CN101808649B - 控制肌球蛋白表达和肌纤维身份的微小rna - Google Patents

控制肌球蛋白表达和肌纤维身份的微小rna Download PDF

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Abstract

本发明涉及遏制快速骨骼肌收缩蛋白质基因的两种微小RNA，即miR-499和miR-208b，的鉴定。miR-499和/或miR-208b的表达可用于在肌肉骨骼病症的治疗中遏制快速纤维基因和激活慢速纤维基因。提议对miR-499和/或miR-208b的抑制作为对心脏肥大、心肌梗死、和/或心力衰竭的治疗。还公开了包含miR-499和miR-208b功能的拮抗剂和激动剂的药物组合物。

Description

控制肌球蛋白表达和肌纤维身份的微小RNA
对相关申请的交叉引用
本申请要求2007年7月31日提交的美国临时申请No.60/952,911；2007年10月15日提交的美国临时申请No.60/980,113；和2007年10月16日提交的美国临时申请No.60/980,314的权益，通过述及将它们都完整收入本文。
关于政府资助的声明
本发明是在来自(美国)国家卫生研究院(NIH)的拨款No.HL53351-06的资助下做出的。政府拥有本发明的某些权利。
关于电子提交的文本文件的说明
通过述及将随此电子提交的文本文件的内容完整收入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：UTFD：1992WO.txt，记录日：2008年7月30日，文件大小9千字节)。
发明领域
一般而言，本发明涉及发育生物学和分子生物学领域。更具体的说，它关注心肌细胞和骨骼肌细胞中的基因调控和细胞生理。具体而言，本发明涉及对导致β-肌球蛋白重链(β-MHC)表达降低的MEF2依赖性miRNA以及与β-MHC共表达的第二miRNA的抑制。对这些miRNA的抑制提供了对心脏肥大和心力衰竭的治疗。还涵盖对这两种miRNA的上调，用于治疗希望快速向慢速肌肉纤维转换的肌肉骨骼疾病。
发明背景
心脏病及其表现，包括冠心病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心脏肥大，清楚代表了美国当今的一项重大健康风险。诊断、治疗和支持罹患这些疾病的患者的花费完全达到数十亿美元。心脏病的两项特别严重的表现是心肌梗死和心脏肥大。就心肌梗死而言，典型的是，由于动脉粥样硬化，在冠状动脉中发生急性血小板性冠状动脉闭塞，并引起心肌细胞死亡。因为心肌细胞，即心脏肌肉细胞，是终末分化的且一般没有能力进行细胞分裂，所以当它们在急性心肌梗死过程期间死亡时它们一般被瘢痕组织代替。瘢痕组织没有收缩性，无助于心脏功能，而且常常通过在心脏收缩期间扩张或通过增加心室的大小和有效半径(例如变成肥大)而在心脏功能中发挥有害作用。
就心脏肥大而言，一种理论将其视为类似异常发育的疾病，并因此提出心脏中的发育信号是否能促成肥大性疾病的问题。心脏肥大是心脏对实际上所有形式心脏病(包括那些源自高血压、机械负荷、心肌梗死、心脏心率失常、内分泌病症、和心脏收缩蛋白质基因中遗传突变的)的适应性应答。虽然肥大性应答最初是提高心输出量的代偿机制，但是持久的肥大能导致扩张性心肌病(DCM)、心力衰竭、和猝死。在美国，每年有大约50万人诊断出心力衰竭，死亡率大约50％。心脏肥大的前因后果已经被广泛证明，但是根本的分子机制尚未阐明。了解这些机制是心脏病的预防和治疗中的一项重大关注点，而且作为设计特异性靶向心脏肥大和心脏心力衰竭的新药物中的治疗形态会是至关重要的。
用药理学药剂进行的治疗代表了用于减轻或消除心力衰竭表现的主要机制。利尿药构成了轻度至中度心力衰竭的一线治疗。如果利尿药无效，那么可使用血管扩张药，诸如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如enalopril和lisinopril)或肌力药疗法(即通过提高心肌肌肉收缩力量来提高心输出量的药物)。不幸的是，这些标准疗法中的许多具有众多副作用，而且在有些患者中是禁忌的。如此，当前使用的药理学药剂在特定患者群中具有严重缺陷。新的、安全的且有效的药剂的可得性无疑会惠及不能使用目前可得的药理学形态的患者或没有自那些形态获得足够缓解的患者。
成人心脏中MHCα同等型对β同等型的比率是心脏收缩性的一项重要决定子。β-MHC，即成人心脏中的主要肌球蛋白同等型，展示出相对较低的ATP酶活性，而α-MHC具有高ATP酶活性。在响应各种病理性刺激(诸如心肌梗死、高血压、和其它病症)时，β-MHC表达升高，而α-MHC表达降低，后果是肌纤维ATP酶活性降低和心脏肌纤维缩短速度降低，导致最终的收缩功能障碍。值得注意的是，心脏中α-MHC含量的微小变化会对心脏性能具有深刻影响。
众多信号传导途径，尤其是那些牵涉异常钙信号传导的，推动心脏肥大和病理性重塑(Heineke & Molkentin，2006)。响应压力而发生的肥大性生长涉及与响应锻炼而发生的生理性肥大不同的信号传导途径和基因表达样式。压力介导的心肌肥大是与众多不良后果有关的复杂现象，其中独特的分子和组织学特征引起心脏发生纤维组织形成、扩张和代偿失调，这经由肌细胞变性和死亡而常常以心力衰竭达到极点。因此，对解释根本的分子机制和为遏制不良心脏生长发现新的治疗靶物很感兴趣。
根据专门化的收缩和代谢特性，成人骨骼肌纤维可分成快速和慢速颤动亚型。这些特性反映了肌红蛋白，以及肌球蛋白重和轻链、原肌球蛋白、和肌钙蛋白的快速和慢速收缩蛋白质同等型的特定子集的表达(Naya et ah，2000)。慢速颤动肌肉主要用于长期活动，诸如保持姿势和持久的运动活性。快速颤动纤维主要用于大力爆发活动。成人骨骼肌表型不是静态的，而是保留根据载荷携带和收缩使用样式的变异来调节的能力，导致形态、表型、和收缩特性的适应。例如，太空飞行的微重力环境中身体负荷的消除导致显著程度的肌肉萎缩和改变的蛋白质表型，其与啮齿类和人类二者收缩和代谢特性的慢速向快速的变化有关(Tsika等，2002；Baldwin和Haddad，2001；Edgerton和Roy，(2000)；Fitts等，2000)。
失用性萎缩(disuse atrophy)，即源自肌肉缺少使用的肌肉萎缩，典型地见于卧床不起的人、四肢铸塑的人、或因其它原因而不能活动的人。对肌纤维电活性的破坏(包括去神经)也导致肌肉萎缩。短时间不用后，肌肉萎缩是可逆的。然而，肌肉的极度废用可导致骨骼肌纤维的永久丧失和结缔组织对那些纤维的取代。涵盖通过遏制骨骼肌中的快速纤维基因，并由此激活相反的慢速纤维基因的表达，可减轻或预防肌肉萎缩的症状。在胰岛素抗性(在II糖尿病患者中看到的胰岛素刺激的葡萄糖摄取的缺陷)与慢速对快速颤动肌肉纤维的百分比之间也存在正关联。
最近提出微小RNA涉及多种生物学过程，包括对发育时机、凋亡、脂肪代谢、和造血细胞分化等的调节。微小RNA(miR)指自常常编码多种密切相关miRNA的多顺反子转录物、蛋白质编码基因的内含子、或各miRNA基因衍生的，长度为约18个至约25个核苷酸的小型、非蛋白质编码RNA。参见综述Carrington等(2003)。miR起靶物mRNA的阻抑物的作用，这通过促进它们的降解(当它们的序列优选互补时)或通过抑制翻译(当它们的序列含有错配时)来实现。
miRNA由RNA聚合酶II(pol II)或RNA聚合酶III(pol III；参见Qi等(2006)Cellular & Molecular Immunology Vol.3：411-419)转录，而且源自称作初级miRNA转录物(pri-miRNA)的初始转录物，它们一般长数千碱基。pri-miRNA在细胞核中被RNA酶Drosha加工成约70个至约100个核苷酸的发夹形前体(pre-miRNA)。转运至细胞质后，发夹pre-miRNA被Dicer进一步加工以生成双链miRNA。然后将成熟miRNA链掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，在那里它通过碱基对互补性与它的靶mRNA联合。在相对罕见的、miRNA与mRNA靶物完美碱基配对的情况中，它促进mRNA降解。更常见的是，miRNA与靶mRNA形成不完美的异源双链体，从而影响mRNA稳定性或抑制mRNA翻译。
