solúvel (por exemplo, TGF-βΙ, TGF-p3, activina-A, BMP- 2 e BMP-7) ou mediadores a jusante de sinalização à endoglina solúvel (por exemplo, PGI2 e eNOS) em um fluido corporal de um indivíduo, de preferên- cia urina e uma alteração (por exemplo, aumento ou diminuição) no nível de proteína de ligação à endoglina solúvel é indicativa de pré-eclampsia ou e- clampsia. Os métodos e o momento para medição da endoglina solúvel des- critos aqui também podem ser usados para a medição de qualquer uma das proteínas de ligação à endoglina solúvel, PGI2 ou eNOS.
Na prática veterinária, ensaios podem ser realizados a qualquer momento durante a gravidez mas são, de preferência, realizados no início de gravidez, antes do início dos sintomas de pré-eclampsia. Dado que o final das gestações varia amplamente entre as espécies, o momento do ensaio será determinado por um veterinário, mas geralmente corresponderá ao momento dos ensaios durante uma gravidez humana.
Os métodos diagnósticos descritos aqui podem ser usados indi- vidualmente ou em combinação com qualquer outro método diagnóstico descrito aqui ou conhecido na técnica para um diagnóstico mais preciso da presença de, gravidade ou tempo estimado de início de pré-eclampsia ou eclampsia. Além disso, os métodos diagnósticos descritos aqui podem ser usados em combinação com outros métodos diagnósticos determinados co- mo sendo úteis para o diagnóstico preciso da presença de ou gravidade de ou tempo estimado de início de pré-eclampsia ou eclampsia. Os métodos diagnósticos descritos aqui também podem ser u- sados para monitorar e gerenciar pré-eclampsia ou pré-eclampsia em um indivíduo. Em um exemplo, uma terapia é administrada até que o nível de endoglina solúvel no sangue, plasma ou soro seja de menos de 25 ng/ml ou até que os níveis de endoglina solúvel no soro (ou proteína de ligação à en- doglina solúvel, nível de PGI2 ou eNOS) retornem para o nível de linha de base determinado antes de início de pré-eclampsia ou pré-eclampsia. Em outro exemplo, se um indivíduo é determinado como tendo um nível aumen- tado de endoglina solúvel com relação a um controle normal, então, a terapia pode ser administrada até que o nível de PIGF no soro se eleve para apro- ximadamente 400 pg/mL ou retorne para o nível de linha de base antes de início de pré-eclampsia ou eclampsia. Nessa modalidade, os níveis de endo- glina solúvel, sFlt-1, PIGF, VEGF, proteína de ligação à endoglina solúvel, PGI2, eNOS ou qualquer um e todos esses, são medidos repetidamente co- mo um método não apenas de diagnóstico de doença, mas monitoramento do tratamento e gerenciamento da pré-eclampsia e eclampsia. Kits diagnósticos
A invenção também proporciona um kit de teste diagnóstico. Por exemplo, um kit de teste diagnóstico pode incluir agentes de ligação (por exemplo, polipeptídeos ou anticorpos) que se ligam especificamente à endo- glina solúvel e meios para detecção e, mais preferivelmente, avaliação, liga- ção entre o agente de ligação e o polipeptídeo de endoglina solúvel. Para detecção, o agente de ligação ou o polipeptídeo de endoglina solúvel é rotu- lado e o agente de ligação ou o polipeptídeo de endoglina solúvel é substra- to-ligado, de modo que a interação agente de ligação-polipeptídeo de endo- glina solúvel possa ser estabelecida através de determinação da quantidade de rótulo preso ao substrato após ligação entre o agente de ligação e o poli- peptídeo de endoglina solúvel. Um ELISA convencional é um método co- mum conhecido na técnica para detecção de interação substrato-anticorpo e pode ser fornecido com o kit da invenção. Polipeptídeos de endoglina solúvel podem ser detectados em virtualmente qualquer fluido corporal incluindo, mas não limitado a urina, soro, plasma, saliva, fluido amniótico ou fluido cé- rebro-espinhal. A invenção também proporciona um kit de teste diagnóstico que inclui um ácido nucleico de endoglina solúvel que pode ser usado para detectar e determinar os níveis de ácidos nucleicos de endoglina solúvel. Um kit que determina uma alteração, por exemplo, um aumento, no nível de po- lipeptídeo de endoglina solúvel com relação a uma referência, tal como o nível presente em um controle normal, é útil como um kit diagnóstico nos métodos da invenção.
Os kits diagnósticos da invenção podem incluir anticorpos ou ácidos nucleicos para a detecção de polipeptídeos ou ácidos nucleicos de sFlt-1, VEGF ou PIGF, conforme descrito nas Publicações de Pedido de Pa- tente U.S. Números 20040126828, 20050025762 e 20050170444 e Publica- ções PCT Números WO 2004/008946 e WO 2005/077007.
Em outra modalidade, o kit pode também incluir agentes de liga- ção para a detecção de ligantes de endoglina solúvel incluindo, mas não li- mitado a, polipeptídeos de TGF-β1, TGF-p3 ou PGI2 ou eNOS. Anticorpos úteis para a medição dos níveis de polipeptídeo de TGF-β1 e β3 estão co- mercialmente disponíveis, por exemplo, da Abcam, Abgent, BD Biosciences Pharmingen, Chemicon, GeneTex e R&D Systems. Anticorpos úteis para a medição dos níveis de polipeptídeo de eNOS estão comercialmente disponí- veis, por exemplo, da Research Diagnostics Inc., Santa Cruz, Cayman Che- micals e BD Biosciences. Agentes de ligação para a detecção dos níveis de PGI2 também podem ser incluídos e incluem, por exemplo, o receptor de PGI2 ou fragmentos do mesmo, como uma molécula de ligação em qualquer um dos ensaios diagnósticos descritos acima ou usando, por exemplo, o kit ELISA colorimétrico de prostaciclina urinária (Assay Designs). Um kit que determina uma alteração, por exemplo, uma diminuição, no nível de polipep- tídeo de eNOS, TGF-β1 ou β3 ou PGI2 com relação a um nível padrão ou de referência normal, tal como o nível presente em um controle normal, é útil como um kit diagnóstico nos métodos da invenção. Um kit que determina uma alteração, por exemplo, uma diminuição, no nível de endoglina solúvel ou um aumento no nível de proteína de ligação à endoglina solúvel (por e- xemplo, TGF-β1, TGF-p3, activina A, BMP2 e BMP 7) ou mediadores a ju- sante de sinalização à endoglina solúvel (por exemplo, eNOS e PGI2) com relação a um padrão ou nível de referência positivo é útil para monitoramen- to do tratamento de pré-eclampsia ou eclampsia.
Desejavelmente, o kit inclui qualquer um dos componentes ne- cessários para realizar qualquer um dos métodos diagnósticos descritos a- cima. Por exemplo, o kit inclui, desejavelmente, uma membrana, onde o a- gente de ligação à endoglina solúvel ou o agente que se liga ao agente de ligação à endoglina solúvel é imobilizado sobre a membrana. A membrana pode ser suportada sobre uma estrutura de tira medidora onde a amostra é depositada sobre a membrana colocando a estrutura de tira medidora na amostra ou a membrana pode ser suportada em um cassete de fluxo lateral onde a amostra é depositada sobre a membrana através de uma abertura no cassete.
Os kits diagnósticos também incluem, em geral, um rótulo ou instruções para o uso pretendido dos componentes do kit e uma amostra de referência ou proteínas purificadas a serem usadas para estabelecer uma curva padrão. Em um exemplo, o kit contém instruções para o uso do kit pa- ra o diagnóstico de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, tal co- mo eclampsia, pré-eclampsia ou a propensão a desenvolver pré-eclampsia ou eclampsia. Em ainda outro exemplo, o kit contém instruções para o uso do kit para monitorar tratamento terapêutico ou regimes de dosagem para o tratamento de pré-eclampsia ou eclampsia. O kit diagnóstico pode também incluir um rótulo ou instruções para o uso do kit para determinar o PAAI ou índice anti-angiogênico de endoglina solúvel da amostra do indivíduo e com- parar o PAAI ou índice anti-angiogênico de endoglina solúvel com um valor de amostra de referência. Deve ser entendido que os valores da amostra de referência dependerão do uso pretendido do kit. Por exemplo, a amostra po- de ser comparada com um valor de referência normal, em que um aumento no PAAI ou índice anti-angiogênico de endoglina solúvel ou no valor de en- doglina solúvel é indicativo de pré-eclampsia ou eclampsia ou uma pré- disposição à pré-eclampsia ou eclampsia. Em outro exemplo, um kit usado para monitoramento terapêutico pode ter um PAAI ou valor de índice anti- artgiogênico de endoglina solúvel de referência ou um valor de endoglina solúvel que é indicativo de pré-eclampsia ou eclampsia, em que uma diminu- ição no PAAI ou valor do índice anti-angiogênico de endoglina solúvel ou uma diminuição no valor de endoglina solúvel na amostra do indivíduo com relação à amostra de referência pode ser usado para indicar a eficácia tera- pêutica ou dosagens eficazes de compostos terapêuticos. Uma curva padrão dos níveis de proteína purificada dentro da faixa de referência positiva ou normal, dependendo do uso do kit, pode também ser incluída. Produtos terapêuticos
A presente invenção se caracteriza por métodos e composições para o tratamento ou prevenção de pré-eclampsia ou eclampsia em um indi- víduo. Dado que os níveis de endoglina solúvel são aumentados em indiví- duos tendo eclampsia, eclampsia ou tendo uma pré-disposição a tais condi- ções, qualquer composto que diminui os níveis de expressão e/ou atividade biológica de um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico de endoglina solúvel é útil nos métodos da invenção. Tais compostos incluem TGF-βΙ, TGF-P3, activina-A, BMP2 ou BMP7, que podem romper a ligação de endo- glina solúvel a ligantes; um anticorpo purificado ou fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente à endoglina solúvel; oligômeros de nu- cleobase anti-senso; e dsRNAs usados para mediar RNA de interferência. Compostos úteis adicionais incluem quaisquer compostos que podem alterar a atividade biológica de endoglina solúvel, por exemplo, conforme medido por um ensaio de angiogênese. Compostos e métodos exemplificativos ao descritos em detalhes abaixo. Esses métodos podem também ser combina- dos com métodos para diminuir os níveis de sFlt-1 ou aumentar os níveis de VEGF ou PIGF ou diminuir os níveis de sFlt-1 , conforme descrito na Publi- cação PCT Número WO 2004/008946 e Publicações de Patente U.S. NQs 20040126828 e 20050170444. Além disso, qualquer composto que aumenta o nível ou atividade biológica de TGF-βΙ ou 3, eNOS ou PGI2 é útil nos mé- todos da invenção. Compostos e métodos exemplificativos são descritos em detalhes abaixo.
Deve ser notado que descobriu-se que as vias de endoglina so- lúvel e sFlt-1 podem estar funcionando de uma maneira cooperativa para a patogênese de pré-eclampsia ou eclampsia. Portanto, a invenção inclui qualquer combinação de qualquer um dos métodos ou composições descri- tas aqui para o tratamento ou prevenção de um distúrbio hipertensivo rela- cionado à gravidez. Por exemplo, um composto que objetiva a via de endo- glina solúvel (por exemplo, sub-regula a expressão ou atividade biológica de endoglina solúvel ou super-regula a expressão ou atividade biológica de TGF-β, eNOS ou PGI2) pode ser usado em combinação com um composto que objetiva a via de sFlt-1 (por exemplo, sub-regula a expressão ou ativida- de biológica de sFlt-1 ou super-regula a expressão ou atividade biológica de VEGF ou PIGF) para o tratamento ou prevenção de um distúrbio hipertensi- vo relacionado à gravidez.
Produtos terapêuticos gue objetivam a via de sinalização de TGF-β
TGF-β é o protótipo de pelo menos 25 fatores de crescimento os quais regulam o crescimento, diferenciação, motilidade, remodelamento te- cidual, neurogênese, reparo de ferimentos, apoptose e angiogênese em mui- tos tipos de célula. TGF-β também inibe a proliferação celular em muitos ti- pos de célula e pode estimular a síntese de proteínas da matriz. A menos que de outro modo evidenciado a partir do contexto no qual ele é usado, o termo TGF-β, conforme usado por toda a presente especificação, deve ser entendido como se referindo em geral a qualquer e todos os membros da superfamília TGF-β, conforme apropriado. A endoglina solúvel se liga a vá- rios membros específicos da família TGF-β, incluindo TGF-βΙ, TGF^3, acti- vina, BMP-2 e BMP-7 e pode servir para privar o feto em desenvolvimento ou placenta desse fator angiogênico e mitogênico necessário. A presente invenção se caracteriza por métodos de aumento dos níveis desses Iigantes para se ligar à endoglina solúvel e neutralizar os efeitos da endoglina solú- vel.
Ligantes de endoglina solúvel como compostos terapêutico
Em uma modalidade preferida da presente invenção, formas pu- rificadas de qualquer Iigante da endoglina solúvel, tais como proteínas da família TGF-β incluindo, mas não limitado a, TGF-β1, TGFβ3, activina-A, ΒΜΡ2 e ΒΜΡ7, são administradas ao indivíduo de forma a tratar ou prevenir pré-eclampsia ou eclampsia.
Proteínas da família do TGF-β purificado incluem qualquer prote- ína com uma seqüência de aminoácido que é homóloga, mais desejavel- mente idêntica substancialmente à seqüência de aminoácido de TGF-βΙ ou TGF-p3 ou qualquer membro da família TGF-β conhecido, que pode induzir à angiogênese. Exemplos não Iimitativos incluem TGF-βΙ humano (Cat #240-B-002) e TGF^3 humano (Cat #243-B3-002) da R & D Systems, MN. Proteínas da família TGF-β preferidas úteis nos métodos da invenção terão a capacidade de se ligar à endoglina solúvel (por exemplo, Bárbara e colabo- radores, J. Biol. Chem. 274: 584-94 (1999)).
Compostos terapêuticos que inibem a clivagem proteolítica de endoglina
Identifica-se um sítio de clivagem potencial no domínio extrace- lular da endoglina, onde uma enzima proteolítica poderia clivar a forma liga- da à membrana de endoglina, liberando o domínio extracelular como uma forma solúvel. Nossos alinhamentos de seqüência do sítio de clivagem suge- rem que uma metaloproteinase na matriz (MMP) pode ser responsável pela clivagem e liberação de endoglina solúvel. Alternativamente, uma catepsina ou uma elastase também podem estar envolvidas no evento de clivagem. MMPs são conhecidas como colagenases, gelatinases e estromelisinas e, atualmente, existem 26 membros conhecidos da família (para uma revisão veja Whittaker e Ayscough, Cell Transmissions 17: 1 (2001)). Uma MMP pre- ferida é MMP9, a qual é conhecida por ser super-regulada em placentas de pacientes pré-eclâmpticos (Lim e colaboradores, Am. J. Pathol. 151: 1809- 1818, 1997). A atividade de MMPs é controlada através de ativação de pró- enzimas e inibição por inibidores endógenos, tais como os inibidores tecidu- ais de metaloproteinases (TIMPS). Inibidores de MMPs são proteínas de ligação ao zinco. Existem 4 inibidores endógenos conhecidos (TIMP 1-4), os quais são revistos em Whittaker e colaboradores, supra. Um inibidor de MMP preferido é o inibidor de MMP1 do tipo membrana que foi mostrado clivar a betaglicana, uma molécula que compartilha similaridade com a en- doglina (Velasco-Loyden e colaboradores, J. Biol. Chem. 279: 7721-7733 (2004)). Além disso, uma variedade de inibidores de MMP sintéticos e que ocorrem naturalmente foi identificada e também são revistos em Whittaker e colaboradores, supra. Exemplos incluem anticorpos dirigidos às MMPs e vários compostos, incluindo marimastat, batimastat, CT1746, BAY 12-9566, Prinomastat, CGS-27023A, D9120, BMS275291 (Bristol Myers Squibb) e trocade, alguns dos quais estão atualmente em testagem clínica. Dado o papel potencial das MMPs, catepsinas ou elastases na liberação e super- regulação dos níveis de endoglina solúvel, a presente invenção também proporciona o uso de qualquer composto, tais como aqueles descritos aci- ma, conhecido por inibir a atividade de qualquer MMP, catepsina ou elastase envolvida na clivagem e liberação de endoglina solúvel, para o tratamento ou prevenção de pré-eclampsia ou pré-eclampsia em um indivíduo.
Compostos terapêuticos que aumentam proteínas de ligação à endoglina solúvel
A presente invenção proporciona o uso de qualquer composto conhecido por estimular ou aumentar os níveis no soro sangüíneo de proteí- nas de ligação à endoglina solúvel incluindo, mas não limitado a, TGF-βΙ, TGF-p3, activina-A, BMP2 e BMP7, para o tratamento ou prevenção de pré- eclampsia em um indivíduo. Esses compostos podem ser usados sozinhos ou em combinação com as proteínas purificadas descritas acima ou em qualquer um dos outros métodos usados para aumentar os níveis de proteí- nas da família TGF-β descritas aqui. Em um exemplo, ciclosporina é usada em uma dosagem de 100-200 mg duas vezes ao dia para estimular a produ- ção de TG F-β 1.
Compostos terapêuticos oue alteram a atividade anti-anoiooênica de endo- glina solúvel
Compostos terapêuticos adicionais podem ser identificados u- sando ensaios de angiogênese. Por exemplo, soro pré-eclâmptico tendo ní- veis elevados de endoglina solúvel é adicionado a um ensaio de formação de tubo em matrigel, induzindo a um estado anti-angiogênico. Compostos de teste podem., então, ser adicionados ao ensaio e uma reversão no estado anti-angiogênico de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais indica que o composto pode reduzir a atividade biológica de endoglina solúvel e é útil como um composto terapêutico.
Compostos terapêuticos que aumentam os níveis ou atividade biológica de NOS
NOS é uma enzima complexa contendo vários co-fatores, um grupo heme o qual é parte do sítio catalítico, um domínio de oxigenase N- terminal o qual pertence à classe de proteínas haem-tiolato e um domínio de reductase C-terminal o qual é homólogo à reductase de NADPH: P450. NOS produz NO catalisando uma oxidação com cinco elétrons de um nitrogênio de guanidino de L-arginina (L-Arg).
Ativação de eNOS envolve um aumento coordenado na fosfori- lação de Ser1177 e desfosforilação de Thr495. Descobriu-se que TGF-β1 desfosforila eNOS em Thr495, o que é necessário para aumentar a sensibili- dade ao Ca2+ e atividade enzimática e pode funcionar sinergisticamente com o VEGF, o qual ativa o eNOS através de fosforilação de Ser1 177.
