CN111458512A - 一种动脉粥样硬化生物标志物及其用途 - Google Patents
一种动脉粥样硬化生物标志物及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种动脉粥样硬化生物标志物及其用途。本发明提供用于检测Tpm2的物质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化。本发明所提供的动脉粥样硬化疾病的生物标志物Tpm2的ROC曲线AUC值为1，比已知ILK和DCN的ACU值高，说明相较于已知的ILK、DCN，本发明所提供的生物标志物能更好地表征动脉粥状硬化疾病状态。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种动脉粥样硬化生物标志物及其用途。
背景技术
动脉粥状硬化(Atherosclerosis)是一种慢性炎症性疾病，在西方国家的心血管疾病中具有较高的发病率和死亡率。动脉粥状硬化的发展常常伴随许多循环系统失衡，包括冠状动脉疾病和脑血管疾病等(Falk,2006)。对于心脏，动脉粥状硬化可引起冠状动脉狭窄，从而引发心肌梗塞和心力衰竭。对于大脑，硬化斑块的狭窄和破裂会导致短暂性脑缺血、缺血性中风和出血性中风等。当斑块狭窄影响到肾动脉分支时，会导致肾脏损伤和一般高血压，而当处于四肢的其他动脉分支时，动脉粥状硬化会引起外周动脉闭塞和严重的肢体缺血(Wu et al., 2017)。
动脉粥状硬化的标志在于含有脂质的巨噬细胞在动脉壁内皮下积聚，并促进动脉壁炎症反应，进而导致多种致病后果，如出血、破裂和钙化等(Lu and Daugherty,2015)。硬化的斑块可以稳定多年，但也可以迅速变得不稳定，发生破裂并引发血栓。因此，动脉粥状硬化斑块的存在与心肌梗死等急性心血管疾病风险息息相关(Emini Veseli et al.,2017)。过去十年，对动脉粥状硬化的生物学和遗传学基础方面研究日益增加，包括动脉粥状硬化疾病的脂代谢、炎症和免疫反应等过程，但是对于动脉粥状硬化早期疾病发生分子机理的研究却很少，同时也缺乏能够表征疾病进程的生物标志物。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种生物标志物及其用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供用于检测Tpm2的物质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化。
在本发明一些实施方式中，用于检测Tpm2的物质和用于检测SLC25A5的物质的组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化。
在本发明一些实施方式中，用于检测Tpm2的物质和用于检测DAG1的物质的组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化。
在本发明一些实施方式中，用于检测Tpm2的物质、用于检测SLC25A5的物质和用于检测DAG1的物质的组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化。
在本发明一些实施方式中，用于检测Tpm2的物质为用于检测Tpm2表达量的试剂。
在本发明一些实施方式中，用于检测SLC25A5的物质为用于检测SLC25A5表达量的试剂。
在本发明一些实施方式中，用于检测DAG1的物质为用于检测DAG1表达量的试剂。
在本发明一些实施方式中，所述试剂盒根据Tpm2的表达量，诊断对象是否患有动脉粥状硬化和/或表征动脉粥状硬化的进程。
在本发明一些实施方式中，所述试剂盒根据Tpm2和/或SLC25A5和/或DAG1的表达量。
在本发明一些实施方式中，所述试剂盒针对受试对象的动脉粥样硬化疾病的靶向器官组织。
在本发明一些实施方式中，所述试剂盒针对受试对象的主动脉组织、肝脏组织、脂肪组织、血液组织中的一种或多种的组合。
在本发明一些实施方式中，所述试剂盒用于诊断早期动脉粥样硬化。
本发明另一方面提供一种检测试剂盒，包括用于检测Tpm2的物质。
在本发明一些实施方式中，还包括用于检测SLC25A5的物质。
在本发明一些实施方式中，还包括用于检测DAG1的物质。
在本发明一些实施方式中，包括用于检测Tpm2的物质和用于检测SLC25A5的物质的组合。
在本发明一些实施方式中，包括用于检测Tpm2的物质和用于检测DAG1的物质的组合。
在本发明一些实施方式中，包括用于检测Tpm2的物质、用于检测SLC25A5的物质和用于检测DAG1的物质的组合。
本发明另一方面提供一种生物标志物，包括Tpm2；可选的，还包括SLC25A5；可选的，还包括DAG1。
在本发明一些实施方式中，所述生物标志物选自Tpm2和SLC25A5的组合。
在本发明一些实施方式中，所述生物标志物选自Tpm2和DAG1的组合。
在本发明一些实施方式中，所述生物标志物选自Tpm2、SLC25A5和DAG1的组合。
本发明另一方面提供所述生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化。
附图说明
图1显示为动物血浆中总胆固醇(TC，图1A)和甘油三酯含量(TG，图1B)(CD2：2 周正常饮食，CD6：6周正常饮食，HFD_R2：2周高脂高胆固醇饮食，HFD_WR6：6周高脂高胆固醇饮食抵抗组，HFD_R6：6周高脂高胆固醇饮食敏感组)。