跨越碱基2-8的miRNA的5′部分(称作“种子”区)对于靶物识别是尤其重要的(Krenz和Robbins，2004；Kiriazis和Kranias，2000)。种子的序列与靶序列的系统发生保守性一起构成许多当前靶物预测模型的基础。虽然可获得日益增多的用于预测miRNA及其靶物的深奥计算办法，但是靶物预测仍然是一项重大挑战，而且需要实验验证。将miRNA的功能归于对特定mRNA靶物的调节因各miRNA与数以百计的潜在的高和低亲和力mRNA靶物碱基配对的能力及使多种miRNA靶向单独mRNA而变得更加复杂。增强的对miRNA功能的了解无疑会揭示促成正常发育、分化、细胞间和细胞内通讯、细胞周期、血管发生、凋亡、和许多其它细胞过程的调节网络。最近，发明人报告了一种心脏特异性微小RNA，miR-208，它是由α-肌球蛋白重链(MHC)基因的内含子编码的，而且是响应心脏压力而上调β-MHC表达和遏制心脏中的快速骨骼肌基因所需要的(参见共同悬而未决的申请WO2008/016924，通过述及将其完整收入本文)。本发明详述了微小RNA在心脏和骨骼肌中的参与。
发明概述
发明人发现了微小RNA作为心脏生长、功能和压力应答性的调节物的关键作用，揭示了心脏病的未曾发现的调节机制和潜在治疗靶。因而，本发明提供了一种在有所需要的受试者中治疗病理性心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的方法。在一个实施方案中，所述方法包括鉴定具有心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的受试者；并抑制所述受试者的心脏细胞中的miR-499和/或miR-208b的表达或活性。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括给所述受试者施用第二疗法。所述第二疗法可以是例如β-阻滞剂、肌力药(ionotrope)、利尿药、ACE抑制剂、AII拮抗剂、BNP、Ca++-阻滞剂、和ERA、或HDAC抑制剂。
在本发明的一些实施方案中，抑制miR-499和/或miR-208b的表达或活性包括施用miR-499和/或miR-208b的微小RNA拮抗剂(antagomir)。在一个实施方案中，本发明提供了miR-499或miR-208b微小RNA拮抗剂。在另一个实施方案中，miR-499和/或miR-208b表达或活性是通过施用靶向成熟miR499和/或miR-208b序列的反义寡核苷酸而抑制的。在又一个实施方案中，miR-499和/或miR-208b表达或活性是通过施用抑制性RNA分子而抑制的，其中所述抑制性RNA分子包含与成熟miR-499和/或miR-208b序列具有同一性的序列。所述抑制性RNA分子可以是核酶、siRNA或shRNA分子。
本发明还提供了一种在有所需要的受试者中预防病理性肥大或心力衰竭的方法，包括鉴定有风险发生病理性心脏肥大或心力衰竭的受试者；并抑制所述受试者的心脏细胞中的miR-499或miR-208b的表达或活性。在一个实施方案中，抑制包括对所述心脏细胞递送miR-499或miR-208b的抑制剂。在另一个实施方案中，所述有风险的受试者可展现出一种或多种选自下组的风险因素：长期存在的不受控制的高血压、未矫正的瓣膜病、慢性心绞痛、近期的心肌梗死、对心脏病的先天性素因、和病理性肥大。
miR-499或miR-208b表达或活性的微小RNA拮抗剂、反义寡核苷酸、抑制性RNA分子、或其它调控物可以通过本领域技术人员知道的、适合于对所靶定的器官、组织、或细胞类型递送的任何方法来施用。例如，在本发明的某些实施方案中，所述miR-499或miR-208b调控物可以通过胃肠外施用(诸如静脉内注射、动脉内注射、心包内注射、或皮下注射)或通过直接注射入组织(例如心脏组织、骨骼肌组织)来施用。在一些实施方案中，所述miR-499或miR-208b调控物可以通过口服、经皮、腹膜内、皮下、持续释放、受控释放、延迟释放、栓剂、或舌下施用路径来施用。在其它实施方案中，所述miR-499或miR-208b调控物可以通过导管系统来施用。
本发明还涵盖一种在有所需要的受试者中治疗或预防肌肉骨骼病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括鉴定具有肌肉骨骼病症或有肌肉骨骼病症风险的受试者；并提高所述受试者的骨骼肌细胞中的miR-499和/或miR-208b的表达和/或活性。所述肌肉骨骼病症可以包括例如失用性萎缩、响应反重力而发生的肌肉萎缩(muscle wasting in response to anti-gravity)、和去神经。在一些实施方案中，提高miR-499和/或miR-208b的表达和/或活性包括给所述受试者施用包含成熟miR-499和/或成熟miR-208b序列的多核苷酸。在其它实施方案中，提高miR-499和/或miR-208b的表达和/或活性包括给所述受试者施用编码miR-499和/或miR-208b的表达载体。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括给所述受试者施用非miR-499或miR-208b疗法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种调节心脏或骨骼肌收缩性的方法，包括对心脏或骨骼肌细胞施用miR-499和/或miR-208b表达或活性的调控物。在另一个实施方案中，提供了一种调节心脏收缩蛋白质基因表达的方法，包括对心脏细胞施用miR-499和/或miR-208b表达或活性的调控物。在另一个实施方案中，提供了一种调节骨骼肌收缩蛋白质基因表达的方法，包括对骨骼肌细胞施用miR-499和/或miR-208b表达或活性的调控物。在还有一个实施方案中，本发明提供了一种诱导骨骼肌细胞的纤维类型转换的方法，包括对所述骨骼肌细胞施用miR-499和/或miR-208b表达或活性的调控物。所述调控物可以是miR-499和/或miR-208b表达或活性的激动剂或拮抗剂。在一些实施方案中，通过使细胞接触miR-499抑制剂来提高所述细胞中的THRAP1、PURβ、myostatin(也叫作GDF8)、Sox 6和快速收缩蛋白质的表达。在其它实施方案中，通过使细胞接触miR-499激动剂来降低所述细胞中的THRAP1、PURβ、myostatin、Sox 6和快速收缩蛋白质的表达。在另一个实施方案中，通过使细胞接触miR-208b抑制剂来提高所述细胞中的Sp3、myostatin、PURβ、THRAP1、和快速收缩蛋白质的表达。在还有一个实施方案中，通过使细胞接触miR-208b激动剂来降低所述细胞中的Sp3、Myostatin、PURβ、THRAP1、和快速收缩蛋白质的表达。可以依照本发明的方法升高或降低的快速骨骼肌收缩蛋白质基因的例子包括肌钙蛋白I2、肌钙蛋白T3、肌球蛋白轻链、或α骨骼肌动蛋白。
本发明还涵盖一种转基因的非人哺乳动物，其细胞未能表达功能性miR-499和/或miR-208b。在另一个实施方案中，本发明提供了一种转基因非人哺乳动物，其细胞包含在异源启动子控制下的miR-499和/或miR-208b编码区，所述异源启动子在所述非人哺乳动物的细胞中有活性。在一些实施方案中，所述哺乳动物是小鼠。
本发明提供了一种鉴定miR-499和/或miR-208b调控物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使细胞接触候选物质；评估miR-499和/或miR-208b活性或表达；并比较步骤(b)中的活性或表达与不存在所述候选物质时的活性或表达，其中测量得到的活性或表达间的差异指示所述候选物质是miR-499和/或miR-208b的调控物。可以在体外或在体内使所述细胞与所述候选物质接触。所述候选物质可以是蛋白质、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸、或小分子。所述miR-499和/或miR-208b调控物可以是miR-499和/或miR-208b的激动剂或拮抗剂。所述miR-499和/或miR-208b调控物可以是miR-499和/或miR-208b的上游调节物(诸如miR-208)的激动剂或拮抗剂。
本发明还提供了一种药物组合物，其包含miR-499和/或miR-208b的抑制剂。所述抑制剂可以是微小RNA拮抗剂、反义寡核苷酸、或抑制性RNA分子。在另一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含含有miR-499和/或miR-208b成熟序列的多核苷酸。所述多核苷酸可以包含在表达载体内。
附图简述
通过参考这些附图中的一幅或多幅并与本文所呈现的具体实施方案的详述组合，可以更好地理解本发明。
图1A-B。miR-208由α-MHC基因编码并在心脏中特异性表达。(图1A)miR-208在α-MHC基因的内含子内编码。星号指示序列保守性。(图1B)通过Northern分析对成年小鼠组织的miR-208转录物的检测。U6 mRNA充当加载对照。