Consequentemente, qualquer composto (por exemplo, polipeptí- deo, molécula de ácido nucleico, composto de pequena molécula ou anticor- po) que aumenta o nível (por exemplo, através de aumento da estabilidade, transcrição ou tradução ou diminuição da degradação de proteína) ou ativi- dade biológica de NOS, particularmente eNOS ou qualquer composto que previne a sub-regulação de atividade de eNOS é útil nos métodos da inven- ção. Tais compostos incluem NOS purificado, de preferência eNOS ou frag- mentos biologicamente ativos dos mesmos, ácidos nucleicos que codificam NOS, de preferência eNOS ou fragmentos biologicamente ativos dos mes- mos, estatinas, vanadato, fator de crescimento de hepatócito, 3-quínase de fosfoinositídeo, Akt, VEGF, TGF-β1 ou qualquer outro composto que aumen- ta a fosforilação de Ser1 177 ou desfosforilação de Thr495 ou ambos. Óxido nítrico é sintetizado a partir de L-arginina pela sintase de óxido nítrico locali- zada em células endoteliais e outras. Óxido nítrico também pode ser gerado através de aplicação de vários doadores de óxido nítrico, tais como nitro- prussida de sódio, nitroglicerina, SIN-1, mononitrato de iso-sorbeto, dinitrato de iso-sorbeto e semelhantes. Consequentemente, compostos que aumen- tam (por exemplo, em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais) o nível ou atividade biológica de NOS podem ser opcio- nalmente administrados em combinação com L-arginina ou um doador de óxido nítrico (por exemplo, nitroprussida de sódio, nitroglicerina, mononitrato de iso-sorbeto e dinitrato de iso-sorbeto). Atividade de NOS pode ser ensai- ada através de métodos padrões conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, o ensaio de citrulina e outros ensaios descritos na Publicação de Pedido de Patente U.S. N9 20050256199, a descrição total da qual é aqui incorporada por referência. O resíduo Thr495 de eNOS está localizado den- tro do domínio de ligação à calmodulina (CaM) do eNOS. Desfosforilação agonista-induzida de eNOS em Thr495 aumenta a ligação de CaM à enzima (Fleming e colaboradores, Circ Res. 2001, 88: E68-75), desse modo, aumen- tando sua sensibilidade ao cálcio e ativação. Além do TGF-βΙ descrito aqui, descobriu-se que outros agonistas causam desfosforilação de Thr495 de eNOS, incluindo bradiquinina, histamina e VEGF. Desfosforilação de Thr495 pode ser intensificada pelo inibidor de quínase de proteína C (PKC) Ro 31- 8220 (CaIbiochem) ou após sub-regulação de PKC usando forbol 12- miristato 13-acetato (PMA) (Sigma Aldrich). Além disso, foi mostrado que desfosforilação agonista-induzida de Thr495 é Ca27calmodulina-dependente e passível de inibição pela caliculina A (Sigma Aldrich), um inibidor de fosfa- tase 1 de proteína (PP1) (Fleming I, e colaboradores Circ Res. 2001, 88: E68-75). Compostos adicionais que realizam desfosforilação de eNOS em Thr495 incluem histamina e bradiquinina (Sigma Aldrich). Compostos terapêuticos que aumentam os níveis ou atividade biológica de PGb
Prostaciclina é um membro da família de moléculas lipídicas co- nhecidas como eicosanóides. Ela é produzida em células endoteliais a partir de prostaglandina H2 (PGH2) através da ação da enzima sintase de prosta- ciclina. Atividade biológica de PGI2 inclui inibição de agregação plaquetária, relaxamento de músculo liso, redução de resistência vascular sistêmica e pulmonar através de vasodilatação direta e natriurese no rim.
PGI2 é um fator anti-trombótico que é estimulado pelo VEGF e TGF-β1. A atividade biológica de PGI2 inclui inibição de agregação plaquetá- ria e relaxamento de músculo liso vascular e ensaios para atividade biológica de PGI2 incluem qualquer ensaio de agregação plaquetária ou outro ensaio de PGI2 conhecido na técnica, tais como aqueles descritos em Jakubowski e colaboradores, Prostaglandins 47: 404 (1994). A invenção se caracteriza pelo uso de qualquer composto que aumenta (por exemplo, em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais) o nível ou ativi- dade de PGI2, conforme medido através de ensaios padrões conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a, miméticos de PGI2, iloprost, cicaprost e aspirina. Compostos adicionais são conhecidos na técnica e exemplos são descritos no U.S.P.N. 5.910.482, a divulgação toda do qual é aqui incorpora- da por referência.
Proteínas purificadas
Para qualquer uma das proteínas purificadas ou fragmentos das mesmas, a proteínas são preparadas usando métodos padrões conhecidos na técnica. Análogos ou homólogos de qualquer uma das proteínas terapêu- ticas descritas acima também são incluídos e podem ser construídos, por exemplo, fazendo várias substituições de resíduos ou seqüências, deletando resíduos terminais ou internos ou seqüências não necessárias para atividade biológica ou adicionando resíduos internos ou terminais os quais possam intensificar a atividade biológica. Substituições, deleções, adições ou muta- ções de aminoácido podem ser feitas para melhorar a expressão, estabilida- de ou solubilidade da proteína nos vários sistemas de expressão. Geralmen- te, substituições são feitas conservativamente e levam em conta o efeito so- bre a atividade biológica. Mutações, deleções ou adições em seqüências de nucleotídeo construídas para expressão de proteínas análogas ou fragmen- tos das mesmas devem, naturalmente, preservar a rede de leitura das se- qüências de codificação e, de preferência, na criar regiões complementares que possam se hibridizar para produzir estruturas de mRNA secundário, tais como Ioops ou hairpinas, os quais poderiam afetar adversamente a tradução do mRNA.
Qualquer um dos compostos terapêuticos da invenção (por e- xemplo, polipeptídeos, anticorpos, compostos de pequena molécula) pode também incluir quaisquer formas modificadas. Exemplos de modificações pós-traducionais incluem, mas não estão limitadas a, fosforilação, glicosila- ção, hidroxilação, sulfatação, acetilação, isoprenilação, isomerização de pro- lina, dimerização ou multimerização de subunidade e ligação cruzada ou fixação a quaisquer outras proteínas ou fragmentos das mesmas ou compo- nentes da membrana ou fragmentos dos mesmos (por exemplo, clivagem da proteína da membrana com um componente lipídico da membrana preso).
Modificações que proporcionam vantagens adicionais tais como afinidade aumentada, imunogenicidade diminuída e incluem, por exemplo, acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, fixação covalente de flavina, fixação covalente de uma porção heme, fixação covalente de um nucleotídeo ou de- rivado de nucleotídeo, fixação covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, fixação covalente de fosfotidil inositol, ligação cruzada, ciclização, formação de ligação de dissulfeto, demetilação, formação de ligações cruzadas cova- lentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama- carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodina- ção, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolí- tico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição de aminoácidos RNA-transferência mediada à proteínas, tais como arginila- ção e ubiquitinação (veja, por exemplo, Creighton, "Proteins: Structures and Molecular Properties," 2ê Ed., W. H. Freeman e Co., N.Y., 1992; "Postransla- tional Covalent Modification of Proteins," Johnson, ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter e colaboradores, Meth. Enzymol., 182: 626-646, 1990;
Rattan e colaboradores, Ann. NY Acad. Sci., 663: 48-62, 1992) também es- tão incluídos. O composto terapêutico de peptidila da invenção pode também incluir variantes de seqüência de qualquer um dos compostos, tais como variantes que incluem 1, 2, 3, 4, 5, mais de 5 ou mais de 10 alterações de aminoácido, tais como substituições, deleções ou inserções com relação à seqüência do tipo silvestre. Adicionalmente, o composto terapêutico da in- venção pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos. Aminoácidos não clássicos incluem, mas não estão limitados a, os D-isômeros dos ami- noácidos comuns, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-amino hexanóico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidróxiproiina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, β-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos projetados, tais como β-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Na-metil aminoácidos e análogos de aminoácido em geral. Além disso, o aminoácido pode ser D (dextro-giratório) ou L (levo- giratório).
Modificações pós-traducionais adicionais abrangidas pela inven- ção incluem, por exemplo, cadeias de carboidrato N-Iigado ou O-ligado, pro- cessamento de extremidades C-terminais ou N-terminais, fixação de porções químicas à parte principal de aminoácido, modificações químicas de cadeias de carboidrato N-Iigado ou O-Iigado e adição ou deleção de um resíduo de metionina N-terminal.
Além disso, derivados quimicamente modificados dos compostos terapêuticos descritos aqui, os quais podem proporcionar vantagens adicio- nais tais como solubilidade, estabilidade e tempo em circulação aumentados do polipeptídeo ou imunogenicidade diminuída (veja, Pat. U.S. N- 4.179.337) são também incluídos. As porções químicas para derivatização podem ser selecionadas de polímeros solúveis em água tais como, por exemplo, polieti- leno glicol, copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carbóximetil celulo- se, dextrana, álcool polivinílico e semelhantes. O composto pode ser modifi- cado em posições aleatórias dentro da molécula ou em posições predeter- minadas dentro da molécula e pode incluir uma, duas, três ou mais porções químicas presas.
O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ra- mificado ou não ramificado. Para polietileno glicol, o peso molecular preferi- do está entre cerca de 1 kDa e cerca de 10O kDa (o termo "cerca de" indi- cando que, nos preparados de polietileno glicol, algumas modalidades pesa- rão mais, algumas menos, do que o peso molecular estabelecido) para faci- lidade de manipulação e fabricação. Outros tamanhos podem ser usados, dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração de libe- ração sustentada desejada, os efeitos, se houver, sobre a atividade biológi- ca, a facilidade de manipulação, o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polietileno glicol a uma proteína terapêutica ou análo- go). Conforme mencionado acima, o polietileno glicol pode ter uma estrutura ramificada. Polietileno glicóis ramificados são descritos, por exemplo, na Pat. U.S. Ng 5.643.575; Morpurgo e colaboradores, Appl. Biochem. Biotechnoi 56: 59-72, (1996); Vorobjev e colaboradores, Nucleosides Nucleotides 18: 2745-2750, (1999); e Caliceti e colaboradores, Bioconjug. Chem. 10: 638- 646, (1999), as descrições de cada uma dos quais são incorporadas por re- ferência.
Qualquer um dos compostos terapêuticos da presente invenção (por exemplo, polipeptídeo, anticorpos ou compostos de pequena molécula) pode também ser modificado de modo a formar uma molécula quimérica compreendendo o composto terapêutico fundido a outro polipeptídeo ou se- qüência de aminoácido heteróloga, tal como uma seqüência de Fc, um rótulo detectável ou uma molécula terapêutica adicional. Em um exemplo, um anti- corpo anti-endoglina solúvel pode ser um peptídeo fundido a uma proteína de fusão de Fc.
Para qualquer um dos poiipeptídeos, incluindo anticorpos, que são usados nos métodos da invenção, os ácidos nucleicos que codificam os poiipeptídeos ou anticorpos ou fragmentos dos mesmos são também úteis nos métodos da invenção usando técnicas padrões para terapia genética conhecidos na técnica e descritos aqui. A invenção também inclui miméticos, baseado em modelamento da estrutura tridimensional de um polipeptídeo ou fragmento peptídico e usando design de fármaco racional para proporcionar compostos inibidores potenciais com um formato molecular, tamanho e ca- racterísticas de carga em particular. Após identificação de um composto te- rapêutico, métodos de modelamento adequados conhecidos na técnica po- dem ser usados para estudar as interações funcionais e projetar compostos miméticos os quais contêm grupos funcionais dispostos de uma maneira tal que eles possam reproduzir essas interações. O design de miméticos a um composto farmaceuticamente ativo conhecido é uma abordagem conhecida ao desenvolvimento de produtos farmacêuticos baseado em um composto protótipo. Isso poderia ser desejável onde o composto ativo é difícil ou caro de sintetizar ou onde ele é inadequado para um método de administração em particular, por exemplo, peptídeos não são bem adequados como agen- tes ativos para composições orais, uma vez que eles tendem a ser rapida- mente degradados por proteases no canal alimentar. Design, síntese e tes- tagem de miméticos podem, então, evitar seleção aleatória de um grande número de moléculas para uma propriedade alvo. O mimético ou miméticos podem, então, ser selecionados para ver se eles reduzem ou inibem os ní- veis ou atividade de endoglina solúvel e otimização ou modificação adicio- nais podem, então, ser realizadas para chegar em um ou mais miméticos finais para testagem clínica in vivo.
Ácidos nucleicos terapêuticos
Trabalho recente mostrou que a distribuição de ácido nucleico (DNA ou RNA) capaz de expressar um mitógeno de célula endotelial, tal co- mo VEGF, ao local de lesão de um vaso sangüíneo induzirá à proliferação e reendotelização do vaso lesado. Embora a presente invenção não se refira à lesão de vasos sangüíneos, essas técnicas gerais para a distribuição de áci- do nucleico à células endoteliais podem ser usadas na presente invenção para a distribuição de ácidos nucleicos que codificam proteínas de ligação à endoglina solúvel, tais como TGF-β1, TGF-p3, activina-A, BMP2 e BMP7 ou eNOS. As técnicas podem também ser usadas para a distribuição de ácidos nucleicos que codificam proteínas, tais como aquelas descritas acima, co- nhecidas por inibir a atividade de qualquer um de MMP, catepsina ou elasta- se, envolvidos na clivagem e liberação de endoglina solúvel, para o trata- mento ou prevenção de pré-eclampsia ou eclampsia em um indivíduo. Essas técnicas gerais são descritas nas Patentes U.S. N9S 5.830.879 e 6.258.787 e são incorporadas aqui por referência.
Na presente invenção, o ácido nucleico pode ser qualquer ácido nucleico (DNA ou RNA), incluindo DNA genômico, cDNA e mRNA, que codi- fica uma proteína de ligação à endoglina solúvel, tal como TGF-β1, TGF-p3, activina-A, BMP2 e BMP7 ou eNOS. Os ácidos nucleicos que codificam a proteína desejada podem ser obtidos usando procedimentos de rotina na técnica, por exemplo, DNA recombinante, amplificação por PCR.
Modos para distribuição de ácidos nucleicos
Para qualquer uma das aplicações de ácido nucleico descritas aqui, métodos padrões para administração de ácidos nucleicos podem ser usados. Exemplos são descritos na Publicação de Pedido de Patente U.S. Ne 20060067937 e Publicação PCT Nq WO 06/034507. Ácidos nucleicos terapêuticos que inibem a expressão de endoglina solúvel
A presente invenção também se caracteriza pelo uso de oligô- meros de nucleobase anti-senso para sub-regular a expressão de mRNA de endoglina solúvel diretamente. Através de ligação à seqüência de ácido nu- cleico complementar (a fita senso ou anti-senso), oligômeros de nucleobase anti-senso são capazes de inibir a expressão de proteína presumivelmente através da clivagem enzimática da fita de RNA pela RNAse H. De preferên- cia, o oligômero de nucleobase anti-senso é capaz de reduzir a expressão de proteína endoglina solúvel em uma célula que expressa níveis aumenta- dos de endoglina solúvel. De preferência, a diminuição na expressão de pro- teína endoglina solúvel é de pelo menos 10% com relação à células tratadas com um oligonucleotídeo de controle, de preferência 20% ou maior, mais preferivelmente 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou maior. Métodos para seleção e preparo de oligômeros de nucleobase anti-senso são bem conhe- cidos na técnica. Para um exemplo do uso de oligômeros de nucleobase a- través de para sub-regular a expressão de VEGF veja, por exemplo, Patente U.S. N2 6.410.322, incorporada aqui por referência. Métodos para ensaio dos níveis de expressão de proteína também são bem conhecidos na técni- ca e incluem Western blotting, imunoprecipitação e ELISA.
A presente invenção também se caracteriza pelo uso de RNA de interferência (RNAi) para inibir a expressão de endoglina solúvel. RNA de interferência (RNAi) é um mecanismo recentemente descoberto de silencia- mento de gene pós-transcricional (PTGS) no qual RNA fita dupla (dsRNA) correspondendo a um gene ou mRNA de interesse é introduzido em um or- ganismo, resultando na degradação do mRNA correspondente. Na reação de RNAi, as fitas senso e anti-senso de uma molécula de dsRNA são pro- cessadas em pequenos fragmentos de RNA ou segmentos oscilando, quan- to ao comprimento, de 21 a 23 nucleotídeos (nt) e tendo caudas 3' de 2- nucleotídeo. Alternativamente, dsRNAs sintéticos, os quais têm 21 a 23 nt de comprimento e têm caudas 3' de 2-nucleotídeo, podem ser sintetizados, puri- ficados e usados na reação. Esses dsRNAs de 21 a 23 nt são conhecidos como "RNAs guia" ou "RNAs de interferência curtos" (siRNAs).
As duplas de siRNA, então, se ligam a um complexo de nucleo- base composto de proteínas que objetivam e destroem mRNAs endógenos tendo homologia com o siRNA dentro do complexo. Embora a identidade das proteínas dentro do complexo permaneça desconhecida, a função do com- plexo é objetivar a molécula de mRNA homóloga através de interações de emparelhamento de base entre uma das fitas de siRNA e o mRNA endóge- no. O mRNA é, então, clivado aproximadamente 12 nt a partir do 31 término do siRNA e degradado. Dessa maneira, genes específicos podem ser objeti- vados e degradados, desse modo, resultando em uma perda de expressão de proteína do gene objetivado. siRNAs podem também ser quimicamente sintetizados ou obtidos de uma companhia que sintetiza quimicamente siR- NAs (por exemplo, Dharmacon Research Inc., Pharmacia ou ABI).
Os requisitos específicos e modificações de dsRNA são descri- tos na Publicação PCT N9 W001/75164 e na Publicação de Pedido de Pa- tente U.S. N5 20060067937 e Publicação PCT N9 WO 06/034507, incorpora- dos aqui por referência.
Compostos terapêuticos baseados em endoglina solúvel úteis no início de gravidez
Foi mostrado que a sinalização à endoglina de comprimento total intensifica a invasividade de trofoblasto em culturas de explante viloso (Ca- niggia I e colaboradores, Endocrinology, 1997, 138: 4977-88). Portanto, é provável que a endoglina solúvel intensifique a invasividade de trofoblasto durante início de gravidez. Consequentemente, composições que aumentam os níveis de endoglina solúvel no início de gravidez em uma mulher que não tem um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez ou uma pré-disposição a um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez podem ser benéficas para intensificação de formação de placenta. Exemplos de composições que au- mentam os níveis de endoglina solúvel incluem polipeptídeos purificados de endoglina solúvel, moléculas de ácido nucleico que codificam endoglina so- lúvel e compostos ou fatores de crescimento que aumentam os níveis ou atividade biológica de endoglina solúvel. Ensaios para expressão de gene e proteína
Os métodos a seguir podem ser usados para avaliar expressão de proteína ou gene e determinar a eficácia por qualquer um dos métodos acima mencionados para aumento dos níveis de proteína de ligação à endo- glina solúvel ou para diminuição dos níveis de proteína endoglina solúvel.
Soro sangüíneo do indivíduo é medido com relação aos níveis de endoglina solúvel usando métodos tais como ELISA, Western blotting ou imunoensaios usando anticorpos específicos. Soro sangüíneo do indivíduo pode também ser medido com relação aos níveis de TGF-βΙ, TGF-p3, acti- vina-A, BMP2, BMP7 ou qualquer Iigante de proteína conhecido por se ligar à endoglina solúvel. Métodos usados para medir os níveis de proteínas no soro incluem ELISA, Western blotting ou imunoensaios usando anticorpos específicos. Além disso, ensaios de angiogênese in vitro podem ser realiza- dos para determinar se o sangue do indivíduo se converteu de um estado anti-angiogênico para um estado pró-angiogênico. Tais ensaios são descri- tos abaixo no Exemplo 4. Um resultado que é diagnóstico de pré-eclampsia ou eclampsia é considerado um aumento de pelo menos 10%, 20%, de pre- ferência 30%, mais preferivelmente pelo menos 40% ou 50% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou mais nos níveis de endoglina solúvel e um resultado indicando um aperfeiçoamento na pré- eclampsia ou eclampsia é uma diminuição de pelo menos 10%, 20%, de pre- ferência 30%, mais preferivelmente pelo menos 40% ou 50% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou mais nos níveis de endoglina solúvel. Alternativa ou adicionalmente, um resultado que é diag- nóstico de pré-eclampsia ou eclampsia é considerado uma diminuição de pelo menos 10%, 20%, de preferência 30%, mais preferivelmente pelo me- nos 40% ou 50% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou mais nos níveis de eNOS, PGI2, TGF-β1, TGF-β3, activina-A, BMP2, BMP7 ou qualquer Iigante de proteína conhecido por se ligar à endo- glina solúvel e um resultado indicando um aperfeiçoamento na pré- eclampsia ou eclampsia é um aumento de pelo menos 10%, 20%, de prefe- rência 30%, mais preferivelmente pelo menos 40% ou 50% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou mais nos níveis de eNOS, PGI2, TGF-β1, TGF-β3, activina-A, BMP2, BMP7 ou qualquer ligante de proteína conhecido por se ligar à endoglina solúvel. Um resultado indi- cando um aperfeiçoamento na pré-eclampsia ou eclampsia também pode ser considerado conversão de pelo menos 10%, de preferência 20%, 30%, 40%, 50% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de um estado anti-angiogênico para um estado pró-angiogênico u- sando o ensaio de angiogênese in vitro.