图2显示为主动脉组织蛋白质组学分析流程(CD2：2周正常饮食，CD6：6周正常饮食， HFD_R2：2周高脂高胆固醇饮食，HFD_WR6：6周高脂高胆固醇饮食抵抗组，HFD_R6：6 周高脂高胆固醇饮食敏感组)。
图3显示为高脂高胆固醇饮食下兔子主动脉蛋白质的整体变化(A)兔子主动脉整体蛋白质组PCA图(1132个蛋白质)。(B)方差分析和TukeyHSD检验挑选162个差异蛋白heatmap 热图。(C)162个差异蛋白表现出6种不同的表达谱。(D)上调和下调差异蛋白生物学过程 GO富集情况。蓝色表示富集p小于0.05，红色表示BH矫正后p小于0.05。CD2：2周正常饮食，CD6：6周正常饮食，HFD_R2：2周高脂高胆固醇饮食，HFD_WR6：6周高脂高胆固醇饮食抵抗组，HFD_R6：6周高脂高胆固醇饮食敏感组。
图4显示为动脉粥状硬化生物标志物的表达谱(A：Tpm2，C：SLC25A5，E：DAG1) 和ROC曲线(B：Tpm2，D：SLC25A5，F：DAG1)。CD2：2周正常饮食，CD6：6周正常饮食，HFD_R2：2周高脂高胆固醇饮食，HFD_WR6：6周高脂高胆固醇饮食抵抗组，HFD_R6： 6周高脂高胆固醇饮食敏感组。
具体实施方式
本发明发明人经过大量研究，通过高脂饮食喂养新西兰白兔，进而促使动脉粥状硬化发生，并进一步通过对高脂饮食敏感组、高脂饮食抵抗组以及正常饮食组下兔子主动脉的定量蛋白质组学分析，发现了162个差异蛋白，其中Tpm2在动脉粥状硬化疾病组(HFD_R6)和正常组(CD6)中存在显著差异，可以作为疾病进程的生物标志物，在此基础上完成了本发明。
本发明第一方面提供用于检测Tpm2的物质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化。Tpm2，β-原肌球蛋白异构体2，属于tropomyosin(TM)基因家族，EMBL编号AIC82815.1，是一种卷曲螺旋二聚体蛋白质，在横纹肌、平滑肌以及非肌肉细胞中具有重要功能。在脊椎动物横纹肌中，肌动蛋白、TM、肌钙蛋白(Tn)复合物(Tn-I、Tn-C、Tn-T) 和tropomodulin(Tmod)一起构成细丝，负责介导Ca2+控制的肌肉收缩和松弛(Dube et al.,2014)。在正常状态下，血管平滑肌细胞的主要功能是通过主动收缩和放松来维持血管稳态，而在动脉粥状硬化疾病中，由于受到周围环境影响下(比如脂质滞留、炎症因子等)，该功能会收到抑制(Steucke et al.,2015)。此外，动脉粥状硬化的早期病变造成内皮细胞损伤，引起内侧平滑肌细胞的迁移、增殖和表型调节，但是这个过程中血管平滑肌收缩跟疾病关系却尚未清楚，而Tpm2在其中扮演角色也未可知。本发明中，发明人通过高脂饮食喂养新西兰白兔，进而促使动脉粥状硬化发生，但在实验过程中，不同兔子对疾病的反应程度存在差异，一部分兔子对疾病敏感，会形成动脉粥状硬化斑块(HFD_R6)，而另一部分兔子对疾病具有抵抗性，不易形成斑块(HFD_WR6)。因此，我们通过对高脂饮食敏感组、高脂饮食抵抗组以及正常饮食组下兔子主动脉的定量蛋白质组学分析，发现了162个差异蛋白，这些差异蛋白表达谱呈现6种不同的形式，Cluster3和Cluster5为动脉粥状硬化疾病表征蛋白。其中Tpm2、 SLC25A5、DAG1这3个蛋白质在动脉粥状硬化疾病组(HFD_R6)和正常组(CD6)中存在显著差异，其中，Tpm2在2周高脂高胆固醇饮食诱导后蛋白水平降低，6周敏感组进一步降低，而在6周抵抗组中却更接近于对照组，同时，Tpm2蛋白ROC曲线AUC值为1，能很好区分动脉粥状硬化疾病和正常状态，可作为有效的生物标志物。另外，本发明所公开的实施例的数据中，整合素连接激酶(ILK)是一种调节血管完整性的关键调节因子，也是一种依赖于磷酸肌醇3激酶的丝氨酸/苏氨酸激酶，与β-整联蛋白细胞质部分结构域结合，位于许多细胞内的上游信号通路。ILK在血管生成、基质-内皮细胞相互作用、内皮细胞和细胞外基质介导的信号传导等都发挥关键作用(Lal et al.,2009)。Beatriz Herranz等人发现，与未患病组织相比，ILK在动脉粥状硬化的动脉中表现出完全不同的分布，随着动脉粥状硬化的不断发展，ILK从内皮细胞层消失。在ILK缺陷鼠(cKO)中，ILK的删除造成内皮NOS(eNOS) 解偶联，四氢生物蝶呤(BH4)降低而BH2增加，二氢叶酸还原酶表达降低，进而增加eNOS 依赖型超氧化物的产生同时伴随广泛的血管蛋白硝化。ILK再表达可阻止cKO细胞中eNOS 解偶联，使得超氧化物的形成不再受ILK删除影响。最后，作者表明，ILK在体内可防止eNOS 解偶联的作用，同时ILK可作为预防血管疾病中内皮细胞功能障碍的治疗靶标(Herranz et al.,2012)。在我们的数据中，ILK为动脉粥状硬化保护蛋白质，在疾病发生组(HFD_R2和 HFD_R6)中下调，而在6周抵抗组中(HFD_WR6)恢复到正常水平，但其AUC值为0.94。 Decorin(DCN)属于富含亮氨酸的小蛋白多糖(SLRP)家族，由一个富含亮氨酸重复序列的蛋白质核心组成(Yamakawa et al.,2000)。来自体外和体内动物模型的各项研究表明decorin 在减轻动脉粥状硬化进展的重要作用。decorin在不同血管中的分布已被证明与动脉粥状硬化发展趋势成反比(Singla et al.,2011)。Al Haj Zen及其同事研究了decorin是否为动脉粥状硬化程度的标志物，以及是否在抑制动脉粥状硬化形成中发挥积极作用这两个问题。在他们的研究中，系统性decorin过表达可显著减少ApoE缺失小鼠中动脉粥状硬化斑块的形成，这与巨噬细胞减少和胶原蛋白累积、明胶酶活性降低有关。此外，血清中甘油三酯水平也降低，说明系统性表达decorin可以调节脂质代谢(Al Haj Zen et al.,2006)。在本发明实施例所公开的数据中，ILK在高脂高胆固醇饮食抵抗组(HFD_WR6)中保持高水平，而在高脂高胆固醇饮食敏感组(HFD_R2和HFD_R6)中保持低水平，也表现出与动脉粥状硬化程度相反的趋势，但其AUC值为0.89。可见，Tpm2相较于已知的两种生物标志物具有更高AUC值，可以作为更加有效的动脉粥状硬化疾病的生物标志物。