图2A-B。对α-和β-MHC的调节。(图2A)甲状腺激素和TRE对类别转换的调节。(图2B)快速向慢速的肌肉纤维收缩性转换中的压力/甲状腺功能减退症的模型。
图3。人类心脏中miR-208的检测。通过对来自六名正常个体和六名具有特发性心肌病的个体的心脏组织的Northern印迹检测α-MHC和miR-208的转录物。在α-MHC与pre-miR-208的表达水平间存在密切相关性，而成熟miR-208表达在后者下调后得到维持。
图4A-B。miR-208突变小鼠的生成。(图4A)通过同源重组生成miR-208突变小鼠的策略。用侧翼为loxP位点的新霉素抗性盒替换pre-miRNA序列。通过将杂合小鼠与携带CAG-Cre转基因的转基因小鼠育种，清除小鼠种系中的新霉素盒。(图4B)通过对来自野生型和miR-208突变小鼠的心脏的Northern分析检测miR-208转录物。
图5。所示基因型的新生小鼠的心脏中α-MHC和β-MHC蛋白质水平的 Western分析。每种基因型分析两只小鼠。检测GAPDH作为加载对照。
图6。miR-208 -/- 小鼠显示出响应压力过载的心脏肥大减轻。野生型和miR-208-/-小鼠的心脏的组织学切片Masson三色染色。miR-208的缺失消除了在接受21天TAB的野生型小鼠中看到的肥大和纤维化。顶图中的标度条等于2mm，而底图中的等于20μm。
图7。miR-208 -/- 小鼠显示出响应钙依赖磷酸酶活化的心脏肥大减轻。表达钙依赖磷酸酶转基因的6周龄小鼠的心脏(CnA-Tg)和miR-208-/-；CnA-Tg的心脏的组织学切片Masson三色染色。miR-208的缺失消除在CnA-Tg小鼠中看到的肥大和纤维化。标度条＝2mm(顶图)或20μm(底图)。
图8。miR-208 -/- 未能响应胸主动脉绑扎(TAB)和钙依赖磷酸酶活化而上调 β-MHC。
图9。成年野生型和miR-208转基因动物中α和β-MHC蛋白质水平的 Western分析。检测GAPDH作为加载对照。
图10。miR-208 -/- 小鼠未能响应用丙基硫尿嘧啶(PTU)处理的甲状腺功能 减退而上调β-MHC。
图11。miR-208在控制β-MHC表达中的作用的示意图。
图12。miR-208在经Thrap1调节β-MHC和快速骨骼肌基因表达中的作用 的示意图。
图13。微小RNA在心脏肥大期间的作用机制。
图14。显示野生型、miR-208 +/- 和miR-208 -/- 小鼠的心脏中miR-499表达的 Northern印迹。在野生型和突变小鼠中在miR-208和miR-499、以及Myh7b的表达之间有直接关联。
图15。Myh7b基因座的结构及其中miR-499编码区的位置。
图16A-D。miR-208调节心脏myh7b表达。(图16A)Myh7b(像miR-499一样)在心脏和慢速骨骼肌(比目鱼肌)中特异性表达。(图16B)心脏和4种骨骼肌类型(腓肠肌/跖肌(GP)、胫骨前肌(TA)趾长伸肌(EDL)、或比目鱼肌)的miR-499实时PCR分析证实了miR-499主要在心脏和比目鱼肌中表达。在TA和EDL中只能检测到略微的miR-499表达水平。(图16C)原位杂交指示在胚胎发生期间，myh7b在心脏和体节中特异性表达。(图16D)野生型和miR-208突变动物二者的Northern印迹分析显示了在miR-208缺失的情况中，miR-499表达在心脏中特异性缺失，但它在比目鱼肌中仍然表达(下面的印迹)。
图17。显示具有心脏病的野生型小鼠中miR-499表达的Northern印迹。MI，心肌梗死。CnA Tg，钙依赖磷酸酶转基因小鼠。
图18。心脏肌肉中miR-208对miR-499的调节的示意图。
图19。心肌和骨骼肌二者中miR-208对miR-499的调节的示意图。
图20。miR-499通过靶向THRAP1、PURβ和GDF8(也叫作myostatm)来调 节肌球蛋白转换和纤维类型身份。
图21A-C。对α-MHC表达的抑制导致miR-208水平降低。(图4A-B)α-和β-MHC转录物在PTU暴露0、3、6、9、12、15、18和21天时的相对表达水平。(图4C)PTU处理期间所示时间点时心脏大鼠组织中miR-208的Northern印迹分析。
图22。miR-208敲除中快速骨骼基因的上调。
图23。miR-208敲除小鼠中心脏压力响应基因的失调。
图24。miR-208在心脏基因调节中的作用的模型。α-MHC基因编码miR-208，其负调节THRAP1和骨骼肌基因及其它靶物的表达。α-和β-MHC基因是连锁的，而且miR-208是响应压力信号传导和PTU对T3信号传导的阻断而发生β-MHC上调所需要的。α-和β-MHC分别提升快速和慢速收缩性。
图25。THRAP1作为miR-208的预测靶物。THRAP1的3′UTR中推定miR-208结合位点的序列比对显示了高水平的互补性和序列保守性(SEQ IDNO：6-13)。
图26。3′UTR THRAP1萤光素酶测定法。含有THRAP13′UTR的萤光素酶基因的表达在与miR-208共转染的细胞中降低，但miR-126(对照)不然。
图27。miR-208突变小鼠的心脏中快速骨骼肌基因的上调。
图28。Myh7基因座(β-MHC)的结构及其中miR-208b编码区的位置(SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：30-36)。
图29A-B。miR-208和miR-208b是由于肌球蛋白重链基因的基因组重复 而发生的(myh6和myh7，也叫作α-MHC和β-MHC)。miR-208和miR-208b与α-MHC和β-MHC共表达(图29A)且共享同源种子区，尽管总的成熟miR在序列上相差3个碱基(图29B)(SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：5)。
图30A-D。肌miR与它们的肌球蛋白宿主基因一起共表达和共调节。(图30A)Northern分析显示了mir-208b在基线条件在心脏中以很低的水平表达且在快速骨骼肌纤维(诸如腓肠肌/跖肌(GP)、胫骨前肌(TA)或趾长伸肌(EDL))中不表达。miR-208b在慢速骨骼肌比目鱼肌中高度表达。(图30B)所示肌球蛋白基因的实时PCR分析显示了给动物喂含PTU的食物对甲状腺受体信号传导的阻断在大鼠心脏组织中遏制α-MHC且诱导β-MHC表达。这种效果能通过后续补充甲状腺激素(T3)来逆转。myh7b的表达在较低的程度反映β-MHC的表达样式。(图30C)出生后不久，有β-MHC向更多α-MHC的转换。虽然miR-208在成年心脏中负责miR-499激活，但是对p1、p6和成年野生型和miR-208突变动物心脏样品的Northern印迹分析指示自β-MHC基因生成的miR-208b的存在，足以驱动miR-499表达，甚至在没有miR-208的情况中。(图30D)肌miR的Northern印迹分析指示miR-208b反映在没有miR-208的情况中响应压力信号传导而发生的β-MHC诱导降低。miR-208敲除动物响应压力和甲状腺功能减退而产生降低的β-MHC升高。虽然Northern分析显示野生型(WT)动物中响应PTU而发生的miR-208b剧烈诱导，但是在没有miR-208(敲除，KO)的情况中miR-208b诱导只是微弱的。注意，208a或208b任一的存在足以激活myh7b/miR-499。
图31。PTU处理的甲状腺功能减退强烈诱导miR-208b表达。虽然miR-208b(像β-MHC一样)在基线条件下在心脏中几乎不表达，但是它的表达响应甲状腺功能减退而被强烈诱导。这种诱导能通过后续补充甲状腺激素(T3)来逆转。
图32。PTU处理的甲状腺功能减退期间miR-208b的时间依赖性诱导。PTU处理对miR-208b的诱导在3天后是明显的。这种PTU诱导的miR-208b表达随PTU处理的持续时间而升高。
图33A-C。miR-208调节miR-208b和miR-499的表达。(A)显示miR-499和miR-208b表达在miR-208杂合(+/-)和纯合(KO)突变动物中剂量依赖性下调的Northern印迹。(B)miR-208b在miR-208转基因动物中上调，其与β-MHC表达有关。(C)心脏肌肉中miR-208调节miR-499的示意图。
图34。miR-208调节心脏重塑的示意模型。miR-208直接地或经由调节miR-499和miR-208b表达而间接地调节心脏重塑。
图35。设计miR-208b敲除小鼠模型的靶向策略的示意模型。