Amostras de soro sangüíneo ou urina do indivíduo também po- dem ser medidas com relação aos níveis de ácidos nucleicos ou polipeptí- deos que codificam eNOS, TGF-β1, TGF-β3, activina-A, BMP2, BMP7 ou endoglina solúvel. Existem vários métodos conhecidos na técnica para en- saiar a expressão de gene. Alguns exemplos incluem o preparo de RNA a partir de amostras de sangue do indivíduo e o uso do RNA para northern blotting, ensaios de proteção de RNAse ou amplificação baseada em PCR. Um resultado positivo é considerado um aumento de pelo menos 10%, 20%, de preferência 30%, mais preferivelmente pelo menos 40% ou 50% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou mais nos níveis de ácidos nucleicos de endoglina solúvel, TGF-β1, TGF-β3, activina-A, BMP2, BMP7
Anticorpos terapêuticos
Os níveis elevados de endoglina solúvel encontrados nas amos- tras de soro tomadas de mulheres grávidas sofrendo de pré-eclampsia suge- rem que a endoglina solúvel está atuando como um "sifão fisiológico" para se ligar a e privar as células de trofoblasto e células endoteliais maternas de fatores de crescimento funcionais requeridos para o desenvolvimento apro- priado e angiogênese do feto ou da placenta. O uso de compostos, tais co- mo anticorpos, para se ligar à endoglina solúvel e neutralizar a atividade da endoglina solúvel (por exemplo, ligação a TGF-β1, TGF-p3, activina-A, BMP2, BMP7), pode ajudar a prevenir ou tratar pré-eclampsia ou eclampsia, através de produção de um aumento no TGF-β1, TGF-p3, activina-A, BMP2 e BMP7 livre. Tal aumento permitiria um aumento na proliferação, migração e angiogênese de trofoblasto requeridos para desenvolvimento placental e nutrição fetal e para morte de células endoteliais maternas sistêmica.
A presente invenção proporciona anticorpos que se ligam espe- cificamente à endoglina solúvel. De preferência, os anticorpos se ligam ao domínio extracelular de endoglina ou ao domínio de ligação a ligante. Os anticorpos são usados para neutralizar a atividade da endoglina solúvel e acredita-se que o mecanismo mais eficaz seja através de bloqueio direto dos sítios de ligação para TGF-β1, TGF-β3, activina-A, BMP2 ou BMP7; contudo, outros mecanismos não podem ser excluídos. Anticorpos preferidos podem se ligar a um epítopo (quer como um resultado de estrutura linear ou con- formação tridimensional) sobre a endoglina humana que inclui qualquer uma ou mais das seqüências peptídicas indicadas em negrito e sublinhadas na figura 30B por exemplo, aminoácidos 40 a 86, 144 a199, 206 a 222, 289 a 304 ou 375 a 381) ou a qualquer um dos fragmentos de endoglina solúvel (por exemplo, os aminoácidos 1 a 437, 4 a 437, 40 a 406 ou 1 a 587 da en- doglina humana). Métodos para o preparo e uso de anticorpos para fins te- rapêuticos são descritos em várias patentes, incluindo Patentes U.S. Núme- ros 6.054.297; 5.821.337; 6.365.157; e 6.165.464; Publicação de Pedido de Patente U.S. N9 2006/0067937; e Publicação PCT Ne WO 06/034507 e são aqui incorporados por referência. Anticorpos podem ser policlonais ou mo- noclonais; anticorpos monoclonais humanizados são preferidos. A presente invenção também inclui os anticorpos que se ligam à endoglina solúvel inclu- indo, mas não limitado a, aqueles que se ligam a qualquer um ou mais das seqüências peptídicas indicadas em negrito e sublinhadas na figura 30B ou a qualquer um dos fragmentos preferidos de endoglina solúvel (por exemplo, os aminoácidos 1 a 437, 4 a 437, 40 a 406 ou 1 a 587 da endoglina huma- na).
Usos terapêuticos de anticorpos
Quando usados in vivo para o tratamento ou prevenção de pré- eclampsia ou pré-eclampsia, os anticorpos da presente invenção são admi- nistrados ao indivíduo em quantidades terapeuticamente eficazes. De prefe- rência, os anticorpos são administrados parenteral ou intravenosamente a - través de infusão contínua. A dose e regime de dosagem dependem da gra- vidade da doença e da saúde global do indivíduo. A quantidade de anticorpo administrado está, tipicamente, na faixa de cerca de 0,001 a cerca de 10 mg/kg de peso do indivíduo, de preferência 0,01 a cerca de 5 mg/kg de peso do indivíduo.
Para administração parenteral, os anticorpos são formulados em uma forma de dosagem unitária injetável (solução, suspensão, emulsão) em associação com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Tais veículos são inerentemente não tóxicos e não terapêuticos. Exemplos de tais veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e albumina de soro humano a 5%. Veículos não aquoso, tais como óleos fixos e oleato de etila, também podem ser usados. Lipossomas podem ser usados como veículos. O veículo pode conter quantidades mínimas de aditivos, tais como substâncias que intensificam a tonicidade e estabilidade química, por exemplo, tampões e conservantes. Os anticorpos são, tipicamente, formula- dos em tais veículos em concentrações de cerca de 1 mg/ml a 10 mg/ml.
Terapias combinadas
Opcionalmente, um produto terapêutico pode ser administrado em combinação com qualquer outra terapia padrão para pré-eclampsia ou eclampsia; tais métodos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e incluem os métodos descritos nas Publicações de Pedido de Patente Núme- ros 20040126828, 20050025762, 20050170444, 20060067937 e 20070104707 e Publicações PCT Números WO 2004/008946, WO 2005/077007 e WO 06/034507.
Desejavelmente, a invenção se caracteriza pelo uso de uma combinação de qualquer um ou mais dos agentes terapêuticos descritos a- qui. Dado nossa descoberta de que a endoglina solúvel e sFlt-1 podem atuar em conjunto para induzir a dano vascular e distúrbios hipertensivos relacio- nados à gravidez através de interferência com a via de sinalização a TGF-β1 e VEGF, respectivamente, possivelmente convergindo na via de sinalização a eNOS, métodos terapêuticos desejáveis da invenção incluem a adminis- tração de um composto que diminui os níveis ou atividade de sFlt-1 ou au- mentam os níveis ou atividade de VEGF ou PIGF em combinação com um composto que diminui os níveis ou atividade de endoglina solúvel ou aumen- ta os níveis ou atividade de TGF-β, NOS ou PIG2. Será reconhecido por a- queles habilitados na técnica que qualquer combinação de qualquer um dos agentes pode ser usada para essa finalidade. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente à endoglina solúvel pode ser administrado em combinação com VEGF. Em outro exemplo, um composto que aumenta os níveis ou atividade de TGF-β1 pode ser administrado em combinação com um composto que aumenta o VEGF ou PIGF de forma a objetivar a endogli- na e a via de VEGF. Alternativamente, uma combinação de anticorpos con- tra a endoglina solúvel e sFlt-1 pode ser usada diretamente ou em uma a- bordagem ex vivo (por exemplo, usando uma coluna que está alinhada com anti-endoglina solúvel ou sFlt-1 e circulação do sangue do paciente através da coluna). Qualquer uma dessas combinações pode ainda incluir a adminis- tração de um composto que aumenta os níveis ou atividade de NOS, de pre- ferência eNOS, de forma a regular a via a jusante dos respectivos recepto- res.
Além disso, a invenção proporciona o uso de qualquer medica- mento para hipertensão crônica em combinação com qualquer um dos mé- todos terapêuticos descritos aqui. Medicamentos usados para o tratamento de hipertensão durante gravidez incluem metildopa, hidrocloreto de hidrala- zina ou labetalol. Para cada um desses medicamentos, modos de adminis- tração e dosagens são determinados pelo médico e através das instruções do fabricante.
Dosagens e Modos de administração De preferência, o produto terapêutico é administrado diretamen- te ou usando uma abordagem ex vivo durante gravidez para o tratamento ou prevenção de pré-eclampsia ou eclampsia ou após gravidez para tratar pré- eclampsia ou eclampsia pós-parto. Técnicas e dosagens para administração variam, dependendo do tipo de composto (por exemplo, composto químico, proteína purificada, anticorpo, anti-senso, RNAi ou vetor de ácido nucleico) e são bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica ou são prontamente determinadas.
Compostos terapêuticos da presente invenção podem ser admi- nistrados com um diluente, veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitá- vel, na forma de dosagem unitária. A administração pode ser parenteral, in- travenosa, subcutânea, oral ou local através de injeção direta no fluido am- niótico. Distribuição intravenosa através de infusão contínua é o método pre- ferido para administração dos compostos terapêuticos da presente invenção.
O composto terapêutico pode estar na forma de uma solução, uma suspen- são, uma emulsão, um dispositivo de infusão ou um dispositivo de distribui- ção para implante ou pode ser apresentado como um pó seco a ser reconsti- tuído com água ou outro veículo adequado antes de uso.
A composição pode estar na forma de uma pílula, tablete, cápsu- la, líquido, tablete com liberação sustentada para administração oral; ou um líquido para administração intravenosa, subcutânea ou parenteral; ou um polímero ou outro veículo com liberação sustentada para administração lo- cal.
Métodos bem conhecidos na técnica para fabricação de formula- ções são encontrados, por exemplo, em "Remington: The Science and Prac- tice of Pharmacy" (20§ ed., ed. A.R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, PA). Formulações para administração parenteral po- dem, por exemplo, conter excipientes, água estéril, solução salina, polialqui- leno glicóis, tais como polietileno glicol, óleos de origem vegetal ou naftale- nos hidrogenados. Polímeros de lactídeo biocompatíveis, biodegradáveis, copolímero de lactídeo/glicolídeo ou copolímeros de polioxietileno- polioxipropileno podem ser usados para controlar a liberação dos compos- tos. Formulações em nanopartícula (por exemplo, nanopartículas biodegra- dáveis, nanopartículas lipídicas sólidas, lipossomas) podem ser usadas para controlar a biodistribuição dos compostos. Outros sistemas de distribuição parenteral potencialmente úteis incluem partículas de copolímero de etileno- acetato de vinila, bombas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis e li- possomas. A concentração do composto na formulação varia dependendo de uma série de fatores, incluindo a dosagem do fármaco a ser administrado e a via de administração.
O composto pode ser opcionalmente administrado como um sal farmaceuticamente aceitável, tal como sais de adição de ácido não tóxicos ou complexos de metal que são comumente usados na indústria farmacêuti- ca. Exemplos de sais de adição de ácido incluem ácidos orgânicos, tais co- mo ácido acético, láctico, pamóico, maleico, cítrico, málico, ascórbico, succí- nico, benzóico, palmítico, subérico, salicílico, tartárico, metano-sulfônico, tolueno-sulfônico ou trifluoroacético ou semelhante; ácidos poliméricos, tais como ácido tânico, carbóximetil celulose de sódio ou semelhante; e ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou semelhante. Complexos de metal incluem zinco, ferro e semelhantes.
Formulações para uso oral incluem tabletes contendo o(s) ingre- diente(s) ativo(s) em uma mistura com excipientes farmaceuticamente acei- táveis não tóxicos. Esses excipientes podem ser, por exemplo, diluentes i- nertes ou enchedores (por exemplo, sacarose e sorbitol), agentes lubrifican- tes, glidantes e anti-adesivos (por exemplo, estearato de magnésio, esteara- to de zinco, ácido esteárico, sílicas, óleos vegetais hidrogenados ou talco).
Formulações para uso oral também podem ser fornecidas como tabletes mastigáveis ou como cápsulas de gelatina dura, em que o ingredi- ente ativo é misturado com um diluente sólido inerte ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente ativo é misturado com água ou um meio oleoso.
A dosagem e momento de administração do composto depende de vários fatores clínicos, incluindo a saúde global do indivíduo e a gravida- de dos sintomas de pré-eclampsia. Em geral, uma vez que pré-eclampsia ou uma pré-disposição à pré-eclampsia é detectada, infusão contínua da prote- ína purificada é usada para tratar ou prevenir progressão da condição. Tra- tamento pode ser continuado durante um período de tempo oscilando de 1 a 100 dias, mais preferivelmente 1 a 60 dias e, ainda mais preferivelmente, 1a 20 dias ou até término da gravidez. As dosagens podem variar, dependendo de cada composto e da gravidade da condição e são tituladas para obter uma concentração no soro sangüíneo em estado uniforme oscilando de 10 a 20 ng/ml de endoglina solúvel; e/ou 1 a 500 pg/mL de VEGF ou PIGF livre ou ambos, de preferência 1 a 100 pg/mL, mais preferivelmente 5 a 50 pg/mL e, ainda mais preferivelmente, 5 a 10 pg/mL de VEGF ou PIGF ou 1-5 ng de sFlt-1.
Os métodos diagnósticos descritos aqui podem ser usados para monitorar a pré-eclampsia ou eclampsia durante terapia ou determinar as dosagens de compostos terapêuticos. Em um exemplo, um composto tera- pêutico é administrado e o PAAl é determinado durante o curso de terapia. Se o PAAl é menor do que 20, de preferência menor do que 10, então, a dosagem terapêutica é considerada como sendo uma dosagem eficaz. Em outro exemplo, um composto terapêutico é administrado e o índice anti- angiogênico de endoglina solúvel é determinado durante o curso de terapia. Se o índice anti-angiogênico de endoglina solúvel é menor do que 200, de preferência menor do que 100, então, a dosagem terapêutica é considerada como sendo uma dosagem eficaz. Monitoramento de indivíduo
O estado da doença ou tratamento de um indivíduo tendo pré- eclampsia, eclampsia ou uma pré-disposição a tal condição pode ser monito- rado usando os métodos diagnósticos, kits e composições da invenção. Por exemplo, a expressão de um polipeptídeo de endoglina solúvel da presente invenção em um fluido corporal, tal como sangue, soro, urina, plasma, fluido amniótico ou CSF, pode ser monitorada. O monitoramento de endoglina so- lúvel pode ser combinado com métodos para monitoramento da expressão de um polipeptídeo ou ácido nucleico de sFlt-1, VEGF ou PIGF, TGF-β ou eNOS ou PGI2. Tal monitoramento pode ser útil, por exemplo, na avaliação da eficácia de um fármaco em particular em um indivíduo ou na avaliação de progressão da doença. Produtos terapêuticos que diminuem a expressão ou atividade biológica de uma molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo de endoglina solúvel são tomados como particularmente úteis na invenção.
Ensaios de Seleção
Conforme discutido acima, o nível de um ácido nucleico ou poli- peptídeo de endoglina solúvel é aumentado em um indivíduo tendo pré- eclampsia, eclampsia ou uma pré-disposição a tais condições. Baseado nessas descobertas, composições da invenção são úteis para a seleção em baixo custo e elevado rendimento de compostos candidatos para identificar aqueles que modulam a expressão de um polipeptídeo ou molécula de ácido nucleico de endoglina solúvel cuja expressão é alterada em um indivíduo tendo pré-eclampsia ou eclampsia.
Qualquer um de uma série de métodos estão disponíveis para realização de ensaios de seleção para identificar novos compostos candida- tos que alteram a expressão de uma molécula de ácido nucleico de endogli- na solúvel. Exemplos são descritos em detalhes na Publicação de Pedido de Patente U.S. N9 20060067937 e Publicação PCT N5 WO 06/034507.
Em um exemplo de trabalho, compostos candidatos podem ser selecionados com relação àqueles que se ligam especificamente a um poli- peptídeo de endoglina solúvel. A eficácia de tal composto candidato é de- pendente de sua capacidade de interagir com tal polipeptídeo ou um equiva- lente funcional do mesmo. Tal interação pode ser prontamente ensaiada u- sando qualquer um de uma série de técnicas de ligação e ensaios funcionais padrões, tais como imunoensaios ou ensaios baseados em cromatografia por afinidade (por exemplo, aqueles descritos em Ausubel e colaboradores, supra). Em uma modalidade, um polipeptídeo de endoglina solúvel é imobili- zado e compostos são testados com relação à capacidade de se ligar à en- doglina solúvel imobilizada usando ensaios padrões baseados em cromato- grafia por afinidade. Compostos que se ligam à endoglina solúvel imobilizada podem, então, ser eluídos e purificados e ainda testados com relação à sua capacidade de se ligar à endoglina solúvel in vitro e in vivo ou sua capacida- de de inibir a atividade biológica da endoglina solúvel.
Em outro exemplo, um composto candidato é testado com rela- ção à sua capacidade de diminuir a atividade biológica de um polipeptídeo de endoglina solúvel através de diminuição da ligação de um polipeptídeo de endoglina solúvel e um fator de crescimento, tal como TGF-β1, TGF-p3, ac- tivina-A, BMP-2 e BMP-7. Esses ensaios podem ser realizados in vivo ou in vitro e a atividade biológica do polipeptídeo de endoglina solúvel pode ser ensaiada usando qualquer um dos ensaios para qualquer uma das ativida- des de endoglina solúvel conhecidos na técnica ou descritos aqui. Por e- xemplo, células podem ser incubadas com uma estrutura repórter Smad2/3- dependente. Se desejado, as células também podem ser incubadas na pre- sença de TGF-β para intensificar o sinal da estrutura repórter Smad2/3- dependente. As células podem, então, ser incubadas na presença de endo- glina solúvel, a qual reduzirá ou inibirá a ativação TGF-p-induzida da estrutu- ra repórter Smad2/3-dependente. Compostos candidatos podem ser adicio- nados à célula e qualquer composto que resulta em um aumento de ativação TGF-p-induzida do repórter Smad2/3-dependente nas células tratadas com endoglina solúvel quando comparado com células não tratadas com o com- posto é considerado um composto que pode ser útil para o tratamento de pré-eclampsia ou pré-eclampsia.
Em outro exemplo, a desfosforilação TGF-β-induzida de eNOS em Thr495 também pode ser usada como um ensaio para alterações na ati- vidade biológica de endoglina solúvel. Nesse exemplo, as células são incu- badas na presença de endoglina solúvel a qual, conforme mostrado nos ex- perimentos descritos abaixo, inibe a desfosforilação de TGF-β1 de Thr495 de eNOS. Compostos candidatos são, então, adicionados às células e o es- tado de fosforilação de Thr495 é determinado. Qualquer composto que resul- ta em um aumento de ativação de desfosforilação de Thr495 TGF-β-induzida nas células tratadas com endoglina solúvel quando comparado com células não tratadas com o composto, é considerado um composto que pode ser útil para o tratamento de pré-eclampsia ou eclampsia. Exemplos
Os exemplos a seguir se destinam a ilustrar a invenção. Eles não se destinam a limitar a invenção de qualquer forma.
Exemplo 1. Níveis aumentados de mRNA e proteína endoglina em mulheres grávidas com pré-eclampsia
Em uma tentativa de identificar novos fatores secretados que exercem um papel patológico em pré-eclampsia, nós realizamos caracteriza- ção de perfil de expressão de gene de tecido placental de 17 mulheres grá- vidas com pré-eclampsia e 13 mulheres grávidas normais usando lascas de microarranjo Affymetrix U95A. Descobriu-se que o gene para endoglina era super-regulado em mulheres com pré-eclampsia.