本发明第一方面所提供的用途中，用于检测Tpm2的物质可选地与用于检测SLC25A5的物质组合。Solute carrier family 25 member 5(溶质载体家族25成员5，SLC25A5)，Ensembl 编号ENSOCUP00000011416，该基因的产物，腺嘌呤核苷酸转运蛋白2(ANT2)，作为线粒体通透性转换孔复合物的主要成分，催化线粒体ATP与细胞溶质ADP的交换。由于其反向转运功能，ANT2通过调节氧化磷酸化中的ADP/ATP比率来维持线粒体膜电位(Vandewalle et al.,2013)。SLC25A5在未分化细胞或者能够增殖和再生的组织中特异性表达，比如癌组织中，因此被作为抗癌的潜在治疗靶点(Clemencon et al.,2013)。但是在动脉粥状硬化疾病中，尚没有研究表明SLC25A5与心血管疾病之间的关联。在本发明实施例所公开的数据中，SLC25A5 在疾病发生组(HFD_R2和HFD_R6)中高表达，在正常组(CD2和CD6)和高脂高胆固醇饮食抵抗组(HFD_WR6)中低表达，且对于HFD_R6和CD6区分的ROC曲线AUC值为1，可作为有效的生物标志物。
本发明第一方面所提供的用途中，用于检测Tpm2的物质可选地包括用于检测DAG1的物质组合。Dystroglycan(DG或者DAG1)被认为是多种组织中基底膜和细胞骨架之间的关键联系，广泛分布于内皮细胞和上皮细胞中，EMBL编号CAA45732.1。DAG1由两个亚基组成，一个与层粘连蛋白和其他基底膜组分结合的细胞外α-亚基和一个跨膜β-亚基，并作为细胞粘附受体起作用(Jarad et al.,2011)。Dystrophin–glycoprotein(DGC)复合物是一种将肌动蛋白细胞骨架和细胞外基质连接的多组分跨膜复合物，对心肌细胞稳态至关重要。Yuka Morikawa等发现DGC组件成分dystrophin1(DAG1)直接结合Hippo通路效应分子Yap，从而抑制小鼠心肌细胞增殖(Morikawa et al.,2017)。在动脉粥状硬化疾病中，主动脉内侧平滑肌细胞会发生迁移、增殖，进而纤维斑块，最后产生斑块，且DAG1广泛分布于内皮细胞，但是DAG1在动脉粥状硬化疾病发生时的作为尚不清楚，其与血管平滑肌迁移和增殖间作用也不十分清楚。在本发明实施例所公开的数据中，DAG1在2周高脂高胆固醇饮食诱导后蛋白水平降低，6周敏感组进一步降低，而在6周抵抗组中却更接近于对照组，同时，DAG1蛋白ROC曲线AUC值为1，能很好区分动脉粥状硬化疾病和正常状态，可作为有效的生物标志物。
在本发明一具体实施例中，可以是用于检测Tpm2的物质和用于检测SLC25A5的物质的组合在制备试剂盒中的用途。在本发明另一具体实施例中，可以是用于检测Tpm2的物质和用于检测DAG1的物质的组合在制备试剂盒中的用途。在本发明另一具体实施例中，可以是用于检测Tpm2的物质、用于检测SLC25A5的物质和用于检测DAG1的物质的组合在制备试剂盒中的用途。
本发明第一方面所提供的用途中，用于检测Tpm2的物质可以是与用于检测Tpm2的试剂，更具体可以是用于检测Tpm2表达量的试剂，检测Tpm2表达量的试剂对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是基于液相色谱质谱标记定量或非标记定量分析方法、免疫学方法(例如，ELISA等)等方法的试剂。用于检测SLC25A5的物质可以是与用于检测SLC25A5的试剂，更具体可以是用于检测SLC25A5表达量的试剂，检测SLC25A5表达量的试剂对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是基于液相色谱质谱标记定量或非标记定量分析方法、免疫学方法(例如，ELISA等)等方法的试剂。用于检测DAG1 的物质可以是与用于检测DAG1的试剂，更具体可以是用于检测DAG1表达量的试剂，检测 DAG1表达量的试剂对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以是基于液相色谱质谱标记定量或非标记定量分析方法、免疫学方法(例如，ELISA等)等方法的试剂。在本发明一具体实施例中，所述试剂盒的使用方法可以包括：标记样品，获取Tpm2和/或SLC25A5 和/或DAG1的表达量，用于标记样品的通常包括用于检测Tpm2的物质和/或用于检测 SLC25A5的物质和/或用于检测DAG1的物质。
