CN105393117A - 2型糖尿病生物标志物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于诊断和预测受试者的葡萄糖耐量受损的发展和受试者的糖尿病进展的生物标志物、方法和试剂盒，以及用于鉴定可抑制受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展；降低或减慢受试者的正常葡萄糖耐量进展至空腹糖血受损、至葡萄糖耐量受损和/或至糖尿病；和/或降低或抑制与受试者的所述疾病相关的并发症的发展的化合物的方法，和用于抑制受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展；降低或减慢受试者的正常葡萄糖耐量进展至空腹糖血受损、至葡萄糖耐量受损和/或至糖尿病；和/或降低或抑制与受试者的所述疾病相关的并发症的发展的方法。

Description

2型糖尿病生物标志物及其用途
相关申请
本申请要求提交于2013年1月31日的美国临时专利申请序列号61/758,987的优先权，其全部内容通过引用结合到本文中。
发明背景
2型糖尿病(亦称为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)或成年型糖尿病)是代谢性疾病，其特征为在存在胰岛素抵抗和相对胰岛素缺乏时的高血糖。2型糖尿病是进行性疾病，其中心肌梗死、中风、微血管事件和死亡率的风险都与高血糖症强相关。2型糖尿病也是具有β-细胞功能的显著减退和经常在疾病表现的任何症状之前发生的肾损伤的无症状疾病(silent disease)。
从正常葡萄糖耐量发展成2型糖尿病包括空腹葡萄糖受损(IFG)和葡萄糖耐量受损(IGT)的中间阶段，亦称为前驱糖尿病。发生这些葡萄糖代谢改变的病理生理学基础是多因素的，并包括例如生活方式和遗传因素。特别是，在遗传上对2型糖尿病易感的人中，肥胖被认为是2型糖尿病的主要原因，并且在过去50年期间2型糖尿病的比率与肥胖平行地显著增加。相比1985年的大约0.3亿人，到2010年为止，大约2.85亿人患有该疾病。
尽管很多风险因素，例如年龄、体重指数(BMI)和种族，与前驱糖尿病和2型糖尿病的发生相关，但这些因素不足以准确预测从正常葡萄糖耐量发展成葡萄糖耐量受损的风险和/或从葡萄糖耐量受损发展成2型糖尿病的风险，因为糖尿病的发展和进展经常是无症状的，在可识别的症状发作之前发生器官损伤。此外，尽管用于确定受试者是否具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的方法是已知的(例如，葡萄糖耐量测试)，但这样的方法要求过夜禁食和在数小时内多次抽血，并且经常伴有副作用，例如恶心、呕吐、腹部气胀和/或头痛。
因此，因为对具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者和/或具有发展葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的风险的受试者和/或将对特定疗法有反应的那些受试者的早期鉴定将降低与葡萄糖失调相关的短期和长期并发症，所以本领域需要确定哪些受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病和/或对某一疗法有反应的可靠和准确的方法，以允许早期干预。
发明简述
本发明至少部分地基于与葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展相关的和具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者对治疗的反应相关的标志物的发现。因此，本发明通过测量和鉴定特定的标志物或特定的标志物组合，提供用于预测受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的灵敏和容易的方法和试剂盒，用于预测受试者是否具有或将发展糖尿病的方法和试剂盒，以及用于鉴定可减慢葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的进展的化合物的方法，监测某一疗法在减低受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的进展中的功效的方法，和用于抑制在细胞或受试者中葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的进展的方法。
因此，在一个方面，本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的方法。所述方法包括测定在受试者的样品中的本发明的一种或多种标志物的水平，例如表1-3的任一个中所列的任何一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR；将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平上的差异指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
在另一方面，本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的方法。所述方法包括测定在受试者的样品中的本发明的一种或多种标志物的水平，例如，表1-3的任一个中所列的任何一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR；将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平上的差异指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病。
在另一方面，本发明提供用于确定受试者是否将发展2型糖尿病-相关并发症的方法。所述方法包括测定在受试者的样品中的本发明的一种或多种标志物的水平，例如表1-3的任一个中所列的任何一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR；将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平上的差异指示所述受试者将发展2型糖尿病-相关并发症。
在又一个方面，本发明提供用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对某一疗法有反应的方法。所述方法包括测定在受试者的样品中的本发明的一种或多种标志物的水平，例如表1-3的任一个中所列的任何一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR；将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平上的差异指示所述受试者将对所述疗法有反应。
在另一方面，本发明提供用于监测在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中的治疗的功效的方法。所述方法包括在治疗开始之前测定在受试者的第一样品中的本发明的一种或多种标志物的水平，例如表1-3的任一个中所列的任何一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR；在已给予至少一部分治疗后测定受试者的第二样品中的一种或多种标志物的水平；将第一样品中的一种或多种标志物的水平与第二样品中的一种或多种标志物的水平相比较，其中与第二样品中的一种或多种标志物的水平相比，第一样品中的一种或多种标志物的水平上差异指示所述受试者将对所述治疗有反应。
在一个方面，本发明提供用于鉴定可抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展的化合物的方法，所述方法包括将受试者的等分部分的样品与化合物库的每个成员接触；测定化合物库的成员对各等分部分中的本发明的一种或多种标志物的水平和/或活性的影响，例如表1-3的任一个中所列的任何一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR；和选择化合物库的成员，与对照样品中的本发明的一种或多种标志物的水平和/或活性相比，所述成员调节等分部分中的本发明的一种或多种标志物的水平和/或活性，从而鉴定可抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展的化合物。
在另一方面，本发明提供用于抑制受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展的方法。所述方法包括给予所述受试者有效量的试剂，所述试剂调节本发明的任何一种或多种标志物的表达和/或活性，例如表1-3的任一个中所列的任何一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR，从而抑制受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展。
在一个实施方案中，受试者样品中的水平通过质谱法测定。在一个实施方案中，所述质谱法是基质辅助的激光解吸/飞行时间(MALDI/TOF)质谱法、液相色谱四重离子捕获电喷射(LCQ-MS)或表面增强激光解吸电离/飞行时间(SELDI/TOF)质谱法。
在另一个实施方案中，受试者样品中的水平通过免疫测定法测定。
受试者的样品可以是流体样品或组织样品。
在一个实施方案中，所述标志物的水平是标志物的表达水平和/或活性。
在一个实施方案中，所述受试者具有发展2型糖尿病的风险。
在一个方面，本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒。所述试剂盒包括用于测定受试者样品中的一种或多种标志物的水平的试剂，例如表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR，和确定所述受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒使用说明书。
在另一方面，本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒。所述试剂盒包括用于确定受试者样品中的一种或多种标志物的水平的试剂，例如表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR，和确定所述受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒使用说明书。
在又一个方面，本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒。所述试剂盒包括用于测定受试者样品中的一种或多种标志物的水平的试剂，例如表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR，和确定所述受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。
在另一方面，本发明提供用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的试剂盒。所述试剂盒包括用于测定受试者样品中的一种或多种标志物的水平的试剂，例如表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR，和确定所述受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
在又一方面，本发明提供在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的试剂盒。所述试剂盒包括用于测定受试者样品中的一种或多种标志物的水平的试剂，例如表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物；USP9X；SEPT3；INS和SERPINB13；PPY和DAG1；INS、CPM和MMP7；BTC、MMP7和PPY；PPY、SEPT3和PTPRJ；CPM、INS、MMP7和LDLR，和监测所述治疗的功效的试剂盒使用说明书。
在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于从受试者获得样品的试剂。
在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括对照样品。
在一个方面，本发明提供用于鉴定2型糖尿病标志物的方法。所述方法包括在稳定状态条件下鉴定来自两个或更多个物种的两种或更多种器官的分泌泡中的蛋白质；鉴定胰脏β细胞的分泌泡中的蛋白质，从而产生稳定状态标志物的临时列表；从两个或更多个物种的两种或更多种器官中鉴定在稳定状态标志物的临时列表中的标志物，其为胰脏β细胞的分泌泡中的共有标志物，并从稳定状态标志物的临时列表中除去那些标志物，从而产生β细胞质量标志物的列表；鉴定在功能障碍的条件下在胰脏β细胞的分泌泡中的蛋白质，鉴定在正常条件下在胰脏β细胞的分泌泡中的蛋白质，鉴定在功能障碍条件下和在正常条件下差别表达的蛋白质，从而产生β细胞功能标志物的临时列表，测定受试样品和对照样品的样品中的β细胞质量标志物和/或β细胞功能标志物的水平，其中与受试样品中的水平相比，对照样品中的标志物水平的差异鉴定所述标志物为2型糖尿病生物标志物。
在一个实施方案中，受试样品来自具有葡萄糖耐量受损的受试者。在另一个实施方案中，受试样品来自新诊断为2型糖尿病的受试者。在又一个实施方案中，受试样品来自已确定为2型糖尿病的受试者。
在一个实施方案中，对照样品来自具有正常葡萄糖耐量的受试者。在另一个实施方案中，对照样品来自具有葡萄糖耐量受损的受试者。在又一个实施方案中，对照样品来自新诊断为2型糖尿病的受试者。
在另一方面，本发明提供用于鉴定2型糖尿病标志物的方法。所述方法包括鉴定在治疗之前和之后的受试者的样品中差异表达的蛋白质，从而产生治疗功效标志物的列表；测定在获自具有2型糖尿病的受试者的第一样品中的一种或多种标志物的水平，然后提供至少一部分疗法给所述受试者；和提供至少一部分疗法之后，测定在获自所述受试者的第二样品中的蛋白质的水平，其中相对于第一样品，在第二样品中一种或多种标志物的表达水平的差异鉴定所述蛋白质为2型糖尿病标志物。
附图简述
图1描述在制备分泌的蛋白质的过程期间鉴定的蛋白质的蛋白质印记。通过机械破裂制备细胞或组织匀浆物，而分泌途径的囊泡通过蔗糖密度离心来分离。得到的囊泡用盐洗涤，以除去松散结合的蛋白质，用碱打开，和通过高速离心回收分泌的蛋白质内容物。显示来自大鼠细胞系(A)和人原代胰岛(B)的原料(Hom)、中间体(SV)和终产物(SC)制备物的蛋白质印记。蛋白质印记标志物为针对特定的细胞内区室，指示在样品制备期间分泌蛋白的逐渐富集。Hom：匀浆物；SV：分泌囊泡；SC：分泌囊泡内容物；Mb：膜；PM：质膜。
发明详述
本发明至少部分地基于与葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展、2型糖尿病的进展和具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者对治疗有反应相关的标志物的发现。具体而言，在多个体外实验系统中已经发现、以优先顺序排列和验证与2型糖尿病相关的生物标志物。所述标志物被鉴定为表达、例如基本上在β-细胞中特异性表达，和/或鉴定为参与、例如基本上特异性参与β-细胞功能，和/或鉴定为参与对治疗性治疗的反应。
因此，本发明通过测量和鉴定特定的标志物或特定的标志物组合，提供用于预测受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的灵敏和容易的方法和试剂盒、用于预测受试者是否具有或将发展糖尿病的方法和试剂盒、以及用于鉴定可减慢葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的进展的化合物的方法、监测疗法在降低受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的进展中的功效的方法、和用于抑制在细胞或受试者中葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的进展的方法。
本发明的各个方面更详细地描述于以下节段中：
I. 定义
如本文所用，以下术语的每一个具有与其在本部分中相关的含义。
冠词"一个"和"一种"在本文用于指该冠词的一个或超过一个(即至少一个)的语法对象。例如，"要素"意指一个要素或超过一个要素。
“标志物”或“生物标志物”是与另一种表型状态(例如未患有疾病)相比，在取自一种表型状态(例如患有疾病)的受试者的样品中差别存在的有机生物分子。如果在不同组中生物标志物的平均或中位水平、例如表达水平经计算为统计学显著的，则生物标志物在不同的表型状态中差别存在。统计学显著性的常见检验特别包括t-检验、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann- Whitney和优势比。单独或组合的生物标志物提供受试者属于一种表型状态或另一种表型状态的相对风险的度量。因此，它们用作标志物，例如，用于疾病(预后和诊断)、药物的治疗功效(治疗诊断学)和药物毒性的标志物。
在一些实施方案中，用于本发明的组合物和方法的标志物的准确性可通过接收器工作特征曲线(“ROC曲线”)来表征。ROC是对于诊断标志物的不同可能的割点的真阳性率相对假阳性率的曲线。ROC曲线显示灵敏性和特异性之间的关系。即是说，灵敏性的增加将伴随特异性的降低。曲线越靠近ROC空间的左轴，然后顶缘，标志物越准确。相反地，曲线越靠近ROC图的45度对角线，标志物越不准确。ROC下的面积是标志物准确性的度量。标志物的准确性取决于标志物如何适当地将待测试的组分成具有所述疾病的组和不具有所述疾病的组。曲线下面积(称为“AUC”)为1表示完美的标志物，而面积为0.5表示有用性较差的标志物。因此，在一些实施方案中，本发明的生物标志物和方法的AUC大于约0.50、大于约0.60或大于约0.70。
“2型糖尿病”在本文中亦称为“糖尿病”，特征为外周胰岛素抵抗和胰脏β细胞的不充分的胰岛素分泌的组合。如果受试者的空腹血糖(FPG)水平为约126 mg/dL (约7.0 mmol/L)或更高；在75-g口服葡萄糖耐量试验(OGTT)期间2-小时血糖(PG)水平为约200 mg/dL (约11.1 mmol/L)或更高；在具有高血糖症或高血糖危象的症状的受试者中随机血糖为约200 mg/dL (约11.1 mmol/L)或更高；和/或血红蛋白A1c (HbA1c)水平为约6.5%或更高，则“受试者具有糖尿病”。
具有“正常葡萄糖耐量”或“NGT”的受试者在75-g口服葡萄糖耐量试验(OGTT)期间2-小时血糖(PG)水平为小于约140 mg/dL (小于约7.8 mmol/L)；空腹血糖(FPG)水平为小于约110 mg/dL (小于约6.1 mmol/L)；和/或血红蛋白A1c (HbA1c)水平为小于约6%。
“具有发展糖尿病的风险的受试者”是这样的受试者，其持续血压为约135/80 mm Hg或更高；超重(例如体重指数(BMI)大于约30 kg/m2)；与糖尿病第一度相关；HDL水平为约35 mg/dL或更高和/或甘油三酯水平小于约250 mg/dL；年龄为45岁或更大；是女性；具有妊娠糖尿病史；具有多囊卵巢综合症；具有与代谢综合征相关的病况；是西班牙人；是非洲籍美国人；和/或是土著美国人。此外，许多药物治疗和其它疾病可能使受试者具有发展糖尿病的风险。例如，糖皮质激素类、噻嗪类、β阻滞剂、非典型抗精神病药物和他汀类药物可能使受试者具有发展糖尿病的风险。之前已患有肢端肥大症、库兴氏综合征(Cushing's syndrome)、甲状腺功能亢进、嗜铬细胞瘤和某些癌症例如胰高血糖素瘤和睾酮缺乏的受试者也具有发展2型糖尿病的风险。
受试者，例如具有发展糖尿病风险的受试者，可能是“前驱糖尿病的”。如果受试者具有葡萄糖耐量受损，则认为所述受试者是“前驱糖尿病的”。“葡萄糖耐量受损”是高血糖症的一种状态，其与胰岛素抵抗和心血管病理风险增加有关。当2小时后受试者具有中间升高的葡萄糖水平，但低于对于2型糖尿病所限定的水平，则受试者具有葡萄糖耐量受损。空腹血糖可能是正常的或略微升高的。
在75-g口服葡萄糖耐量试验(OGTT)期间，具有葡萄糖耐量受损的受试者的2-小时血糖(PG)水平为约140 mg/dL (约7.8 mmol/L)或更高(例如在约7.8和11 mmol/L之间)；空腹血糖(FPG)水平为小于约126 mg/dL (小于约7 mmol/L) (例如在约95和约125 mg/dL之间)；血红蛋白A1c (HbA1c)水平为约6%或更高(例如在约6.0和6.4之间)；和/或BMI为约24 kg/m2或更大。
受试者，例如具有发展糖尿病风险的受试者，可能具有“空腹糖血受损”。在75-g口服葡萄糖耐量试验(OGTT)期间，具有空腹糖血受损的受试者的2-小时血糖(PG)水平为小于约140 mg/dL (小于约7.8 mmol/L)；空腹血糖(FPG)水平为小于约126 mg/dL (小于约7 mmol/L) (例如在约110和约125 mg/dL之间)；和/或血红蛋白A1c (HbA1c)水平为约6%或更高(例如在约6.0和6.4之间)。
术语“糖尿病已发展”是指在受试者中，正常葡萄糖耐量发展为空腹糖血受损；正常葡萄糖耐量发展为葡萄糖耐量受损；正常葡萄糖耐量发展为2型糖尿病；空腹糖血受损发展为葡萄糖耐量受损；空腹糖血受损发展为2型糖尿病；和/或葡萄糖耐量受损发展为2型糖尿病。
“标志物的水平”或“生物标志物的水平”是指在待测试的样品中存在的标志物的量。标志物的水平可以是绝对水平或量(例如μg/ml)或相对水平或量(例如相对信号强度)。
标志物的“更高水平”或“水平增加”是指大于用于评估标志物水平的测定法的标准误差的试验样品中的标志物水平，和优选为对照样品中标志物水平(例如来自具有正常葡萄糖耐量的受试者、具有空腹糖血受损的受试者、具有葡萄糖耐量受损的受试者、在过去18个月内已经诊断为2型糖尿病的受试者的样品和/或几种对照样品中标志物的平均水平)的至少2倍、和更优选3、4、5、6、7、8、9或10或更多倍。
标志物的“更低水平”或“水平降低”是指小于用于评估标志物水平的测定法的标准误差的试验样品中的标志物的水平，和优选为对照样品中标志物水平(例如来自具有正常葡萄糖耐量的受试者、具有空腹糖血受损的受试者、具有葡萄糖耐量受损的受试者、在过去18个月内已经诊断为2型糖尿病的受试者的样品和/或几种对照样品中标志物的平均水平)的至多1/2、和更优选1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9或1/10或更低。
术语“已知的标准水平”或“对照水平”是指标志物的公认的或预定的水平，其用于比较源自受试者的样品中的标志物的水平。在一个实施方案中，标志物的对照水平基于来自具有正常葡萄糖耐量的受试者的样品中的标志物的水平。在另一实施方案中，标志物的对照水平基于来自具有空腹糖血受损的一个或多个受试者的样品中的标志物的水平。在另一实施方案中，标志物的对照水平基于来自具有葡萄糖耐量受损的受试者的样品中的标志物的水平。在另一实施方案中，标志物的对照水平基于来自在过去18个月内已经诊断为2型糖尿病的受试者的样品中的标志物的水平。在一个实施方案中，来自受试者的样品中的标志物的对照水平是之前在受试者的样品中已确定的标志物的水平。
在又一个实施方案中，标志物的对照水平基于在给予对空腹糖血受损、葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的疗法之前来自受试者的样品中的标志物的水平。在另一实施方案中，标志物的对照水平基于来自未与试验化合物接触的具有空腹糖血受损、葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者的样品中的标志物的水平。在另一实施方案中，标志物的对照水平基于来自与试验化合物接触的具有正常葡萄糖耐量的受试者的样品中的标志物的水平。在一个实施方案中，标志物的对照水平基于来自空腹糖血受损、葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的动物模型的样品中的标志物的表达水平；源自空腹糖血受损、葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的动物模型的细胞或细胞系的样品中的标志物的表达水平。
或者，和特别是当因为本文所述方法的常规实施所致进一步的信息成为可用时，可使用标志物表达的“对照”水平的群体平均值。在其它实施方案中，标志物的“对照”水平可通过测定获自在受试者中怀疑空腹糖血受损、葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病发作之前的受试者的受试者样品、获自存档的受试者样品等的标志物的水平来确定。
如本文所用的，术语"患者"或“受试者”是指人和非人动物，例如兽医学患者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、小鼠、兔、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在一个实施方案中，所述受试者是人。
在一些实施方案中，受试者的体重指数(BMI)为小于约40 kg/m2 (例如约40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或约18 kg/m2)。在其它实施方案中，受试者的体重指数(BMI)为大于约40 kg/m2 (例如约41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或约80 kg/m2)。
本文所用的术语“样品”是指自受试者分离的类似细胞或组织的收集物，以及在受试者内存在的组织、细胞和流体。术语“样品”包括来自受试者的任何体液(例如血液、淋巴、妇科流体、囊液、尿液、眼泪和通过支气管灌洗和/或腹膜冲洗收集的流体)或细胞。在一个实施方案中，从受试者取出所述组织或细胞。在另一实施方案中，所述或细胞存在于所述受试者内。其它受试者样品包括泪滴、血清、脑脊液、粪便、痰和细胞提取物。在一个实施方案中，生物学样品包含来自测试受试者的蛋白分子。在另一实施方案中，生物学样品可包含来自测试受试者的mRNA分子或来自测试受试者的基因组DNA分子。
术语"测定"意指包括检测样品中标志物的存在或不存在、定量测定样品中标志物的量、和/或确定生物标志物的类型的方法。测量可通过本领域已知的方法和本文进一步描述的那些方法实现。