De forma a confirmar a super-regulação de endoglina em pré- eclampsia, nós realizamos Northern blots para analisar os níveis de mRNA de endoglina placental (figura 3) e análise por Western blot para medir os níveis de proteína endoglina no soro (figura 4) em mulheres grávidas pré- eclâmpticas quando comparado com mulheres grávidas normotensas. Pré- eclampsia foi definida como (1) BP sistólica > 140 e BP diastólica > 90 após 20 semanas de gestação em uma paciente anteriormente normotensa, (2) novo início de proteinúria (1+ através da tira medidora quando de urinálise ou > 300 mg de proteína em uma coleta de urina de 24 horas ou proporção de proteína/creatinina na urina > 0,3) e (3) resolução de hipertensão e prote- inúria em 12 semanas pós-parto. Pacientes com hipertensão, proteinúria ou doença renal subjacente foram excluídas. As pacientes foram divididas em pré-eclampsia branda ou grave, baseado na presença ou ausência de prote- inúria de faixa nefrótica (> 3 g de proteína quando de coleta de urina ou pro- porção de proteína/creatinina na urina maior do que 3,0). As proporções mé- dias de proteína/creatinina na urina no grupo com pré-eclampsia branda são de 0,94 ± 0,2 e, no grupo com pré-eclampsia grave, eram de 7,8 ± 2,1. As idades gestacionais médias dos vários grupos eram como segue: normal 38,8 ± 0,2 semanas, pré-eclampsia branda 34 ± 1,2 semanas, pré-eclampsia grave 31,3 ± 0,6 semanas e pré-termo 29,5 ± 2,0 semanas. Amostras pla- centais foram obtidas imediatamente após parto. Quatro amostras aleatórias foram tomadas de cada placenta, colocadas em solução de estabilização RNAlater (Ambion, Austin, TX) e armazenadas a -70°C. Isolamento de RNA foi realizado usando o Qiagen RNAeasy Maxi Kit (Qiagen, Valencia, CA).
Northern blots hibridizadas com uma sonda de 400 pares de ba- se na região de codificação da endoglina (Unigene Hs.76753) correspon- dendo à região N-terminal (gene bank #BC014271) e uma sonda 18S como um controle de normalização mostraram um aumento no mRNA de endogli- na placental (veja Knebelmann e colaboradores, Câncer fíes. 58: 226-231 (1998)). Western blots hibridizadas com um anticorpo ao amino término da endoglina mostraram um aumento nos níveis de proteína endoglina placental e materna em mulheres grávidas pré-eclâmpticas quando comparado com mulheres grávidas normotensas.
Exemplo 2. Demonstração de um polipeptídeo de endoglina solúvel nas pla- centas e soro de pacientes pré-eclâmpticas
A análise de Western blotting usada para medir os níveis de pro- teína endoglina em placentas e soro de mulheres pré-eclâmpticas sugeriu a presença de uma proteína menor (aproximadamente 63-65 kDa), que estava presente na placenta e soro de mulheres grávidas pré-eclâmpticas (figuras 4 E 30A). Nós demonstramos que esse fragmento menor é o domínio extrace- lular da endoglina. Essa versão truncada provavelmente é a forma vazada dos sincitiotrofoblastos placentais e células endoteliais e circulou em quanti- dades excessivas em pacientes com pré-eclampsia. Essa forma solúvel de endoglina pode estar atuando como um agente anti-angiogênico através de ligação a Iigantes em circulação que são necessários para saúde vascular normal.
O comprimento previsto da forma solúvel da proteína é de apro- ximadamente 437 aminoácidos (incluído a seqüência do peptídeo líder, 412 aminoácidos sem a seqüência líder). sEng foi purificada do soro de pacien- tes pré-eclâmpticas. As frações 4 e 5 da 44G4-lgG (anti-Eng) Sepharose foram passadas sobre condições de redução de SDS-PAGE e testadas atra- vés de Western blot usando um anticorpo policlonal à Eng. As frações eluí- das foram submetidas à análise por espectrometria de massa (3 operações) e os peptídeos identificados são mostrados na (figura 30B). A purificação e análise através de espectrometria de massa revelaram vários peptídeos Eng-específicos oscilando de Gly40 a Arg406, indicando uma forma solúvel (endoglina solúvel) correspondendo à região N-terminal da proteína de com- primento total em negrito sobre a seqüência da endoglina humana.
Exemplo 3. Concentrações de endoglina solúvel em circulação em mulheres com gestações normais versus pré-eclâmpticas
De forma a comparar os níveis de endoglina solúvel em circula- ção do soro de mulheres com gestação normal, brandamente pré- eclâmpticas ou gravemente pré-eclâmpticas, nós realizamos análise por E- LISA sobre amostras de sangue tomadas dessas mulheres. Todas as paci- entes para esse estudo foram recrutadas no Beth Israel Deaconess Medicai Center após obtenção de consentimentos IRB-aprovados apropriados. Pré- eclampsia foi definida como (1) BP sistólica > 140 e BP diastólica > 90 após 20 semanas de gestação em uma paciente anteriormente normotensa, (2) novo início de proteinúria (1+ através da tira medidora quando de urinálise ou > 300 mg de proteína em uma coleta de urina de 24 horas ou proporção de proteína/creatinina na urina > 0,3) e (3) resolução de hipertensão e prote- inúria em 12 semanas pós-parto. Pacientes com hipertensão, proteinúria ou doença renal de linha de base foram excluídas. Para fins desse estudo, as pacientes foram divididas em pré-eclampsia branda e grave, baseado na ausência ou presença de proteinúria de faixa nefrótica (> 3 g de proteína quando de coleta de urina de 24 horas ou proporção de proteína para creati- nina maior do que 3,0). Síndrome HELLP foi definida quando os pacientes tinham evidência de trombocitopenia (<100000 células/μl), LDH aumentado (> 600 IU/mL) e AST aumentado (> 70 IU/mL). Mulheres grávidas saudáveis foram incluídas como controles. 8 pacientes com parto pré-termo por outras razões foram incluídas como controles adicionais. Amostras de placenta fo- ram obtidas imediatamente após parto. O soro foi coletado de pacientes grá- vidas no momento de parto (0-12 horas antes de expulsão da placenta) após obtenção de consentimento por escrito. Esses experimentos foram aprova- dos pelo Institutional Review Board no Beth Israel Deaconess Medicai Cen- ter.
Usando amostras de soro de pacientes descritas na Tabela 1, nós medimos as concentrações em circulação de endoglina solúvel nos vá- rios grupos de pacientes pré-eclâmpticas e pacientes grávidas de controle.
Quando pacientes pré-eclâmpticas foram ainda subdivididas naquelas com e sem HELLP1 as concentrações de sEng foram três, cinco e dez vezes maio- res em pré-eclâmpticas com síndrome HELLP branda e grave, respectiva- mente, comparado com os controles pré-termo com idade gestacional equi- valente (figura 28). As concentrações de sEng em pacientes grávidas se cor- relacionavam com aquelas de sFItl (R2 = 0,56), exceto no grupo com HEL- LP, onde sEng era maior do que sFlt-1. Em um subconjunto de pacientes, amostras de sangue obtidas 48 horas após parto mostraram uma redução de 70% nos níveis médios de sEng em circulação em pacientes pré- eclâmpticas e com gravidez normal (figura 29). <table>table see original document page 87</column></row><table> As concentrações médias de endoglina solúvel no soro eram pelo menos duas vezes maiores em pré-eclampsia branda e 3-4 vezes maio- res em pacientes com pré-eclampsia grave. Em pacientes pré-eclâmpticas complicadas com a síndrome HELLP, a concentração de endoglina solúvel era pelo menos 5-10 vezes maior do que as amostras de controle com idade gestacional equivalente. Adicionalmente, os níveis de endoglina solúvel em pacientes grávidas se correlacionam com os níveis de sFlt-1 (figura 18). O valor R2 para correlação foi de 0,6. (Note que as concentrações de sFlt-1 em circulação reportadas aqui são pelo menos 4-5 vezes maiores do que previ- amente publicado (Maynard e colaboradores, supra). Isso é em virtude de uma diferença na sensibilidade de um novo kit ELISA da R&D Systems o qual carece de uréia no diluente de ensaio e, portanto, proporciona valores consistentemente maiores do que anteriormente publicado). Em outras pala- vras, pacientes com os maiores níveis de endoglina solúvel também tinham os maiores níveis em circulação de sFlt-1. A origem da endoglina solúvel é mais provavelmente os sincitiotrofoblastos da placenta, conforme evidencia- do pela coloração intensificada observada em nossa imunohistoquímica pla- cental (figuras 19 e 20). Essas figuras mostram que a proteína endoglina é expressa pelos sincitiotrofoblastos e é grandemente super-regulada em pré- eclampsia. Nossos dados de Western blot (figuras 21A e 21B) e a falta de variantes com estrutura alternativa detectáveis através de Northern blot sus- tentam a noção de que a endoglina solúvel provavelmente é uma forma va- zada do domínio extracelular da proteína endoglina da membrana. Ela tem um tamanho de aproximadamente 65 kDa e é produzida em níveis elevados em placentas pré-eclâmpticas e que ela circula em maiores quantidades em soro pré-eclâmptico. Essa proteína estava presente em níveis muito meno- res no soro de mulheres grávidas e raramente detectável em mulheres não grávidas. A expressão de endoglina solúvel em placenta pré-eclâmptica era quatro vezes maior do que em gravidez normal (n = 1-/grupo, P< 0,01). Quantificação de sEng/Eng nessas amostras não mostrou diferença signifi- cativa entre as placentas (0,43) e pré-eclâmptica (0,56) (η = 10/grupo, P = 0,4), sugerindo que sEng é derivada da proteína de comprimento total e que Eng e sEng são similarmente aumentadas em pré-eclampsia.
Os métodos a seguir foram usados para alguns dos experimen- tos descritos nesse exemplo.
Imunohistoquímica
Imunohistoquímica sobre amostras placentais para endoglina e actina de músculo α-liso (SMA) foi feita conforme reportado por (Leach e colaboradores, Lancet 360: 1215-1219 (2002)). Resumidamente, lâminas com seções de placenta congelada obtida de pacientes sem pré-eclampsia (n = 10) e com pré-eclampsia (n = 10) foram incubadas com uma solução de bloqueio de proteína isenta de soro (DAKO) durante 30 minutos em tempera- tura ambiente e, então, com o anticorpo primário em temperatura ambiente (anti-endoglina de camundongo monoclonal: diluição a 1:50; DAKO) durante 2 horas. As lâminas foram, então, lavadas com solução salina tamponada com fosfato durante 10 minutos. O anticorpo secundário, IgG anti-. copiar fórmula química de ovelha conjugada com Rodamina, diluição a 1:200 (Bio- meda) foi aplicado durante 1 hora. As seções foram novamente lavadas com solução salina tamponada com fosfato e subseqüentemente incubadas com uma diluição a 1:400 de SMA anti-humano de camundongo FITC-conjugado (Dako) durante 30 minutos em temperatura ambiente. A imuno-reatividade da endoglina foi revista usando um sistema de formação de imagem avan- çado SPOT (RT SLIDER Diagnostic Instruments, Inc) por um patologista que não tinha ciência do diagnóstico clínico.
ELISA e Western blots
ELISA foi realizado usando um kit ELISA comercialmente dispo- nível da R & D Systems, MN (por exemplo, Cat # DNDGOO) e conforme pre- viamente descrito (Maynard e colaboradores, J. Clin. Invest. 111: 649-658, 2003). Western blots foram realizadas essencialmente conforme descrito anteriormente (Maynard e colaboradores, supra e Kuo e colaboradores Proc. Natl. Acad. Sei. 98: 4605-4610 (2001))).
Experimentos de imunoprecipitacão (IP)
IP seguido por Western blots foram usados para identificar a ca- racterizar a endoglina solúvel em amostras de tecido placental e soro de pa- cientes com pré-eclampsia. Tecido placental humano foi lavado com PBS gelado e submetido à lise em tampão de homogeneização Tris-HCl a 10 mM, pH de 7,4; NaCl a 15 mM; KCl a 60 mM; EDTA a 1 mM; EGTA a 0,1 mM; NonidetP-40 a 0,5%; sacarose a 5%; mistura de proteína da Roche (In- dianápolis, IN) durante 10 minutos. Lisatos placentais foram, então, submeti- dos à imunoprecipitação com um anticorpo de endoglina de camundongo monoclonal anti-humano (mAb P4A4, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Colunas de imunoafinidade foram preparadas através do acopla- mento direcional de 3-5 mg do anticorpo purificado a 2 ml de proteína A- Sepharose usando um kit de orientação de IgG imunopura (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As colunas foram, então, lavadas extensivamente com tampão RIPA contendo mistura de protease e as proteínas ligadas foram eluídas com 0,1 mol/L de tampão de glicina-HCI, pH de 2,8. O eluente foi coletado em frações de 0,5 ml contendo 1 mol/L de tampão de Tris-HCl. As frações contendo proteína foram empoçadas e concentradas 9 a 10 vezes com um CENTRICON Cen- trifugai Concentrator (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, EUA). As a- mostras imunoprecipitadas foram separadas sobre um gel com gradiente de 4-12% (Invitrogen) e as proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF). A proteína endoglina foi detectada atra- vés de Western blots usando anticorpo primário de endoglina de coelho anti- humano policlonal (H-300, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Purificação de endoglina solúvel e análise através de espectrometria de massa
Soro (10 ml) de pacientes pré-eclâmpticas foi seqüencialmente aplicado sobre CM Affi-gel Blue e colunas de proteína A-Sepharose (Bio- Rad) para remover a albumina e imunoglobulinas, respectivamente. O nível sérico foi lentamente aplicado a uma coluna de 2,5 ml de IgG de mAb 44G4 à Eng humana, conjugado à Sepharose (Gougos e colaboradores, Int. Im- muno. 4: 83-92, (1992)). As frações ligadas foram eluídas com dietilamina a 0,02M, pH de 11,4 e imediatamente neutralizadas com Tris a 1M, pH de 7,8. As frações 4 e 5 com absorbância elevada a 280 nm foram empoçadas, re- duzidas com DTT a 10 mM durante 1 h a 57°C e alquiladas com iodoaceta- mida a 0,055 M. As amostras foram, então, completamente digeridas com tripsina (1:100). A amostra Iiofilizada foi resuspensa em ácido trifluoroacético a 0,1% e injetada em um instrumento de HPLC CapLC (Waters). Os peptí- deos foram separados usando uma coluna da Série Nano de 75 μm (LC Packings) e analisados usando um sistema de MS/MS Qstar XL. Os dados foram pesquisados usando a ferramenta de busca Mascot (Matrix Science) contra o banco de dados de proteína humana NCBInr.
Exemplo 4. Ensaio modelo para anqiogênese
Um ensaio de tubo endotelial pode ser usado como um modelo in vitro de angiogênese. Matrigel induzida por fator de crescimento (7 mg/mL, Collaborative Biomedical Produtos, Bedford, MA) é colocada em ca- vidades (100 μl/cavidade) de uma lâmina de cultura de células com 48 cavi- dades pré-resfriada e é incubada a 37°C durante 25-30 minutos para permi- tir polimerização. Células endoteliais de veia umbilical humana (30.000 + em 300 μl de meio basal endotelial sem soro, Clonetics, Walkersville, MD) nas passagens 3-5 são tratadas com soro da paciente a 10%, colocadas sobre as cavidades revestidas com Matrigel e são incubadas a 37°C durante 12- 16 horas. A formação de tubo é, então, avaliada através de um microscópio de contraste de fase invertido a 4X (Nikon Corporation, Tóquio, Japão) e é analisada (área do tubo e comprimento total) usando o software de análise de imagem Simple PCI.
Exemplo 5. Níveis de proteína endoqlina solúvel como um indicador diagnós- tico de pré-eclampsia e eclampsia em mulheres (estudo de Romero)
Esse estudo foi projetado para avaliar se a endoglina solúvel é alterada durante pré-eclampsia clínica e se ela pode ser usada para prever pré-eclampsia e eclampsia em mulheres.
Esse estudo foi feito sob a colaboração do Dr. Roberto Romero, na Wayne State University/NICHD Perinatology Branch, Detroit, MI. Um es- tudo de controle de caso longitudinal retrospectivo foi conduzido usando um banco de dados de amostra biológica agrupado, conforme previamente des- crito em Chaiworapongsa e colaboradores (The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine, Janeiro de 2005, 17 (1): 3-18). Todas as mulheres foram arroladas na clínica pré-natal no Sotero dei Rio Hospital, Santiago, Chile e acompanhadas até o parto. Visitas pré-natal foram esquematizadas em intervalos de 4 semanas nos primeiro e segundo trimestres e a cada du- as semanas no terceiro trimestre até o parto. Amostras de plasma foram se- lecionadas de cada paciente apenas uma vez para cada um dos seis interva- los a seguir: (1) 7-16 semanas, (2) 16-24 semanas, (3) 24-28 semanas, (4) 28-32 semanas, (5) 32-37 semanas e (6) >37 semanas de gestação. Para cada caso pré-eclâmptico, um controle foi selecionado com equivalência pa- ra a idade gestacional (+/- 2 semanas) no momento de diagnóstico clínico de pré-eclampsia. Os critérios clínicos para o diagnóstico de pré-eclampsia fo- ram os mesmos conforme previamente descrito em Chaiworapongsa e cola- boradores, supra.
Medição dos níveis de endoglina no plasma
As amostras de plasma armazenadas a-70 0C foram desconge- ladas e os níveis de endoglina solúvel no plasma foram medidos em um lote usando os kits ELISA comercialmente disponíveis da R&D systems, Minnea- polis, MN.(Catálogo # DNDGOO).
Análise estatística
Análise de covariância foi usada para avaliar a diferença nas concentrações no plasma de endoglina solúvel entre pacientes destinadas a desenvolver pré-eclampsia e em gravidez normal após ajuste para a idade gestacional na amostragem de sangue e intervalos de armazenamento de amostra. Testes exatos de Fisher ou Chi-quadrado foram empregados para comparações de proporções. O pacote de estatística usado foi SPSS V.12 (SPSS Inc., Chicago, IL). Significância foi admitida para um ρ valor de me- nos de 0,05. Resultados
As características clínicas da população de estudo são descritas na Tabela 2. O grupo com pré-eclampsia incluía mais mulheres nulíparas e que tiveram um parto antes do grupo de controle. De modo importante, os pesos dos fetos ao nascer eram menores no grupo pré-eclâmptico e havia uma maior proporção de mulheres trazendo bebês pequenos para a idade gestacional (SGA).
<table>table see original document page 93</column></row><table>
Valor expresso como a media ± sd ou numero (percentual) GA: idade gestacional
As características clínicas de pacientes com pré-eclampsia são descritas na Tabela 3. Trinta e duas (72%) das pacientes tinham pré-eclampsia grave, enquanto que 10 pacientes tinham pré-eclampsia de início precoce, confor- me definido como início a <34 semanas.