本发明第一方面所提供的用途中，通常可以根据受试对象所提供的组织中Tpm2和/或 SLC25A5和/或DAG1的表达量，诊断对象是否患有动脉粥状硬化和/或表征动脉粥状硬化的进程。例如，当受试对象所提供的样品中Tpm2表达量较低时，例如，表达量不高于正常组织表达量的50％、60％、70％、80％、90％、或95％时，则认为对象有更大的可能患有动脉粥状硬化，倍数越高则通常患有动脉粥状硬化的可能性更大或有较严重的动脉粥状硬化疾病。再例如，当受试对象所提供的样品中SLC25A5表达量较高时，例如，高于正常组织表达量至少1.05倍、1.1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍时，则认为对象有更大的可能患有动脉粥状硬化，倍数越高则通常患有动脉粥状硬化的可能性更大或有较严重的动脉粥状硬化疾病。再例如，当受试对象所提供的样品中DAG1表达量较低时，例如，表达量不高于正常组织表达量的50％、60％、70％、80％、90％、或95％时，则认为对象有更大的可能患有动脉粥状硬化，倍数越高则通常患有动脉粥状硬化的可能性更大或有较严重的动脉粥状硬化疾病。所述动脉粥状硬化可以是早期动脉粥样硬化，该阶段主动脉还没有明显的斑块形成，但是血浆中内胆固醇和甘油三酯含量已经明显升高。
本发明第一方面所提供的用途中，所述试剂盒可以是针对受试对象的动脉粥样硬化疾病的靶向器官组织，所述动脉粥样硬化疾病的靶向器官组织通常指能够动脉粥样硬化疾病发生发展过程中发生生理病理变化的组织器官，例如，所述动脉粥样硬化疾病的靶向器官组织可以是包括但不限于主动脉组织、肝脏组织、脂肪组织、血液组织等中的一种或多种的组合。再例如，所述试剂盒通常可以用来测量受试对象动脉粥样硬化疾病的靶向器官组织中的Tpm2 和/或SLC25A5和/或DAG1的表达量，从而可以对受试对象进行诊断。
本发明第二方面提供一种检测试剂盒，包括：用于检测Tpm2的物质；可选的，还可以包括用于检测SLC25A5的物质；可选的，还可以包括用于检测DAG1的物质。在本发明一具体实施例中，所述检测试剂盒包括用于检测Tpm2的物质和用于检测SLC25A5的物质的组合；在本发明另一具体实施例中，所述检测试剂盒包括用于检测Tpm2的物质和用于检测 DAG1的物质的组合；在本发明另一具体实施例中，所述检测试剂盒包括用于检测Tpm2的物质、用于检测SLC25A5的物质和用于检测DAG1的物质的组合。用于检测Tpm2的物质、用于检测SLC25A5的物质和用于检测DAG1的物质的具体选择，以及试剂盒具体的使用方法可以参见本发明第一方面，在此不作赘述。
本发明所提供的检测试剂盒中，还可以包括其他试剂，本领域技术人员可根据检测试剂盒所对应的检测原理，在检测试剂盒中选择加入所需的试剂。
本发明第三方面提供一种生物标志物，所述生物标志物选自Tpm2，所述生物标志物还可以可选地包括SLC25A5；所述生物标志物还可以可选地包括DAG1。生物标志物(Biomarker) 通常指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标，从而可以被用于疾病的诊断、预后或风险评估等。在本发明一具体实施例中，所述生物标志物选自Tpm2。在本发明一具体实施例中，所述生物标志物选自Tpm2和SLC25A5 的组合。在本发明另一具体实施例中，所述生物标志物选自Tpm2和DAG1的组合。在本发明另一具体实施例中，所述生物标志物选自Tpm2、SLC25A5和DAG1的组合。受试对象所提供的组织中生物标志物Tpm2和/或SLC25A5和/或DAG1与诊断对象是否患有动脉粥状硬化和/或表征动脉粥状硬化的进程的关系参照本发明第一方面，在此不作赘述。
本发明第四方面提供本发明第三方面所提供的生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化。
本发明第五方面提供一种诊断方法，包括：获取对象Tpm2的表达量，从而诊断对象是否患有动脉粥状硬化和/或表征动脉粥状硬化的进程；可选的，还可以获取对象SLC25A5的表达量；可选的，还可以获取对象DAG1的表达量。例如，可以获取对象Tpm2的表达量；再例如，可以获取对象Tpm2和SLC25A5的表达量；再例如，可以获取对象Tpm2和DAG1 的表达量；再例如，可以获取对象Tpm2、SLC25A5和DAG1的表达量。获取对象相关生物标志物的表达量的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以采用本发明第二方面所提供的试剂盒，获取对象的生物标志物的表达量。受试对象所提供的组织中Tpm2和/ 或SLC25A5和/或DAG1的表达量与诊断对象是否患有动脉粥状硬化和/或表征动脉粥状硬化的进程的关系参照本发明第一方面，在此不作赘述。
本发明所提供的动脉粥样硬化疾病的生物标志物Tpm2、SLC25A5、DAG1的ROC曲线AUC值均为1，比已知ILK和DCN的ACU值高，说明相较于已知的ILK、DCN，本发明所提供的生物标志物能更好地表征动脉粥状硬化疾病状态。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
1、动物和主动脉收集
实施例中共使用41只健康雄性新西兰白兔，并在实验前将其饲养4.5个月。在实验组中，给动物(n＝25)喂养高脂高胆固醇饮食(脂肪含量6％，胆固醇含量第一周是1％，之后0.5％， 21.1％卡路里来自脂肪)，喂养时间为2周(n＝8，HFD_R2)和6周(n＝17)。在6周高脂高胆固醇饮食条件下，一部分动物表现出动脉粥状硬化特征，即高脂高胆固醇饮食下疾病敏感组(Response Group，HFD_R6，n＝8)，而另一部分动物不易形成斑块，即高脂高胆固醇饮食下疾病抵抗组(Weak response Group，HFD_WR6，n＝9)。敏感组和抵抗组的区分依赖于兔子血浆中总胆固醇含量(TC，Serum total cholesterol)。在对照组中，给动物(n＝16)喂养正常食物，喂养时间为2周(n＝8，CD2)和6周(n＝8，CD6)。