如本文所用的，术语"调节"的各种形式意图包括刺激(例如增加或增量调节特定的反应或活性)和抑制(例如降低或减量调节特定的反应或活性)。
试剂盒是包含特异性检测本发明的标志物的至少一种试剂例如探针、引物或抗体的任何制品(例如包装或容器)，所述制品作为用于进行本发明的方法的一个单位来推销、分配或销售。在某些实施方案中，试剂盒可包括基质，例如包含本发明的一种或多种标志物的捕获试剂和/或与本发明的一种或多种标志物结合的捕获试剂的基质。在一些实施方案中，这样的试剂盒包含用于使用质谱测定标志物的水平的使用说明书。
II. 本发明的标志物
本发明基于基本上在胰脏β-细胞中特异性表达的标志物(表1)和/或基本上特异性参与β-细胞功能的标志物(表2)和/或参与对治疗性治疗的反应的标志物(表3)的发现。这些标志物已经显示差别存在于具有葡萄糖耐量受损的受试者和对照受试者的样品，和/或差别存在于具有葡萄糖耐量受损的受试者和新诊断为2型糖尿病的受试者的样品，和/或差别存在于具有葡萄糖耐量受损的受试者和已确定2型糖尿病的受试者的样品，和/或差别存在于新诊断为2型糖尿病的受试者和已确定2型糖尿病的受试者的样品，和/或在对用胰岛素致敏剂治疗有反应的受试者和对胰岛素致敏剂无反应的受试者的样品中差别表达，和/或在对用胰岛素致敏剂和促分泌剂治疗有反应的受试者和对胰岛素致敏剂和促分泌剂无反应的受试者的样品中差别表达，和/或在对用胰岛素致敏剂、促分泌剂和胰岛素治疗有反应的受试者和对胰岛素致敏剂、促分泌剂和胰岛素无反应的受试者的样品中差别表达。
因此，与对照相比，在试验样品中存在的表1-3中所列的任何一种标志物或标志物的任何组合的水平，或在试验样品中表1-3中所列的一种标志物或标志物的组合的存在或不存在可用于本发明的方法和试剂盒。
本发明的标志物列于表1-3中。所述标志物的核苷酸和氨基酸序列是本领域已知的，和可发现于例如在表1-3中所列的GenBank检索号，其全部内容通过引用结合到本文中。
表 1. 本发明的 β- 细胞质量标志物
表 2. 本发明的 β- 细胞功能标志物
表 3. 本发明的治疗功效标志物
在本发明的某些方面，单个标志物(例如表1-3中所列的任一种标志物)可用于本发明的方法和组合物。例如，在一个实施方案中，用于本发明的方法和组合物的标志物是USP9X。在一个实施方案中，标志物是SEPT3。在一个实施方案中，标志物是DAG1。在一个实施方案中，标志物是PTPRJ。在一个实施方案中，标志物是CPM。在一个实施方案中，标志物是SERPINB13。在一个实施方案中，标志物是LDLR。在一个实施方案中，标志物是MMP7。在一个实施方案中，标志物是BTC。在一个实施方案中，标志物是PPY。在一个实施方案中，标志物是INS。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括测定选自表1-3中所列的标志物的标志物的水平。在其它实施方案中，所述方法可进一步包括测定选自CSTF3、NELL1、SLIT3、LAMTOR2、MGAT4B、TMPRSS11F、ATAD3B、PTPRN、WNT9B、FUT6、B4GALT1、FAM20C、CNTN1、MGAT1、STX1A、NMU、CD59、CASR和CPE的标志物的水平。
在本发明的其它方面，超过一种标志物，例如多种标志物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更多种标志物，可用于本发明的方法和组合物。例如，在一个实施方案中，用于本发明的方法和组合物的标志物包括USP9X和SEPT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X和INS。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3和INS。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13和INS。在一个实施方案中，标志物包括PPY和DAG1。在一个实施方案中，标志物包括PPY和BTC。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和DAG1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和PTPRJ。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和CPM。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和SERPINB13。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和LDLR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和MMP7。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和BTC。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和PPY。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和INS。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7和PPY。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3和PTPRJ。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7和LDLR。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括测定选自表1-3中所列的标志物的标志物的水平。在其它实施方案中，所述方法可进一步包括测定选自CSTF3、NELL1、SLIT3、LAMTOR2、MGAT4B、TMPRSS11F、ATAD3B、PTPRN、WNT9B、FUT6、B4GALT1、FAM20C、CNTN1、MGAT1、STX1A、NMU、CD59、CASR和CPE的标志物的水平。例如，在一个实施方案中，用于本发明的方法和组合物的标志物包括USP9X、SEPT3和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和NMU。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和CD59。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和CASR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3和CPE。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和NMU。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和CD59。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和CASR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、INS和CPE。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和NMU。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和CD59。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和CASR。在一个实施方案中，标志物包括SEPT3、INS和CPE。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和NMU。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和CD59。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和CASR。在一个实施方案中，标志物包括SERPINB13、INS和CPE。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和NMU。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和CD59。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和CASR。在一个实施方案中，标志物包括PPY、DAG1和CPE。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和NMU。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和CD59。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和CASR。在一个实施方案中，标志物包括PPY、BTC和CPE。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和NMU。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和CD59。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和CASR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、DAG1和CPE。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和NMU。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和CD59。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和CASR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PTPRJ和CPE。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和NMU。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和CD59。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和CASR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、CPM和CPE。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和NMU。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和CD59。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和CASR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、SERPINB13和CPE。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和NMU。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和CD59。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和CASR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、LDLR和CPE。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和NMU。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和CD59。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和CASR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、MMP7和CPE。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和NMU。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和CD59。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和CASR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、BTC和CPE。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和NMU。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和CD59。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和CASR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、PPY和CPE。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和NMU。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和CD59。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和CASR。在一个实施方案中，标志物包括USP9X、SEPT3、INS和CPE。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和NMU。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和CD59。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和CASR。在一个实施方案中，标志物包括BTC、MMP7、PPY和CPE。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和NMU。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和CD59。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和CASR。在一个实施方案中，标志物包括PPY、SEPT3、PTPRJ和CPE。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和CSTF3。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和NELL1。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和SLIT3。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和LAMTOR2。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和MGAT4B。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和TMPRSS11F。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和ATAD3B。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和PTPRN。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和WNT9B。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和FUT6。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和B4GALT1。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和FAM20C。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和CNTN1。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和MGAT1。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和STX1A。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和NMU。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和CD59。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和CASR。在一个实施方案中，标志物包括CPM、INS、MMP7、LDLR和CPE。
III. 本发明的方法
A. 诊断和预后方法
在某些方面，本发明提供诊断方法。例如，在一个方面，本发明提供用于确定受试者是否具有葡萄糖耐量受损的方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者具有葡萄糖耐量受损。
在另一方面，本发明提供用于确定受试者是否具有2型糖尿病的方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者具有2型糖尿病。
本发明还提供预后方法。例如，在一个方面，本发明提供用于确定受试者是否将发展葡萄糖耐量受损的方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者将发展葡萄糖耐量受损。
在另一方面、本发明提供用于确定受试者是否将发展2型糖尿病的方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者将发展2型糖尿病。
多种并发症与葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病相关，尤其是与长期的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病相关。例如，这样的受试者具有2-4倍风险的心血管疾病(包括缺血性心脏病和中风)、下肢截肢增加20倍和住院率增加。2型糖尿病也是非创伤性致盲和肾病(包括肾衰竭)的最主要原因，并与认知功能障碍和痴呆(通过疾病过程例如阿尔茨海默病和血管性痴呆)的风险增加相关。其它并发症包括例如神经病、黑棘皮病、性功能障碍和经常感染。
因为本发明的标志物已显示在新诊断为2型糖尿病的受试者和已确定为2型糖尿病的那些受试者(例如具有长期葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的那些受试者)中差异表达，因此本发明还提供用于确定受试者是否将发展2型糖尿病相关并发症的方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者将对糖尿病疗法有反应。
在另一方面，本发明提供用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗方案有反应的方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者将对治疗有反应。
本领域已知多种糖尿病疗法，包括例如胰岛素致敏剂，例如双胍类(例如二甲双胍)和噻唑烷二酮类(例如罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮)；促分泌剂，例如磺脲类(例如格列本脲、格列吡嗪、格列美脲、甲苯磺丁脲、醋酸己脲、妥拉磺脲、氯磺丙脲、格列齐特、glycopyamide、格列喹酮)、非磺脲类促分泌剂例如氯茴苯酸衍生物(例如瑞格列奈、那格列奈)；二肽基肽酶IV抑制剂(例如西他列汀(sitagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、利拉利汀(linagliptin)、维达列汀(vildagliptin)、阿格列汀(allogliptin)、septagliptin)；α-糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖)；胰岛淀粉样多肽模拟物(例如醋酸普兰林肽)；肠降血糖素模拟物(例如艾塞那肽、利拉鲁肽、他司鲁肽)；胰岛素和其类似物(例如快速起效、缓慢起效和中等起效)；胆汁酸多价螯合剂(例如考来维仑)；和多巴胺激动剂(例如溴隐亭)，单独或组合使用。
在本发明的某些实施方案中，所述治疗包括胰岛素致敏剂。在另一实施方案中，所述治疗包括胰岛素致敏剂和促分泌剂。在又一个实施方案中，所述治疗包括胰岛素致敏剂、促分泌剂和胰岛素。
本发明的方法可与技术人员用于诊断、预测和/或监测受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病和/或2型糖尿病并发症和/或对治疗的反应的任何其它方法一起实施。例如，本发明的方法可与本领域已知的葡萄糖耐量、肥胖和/或糖尿病的任何临床测量一起进行，所述测量包括其它分子标志物的血清学、细胞学和/或检测(和定量，如果合适的话)。
在本发明的任何方法(和试剂盒)中，获自受试者的样品中本发明的标志物的水平可通过各种众所周知的技术和方法中的任一种来测定，其将样品中的本发明的标志物转化成可检测和定量的部分。这样的方法的非限制性实例包括使用用于检测蛋白质的免疫学方法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩增方法、免疫印迹法、蛋白质印迹法、RNA印迹法、电子显微术、质谱法(例如MALDI-TOF和SELDI-TOF)、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法(ELISA) (例如扩增ELISA)、基于血液的定量测定法(例如血清ELISA)、基于尿液的定量测定法、流式细胞术、DNA杂交、阵列分析等和其组合或亚组合分析样品。
例如，mRNA样品可获自受试者的样品(例如支气管灌洗液、口腔拭子、活检样品或外周血单核细胞，通过标准方法)，样品中编码本发明标志物的mRNA的表达可使用标准分子生物学技术例如PCR分析来检测和/或测定。PCR分析的优选方法是逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)。mRNA样品分析的其它合适的系统包括微阵列分析(例如使用Affymetrix的微阵列系统或Illumina的BeadArray Technology)。
普通技术人员将容易理解的是，本领域已建立用于在核酸或蛋白水平上检测本发明的标志物的水平的任何技术手段基本上都可用于测定本文所述的本发明的标志物的水平。
在一个实施方案中，样品中的本发明的标志物的水平通过检测本发明的标志物基因的转录多核苷酸或其部分例如mRNA或cDNA来测定。可使用RNA提取技术从细胞提取RNA，所述技术包括例如使用酸性苯酚/异硫氰酸胍提取法(RNAzol B; Biogenesis)、RNeasy RNA制备试剂盒(Qiagen)或PAXgene (PreAnalytix、Switzerland)。使用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核连缀分析、RT-PCR、RNase保护测定法(Melton等, Nuc. Acids Res. 12:7035)、RNA印迹法、原位杂交和微阵列分析。
在一个实施方案中，本发明的标志物的水平使用核酸探针来测定。本文所用的术语"探针"是指能够选择性结合本发明的特定标志物的任何分子。探针可由本领域技术人员合成，或来源于合适的生物制备物。探针可经特别设计为标记的。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
分离的mRNA可用于杂交或扩增测定法，所述测定法包括但不限于DNA杂交分析或RNA杂交分析、聚合酶链反应(PCR)分析和探针阵列。用于测定mRNA水平的一种方法包括使分离的mRNA与可与标志物mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是例如全长的cDNA或其部分，例如至少约7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、250或约500个核苷酸长度并足以在严格条件下与标志物基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。
在一个实施方案中，将mRNA固定在固体表面上并使之与探针接触，例如通过使分离的mRNA在琼脂糖凝胶上电泳和将mRNA从所述凝胶转移至膜(例如硝酸纤维素)上。在备选的实施方案中，将探针固定在固体表面上并使mRNA与所述探针接触，例如在Affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可容易修改已知的mRNA检测方法以用于测定本发明的标志物mRNA的水平。
用于测定样品中本发明的标志物水平的备选方法包括例如样品中的mRNA的核酸扩增和/或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PCR (Mullis, 1987, 美国专利号4,683,202中所述的实验实施方案)、连接酶链反应(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193)、自持续序列复制(Guatelli等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等(1988) Bio/Technology 6:1197)、滚动循环复制(Lizardi等, 美国专利号5,854,033)或任何其它核酸扩增方法，接着使用本领域技术人员众所周知的技术检测扩增的分子。如果核酸分子以非常少的数量存在，则这些检测方案可特别用于检测这样的分子。在本发明的特别方面，本发明的标志物的表达水平通过定量荧光RT-PCR (即TaqManTM系统)来测定。这样的方法通常利用对本发明的标志物特异的寡核苷酸引物对。用于设计对已知序列特异的寡核苷酸引物的方法是本领域众所周知的。