Tabela. Características clínicas de pacientes com pré-eclampsia
<table>table see original document page 93</column></row><table>
Valor expresso como a média ± sd ou número (percentual) α (n = 26);β (η = 42) Os níveis de endoglina solúvel no soro nas mulheres de controle e pré-eclâmpticas medidos nas janelas gestacionais de 6 semanas são mos- trados na Tabela 4. Dentre as pré-eclâmpticas, suas amostras foram dividi- das em dois grupos - pré-eclampsia clínica (amostras tomadas no momento dos sintomas de pré-eclampsia) e pré-eclampsia pré-clínica (amostras toma- das antes dos sintomas clínicos). Os dados mostram que, no meio da gravi- dez (24-28 semanas de gestação), as concentrações de endoglina solúvel no soro começam a se elevar em mulheres destinadas a desenvolver pré- eclampsia e se tornam pelo menos 3 vezes maiores do que nos controles em 28-32 semanas de gestação. Amostras de sangue tomadas de mulheres com pré-eclampsia mostram uma elevação muito dramática (aproximada- mente 10-15 vezes) quando comparado com os controles com idade gesta- cional equivalentes. <table>table see original document page 95</column></row><table> <table>table see original document page 96</column></row><table> Para examinar a relação entre as concentrações de endoglina solúvel no plasma e o intervalo para diagnóstico clínico de pré-eclampsia, amostras de plasma de pacientes pré-eclâmpticas em diferentes idades ges- tacionais foram estratificadas de acordo com o intervalo da amostragem de sangue até o diagnóstico clínico em cinco grupos: (1) quando de diagnóstico clínico, (2) 2-5,9 semanas antes de manifestação clínica, (3) 6-10,9 semanas antes de manifestação clínica, (4) 11-15,9 semanas antes de manifestação clínica e (5) 16-25 semanas antes de manifestação clínica. Os dados mos- trados na Tabela 5 demonstram que os níveis de endoglina solúvel no plas- ma começam a surgir a 6-10,9 semanas antes de início dos sintomas em pré-eclâmpticas e são pelo menos 3 vezes maiores s 2-5,9 semanas antes dos sintomas em mulheres destinadas a desenvolver pré-eclampsia. Tabela 5. Concentracoes de endoglina soluvel no plasma em mulleres com gravidez normal e pre-eclamptica
<table>table see original document page 98</column></row><table> <table>table see original document page 99</column></row><table> Para examinar o potencial diagnóstico das concentrações de endoglina solúvel no plasma a fim de identificar aquelas destinadas a desen- volver pré-eclampsia, as pacientes foram estratificadas em pré-eclampsia de início precoce (PE < 34 semanas) e pré-eclampsia de início tardio (PE > 34 semanas). Para pacientes com pré-eclampsia de início precoce, os níveis médios de endoglina solúvel no plasma eram significativamente maiores em pré-eclampsia (antes de diagnóstico clínico) do que em gravidez normal, começando em torno de 16-24 semanas de gestação (Tabela 6), com muito pouca diferença em janelas gestacionais de 24-28 semanas e 28-32 sema- nas. Em contraste, para pacientes com pré-eclampsia de início tardio, as concentrações de endoglina solúvel no plasma em pré-eclampsia pré-clínica eram significativamente maiores do que em gravidez normal apenas a 28-32 semanas, com muito pouca diferença a 32-36 semanas de gestação (Tabela 7). <table>table see original document page 101</column></row><table> <table>table see original document page 102</column></row><table> <table>table see original document page 103</column></row><table> <table>table see original document page 104</column></row><table> Sumário
Os resultados desses experimentos demonstram que mulheres com pré-eclampsia clínica têm níveis muito altos de endoglina solúvel em circulação quando comparado com controles com idade gestacional equiva- lente. Os resultados também demonstram que mulheres destinadas a de- senvolver pré-eclampsia (pré-eclampsia pré-clínica) têm maiores níveis de endoglina solúvel no plasma do que aquelas que são previstas como tendo uma gravidez normal. O aumento nos níveis de endoglina solúvel é detectá- vel pelo menos 6-10 semanas antes do início de sintomas clínicos. Final- mente, esses resultados demonstram que pré-eclampsia de início precoce e de início tardio tem concentrações de endoglina solúvel em circulação ele- vadas, mas as alterações são mais dramáticas na pré-eclampsia de início precoce.
Exemplo 6. Níveis de proteína endoglina solúvel como um indicador diagnós- tico de pré-eclampsia e eclampsia em mulheres (estudo CPEP).
Conforme descrito acima, descobriu-se que a endoglina solúvel, um receptor na superfície celular para a proteína pró-angiogênica TGF-β e expressa sobre o endotelio e sincitiotrofoblastos, é super-regulada em placentas pré-eclâmpticas. Nos experimentos descritos acima, nós mostramos que, em pré-eclampsia, endoglina solúvel em excesso é liberada da placenta na circulação através de vazamento do domínio extracelular; endoglina solúvel pode, então, atuar sinergisticamente com o sFlt-1, um fator anti-angiogênico o qual se liga ao fator de crescimento placental (PIGF) e VEGF para causar disfunção endotelial. Para testar essa hipótese, nós comparamos as concentrações no soro de endoglina solúvel, sFlt-1 e PIGF livre por toda a gravidez em mulheres que desenvolveram pré-eclampsia e naquelas mulheres com outras complicações da gravidez, tal como hipertensão gestacional (GH) e gestações complicadas por bebês pequenos para a idade gestacional (SGA) com aquelas de mulheres com gestações de conrole normotensas. Esse estudo foi feito em colaboração com o Dr. Richard Levine no NIH.
Existiam dois objetivos principais nesse estudo. O primeiro obje- tivo foi determinar se, em comparação com controles normotensos, concen- trações elevadas no soro de endoglina solúvel, sFlt-1 e níveis reduzidos de PIGF podem ser detectados antes de início de pré-eclampsia e outros dis- túrbios gestacionais, tais como hipertensão gestacional ou gestações com- plicadas por bebês pequenos para a idade gestacional (SGA). O segundo objetivo foi descrever o curso de tempo de concentrações no soro materno de endoglina solúvel, sFlt-1 e PIGF livre com relação à idade gestacional em mulheres com pré-eclampsia, hipertensão gestacional ou SGA com exame separado de amostras obtidas antes e após início de sintomas clínicos e em controles normotensos.
Métodos
Informação clínica
Esse estudo foi um estudo de controle de caso de complicações da gravidez (pré-eclampsia prematura, pré-eclampsia a termo, hipertensão gestacional, gestações com bebês SGA, gestações de controle normoten- sas) agrupados dentro do grupo de 4.589 mulheres nulíparas saudáveis que participaram do experimento Calcium for Pré-eclampsia Prevention (CPEP). 120 casos aleatórios foram selecionados de cada um dos grupos de estudo. Os métodos de estudo eram idênticos ao estudo de controle de caso agru- pado recentemente realizado para pré-eclampsia (Levine e colaboradores, N. Eng. J. Med. 2004, 350: 672-83). De cada mulher, amostras de sangue foram obtidas antes de arrolamento no estudo (13-21 semanas), a 26-29 semanas, a 36 semanas e quando de suspeita de hipertensão ou proteinú- ria. Todas as amostras de soro coletadas a qualquer momento durante a gravidez antes de início de trabalho de parto e parto eram elegíveis para o estudo. Os casos incluíam 120 mulheres que desenvolveram pré-eclampsia a termo, hipertensão gestacional ou SGA e que tiveram um bebê vivo ou bebê masculino natimorto sem anormalidades cromossômicas ou estruturais conhecidas e das quais uma amostra de soro de linha de base foi obtida.
Para pré-eclampsia prematura, definida como (PE < 37 semanas), todas as 72 pacientes do grupo CPEP foram estudadas. O critério clínico para o diag- nóstico de pré-eclampsia é descrito em Levine e colaboradores, (2004), su- pra. Foi requerido que todos os casos de hipertensão gestacional tivesse uma medição normal de proteína na urina dentro do intervalo de 1 dia antes de hipertensão gestacional até os 7 dias seguintes. SGA foi definido como <10° e <5° (SGA grave) percentile, usando as tabelas de Zhang & Bowes de peso ao nascer para a idade gestacional, específico para a raça, nuliparidade e sexo do bebê. Controles foram aleatoriamente selecionados de mulheres sem pré-eclampsia ou hipertensão gestacional ou SGA que tiveram um bebê vivo ou natimorto sem má formações estruturais ou anormalidades cromossomicas conhecidas e em idade gestacional equivalente, um controle para um caso, pelo centro clínico, na coleta da primeira amostra de soro (± 1 semana), pelo tempo de armazenamento no congelador (± 1 ano) e pelo número de congelamentos-descongelamentos. Um total de 1674 amostras de soro foi estudado. Equivalência pela idade gestacional foi feita para controlar as diferenças relacionadas à idade gestacional nos níveis de sFlt-1, VEGF e PIGF. Equivalência pelo tempo de armazenamento no congelador foi feita para controlar o fato de que as taxas de pré-eclampsia diferiam significativamente entre os centros, talvez em virtude de diferenças na patofisiologia da doença. Além disso, os centros podem ter usado procedimentos ligeiramente diferentes para coleta, preparo e armazenamento das amostras. Equivalência pelo número de descongelamentos também foi realizada para assegurar que os casos e controles tinham sido igualmente submetidos à degradação por congelamento/descongelamento.
Medições por ELISA
ELISA para os vários marcadores angiogênicos foi realizado no laboratório Karumanchi por um único assistente de pesquisa que não tinha ciência das conseqüências clínicas.
Kits ELISA comercialmente disponíveis para endoglina solúvel (DNDG00), sFItl (DVR100), PIGF (DPG00) foram obtidos da R&D systems, (Minneapolis, MN).
Análise estatística
T-teste foi usado para a comparação das várias medições após transformação tic logarítmica para determinar a significância. P< 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
As concentrações médias de endoglina solúvel (figura 6), sFIt1 (figura 7) e PIGF (figura 8) para os cinco diferentes grupos de estudo de mu- lheres grávidas por toda a gravidez durante as várias janelas de grupo de idade gestacional, conforme descrito nos métodos, são mostradas as figuras 6-8. Para os grupos com pré-eclampsia e grupos com hipertensão gestacio- nal, amostras tomadas após o início dos sintomas clínicos não são mostra- das aqui. Comparado com amostras de controle com idade gestacional equi- valente, endoglina solúvel e sFlt-1 aumentaram e PIGF livre diminuiu, come- çando 9-11 semanas antes de pré-eclampsia pré-termo, atingindo níveis 5 vezes (46,4 vs 9,8 ng/ml, P< 0,0001) e 3 vezes maiores (6356 vs 2316 pg/ml, P< 0,0001) e 4 vezes maiores (144 vs 546 pg/ml, P< 0,0001), respectivamente, após início de pré-eclampsia. Para pré-eclampsia a termo, a endoglina solúvel aumentou começando 12-14 semanas, PIGF livre dimi- nuiu começando 9-11 semanas e sFlt-1 aumento <5 semanas antes de início de pré-eclampsia. As concentrações no soro de sFlt-1 e PIGF livre não dife- rem significativamente entre as gestações com SGA ou a média para bebês em idade gestacional/grande para a idade gestacional (AGA/LGA) de 10-42 semanas de gestação. A endoglina solúvel no soro estava modestamente aumentada em gestações com SGA, começando a 17-20 semanas (7,2 vs 5,8 ng/ml, P = 0,03), atingindo concentrações de 15,7 e 43,7 ng/ml a 37-42 semanas para SGA brando e grave, respectivamente, quando comparado com 12,9 ng/ml em gestações com AGA/LGA (SGA grave vs AGA/LGA, P = 0,002). No estudo de hipertensão gestacional, comparado com amostras de controle com GA equivalente, aumentos modestos na endoglina solúvel fo- ram evidentes < 1-5 semanas antes de hipertensão gestacional, atingindo níveis 2 vezes maiores para endoglina solúvel (29,7 vs 12,5 ng/ml, P = 0,002) após início de hipertensão gestacional. A proporção de possibilidades ajustada para subsequente PE pré-termo para amostras obtidas a 21-32 semanas, as quais estavam no quartile mais alto, das concentrações de endoglina solúvel de controle (>7,2 ng/ml), quando comparado com todos os outros quartiles, foi de 9,8 (Cl de 95% de 4,5-21,5).
O índice anti-angiogênico de endoglina solúvel para pré- eclampsia foi definido como (sFlt-1 + 0,25 endoglina solúvel)/PIGF. O índice foi calculado através dos vários grupos de idade gestacional para os cinco diferentes grupos de estudo. O índice anti-angiogênico de endoglina solúvel para eclampsia para amostras tomadas antes dos sintomas clínicos é mos- trado na figura 9. Valores elevados para o índice anti-angiogênico de endo- glina solúvel foram observados tão cedo quanto 17-20 semanas de gestação e parecem ser mais dramáticos com avanço da gestação em pré-eclampsia prematura grave. Em pré-eclampsia a termo, SGA e GH1 houve uma eleva- ção modesta durante o final da gravidez (33-36 semanas) quando compara- do com mulheres de controle.
As figuras 10 e 11 representam as concentrações médias de endoglina solúvel (figura 10) e índice anti-angiogênico de endoglina solúvel (figura 11) de acordo com o número de semanas antes de pré-eclampsia prematura clínica (PE <37 semanas). Mesmo no início de 9-11 semanas an- tes do surgimento de pré-eclampsia prematura, havia uma elevação de 2-3 vezes na endoglina solúvel e no índice anti-angiogênico de endoglina solúvel em mulheres destinadas a desenvolver pré-eclampsia, com elevações dra- máticas (>5 vezes) em 1-5 semanas que precedem os sintomas clínicos.
As figuras 12 e 13 mostram a alteração na endoglina solúvel (fi- gura 12) e no índice anti-angiogênico de endoglina solúvel (figura 13) no de- correr da gravidez para pré-eclampsia a termo (PE>37 semanas) antes e após os sintomas. Elevação na endoglina solúvel e no índice anti- angiogênico de endoglina solúvel são observadas começando a 33-36 se- manas de gravidez, atingindo em média níveis 2 vezes maiores no momento de pré-eclampsia clínica.
As figuras 14 e 15 mostram uma elevação modesta na endoglina solúvel (figura 14) e no índice anti-angiogênico de endoglina solúvel (figura 15) detectada em mulheres durante hipertensão gestacional e 1-5 semanas que precedem a hipertensão gestacional (durante as 33-36 semanas de gra- videz) quando comparado com controles normotensos.
As figuras 16 e 17 mostram elevações modestas na endoglina solúvel (figura 16) e no índice anti-angiogênico de endoglina solúvel (figura 17) detectadas durante as janelas gestacionais de 33-36 semanas em mu- lheres com SGA grave e não em mulheres com SGA quando comparado com gestações de controle.
Sumário
Os resultados desse estudo mostram que os níveis de endoglina solúvel e os níveis do índice anti-angiogênico de endoglina solúvel, quando medidos antes de 33 semanas de gravidez, estavam dramaticamente eleva- dos em mulheres destinadas a desenvolver pré-eclampsia prematura e em mulheres com pré-eclampsia prematura clínica (PE < 37 semanas) quando comparado com a gravidez de controle normal. Portanto, os níveis de endo- glina solúvel e os níveis do índice anti-angiogênico de endoglina solúvel (an- tes de 33 semanas) podem não apenas ser usados para o diagnóstico de pré-eclampsia prematura, mas também para a previsão de pré-eclampsia. Parece que elevações nos níveis de endoglina solúvel e nos níveis do índice anti-angiogênico de endoglina solúvel começam tão cedo quanto 10-12 se- manas antes dos sintomas de pré-eclampsia.
Os níveis de endoglina solúvel e os níveis do índice anti- angiogênico de endoglina solúvel também estavam significativamente eleva- dos em pré-eclampsia a termo (PE > 37 semanas) e modestamente eleva- dos em hipertensão gestacional e SGA grave quando medidos posteriormen- te na gravidez (janelas gestacionais de 33-36 semanas). Portanto, os níveis de endoglina solúvel e os níveis de índice anti-angiogênico de endoglina so- lúvel podem também ser usados para identificar outras complicações da gravidez, tais como SGA e hipertensão gestacional, quando medidos após 33 semanas de gravidez.
Exemplo 7. Envolvimento de endoglina solúvel na patogênese de pré- eclampsia
Mostra-se que a endoglina, um receptor na superfície celular para a proteína pró-angiogênica TGF-β e expressa sobre o endotélio e sinci- tiotrofoblastos, é super-reguiada em placentas pré-eclâmpticas. Mostra-se que, em pré-eclampsia, endoglina solúvel em excesso é liberada da placenta na circulação através de vazamento do domínio extracelular. Os experimen- tos descritos abaixo foram projetados para testar a hipótese de que a endo- glina solúvel pode ter uma sinergia com o sFlt-1, um fator anti-angiogênico o qual se liga ao fator de crescimento placental (PIGF) e ao VEGF, para cau- sar disfunção endotelial.
Materiais e Métodos
Reaaentes
Endoglina humana recombinante, sFIt1 humano, endoglina de camundongo, sFlt-1 de camundongo, TGF-β1 humano, TGF-P3 humano, VEGF de camundongo foram obtidos da R&D systems (Minneapolis, MN). Anticorpo monoclonal de camundongo (catálogo # sc 20072) e anticorpo po- liclonal (sc 20632) contra a região N-terminal da endoglina humana foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology, Inc. Kits ELISA para sFlt-1 humano, sFlt-1 de camundongo e endoglina solúvel humana foram obtidos da R&D systems, MN.
Geração de adenovírus
Adenovírus contra sFItl e adenovírus de controle (CMV) foram anteriormente descritos (Maynard e colaboradores, J. Clin. Invest. 111: 649: 658 (2003)) e foram gerados na unidade Harvard Medical Core em colabora- ção com o Dr. Richard Mulligan. Para criar o adenovírus de endoglina solú- vel, usa-se o kit Adeasy (Stratagene). Resumidamente, endoglina solúvel humana (que codifica a região extracelular toda da proteína endoglina) foi amplificada por PCR usando um clone de endoglina de comprimento total de cDNA humano (Invitrogen, CA) como o template e os seguintes oligonucleo- tídeos como primers: dianteiro 5'-ACG AAG CTT GAA ACA GTC CAT TGT GAC CTT-3' (SEQ ID N5: 3) e reverso 5'TTA GAT ATC TGG CCT TTG CTT GTG CAA CC-3' (SEQ ID N9: 4). Os fragmentos amplificados por PCR foram inicialmente subclonados no pSecTag2-B (Invitrogen, CA) e a seqüência de DNA foi confirmada. Uma estrutura de expressão de mamífero que codifica a endoglina solúvel humana His-tagged foi amplificada por PCR usando endo- glina solúvel- pSecTag2 B como o padrão e subclonada no vetor pShuttle- CMV (Stratagene; sítios Kpnl e Sca1), um vetor de transferência de adeno- vírus, para geração de adenovírus. Endoglina solúvel expressando adenoví- rus (sE) foi, então, gerada usando o protocolo padrão conforme as instru- ções do fabricante e confirmada com relação à expressão através de Wes- tern blotting. O clone confirmado foi, então, amplificado sobre células 293 e purificado sobre um gradiente de densidade de CsCfe, conforme previamente descrito (Kuo e colaboradores, Proc. NatL Acad. Sei. USA 98: 4605-4610 (2001)). A titulação dos produtos finais foi feita através de um método de absorbância óptica (Sweeney e colaboradores, Virology, 2002, 295: 284- 288). A titulação é expressa como unidades de formação de placa (pfu)/mL, baseado em uma fórmula derivada de preps de vírus anteriores que foram titulados usando o kit de ensaio de titulação baseado em diluição de placa padrão (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, Cat. N5 K1653-1) e o mé- 15 todo de absorbância óptica.
Western blots
Western blots foram usadas para verificar a expressão de trans- genes adenovírus-infectados no plasma de rato, conforme descrito em al- gum lugar aqui (Maynard e colaboradores, supra).
Experimentos de imunoprecipitacão (IP)
IP, seguido por Western blots, foram usados para identificar e caracterizar endoglina solúvel no tecido placental e amostras de soro de pa- cientes com pré-eclampsia. Tecido placental humano foi lavado com PBS gelado e submetidos à Iise em tampão de homogeneização Tris-HCI a 10 mM, pH de 7,4; NaCI a 15 mM; KCI a 60 mM; EDTA a 1 mM; EGTA a 0,1 mM; Nonidet P-40 a 0,5%; sacarose a 5%; mistura de protease da Roche (Indianápolis, IN) durante 10 minutos. Os Iisatos placentais foram, então, submetidos à imunoprecipitação com um anticorpo de endoglina de camun- dongo monoclonal anti-humano (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Colunas de imunoafinidade foram preparadas através do acoplamento direcional de 3-5 mg de anticorpo purificado a 2 ml de proteína A-Sepharose usando um kit de orientação de IgG imunopura (Pierce Chemical Co., Rock- ford, Illinois, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As colunas foram, então, extensivamente lavadas com tampão RIPA contendo mistura de protease e as proteínas ligadas foram eluídas com 0,1 mol/L de tampão de glicina-HCl, pH de 2,8. O eluente foi coletado em frações de 0,5 ml con- tendo 1 mol/L de tampão de Tris-HCl. As frações contendo proteína foram empoladas e concentradas 9 a 10 vezes com CENTRICON Centrifugai Con- centrator (Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, EUA). As amostras imu- noprecipitadas foram separadas sobre um gel com gradiente de 4-12% (Invi- trogen) e as proteínas foram transferidas para membranas de difIuoreto de polivinilideno (PVDF). A proteína endoglina foi detectada através de Western blots usando anticorpo policlonal de coelho à endoglina humana (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA).