图36。过表达miR-499和miR-208b二者结合位点区的转基因小鼠模型的 示意图。使用骨骼和心脏肌肉特异性启动子(肌肉肌酸激酶(MCK))进行的miR-499和miR-208b二者的结合位点区的骨骼肌特异性过表达应清除心脏和骨骼肌二者中的miR-208b和miR-499，由此生成这两种miRNA的敲低(SEQID NO：5、26和27)。
图37A-D。Myh7b/miR-499表达依赖于MEF2。(图37A)使用来自经空pcDNA-Flag或Flag-MEF2C转染的COS-1细胞的核提取物和作为探针的放射性标记的MEF2位点实施了凝胶迁移率变动测定法。虽然pcDNA-Flag不能结合放射性标记的MEF2位点(道1)，但是MEF2C过表达诱导结合(道2)，这能用1μg多克隆Flag抗体超变动(道3)。以50倍摩尔过量使用特异性的和非特异性的竞争物(道4-6)。(图37B)用100ng myh7b-萤光素酶报告物(野生型和Mef2突变型)、50ng编码Mef2c、Mef2辅激活物、心肌素(myocardin)蛋白质的表达载体和30ng pCMV-lacZ转染COS细胞(24孔板，5x104细胞/孔)。Mef2c和心肌素对myh7b报告物的激活需要Mef2结合位点。(图37C)MEF2位点对于myh7b/miR-499的心脏表达是至关重要的。生成了LacZ转基因小鼠胚，并在E12.5和p1时对β-半乳糖苷酶表达染色。虽然myh7b基因上游0.8Kb的一个区域足以驱动心脏lacZ表达，但是MEF2位点的突变消除心脏中的表达。(图37D)Northern印迹分析指示miR-499表达在心脏特异性MEF2D转基因动物的心脏中升高，而miR-499水平在缺失了MEF2C和-D的心脏中降低。
图38A-F。miR-499调节β-MHC和快速骨骼基因的表达。(图38A)miR-499的Northern印迹分析指示使用肌肉特异性启动子进行的miR-499转基因过表达在所有肌肉类型中有效诱导miR-499水平。(图38B)实时PCR分析显示转基因过表达导致与基线心脏表达水平相比有效的miR-499过表达，快速骨骼肌类型(GP、TA和EDL)中的水平最高。(图38C)野生型或转基因动物的肌肉组织的实时PCR分析显示miR-499的过表达足以在比目鱼肌、TA和EDL中驱动β-MHC表达，但它在心脏、比目鱼肌和EDL中遏制快速骨骼肌钙蛋白I2(TnnI2)和T3(TnnT3)。(图38D)野生型和miR-499转基因动物二者的肌纤维骤冻组织学切片异染性ATP酶染色显示了转基因小鼠的快速纤维(EDL)中慢速肌纤维的显著增多。(图38E)miR-208消融对响应PTU发生的β-MHC表达的遏制性效果当miR-499重新引入时缺失。在miR-208突变动物的心脏中转基因重新引入miR-499导致对β-MHC及其相应miRNA(即miR-208b)的剧烈诱导。(图38F)虽然miR-208消除诱导对快速骨骼基因的不当诱导，但是miR-499当在miR-208突变动物中转基因表达时非常有力地遏制这些基因。
发明详述
心肌和骨骼肌通过调控肌球蛋白的调节收缩效率的各同等型的表达来响应多种病理生理刺激，诸如工作负荷、甲状腺激素信号传导和损伤。最近，发明人报告了一种心脏特异性微小RNA，即miR-208，它是由α-肌球蛋白重链(MHC)基因的内含子编码的，而且是在心脏中响应心脏压力而上调β-MHC表达和遏制快速骨骼肌基因所需要的(参见共同悬而未决的申请WO2008/016924，通过述及而完整收入本文)。
在此，发明人延伸了他们早先的工作，并且显示了miR-208也是密切相关的微小RNA(即miR-499和miR-208b，分别由Myh7b基因和βMHC基因的内含子编码)的心脏表达所需要的。Myh7b和miR-499在心脏中的以及在慢速骨骼肌中的表达受到MEF2转录因子(条纹肌肉基因表达的一种信号依赖性调节物)的控制。miR-499或miR-208的受迫表达足以在体内介导快速向慢速肌纤维的转换。mir-208和miR-499能负调节Thrap1(一种甲状腺激素受体辅调节物)和转录因子PUR家族各成员的表达，它们继而负调节β-MHC在心肌和骨骼肌中的表达。Sox6发挥慢速纤维类型特异性基因的遏制物的功能。Sox6表达在野生型肌管中的敲低导致β-MHC表达的显著升高。对β-MHC启动子的分析揭示了一种Sox共有序列，这提示Sox6在心脏中的胎骨骼肌纤维类型分化和β-MHC调节中发挥关键作用。这些发现揭示了Myh基因通过编码控制收缩性和信号响应性的调节性微小RNA而调节条纹肌肉基因表达样式的一种共同调节性机制。根据这些发现描述了在条纹肌肉疾病的背景中通过调控miR-499表达来操作骨骼和心脏肌肉基因表达的策略。
发明人还发现了基因组含有miR208的第二种型式，称作miR-208b，它位于β-MHC基因内，在内含子31处，而且像β-MHC一样，miRNA 208b仅仅在心脏和慢速骨骼肌(比目鱼肌)中表达。此微小RNA的序列与miR-208有很大的交叠，其中在所谓的种子区有100％同源性(即微小RNA中限定某些miRNA的mRNA靶物的区域)。如此，miR-208b在人类中能对心脏收缩性具有深刻的影响，而且本发明还涵盖通过调控miR-208b来调节心脏收缩性。
如此，本发明涵盖对miR-499和/或miR-208b表达或活性的激动，或是通过治疗性激活内源miR-208b基因或miR-208基因(以上调miR-499)或是将外源miR-499或miR-208b引入心脏中，或是使用miRNA自身或是通过使用腺病毒载体或其它异位表达手段以提高β-MHC表达。miR-208突变小鼠的心脏中数种快速骨骼肌收缩蛋白质基因的上调提示miR-208和miR-208b通常遏制快速骨骼肌基因程序，这暗示miR-499在骨骼和心脏肌肉中的相似作用。如此，心脏中这些基因的激活代表了调节心脏收缩性的一种潜在办法。
另外，发明人提出了miR-499和/或miR-208b在骨骼肌中遏制快速纤维基因，由此激活反向的慢速纤维基因表达的用途。慢速纤维基因的表达是与增强的胰岛素敏感度和骨骼肌耐久性偶联的。骨骼肌中对慢速纤维基因的遏制和对快速纤维基因的激活与众多肌肉骨骼病症有关，包括失用性萎缩、响应反重力而发生的肌肉萎缩、和去神经。
如此，本发明人发现了，像miR-208一样，miR-499是心脏中β-MHC基因表达的肌肉特异性的和至关重要的调节物。另外，发现miR-208b是心脏中肌球蛋白基因表达的肌肉特异性的和至关重要的调节物，它另外调节心脏纤维化。这两项发现是全新的，正如这些微小RNA用于控制心脏收缩性和骨骼肌功能的用途。对miR-499基因的基因组位置的分析显示它包含在Myh7b基因(α-MHC基因的一种同系物)的第20内含子内(图15；SEQ ID NO：26描绘了成熟miRNA序列；SEQ ID NO：25显示了前体序列的茎环结构)。SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23和SEQ ID NO：24分别提供了小鼠、大鼠、人、犬、负鼠、鸡和非洲蟾蜍(X.tropicalis)的miR-499的pre-miRNA编码序列(图15)。Myh7b基因在脊椎动物中是保守的，而且仅仅在心脏和慢速骨骼肌(例如比目鱼肌)中表达。
已经显示出调节miR-499表达的miR-208是位于α-MHC基因内含子内的内含子miRNA。精确的内含子位置取决于具体的物种和具体的转录物。例如，在人类中，miR-208是在α-MHC基因的第28内含子内编码的，而在小鼠中，它是在第29内含子内编码的。SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17中分别提供了人类、小鼠、大鼠、和犬的miR-208的pre-miRNA编码序列。SEQ ID NO：5中提供了成熟miR-208序列。像α-MHC一样，miR-208仅仅在心脏中表达(图1)。
人类pre-miR-208(SEQ ID NO：14)
acgggcgagc ttttggcccg ggttatacct gatgctcacg tataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a
小鼠pre-miR-208(SEQ ID NO：15)
acgggtgagc ttttggcccg ggttatacct gactctcacg tataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a
大鼠pre-miR-208(SEQ ID NO：16)
acgggtgagc ttttggcccg ggttatacct gactctcacg tataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a
犬pre-miR-208(SEQ ID NO：17)