本发明的标志物mRNA的水平可使用膜印迹法(例如用于杂交分析例如RNA杂交、DNA杂交、点杂交等)或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或包含结合的核酸的任何固体支持物)来监测。参见美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，其通过引用结合到本文中。本发明的标志物水平的测定也可包括使用溶液中的核酸探针。
在本发明的一个实施方案中，使用微阵列来检测本发明的标志物的水平。因为不同实验之间的可再现性，微阵列特别地非常适合用于此目的。DNA微阵列提供一种用于同时测量大量基因的水平的方法。各阵列由附着至固体支持物的可重现形式的捕获探针组成。标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，然后通过激光扫描检测。阵列上的各探针的杂交强度经测定并转化成表示相对基因表达水平的定量值。参见例如美国专利号6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316，其通过引用结合到本文中。高密度寡核苷酸阵列可特别用于测定样品中大量RNA的基因表达概况。
在某些情况下，有可能使用检测本发明的标志物的mRNA所编码的蛋白产物的检测试剂，在蛋白水平上测定本发明的标志物的水平。例如，如果可获得特异结合待检测的本发明标志物的蛋白产物(而不结合其它蛋白)的抗体试剂，则使用本领域已知的标准的基于抗体的技术(例如FACS分析等)，这样的抗体试剂可用于在来自受试者的细胞样品或源自细胞样品的制备物中检测本发明的标志物的表达。
用于在蛋白水平上检测本发明的标志物的其它已知方法包括以下方法，例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱等，或各种免疫学方法例如流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫荧光测定法和蛋白质印迹法。
来自样品的蛋白质可使用本领域技术人员众所周知的技术分离。使用的蛋白分离方法可以为例如描述于Harlow和Lane (Harlow和Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)中的那些。
在一个实施方案中，将抗体或抗体片段用于方法例如蛋白质印迹法或免疫荧光技术以检测表达的蛋白。用于测定本发明标志物的表达的抗体为市售可得的，且本领域技术人员可容易确定用于本发明方法的合适抗体。适合用于要求保护的用于测定本发明标志物的水平的方法的示例性市售可得的抗体列于下表(表4)。
表 4. 市售可得的抗体
通常优选将抗体或蛋白固定在固体支持物上用于蛋白质印迹法和免疫荧光技术。合适的固相支持物或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持物。众所周知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶(amylase)、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩(gabbro)和磁铁石。
本领域技术人员将了解用于结合抗体或抗原的许多其它合适的载体，并将能够改变这样的支持物用于本发明。例如，自细胞分离的蛋白质可在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，和固定至固相支持物例如硝酸纤维素上。然后所述支持物可用合适的缓冲液洗涤，接着用可检测标记的抗体处理。然后所述固相支持物可再次用缓冲液洗涤，以除去未结合的抗体。然后，在固体支持物上的结合标记的量可通过常规方法检测。使用电泳技术检测蛋白质的方法是本领域技术人员众所周知的(一般参见R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Method in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.)。
其它标准方法包括免疫测定技术，其为本领域普通技术人员众所周知的，可参见Principles and Practice Of Immunoassay (免疫测定法的原理和实践), 第二版, Price和Newman编辑, MacMillan (1997)和Antibodies, A Laboratory Manual (抗体实验室手册), Harlow和Lane编辑, Cold Spring Harbor Laboratory, Ch. 9 (1988)，其各自通过引用以其整体结合到本文中。
用于免疫测定法以检测本发明标志物的水平的抗体可用可检测标记进行标记。关于探针或抗体的术语"标记"，意图包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)至探针或抗体来直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂的反应来间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，和用生物素末端标记DNA探针使得其可用荧光标记的链霉抗生物素来检测。
在一个实施方案中，抗体被标记，例如放射标记、发色团标记、荧光团标记或酶标记的抗体。在另一实施方案中，抗体衍生物(例如与底物缀合的抗体或与蛋白-配体对{例如生物素-链霉抗生物素}的蛋白或配体缀合的抗体)或抗体片段(例如单链抗体、分离的抗体超变结构域等)，其特异性结合本发明的标志物。
在本发明的一个实施方案中，使用蛋白质组方法，例如质谱法。质谱法是一种分析技术，包括将化合物电离以产生带电分子(或其片段)和测量其质量-电荷比。在典型的质谱程序中，自受试者获得样品，加载到质谱上，和其组分(例如本发明的标志物)通过不同的方法电离(例如通过用电子束轰击它们)，导致形成带电颗粒(离子)。然后当离子穿越电磁场时，根据离子的运动计算颗粒的质量-电荷比。
例如，基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI/TOF MS)或表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱法(SELDI/TOF MS)，其包括应用生物样品例如血清至蛋白结合芯片(Wright, G.L., Jr.等(2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J.等(2002) Clin Chem 48:1296; Laronga, C.等(2003) Dis Marker 19:229; Petricoin, E.F.等(2002) 359:572; Adam, B.L.等(2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J.等(2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z.等(2001) Cancer Res 61:6029)，可用于测定本发明的标志物的水平。
此外，用于测定本发明标志物的水平的体内技术包括将针对本发明标志物的标记抗体引入到受试者中，所述抗体结合本发明的标志物并将其转化成可检测的分子。如上所述，在受试者中本发明的可检测标志物的存在、水平或甚至位置可通过标准成像技术检测而测定。
总的来说，优选受试者样品中的本发明标志物的水平与对照样品中的本发明标志物的量之间的差异尽可能的大。尽管该差异可能与用于测定标志物水平的方法的检测限度一样小，但优选所述差异至少大于评估方法的标准误差，优选差异为评估方法的标准误差的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、100、500、1000倍或更大。
B. 用于监测治疗功效的方法
本发明还提供用于监测可用于在受试者中抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展；降低或减慢正常葡萄糖耐量至空腹糖血受损、至葡萄糖耐量受损和/或至糖尿病的进展；和/或降低或抑制与所述疾病相关的并发症的发展的疗法或治疗方案或任何其它治疗方法的功效的方法。在这些方法中，评估在一对样品(不经过治疗方案的第一样品和经过治疗方案的至少一部分的第二样品)中的本发明的一种或多种标志物的水平。相对于第二样品，第一样品中一种或多种标志物的表达水平的调节表明所述疗法有效在受试者中抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展；降低或减慢正常葡萄糖耐量至空腹糖血受损、至葡萄糖耐量受损和/或至糖尿病的进展；和/或降低或抑制与所述疾病相关的并发症的发展。
C. 筛选方法
使用本文所述的方法，各种分子，特别是足够小以能够穿过细胞膜的分子，可经筛选以鉴定调节(例如减少或增加)本发明标志物的表达和/或活性的分子。如此鉴定的化合物可给予受试者以在受试者中抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展；降低或减慢正常葡萄糖耐量至空腹糖血受损、至葡萄糖耐量受损和/或至糖尿病的进展；和/或降低或抑制与所述疾病相关的并发症的发展。
因此，在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定调节物即候选物或试验化合物或试剂(例如酶、肽、肽模拟物、小分子、核酶或标志物反义分子)的方法，所述调节物结合标志物多肽；对标志物表达、标志物加工、标志物翻译后修饰(例如糖基化、泛素化或磷酸化)、标志物活性具有刺激或抑制作用；和/或对标志物靶分子的表达、加工或活性具有刺激或抑制作用。
用于在受试者中鉴定可调节细胞(体外和/或体内)中的标志物的表达和/或活性；抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展；降低或减慢正常葡萄糖耐量至空腹糖血受损、至葡萄糖耐量受损和/或至糖尿病的进展；和/或降低或抑制与所述疾病相关的并发症的发展的化合物的方法(本文亦称为筛选测定法)包括分别使等份的样品(例如来自受试者的样品)与化合物库的各成员接触；测定化合物库的成员对各等份中本发明的一种或多种标志物的水平(或本发明的一种或多种标志物的活性)的影响；和选择化合物库的成员，与对照样品中本发明的一种或多种标志物的水平和/或活性相比，其调节等份中本发明的一种或多种标志物的水平和/或活性，从而鉴定化合物，其可在受试者中调节细胞中的标志物的表达和/或活性；抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展；降低或减慢正常葡萄糖耐量至空腹糖血受损、至葡萄糖耐量受损和/或至糖尿病的进展；和/或降低或抑制与所述疾病相关的并发症的发展。
如本文可互换使用的术语“标志物活性”和“标志物的生物活性”包括标志物蛋白对标志物反应细胞或组织所施加的活性，或对标志物核酸分子或蛋白靶分子所施加的活性，如按照标准技术在体内和/或体外所测定。标志物活性可以是直接活性，例如与标志物-靶分子缔合。或者，标志物活性是间接活性，例如通过标志物蛋白与标志物-靶分子或涉及所述标志物的信号转导通路中的其它分子相互作用而介导的下游生物事件。本发明的标志物的生物活性是本领域已知的，可参见例如www.uniprot.org。每一种本发明的标志物的Uniprot检索号在表1-3中提供。这些Uniprot记录的每一个的全部内容通过引用结合到本文中。用于测定化合物对标志物的表达和/或活性的影响的方法是本领域已知的，和/或在本文中描述。
可使用本文所述的筛选测定法评价各种试验化合物。术语"试验化合物"包括用于本发明的测定法并分析其影响标志物的表达和/或活性的能力的任何试剂或测试试剂。在筛选测定法中可同时测试超过一种化合物，例如多种化合物调节标志物的表达和/或活性的能力。术语“筛选测定法”优选指测试多种化合物影响选择的读出的能力的测定法，而非测试一种化合物影响读出的能力的试验。优选地，受试者测定法鉴定之前未知具有所筛选效果的化合物。在一个实施方案中，可使用高通量筛选以分析化合物的活性。
候选物/试验化合物包括例如1)肽，例如可溶性肽，包括Ig-加尾的融合肽和随机肽库(参见例如Lam, K.S.等(1991) Nature 354:82-84; Houghten, R.等(1991) Nature 354:84-86)和组合化学来源的由D和/或L构型氨基酸构成的分子库的成员；2)磷酸肽(例如随机和部分简并的定向磷酸肽库的成员，参见例如Songyang, Z.等(1993) Cell 72:767-778)；3)抗体(例如多克隆的、单克隆的、人源化的、抗-个体基因型的、嵌合的和单链抗体以及Fab、F(ab')2、Fab表达库片段和抗体的表位结合片段)；4)小的有机和无机分子(例如自组合的和天然的产物库获得的分子)；5)酶(例如核糖核酸内切酶、水解酶、核酶、蛋白酶、合成酶、异构酶、聚合酶、激酶、磷酸酶、氧化还原酶和ATP酶)；6)标志物分子的突变体形式，例如分子的主要的阴性突变体形式；7)核酸；8)碳水化合物；和9)天然产物提取化合物。
在本领域已知的组合库方法中，可使用多种方法中的任一种获得试验化合物，包括：生物库；可空间定位的平行固相或溶液相库；要求重叠合法的合成库方法；“一珠一化合物”库方法；和使用亲和色谱选择的合成库方法。生物库方法限于肽库，而其它四种方法可应用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物库(Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
用于合成分子库的方法的实例可见于本领域，例如：DeWitt等(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann等(1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho等(1993) Science 261:1303; Carrell等(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell等(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;和Gallop等(1994) J. Med. Chem. 37:1233。
化合物库可在溶液中提供(例如Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)或在珠上提供(Lam (1991) Nature 354:82-84)，在芯片上提供(Fodor (1993) Nature 364:555-556)，在细菌中提供(Ladner USP 5,223,409)，在芽孢中提供(Ladner USP '409)，在质粒中提供(Cull等(1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)或在噬菌体中提供(Scott和Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406; Cwirla等(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner supra.)。
在筛选测定法中鉴定的化合物可用于调节受标志物调节的一种或多种生物反应的方法，所述生物反应例如葡萄糖耐受。将理解，在将化合物与细胞接触之前，将所述化合物配制成药物组合物可能是需要的。
一旦通过前文所述的多种方法之一鉴定出试验化合物，则可进一步评价选择的试验化合物(或"目的化合物")对细胞的作用，例如通过将目的化合物与细胞在体内接触(例如通过给予受试者或动物模型目的化合物)或离体接触(例如通过分离来自受试者或动物模型的细胞和将分离的细胞与目的化合物接触，或者通过将目的化合物与细胞系接触)，并与合适的对照(例如未处理的细胞或用不调节生物反应的对照化合物或载体处理的细胞)相比，测定目的化合物对细胞的作用。
具有已知结构的标志物的基于计算机的分析也可用于鉴定与本发明的标志物结合的分子。这样的方法根据与受体位点互补的分子形状将分子分类。例如，使用3-D数据库，可使用程序例如DOCK鉴定与TLR9结合的分子。参见DesJarlias等(1988) J. Med. Chem. 31:722; Meng等(1992) J. Computer Chem. 13:505; Meng等(1993) Proteins 17:266; Shoichet等(1993) Science 259:1445。此外，可分析分子与标志物的电子互补性以鉴定与标志物结合的分子。这可使用例如Meng等(1992) J. Computer Chem. 13:505和Meng等(1993) Proteins 17:266中所述的分子机械力场来测定。可使用的其它程序包括CLIX，其在推定配体的对接中使用GRID力场。参见Lawrence等(1992) Proteins 12:31; Goodford等(1985) J. Med. Chem. 28:849; Boobbyer等(1989) J. Med. Chem. 32:1083。
本发明还涉及使用前述筛选测定法鉴定的化合物。
D. 用于调节本发明的生物标志物的表达和 / 或活性的方法
本发明的又一方面涉及在细胞中调节标志物的表达和/或活性的方法。本发明的调节方法包括使细胞与调节标志物的表达和/或活性的试剂接触，使得细胞中的标志物的表达和/或活性受到调节。为了使在细胞中标志物的表达和/或活性受到调节，所述细胞与足以调节标志物的表达和/或活性的量的调节剂接触。
"调节物"或“调节剂”是起调节作用的化合物或分子，和可以是例如激动剂、拮抗剂、激活剂、刺激剂、阻抑剂或抑制剂。如本文所用的术语“调节剂”是指调节标志物的活性的任何部分，包括调节标志物表达或调节标志物功能的部分。调节剂可通过调节在细胞中标志物多肽的活性起作用，例如通过使细胞与试剂接触，所述试剂例如干扰标志物与其相互作用的分子的结合，改变标志物的结合特异性，或翻译后修饰标志物或标志物的表达(例如通过调节标志物基因的转录或标志物mRNA的翻译)。因此，本发明的特征在于用于调节受标志物调节的一种或多种生物反应的方法，即，通过使细胞与标志物的表达和/或活性的调节剂接触，使得生物反应受到调节。
代表性的调节剂在下文描述，包括但不限于蛋白、核酸分子、抗体、核酸(例如反义分子，例如核酶和RNA干扰剂)、免疫缀合物(例如与治疗剂缀合的抗体)、小分子、融合蛋白、adnectin、适体、anticalin、脂笼蛋白(lipocalin)和标志物-衍生的肽化合物。
如本文所用的术语"接触" (例如使细胞与调节剂接触)意欲包括一起体外孵育调节剂和细胞(例如添加调节剂至培养的细胞中)或将调节剂给予受试者使得调节剂和受试者的细胞在体内接触。术语"接触"不意欲包括将细胞暴露于可天然存在于受试者中的试剂(即，因为天然生理过程而可能发生的暴露)。
在一个实施方案中，本发明的调节方法在体外进行。在另一实施方案中，本发明的调节方法在体内进行，例如在受试者中进行，例如具有葡萄糖耐量受损、2型糖尿病的受试者，其将受益于本发明的标志物的表达和/或活性的调节。
因此，本发明还提供用于在受试者中抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展；降低或减慢正常葡萄糖耐量至空腹糖血受损、至葡萄糖耐量受损和/或至糖尿病的进展；和/或降低或抑制与所述疾病相关的并发症的发展的方法。
“抑制”、“减慢”和/或“治疗”的方法包括给予受试者标志物调节剂以治愈或延长受试者的健康或存活超过在缺少所述治疗的情况下所预期的。
如本文所用的术语"患者"或“受试者”意欲包括人和兽医学患者。在具体的实施方案中，受试者是人。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、小鼠、兔、绵羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。
本发明的方法还预期标志物调节剂与其它疗法(包括生活方式的改变)组合的用途。因此，除了使用标志物调节剂之外，本发明的方法还可包括给予受试者一种或多种"标准"疗法。例如，调节剂可与细胞毒素、免疫抑制剂、放射毒性剂和/或治疗抗体组合给予(即与之一起或与之连接(即免疫缀合物))给予。本发明预期的特定共同疗法包括但不限于胰岛素致敏剂、促分泌剂、二肽基肽酶IV抑制剂、α-糖苷酶抑制剂、胰岛淀粉样多肽模拟物、肠降血糖素模拟物、胰岛素、胆汁酸多价螯合剂、多巴胺激动剂、他汀类。
标志物调节剂和共治疗剂或共同疗法可在同一制剂中或分开给予。在分开给予的情况下，标志物调节剂可在共治疗剂或共同疗法之前、之后或同时给予。一种试剂可在给予另一种试剂之前或之后，间隔时间范围为数分钟至数周。在其中两种或更多种不同类型的治疗剂分开施用给受试者的实施方案中，通常确保在各递送的时间之间未满显著的时间段，使得这些不同类型的试剂仍能够对靶组织或细胞产生有利的组合效果。
在一个实施方案中，标志物调节剂(例如抗-标志物抗体)可连接至第二结合分子，例如抗体(即，从而形成双特异性分子)或其它结合剂，例如所述结合剂结合至不同的靶标或标志物上的不同的表位。
本文所用的术语“有效量”是指标志物调节剂的量，当给予受试者时其足以抑制受试者的纤维化的进展。有效量根据受试者和疾病的严重性和受试者的年龄、给药方式等而变化，其可容易地由本领域普通技术人员确定。标志物调节剂的给予剂量的范围可以是例如约1 ng至约10,000 mg、约5 ng至约9,500 mg、约10 ng至约9,000 mg、约20 ng至约8,500 mg、约30 ng至约7,500 mg、约40 ng至约7,000 mg、约50 ng至约6,500 mg、约100 ng至约6,000 mg、约200 ng至约5,500 mg、约300 ng至约5,000 mg、约400 ng至约4,500 mg、约500 ng至约4,000 mg、约1 µg至约3,500 mg、约5 µg至约3,000 mg、约10 µg至约2,600 mg、约20 µg至约2,575 mg、约30 µg至约2,550 mg、约40 µg至约2,500 mg、约50 µg至约2,475 mg、约100 µg至约2,450 mg、约200 µg至约2,425 mg、约300 µg至约2,000、约400 µg至约1,175 mg、约500 µg至约1,150 mg、约0.5 mg至约1,125 mg、约1 mg至约1,100 mg、约1.25 mg至约1,075 mg、约1.5 mg至约1,050 mg、约2.0 mg至约1,025 mg、约2.5 mg至约1,000 mg、约3.0 mg至约975 mg、约3.5 mg至约950 mg、约4.0 mg至约925 mg、约4.5 mg至约900 mg、约5 mg至约875 mg、约10 mg至约850 mg、约20 mg至约825 mg、约30 mg至约800 mg、约40 mg至约775 mg、约50 mg至约750 mg、约100 mg至约725 mg、约200 mg至约700 mg、约300 mg至约675 mg、约400 mg至约650 mg、约500 mg或约525 mg至约625 mg的标志物调节剂。剂量方案可经调整以提供最佳治疗反应。有效量也是这样的量，其中标志物调节剂的任何毒性或有害的作用(即副作用)被最小化和/或小于有益作用。
对于特定的患者、组合物和给药模式，用于本发明的方法的标志物调节剂的实际剂量水平可改变，以获得有效实现所需反应(例如抑制糖尿病的进展)的活性成分的量，而对所述患者没有毒性。所选的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所用的特定标志物调节剂或其酯、盐或酰胺的活性；给药途径；给药次数；所用的特定调节剂的排泄速率；治疗持续时间；与所用的特定调节剂组合使用的其它药物、化合物和/或材料；待治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前的医疗史；和医疗领域众所周知的类似的因素。具有本领域普通技术的医师或兽医可容易地确定和处方需要的有效量的调节剂。例如，医师或兽医可以低于为实现所需治疗效果所需的水平开始调节剂的剂量，并逐渐增加剂量直到实现所需的效果。总的来说，标志物调节剂的合适的每日剂量是这样的量，其是有效产生治疗效果的最低剂量。这样的有效剂量通常取决于上文所述的因素。优选所述给药是静脉内、肌内、腹膜内或皮下，优选在靶位点附近给予。如果需要，标志物调节剂的有效每日剂量可在全天以合适的时间间隔按分开给予的2、3、4、5、6或更多个子剂量给予，任选以单位剂量形式。尽管有可能单独给予本发明的标志物调节剂，但优选作为药物制剂(组合物)给予所述调节剂。
剂量方案经调整以提供最佳的所需反应(例如治疗反应)。例如，可给予单个丸剂，可随时间给予数个分开的剂量，或如治疗情况的紧急性所需要的，剂量可按比例减少或增加。例如，用于本发明的方法的标志物调节剂可每周一次或两次通过皮下注射给予，或每月一次或两次通过皮下注射给予。
为通过某些给药途径给予用于本发明的方法的标志物调节剂，可能需要在适于阻止其失活的制剂中包括所述调节剂。例如，所述标志物调节剂可在合适的载体中给予受试者，所述载体例如脂质体或稀释剂。药学上可接受的稀释剂包括盐水和含水缓冲溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规的脂质体(Strejan等(1984) J. Neuroimmunol. 7:27)。
药学上可接受的载体包括无菌含水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌粉剂。用于药学活性物质的这样的介质和试剂的用途是本领域已知的。除了任何常规介质或试剂与活性标志物调节剂不相容的情况之外，考虑其在药物组合物中的用途。还可将补充的活性化合物与标志物调节剂一起掺入。
用于本发明方法的标志物调节剂在制备和储存条件下通常必需是无菌的和稳定的。所述调节剂可配制为溶液剂、微乳剂、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。可保持合适的流动性，例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂。在许多情况下，在组合物中优选包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来产生。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性调节剂与上述的一种成分或成分的组合(按需要)掺入至合适的溶剂中，接着无菌微过滤来制备。通常，分散剂通过将活性化合物掺入至含有基础分散介质和来自上述的那些的所需其它成分的无菌溶媒中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，这得到来自其之前无菌过滤的溶液的活性成分加任何另外所需的成分的粉末。