在高脂高胆固醇饮食或正常饮食的0w，2周，4周，6周分别取动物血浆，分析其中脂质成分。禁食16小时后从兔子收集血液样品，使用Wako测定试剂盒(方法参照官网说明书TC，439-17501，TG，290-63701)测量总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量。
在规定时间取出条件处理后兔子并禁食16小时，注射过量的戊巴比妥钠溶液麻醉动物并安乐死，迅速收集主动脉根部，并置于液氮中暂存，之后移至-80℃储存。
2、蛋白提取和样品制备
使用全自动样品冷冻研磨仪(JX-FSTPRP，上海净信科技)对冷冻的主动脉进行匀浆，使用含有SDS裂解液(4％SDS，100mM Tris-HCl，0.1M DTT，pH 7.6)裂解组织，然后4℃，12000g离心10min，保留中间澄清组分，煮沸5min进行变性和二硫键还原，短暂离心后取上清。用295nm为激发波长和350nm为发射波长的色氨酸荧光定量法测定蛋白质浓度(Thakuret al.,2011)。用稍微修改过的过滤辅助样品制备(FASP方法见文献(Wisniewski et al.,2009))方法对蛋白样品进行Trypsin酶解，酶解缓冲液使用与TMT10标记兼容的TEAB体系(100mM TEAB，Triethylammonium bicarbonate)。使用TMT10(Thermo Scientific)对不同通道样品进行标记，标记方法参考试剂盒说明书。为了避免TMT10不同试剂之间的技术偏差，每个TMT10 其中一个通道加入相同的Mix，方便后续标准化处理和不同TMT10实验之间的比较。肽段纯化方法为StageTip脱盐(Rappsilber et al.,2007)。
3、液相色谱-串联质谱鉴定
样品制备完毕后首先进入C18反相高效液相色谱EASY-nLC 1000(Thermo FisherScientific)，进一步分流，再进入质谱(Q ExactiveTM HF-X)分析。液相A液为0.1％FA/H2O，B液为0.1％FA/ACN，柱子75μm x 150mm，3μm填料。液相流速300nl/min，总共120min，色谱梯度为(％B)：时间，(2％-5％)：2min，(5％-30％)：96min，(30％-45％)：12min， (45％-90％)：2min，(90％)：8min。质谱采集一级全扫300-1500m/z，分辨率120000@m/z 200，AGCtarget为3E6，maximum IT为50ms。二级扫描为数据依赖型采集模式(Top 25)， HCD碎裂，分辨率为60,000@m/z 200，AGC target设置为1E5，maximum IT为45ms， isolation window为1.2m/z，35.0％NCE，orbitrap检测器检测。动态排除设置为：重复次数， 1；动态排除时间，30s。所有数据通过Xcalibur软件进行采集。
4、数据库搜索
所有Raw文件通过MaxQuant 1.5.2.8软件进行数据检索(Cox et al.,2009)，数据库Uniprot 兔子数据库(2018年7月下载)。固定修饰：Carbamidomethyl，可变修饰：Oxidation(M)， Acetyl(Protein N-term)，repoter ion MS2 TMT10，reporter masstolerance 0.04ppm，肽段first search和main search的质量容忍度分别设置为20ppm和4.5ppm。肽段和蛋白质的FDR均设置0.01。酶酶切位点和miss位点数：Trypsin KR/miss-cleave＝2。
5、生物统计学分析
蛋白定量结果分别进行纵向中位数矫正，横向相同参入样品Mix矫正，数据分析和统计学检验在软件R和Excel上完成。通路富集用DAVID软件完成，count number设置为2，使用原始p-value并设置阈值为0.05，以兔子全蛋白质数据库作为背景进行富集分析。
对5个组别进行方差分析，以校正后pvalue(BH)0.05为阈值，且CD2&HFD_R2， HFD_R6&HFD_WR6，CD6&HFD_R6，CD6&HFD_WR6任意一组TukeyHSD检验p小于0.05，则视为差异蛋白。差异蛋白通过R语言fuzzy c-means分类后发现一类蛋白质可作为动脉粥状硬化的生物标志物。
6、结果分析
(1)高脂饮食下兔子对动脉粥状硬化疾病反应存在差异
实验动物在条件处理的0w，2周，4周，6周检测其血浆脂质成分(TC和TG)，发现高脂高胆固醇饮食下兔子对疾病的反应存在差异，一部分动物表现出动脉粥状硬化特征，即高脂高胆固醇饮食下疾病敏感组(Response Group，HFD_R6，n＝8)，而另一部分动物不易形成斑块，即高脂高胆固醇饮食下疾病抵抗组(Weak response Group，HFD_WR6，n＝9)，具体表现为抵抗组的TC大约是敏感组的50％，具体如图1所示，其中，动物血浆中总胆固醇(TC，左图)和甘油三酯含量(TG，右图)(CD2：2周正常饮食，CD6：6周正常饮食，HFD_R2： 2周高脂高胆固醇饮食，HFD_WR6：6周高脂高胆固醇饮食抵抗组，HFD_R6：6周高脂高胆固醇饮食敏感组)。因此，本次实验分为5个条件，分别为2周正常饮食(CD2，n＝8)，6周正常饮食(CD6，n＝8)，2周高脂高胆固醇饮食(HFD_R2，n＝8)，6周高脂高胆固醇饮食抵抗组(HFD_WR6，n＝9)和6周高脂高胆固醇饮食敏感组(HFD_R6，n＝8)。