acgcatgagc ttttggctcg ggttatacct gatgctcacg tataagacga gcaaaaagct tgttggtcag a
使用用于鉴定miRNA靶物的PicTar算法(Krek等，2005)，发明人鉴定出甲状腺激素受体相关蛋白质1(THRAP1)作为miR-208的预测靶物。SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、和SEQ ID NO：13中分别提供了来自人类、黑猩猩、小鼠、大鼠、犬、鸡、河豚、和斑马鱼的THRAP1 3′UTR序列(图25)。
在一项对于可能牵涉肌肉收缩性调节的微小RNA的进一步研究中，发明人发现βMHC基因在内含子31中含有miR208b，它与miR-208密切相关。miR-208b的表达在βMHC的表达之后，也就是说它仅仅在心脏和慢速骨骼肌(比目鱼肌)中表达。此微小RNA的序列与miR-208有很大的交叠，在所谓的种子区(即微小RNA中有助于限定某些miRNA的mRNA靶物的部分)中具有100％同源性(以下划线标示)：
miR-208     AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU(SEQ ID NO：5)
miR-208b    AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU(SEQ ID NO：27)
SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、和SEQ ID NO：35中分别提供了人、小鼠、大鼠、犬、负鼠、和非洲蟾蜍的miR-208b的pre-miRNA编码序列(图28)。图28还显示了miR-208b前体序列的茎环结构(SEQ ID NO：36)。
治疗心脏肥大、心力衰竭、和心肌梗死的方法
本发明提供了用于在有所需要的受试者中治疗病理性心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的方法。在一个实施方案中，所述方法包括鉴定具有心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的受试者，并抑制所述受试者的心脏细胞中的miR-499和/或miR-208b的表达或活性。在另一个实施方案中，所述方法包括鉴定有风险发生病理性心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的受试者，并抑制所述受试者的心脏细胞中的miR-499和/或miR-208b的表达或活性。有风险发生病理性心脏肥大或心力衰竭的受试者可展现出一种或多种风险因素，包括例如长期存在的不受控制的高血压、未矫正的瓣膜病、慢性心绞痛(chronicangina)、近期的心肌梗死、对心脏病的先天性素因或病理性肥大。在某些实施方案中，所述有风险的受试者会诊断为具有心脏肥大的遗传素因。在本发明的一些实施方案中，所述有风险的受试者会具有心脏肥大的家族史。
在另一个实施方案中，本发明提供了在有所需要的受试者中预防心脏肥大和扩张性心肌病的方法，包括抑制所述受试者的心脏细胞中的miR-499和/或miR-208b的表达或活性。在还有一个实施方案中，本发明提供了在有所需要的受试者中抑制心脏肥大进展的方法，包括抑制所述受试者的心脏细胞中的miR-499和/或miR-208b的表达或活性。在某些实施方案中，本发明提供了在具有心力衰竭或心脏肥大的受试者中提高运动耐量、减少住院治疗、提高生命质量、降低发病率、和/或降低死亡率的方法，包括抑制所述受试者的心脏细胞中的miR-499和/或miR-208b的表达或活性。
如此，本发明提供了利用miR-499的或miR-208b的抑制剂治疗心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的方法。优选的是，miR-499和/或miR-208b抑制剂的施用导致受试者中心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的一种或多种症状的改善，或者导致自心脏肥大向心力衰竭的转变的延迟。所述一种或多种得到改善的症状可以是例如提高的运动能力、提高的心脏射血体积、降低的左心室舒张末期压、降低的肺毛细血管楔压、升高的心输出量、升高的心指数、降低的肺动脉压、降低的左心室收缩和舒张末期内径、降低的心脏纤维化、心脏肌肉中降低的胶原沉积、降低的左和右心室壁压、降低的壁张力、提高的生命质量、和降低的疾病相关发病率或死亡率。另外，miR-499的和/或miR-208b的抑制剂的使用可预防心脏肥大及其相关症状的发生。
miRNA的功能可通过微小RNA拮抗剂的施用来抑制。最初由Krützfeldt及其同事(Krützfeldt等，2005)记载，“微小RNA拮抗剂”指单链的、经化学修饰的、至少部分与miRNA序列互补的核糖核苷酸。微小RNA拮抗剂会含有一个或多个经修饰的核苷酸，诸如2′-O-甲基-糖修饰。在一些实施方案中，微小RNA拮抗剂仅包含经修饰的核苷酸。微小RNA拮抗剂也可包含一个或多个硫代磷酸酯连接，导致部分或完全是硫代磷酸酯的主链。为了促进体内递送和稳定性，可以在其3′端将微小RNA拮抗剂连接至胆固醇模块。适合于抑制miRNA的微小RNA拮抗剂可以长约15个至约50个核苷酸，更优选长约18个至约30个核苷酸，且最优选长约20个至约25个核苷酸。“部分互补”指某序列与靶多核苷酸序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补。微小RNA拮抗剂可以与成熟miRNA序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一些实施方案中，微小RNA拮抗剂可以与成熟miRNA序列基本上互补，也就是与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％互补。在其它实施方案中，微小RNA拮抗剂与成熟miRNA序列100％互补。
对微小RNA功能的抑制也可以通过施用靶向成熟miR-499、miR-208、或miR-208b序列的反义寡核苷酸来实现。所述反义寡核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。优选的是，所述反义寡核苷酸具有至少一处化学修饰。反义寡核苷酸可以包含一个或多个“锁定核酸”。“锁定核酸”(LNA)指经修饰核糖核苷酸，它在核糖糖模块的2′和4′碳之间含有额外桥接，导致赋予含有LNA的寡核苷酸以增强的热稳定性的“锁定”构象。或者，所述反义寡核苷酸可包含肽核酸(PNA)，其含有基于肽的主链，而非糖-磷酸酯主链。反义寡核苷酸可含有的其它化学修饰包括但不限于糖修饰，诸如′-O-烃基(例如2′-O-甲基、2′-O-甲氧乙基)、2′-氟、和4′-硫修饰，及主链修饰，诸如一个或多个硫代磷酸酯、吗啉代、或膦羧酸酯(phosphonocarboxylate)连接(参加例如美国专利No.6,693,187和7,067,641，通过述及而完整收入本文)。在一些实施方案中，合适的反义寡核苷酸是2′-O-甲氧乙基“缺口聚物”(gapmer)，其在5′和3′端都含有2′-O-甲氧乙基修饰的核糖核苷酸，且中央有至少十个脱氧核糖核苷酸。这些“缺口聚物”能够触发依赖于RNA酶H的对RNA靶物的降解机制。增强稳定性和提高功效的对反义寡核苷酸的其它修饰(诸如美国专利No.6,838,283中记载的那些，通过述及而完整收入本文)是本领域已知的，而且适合于在本发明的方法中使用。对抑制微小RNA的活性有用的优选反义寡核苷酸长约19个至约25个核苷酸。反义寡核苷酸可包含至少部分与成熟miRNA序列互补的序列，例如与成熟miRNA序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸可以与成熟miRNA序列基本上互补，也就是与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％互补。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与成熟miRNA序列100％互补的序列。