可用于本发明方法的标志物调节剂包括适合于口服、经鼻、局部(包括含服和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠外给予的那些。所述制剂可适宜以单位剂型存在和可通过药学领域已知的任何方法制备。可与载体物质组合产生单一剂型的活性成分的量将根据待治疗的受试者和具体的给药方式而改变。可与载体物质组合产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的调节剂的量。通常，按100%计，该量的范围为约0.001%至约90 %的活性成分，优选约0.005%至约70%，最优选约0.01%至约30%。
本文所使用的短语“胃肠外给药”和“经胃肠外给予的”意指非肠内和局部给药的给药方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可与用于本发明方法的标志物调节剂一起使用的合适的含水和无水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合适的混合物、植物油例如橄榄油和可注射的有机酯例如油酸乙酯。可保持合适的流动性，例如通过使用包衣材料例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过保持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂。
标志物调节剂也可与辅剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂一起给予。防止微生物存在可通过灭菌程序和通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保。在组合物中包括等渗剂例如糖、氯化钠等也可能是需要的。此外，可注射药物形式的延长吸收可通过包括延迟吸收的试剂来产生，例如单硬脂酸铝和明胶。
当用于本发明方法的标志物调节剂给予至人和动物时，它们可单独给予，或作为含例如0.001-90% (更优选0.005-70%，例如0.01-30%)的活性成分与药学上可接受的载体的组合的药物调节剂给予。
标志物调节剂可用本领域已知的医学装置给予。例如，在优选的实施方案中，调节剂可用无针头皮下注射装置给予，例如公开于美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中的装置。可用于本发明的众所周知的植入物和组件的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开了用于以可控速率分配药物的可植入的微输注泵；美国专利号4.,486,194，其公开了用于通过皮肤给予药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开了用于以准确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开了用于持续药物递送的可变流量的可植入输注装置；美国专利号4,439,196，其公开了具有多区室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开了渗透药物递送系统。许多其它这样的植入物、递送系统和组件是本领域技术人员已知的。
1. 抑制剂
根据本发明的调节方法，标志物的表达和/或活性在细胞或受试者中通过使细胞与(或给予受试者)抑制剂接触而得到抑制。本发明的抑制剂可以是例如起降低或抑制标志物的表达和/或活性的作用的分子。
在本发明的一个实施方案中，本文所述的调节方法，例如治疗和诊断方法使用结合(例如直接或间接)标志物，抑制标志物活性和/或减量调节标志物表达的抗体。
本文可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原-结合部分”)或单链。“抗体”包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。各重链包含重链可变区(本文简称为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(本文简称为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更加保守的区，称为框架区(FR)。各VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应器细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
本文所用的术语抗体的“抗原-结合部分” (或简称“抗体部分”)是指抗体的一个或多个片段，其保留特异性结合抗原(例如标志物)的能力。已经表明，抗体的抗原-结合功能可通过全长抗体的片段来实现。包括在术语抗体的“抗原-结合部分”内的结合片段的实例包括(i) Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab')2片段，其为包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii) 由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv) 由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v) 包括VH和VL结构域的dAb；(vi) dAb片段(Ward等(1989) Nature 341, 544-546)，其由VH结构域组成；(vii) 由VH或VL结构域组成的dAb；和(viii) 分离的互补决定区(CDR)或(ix) 两个或更多个分离的CDR的组合，其可任选通过合成的接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH，通过单独的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成的接头连接，所述接头能够使它们成为单一的蛋白链，其中VL和VH区配对以形成单价分子(已知为单链Fv (scFv)；参见例如Bird等(1988) Science 242, 423-426;和Huston等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883)。这样的单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原-结合部分”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。抗原-结合部分可通过重组DNA技术或通过酶或化学裂解完整的免疫球蛋白而产生。
本文所用的术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，和天然存在的或按照本领域众所周知的方法重组产生的那些抗体。
在一个实施方案中，用于本发明方法的抗体是双特异性的抗体。“双特异性的”或“双功能的抗体”是具有两个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。双特异性的抗体可通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321; Kostelny等(1992) J. Immunol. 148, 1547-1553。
在另一实施方案中，用于本发明方法的抗体是骆驼抗体，如在例如PCT公开WO 94/04678中所述的，其完整内容通过引用结合到本文中。
称为VHH的骆驼抗体的区域，其为小的单一可变结构域，可通过基因工程改造获得，以得到对靶标具有高亲和力的小蛋白，产生低分子量的、抗体来源的蛋白，称为“骆驼纳米抗体”。参见美国专利号5,759,808；亦参见Stijlemans等, 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin等, 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger等, 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo等, 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62;和Lauwereys,等, 1998 EMBO J. 17: 3512-3520。工程改造的骆驼抗体和抗体片段的库是市售可得的，例如得自Ablynx, Ghent, Belgium。因此，本发明的一个特征是对标志物具有高亲和力的骆驼纳米抗体。
在本发明的其它实施方案中，用于本发明方法的抗体是双抗体、单链双抗体或二-双抗体。
双抗体是二价双特异性的分子，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，其通过接头连接，所述接头太短而不能允许在同一链上的两个结构域之间配对。VH和VL结构域与另一条链上的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger等, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak等, 1994 Structure 2:1121-1123)。双抗体可通过在同一细胞内表达具有结构VHA-VLB和VHB-VLA (VH-VL构型)或VLA-VHB和VLB-VHA (VL-VH构型)的两条多肽链产生。它们大多数可在细菌中以可溶形式表达。
单链双抗体(scDb)通过用大约15个氨基酸残基的接头连接两条形成双抗体的多肽链而产生(参见Holliger和Winter, 1997 Cancer Immunol. Immun 其它., 45(3-4):128-30; Wu等, 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36)。scDb可在细菌中以可溶的活性单体形式表达(参见Holliger和Winter, 1997 Cancer Immunol. Immun 其它., 45(34): 128-30; Wu等, 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun和Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway等, 1996 Protein Eng., 9(7):617-21)。
双抗体可与Fc融合以产生“二-双抗体” (参见Lu等, 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65)。
显示抗体的功能特性但其框架和和抗原结合部分衍生自其它多肽(例如非由抗体基因编码的或通过体内抗体基因重组产生的那些的多肽)的标志物结合分子也可用于本发明的方法。这些结合分子的抗原结合结构域(例如标志物结合结构域)通过定向进化过程产生。参见美国专利号7,115,396。具有类似于抗体的可变结构域的整体折叠(“免疫球蛋白-样”折叠)的分子是合适的支架蛋白。适合于衍生抗原结合分子的支架蛋白包括纤连蛋白或纤连蛋白二聚体、结合腕蛋白、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、ICAM、肌联蛋白、GCSF-受体、细胞因子受体、糖苷酶抑制剂、抗生素色蛋白、髓磷脂膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I类MHC、T-细胞抗原受体、CD1、C2和VCAM-1的I-组结构域、肌球蛋白-结合蛋白C的I-组免疫球蛋白结构域、肌球蛋白-结合蛋白H的I-组免疫球蛋白结构域、端蛋白(telokin)的I-组免疫球蛋白结构域、NCAM、颤搐蛋白、神经胶质蛋白、生长激素受体、促红细胞生成素受体、催乳素受体、干扰素-γ受体、β-半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、转谷氨酰胺酶、T-细胞抗原受体、超氧化物歧化酶、组织因子结构域、细胞色素F、绿色荧光蛋白、GroEL和竹芋蛋白。
为产生非-抗体结合分子，建立克隆文库，其中形成抗原结合表面的支架蛋白区的序列(例如在位置和结构上类似于抗体可变结构域免疫球蛋白折叠的CDR的区域)被随机化。测试文库克隆与目的抗原(例如TLR9)的特异性结合和库克隆的其它功能(例如抑制TLR9的生物活性)。选择的克隆可用作进一步随机化和选择以产生对抗原有较高亲和力的衍生物的基础。
产生高亲和力结合分子，例如使用纤连蛋白III的第10模块(10Fn3)作为支架，其描述于美国专利号6,818,418和7,115,396；Roberts和Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:12297；美国专利号6,261,804；美国专利号6,258,558；和Szostak等WO98/31700，其每个的全部内容通过引用结合到本文中。
非-抗体结合分子可作为二聚体或多聚体产生以增加对靶抗原的亲合力。例如，抗原结合结构域作为与形成Fc-Fc二聚体的抗体的恒定区(Fc)的融合物表达。参见例如美国专利号7,115,396，其全部内容通过引用结合到本文中。
本发明的治疗方法还可通过使用抗体片段和抗体模拟物实施。如下文所详述的，目前已开发了各种抗体片段和抗体模拟技术，并且为本领域广泛已知的。尽管许多这些技术，例如结构域抗体、纳米抗体(Nanobody)和UniBody，利用传统抗体结构的片段或对传统抗体结构的其它修饰，但也存在可选择的技术，例如利用结合结构的Adnectin、Affibody、DARPin、Anticalin、Avimer和Versabody，尽管它们模拟传统的抗体结合，但通过不同的机制产生并通过不同的机制发挥作用。这些可选择的结构中的一些综述于Gill和Damle (2006) 17: 653-658。
结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能结合单位，其对应于人抗体的重(VH)或轻(VL)链的可变区。Domantis已经开发了全人VH和VL dAb的一系列大的和高度功能化的库(在每个库中超过100亿个不同的序列)，并使用这些库以选择对治疗靶标具有特异性的dAb。与许多常规抗体形成对比，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中良好表达。结构域抗体和其制备方法的进一步细节可参照美国专利6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; 6,696,245; 美国系列号2004/0110941; 欧洲专利申请号1433846和欧洲专利0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019和WO03/002609获得，其每个的内容通过引用以其整体结合到本文中。
纳米抗体是抗体衍生的治疗蛋白，其包含天然存在的重链抗体的独特的结构和功能性质。这些重链抗体包含单一的可变结构域(VHH)和两个恒定结构域(CH2和CH3)。重要的是，克隆和分离的VHH结构域是完全稳定的多肽，其具有原始重链抗体的全抗原-结合能力。纳米抗体与人抗体的VH结构域具有高的同源性并且可进一步人源化而没有活性的任何损失。
纳米抗体通过单个基因编码，并在几乎所有的原核和真核宿主中有效地产生，所述宿主例如大肠杆菌(参见例如U.S. 6,765,087，其通过引用以其整体结合到本文中)、霉菌(例如曲霉(Aspergillus)或木霉(Trichoderma))和酵母(例如酵母(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)、汉森酵母(Hansenula)或毕赤酵母(Pichia)) (参见例如U.S. 6,838,254，其通过引用以其整体结合到本文中)。生产过程是可放大的，已产生了多个千克量的纳米抗体。因为与常规抗体相比，纳米抗体显示优越的稳定性，所以它们可配制为长保存期的即用型溶液。
纳米克隆(Nanoclone)方法(参见例如WO 06/079372，其通过引用以其整体结合到本文中)是一种用于产生针对所需靶标的纳米抗体的有专利权保护的方法，其基于自动化高通量选择B-细胞，并可在本发明的背景下使用。
UniBody是另一种抗体片段技术，然而该技术基于IgG4抗体的铰链区的去除。铰链区的删除产生这样的分子，其基本上是传统IgG4抗体的大小的一半，并具有IgG4抗体的单价结合区，而非二价结合区。还众所周知的是，IgG4抗体是惰性的，因此不与免疫系统相互作用，这可能有利地用于治疗其中不需要免疫反应的疾病，并且该优点传递到UniBody上。UniBody的其它细节可参照专利申请WO2007/059782获得，其通过引用以其整体结合到本文中。
Adnectin分子是工程改造的结合蛋白，其衍生自纤连蛋白的一个或多个结构域。在一个实施方案中，adnectin分子通过改变包括在两个β片之间分布的多个β链的天然蛋白而衍生自纤连蛋白2I型结构域。根据来源组织，纤连蛋白可含有多个2I型结构域，其可表示为例如1Fn3、2Fn3、3Fn3等。Adnectin分子还可衍生自10Fn3相关分子的聚合物，而非简单的单体10Fn3结构。
尽管天然10Fn3结构域通常与整联蛋白结合，但改变成adnectin分子的10Fn3蛋白经改变以结合目的抗原，例如标志物。在一个实施方案中，对10Fn3分子的改变包括对β链的至少一个突变。在优选的实施方案中，连接10Fn3分子的β链的环区经改变以结合目的抗原，例如标志物。
10Fn3的改变可通过本领域已知的任何方法进行，包括但不限于易错PCR、定点诱变、DNA改组或本文所提及的其它类型的重组诱变。在一个实例中，编码10Fn3序列的DNA的变体可直接在体外合成，和之后在体外或体内转录和翻译。或者，天然10Fn3序列可使用标准方法自基因组分离或克隆(如例如在美国专利申请号20070082365中所进行的)，然后使用本领域已知的诱变方法突变。
适体是另一类型的抗体模拟物，其可用于本发明的方法。适体通常是小核苷酸聚合物，其结合特定的分子靶标。适体可以是单链或双链核酸分子(DNA或RNA)，尽管基于DNA的适体最常见是双链的。适体核酸没有确定的长度；然而，适体分子最常见在15和40个核苷酸长之间。
适体可使用多种技术产生，但最初使用体外选择(Ellington和Szostak. (1990) Nature. 346(6287):818-22)和SELEX方法(通过指数富集的配体的系统进化) (Schneider等1992. J Mol Biol. 228(3):862-9)而开发，其内容通过引用结合到本文中。已公布了制备和使用适体的其它方法，包括Klussmann的适体手册：功能性寡核苷酸和其应用(The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications). ISBN: 978-3-527-31059-3; Ulrich等2006. Comb Chem High Throughput Screen 9(8):619-32; Cerchia和de Franciscis. 2007. Method Mol Biol. 361:187-200; Ireson和Kelland. 2006. Mol Cancer Ther. 2006 5(12):2957-62; 美国专利号：5582981; 5840867; 5756291; 6261783; 6458559; 5792613; 6111095;和美国专利申请号：11/482,671; 11/102,428; 11/291,610;和10/627,543，其所有都通过引用结合到本文中。
由肽而非核苷酸构成的适体分子也可用于本发明的方法。肽适体与核苷酸适体共有许多性质(例如，小的型号和以高亲和力结合靶分子的能力)，它们可通过具有与用于产生核苷酸适体的类似原理的选择方法产生，例如Baines和Colas. 2006. Drug Discov Today. 11(7-8):334-41;和Bickle等2006. Nat Protoc. 1(3):1066-91，其通过引用结合到本文中。
Affibody分子表示一类基于58个氨基酸残基蛋白结构域的亲和蛋白，其衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域之一。该三螺旋束结构域已用作构建组合的噬菌粒库的支架，从中可使用噬菌体展示技术选择靶向所需分子的Affibody变体(Nord K,等Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J,等, Eur J Biochem 2002;269:2647-55)。Affibody和其制备方法的其它细节可参照美国专利号5,831,012获得，其通过引用以其整体结合到本文中。
DARPin (设计的锚蛋白重复蛋白)是抗体模拟物DRP (设计的重复蛋白)技术的一个实例，其已经开发来利用非-抗体多肽的结合能力。重复蛋白例如锚蛋白或富亮氨酸重复蛋白，是普遍存在的结合分子，不像抗体，其存在于胞内和和胞外。它们的独特模块结构的特征在于重复的结构单元(重复)，其堆叠在一起形成伸长的重复结构域，显示可变的和模块靶标结合的表面。基于这种模块性，可产生具有高度变化的结合特异性的组合的多肽库。该策略包括一致设计显示可变的表面残基的自身相容的重复，和将它们随机装配成重复结构域。
关于DARPin和其它DRP技术的另外的信息可见于美国专利申请公开号2004/0132028和国际专利申请公开号WO 02/20565，两者通过引用以其整体结合到本文中。
Anticalin是一种另外的抗体模拟技术，然而在该情况下结合特异性源自于脂笼蛋白，一个在人组织和体液中天然和大量表达的低分子量蛋白家族。脂笼蛋白经进化以执行与化学敏感性或不溶性化合物的生理运输和储存有关的各种体内功能。脂笼蛋白具有稳健的内在结构，包括高度保守的β-桶，其支持在蛋白一个末端的四个环。这些环形成结合袋的入口，并且在分子的该部分上的构象差异说明在单个脂笼蛋白之间的结合特异性的改变。
脂笼蛋白经克隆，并且它们的环经过工程改造以生成Anticalin。已经产生结构不同的Anticalin的库，并且Anticalin展示允许选择和筛选结合功能，接着表达和生产可溶性蛋白以在原核或真核系统中进一步分析。研究成功证实，可开发并分离对事实上任何人靶蛋白具有特异性的Anticalin，并可获得纳摩尔或更高范围的结合亲和力。
Anticalin也可呈双重靶蛋白形式，所谓的Duocalin。Duocalin在一种使用标准制备方法容易制备的单体蛋白中结合两个单独的治疗靶标，同时保持靶标特异性和亲和力，不管其两个结合结构域的结构取向如何。
关于Anticalin的其它信息可见于美国专利号7,250,297和国际专利申请公开号WO 99/16873，两者通过引用以其整体结合到本文中。
用于本发明背景的其它抗体模拟技术是Avimer。Avimer通过体外外显子改组和噬菌体展示自人胞外受体结构域的大家族进化，产生具有结合和抑制性质的多结构域蛋白。连接多个独立的结合结构域已经表明产生亲合力，并与常规单表位结合蛋白相比，产生改进的亲和力和特异性。其它潜在的优点包括在大肠杆菌中简单和有效产生多靶标特异性分子、改进的热稳定性和蛋白酶抗性。已经获得针对多种靶标具有亚纳摩尔亲和力的Avimer。
关于Avimer的其它信息可见于美国专利申请公开号2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756，其全部通过引用以其整体结合到本文中。
Versabody是另一种抗体模拟技术，其可用于本发明的背景下。Versabody是3-5 kDa的小蛋白，含>15%半胱氨酸，其形成高二硫化物密度支架，替代典型蛋白具有的疏水核心。大量疏水氨基酸(包括疏水核心)用少量二硫化物替代，产生更小、更亲水(较少聚集和非特异性结合)、对蛋白酶和热更有抵抗、和具有更低密度的T细胞表位的蛋白，因为最有助于MHC呈递的残基是疏水的。所有四种的这些性质众所周知都影响免疫原性，它们共同预期引起免疫原性的大的降低。
关于Versabody的其它信息可见于美国专利申请公开号2007/0191272，其通过引用以其整体结合到本文中。
SMIPsTM (Small Modular ImmunoPharmaceuticals-Trubion Pharmaceuticals)经工程改造以保持和优化靶标结合、效应器功能、体内半寿期和表达水平。SMIPS由三个不同的模块结构域组成。首先它们含有结合结构域，其可由赋予特异性的任何蛋白(例如细胞表面受体、单链抗体、可溶蛋白等)组成。第二，它们含有铰链结构域，其在结合结构域和效应器结构域之间起柔性接头的作用，并还有助于控制SMIP药物的多聚化。最后，SMIPS含有效应器结构域，其可衍生自多种分子，包括Fc结构域或其它特别设计的蛋白。设计的模块性允许简单构建具有多个不同结合、铰链和效应器结构域的SMIPs，提供快速和定制的药物设计。
关于SMIPs的更多信息，包括如何设计它们的实例，可见于Zhao等(2007) Blood 110:2569-77和以下的美国专利申请号20050238646; 20050202534; 20050202028; 20050202023; 20050202012; 20050186216; 20050180970;和20050175614。
在另一方面，本发明的方法使用靶向标志物和抑制或减量调节标志物的免疫缀合物试剂。可靶向标志物的试剂包括但不限于细胞毒性剂、抗炎剂例如甾体的或非甾体的炎性试剂、或细胞毒素抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、硫替派(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法兰、卡莫司汀(BSNU)和罗莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二氨铂(II) (DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(之前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(之前的放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)。