(2)实验流程和数据概览
样品有5个组别，每个组8～9只兔子，共41个兔子主动脉样品，分成5个TMT10进行标记，每个TMT10有1～2个相同的Mix样品，便于后期矫正从而消除不同TMT10的技术偏差。肽段标记效率均在99％以上，5组TMT10共鉴定1761个蛋白质，对应11332个肽段。 41个样品都能定量到的蛋白质有1132个蛋白质，根据表型、血浆中脂质含量和蛋白质组情况每组挑选6只兔子进行后续差异分析和疾病生物标志物筛选，主动脉组织蛋白质组学分析整体流程如图2所示，其中，CD2：2周正常饮食，CD6：6周正常饮食，HFD_R2：2周高脂高胆固醇饮食，HFD_WR6：6周高脂高胆固醇饮食抵抗组，HFD_R6：6周高脂高胆固醇饮食敏感组。
(3)差异蛋白质组学分析
对5个组别进行方差分析，以校正后pvalue(BH)0.05为阈值，且CD2&HFD_R2， HFD_R6&HFD_WR6，CD6&HFD_R6，CD6&HFD_WR6任意一组TukeyHSD检验p小于0.05，以此为标准共挑出162个差异蛋白质。高脂高胆固醇饮食下，新西兰白兔的蛋白质组学存在明显差异，图3A表示整体蛋白质组的聚类情况(1132个蛋白质)，图3B表示162个差异蛋白的聚类情况。2周的饮食诱导已产生较明显的蛋白重组，6周差异进一步增加。为了研究早期动脉粥状硬化疾病的发生机制，选择了6周作为实验节点，这个时候主动脉还没有明显斑块产生，但是高脂高胆固醇饮食诱导的兔子敏感组血浆内胆固醇和甘油三酯含量明显升高。在高脂高胆固醇饮食中，动脉粥状硬化出现抵抗性的兔子有利于我们寻找更好的疾病标志物。
162个差异蛋白表达谱表现出不同的变化趋势，其中Cluster3和Cluster5含有早期动脉粥状硬化特征标志物，即Cluster3为疾病保护因子，共31个，Cluster5为疾病驱动因子，共9 个(图3C)。上调的Cluster2，Cluster4，Cluster5主要富集到脂蛋白代谢，胆固醇流，磷脂流，脂质运输，胆固醇代谢，VLDL颗粒清除负调控、血管生成负调控等生物学过程，下调的 Cluster1，Cluster3，Cluster6主要富集到谷胱甘肽代谢、ATP合成耦合联质子传输、细胞氧化还原稳态、三羧酸循环、细胞骨架锚定在质膜、肌动蛋白丝解聚负调控等生物学过程(图3D)。
动脉粥状硬化的早期病变是由于循环脂质(脂质渗出)和血浆其他大分子成分的局部积聚，从而改变内皮细胞通透性，造成内皮细胞损伤。局灶性内皮脱落会刺激血小板源性生长因子的粘附和局部释放，从而引起内侧平滑肌细胞的迁移、增殖和表型调节，进而形成纤维斑块，最后产生动脉粥状硬化斑块(Gimbrone and Garcia-Cardena,2016)。在我们的数据中，动脉粥状硬化发生组(HFD_R2，HFD_R6)的脂代谢上调，包括胆固醇流，磷脂流，脂质运输和代谢等，且抑制VLDL颗粒清除通路负调控增加，说明VLDL清除受阻，循环低密度脂蛋白含量会增加，最后导致脂质滞留在内皮细胞，同时，当发生动脉粥状硬化时细胞氧化还原稳态也被破坏。
(4)疾病生物标志物的发现
为了获得更有效可靠的生物标志物，对脉粥状硬化特征标志物表达谱(Cluster3和Cluster5)中40个蛋白质进行CD6和HFD_R6的t检验，p值阈值为0.05。同时为了保证生物标志物能很好地表征疾病状态，对每个蛋白质进行ROC检验，并计算CD6和HFD_R6两组区分的AUC值。最终，我们筛选出了5个差异显著的蛋白质，其中包括2个已知的动脉粥状硬化相关蛋白(表1)。除了SLC25A5，其他4个蛋白均为动脉粥状硬化保护蛋白，而 SLC25A5是疾病驱动蛋白(图4A)。Tpm2、SLC25A5、DAG1的ROC曲线AUC值均为1，比已知ILK和DCN的ACU值高(ILK的AUC为0.94，DCN为0.89)，它们都可以将动脉粥状硬化疾病发生组HFD_R6和正常组CD6分开，表明这3个蛋白质可以作为动脉粥状硬化疾病生物标志物(图4B)。
表1 动脉粥状硬化疾病表征5个特征蛋白
可见，对动脉粥状硬化特征标志物表达谱(Cluster3和Cluster5)中40个蛋白质进行CD6 和HFD_R6的t检验和ROC检验，筛选出5个差异显著的蛋白质，其中包括2个已知的动脉粥状硬化相关蛋白。Tpm2、SLC25A5、DAG1的ROC曲线AUC值均为1，比已知ILK和 DCN的ACU值高(ILK的AUC为0.94，DCN为0.89)，说明相较于已知ILK、DCN，Tpm2、 SLC25A5、DAG1能更好地表征动脉粥状硬化疾病状态。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.用于检测Tpm2的物质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，用于检测Tpm2的物质和用于检测SLC25A5的物质的组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化；
和/或，用于检测Tpm2的物质和用于检测DAG1的物质的组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化；
和/或，用于检测Tpm2的物质、用于检测SLC25A5的物质和用于检测DAG1的物质的组合在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，用于检测Tpm2的物质为用于检测Tpm2表达量的试剂；