用于抑制miR-499、miR-208、和miR-208b的功能的另一种办法是施用与成熟miR-499、miR-208、和miR-208b序列具有至少部分序列同一性的抑制性RNA分子。所述抑制性RNA分子可以是双链小干扰RNA(siRNA)或包含茎环结构的短发夹RNA分子(shRNA)。所述抑制性RNA分子的双链区可包含与成熟miRNA序列至少部分相同，例如约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。在一些实施方案中，所述抑制性RNA的双链区包含与成熟miRNA序列至少基本上相同的序列。“基本上相同”指某序列与靶多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、或99％相同。在其它实施方案中，所述抑制性RNA分子的双链区可含有与靶miRNA序列100％的同一性。
本文所述抑制性核苷酸分子优选靶向miR-499(SEQ ID NO：26)、miR-208(SEQ ID NO：5)、或miR-208b(SEQ ID NO：27)的成熟序列。在一些实施方案中，miR-499、miR-208、和miR-208b的抑制剂是包含与成熟miR-499、成熟miR-208、或成熟miR-208b序列完美互补的序列的微小RNA拮抗剂。在一个实施方案中，miR-499的抑制剂是具有与5′-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3′(SEQ ID NO：26)部分或完美互补的序列的微小RNA拮抗剂。在另一个实施方案中，miR-208的抑制剂是具有与5′-AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU-3′(SEQ ID NO：5)部分或完美互补的序列的微小RNA拮抗剂。在另一个实施方案中，miR-208b的抑制剂是具有与5′-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU(SEQ ID NO：27)部分或完美互补的序列的微小RNA拮抗剂。
在一些实施方案中，miR-499、miR-208、和miR-208b的抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸。在一个实施方案中，miR-499的抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸，其包含与5′-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3′(SEQ IDNO：26)基本上互补的序列。在另一个实施方案中，miR-208的抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸，其包含与5′-AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU-3′(SEQ ID NO：5)基本上互补的序列。在另一个实施方案中，miR-208b的抑制剂是经化学修饰的反义寡核苷酸，其包含与5′-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU(SEQ ID NO：27)基本上互补的序列。如本文中所使用的，“基本上互补”指某序列与靶多核苷酸序列(例如成熟或前体miRNA序列)至少约95％、96％、97％、98％、99％、或100％互补。
反义寡核苷酸可包含与miR-499、miR-208、或miR-208b的前体miRNA序列(pre-miRNA)基本上互补的序列。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与位于pre-miR-499、pre-miR-208、或pre-miR-208b序列茎环区以外的序列基本上互补的序列。在一个实施方案中，miR-499功能的抑制剂是反义寡核苷酸，其具有与选自下组的pre-miR-499序列基本上互补的序列：SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。在另一个实施方案中，miR-208功能的抑制剂是反义寡核苷酸，其具有与选自下组的pre-miR-208序列基本上互补的序列：SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，和SEQ ID NO：17。在还有一个实施方案中，miR-208b功能的抑制剂是反义寡核苷酸，其具有与选自下组的pre-miR-208b序列基本上互补的序列：SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，和SEQ ID NO：35。
在本发明的其它实施方案中，miR-499、miR-208、和miR-208b的抑制剂可以是抑制性RNA分子，诸如核酶、siRNA、或shRNA。在一个实施方案中，miR-499的抑制剂是包含双链区的抑制性RNA分子，其中所述双链区包含与成熟miR-499序列(SEQ ID NO：26)具有100％同一性的序列。在另一个实施方案中，miR-208的抑制剂是包含双链区的抑制性RNA分子，其中所述双链区包含与成熟miR-208序列(SEQ ID NO：5)具有100％同一性的序列。在另一个实施方案中，miR-208b的抑制剂是包含双链区的抑制性RNA分子，其中所述双链区包含与成熟miR-208b序列(SEQ ID NO：27)具有100％同一性的序列。在一些实施方案中，miR-208、miR-208b、和miR-499功能的抑制剂是包含双链区的抑制性RNA分子，其中所述双链区包含与成熟miR-208、miR-208b、或miR-499序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的序列。
本发明还涵盖用于在治疗后清除或消除miR-499和/或miR-208b拮抗剂的方法。所述方法可包括在心脏组织过表达miR-499和/或miR-208b拮抗剂的结合位点。在另一个实施方案中，本发明提供了用于在治疗后清除或消除miR-499和/或miR-208b的方法。在一个实施方案中，所述方法包括使用骨骼和心脏肌肉特异性启动子(肌肉肌酸激酶(MCK))在骨骼肌中过表达miR-499和/或miR-208b的结合位点区。所述结合位点区优选含有miR-499和/或miR-208b的种子区的序列。在一些实施方案中，所述结合位点可含有来自miR-499或miR-208b的一种或多种靶物3′UTR的序列，诸如THRAP1或PURβ。在另一个实施方案中，可以在miR-499和/或miR-208b之后施用miR-499和/或miR-208b拮抗剂以削弱或终止微小RNA的功能。
组合疗法
在本发明的另一个实施方案中，与其它治疗形态组合地使用miR-499或miR-208b的抑制剂。心血管病症背景中的心脏肥大的当前医学管理包括使用至少两种类型的药物：肾素-血管紧张素系统的抑制剂，和β-肾上腺素能阻断剂(Bristow，1999)。用于治疗心力衰竭背景中的病理性肥大的治疗剂包括血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂和β-肾上腺素能受体阻断剂(Eichhorn和Bristow，1996)。已经公开的用于治疗心脏肥大的其它药剂包括血管紧张素II受体拮抗剂(美国专利5,604,251)和神经肽Y拮抗剂(WO 98/33791)。
非药理学治疗主要作为药理学治疗的辅助方法使用。非药理学治疗的一种手段涉及减少饮食中的钠。另外，非药理学治疗还需要消除某些沉淀性药物，包括负性肌力药(例如某些钙通道阻滞剂和抗心率不齐药像丙吡胺(disopyramide))、心脏毒素(例如安非他明(amphetamine)、和血容量扩充药(plasma volume expander)(例如非类固醇抗炎药和糖皮质激素)。
如此，在上文所述疗法之外，还可以给受试者提供用miR-499和/或miR-208b的抑制剂进行的更多“标准”制药学心脏疗法。其它疗法的例子包括但不限于所谓的“β-阻滞剂”、抗高血压药、强心药、抗血栓药、血管扩张药、激素拮抗剂、肌力药(iontrope)、利尿药、内皮缩血管肽受体拮抗剂、钙通道阻滞剂、磷酸二酯酶抑制剂、ACE抑制剂、血管紧张素2型拮抗剂和细胞因子阻滞剂/抑制剂、和HDAC抑制剂。所述组合疗法还可涉及抑制miR-499和miR-208b二者的表达或活性，或者抑制miR-208，和/或别的涉及心脏重塑的miRNA(诸如miR-21和miR-195)的表达或活性。组合疗法还可包括过表达特定微小RNA，诸如miR-29。