在另一实施方案中，用于本发明方法的标志物调节剂是小分子。本文所用的术语“小分子”是本领域的一个术语，包括为小于约7500、小于约5000、小于约1000分子量或小于约500分子量并抑制标志物活性的分子。示例性的小分子包括但不限于小有机分子(例如Cane等1998. Science 282:63)和天然产物提取库。在另一实施方案中，化合物是小的有机非肽化合物。像抗体一样，这些小分子抑制剂间接或直接抑制标志物的活性。
在另一实施方案中，用于本发明方法的标志物调节剂是反义核酸分子(其与编码标志物的基因或所述基因的一部分互补)或编码所述反义核酸分子的重组表达载体。本文所用的"反义"核酸包括核苷酸序列，其与编码蛋白的"有义"核酸互补，例如与双链cDNA分子的编码链互补，与mRNA序列互补或与基因的编码链互补。因此，反义核酸可与有义核酸形成氢键。
反义核酸在细胞中减量调节特定蛋白的表达的用途是本领域众所周知的(参见例如Weintraub, H.等, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis (反义RNA作为基因分析的分子工具), Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986; Askari, F.K.和McDonnell, W.M. (1996) N. Eng. J. Med. 334:316-318; Bennett, M.R.和Schwartz, S.M. (1995) Circulation 92:1981-1993; Mercola, D.和Cohen, J.S. (1995) Cancer Gene Ther. 2:47-59; Rossi, J.J. (1995) Br. Med. Bull. 51:217-225; Wagner, R.W. (1994) Nature 372:333-335)。反义核酸分子包括与其它核酸分子(例如mRNA序列)的编码链互补的核苷酸序列，因此能够与其它核酸分子的编码链形成氢键。与mRNA的序列互补的反义序列可能与存在于mRNA的编码区、mRNA的5'或3'非翻译区或桥接编码区和非翻译区的区(例如在5'非翻译区和编码区的接合处)的序列互补。此外，反义核酸可能在序列上与编码mRNA的基因的调节区互补，例如转录起始序列或调控元件。优选，反义核酸经设计以与编码链的起始密码子之前的区域或跨越起始密码子的区域互补，或与在mRNA的3'非翻译区中的区域互补。
反义核酸可根据Watson和Crick碱基配对规则来设计。反义核酸分子可以与标志物mRNA的完整编码区互补，但更优选是对仅一部分的标志物mRNA的编码或非编码区反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可以与标志物mRNA的翻译起始位点附近的区域互补。反义寡核苷酸可以是例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸长度。
反义核酸可使用化学合成和酶连接反应，使用本领域已知的程序构建。例如，反义核酸(例如反义寡核苷酸)可使用天然存在的核苷酸或不同修饰的核苷酸(经设计以增加分子的生物稳定性或增加在反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性)化学合成，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰的核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(queosine)、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。或者，反义核酸可使用表达载体而生物学产生，核酸已在反义方向上被亚克隆至所述载体中(即从插入的核酸转录的RNA将对目的靶核酸具有反义方向，其在下面的子部分中进一步描述)。
可用于本发明方法的反义核酸分子通常给予受试者或在原位产生，使得它们与编码标志物的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而通过抑制转录和/或翻译来抑制表达。杂交可通过常规核苷酸互补性以形成稳定的双链体，或者例如在结合DNA双链体的反义核酸分子的情况下，通过在双螺旋的大沟中的特异相互作用。反义核酸分子的给药途径的实例包括在组织位点处直接注射。或者，反义核酸分子可经修饰以靶向选择的细胞，然后经系统给予。例如，对于系统给予，反义分子可经修饰，使得它们特异性结合在选择的细胞表面上表达的受体或抗原，例如通过连接反义核酸分子和结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体。反义核酸分子也可使用本领域众所周知和描述于例如US20070111230的载体递送至细胞，所述专利的全部内容结合到本文中。为获得足够的细胞内浓度的反义分子，优选这样的载体构建体，其中反义核酸分子位于强pol II或pol III启动子的控制之下。
在又一个实施方案中，用于本发明方法的反义核酸分子可包括α-异头核酸分子。α-异头核酸分子与互补的RNA形成特定的双链杂交体，其中与通常的β-单元相反，所述链彼此平行排列(Gaultier等(1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641)。反义核酸分子还可包含2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987) FEBS Lett. 215:327-330)。
在另一实施方案中，用于本发明方法的反义核酸是介导RNAi的化合物。RNA干扰剂包括但不限于核酸分子，包括与标志物或其片段同源的RNA分子、“短干扰RNA” (siRNA)、“小发夹结构”或“小发夹RNA” (shRNA)和通过RNA干扰(RNAi)干扰或抑制靶基因表达的小分子。RNA干扰是转录后的靶向基因沉默技术，其使用双链RNA (dsRNA)来使含与dsRNA相同的序列的信使RNA (mRNA)降解(Sharp, P.A.和Zamore, P.D. 287, 2431-2432 (2000); Zamore, P.D.,等Cell 101, 25-33 (2000)；Tuschl, T.等Genes Dev. 13, 3191-3197 (1999))。当内源核糖核酸酶裂解较长的dsRNA为较短的21或22个核苷酸-长的RNA (称为小干扰RNA或siRNA)时，该过程发生。然后，较小的RNA区段介导靶mRNA的降解。用于合成RNAi的试剂盒是市售可得的，例如得自New England Biolabs和Ambion。在一个实施方案中可使用上述用于反义RNA的一种或多种化学物。
在又一个实施方案中，反义核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化RNA分子，其能够裂解它们与其具有互补区的单链核酸，例如mRNA。因此，核酶(例如锤头核酶(描述于Haselhoff和Gerlach, 1988, Nature 334:585-591)可用于催化裂解标志物mRNA转录物，从而抑制标志物mRNA的翻译。
或者，基因表达可通过靶向与标志物的调控区互补的核苷酸序列(例如，启动子和/或增强子)以形成阻止标志物基因转录的三螺旋结构来抑制。一般性参见Helene, C., 1991, Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C.等, 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36;和Maher, L.J., 1992, Bioassays 14(12):807-15。
在另一实施方案中，用于本发明方法的标志物调节剂是衍生自标志物氨基酸序列的融合蛋白或肽化合物。具体而言，抑制化合物包含标志物(或其模拟物)的融合蛋白或一部分，其介导标志物与靶分子的相互作用，使得标志物与该融合蛋白或肽化合物的接触竞争性抑制标志物与靶分子的相互作用。这样的融合蛋白和肽化合物可使用本领域已知的标准技术制备。例如，肽化合物可通过化学合成使用标准肽合成技术来制备，然后通过本领域已知用于引入肽至细胞的多种方式(例如脂质体等)将其引入至细胞中。
本发明的融合蛋白或肽化合物的体内半寿期可通过对肽进行修饰来提高，例如添加N-连接的糖基化位点至标志物中或将标志物与聚乙二醇(PEG；聚乙二醇化)缀合，例如通过赖氨酸-单聚乙二醇化。这样的技术已证明有利于延长治疗蛋白药物的半寿期。预期，本发明的标志物多肽的聚乙二醇化可产生类似的药学益处。
此外，通过引入非天然氨基酸，聚乙二醇化可在本发明的多肽的任何部分上实现。某些非天然氨基酸可通过描述于Deiters等, J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003; Wang和Schultz, Science 301:964-967, 2003; Wang等, Science 292:498-500, 2001; Zhang等, Science 303:371-373, 2004或美国专利号7,083,970中的技术引入。简言之，这些表达系统中的一些包括定点诱变以引入无义密码子，例如琥珀TAG，至编码本发明的多肽的开放阅读框。然后将这样的表达载体引入至宿主，其可利用对引入的无义密码子有特异性的tRNA并装载选择的非天然氨基酸。为了缀合各部分至本发明多肽的目的而有利的具体的非天然氨基酸包括具有乙炔和叠氮基侧链的那些。然后，含有这些新氨基酸的标志物多肽可在蛋白质的这些选择的位点上被聚乙二醇化。
2. 刺激剂
根据本发明的调节方法，在细胞或受试者中标志物的表达和/或活性通过使细胞与(或给予受试者)刺激剂接触而被刺激。本发明的刺激剂可以是例如起刺激或增加标志物的表达和/或活性的作用的分子。
这样的刺激剂的实例包括活性标志物多肽和编码标志物的核酸分子，其被引入至细胞以增加细胞中标志物的表达和/或活性。优选的刺激剂是编码标志物多肽的核酸分子，其中以适于在细胞中表达活性标志物多肽的形式将核酸分子引入至细胞中。为了在细胞中表达标志物多肽，通常首先使用标准分子生物学技术将编码标志物的cDNA (全长或部分cDNA序列)引入至重组表达载体中，和使用标准分子生物学技术将所述载体转染至细胞中。例如，通过扩增使用聚合酶链反应(PCR)、使用基于标志物核苷酸序列的引物或通过筛选合适的cDNA文库，可获得cDNA。
用于本发明方法的核酸也可例如通过标准重组DNA技术制备。本发明的核酸也可使用标准技术化学合成。化学合成多脱氧核苷酸的各种方法是已知的，包括已在商业可得的DNA合成仪上自动化进行的固相合成(参见例如Itakura等美国专利号4,598,049; Caruthers等美国专利号4,458,066;和Itakura美国专利号4,401,796和4,373,071，通过引用结合到本文中)。
在一个实施方案中，编码标志物的核酸分子可存在于可诱导的构建体中。在另一实施方案中，编码标志物的核酸分子可存在于导致组成型表达的构建体中。在一个实施方案中，可在缺少载体的情况下将编码标志物的核酸分子递送至细胞，或递送至受试者。
可使用病毒载体，优选其基因治疗用途是本领域众所周知的病毒载体，将编码标志物的核酸分子递送至细胞或受试者。用于形成载体或病毒体的技术通常描述于Recombinant DNA, 第2版, Watson, J. D.等编辑，第28章，"Working Toward Human Gene Therapy"，New York: Scientific American Books, 第567-581页(1992)。合适的病毒载体或病毒体的综述提供于Wilson, J. M., Clin. Exp. Immunol. 107(Suppl. 1):31-32 (1997)以及Nakanishi, M., Crit. Rev. Therapeu. Drug Carrier Systems 12:263-310 (1995); Robbins, P. D.等, Trends Biotechnol.16:35-40 (1998); Zhang, J.等, Cancer Metastasis Rev. 15:385-401(1996);和Kramm, C. M.等, Brain Pathology 5:345-381 (1995)。这样的载体可衍生自包含RNA的病毒(Vile, R. G.等, Br. Med Bull. 51:12-30 (1995))或包含DNA的病毒(Ali M.等, Gene Ther. 1:367-384 (1994))。
用于基因疗法领域和因此适用于本发明的病毒载体系统的实例包括以下：逆转录病毒(Vile, R. G., 同上; 美国专利号5,741,486和5,763,242)；腺病毒(Brody, S. L.,等, Ann. N.Y. Acad. Sci. 716: 90-101 (1994); Heise, C.等, Nat. Med. 3:639-645 (1997))；腺病毒/逆转录病毒嵌合体(Bilbao, G.,等, FASEB J. 11:624-634 (1997); Feng, M.,等, Nat. Biotechnol. 15:866-870 (1997))；腺伴随病毒(Flotte, T. R.和Carter, B. J., Gene Ther. 2:357-362 (1995); 美国专利号5,756,283)；单纯疱疹病毒I或II (Latchman, D. S., Mol. Biotechnol. 2:179-195 (1994); 美国专利号5,763,217; Chase, M.,等, Nature Biotechnol. 16:444-448 (1998))；细小病毒(Shaughnessy, E.,等, Semin Oncol. 23:159-171 (1996))；网状内皮组织增生病毒(Donburg, R., Gene Therap. 2:301-310 (1995))。染色体外复制载体也可用于本发明的基因治疗方法。这样的载体描述于例如Calos, M. P. (1996) Trends Genet. 12:463-466，其全部内容通过引用结合到本文中。可用作基因递送的载体的其它病毒包括脊髓灰质炎病毒、乳头瘤病毒、牛痘病毒、慢病毒以及包含两种或更多种病毒的有利方面的杂合或嵌合载体(Nakanishi, M. (1995) Crit. Rev. Therapeu. Drug Carrier Systems 12:263-310; Zhang, J.,等(1996) Cancer Metastasis Rev. 15:385-401; Jacoby, D. R.,等(1997) Gene Therapy 4:1281-1283)。
术语"AAV载体"是指衍生自腺伴随病毒血清型的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5或AAVX7。"rAAV载体"是指包括AAV核苷酸序列以及异源核苷酸序列的载体。rAAV载体仅需要呈顺式的145个碱基的末端重复以产生病毒。所有其它的病毒序列不是必要的，并可以反式提供(Muzyczka (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97)。通常rAAV载体基因组仅保留反向末端重复(ITR)序列，以使可有效包装在载体中的转基因的大小最大化。ITR不需要是野生型核苷酸序列，并可通过例如插入、缺失或置换核苷酸而改变，只要所述序列提供功能复苏、复制和包装。在具体的实施方案中，AAV载体是AAV2/5或AAV2/8载体。合适的AAV载体描述于例如美国专利号7,056,502和Yan等(2002) J. Virology 76(5):2043-2053，其全部内容通过引用结合到本文中。
本文所用的术语"慢病毒"是指一类(或属)逆转录病毒，其产生慢慢发展的疾病。包括在该类中的病毒包括HIV (人免疫缺陷病毒；包括但不限于HIV 1型和HIV 2型)，其为人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体；visna-maedi，其在绵羊中引起脑炎(visna)或肺炎(maedi)；羊关节炎-脑炎病毒，其在山羊中引起免疫缺陷、关节炎和脑病；马传染性贫血病毒(EIAV)，其在马中引起自体免疫溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，其在猫中引起免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其在牛中引起淋巴结病、淋巴细胞增多和可能的中枢神经系统感染；和猴免疫缺陷病毒(SIV)，其在类人灵长类动物中引起免疫缺陷和脑病。由这些病毒引起的疾病的特征在于长的潜伏期和长期的病程。通常，病毒潜伏感染单核细胞和巨噬细胞，从这些细胞它们散布到其它细胞。HIV、FIV和SIV还容易地感染T淋巴细胞(即T-细胞)。在本发明的一个实施方案中，慢病毒不是HIV。
本文所用的术语“腺病毒” (“Ad”)是指一类双链DNA病毒，具有约36 kb的线状基因组。参见例如Berkner等, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 39-61 (1992)。在一些实施方案中，基于腺病毒的载体是基于Ad-2或Ad-5的载体。参见例如Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 97-123, 1992; Ali等, 1994 Gene Therapy 1: 367-384; 美国专利号4,797,368和5,399,346。衍生自腺病毒毒株Ad型5 dl324或其它腺病毒毒株(例如Ad2、Ad3、Ad7等)的合适的腺病毒载体是本领域技术人员众所周知的。重组腺病毒的优点在于它们不需要分裂细胞作为有效基因递送媒介并可用于感染各种细胞类型。此外，引入的腺病毒DNA (和其中包含的外源DNA)未整合至宿主细胞的基因组，而是保持游离基因，从而避免在其中引入的DNA整合至宿主基因组的情况下(例如逆转录病毒DNA)因为插入诱变而可能发生的潜在问题。此外，相对于其它基因递送载体，腺病毒基因组对外源DNA的运载能力大(达到8千碱基) (Haj-Ahmand等J. Virol. 57, 267-273 [1986])。
在一个实施方案中，腺病毒为复制缺陷的腺病毒。目前使用的大多数复制缺陷的腺病毒载体具有全部或部分的病毒E1和E3基因缺失，但保留多至80%的腺病毒遗传物质。缺失所有病毒编码区的腺病毒载体还描述于Kochanek等和Chamberlain等(美国专利号5,985,846和美国专利号6,083,750)。在缺少由第二病毒(称为“辅助”病毒)提供的病毒产物的情况下,这样的病毒不能作为病毒复制。
在一个实施方案中，腺病毒载体是“无病毒(gutless)”载体。这样的载体包含最小量的腺病毒DNA和不能表达任何腺病毒抗原(由此术语“无病毒”)。当无病毒复制缺陷的Ad载体用于基因疗法时，无病毒复制缺陷的Ad载体提供容纳大的外源DNA插入物同时完全消除表达腺病毒基因(其导致对病毒蛋白的免疫学反应)的问题的重要优点。用于产生无病毒复制缺陷的Ad载体的方法已描述于例如Kochanek等的美国专利号5,981,225和Chamberlain等的美国专利号6,063,622和6,451,596；Parks等, PNAS 93:13565 (1996)和Lieber等, J. Virol. 70:8944-8960 (1996)。
在另一个实施方案中，腺病毒载体是“条件复制腺病毒” (“CRAd”)。CRAd经遗传修饰以在特定细胞中通过以下而优先复制：(i)用组织特异性启动子替换病毒启动子或(ii)缺失对复制重要的病毒基因，其仅通过靶细胞来补偿。技术人员将能够鉴定上皮细胞特异性启动子。
本领域已知的其它腺病毒载体可用于本发明的方法。实例包括具有用于改变向性的重组纤维蛋白的Ad载体(描述于例如van Beusechem等, 2000 Gene Ther. 7: 1940-1946)、蛋白酶预处理病毒载体(描述于例如Kuriyama等, 2000 Hum. Gene Ther. 11: 2219-2230)、E2a温度敏感性突变体Ad载体(描述于例如Engelhardt等, 1994 Hum. Gene Ther. 5: 1217-1229)和“无病毒” Ad载体(描述于例如Armentano等, 1997 J. Virol. 71: 2408-2416; Chen等, 1997 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 94: 1645-1650; Schieder等, 1998 Nature Genetics 18: 180-183)。
所述载体将包括一个或多个启动子或增强子，其选择对本领域技术人员是已知的。合适的启动子包括但不限于逆转录病毒长末端重复(LTR)、SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV)启动子和技术人员已知的其它病毒和真核细胞启动子。
基因疗法载体的构建和为治疗目的将其引入至受累受试者的指导可在上文提到的出版物中以及在美国专利号5,631,236、5,688,773、5,691,177、5,670,488、5,529,774、5,601,818和PCT公开号WO 95/06486中获得，其全部内容通过引用结合到本文中。
通常，病毒感染目的细胞的方法是本领域已知的。可将病毒与目的细胞接触，或备选地，可将病毒注射至患有视网膜病症的受试者，例如如美国专利临时申请号61/169,835和PCT申请号PCT/US09/053730中所述，其各自内容通过引用结合到本文中。
包含编码标志物的核酸分子的基因治疗载体可通过本领域任何合适的方法递送至受试者或细胞，所述方法例如静脉内注射；局部给予例如在凝胶、油或乳膏中施用核酸(参见例如美国专利号5,328,470)；定向注射(参见例如Chen等(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3054)；基因枪或通过电穿孔(参见例如Matsuda和Cepko (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:1027)；使用基于脂质的转染试剂；或通过任何其它合适的转染方法。
本文所用的术语“转化”和“转染”意欲指用于将外源核酸(例如DNA)引入至宿主细胞的各种公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂质转染(例如使用市售可得的试剂，例如LIPOFECTIN® (Invitrogen Corp., San Diego, CA)、LIPOFECTAMINE® (Invitrogen)、FUGENE® (Roche Applied Science, Basel, Switzerland)、JETPEI™ (Polyplus-transfection Inc., New York, NY)、EFFECTENE® (Qiagen, Valencia, CA)、DREAMFECT™ (OZ Biosciences, France)等)或电穿孔(例如体内电穿孔)。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等(分子克隆：实验室手册，第二版，Cold Spring harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)和其它实验室手册。
在一个实施方案中，将标志物以肽或蛋白的形式递送至受试者或细胞。为了产生这样的肽或蛋白，本发明的重组表达载体可经设计以在原核或真核细胞中表达一种或多种标志物蛋白和/或其部分。例如，一种或多种葡萄糖运输蛋白和/或其部分可在细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞进一步论述于Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)。或者，重组表达载体可在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
在一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调控元件表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括视网膜细胞型特异性启动子(例如视紫质调控序列、Cabp5、Cralbp、Nrl、Crx、Ndrg4、丛生蛋白、Rax、Hes1等(Matsuda和Cepko, supra))、白蛋白启动子(肝特异性的，Pinkert等(1987) Genes Dev. 1:268)、神经元特异性启动子(例如神经微丝启动子；Byrne和Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:5473)。还包括发育调控启动子，例如α-胎蛋白启动子(Campes和Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537)。
本发明的方法用于治疗和/或预防视网膜病症的应用可导致治愈所述病症、减少与所述病症相关的至少一种症状，对受试者的长期或短期的有益作用或对受试者仅有暂时的有益作用。因此，本文所用的术语“治疗”包括施用或给予患有视网膜病症或对所述病况易感的受试者本文所述的试剂，目的是治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响所述病况或所述病况的至少一种症状。如本文所用的，如果病况的复发被减少、减慢、延迟或阻止，病况亦得到“治疗”。
调节剂，例如化合物，可作为药物组合物给予受试者。这样的组合物通常包含调节剂和药学上可接受的载体。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”意欲包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其与药物给予相容。这样的介质和试剂用于药学活性物质的用途是本领域众所周知的。除了任何常规介质或试剂与活性化合物不相容的情况之外，考虑其在组合物中的用途。补充的活性化合物也可掺入至组合物中。可按上所述制备药物组合物。
E. 鉴定 2 型糖尿病生物标志物的方法