和/或，用于检测SLC25A5的物质为用于检测SLC25A5表达量的试剂；
和/或，用于检测DAG1的物质为用于检测DAG1表达量的试剂。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒根据Tpm2的表达量，诊断对象是否患有动脉粥状硬化和/或表征动脉粥状硬化的进程，优选还包括SLC25A5和/或DAG1的表达量。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂盒针对受试对象的动脉粥样硬化疾病的靶向器官组织，优选选自主动脉组织、肝脏组织、脂肪组织、血液组织中的一种或多种的组合；
和/或，所述试剂盒用于诊断早期动脉粥样硬化。
6.一种检测试剂盒，包括用于检测Tpm2的物质；
可选的，还包括用于检测SLC25A5的物质；
可选的，还包括用于检测DAG1的物质。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测Tpm2的物质和用于检测SLC25A5的物质的组合；
和/或，包括用于检测Tpm2的物质和用于检测DAG1的物质的组合；
和/或，包括用于检测Tpm2的物质、用于检测SLC25A5的物质和用于检测DAG1的物质的组合。
8.一种生物标志物，包括Tpm2；可选的，还包括SLC25A5；可选的，还包括DAG1。
9.如权利要求8所述的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物选自Tpm2和SLC25A5的组合；
和/或，所述生物标志物选自Tpm2和DAG1的组合；
和/或，所述生物标志物选自Tpm2、SLC25A5和DAG1的组合。
10.如权利要求8～9任一权利要求所述的生物标志物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断动脉粥样硬化。
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|---|---|
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Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2378985A1 (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-18 | Incyte Genomics, Inc. | Atherosclerosis-associated genes |
| CA2424199A1 (en) * | 2000-10-05 | 2002-04-11 | Curagen Corporation | Novel human proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same |
| US20090226420A1 (en) * | 2005-11-10 | 2009-09-10 | Elizabeth Hauser | Methods of Determining the Risk of Developing Coronary Artery Disease |
| CN103025890A (zh) * | 2010-04-06 | 2013-04-03 | 卡里斯生命科学卢森堡控股 | 疾病的循环生物标志物 |
| CN103038645A (zh) * | 2010-04-13 | 2013-04-10 | 普罗诺塔股份有限公司 | 用于妊娠的高血压疾病的生物标志物 |
| US20130122519A1 (en) * | 2010-07-28 | 2013-05-16 | Institut de recerca Hoepital Universitari Vall D'Heerbron, Fundacio Privada | Method for Detection of Ischemic Strokes |
| US20130302821A1 (en) * | 2010-11-17 | 2013-11-14 | National Univeristy Corporation Hokkaido University | Method For Evaluating Atherosclerotic Lesion, And Kit |
| CN104508486A (zh) * | 2012-04-10 | 2015-04-08 | 伊缪诺维亚公司 | 用于确定乳癌相关疾病状态的方法和用于该方法中的阵列 |
| CN105393117A (zh) * | 2013-01-31 | 2016-03-09 | 凯普里昂蛋白质组学公司 | 2型糖尿病生物标志物及其用途 |
| CN105758967A (zh) * | 2016-03-24 | 2016-07-13 | 中国药科大学 | 诊断区分冠状动脉粥样硬化和稳定型心绞痛的标志物群 |
| CN107643402A (zh) * | 2017-08-30 | 2018-01-30 | 福建师范大学 | Tpm2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用、直肠癌预后评估试剂盒及方法 |
| CN109055544A (zh) * | 2018-09-28 | 2018-12-21 | 新乡医学院 | 动脉粥样硬化分子标志物及其应用 |