可以如下实现组合，即使心脏细胞接触包括miR-499或miR-208b的抑制剂和标准药剂的单一组合物或药理学配制剂，或者使细胞同时接触两种不同组合物或配制剂，其中一种组合物包括miR-499或miR-208b的抑制剂，而另一种包括标准药剂。或者，所述使用miR-499和/或miR-208b抑制剂的疗法可以在另一药剂的施用之前或之后，间隔范围为数分钟至数周。在分开对细胞应用标准药剂和miR-499或miR-208b抑制剂的实施方案中，一般会确保每次递送的时间之间没有经过显著的一段时间，使得所述药剂和miR-499或miR-208b抑制剂会仍然能够有利地对细胞发挥组合效应。在此类情况中，通常会使细胞在彼此相距约12-24小时、更优选在彼此相距约6-12小时内接触两种形态，延迟时间最优选只有约12小时。然而，在一些情况中，可能希望显著延长治疗时间段，其中各施用间经过数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
也想得到的是会希望超过一次地施用miR-499和/或miR-208b抑制剂、或另一药剂。在这点上，可以采用各种组合。举例而言，在miR-499或miR-208b的抑制剂为“A”而另一药剂为“B”的情况中，下列基于总共3次和4次施用的排列是例示性的：
A/B/A  B/A/B   B/B/A  A/A/B  B/A/A   A/B/B    B/B/B/A  B/B/A/B
A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A  B/A/B/A   B/A/A/B  B/B/B/A
A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A  A/B/B/B   B/A/B/B  B/B/A/B
同样涵盖其它组合。
治疗方案会随临床情形而变化。然而，长期维持在大多数情形中会是适宜的。可能还希望间歇地用miR-499和/或miR-208b的抑制剂治疗肥大，诸如在疾病进展期间的短暂窗口内。
药理学治疗剂和施用方法、剂量、等是本领域技术人员公知的(参加例如《Physicians Desk Reference》(医师案头参考文献)、Klaassen的《ThePharmacological Basis of Therapeutics》、《Remington′s PharmaceuticalSciences》、和《The Merck Index》第11版，通过述及将相关部分收入本文)，而且可以根据本文中的公开内容与本发明组合。取决于所治疗的受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况中负责施用的人会为各受试者决定适宜的剂量，而且此类个体决定在本领域普通技术人员的技术范围内。
可以在本发明中使用的药理学治疗剂的非限制性例子包括抗高脂蛋白药、抗动脉硬化药、抗血栓药/溶纤维蛋白药、凝血药、抗心率不齐药、抗高血压药、血管加压药、用于充血性心力衰竭的治疗剂、抗心绞痛药、抗菌剂或其组合。
另外，应当注意，可以使用任何下述各项来开发心脏疗法靶基因的新集合，正如本例中使用β-阻滞剂(见下文)。虽然预期这些基因中许多可能有交叠，但是有可能能开发出新的基因靶。
在某些实施方案中，可以将降低一种或多种血脂和/或脂蛋白的浓度的药剂(在本文中称作“抗高脂蛋白药”)的施用与依照本发明的心血管疗法组合，特别是在动脉粥样硬化和血管组织的增厚或阻断的治疗中。在某些实施方案中，抗高脂蛋白药可包含芳氧链烷酸/纤维酸衍生物、树脂/胆汁酸隐蔽剂(sequesterant)、HMG CoA还原酶抑制剂、烟酸衍生物、甲状腺激素或甲状腺激素类似物、混杂剂或其组合。
芳氧链烷酸/纤维酸衍生物的非限制性例子包括苄氯贝特(beclobrate)、enzafibrate、比尼贝特(binifibrate)、环丙贝特(ciprofibrate)、克利贝特(clinofibrate)、氯贝特(clofibrate)(安妥明(atromide)-S)、氯贝酸(clofibric acid)、依托贝特(etofibrate)、非诺贝特(fenofibrate)、吉非贝齐(gemfibrozil)(lobid)、尼可贝特(nicofibrate)、吡贝特(pirifibrate)、氯烟贝特(ronifibrate)、双贝特(simfibrate)和益多酯(theofibrate)。
树脂/胆汁酸隐蔽剂的非限制性例子包括考来烯胺(cholestyramine)(cholybar、questran)、考来替泊(colestipol)(colestid)和降胆葡胺(polidexide)。
HMG CoA还原酶抑制剂的非限制性例子包括洛伐他汀(lovastatin)(美降脂(mevacor))、普伐他汀(pravastatin)(pravochol)或辛伐他汀(simvastatin)(zocor)。
烟酸衍生物的非限制性例子包括烟酸、acepimox、戊四烟酯(niceritrol)、尼可氯酯(nicoclonate)、尼可莫尔(nicomol)和氧烟酸(oxiniacic acid)。
甲状腺激素及其类似物的非限制性例子包括etoroxate、甲状丙酸和甲状腺素。
混杂抗高脂蛋白药的非限制性例子包括阿昔呋喃(acifran)、阿扎胆醇(azacosterol)、苯氟雷司(benfluorex)、β-苄丁酰胺(β-benzalbutyramide)、卡尼汀(carnitine)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、氯雌酮甲醚(clomestrone)、detaxtran、右旋糖苷硫酸钠(dextran sulfate sodium)、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、赤酮嘌啉(eritadenine)、夫拉扎勃(furazabol)、美格鲁托(meglutol)、甲亚油酰胺(melinamide)、双甲雌三醇(mytatrienediol)、鸟氨酸(ornithine)、γ-谷维素(γ-oryzanol)、泛硫乙胺(pantethine)、四乙酸季戊四醇酯(pentaerythritoltetraacetate)、α-苯基丁酰胺(α-phenylbutyramide)、吡扎地尔(pirozadil)、普罗布考(probucol)(lorelco)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、磺托酸-哌嗪盐(sultosilicacid-piperazine salt)、硫地醇(tiadenol)、曲帕拉醇(triparanol)和联苯丁酸(xenbucin)。
抗动脉硬化药的非限制性例子包括氨基甲酸吡啶酚酯(pyridinolcarbamate)。
在某些实施方案中，可以将有助于消除或预防血液凝块的药剂的施用与调控物的施用组合，特别是在动脉粥样硬化和脉管系统(例如动脉)阻断的治疗中。抗血栓药和/或溶纤维蛋白药的非限制性例子包括抗凝血药、抗凝血药拮抗剂、抗血小板药、溶血栓药、溶血栓药拮抗剂或其组合。
在某些实施方案中，优选口服施用的抗血栓药，诸如例如阿司匹林(aspirin)和华法林(wafarin)(Coumadin)。
抗凝血药的非限制性例子包括醋硝香豆素(acenocoumarol)、安克洛酶(ancrod)、茴茚二酮(anisindione)、溴茚二酮(bromindione)、氯茚二酮(clorindione)、库美香豆素(coumetarol)、环香豆素(cyclocumarol)、右旋糖苷硫酸钠(dextran sulfate sodium)、双香豆素(dicumarol)、二苯茚酮(diphenadione)、双香豆素乙酯(ethyl biscoumacetate)、乙撑双香豆素(ethylidenedicoumarol)、氟茚二酮(fluindione)、肝素(heparin)、水蛭素(hirudin)、阿朴酸钠(lyapolate sodium)、奥沙二酮(oxazidione)、戊聚糖多硫酸(pentosanpolysulfate)、苯茚二酮(phenindione)、苯丙香豆醇(phenprocoumon)、卵黄高磷蛋白(phosvitin)、吡考他胺(picotamide)、噻氯香豆素(tioclomarol)和华法林(warfarin)。
抗血小板药的非限制性例子包括阿司匹林(aspirin)、右旋糖苷(dextran)、双嘧达莫(dipyridamole)(潘生丁(persantin))、肝素(heparin)、磺吡酮(sulfmpyranone)(安特灵(anturane))和噻氯匹定(ticlopidine)(力抗栓(ticlid))。
溶血栓药的非限制性例子包括组织纤溶酶原激活物(activase)、纤溶酶、尿激酶原、尿激酶(abbokinase)链激酶(streptase)、阿尼普酶(anistreplase)/APSAC(依米那酶(eminase))。