本发明进一步提供用于鉴定2型糖尿病生物标志物的方法，所述生物标志物用作例如疾病(预后和诊断)、药物的治疗功效(治疗诊断)和药物毒性的标志物。例如，如上所述，本文所述的标志物和使用生物标志物发现的方法鉴定的标志物可用于例如确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损；确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病；确定具有2型糖尿病的受试者是否将对糖尿病疗法有反应；监测用于在受试者中抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展、降低或减慢正常葡萄糖耐量至空腹糖血受损、至葡萄糖耐量受损和/或至糖尿病的进展和/或降低或抑制与所述疾病相关的并发症的发展的疗法的功效；鉴定调节(例如降低或增加)用作例如疗法的本发明的标志物的表达和/或活性的分子的筛选测定法中。
用于鉴定2型糖尿病标志物的方法描述于工作实施例中，并包括在稳定状态条件下鉴定两个或更多个物种的两种或更多种器官的分泌泡中的蛋白，鉴定胰脏β细胞的分泌泡中的蛋白，从而产生稳定状态标志物的临时列表，从两个或更多个物种的两种或更多种器官中鉴定稳定状态标志物的临时列表中的标志物，其为胰脏β细胞的分泌泡中的共有标志物，和从稳定状态标志物的临时列表中除去那些标志物，从而产生β细胞质量标志物的列表；在功能障碍条件下鉴定胰脏β细胞的分泌泡中的蛋白，在正常条件下鉴定胰脏β细胞的分泌泡中的蛋白，鉴定在功能障碍条件下和在正常条件下差异表达的蛋白，从而产生β细胞功能标志物的临时列表，测定对照受试者(例如具有正常葡萄糖耐量的受试者)的样品中β细胞质量标志物和/或β细胞功能标志物的水平，测定受试者(例如具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者)的试验样品中标志物的水平。对照样品中标志物的水平与试验样品中的水平相比的差异，例如统计学显著水平，鉴定所述标志物为2型糖尿病生物标志物。
2型糖尿病标志物还可通过以下来鉴定：测定提供至少一部分疗法给受试者之前获自具有2型糖尿病的受试者的第一样品中的蛋白水平，和测定提供所述疗法的至少一部分后获自所述受试者的第二样品中的蛋白水平。相对于第一样品，第二样品中蛋白表达水平的差异，例如统计学显著水平，鉴定所述蛋白为2型糖尿病标志物。
IV. 本发明的试剂盒
本发明还提供用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损和/或受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒。还提供确定受试者是否将发展2型糖尿病并发症、确定疗法是否将有效治疗具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者的试剂盒和用于监测疗法的功效的试剂盒。
这些试剂盒包括测定本发明的一种或多种标志物的水平的工具和试剂盒使用说明书。
本发明的试剂盒可任选包含用于进行本发明方法的另外组分。例如，试剂盒可包含用于从受试者获得生物样品的试剂、对照样品、一个或多个样品区室、糖尿病治疗剂、描述进行本发明方法的指导材料和组织特异性对照/标准品。
用于测定一种或多种标志物的水平的试剂可包括例如缓冲液或用于评价一种或多种标志物的水平(例如表达水平(例如在mRNA或蛋白水平上))的测定法的其它试剂。说明书可以是例如用于进行评价本发明的一种或多种标志物的水平的测定法的印刷的说明书。
用于自受试者分离生物样品的试剂可包括可用于从受试者获得流体或组织的一种或多种试剂，例如用于获得唾液或血液的工具。
本发明的试剂盒可进一步包括用于培养获自受试者的样品的试剂。
优选，试剂盒经设计用于人类受试者。
本发明通过以下实施例作进一步说明，实施例不应解释为进一步限制。本申请全文所引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容，以及附图，明确地通过引用以其整体结合到本文中。
实施例
实施例 I. 生物标志物鉴定
材料和方法
候选生物标志物通过评价已知或怀疑由β胰岛分泌的蛋白来鉴定。
使用三种体外系统来鉴定分泌蛋白候选生物标志物，原代人胰岛和2种胰脏β-细胞系。原代人胰岛获自缺少主要医学问题的供体。表5列出了供体的特征。使用的细胞系是大鼠INS832/13和小鼠MIN6。实验系统使用两种条件来分析，即稳定状态和在实验的功能障碍状态期间(经设计以模拟在2型糖尿病中观察到的胰脏β细胞功能障碍)。
表 5. 胰岛供体特征
对于鉴定在稳定状态期间分泌的蛋白，将细胞系在含5mM葡萄糖的RPMI中培养和将原代人胰岛在4℃保持在盐水中直到分泌泡样品制备。对于鉴定在功能障碍状态期间分泌的蛋白，实验系统用20 mM葡萄糖/0.4mM棕榈酸盐或用25 mM葡萄糖/0.4mM棕榈酸盐孵育(El-Assaad等(2010) Endocrinology 151:3061-73)直到胰岛素产生减少至少30%和诱导程序化细胞死亡，其为通常对于细胞系在16-24小时之间发生和对于原代胰岛在36-72小时之间发生的事件。
自稳定状态和功能障碍的胰岛和细胞系分泌的蛋白制备物使用相同方法制备。每个实验系统使用至少4个独立的重复。通过刮除、在4℃ 1400 rpm离心5分钟以除去碎片和重悬于匀浆缓冲液(250 mM蔗糖/10 mM Tris pH 7.4/蛋白酶抑制剂无EDTA混合物)中收获培养的细胞。将胰岛或细胞系悬浮液使用Dounce匀浆器匀浆。匀浆液调整至1.4M蔗糖。14ml SW40Ti超清离心管(Beckman Coulter #344060)用匀浆液分层，接着4ml的1.2M蔗糖并在最上面添加0.8M蔗糖。将样品以155,000 g在4℃离心2小时和从0.8-1.2M界面收获囊泡。囊泡在0.5M KCl中洗涤，接着在碳酸铵pH11中孵育。通过在112,000 g离心将囊泡内容物与囊泡膜分离。使用BCA蛋白测定法(Pierce #23227)测量蛋白收率。在样品有限的情况下，处理全部分泌泡用于质谱分析。使用针对在特定亚细胞区室(例如质膜、内质网(ER)、高尔基体和线粒体)中表达的蛋白的抗体，将起始细胞系匀浆物和分泌的蛋白终产物进行蛋白质印迹表征。使用与这些区室相关的膜结合蛋白和可溶蛋白两者以评价从相关的亚细胞区室中可能分泌的蛋白在制备物中的相对富集。图1描述来自大鼠细胞系(A)和人原代胰岛(B)的分泌蛋白的起始材料(Hom)、中间体(SV)和终产物(SC)制备物的蛋白质印迹。
使用上述方法，自选择的主要器官或自已知参与糖尿病疾病进展和并发症的器官制备另外一组分泌蛋白样品，对于更多纤维的器官，替换为更强烈的机械组织破裂。为产生人器官分泌体数据集，自肺、乳腺、肾、前列腺、膀胱和结肠制备分泌蛋白。对于大鼠数据集，自心、肝、肾、骨骼肌、皮下脂肪和整个胰腺制备分泌蛋白。进行该实验以鉴定也可通过除原代胰岛或β细胞系之外的其它组织制备的分泌蛋白。可通过多个组织制备的分泌蛋白因此将可能具有相对低的组织特异性，因此不以优先顺序排列为生物标志物候选物。
一旦产生分泌蛋白样品，将它们进一步处理用于质谱数据采集以及肽和蛋白鉴定。简言之，样品用胰蛋白酶消化以产生肽。然后通过强阳离子交换色谱(SCX)将肽分成三个部分。每一样品的三个部分中的每一个通过经由电喷射与Waters QTOF质谱连接的反相液相色谱(LC-MS)进行分析。检测各组分，在所有样品中进行匹配，并比较相对峰强度。将峰强度标准化以说明样品间在蛋白浓度上小的差异。然后应用ANOVA以鉴定在源自功能障碍的胰岛或细胞系的样品的目标组之间差异表达的肽。使用高度严格的阈值以确保鉴定的肽的统计学显著。所有强度值为log (底e)，其经过< 0的值用0替换的转化。样品的子集用于建立平均样品(即参考样品)，然后所有样品针对该平均样品进行标准化。选择标准化因数，使得在所有肽中，在各样品和参考样品之间log比率的中位数调整为0。用定制的蛋白数据库使用Mascot (Matrix Science)软件进行肽鉴定。使用手动文献检查和网络以及途径分析的组合(Ingenuity)，进行候选生物标志物注释。
在稳定状态的原代胰岛、细胞系和器官的分泌体中鉴定了数千种蛋白质。除去在胰岛或细胞系中鉴定的并且还存在于器官分泌体中的分泌蛋白。将剩余的蛋白排序以鉴定哪一子集仅在原代人胰岛中表达，或还在至少一个细胞系中表达。总共170种蛋白满足这些标准，因此这些蛋白构成了起始稳定状态生物标志物数据集。
使用类似的方法鉴定起始功能障碍的生物标志物数据集。对两个之前描述的标准的额外的要求是与对照相比，在功能障碍状态中候选生物标志物的任一种还差异表达至少1.5倍。总共245种蛋白满足该标准，因此这些蛋白构成起始功能障碍的生物标志物数据集。
用于基于血浆的生物标志物验证分析的受试者显示在表6和7中。使用3种不同的方法处理血浆。首先，使用亲和色谱方法除去共同高丰度的血浆蛋白。除去最丰富的血浆蛋白允许更容易测量较不丰富的血浆蛋白。然而，预期一些生物标志物候选物以所用的MRM-MS测定法的当前检测水平之下存在。为测量来自该低丰度类型的生物标志物的候选物，使用市售可得的ELISA试剂盒。最后，处理血浆以富集外来体。外来体是小的囊泡，其在正常和疾病条件下由多种细胞类型完整分泌。最初在免疫和中枢神经系统相互作用中描述外来体，之后外来体被描述为通过多种组织类型产生，并存在于多种不同的体液包括血浆中。目前认为外来体为一般性广泛使用的分泌机制的一部分。
使用连续高速离心方法以富集存在于血液中的外来体(Graner MW等(2009) FASEB J. 23 :1541)，并使用该方法从获得的大多数临床样品中制备外来体制备物。这些制备物的分析预期检测出生物标志物的性能，所述生物标志物以其它方式不会被测出，包括低丰度蛋白，但还包括预期不容易溶于血液的膜相关蛋白。
表 6 ：用于验证 BCM/BCF 候选生物标志物的受试者的特征
表 7 ：用于验证 BCM/BCF/TEM 候选生物标志物的其它受试者
结果
A. 2型糖尿病生物标志物鉴定
基于上文所述的方法产生三个数据集。第一数据集是自6种不同人类器官制备的分泌泡内容物蛋白的广泛目录。第二数据集包含来自6种大鼠器官的分泌泡内容物蛋白的相应列表。第三数据集来自三个实验系统的每一个的稳定状态分泌泡内容物蛋白的目录。然后将器官分泌体数据集和实验系统的任一个所共有的蛋白从实验系统数据集中除去，留下更可能由β-细胞或β-胰岛独特表达的分泌蛋白。对每一物种鉴定了超过2000种蛋白，并且从啮齿动物β-细胞系或原代人β-胰岛的分泌泡内容物鉴定了大约1000种蛋白。一半和2/3之间的这些蛋白显示还由至少一种器官分泌体表达。除去这些共同表达的蛋白得到β-细胞质量候选生物标志物。然后，详细检查这些候选物从而以优先顺序排列它们用于进一步分析。
初始分析显示了自3个实验系统鉴定的纯的分泌体蛋白适度重叠，表明在细胞系系统和原代胰岛之间仅部分一致。尽管该发现可能并未出人意料，但在两种细胞系之间观察到的类似的适度重叠不是预期的，可能表明所述细胞系的不同的生理学状态。
通过手工文献检查和网络化软件分析，评价了鉴定的蛋白的生物学功能以及网络和通路联系。使用相对严格的标准以表示蛋白与蛋白的相互关系，例如已经确立的任何两种蛋白之间的已知直接联系，以及显示过度表现的生物学功能或通路超过仅是意外的统计学显著性。满足这些标准的数据集子集包含大量的蛋白(152)。
对于以优先顺序排列候选生物标志物的其它评价是建立组织特异性，其使用胰脏和其它器官中候选生物标志物蛋白表达的组织化学评价进行。该分析表明鉴定的较高排列的候选生物标志物的显著比例具有相对有限的组织表达(通常对胰岛)，或如果它们也在其它组织中表达，则发现它们通常在中枢神经系统中较少表达。这些标志物的子集还已在人体液中检出，表明也分泌这些蛋白。在分析结束时，以优先顺序排列200种蛋白，这些候选生物标志物列于表1 (β细胞质量(BCM)标志物)。
在稳定状态条件下由目的组织分泌的蛋白可在应激下或在功能障碍条件下改变。在这些条件下特定蛋白的分泌可变得增量调节或减量调节。此外，在稳定状态下非正常分泌的蛋白在应激下可变得被分泌。还进行了这些改变的鉴定以限定与β-细胞和β-胰岛功能相关的生物标志物候选物。
将β-细胞系和原代人β-胰岛与溶媒或糖脂毒性处理(上文所述)孵育确定的时间，直到得到前面描述的功能障碍。处理后，按上文进行分泌泡内容物样品制备和蛋白质组数据获得和分析。鉴定了在糖脂毒性处理后变得差异表达的数百种蛋白。扣除与器官分泌体共有的蛋白，留下326种非重复的蛋白，其在三个实验系统的任一个中差异表达。三个实验系统继续显示极少的重叠，即使它们各自用相同的糖脂毒性处理进行处理并且在胰岛素产生和细胞凋亡的诱导方面各自发生类似的下降。在应用上述以优先顺序排列策略之后，选择129种蛋白。β-细胞功能(BCF)候选生物标志物蛋白和处理后它们的变化程度列于表2。
通路分析支持这样的解释，即3个实验系统对相同刺激的反应不同。这表明细胞系系统的生理学关联性可能不足以有效模仿人原代组织。因此焦点在于原代人胰岛选择与β-细胞功能障碍相关的生物标志物候选物的反应。
还产生了人血浆中与治疗反应相关的生物标志物候选物的列表。募集用于该方案部分的所有受试者均具有2型糖尿病，且即将开始或改变治疗。在治疗开始之前以及在开始治疗后2周收集血浆。然后受试者接着进行至少5个月以确定治疗反应。有反应者定义为治疗末期显示糖化血红蛋白水平小于7%并无副作用的受试者，或治疗末期糖化血红蛋白具有1.5%下降并无副作用的受试者。最初的目标是仅评价二甲双胍治疗，其为2型糖尿病的第一线治疗。后来研究范围扩展到允许包括使用其它疗法的受试者。募集时受试者的数量和他们的治疗方案显示在表8中。
表 8 ：用于发现监测候选生物标志物的治疗的受试者的特征
来自这些受试者的血浆样品耗尽了高丰度蛋白并进行分析。然后，将鉴定的差异表达的蛋白与可用的临床数据关联，以鉴定与反应预测(使用前剂量样品分析)或反应监测(使用治疗开始后样品分析)相关的蛋白生物标志物候选物。治疗功效生物标志物(TEM)候选物列于表3。
鉴定了大约150种蛋白，其在至少一种治疗反应比较中显著差异表达。在最后的有反应者和最后的无反应者的前剂量样品中观察到差异。此外，有反应者和无反应者之间的差异显得在治疗期间被放大，因为一旦治疗开始后，与最后的无反应者相比，在最后的有反应者中更多蛋白变得差异表达。
这些分析表明，在治疗开始后，有反应者和无反应者之间的变化增大，不但在每个通路差异表达的蛋白数量上，而且还在治疗前样品中未诱导的相关通路的引入上。
B. 生物标志物验证
上文鉴定的生物标志物在血液中进行评价。通过前文所述的三种方法处理人血浆。等份的各受试者的血浆样品通过亲合色谱法耗尽高丰度蛋白。剩余的材料用胰蛋白酶消化和通过多路MRM-MS测定法进行分析。另一血浆等份用于通过连续高速离心制备血浆外来体。回收的材料使用用于经耗尽的血浆的相同的多路MRM-MS测定法分析。最后，第三等份的血浆用于通过ELISA评价23种生物标志物候选物的性能。
选择的临床组经设计以描述糖尿病疾病进展谱。疾病进展的早期表现为代表非糖尿病健康受试者的血糖正常对照，和表现为具有葡萄糖耐量受损的受试者，其对应于形式上尚未诊断有2型糖尿病的前驱糖尿病个体。糖尿病表现为在最近1.5年内或以前至少5年内已诊断有2型糖尿病的受试者。这两组分别代表了早期和晚期糖尿病。长期(从诊断开始> 5年) 1型糖尿病也包括在本研究中。使用市售的ELISA试剂盒，测试了研究血浆的胰岛素。在过夜禁食后的上午，对所有受试者进行抽血，因此检测的胰岛素反应性最可能代表内源水平。与对照相比，在葡萄糖耐量受损、早期和晚期糖尿病中观察到静止胰岛素浓度的增加，这与2型糖尿病疾病进展一致。
为了验证生物标志物，测定来自受试者样品的生物标志物水平。用于分析的样品描述于表7。它们包括具有代谢综合征的病态肥胖个体和肥胖治疗手术的候选者。这些受试者的一个子集已诊断有T2D并在采集血样时正经历治疗，而其它则显示处于前驱糖尿病状态。代谢综合征是一个涵盖性术语，其用于描述可能的各种病况，全都具有常见的代谢失调，经常导致肥胖且往往是T2D的前体。进行这些受试者的分析以评价候选生物标志物在极端代谢综合征的背景下的性能。针对非病态肥胖受试者，进行相同类型的分析(见表7)：血浆样品通过色谱法耗尽了丰富的蛋白，使用多路MRM-MS测定法进行分析。还进行血浆外来体制备以评价生物标志物候选物的检测，其可能在经耗尽的血浆的多路MRM-MS测定法的检测水平之下，并且还进行选择的ELISA测定法。候选生物标志物的性能显示在表9-12中，其提供DI值用于各标志物比较。对于具体的比较，如果DI值大于1，则蛋白的水平被增量调节。对于具体的比较，如果DI值小于1，则标志物的水平被减量调节。
在初始验证分析中，鉴定在该组肥胖受试者和较不肥胖受试者两者中差异表达的生物标志物的子集。然而，在这两组中存在未共有的许多生物标志物候选物。过度肥胖的影响是明显的。与病态肥胖糖尿病至病态肥胖前驱糖尿病比较相比，在病态肥胖至瘦的比较中存在更多差异表达的生物标志物候选物。还在来自具有2型糖尿病和即将开始或改变治疗的受试者的样品中检测候选生物标志物的水平(见表8)。
通过A1c水平和血糖水平评价对治疗的反应性。3个最大的治疗组是用二甲双胍的受试者、用二甲双胍和格列本脲的受试者和用二甲双胍、格列本脲和胰岛素的受试者，并使用这些组来评价候选生物标志物的性能。针对每种治疗，鉴定在有反应者和无反应者之间的变化(表13)。观察到差异表达的生物标志物候选物的数量随每种添加的治疗而增加。鉴定了在二甲双胍有反应者和无反应者之间差异表达的12种蛋白、针对二甲双胍和格列本脲在相同比较中有15种、而针对二甲双胍、格列本脲和胰岛素有21种。
值得注意的是，仅对用二甲双胍的那些受试者观察到胰岛素家族蛋白在有反应者和无反应者之间差异表达，而对用后面的组合疗法的任何受试者并非如此。该结果与发展的疾病进展一致。
标志物的另外分析鉴定了具有单独的辨别力的30种标志物，其定义为能够在两组之间辨别，准确度为75%或更大。具体而言，并且如上文所述，从对照受试者(例如正常葡萄糖耐量(NGT)受试者)、前驱糖尿病受试者(例如具有葡萄糖耐量受损的受试者)、在之前18个月中诊断为具有2型糖尿病的受试者(nT2D)和具有2型糖尿病和与2型糖尿病相关的并发症(例如糖尿病性神经病、视网膜病、肾病、心血管疾病(eT2D))的受试者获得样品，并测定表1-3中所列的每种标志物的水平。进行NGT受试者和；IGT受试者；nT2D受试者；eT2D；和nT2D和eT2D受试者的组合(全部T2D)中的每种标志物的水平的成对比较，并计算每种标志物的曲线下面积。类似地，进行IGT受试者和；nT2D受试者；eT2D；和nT2D和eT2D受试者的组合(全部T2D)中的每种标志物的水平的成对比较，并计算每种标志物的曲线下面积。这些分析结果显示于表14。因此，鉴定了大量的良好表现的候选物。对于大多数比较，鉴定了具有良好性能指示剂的多种生物标志物候选物。
表 14. 单一标志物的曲线下面积 (AUC)
还评价了这些单独的生物标志物作为一组而组合起作用的能力。该初步的组分析集中在鉴定改进辨别准确度的组合，而且还使用最小可能的生物标志物数。如表15所示，成功鉴定了能够在疾病进展组的每个之间准确辨别的蛋白小组。还检测了列于表1-3中的标志物的各种组合的曲线下面积(AUC)。这些分析结果显示在表15中。
表 15. 标志物组合的曲线下面积 (AUC)
还评价了在来自病态肥胖2型糖尿病或前驱糖尿病的血浆中的与胰脏功能和疾病进展相关的生物标志物候选物。与初始较少肥胖的组相比，发现总共较少的蛋白(13对比30)具有可接受的单独辨别力。然而，来自两组的候选生物标志物的列表重叠，来自肥胖受试者子集的13种较好生物标志物候选物中仅2种仅在肥胖受试者中检出。这表明，鉴定具有良好辨别力的大多数生物标志物候选物在两组中具有类似的性能。尽管这表明这些生物标志物候选物能够在多个群体中是相关的，但也存在重要的差异。这些之一表现为含有更多蛋白的组合对分开来自肥胖组的糖尿病受试者和前驱糖尿病受试者是必需的。例如，5种蛋白的组合对产生能够辨别病态肥胖糖尿病与病态肥胖前驱糖尿病的组是必需的，准确度是0.826。通过比较，使用仅3种蛋白的组合，非病态肥胖前驱糖尿病能够与具有相当BMI的糖尿病区分，准确度为0.998。这表明，可能更难以分开肥胖糖尿病与肥胖前驱糖尿病，这是需要更多组成员，甚至然后这些另外的组成员产生总体较不准确组合的原因。在组受试者中的变异性可能是影响组性能的因素，因为包括的病态肥胖受试者具有广泛改变的BMI值，范围为35-70。一旦受试者分为两组，含有BMI至多40的受试者的一组和BMI大于40的其它受试者，最佳的5种蛋白组的组成对于这些组的每一个变得不同，且最佳组性能从0.826分别提高至0.843和0.889 (表16)。
表 16. BCM|BCF|TEM 高 BMI [ 糖尿病对比非糖尿病 ]
实施例 II. 受试者样品中的一种或多种生物标志物的水平检测
生物学样品(例如血清、唾液)获自受试者，并且列于表1-3中的一种或多种标志物的水平通过质谱法测定以确定(例如，受试者是否具有或将发展2型糖尿病，受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损，受试者是否将发展2型糖尿病-相关的并发症，具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对疗法有反应)。简言之，样品用胰蛋白酶消化，以产生肽。然后将肽通过强阳离子交换色谱(SCX)分离成三个部分。每一样品的三个部分的每一个通过经由电喷射与Waters QTOF质谱连接的反相液相色谱(LC-MS)分析。检测各组分，在所有样品中进行匹配，并比较相对峰强度。将峰强度标准化。将样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水平比较，并且与对照样品的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品的一种或多种标志物的水平的差异表明所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
等效物
在描述实例性实施方案中，为澄清的原因使用特定的术语。为描述的目的，各特定的术语意指至少包括所有技术和功能等效物，其以类似的方式操作来实现类似的目的。此外，在其中具体的实例性实施方案包括多个系统要素或方法步骤的一些实例中，那些要素或步骤可替换为单一要素或步骤。同样，单一要素或步骤可替换为用于相同目的的多个要素或步骤。此外，在本文指定实例性实施方案的各种性质的参数的情况下，那些参数可向上或向下调整1/20、1/10、1/5、1/3、½等，或通过其四舍五入近似值调整，除非另有说明。此外，尽管实例性实施方案已经参考其具体的实施方案进行显示和描述，但本领域普通技术人员将理解，在不背离本发明的范围的情况下，可对其进行形式和细节上的各种替换和改变。还另外，其它方面、功能和优点也在本发明的范围内。
本文提供了实例性的流程图用于说明的目的，并且是非限制性的方法实例。本领域普通技术人员将认识到，实例性的方法可包括比实例性流程图中说明的那些更多或更少的步骤，并且实例性流程图中的步骤可以与所示不同的顺序进行。
通过引用结合
本申请全文引用的所有参考文献(包括专利和专利申请)的内容通过引用以其整体结合到本文中。可选择这些参考文献的合适的要素和方法用于本发明和其实施方案。更进一步地，在背景部分中确定的要素和方法是本公开内容所必需的，并且可与本发明范围内的公开内容的其它地方描述的要素和方法结合使用，或替换本发明范围内的公开内容的其它地方描述的要素和方法。

Claims (176)

1. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的方法，所述方法包括
在受试者的样品中测定表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物的水平；
将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平的差异指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
2. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的方法，所述方法包括
在受试者的样品中测定表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物的水平；
将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平的差异指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病。
3. 用于确定受试者是否将发展2型糖尿病相关并发症的方法，所述方法包括
在受试者的样品中测定表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物的水平；
将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平的差异指示所述受试者将发展2型糖尿病相关并发症。
4. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对疗法有反应的方法，所述方法包括
在受试者的样品中测定表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物的水平；
将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平的差异指示所述受试者将对所述疗法有反应。
5. 用于在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗功效的方法，所述方法包括
在开始所述治疗之前，在来自受试者的第一样品中测定表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物的水平；
在已给予所述治疗的至少一部分之后，在来自受试者的第二样品中测定表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物的水平；
将第一样品中的一种或多种标志物的水平与第二样品中的一种或多种标志物的水平相比较，其中与第二样品中的一种或多种标志物的水平相比，第一样品中的一种或多种标志物的水平的差异指示所述受试者将对所述治疗有反应。
6. 用于鉴定可抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展的化合物的方法，所述方法包括
使来自受试者的等份样品与化合物库的各个成员接触；
测定化合物库的成员对各个等份中的本发明的一种或多种标志物的水平和/或活性的影响；和
选择化合物库的成员，与对照样品中的本发明的一种或多种标志物的水平和/或活性相比，所述成员调节所述等份中的本发明的一种或多种标志物的水平和/或活性，从而鉴定可抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展的化合物。