Ensaio de Tubo Endotelial
Matrigel reduzida com fator de crescimento (7 mg/mL, Collabora- tive Biomedical Produtos, Bedford, MA) foi colocada em cavidades (1001/cavidade) de uma lâmina de cultura de células com 48 cavidades pré- resfriada e incubada a 37°C durante 30 minutos para permitir polimerização. Células HUVEC (30.000 + em 300 μl de meio basal endotelial sem nenhum soro, Clonetics, Walkersville, MD) foram tratadas com várias combinações de proteína recombinante (endoglina solúvel, sFlt-1 ou ambos) e colocadas sobre as lâminas revestidas com Matrigel a 37°C durante 12-16 horas. A formação de tubo foi, então, avaliada através de um microscópio de contras- te de fase invertida a 4X (Nikon Corporation, Tóquio, Japão) e quantitativa- mente analisada (área do tubo e comprimento total) usando o software de análise de imagem Simple PCl.
Experimentos de permeabilidade microvascular
Camundongos Balb-C foram injetados através do plexo venoso retro-orbital com 1x 10^8 pfu de adenovírus expressando GFP ou endoglina solúvel ou sFIt1 ou combinações e o ensaio de permeabilidade microvascu- lar foi realizado 48 horas depois. Os camundongos foram anestesiados atra- vés de injeção IP de 0,5 de Avertin. 100 ml de corante azul de Evans a 1% (em PBS) foram injetados na veia caudal. 40 minutos depois, os camundon- gos foram perfundidos, via punção cardíaca, com PBS contendo EDTA a 2 mM durante 20 minutos. Os órgãos (cérebro, pulmão, fígado, rim) foram co- letados e incubados em formamida durante 3 dias para eluir o corante azul de Evans. A OD da solução de formamida foi medida usando um compri- mento de onda de 620 nm.
Experimentos de reatividade microvascular renal
Experimentos de reatividade microvascular foram feitos confor- me descrito anteriormente (Maynard e colaboradores, supra) usando micro- vasos renais de rato (diâmetro interno de 70-170 pm). Em todos os grupos experimentais, as respostas de relaxamento dos microvasos renais foram examinadas após pré-contração dos microvasos com U46619 (agonista de tromboxano) para 40-60% de seu diâmetro de linha de base em uma pres- são de estiramento de 40 mmHg. Uma vez que o tônus em estado uniforme tinha sido atingido, as respostas a vários reagentes, tais como TGF-βΙ ou TGF-P3 ou VEGF foram examinadas em uma ordem padronizada. Todos os fármacos foram aplicados extraluminalmente.
Modelos animais
Ratos Sprague-Dawley prenhes e não-prenhes foram injetados com 2 χ 109 pfu de adenovírus (Ad CMV ou Ad sFItl ou Ad sE ou Ad sFItl +Ad sE) através de injeções na veia caudal. Ratos prenhes foram injetados nos dias 8-9 de gravidez (início do segundo trimestre) e a pressão sangüí- nea medida nos dias 16-17 de gravidez (início do terceiro trimestre). As pressões sangüíneas foram medidas nos ratos após anestesia com pento- barbital sódico (60 mg/kg, i.p.). A artéria carótida foi isolada e uma cânula inserida com um cateter com microponta de alta fidelidade 3-Fr conectado a um transdutor de pressão (Millar Instruments, Houston, TX). A pressão san- güínea foi registrada e a média calculada durante um período de 10 minutos. Amostras de sangue, tecido e urina foram, então, obtidas antes de eutaná- sia. Os níveis no plasma foram medidos no dia de medição da pressão san- guínea (dia 8 após injeção dos adenovírus), reconhecendo que 7-10 dias após injeção adenoviral corresponde ao nível de pico de expressão dessas proteínas. Os níveis de sFlt-1 e endoglina solúvel em circulação foram con- firmados inicialmente através de Western blotting e, então, quantificados u- sando kits ELISA para murino comercialmente disponíveis (R & D Systems, Minneapolis, MN). A albumina na urina foi medida através de uma tira medi- dora padrão e quantificada através de um imunoensaio enzima-ligado com- petitivo usando um kit ELISA para albumina de rato comercialmente disponí- vel (Nephrat kit, Exocell Inc1 Filadélfia, PA). A creatinina na urina foi medida através de um kit de procedimento colorimétrico com ácido pícrico (Metra Creatinine Assay Kit, Quidel Corp, San Diego, CA). AST e LDH foram medi- dos usando kits comercialmente disponíveis (Thermo Electron, Louisville, CO). A contagem de plaquetas de sangue de rato foi medida usando um hemocitômetro automático (Hemavet 850, Drew Scientific Inc, Oxford, CT). Um esfregaço periférico do sangue com corante de Wright foi realizado para a detecção de esquistocistos no sangue em circulação. Após a medição da pressão sangüínea e coleta de espécimes, os ratos foram sacrificados e os órgãos coletados para histologia. O filhote foi contado e placentas e fetos individuais pesados. Os rins coletados foram colocados em solução de Bou- in, incrustados em parafina, seccionados e corados com corante de tricroma de Masson, H&E ou PAS.
Comparações estatísticas
Os resultados são apresentados como a média ± erro padrão da média (SEM) e comparações entre múltiplos grupo foram feitas através de análise de variância usando ANOVA. Diferenças significativas são reporta- das quando ρ < 0,05.
Resultados
Endoglina solúvel é uma molécula anti-angiogênica e induz à disfunção vas- cular
Usa-se um modelo in vitro de angiogênese para compreender a função da endoglina solúvel. A endoglina solúvel inibe modestamente a for- mação de tubo endotelial, que é ainda intensificada pela presença de sFItl (figura 22 e figura 31). Em pré-eclampsia, foi reportado que, além de disfun- ção endotelial, há também permeabilidade microvascular intensificada, con- forme evidenciado por edema e vazamento intensificado da albumina ligada a azul de Evans extracelularmente. De forma a observar se endoglina solú- vel induz a vazamento microvascular, nós usamos camundongos tratados durante 48 horas com adenovírus de endoglina solúvel e sFlt-1. Uma combi- nação de endoglina solúvel e sFlt-1 induziu a um aumento dramático no va- zamento de albumina nos pulmões, fígado e nos rins e a uma vazamento modesto no cérebro, conforme demonstrado usando o ensaio com azul de Evans (figura 23). A endoglina solúvel sozinha induziu a um vazamento mo- desto no fígado. De modo importante, a combinação de endoglina solúvel e sFlt-1 mostrou um efeito aditivo no fígado, indicando que esses receptores solúveis podem atuar em conjunto para romper a integridade endotelial e induzir a dano vascular e vazamento significativos. Esses dados sugerem que a combinação de endoglina solúvel e sFlt-1 são moléculas anti- angiogênicas potentes e podem induzir a vazamento vascular significativo.
Para avaliar os efeitos hemodinâmicos da endoglina solúvel, uma série de experimentos de reatividade microvascular em microvasos re- nais de rato foram realizados. Estuda-se primeiro os efeitos de TGF-β1 e TGF-P3 - dois ligantes conhecidos de endoglina. TGF-β1 e TGF-β3 induzi- ram a um aumento dose-dependente no diâmetro vascular. TGF-β1 e TGF- β3 induziram a um aumento dose-dependente no diâmetro arterial, enquanto que TGF-β2, o qual não é um ligante para a endoglina, falhou em produzir qualquer vasodilatação significativa (<2% a 0,1 e 1 ug/ml). De modo impor- tante, na presença de endoglina solúvel em excesso, o efeito de ambos os TGF-βs foi significativamente atenuado (figura 24). Esse efeito agudo das isoformas TGF-β1 e TGF-β3 sobre o tônus vascular também foi observado em vasos mesentéricos (figura 32). Finalmente, a combinação de VEGF e TGF-β1 induziu à vasodilatação, a qual foi bloqueada pela endoglina solúvel e sFItl em excesso (figura 25). Isso sugere que o sFlt-1 e endoglina solúvel podem se opor à vasodilatação fisiológica induzida por fatores de crescimen- to angiogênicos, tais como VEGF e TGF-β1, e induzir à hipertensão.
Efeitos in vivo de endoglina solúvel e sFIt1
De forma a avaliar os efeitos vasculares da endoglina solúvel e sFlt-1, escolhe-se o sistema de expressão adenoviral em ratos prenhes. A- denovírus que codifica um gene de controle (CMV) ou endoglina solúvel ou sFlt-1 ou sFlt-1 + endoglina solúvel foram injetados através da veia caudal no dia 8 de gravidez em ratos Sprague Dawley. No dia 17, os animais foram examinados com relação ao fenotipo de pré-eclampsia. A Tabela 8 inclui os dados hemodinâmicos e bioquímicos.
Tabela 8. Dados hemodinâmicos e bioquímicos para modelos animais com ratos tratados com adenovírus
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Dados são apresentados como a média + s.e.m. MAP- pressão arterial média (pressão diastólica + 1/3 pressão de pulso); o peso fetal é o peso médio do bebê para cada grupo em gramas; Alb/Creat - proporções de albumina/creatinina; LDH- dehidrogenase de lactato; AST- aminotransferase de aspartato.
* P<0,05 quando comparado com o grupo de controle.
Expressão de sEng e sFlt-1 foi primeiro confirmada em plasma de rato através de Western blots (figura 36) e a concentração em circulação quantificada usando kits ELISA comerciais.
As concentrações médias no plasma de sFlt-1 no controle, gru- pos com sEng, sFItl e sFItl+ sEng foram de 0,64 ng/ml, 0,66 ng/ml, 249 ng/ml e 204 ng/ml, respectivamente. As concentrações de sEng nesses qua- tro grupos foram de 0,39 ng/ml, 129 ng/ml, 0,37 ng/ml e 123 ng/ml, respecti- vamente.
A endoglina solúvel sozinha induziu a uma hipertensão branda. sFlt-1 induziu à hipertensão e proteinúria, conforme previamente reportado. Restrição de crescimento fetal foi observada em bebês nascidos no grupo sEng + sFlt-1, provavelmente relacionado à isquemia e dano vascular pla- cental. De modo importante, a combinação de sFlt-1 e endoglina solúvel in- duziu à hipertensão grave, proteinúria de faixa nefrótica, restrição de cresci- mento dos fetos e evidência bioquímica do desenvolvimento de síndrome HELLP (LDH elevado, AST elevada e diminuição das contagens de plaque- tas) (Tabela 8). Evidência de hemólise no grupo com endoglina solúvel + sFlt-1 foi confirmada através do esfregaço periférico, o qual revelou esquis- tocistos e reticulocitose (figuras 26A-B). Finalmente, histologia renal também revelou endoteliose focai no grupo com endoglina solúvel e uma endoteliose glomerular grave no grupo com endoglina solúvel + sFlt-1 (figuras 27A-27D e 33). Note que, na figura 33, o grupo de controle está dentro de limites nor- mais. Note Ioops de capilar abertos com endotélio fenestrado. O painel com endoglina solúvel mostra intumescimento endotelial, com perda de fenestro e oclusão Iuminal parcial. Note um estreitamento das células sangüíneas vermelhas através do lúmen comprometido. Embora microscopia luminosa dos rins dos ratos tratados com endoglina solúvel não tenha revelado endo- teliose significativa, microscopia eletrônica revelou endoteliose focai. De mo- do importante, os animais que receberam endoglina solúvel e sFlt-1 tinham endoteliose glomerular grave. O grupo com terapia combinada (painel inferi- or) mostra oclusão endocapilar massiva, com células endoteliais intumesci- das. Note a preservação relativa de processos da raiz de podócitos (mostra- dos como setas), a despeito de proteinúria grave. Dano vascular extensivo da placenta, incluindo enfarte na junção maternal-fetal, foi observado no grupo com sFlt-1 + sEng, mas não em ratos de controle ou naqueles trata- dos com qualquer agente sozinho (figuras 34A-H). Inflamação difusa na ca- mada de células gigantes (correspondendo aos trofoblastos invasivos huma- nos) foi notada nos grupos com sEng e sFlt-1 e foi maior no grupo combina- do. Histologia do fígado revelou sinais de isquemia e áreas de necrose no grupo com sEng + sFlt-1, similar àqueles observados em pacientes com sín- drome HELLP (figuras 34A-H). Sinais de dano vascular maternal grave tam- bém foram observados quando sEng + sFlt-1 foram injetados em ratos não- prenhes, sugerindo que o fenotipo observado em ratos prenhes era em vir- tude de um efeito direto sobre os vasos maternos e não requer a placenta.
Sumário
Esses resultados demonstram que a endoglina solúvel é super- regulada nas placentas pré-eclâmpticas e está presente em níveis extrema- mente altos em pacientes com pré-eclampsia. Os maiores níveis de endogli- na solúvel estavam presentes em pacientes com síndrome HELLP, uma das formas mais graves de pré-eclampsia. Esses resultados também demons- tram que os níveis de endoglina solúvel se correlacionam com o sFlt-1 ele- vado em pacientes grávidas e era maior naquelas pacientes onde existem maiores níveis de sFlt-1 em circulação. Além disso, os resultados indicam que a endoglina solúvel é uma molécula anti-angiogênica e rompe a função endotelial em múltiplos ensaios endoteliais, tais como ensaios de angiogê- nese, ensaios de permeabilidade microvascular e experimentos de reativida- de microvascular. De modo importante, a endoglina solúvel pode amplificar a conseqüência tóxica de sFlt-1 nesses ensaios endoteliais in vitro. Ainda, em ensaios in vivo, expressão adenoviral de endoglina solúvel induz à hiperten- são branda sem qualquer proteinúria significativa. Contudo, na presença de sFlt-1 , a endoglina solúvel induz a dano vascular significativo, conforme evi- denciado pela presença de hipertensão grave, proteinúria, endoteliose glo- merular, desenvolvimento de síndrome HELLP e restrição de crescimento fetal.
O mecanismo de liberação de endoglina solúvel é provavelmen- te clivagem proteolítica da região extracelular da molécula de endoglina. Pro- teases específicas que são super-reguladas no tecido pré-eclâmptico podem servir como moléculas candidatas. Um exemplo seria a metaloproteinase-1 da matriz do tipo membrana (MT1 -MMP) que foi mostrada clivar a betaglica- na, uma molécula que compartilha similaridade com a endoglina (Velasco- Loyden G e colaboradores, J. BioL Chem. 279: 7721-33 (2004)). Portanto, inibidores de tais proteases podem servir como alvos valiosos para o trata- mento de pré-eclampsia.
Exemplo 8. Endoqlina solúvel inibe a vasodilatacão NOS-dependente medi- ada por TGF-31 e TGF-63
eNOS é uma sintase de óxido nítrico (NO) Ca2+/calmodulina- regulada que pode ser ativada por estresse por cisalhamento de fluido e es- tímulos neuro-humorais. O NO endotélio-derivado é um vaso-relaxante muito potente que contribui para a regulação de pressão sangüínea sistêmica, permeabilidade vascular e angiogênese. Na verdade, os efeitos do VEGF sobre a angiogênese e tônus vascular são parcialmente mediados por ativa- ção de eNOS, através de associação eNOS/Hsp90 aumentada e fosforilação de eNOS Akt-dependente em Serl 177. Nossa demonstração recente de que sFlt-1 placenta-derivado aumentado no soro de pacientes pré-eclâmpticas é anti-angiogênico e induz à hipertensão pode, na verdade, refletir ativação de eNOS VEGF-dependente deficiente (Maynard e colaboradores, supra). Mais recentemente, foi mostrado que a desfosforilação de Thr495 de eNOS pre- cede a fosforilação de Serl 177 e esses eventos coordenados determinam a atividade de eNOS em células endoteliais (Fleming e colaboradores, Cir. Res. 88: E68-75 (2001)). Dado o efeito conhecido do VEGF sobre a redução de reatividade vascular via ativação de eNOS e a demonstração recente de que a endoglina modula a atividade vasomotora eNOS-dependente (Topor- sian e colaboradores, Circ. Res. 96: 684-692 (2005)), nós avaliamos os efei- tos hemodinâmicos das isoformas de TGF-β e endoglina solúvel em micro- vasos renais isolados de rato. Conforme descrito no Exemplo 7 e figuras 24 e 25, TGF-β1 e TGF-p3 induziram a um aumento dose-dependente no diâ- metro arterial, o qual foi significativamente atenuado pela endoglina solúvel.
Esse efeito agudo das isoformas de TGF-β1 e TGF-33 sobre o tônus vascu- lares não tinham sido anteriormente reconhecidos e também foi observado em vasos mesentéricos (figura 32). VEGF e TGF-β1 tinham efeitos aditivos sobre a vasodilatação, os quais foram bloqueados por sEng + sFItl em con- centrações notadas em pacientes com pré-eclampsia (figura 25 e 35A). L- NAME bloqueou a vasodilatação mediada por TGF-βΙ e VEGF, indicando um resposta NOS-dependente (figura 35A). Esses dados sugerem que sEng e sFlt-1 em circulação podem se opor à vasodilatação NO-dependente fisio- lógica estimulada por esses fatores de crescimento angiogênico, contribuin- do para o desenvolvimento de hipertensão observada em pré-eclampsia.
Exemplo 9. Endoglina solúvel inibe a ligação e sinalização de TGF-31 em células endoteliais
Dado que a endoglina é um coreceptor para as isoformas TGF- β1 e -β3, nós supomos que a endoglina solúvel atua através de interferência com a ligação ao receptor na superfície celular. Pré-incubação de TGF-βΙ radio-rotulado com endoglina solúvel recombinante reduziu significativamen- te sua ligação ao receptor de TGF-β do tipo II (TpRII) a 50 e 100 pM (figura 35B). Assim, a endoglina solúvel compete pela ligação de TGF-βΙ a seu re- ceptor sobre células endoteliais. Para testar se isso leva à sinalização defici- ente, a atividade de uma estrutura repórter CAGA-Luc foi avaliada em célu- las endoteliais humanas. TGF-βΙ induziu à ativação do repórter CAGA-Luc Smad 2/3-dependente e essa resposta foi eliminada através de tratamento com endoglina solúvel (figura 35C).
Exemplo 10. Endoglina solúvel blogueia a ativação de eNOS mediada por TGF-31
Dado descobertas de que TGF-βΙ induz ao vaso-relaxamento NOS-dependente em vasos com resistência renal e mesentérica, explora-se seus efeitos imediatos sobre a ativação de eNOS. Embora o TGF-βΙ não tenha efeito sobre a fosforilação de Ser1177 de eNOS, ele induziu a uma desfosforilação significativa em Thr495 (figura 35D), sugerindo que o TGF-β regula o estado de fosforilação de um resíduo chave na ativação de eNOS. Esse efeito foi significativamente atenuado pela endoglina solúvel (figura 35D).
Tomados juntos, os resultados nos Exemplos 8-10 demonstram que a endoglina solúvel interfere com a ligação ao receptor TGF-β e sinali- zação a jusante em células endoteliais e atenua a ativação de eNOS. A en- doglina solúvel e sFlt-1 podem estar trabalhando juntos para inibir a ativação de NO endotelial-dependente e efeitos vasomotores através das vias de si- nalização de VEGF e TGF-β.
Exemplo 11. Alterações seqüenciais em fatores angiogênicos podem identi- ficar mulheres em risco de pré-eclampsia ou pré-eclampsia
Nos exemplos descritos acima, nós mostramos gue sFlt-1 e en- doglina solúvel (sEng) estão intimamente relacionados à patogênese de pré- eclampsia. No exemplo descrito abaixo, mede-se as concentrações de sEng e sFlt-1 em espécimes de soro eguiparadas coletadas nos primeiro e segun- do trimestres de mulheres acompanhadas prospectivamente durante gravi- dez e cujas conseguências da gravidez foram caracterizadas em detalhes de forma a determinar se alterações seguenciais desses marcadores entre os primeiro e segundo trimestres estão associadas ao desenvolvimento de pré- eclampsia.