| US20190017119A1 (en) * | 2017-07-12 | 2019-01-17 | The General Hospital Corporation | Genetic Risk Predictor |
-
2019
- 2019-01-21 CN CN201910053299.XA patent/CN111458512A/zh active Pending
Patent Citations (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2378985A1 (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-18 | Incyte Genomics, Inc. | Atherosclerosis-associated genes |
| US20020015950A1 (en) * | 1999-07-07 | 2002-02-07 | Karen Anne Jones | Atherosclerosis-associated genes |
| CA2424199A1 (en) * | 2000-10-05 | 2002-04-11 | Curagen Corporation | Novel human proteins, polynucleotides encoding them and methods of using the same |
| US20090226420A1 (en) * | 2005-11-10 | 2009-09-10 | Elizabeth Hauser | Methods of Determining the Risk of Developing Coronary Artery Disease |
| CN103025890A (zh) * | 2010-04-06 | 2013-04-03 | 卡里斯生命科学卢森堡控股 | 疾病的循环生物标志物 |
| CN103038645A (zh) * | 2010-04-13 | 2013-04-10 | 普罗诺塔股份有限公司 | 用于妊娠的高血压疾病的生物标志物 |
| US20130122519A1 (en) * | 2010-07-28 | 2013-05-16 | Institut de recerca Hoepital Universitari Vall D'Heerbron, Fundacio Privada | Method for Detection of Ischemic Strokes |
| US20130302821A1 (en) * | 2010-11-17 | 2013-11-14 | National Univeristy Corporation Hokkaido University | Method For Evaluating Atherosclerotic Lesion, And Kit |
| CN104508486A (zh) * | 2012-04-10 | 2015-04-08 | 伊缪诺维亚公司 | 用于确定乳癌相关疾病状态的方法和用于该方法中的阵列 |
| CN105393117A (zh) * | 2013-01-31 | 2016-03-09 | 凯普里昂蛋白质组学公司 | 2型糖尿病生物标志物及其用途 |
| CN105758967A (zh) * | 2016-03-24 | 2016-07-13 | 中国药科大学 | 诊断区分冠状动脉粥样硬化和稳定型心绞痛的标志物群 |
| US20190017119A1 (en) * | 2017-07-12 | 2019-01-17 | The General Hospital Corporation | Genetic Risk Predictor |
| CN107643402A (zh) * | 2017-08-30 | 2018-01-30 | 福建师范大学 | Tpm2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用、直肠癌预后评估试剂盒及方法 |
| CN109055544A (zh) * | 2018-09-28 | 2018-12-21 | 新乡医学院 | 动脉粥样硬化分子标志物及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| EUN HEE KIM等: "Adenine Nucleotide Translocator as a Regulator of Mitochondrial Function: Implication in the Pathogenesis of Metabolic Syndrome", 《KOREAN DIABETES J》 * |
| HUPROT人全蛋白质组芯片: "HuProt v3", 《HTTPS://COLLECTION.CDI-LAB.COM/PUBLIC/DOWNLOADS》 * |
| 孙启玉等: "急性冠脉综合征相关血清及血浆检测标志物研究进展", 《承德医学院学报》 * |
| 张丽丽等: "PGC-1α与动脉粥样硬化的相关机制研究进展", 《中国神经免疫学和神经病学杂志》 * |
| 李燕等: "大鼠ANT1基因腺病毒载体的构建及体外表达", 《中国老年学杂志》 * |
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