7. 用于在受试者中抑制葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的方法，包括给予所述受试者调节表1-3中所列的任何一种或多种标志物的表达和/或活性的有效量的试剂，从而抑制受试者的葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的发展。
8. 前述权利要求中任一项的方法，其中受试者样品中的所述水平通过质谱法测定。
9. 权利要求8的方法，其中所述质谱法是基质辅助的激光解吸/飞行时间(MALDI/TOF)质谱法、液相色谱四重离子捕获电喷射(LCQ-MS)或表面增强激光解吸电离/飞行时间(SELDI/TOF)质谱法。
10. 前述权利要求中任一项的方法，其中受试者样品中的所述水平通过免疫测定法测定。
11. 前述权利要求中任一项的方法，其中受试者样品是流体样品。
12. 前述权利要求中任一项的方法，其中受试者样品是组织样品。
13. 前述权利要求中任一项的方法，其中标志物的水平是标志物的表达水平和/或活性。
14. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者具有发展2型糖尿病的风险。
15. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的USP9X的水平；
将受试者样品中的USP9X的水平与对照样品中的USP9X的水平相比较，其中受试者样品中的USP9X的水平低于对照样品中的USP9X的水平，指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
16. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的USP9X的水平；
将受试者样品中的USP9X的水平与对照样品中USP9X的水平相比较，其中受试者样品中的USP9X的水平低于对照样品中的USP9X的水平，指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病。
17. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的USP9X的水平；
将受试者样品中的USP9X的水平与对照样品中USP9X的水平相比较，其中受试者样品中的USP9X的水平低于对照样品中的USP9X的水平，指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病并发症。
18. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的USP9X的水平；
将受试者样品中的USP9X的水平与对照样品中USP9X的水平相比较，其中受试者样品中的USP9X的水平低于对照样品中的USP9X的水平，指示所述受试者将对所述治疗有反应。
19. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的方法，所述方法包括
在给予受试者所述治疗的至少一部分之前和之后，测定在受试者样品中的USP9X的水平；和
将在给予所述治疗之前来自受试者样品中的USP9X的水平与在给予所述治疗的至少一部分之后来自受试者样品中的USP9X的水平相比较，其中与在给予所述治疗之前的样品中的USP9X的水平相比，在给予所述治疗的至少一部分之后的样品中的USP9X的水平增加表明所述受试者对所述治疗有反应，从而监测所述治疗的功效。
20. 权利要求15-19中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的表1-3中所列的一种或多种另外的标志物的水平。
21. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的SEPT3的水平；
将受试者样品中的SEPT3的水平与对照样品中的SEPT3的水平相比较，其中受试者样品中的SEPT3的水平低于对照样品中的SEPT3的水平，指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
22. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的SEPT3的水平；
将受试者样品中的SEPT3的水平与对照样品中的SEPT3的水平相比较，其中受试者样品中的SEPT3的水平低于对照样品中的SEPT3的水平，指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病。
23. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的SEPT3的水平；
将受试者样品中的SEPT3的水平与对照样品中的SEPT3的水平相比较，其中受试者样品中的SEPT3的水平低于对照样品中的SEPT3的水平，指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病并发症。
24. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的SEPT3的水平；
将受试者样品中的SEPT3的水平与对照样品中的SEPT3的水平相比较，其中受试者样品中的SEPT3的水平低于对照样品中的SEPT3的水平，指示所述受试者将对所述治疗有反应。
25. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的方法，所述方法包括
在给予受试者所述治疗的至少一部分之前和之后测定在受试者样品中的SEPT3的水平；和
将给予所述治疗之前来自受试者样品中的SEPT3的水平与在给予所述治疗的至少一部分之后来自受试者样品中的SEPT3的水平相比较，其中与给予所述治疗之前的样品中的SEPT3的水平相比，给予所述治疗的至少一部分之后的样品中的SEPT3的水平增加表明所述受试者对所述治疗有反应，从而监测所述治疗的功效。
26. 权利要求21-25中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的表1-3中所列的一种或多种另外的标志物的水平。
27. 权利要求15-19中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的SEPT3的水平。
28. 权利要求21-25中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的USP9X的水平。
29. 权利要求15-28中任一项的方法，进一步包括在受试者样品中测定选自DAG1、PTPRJ、CPM、SERPINB13、LDLR、MMP7、BTC、PPY和INS的一种或多种标志物的水平。
30. 权利要求15-28中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的DAG1的水平。
31. 权利要求15-28中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的PTPRJ的水平。
32. 权利要求15-28中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的CPM的水平。
33. 权利要求15-28中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的SERPINB13的水平。
34. 权利要求15-28中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的LDLR的水平。
35. 权利要求15-28中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的MMP7的水平。
36. 权利要求15-28中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的BTC的水平。
37. 权利要求15-28中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的PPY的水平。
38. 权利要求15-28中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的INS的水平。
39. 权利要求29的方法，其中所述一种或多种标志物是INS。
40. 权利要求15-28中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的DAG1的水平。
41. 权利要求15-28和40中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的PTPRJ的水平。
42. 权利要求15-28、40和41中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的CPM的水平。
43. 权利要求15-28和40-42中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的SERPINB13的水平。
44. 权利要求15-28和40-43中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的LDLR的水平。
45. 权利要求15-28和40-44中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的MMP7的水平。
46. 权利要求15-28和40-45中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的BTC的水平。
47. 权利要求15-28和40-46中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的PPY的水平。
48. 权利要求15-28和40-47中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的INS的水平。
49. 前述权利要求中任一项的方法，进一步包括在受试者样品中测定选自CSTF3、NELL1、SLIT3、LAMTOR2、MGAT4B、TMPRSS11F、ATAD3B、PTPRN、WNT9B、FUT6、B4GALT1、FAM20C、CNTN1、MGAT1、STX1A、NMU、CD59、CASR和CPE的一种或多种标志物的水平。
50. 权利要求15-49中任一项的方法，其中标志物的水平是标志物的表达水平和/或活性。
51. 权利要求15-49中任一项的方法，其中受试者具有发展2型糖尿病的风险。
52. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的INS和SERPINB13的水平；
将受试者样品中的INS和SERPINB13的水平与对照样品中的INS和SERPINB13的水平相比较，其中与对照样品中的INS和SERPINB13的水平相比，受试者样品中的INS水平更高和SERPINB13水平更低指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
53. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的INS和SERPINB13的水平；
将受试者样品中的INS和SERPINB13的水平与对照样品中的INS和SERPINB13的水平相比较，其中与对照样品中的INS和SERPINB13的水平相比，受试者样品中的INS水平更高和SERPINB13水平更低指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病。
54. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的INS和SERPINB13的水平；
将受试者样品中的INS和SERPINB13的水平与对照样品中的INS和SERPINB13的水平相比较，其中与对照样品中的INS和SERPINB13的水平相比，受试者样品中的INS水平更高和SERPINB13水平更低指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病并发症。
55. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的INS和SERPINB13的水平；
将受试者样品中的INS和SERPINB13的水平与对照样品中的INS和SERPINB13的水平相比较，其中与对照样品中的INS和SERPINB13的水平相比，受试者样品中的INS水平更高和SERPINB13水平更低指示所述受试者将对所述治疗有反应。
56. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的方法，所述方法包括
在给予受试者所述治疗的至少一部分之前和之后，测定在受试者样品中的INS和SERPINB13的水平；和
将给予所述治疗之前来自受试者的样品中的INS和SERPINB13的水平与给予所述治疗的至少一部分之后来自受试者的样品中的INS和SERPINB13的水平相比较，其中与给予所述治疗之前样品中的INS和SERPINB13的水平相比，给予所述治疗的至少一部分之后样品中的INS水平更低和SERPINB13水平更高表明所述受试者对所述治疗有反应，从而监测所述治疗的功效。
57. 权利要求52-56中任一项的方法，进一步包括在受试者样品中测定选自USP9X、DAG1、SEPT3、PTPRJ、CPM、LDLR、MMP7、BTC和PPY的一种或多种标志物的水平。
58. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的PPY和DAG1的水平；
将受试者样品中的PPY和DAG1的水平与对照样品中的PPY和DAG1的水平相比较，其中与对照样品中的PPY和DAG1的水平相比，受试者样品中的PPY水平更高和DAG1水平更高指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
59. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的PPY和DAG1的水平；
将受试者样品中的PPY和DAG1的水平与对照样品中的PPY和DAG1的水平相比较，其中与对照样品中的PPY和DAG1的水平相比，受试者样品中的PPY水平更高和DAG1水平更高指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病。
60. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的PPY和DAG1的水平；
将受试者样品中的PPY和DAG1的水平与对照样品中的PPY和DAG1的水平相比较，其中与对照样品中的PPY和DAG1的水平相比，受试者样品中的PPY水平更高和DAG1水平更高指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病并发症。
61. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的PPY和DAG1的水平；
将受试者样品中的PPY和DAG1的水平与对照样品中的PPY和DAG1的水平相比较，其中与对照样品中的PPY和DAG1的水平相比，受试者样品中的PPY水平更高和DAG1水平更高指示所述受试者将对所述治疗有反应。
62. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的方法，所述方法包括
在给予受试者所述治疗的至少一部分之前和之后测定在受试者样品中的PPY和DAG1的水平；和
将在给予所述治疗之前来自受试者的样品中的PPY和DAG1的水平与在给予所述治疗的至少一部分之后来自受试者的样品中的PPY和DAG1的水平相比较，其中与给予所述治疗之前样品中的PPY和DAG1的水平相比，给予所述治疗的至少一部分之后样品中的PPY水平更低和DAG1水平更低表明所述受试者对所述治疗有反应，从而监测所述治疗的功效。
63. 权利要求58-62中任一项的方法，进一步包括在受试者样品中测定选自USP9X、SEPT3、PTPRJ、CPM、SERPINB13、LDLR、MMP7、BTC和INS的一种或多种标志物的水平。
64. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的INS、CPM和MMP7的水平；
将受试者样品中的INS、CPM和MMP7的水平与对照样品中的INS、CPM和MMP7的水平相比较，其中与对照样品中的INS、CPM和MMP7的水平相比，受试者样品中的INS水平更高、CPM水平更高和MMP7水平更高指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
65. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的INS、CPM和MMP7的水平；
将受试者样品中的INS、CPM和MMP7的水平与对照样品中的INS、CPM和MMP7的水平相比较，其中与对照样品中的INS、CPM和MMP7的水平相比，受试者样品中的INS水平更高、CPM水平更高和MMP7水平更高指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病。
66. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的INS、CPM和MMP7的水平；
将受试者样品中的INS、CPM和MMP7的水平与对照样品中的INS、CPM和MMP7的水平相比较，其中与对照样品中的INS、CPM和MMP7的水平相比，受试者样品中的INS水平更高、CPM水平更高和MMP7水平更高指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病并发症。
67. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的INS、CPM和MMP7的水平；
将受试者样品中的INS、CPM和MMP7的水平与对照样品中的INS、CPM和MMP7的水平相比较，其中与对照样品中的INS、CPM和MMP7的水平相比，受试者样品中的INS水平更高、CPM水平更高和MMP7水平更高指示所述受试者将对所述治疗有反应。
68. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的方法，所述方法包括
在给予受试者所述治疗的至少一部分之前和之后测定在受试者样品中的INS、CPM和MMP7的水平；和
将给予所述治疗之前来自受试者的样品中的INS、CPM和MMP7的水平与给予所述治疗的至少一部分之后来自受试者的样品中的INS、CPM和MMP7的水平相比较，其中与给予所述治疗之前样品中的INS、CPM和MMP7的水平相比，给予所述治疗的至少一部分之后样品中的INS、CPM和MMP7的水平更低表明所述受试者对所述治疗有反应，从而监测所述治疗的功效。
69. 权利要求64-68中任一项的方法，进一步包括在受试者样品中测定选自USP9X、DAG1、SEPT3、PTPRJ、SERPINB13、LDLR、BTC和PPY的一种或多种标志物的水平。
70. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的BTC、MMP7和PPY的水平；
将受试者样品中的BTC、MMP7和PPY的水平与对照样品中的BTC、MMP7和PPY的水平相比较，其中与对照样品中的BTC、MMP7和PPY的水平相比，受试者样品中的BTC水平更高、MMP7水平更高和PPY水平更高指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
71. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的BTC、MMP7和PPY的水平；
将受试者样品中的BTC、MMP7和PPY的水平与对照样品中的BTC、MMP7和PPY的水平相比较，其中与对照样品中的BTC、MMP7和PPY的水平相比，受试者样品中的BTC水平更高、MMP7水平更高和PPY水平更高指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病。
72. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的BTC、MMP7和PPY的水平；
将受试者样品中的BTC、MMP7和PPY的水平与对照样品中的BTC、MMP7和PPY的水平相比较，其中与对照样品中的BTC、MMP7和PPY的水平相比，受试者样品中的BTC水平更高、MMP7水平更高和PPY水平更高指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病并发症。
73. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的BTC、MMP7和PPY的水平；
将受试者样品中的BTC、MMP7和PPY的水平与对照样品中的BTC、MMP7和PPY的水平相比较，其中与对照样品中的BTC、MMP7和PPY的水平相比，受试者样品中的BTC水平更高、MMP7水平更高和PPY水平更高指示所述受试者将对所述治疗有反应。
74. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的方法，所述方法包括
在给予受试者所述治疗的至少一部分之前和之后，测定在受试者样品中的BTC、MMP7和PPY的水平；和
将给予所述治疗之前来自受试者的样品中的BTC、MMP7和PPY的水平与给予所述治疗的至少一部分之后来自受试者的样品中的BTC、MMP7和PPY的水平相比较，其中与给予所述治疗之前样品中的BTC、MMP7和PPY的水平相比，给予所述治疗的至少一部分之后样品中的BTC、MMP7和PPY的水平更低表明所述受试者对所述治疗有反应，从而监测所述治疗的功效。
75. 权利要求70-74中任一项的方法，进一步包括在受试者的样品中测定选自USP9X、DAG1、SEPT3、PTPRJ、CPM、SERPINB13、LDLR和INS的一种或多种标志物的水平。
76. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平；
将受试者样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平与对照样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平相比较，其中与对照样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平相比，受试者样品中的PPY水平更高、SEPT3水平更低和PTPRJ水平更高指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
77. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平；
将受试者样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平与对照样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平相比较，其中与对照样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平相比，受试者样品中的PPY水平更高、SEPT3水平更低和PTPRJ水平更高指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病。
78. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平；
将受试者样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平与对照样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平相比较，其中与对照样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平相比，受试者样品中的PPY水平更高、SEPT3水平更低和PTPRJ水平更高指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病并发症。
79. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平；
将受试者样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平与对照样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平相比较，其中与对照样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平相比，受试者样品中的PPY水平更高、SEPT3水平更低和PTPRJ水平更高指示所述受试者将对所述治疗有反应。
80. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的方法，所述方法包括
在给予受试者所述治疗的至少一部分之前和之后测定在受试者样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平；和
将给予所述治疗之前来自受试者的样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平与给予所述治疗的至少一部分之后来自受试者的样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平相比较，其中与给予所述治疗之前样品中的PPY、SEPT3和PTPRJ的水平相比，给予所述治疗的至少一部分之后样品中的PPY水平更低、SEPT3水平更高和PTPRJ水平更低表明所述受试者对所述治疗有反应，从而监测所述治疗的功效。
81. 权利要求76-80中任一项的方法，进一步包括在受试者样品中测定选自USP9X、DAG1、CPM、SERPINB13、LDLR、MMP7、BTC和INS的一种或多种标志物的水平。
82. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平；