Materiais e Métodos
População de estudo
Foi realizada um estudo de controle de caso agrupado, prospec- tivo, de mulheres gue foram arroladas no Massachusetts General Hospital Obstetrical Matemal Study (MOMS)1 cujos métodos foram anteriormente descritos (Thadhani e colaboradores, Obstet. Gynecol. 97: 515-20 (2001) e Wolf e colaboradores, Obstet. Gynecol. 98: 757-62 (2001)). Em resumo, o grupo MOMS foi estabelecido em 1998 para o estudo prospectivo de fatores de risco gestacional precoces para conseguências adversas gue ocorrem posteriormente na gravidez. Mulheres gue receberam cuidados pré-natais no Massachusetts General Hospital e se afiliaram a centros de saúde eram ele- gíveis para inclusão no grupo. Para o presente estudo, mulheres consecuti- vas com gestações com um único bebê entre 1 de Junho de 2001 e 1 de Maio de 2004, gue foram arroladas no grupo MOMS antes ou após 12 se- manas de gestação e gue tiveram o parto após 20 semanas eram elegíveis para inclusão. Casos (n = 39) foram definidos como aqueles com coletas de sangue nos primeiro e segundo trimestres gue desenvolveram subseguen- temente pré-eclampsia e controles (n = 147) eram mulheres contemporâ- neas consecutivas arroladas no mesmo grupo gue tiveram parto a termo (>37 semanas) e permaneceram normotensas, normoglicêmicas e sem evi- dência de proteinúria por toda a gravidez. Os casos e controles foram equi- parados por idade (± 2 anos) e índice de massa corporal (± 1 kg/m2) dado o potencial para confusão através dessas exposições (Thadhani e colaborado- res, Obstet. Gynecol. 94: 543-50 (1999)). Todos os indivíduos forneceram consentimento por escrito e esse estudo foi aprovado pelo Institutional Revi- ew Board do Massachusetts General Hospital.
Exposições primárias
Amostras de sangue foram coletadas na primeira visita pré-natal (11-13 semanas) e novamente no segundo trimestre (17-20 semanas) em todas as mulheres. Após coleta, as amostras foram armazenadas a -80 0C para futura análise. As exposições primárias foram sEng e sFlt-1 no soro que foram medidos usando kits ELISA comerciais (R&D systems, Minneapolis, MN) (Maynard e colaboradores, supra e Venkatesha e colaboradores, Nat Med. 12: 642-9 (2006)). Aos coeficientes de precisão intra-ensaio de varia- ção para sEng e sFlt-1 foram de 3,5 e 3,2% respectivamente. Os coeficien- tes de precisão inter-ensaio de variação para sFlt-1 e endoglina foram de 8,1 e 9,5%, respectivamente. Todas as amostras foram realizadas em duplicata e, se houvesse uma variação de mais de 10% entre as duplicatas, o ensaio era repetido e as médias eram reportadas. Todos os ensaios foram realiza- dos por alguém que não sabia do estado do caso. As amostras foram aleato- riamente enviadas para análise.
Co-variáveis e Confounders
O registro médico eletrônico (EMR), o qual é o registro médico usado no Massachusetts General Hospital, fornece dados clínicos e demo- gráficos que detalha prospectivamente os eventos de gravidez através do período pós-parto precoce. Informação específica obtida do EMR coletada na linha de base (primeira visita pré-natal) e todas as subsequentes visitas pré-natais incluíam idade, raça, altura, peso, se fumante ou não, idade ges- tacional estimada a partir do último período menstrual e verificada através de ultra-som, pressão sangüínea e os resultados de análise de urina e estimati- va de idade gestacional fetal. Toda a informação das conseqüências da gra- videz também entraram no EMR1 incluindo resultados de testes de tolerância à glicose e outros valores de laboratório rotineiramente medidos e caracte- rísticas do parto, tais como peso ao nascer, tipo de parto e diagnóstico de pré-eclampsia.
Conseqüências primárias
Todas as conseqüências da gravidez foram verificadas através de exame detalhado dos registros médicos, incluindo fluxogramas pré-natais e medições de laboratório. Em cada visita pré-natal, a pressão sangüínea foi obtida do braço direito usando esfigmomanômetros padrões com a mulher na posição sentada após 3-5 minutos de repouso. Para cada paciente, o ta- manho de manguito apropriado foi selecionado baseado na circunferência mediana do braço direito. Medições da pressão sangüínea que coincidiam com o momento dos primeiro (sistólico) e quinto (diastólico) sons de Korot- koff foram registradas. Todos os indivíduos para o presente estudo não ti- nham história de hipertensão ou diabetes mellitus pré-existente, iniciaram e terminaram seus cuidados pré-natais e gravidez dentro da estrutura MOMS, tiveram um bebê vivo e não tinham evidência de hipertensão 6 semanas a- pós parto.
Pré-eclampsia foi definida como uma elevação na pressão san- guínea sistólica de pelo menos 140 mm Hg ou pressão sangüínea diastólica de pelo menos 90 mm Hg após a 20ã semana de gestação, em associação com proteinúria, quer 2+ ou maior com a tira medidora ou pelo menos 300 mg/24 h na ausência de infecção do trato urinário (ACOG Committee on Practice Bulletins--Obstetrics. ACOG practice bulletin. Diagnosis and mana- gement of preeclampsia e eclampsia. Número 33, Janeiro de 2002. Obstet Gyneco!. 99: 159-67). Pré-eclâmpticos foram analisados como pré-eclampsia a termo (> 37 semanas) e pré-eclampsia pré-termo (<37 semanas). Análise estatística
Dados demográficos e características clínicas foram compara- dos usando testes de Chi Quadrado ou o t teste de Student, conforme apro- priado. Transformação Iog foi necessária para as exposições primárias, dado seus partos fora do normal (Levine e colaboradores, (2004), supra, Levine e colaboradores, Ν. Engl. J. Med. 355: 992-1005 (2006)). Exposições primá- rias foram examinadas como variáveis contínuas e com pontos de corte de análises de tertile baseado nos partos naturais dos controles e simplificadas para interpretação clínica. Análise de regressão múltipla foi realizada usando técnicas de regressão logística. Todos os Pvalores foram duplamente confi- gurados e um Pvalor < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Análise secundária de marcadores angiogênicos no estudo de CPEP
Realizou-se também uma análise secundária de alterações de fator angiogênico durante o início de gravidez do estudo de controle de caso agrupado recentemente publicado dentro do grupo com CPEP, descrito aci- ma. Analisa-se amostras de mulheres normotensas, mulheres que desenvol- veram pré-eclampsia antes de 37 semanas e mulheres que desenvolveram pré-eclampsia após 37 semanas em três intervalos de tempo diferentes -10- 12 semanas, 13-16 semanas e 17-20 semanas.
Resultados
Dados demográficos e características clínicas
As características de linha de base e no parto da população de estudo MOMS são mostradas na Tabela 9. Não havia diferença significativa na idade e índice de massa corporal entre os dois grupos. Mulheres que de- senvolveram pré-eclampsia subseqüentemente tinham pressões sangüíneas sistólica e diastólica mais elevadas na primeira visita pré-natal. No momento de apresentação de pré-eclampsia, as pressões sangüíneas sistólica e dias- tólica eram mais elevadas no grupo pré-eclâmptico, conforme esperado.
Tabela 9. Dados demográficos
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BMI = índice de massa corporal; DBP = pressão sangüínea dias- tólica; SBP = pressão sangüínea sistólica
UTP = proteína total na urina em mg/L; SPOT = proporção de proteína/creatinina na urina
Valores são a média ± S.D.
Níveis de sFlt1 e sEng nos primeiro e segundo trimestres em gravidez nor- mal e pré-eclâmptica
Os níveis médios de sFlt1 no soro eram maiores em mulheres com pré-eclampsia comparado com mulheres com gestações normais, 3,49 ± 0,35 ng/ml versus 3,03 ±0,13 ng/ml, respectivamente, no primeiro trimes- tre (P = NS). No segundo trimestre, os níveis médios de sFlt-1 no soro eram significativamente maiores no grupo pré-eclâmptico, valor médio de 4,12 ± 0,5 ng/ml comparado com o grupo normal 3,10 ± 0,15 ng/ml (P<0,01) (Tabe- la 10).
Os níveis médios de sEng no soro não eram significativamente diferentes no primeiro trimestre, mas estavam significativamente alterados no segundo trimestre entre mulheres com pré-eclampsia, quando comparado com mulheres normais, 6,9 ± 0,32 ng/ml versus 6,57 ± 0,17 ng/ml (P = NS) no primeiro trimestre e 6,37 ± 0,38 ng/ml versus 5,23 ±0,12 ng/ml no segun- do trimestre, (Ρ = 0,004), respectivamente (Tabela 10).
Tabela 10. Níveis de sFlt e sEnq no soro
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Alterações seqüenciais em fatores angiogênicos
A Figura 37 mostra graficamente o delta ou d (diferença entre os valores de sEng e sFlt-1 nos primeiro e segundo trimestres) em mulheres normais, todas pré-eclâmpticas e em mulheres com pré-eclampsia em me- nos de 37 semanas. Em gravidez normal, há muito pouca alteração no sFlt-1 entre os primeiro e segundo trimestres (dsFItl = 0,05 ±0,15 ng/ml). dsFItl é relativamente maior em mulheres que desenvolvem pré-eclampsia, 0,713 ± 0,47 ng/ml versus 0,0497 ±0,15 ng/ml em mulheres normais (P = 0,08). Si- milarmente, em mulheres com pré-eclampsia em menos de 37 semanas, dsFItl era maior a 0,634 ± 0,91 ng/ml.
Houve uma queda no nível de sEng entre os primeiro e segundo trimestres em gravidez normal (-1,322 ±0,18 ng/ml). Essa queda é acentua- da em pacientes com pré-eclampsia, com dsEng de -0,441 ± 0,42 ng/ml (P = 0,04). Em mulheres com pré-eclampsia em menos de 37 semanas, a queda no nível de endoglina solúvel é acentuado e parece tender à direção oposta (0,732 ± 0,77 ng/ml, P <0,01 comparado com controles). Algoritmos prognósticos
Para observar se essas alterações podem ser usadas como um teste prognóstico para pré-eclampsia prematura grave, nós observamos o produto (valor de sFItl χ sEng) como produto-1 (no primeiro trimestre) e pro- duto-2 (no segundo trimestre) em mulheres normotensas e mulheres que desenvolveram pré-eclampsia e, especificamente em pré-eclampsia pré- termo. O produto-1 e produto-2 estavam significativamente elevados em pa- cientes com pré-eclampsia e, de modo importante, o delta do produto (dpro- duto) era notavelmente positivo, em contraste com um número negativo em controles normais (Figura 38). Além disso, o dproduto foi grandemente am- plificado em pacientes com pré-eclampsia pré-termo quando comparado com controles normais (P = 0,004).
Para avaliar a relação entre níveis alterados de fatores angiogê- nicos e o risco de pré-eclampsia pré-termo, nós computámos as razões de possibilidade ajustadas (aOR) e intervalos de confiança de 95 por cento (Cl de 95%) para pré-eclampsia pré-termo na maior categoria de parto de con- centrações de dproduto com relação as duas menores categorias após ajus- te da raça/etnicidade, índice de massa corporal e idade gestacional na coleta de amostra (Figura 39). Aumentos substanciais no risco de pré-termo foram observados no grupo cujos níveis de delta produto eram maiores do que +1 aOR 5,5, Cl de 95% de 1,4 - 22,4, comparado com mulheres cujo delta pro- duto era menos do que -1.
Análise secundária do estudo de controle de caso agrupado CPEP
No conjunto de mulheres no experimento de CPEP, entre o gru- po de mulheres que permaneceram normotensas, os valores médios de s- Fltl aumentaram de 3,68 ng/ml para 4,92 ng/ml entre 10-12semanas e 13-16 semanas e diminuíram para 4,29 ng/ml a 17-20 semanas, enquanto que, em mulheres com pré-eclampsia pré-termo, os valores médios de sFItl aumen- taram de 3,44 ng/ml para 4,22 ng/ml e aumentaram ainda para 5,39 ng/ml a 10-12, 13-16 e 17-20 semanas de gestação. Esse padrão não era óbvio em mulheres com pré-eclampsia pré-termo (Tabela 11). Tabela 11. Níveis de sFlt e sEng no soro em um experimento de CPEP
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Resultados similares foram observados nos níveis de sEng. Em mulheres normotensas, os níveis de sEng aumentaram de 6,8 ng/ml para 7,07 ng/ml a 10-12 semanas e 13-16 semanas e, então, diminuíram para 5,78 ng/ml a 17-20 semanas, enquanto que, em mulheres com pré- eclampsia pré-termo, os níveis de endoglina aumentaram de 7,15 ng/ml para 7,95 ng/ml e aumentaram ainda para 10,19 ng/ml entre 10-12 semanas, 13- 16 semanas e 17-20 semanas. A mesma tendência foi notada em mulheres com pré-eclampsia pré-termo, onde os níveis médio de sEng aumentaram de 7,41 ng/ml para 7,80 ng/ml para 8,34 ng/ml a 10-12 semanas, 13-16 se- manas e 17-20 semanas (veja Tabela 11). Sumário
SEng e sFlt-1 estão elevados durante o segundo trimestre em pacientes destinadas a desenvolver pré-eclampsia. A gravidez normal é ca- racterizada por uma queda na sEng do primeiro para o segundo trimestre sem alteração significativa na sFlt-1. Contudo, em pacientes que desenvol- vem pré-eclampsia, particularmente pré-eclampsia pré-termo, sEng e sFlt-1 continuam a se elevar do primeiro para o segundo trimestre. As alterações em sEng e sFlt-1 durante os primeiro e segundo trimestres são úteis para seleção de pacientes em alto risco de subsequente desenvolvimento de pré- eclampsia pré-termo.
Essas descobertas têm implicações importantes para a previsão de pré-eclampsia pré-termo. A busca por um teste de seleção seguro, confi- ável para pré-eclampsia não foi atingida pelos pesquisadores durante muitos anos. Esforços anteriores se focalizaram na detecção de manifestações pre- coces da doença, tais como microalbuminuria, ganho de peso e alterações do volume de plasma. Em uma meta-análise grande, Conde-Agudelo, A. e colaboradores analisaram oitenta e sete de 7.191 (211.369 mulheres) artigos potencialmente relevantes para avaliar a utilidade de testes clínicos, biofísi- cos e bioquímicos na previsão de pré-eclampsia. Eles concluíram que até 2004, não havia um teste de seleção clinicamente útil para a previsão do desenvolvimento de pré-eclampsia (12). No presente estudo, nós mostramos que os níveis de sEng e sFlt-1 estão elevados em mulheres que são desti- nadas a se tornar pré-eclâmpticas, em seus primeiro e segundo trimestres (conforme medido como um delta em paciente individuais), semanas a me- ses antes de início clínico da doença. Essas alterações são mais substanci- ais em mulheres que desenvolvem pré-eclampsia pré-termo.
Acredita-se que um desequilíbrio em fatores angiogênicos exer- ça um papel íntimo na patogênese de pré-eclampsia. Placentas pré- eclâmpticas são caracterizadas por implante oco e remodelamento vascular anormal, incluindo pseudo-vasculogênese deficiente (Fisher e colaborado- res, Semin Cell BioL 4: 183-8 (1993)). Acredita-se que essas alterações pla- centais ocorram entre 12-18 semanas de gravidez e é importante na patogê- nese da grande maioria da pré-eclampsia de início precoce grave. Acredita- se que essas anormalidades placentais levam à elaboração de fatores sis- têmicos que induzem à síndrome materna de pré-eclampsia. Conforme des- crito aqui e nas Publicações de Pedido PCT números WO 2004/008946, WO 2005/077007 e WO 2006/034507, descobriu-se que sEng e sFlt-1 , duas pro- teínas anti-angiogênicas, estão elevadas em pré-eclampsia não apenas du- rante doença clínica, mas também várias semanas antes de início dos sin- tomas (Levine e colaboradores, (2006), supra). De modo importante, ambos esses fatores foram implicados na indução de uma síndrome semelhante à pré-eclampsia em ratos (Maynard e colaboradores, supra, Venkatesha e co- laboradores, supra). Contudo, uma vez que alterações nas concentrações de fatores angiogênicos na circulação materna ocorrem de modo relativamente posterior na gravidez, produção aumentada desses fatores anti-angiogênicos pode ser um fenômeno secundário que ocorre em resposta à formação a- normal de placenta. Dados in vitro usando explantes de vilosidades placen- tais e estudos de cultura de citotrofoblasto primário sugerem que, além de seu papel na indução de disfunção endotelial materna, fatores anti- angiogênicos podem estar envolvidos em migração e diferenciação de cito- trofoblasto. Nossas descobertas de que os níveis de fatores anti- angiogênicos diminuem do primeiro para o segundo trimestre em gestações normais, mas não em gestações nas quais pré-eclampsia pré-termo se de- senvolve depois, sugerem que anormalidades nos fatores angiogênicos em circulação estão ocorrendo ao mesmo tempo que anormalidades na diferen- ciação placental.
A etiologia das concentrações aumentadas de sEng e sFlt-1 em circulação em pacientes com pré-eclampsia é desconhecida. Acredita-se que hipóxia, genes ou fatores imunológicos exerçam um papel. É notável observar que a expressão de sEng e sFlt-1 estão elevadas em resposta à hipóxia em modelos in vivo e in vitro de hipóxia placental, onde expressão aumentada é mediada por HIF-1 (Nevo e colaboradores, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 291: R1085-93 (2006)). Além disso, acredita-se que, durante gravidez normal, a placenta é hipóxica no início de gravidez e essa hipóxia desaparece com fluxo sangüíneo aumentado para a placenta duran- te o segundo trimestre. Embora a hipóxia nunca tenha sido formalmente do- cumentada em gestações pré-eclâmpticas, acredita-se que a hipóxia seja central para a maioria das gestações pré-eclâmpticas baseado na evidência substituta de expressão aumentada de fator de transcrição induzida por hi- póxia e fluxo sangüíneo de Doppler deficiente para as placentas. Nossas descobertas de que sEng e sFlt-1 permanecem elevados em pacientes com pré-eclampsia grave em contraste às gestações normais, onde há uma que- da entre os primeiro e segundo trimestres, sugere que isquemia placental pode, na verdade, exercer um papel na produção aumentada dessas proteí- nas anti-angiogênicas em pacientes pré-eclâmpticas.
Em resumo, alterações seqüenciais de sFlt-1 e sEng parecem identificar mulheres destinadas a desenvolver pré-eclampsia, especialmente mulheres que desenvolvem subseqüentemente pré-eclampsia pré-termo. Nossas descobertas são reproduzidas em estudos seccionais cruzados com um tamanho de amostra muito maior (Tabela 11).
Exemplo 12. Endoqlina é necessária para desfosforilacão de Thr495 de e- NOS TGF-31-induzida
Células endoteliais de murino foram derivadas de embriões de camundongo Eng +/+ e Eng -/- (E8.5) e crescidas conforme descrito em Balconi e colaboradores (Arterioscler. Thromb. Vasc. BioL 20: 1443-51 (2000)). Mo- nocamadas confluentes foram privadas de soro durante 2 horas e estimula- das com ou sem TGF-β1 (125 e 250 pM) durante 15 minutos. Extratos de células foram imediatamente preparados em Tris-HCl a 10 mM contendo Triton X-100 a 1% e suplementados com inibidores de protease e fosfatase. As concentrações de proteína foram quantificadas e amostras foram anali- sadas através de Western blot usando pAbs fosfo-específicos ao Thr495 de eNOS (Sinalização Celular) e um mAb para eNOS total (BD Biosciences).
As Western blots representativas mostradas na Figura 40A e gráfico associado mostrado na Figura 40B (média de η = 3 experimentos) demonstram a desfosforilação de Thr495 de eNOS TGF-β1 -induzida (**P<0,01 versus linha de base) em células endoteliais Eng+/+ de camundon- go, mas não em células Eng-/-. Esse resultado sugere um papel crítico para a endoglina na ligação de sinalização de TGF-β1 para a desfosforilação e ati- vação de Thr495 de eNOS. Além disso, dado que esse processo é endogli- na-dependente, endoglina solúvel pode ser usada para inibir o processo, presumivelmente através de ligação a e inibição de TGF-β1.
Outras Modalidades
A descrição das modalidades específicas da invenção é apre- sentada para fins de ilustração. Não se pretende ser exaustivo ou limitar o escopo da invenção às formas específicas descritas aqui. Embora a inven- ção tenha sido descrita com referência à várias modalidades, será entendido por aqueles habilitados na técnica que várias modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito e escopo da invenção, conforme apresentado nas reivindicações.
Todas as patentes, pedidos de patente e publicações menciona- dos aqui, incluindo as Publicações de Pedido PCT Números WO 2004/008946, WO 2005/077007 e WO 2006/034507; Publicações de Pedido de Patente U.S. Números 20060067937 e 20070104707; e Pedido de Paten- te Provisório U.S. Número 60/852.761, são aqui incorporados por referência.
Outras modalidades estão nas reivindicações. Listagem de Seqüência
<110> BETH ISRAEL DEACONESS MEDICAL CENTER et al.
<120> MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE COMPLICAÇÕES DE GRAVIDEZ
<130> 01948/106W03
<150> 11/443,920
<151> 2006-05-31
<150> 60/852,761
<151> 2006-10-19
<160> 5
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1
<211> 1311
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggaccgcg gcacgctccc tctggctgtt gccctgctgc tggccagctg cagcctcagc 60
cccacaagtc ttgcagaaac agtccattgt gaccttcagc ctgtgggccc cgagagggac 120
gaggtgacat ataccactag ccaggtctcg aagggctgcg tggctcaggc ccccaatgcc 180
atccttgaag tccatgtcct cttcctggag ttcccaacgg gcccgtcaca gctggagctg 240
actctccagg catccaagca aaatggcacc tggccccgag aggtgcttct ggtcctcagt 300
gtaaacagca gtgtcttcct gcatctccag gccctgggaa tcccactgca cttggcctac 360
aattccagcc tggtcacctt ccaagagccc ccgggggtca acaccacaga gctgccatcc 420
ttccccaaga cccagatcct tgagtgggca gctgagaggg gccccatcac ctctgctgct 480
gagctgaatg acccccagag catcctcctc cgactgggcc aagcccaggg gtcactgtcc 540
ttctgcatgc tggaagccag ccaggacatg ggccgcacgc tcgagtggcg gccgcgtact 600
ccagccttgg tccggggctg ccacttggaa ggcgtggccg gccacaagga ggcgcacatc 660
ctgagggtcc tgccgggcca ctcggccggg ccccggacgg tgacggtgaa ggtggaactg 720
agctgcgcac ccggggatct cgatgccgtc ctcatcctgc agggtccccc ctacgtgtcc 780
tggctcatcg acgccaacca caacatgcag atctggacca ctggagaata ctccttcaag 840
atctttccag agaaaaacat tcgtggcttc aagctcccag acacacctca aggcctcctg 900
ggggaggccc ggatgctcaa tgccagcatt gtggcatcct tcgtggagct accgctggcc 960
agcattgtct cacttcatgc ctccagctgc ggtggtaggc tgcagacctc acccgcaccg 1020 atccagacca ctcctcccaa ggacacttgt agcccggagc tgctcatgtc cttgatccag 1080
acaaagtgtg ccgacgacgc catgaccctg gtactaaaga aagagcttgt tgcgcatttg 1140
aagtgcacca tcacgggcct gaccttctgg gaccccagct gtgaggcaga ggacaggggt 1200
gacaagtttg tcttgcgcag tgcttactcc agctgtggca tgcaggtgtc agcaagtatg 1260
atcagcaatg aggcggtggt caatatcctg tcgagctcat caccacagcg g 1311
<210> 2
<211> 437
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15
Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu 20 25 30
Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln 35 40 45
Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val 50 55 60
His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu 65 70 75 80
Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu 85 90 95
Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu 100 105 110
Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln 115 120 125
Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr 130 135 140
Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala 145 150 155 160
Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln 165 170 175 Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg
180 185 190
Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His
195 200 205
Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu
210 215 220
Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu 225 230 235 240
Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro
245 250 255
Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp
260 265 270
Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg
275 280 285
Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg
290 295 300
Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala 305 310 315 320
Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr
325 330 335
Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro
340 345 350
Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met
355 360 365
Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile
370 375 380
Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly 385 390 395 400
Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val
405 410 415
Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser 420 425 430 Ser Ser Pro Gln Arg 435
<210> 3 <211> 30 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Primer <400> 3
acgaagcttg aaacagtcca ttgtgacctt <210> 4 <211> 29 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Primer <400> 4
ttagatatct ggcctttgct tgtgcaacc
<210> 5
<211> 633
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu 15 10 15
Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala
20 25 30
Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr
35 40 45
Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly
50 55 60
Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Lau Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val 65 70 75 80
Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn
85 90 95
Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu
100 105 110
Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg
115 120 125
Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu
130 135 140
Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu 145 150 155 160
Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro
165 170 175
Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu
180 185 190
Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr
195 200 205
Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala
210 215 220
Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala 225 230 235 240
Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile
245 250 255
Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln
260 265 270
Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser
275 280 285
Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser
290 295 300
Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro 305 310 315 320
Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr 325 330 335
Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val
340 345 350
Ala His Leu Lys Cys Thr Ile Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser
355 360 365
Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr
370 375 380
Ser Ser Cys Gly Met Gln Val Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala 385 390 395 400
Val Val Asn Ile Leu Ser Ser Ser Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His
405 410 415
Cys Leu Asn Met Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser
420 425 430
Pro His Phe Leu Gln Ala Ser Asn Thr Ile Glu Pro Gly Gln Gln Ser
435 440 445
Phe Val Gln Val Arg Val Ser Pro Ser Val Ser Glu Phe Leu Leu Gln
450 455 460
Leu Asp Ser Cys His Leu Asp Leu Gly Pro Glu Gly Gly Thr Val Glu 465 470 475 480
Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala Lys Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser
485 490 495
Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro Arg Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr
500 505 510
Thr Val Pro Ile Pro Lys Thr Gly Thr Leu Ser Cys Thr Val Ala Leu
515 520 525
Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln Asp Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe
530 535 540
Met Arg Leu Asn Ile Ile Ser Pro Asp Leu Ser Gly Cys Thr Ser Lys 545 550 555 560
Gly Leu Val Leu Pro Ala Val Leu Gly Ile Thr Phe Gly Ala Phe Leu
565 570 575
Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr 580 585 590
Arg Ser Pro Ser Lys Arg Glu Pro Val Val Ala Val Ala Ala Pro Ala
595 600 605
Ser Ser Glu Ser Ser Ser Thr Asn His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser
610 615 620
Thr Pro Cys Ser Thr Ser Ser Met Ala 625 630

Claims (57)

1. Método de tratamento ou prevenção de distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez em um indivíduo, o referido método compreendendo a etapa de administração, ao referido indivíduo, de um composto capaz de aumentar o nível de expressão ou atividade biológica de NOS, em que a re- ferida administração é durante um tempo e em uma quantidade suficiente para tratar ou prevenir o referido distúrbio relacionado à gravidez no referido indivíduo.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido NOS é eNOS.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o referido composto aumenta a fosforilação de Ser 1177 de eNOS.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido composto é VEGF ou fragmentos biologicamente ativos do mesmo.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o referido VEGF é VEGF121, VEGF165 ou uma forma modificada de VEGF ou frag- mentos biologicamente ativos dos mesmos.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o referido composto é PIGF ou fragmentos biologicamente ativos do mesmo.
7. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o referido composto aumenta a desfosforilação de Thr495 de eNOS.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o referido composto é selecionado do grupo consistindo de TGF-βΙ, TGF-33, activina A, BMP-2, BMP-7 e fragmentos biologicamente ativos dos mesmos.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, ainda compreen- dendo administração, ao referido indivíduo, de um composto capaz de redu- zir a expressão de endoglina solúvel ou atividade biológica de endoglina so- lúvel, em que a referida administração é suficiente para tratar ou prevenir o referido distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez no referido indivíduo.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido composto é um anticorpo purificado que se liga especificamente à endoglina solúvel ou um fragmento de ligação a antígênõ de endoglina solúvel.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo se liga a um polipeptídeo de endoglina solúvel ou um fragmento do mesmo compreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada do gru- po consistindo de aminoácidos 26 a 437, 40 a 406 ou 26 a 587 da seqüência de endoglina humana mostrada na Figura 30B.
12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o referido anticorpo se liga a um epítopo sobre a endoglina solúvel compreendendo os aminoácidos 40 a 86, 144 a199, 206 a 222, 289 a 304 ou 375 a 381 da se- qüência de endoglina humana mostrada na Figura 30B.
13. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido composto é um composto que inibe uma enzima proteolítica selecionada do grupo consistindo de uma metaloproteinase da matriz (MMP), catepsina e elastase.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido distúrbio relacionado à gravidez é caracterizado por níveis aumentados de sFlt-1 quando comparado com uma referência normal.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, ainda compreen- dendo administração, ao referido indivíduo, de um composto capaz de redu- zir os níveis de expressão de sFlt-1 ou atividade biológica de sFlt-1, em que a referida administração é suficiente para tratar ou prevenir o referido distúr- bio hipertensivo relacionado à gravidez no referido indivíduo.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o referido composto é um fator de crescimento purificado ou anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno que se liga a sFlt-1.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido indivíduo é uma mulher grávida, uma mulher em pós-parto ou um não- humano grávido.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido método ainda compreende monitoramento do referido distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez no referido indivíduo, em que o referido monitoramen- to compreende medição do nível de polipeptídeo de endoglina solúvel em uma amostra de soro ou plasma do referido indivíduo, em que um nível de polipeptídeo de endoglina solúvel de menos de 25 ng/ml indica um aperfei- çoamento no referido distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez.
19. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido método ainda compreende monitoramento do referido distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez no referido indivíduo, em que o referido monitoramen- to compreende medição do nível de polipeptídeo de endoglina solúvel em uma amostra do referido indivíduo, em que a referida medição dos níveis é feita em duas ou mais ocasiões e uma diminuição nos referidos níveis de endoglina solúvel entre medições é um indicador de um aperfeiçoamento no referido distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez.
20. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido método ainda compreende monitoramento do referido distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez no referido indivíduo, em que o referido monitoramen- to compreende medição do nível de polipeptídeo de endoglina solúvel em uma amostra do referido indivíduo e comparação do referido nível com uma amostra de referência positiva, em que uma diminuição no nível de endogli- na solúvel com relação à amostra de referência positiva indica um aperfeiço- amento no referido distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez no referido indivíduo.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-20, em que o referido monitoramento é usado para determinar a dosagem terapêutica do composto.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-20, em que a referida medição compreende o uso de um ensaio imunológi- co.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-20, em que o nível de endoglina solúvel é o nível de endoglina solúvel livre, ligada ou total ou o nível de um polipeptídeo de endoglina resultante de de- gradação ou clivagem enzimática.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-20, em que o referido monitoramento ainda compreende medição do nível de pelo menos um de polipeptídeo de sFlt-1, VEGF ou PIGF em uma amostra do referido indivíduo.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, ainda compreen- dendo cálculo da relação entre os referidos níveis de endoglina solúvel, sFlt- -1, VEGF ou PIGF usando um sistema métrico, em que uma alteração na re- lação entre os referidos níveis na amostra do indivíduo com relação a uma amostra de referência indica um aperfeiçoamento no referido distúrbio hiper- tensivo relacionado à gravidez no referido indivíduo.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o referido sistema métrico é selecionado do grupo consistindo de: [(sFlt-1 + 0,25 endo- glina solúvel)/PIGF], [(endoglina solúvel + sFlt-1)/PIGF] e [sFlt-1 χ endoglina solúvel].
27. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o referido sistema métrico é [dproduto = (sFItl χ sEng) no segundo trimestre - (sFItl χ sEng) no primeiro trimestre], em que um valor dproduto maior do que 0 indi- ca um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez no referido indivíduo e uma diminuição no referido valor dproduto, quando comparado com uma amostra de referência positiva, indica um aperfeiçoamento no referido dis- túrbio hipertensiyo relacionado à gravidez no referido indivíduo.
28. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a um polipeptídeo de endoglina solúvel, em que o referido anticorpo se liga a um epítopo compreendendo os aminoácidos 40 a -86, 144 a 199, 206 a 222, 289 a 304 ou 375 a 381 da seqüência de endogli- na humana mostrada na Figura 3B.
29. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 28, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno impede ligação de um fator de crescimento à endoglina solúvel.
30. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 29, em que o referido fator de crescimento é se- lecionado do grupo consistindo de TGF-βΙ, TGF-33, activina A, BMP-2 e BMP-7.
31. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 28, em que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo huma- no.
32. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 28, em que o referido anticorpo carece de uma porção Fc, é uma estrutura F(ab')2, Fab ou Fv.
33. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 28, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo está presente em um veículo farmaceutica- mente aceitável.
34. Método de diagnóstico de um indivíduo como tendo ou tendo uma predisposição a um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, o re- ferido método compreendendo medição do nível de um polipeptídeo de en- doglina solúvel e pelo menos um polipeptídeo adicional selecionado do gru- po consistindo de TGF-βΙ, TGF-33, activina A, BMP2, BMP7, eNOS e PGI2 em uma amostra do referido indivíduo, em que um aumento no nível de en- doglina solúvel e uma diminuição no nível do referido pelo menos um poli- peptídeo adicional, quando comparado com uma amostra de referência, pa- drão ou nível normal é um indicador diagnóstico de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez ou uma propensão de desenvolver um distúrbio hi- pertensivo relacionado à gravidez.
35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a referida medição compreende o uso de um ensaio imunológico.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o referido ensaio imunológico é um ELISA.
37. Método de acordo com a reivindicação 34, em que a referida amostra de referência normal é uma amostra anterior do referido indivíduo.
38. Método de diagnóstico de um indivíduo como tendo ou tendo uma predisposição a um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, o re- ferido método compreendendo medição do nível de um polipeptídeo de en- doglina solúvel e um polipeptídeo de sFlt-1 do referido indivíduo e cálculo da relação entre os referidos níveis de endoglina solúvel e sFlt-1 usando um sistema métrico endoglina solúvel χ sFlt-1, em que um aumento no sistema métrico na amostra do indivíduo com relação a uma amostra de referência normal é um indicador diagnóstico de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez no referido indivíduo.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, em que o referido sistema métrico ainda compreende o índice de massa corporal da mãe ou a idade gestacional do feto.
40. Método de diagnóstico de um indivíduo como tendo ou tendo uma predisposição a um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez, o re- ferido método compreendendo medição do nível de um polipeptídeo de en- doglina solúvel e um polipeptídeo de sFlt-1 do referido indivíduo durante o primeiro trimestre e o segundo trimestre e cálculo da relação entre os referi- dos níveis de endoglina solúvel e sFlt-1 usando o seguinte sistema métrico: dproduto = (sFlt1 χ sEng) no segundo trimestre - (sFlt1 χ sEng) no primeiro trimestre, em que um valor de dproduto maior do que zero é um indicador diagnóstico de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez no referido indivíduo.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, em que um valor de dproduto maior do que um é um indicador diagnóstico de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez no referido indivíduo.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, em que o valor de dproduto maior do que um é um indicador diagnóstico de pré-eclampsia pré- termo.
43. Método de acordo com a reivindicação 34, 38 ou 40, em que a referida amostra é um fluido corporal, célula ou um tecido do referido indi- víduo no qual a referida endoglina solúvel é normalmente detectável.
44. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o referido fluido corporal é selecionado do grupo consistindo de urina, fluido amniótico, sangue, soro e plasma.
45. Método de acordo com a reivindicação 43, em que a referida célula é selecionada do grupo consistindo de uma célula endotelial, um Ieu- cócito, um monócito e uma célula derivada da placenta.
46. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o referido tecido é um tecido placentário.
47. Método de acordo com a reivindicação 34, 38 ou 40, em que o referido indivíduo é uma mulher não grávida, uma mulher grávida, uma mulher em pós-parto ou um não-humano e o referido método diagnostica uma propensão de desenvolver um distúrbio hipertensivo relacionado à gra- videz.
48. Método de acordo com a reivindicação 47, em que o referido não-humano é selecionado do grupo consistindo de um cavalo, uma vaca, uma ovelha, um porco, uma cabra, um cão ou um gato.
49. Método de acordo com a reivindicação 34, 38 ou 40, em que o referido método é usado para diagnosticar um distúrbio hipertensivo rela- cionado à gravidez ou uma propensão a desenvolver um distúrbio hiperten- sivo relacionado à gravidez pelo menos quatro semanas antes de início dos sintomas.
50. Método de acordo com a reivindicação 1, 34, 38 ou 40, em que o referido distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez é pré-eclampsia, eclampsia, hipertensão gestacional, hipertensão crônica, síndrome HELLP e gravidez com um bebê SGA.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que o referido distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez é pré-eclampsia ou eclampsia.
52. Kit para o diagnóstico de um distúrbio hipertensivo relacio- nado à gravidez em um indivíduo compreendendo (i) um agente de ligação à endoglina solúvel e (ii) pelo menos um agente de ligação adicional que se liga a um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo de TGF-βΙ, TGF- β3, activina A, BMP2, BMP7, eNOS e PGI2 e (iii) instruções para o uso do agente de ligação de (i) e pelo menos um agente de ligação de (ii) para o diagnóstico de um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez ou uma pro- pensão de desenvolver um distúrbio hipertensivo relacionado à gravidez.
53. Kit de acordo com a reivindicação 52, em que o referido a- gente de ligação de (i) é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente à endoglina solúvel e o pelo menos um agente de ligação de (ii) é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a TGF-β1, TGF-P3, activina A1 BMP2, BMP7, eNOS ou PGI2.
54. Kit de acordo com a reivindicação 52, em que o referido kit ainda compreende uma molécula de ligação a VEGF, sFlt-1 ou PIGF.
55. Kit de acordo com a reivindicação 52, em que o referido dis- túrbio hipertensivo relacionado à gravidez é pré-eclampsia, eclampsia, hiper- tensão crônica, síndrome HELLP, hipertensão gestacional ou gravidez com um bebê SGA.
56. Método de identificação de um composto que alivia um dis- túrbio hipertensivo relacionado à gravidez, o referido método compreenden- do: (a) contato de uma célula com um composto de endoglina solú- vel; (b) determinação do estado de fosforilação de Thr495 de eNOS na referida célula da etapa (a); (c) contato da referida célula com um composto candidato; (d) determinação do estado de fosforilação de Thr495 de eNOS na referida célula da etapa (c); e (e) comparação do estado de fosforilação determinado na etapa (b) e etapa (d), em que um aumento na desfosforilação de Thr495 de eNOS na etapa (d), quando comparado com a etapa (b), identifica o referido com- posto candidato como um composto que alivia um distúrbio hipertensivo re- lacionado à gravidez.
57. Método de identificação de um composto que alivia um dis- túrbio hipertensivo relacionado à gravidez, o referido método compreenden- do: (a) contato de uma célula com uma estrutura repórter Smad2/3 dependente e um composto de endoglina solúvel, (b) determinação do nível de ativação da estrutura repórter Smad2/3 na célula da etapa (a); (c) contato da referida célula da etapa (a) com um composto candidato; (d) determinação do nível de ativação da estrutura repórter Smad2/3 na célula da etapa (c); e (e) comparação do nível de ativação da estrutura repórter Smad2/3 determinada na etapa (b) e etapa (d), em que um aumento no nível de ativação da estrutura repórter Smad2/3 na etapa (d), quando comparado com a etapa (b), identifica o referido composto candidato como um composto que alivia um distúrbio hipertensivo relaciona- do à gravidez.
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