将受试者样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平与对照样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平相比较，其中与对照样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平相比，受试者样品中的CPM水平更高、INS水平更高、MMP7水平更高和LDLR水平更低指示所述受试者具有或将发展葡萄糖耐量受损。
83. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平；
将受试者样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平与对照样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平相比较，其中与对照样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平相比，受试者样品中的CPM水平更高、INS水平更高、MMP7水平更高和LDLR水平更低指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病。
84. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平；
将受试者样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平与对照样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平相比较，其中与对照样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平相比，受试者样品中的CPM水平更高、INS水平更高、MMP7水平更高和LDLR水平更低指示所述受试者具有或将发展2型糖尿病并发症。
85. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的方法，所述方法包括
测定在受试者样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平；
将受试者样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平与对照样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平相比较，其中与对照样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平相比，受试者样品中的CPM水平更高、INS水平更高、MMP7水平更高和LDLR水平更低指示所述受试者将对所述治疗有反应。
86. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的方法，所述方法包括
在给予受试者所述治疗的至少一部分之前和之后测定在受试者样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平；和
将给予所述治疗之前来自受试者的样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平与给予所述治疗的至少一部分之后来自受试者的样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平相比较，其中与给予所述治疗之前样品中的CPM、INS、MMP7和LDLR的水平相比，给予所述治疗的至少一部分之后样品中的CPM水平更低、INS水平更低、MMP7水平更低和LDLR水平更高表明所述受试者对所述治疗有反应，从而监测所述治疗的功效。
87. 权利要求82-86中任一项的方法，进一步包括在受试者样品中测定选自USP9X、DAG1、SEPT3、PTPRJ、SERPINB13、BTC和PPY的一种或多种标志物的水平。
88. 权利要求52-87中任一项的方法，进一步包括在受试者样品中测定选自CSTF3、NELL1、SLIT3、LAMTOR2、MGAT4B、TMPRSS11F、ATAD3B、PTPRN、WNT9B、FUT6、B4GALT1、FAM20C、CNTN1、MGAT1、STX1A、NMU、CD59、CASR和CPE的一种或多种标志物的水平。
89. 权利要求52-88中任一项的方法，进一步包括在受试者样品中测定表1-3中所列的一种或多种另外的标志物的水平。
90. 权利要求52-89中任一项的方法，其中受试者样品中的所述水平通过质谱法测定。
91. 权利要求90的方法，其中所述质谱法是基质辅助的激光解吸/飞行时间(MALDI/TOF)质谱法、液相色谱四重离子捕获电喷射(LCQ-MS)或表面增强激光解吸电离/飞行时间(SELDI/TOF)质谱法。
92. 权利要求52-89中任一项的方法，其中受试者样品中的所述水平通过免疫测定法测定。
93. 权利要求52-92中任一项的方法，其中受试者样品是流体样品。
94. 权利要求52-92中任一项的方法，其中受试者样品是组织样品。
95. 权利要求52-94中任一项的方法，其中标志物的水平是标志物的表达水平和/或活性。
96. 权利要求52-89中任一项的方法，其中所述受试者具有发展2型糖尿病的风险。
97. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒使用说明书。
98. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒使用说明书。
99. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。
100. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物的水平的试剂和确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
101. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定表1-3的任一个中所列的一种或多种标志物的水平的试剂和监测所述治疗的功效的试剂盒使用说明书。
102. 权利要求97-101中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者的样品中测定表1-3的任一个中所列的任何一种或多种标志物的水平的试剂。
103. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定USP9X的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒使用说明书。
104. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定USP9X的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒使用说明书。
105. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定USP9X的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。
106. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定USP9X的水平的试剂和确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
107. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定USP9X的水平的试剂和监测所述治疗的功效的试剂盒使用说明书。
108. 权利要求103-107中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定表1-3的任一个中所列的任何一种或多种另外的标志物的水平的试剂。
109. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定SEPT3的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒使用说明书。
110. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定SEPT3的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒使用说明书。
111. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定SEPT3的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。
112. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定SEPT3的水平的试剂和确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
113. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定SEPT3的水平的试剂和监测所述治疗的功效的试剂盒使用说明书。
114. 权利要求109-113中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定表1-3的任一个中所列的任何一种或多种标志物的水平的试剂。
115. 权利要求103-107中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定SEPT3的水平的试剂。
116. 权利要求109-113中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定USP9X的水平的试剂。
117. 权利要求103-116中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者的样品中测定选自DAG1、PTPRJ、CPM、SERPINB13、LDLR、MMP7、BTC、PPY和INS的一种或多种标志物的水平的试剂。
118. 权利要求117的试剂盒，其中所述一种或多种标志物是INS。
119. 权利要求103-116中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定DAG1的水平的试剂。
120. 权利要求103-116和119中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定PTPRJ的水平的试剂。
121. 权利要求103-116、119和120中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定CPM的水平的试剂。
122. 权利要求103-116和119-121中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定SERPINB13的水平的试剂。
123. 权利要求103-116和119-122中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定LDLR的水平的试剂。
124. 权利要求103-116和119-123中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定MMP7的水平的试剂。
125. 权利要求103-116和119-124中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定BTC的水平的试剂。
126. 权利要求103-116和119-125中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定PPY的水平的试剂。
127. 权利要求103-116和119-126中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定INS的水平的试剂。
128. 前述权利要求中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定选自CSTF3、NELL1、SLIT3、LAMTOR2、MGAT4B、TMPRSS11F、ATAD3B、PTPRN、WNT9B、FUT6、B4GALT1、FAM20C、CNTN1、MGAT1、STX1A、NMU、CD59、CASR和CPE的一种或多种标志物的水平的试剂。
129. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定INS的水平和SERPINB13的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒使用说明书。
130. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定INS的水平和SERPINB13的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒使用说明书。
131. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定INS的水平和SERPINB13的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。
132. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定INS的水平和SERPINB13的水平的试剂和确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
133. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定INS的水平和SERPINB13的水平的试剂和监测所述治疗的功效的试剂盒使用说明书。
134. 权利要求129-133中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定选自USP9X、DAG1、SEPT3、PTPRJ、CPM、LDLR、MMP7、BTC和PPY的一种或多种标志物的水平的试剂。
135. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定PPY的水平和DAG1的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒使用说明书。
136. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定PPY的水平和DAG1的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒使用说明书。
137. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定PPY的水平和DAG1的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。
138. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定PPY的水平和DAG1的水平的试剂和确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
139. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定PPY的水平和DAG1的水平的试剂和监测所述治疗的功效的试剂盒使用说明书。
140. 权利要求135-139中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定选自USP9X、SEPT3、PTPRJ、CPM、SERPINB13、LDLR、MMP7、BTC和INS的一种或多种标志物的水平的试剂。
141. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定INS的水平、CPM的水平和MMP7的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒使用说明书。
142. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定INS的水平、CPM的水平和MMP7的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒使用说明书。
143. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定INS的水平、CPM的水平和MMP7的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。
144. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定INS的水平、CPM的水平和MMP7的水平的试剂和确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
145. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定INS的水平、CPM的水平和MMP7的水平的试剂和监测所述治疗的功效的试剂盒使用说明书。
146. 权利要求141-145中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定选自USP9X、DAG1、SEPT3、PTPRJ、SERPINB13、LDLR、BTC和PPY的一种或多种标志物的水平的试剂。
147. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定BTC的水平、MMP7的水平和PPY的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒使用说明书。
148. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定BTC的水平、MMP7的水平和PPY的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒使用说明书。
149. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定BTC的水平、MMP7的水平和PPY的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。
150. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定BTC的水平、MMP7的水平和PPY的水平的试剂和确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
151. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定BTC的水平、MMP7的水平和PPY的水平的试剂和监测所述治疗的功效的试剂盒使用说明书。
152. 权利要求147-151中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定选自USP9X、DAG1、SEPT3、PTPRJ、CPM、SERPINB13、LDLR和INS的一种或多种标志物的水平的试剂。
153. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定PPY的水平、SEPT3的水平和PTPRJ的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒使用说明书。
154. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定PPY的水平、SEPT3的水平和PTPRJ的水平的试剂和确定受试者是否将发展2型糖尿病的试剂盒使用说明书。
155. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定PPY的水平、SEPT3的水平和PTPRJ的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。
156. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定PPY的水平、SEPT3的水平和PTPRJ的水平的试剂和确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
157. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定PPY的水平、SEPT3的水平和PTPRJ的水平的试剂和监测所述治疗的功效的试剂盒使用说明书。
158. 权利要求153-157中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定选自USP9X、DAG1、CPM、SERPINB13、LDLR、MMP7、BTC和INS的一种或多种标志物的水平的试剂。
159. 用于确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定CPM的水平、INS的水平、MMP7的水平和LDLR的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展葡萄糖耐量受损的试剂盒使用说明书。
160. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定CPM的水平、INS的水平、MMP7的水平和LDLR的水平的试剂和确定受试者是否将发展2型糖尿病的试剂盒使用说明书。
161. 用于确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定CPM的水平、INS的水平、MMP7的水平和LDLR的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展2型糖尿病并发症的试剂盒使用说明书。
162. 用于确定具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者是否将对治疗有反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定CPM的水平、INS的水平、MMP7的水平和LDLR的水平的试剂和确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
163. 在具有葡萄糖耐量受损和/或2型糖尿病的受试者中监测治疗的功效的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定CPM的水平、INS的水平、MMP7的水平和LDLR的水平的试剂和监测所述治疗的功效的试剂盒使用说明书。
164. 权利要求159-163中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定选自USP9X、DAG1、CPM、SERPINB13、LDLR、MMP7、BTC和INS的一种或多种标志物的水平的试剂。
165. 权利要求129-164中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定选自CSTF3、NELL1、SLIT3、LAMTOR2、MGAT4B、TMPRSS11F、ATAD3B、PTPRN、WNT9B、FUT6、B4GALT1、FAM20C、CNTN1、MGAT1、STX1A、NMU、CD59、CASR和CPE的一种或多种标志物的水平的试剂。
166. 权利要求129-165中任一项的试剂盒，进一步包括用于在受试者样品中测定表1-3的任一个中所列的任何一种或多种标志物的水平的试剂。
167. 权利要求97-166中任一项的试剂盒，进一步包括用于从受试者获得生物样品的试剂。
168. 权利要求97-167中任一项的试剂盒，进一步包括对照样品。
169. 用于鉴定2型糖尿病标志物的方法，所述方法包括
在稳定状态条件下，鉴定来自两个或更多个物种的两种或更多种器官的分泌泡中的蛋白质；
鉴定胰脏β细胞的分泌泡中的蛋白质，从而产生稳定状态标志物的临时列表；
从来自两个或更多个物种的两种或更多种器官中鉴定稳定状态标志物的临时列表中的标志物，其为胰脏β细胞的分泌泡中的共有标志物，和从稳定状态标志物的临时列表中除去那些标志物，从而产生β细胞质量标志物的列表；
在功能障碍条件下鉴定胰脏β细胞的分泌泡中的蛋白质，
在正常条件下鉴定胰脏β细胞的分泌泡中的蛋白质，
鉴定在功能障碍条件下和在正常条件下差异表达的蛋白质，从而产生β细胞功能标志物的临时列表，
测定试验样品和对照样品的样品中的β细胞质量标志物和/或β细胞功能标志物的水平，其中与试验样品中的水平相比，对照样品中标志物的水平的差异鉴定所述标志物为2型糖尿病生物标志物。
170. 权利要求169的方法，其中试验样品来自具有葡萄糖耐量受损的受试者。
171. 权利要求169的方法，其中试验样品来自新诊断为2型糖尿病的受试者。
172. 权利要求169的方法，其中试验样品来自已确定为2型糖尿病的受试者。
173. 权利要求169的方法，其中对照样品来自具有正常葡萄糖耐量的受试者。
174. 权利要求169的方法，其中对照样品来自具有葡萄糖耐量受损的受试者。
175. 权利要求169的方法，其中对照样品来自新诊断为2型糖尿病的受试者。
176. 用于鉴定2型糖尿病标志物的方法，所述方法包括
鉴定在来自治疗之前和之后的受试者的样品中差异表达的蛋白质，从而产生治疗功效标志物的列表；
在提供至少一部分疗法给受试者之前，测定获自具有2型糖尿病的受试者的第一样品中的一种或多种标志物的水平；和
在提供至少一部分所述疗法之后，测定获自所述受试者的第二样品中的蛋白质的水平，其中相对于第一样品，第二样品中的一种或多种标志物的表达水平的差异鉴定所述蛋白质为2型糖尿病标志物。
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