在其中受试者罹患出血或出血可能性升高的某些实施方案中，可以使用可增强血液凝结的药剂。血液凝结促进剂的非限制性例子包括溶血栓药拮抗剂和抗凝血药拮抗剂。
抗凝血药拮抗剂的非限制性例子包括精蛋白(protamine)和维生素K1。
溶血栓药拮抗剂的非限制性例子包括氨基己酸(amiocaproic acid)(amicar)和氨甲环酸(tranexamic acid)(amstat)。抗血栓药的非限制性例子包括阿那格雷(anagrelide)、阿加曲班(argatroban)、西鲁唑啉(cilstazol)、达曲班(daltroban)、去纤苷(defibrotide)、依诺肝素(enoxaparin)、速避凝(fraxiparine)、吲哚布芬(indobufen)、lamoparan、奥扎格雷(ozagrel)、吡考他胺(picotamide)、普拉贝脲(plafibride)、替地肝素(tedelparin)、噻氯匹定(ticlopidine)和三氟柳(triflusal)。
抗心率不齐药的非限制性例子包括I类抗心率不齐药(钠通道阻滞剂)、II类抗心率不齐药(β-肾上腺素能阻滞剂)、III类抗心率不齐药(复极化延长药)、IV类抗心率不齐药(钙通道阻滞剂)和混杂型抗心率不齐药。
钠通道阻滞剂的非限制性例子包括IA类、IB类和IC类抗心率不齐药。IA类抗心率不齐药的非限制性例子包括丙吡胺(disppyramide)(norpace)、普鲁卡因胺(procainamide)(pronestyl)和奎尼丁(quinidine)(quinidex)。IB类抗心率不齐药的非限制性例子包括利多卡因(lidocaine)(xylocaine)、妥卡尼(tocainide)(tonocard)和美西律(mexiletine)(mexitil)。IC类抗心率不齐药的非限制性例子包括恩卡尼(encainide)(enkaid)和氟卡尼(flecainide)(tambocor)。
β-阻滞剂(也称作β-肾上腺素能阻滞剂、β-肾上腺素能拮抗剂或II类抗心率不齐药)的非限制性例子包括醋丁洛尔(acebutolol)(sectral)、阿普洛尔(alprenolol)、氨磺洛尔(amosulalol)、阿罗洛尔(arotinolol)、阿替洛尔(atenolol)、苯呋洛尔(befunolol)、倍他洛尔(betaxolol)、贝凡洛尔(bevantolol)、比索洛尔(bisoprolol)、波吲洛尔(bopindolol)、布库洛尔(bucumolol)、布非洛尔(bufetolol)、丁呋洛尔(bufuralol)、布尼洛尔(bunitrolol)、布拉洛尔(bupranolol)、盐酸布替君(butidrine hydrochloride)、丁非洛尔(butofilolol)、卡拉洛尔(carazolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、塞利洛尔(celiprolol)、塞他洛尔(cetamolol)、氯拉洛尔(cloranolol)、地来洛尔(dilevalol)、依泮洛尔(epanolol)、艾司洛尔(esmolol)(brevibloc)、茚诺洛尔(indenolol)、拉贝洛尔(labetalol)、左布诺洛尔(levobunolol)、甲吲洛尔(mepindolol)、美替洛尔(metipranolol)、美托洛尔(metoprolol)、莫普洛尔(moprolol)、纳多洛尔(nadolol)、萘肟洛尔(nadoxolol)、硝苯洛尔(nifenalol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普拉洛尔(practolol)、丙萘洛尔(pronethalol)、普萘洛尔(propanolol)(inderal)、索他洛尔(sotalol)(betapace)、硫氧洛尔(sulfinalol)、他林洛尔(talinolol)、特他洛尔(tertatolol)、噻吗洛尔(timolol)、托利洛尔(toliprolol)和希波酚(xibinolol)。在某些实施方案中，β-阻滞剂包含芳氧丙醇胺衍生物。芳氧丙醇胺衍生物的非限制性例子包括醋丁洛尔(acebutolol)、阿普洛尔(alprenolol)、阿罗洛尔(arotinolol)、阿替洛尔(atenolol)、倍他洛尔(betaxolol)、贝凡洛尔(bevantolol)、比索洛尔(bisoprolol)、波吲洛尔(bopindolol)、布尼洛尔(bunitrolol)、丁非洛尔(butofilolol)、卡拉洛尔(carazolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、塞利洛尔(celiprolol)、塞他洛尔(cetamolol)、依泮洛尔(epanolol)、茚诺洛尔(indenolol)、甲吲洛尔(mepindolol)、美替洛尔(metipranolol)、美托洛尔(metoprolol)、莫普洛尔(moprolol)、纳多洛尔(nadolol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普萘洛尔(propanolol)、他林洛尔(talinolol)、特他洛尔(tertatolol)、噻吗洛尔(timolol)和托利洛尔(toliprolol)。
延长复极化的药剂(也称作III类抗心率不齐药)的非限制性例子包括胺碘酮(amiodarone)(可达龙(cordarone))和索他洛尔(sotalol)(betapace)。
钙通道阻滞剂(也称作IV类抗心率不齐药)的非限制性例子包括芳基烃基胺(例如bepridile、地尔硫卓(diltiazem)、芬地林(fendiline)、戈洛帕米(gallopamil)、普尼拉明(prenylamine)、特罗地林(terodiline)、维拉帕米(verapamil))、二氢吡啶衍生物(非洛地平(felodipine)、伊拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine))、哌嗪衍生物(例如桂利嗪(cinnarizine)、氟桂利嗪(flunarizine)、利多氟嗪(lidoflazine))或混杂型钙通道阻滞剂(诸如苄环烷(bencyclane)、依他苯酮(etafenone)、镁(magnesium)、米贝拉地尔(mibefradil)或哌克昔林(perhexiline))。在某些实施方案中，钙通道阻滞剂包含长效二氢吡啶(硝苯地平型)钙拮抗剂。
混杂型抗心率不齐药的非限制性例子包括阿糖腺苷(adenosine)(adenocard)、地高辛(digoxin)(拉诺辛(lanoxin))、乙酰卡尼(acecainide)、阿义马林(ajmaline)、克冠吗啉(amoproxan)、阿普林定(aprindine)、甲苯磺酸溴苄胺(bretylium tosylate)、丁萘夫汀(bunaftine)、布托苯定(butobendine)、卡泊酸(capobenic acid)、西苯唑啉(cifenline)、吡二丙胺(disopyranide)、二氢奎尼丁(hydroquinidine)、英地卡尼(indecainide)、异丙托溴胺(ipatropium bromide)、利多卡因(lidocaine)、劳拉义明(lorajmine)、劳卡尼(lorcainide)、甲氧苯汀(meobentine)、莫雷西嗪(moricizine)、吡美诺(pirmenol)、丙缓脉灵(prajmaline)、普罗帕酮(propafenone)、吡诺林(pyrinoline)、聚半乳糖醛酸奎尼丁(quinidinepolygalacturonate)、硫酸奎尼丁(quinidine sulfate)和维喹地尔(viquidil)。
抗高血压药的非限制性例子包括抗交感神经药、α/β阻滞剂、α阻滞剂、抗血管紧张素II药、β阻滞剂、钙通道阻滞剂、血管扩张药和混杂型抗高血压药。
α阻滞剂(也称作α-肾上腺素能阻滞剂或α-肾上腺素能拮抗剂)的非限制性例子包括氨磺洛尔(amosulalol)、阿罗洛尔(arotinolol)、达哌唑(dapiprazole)、多沙唑嗪(doxazosin)、甲磺酸双氢麦角碱(ergoloid mesylate)、芬司匹利(fenspiride)、吲哚拉明(indoramin)、拉贝洛尔(labetalol)、麦角溴烟酯(nicergoline)、哌唑嗪(prazosin)、特拉唑嗪(terazosin)、妥拉唑林(tolazoline)、曲马唑嗪(trimazosin)和育亨宾(yohimbine)。在某些实施方案中，α阻滞剂可以包含喹唑啉衍生物。喹唑啉衍生物的非限制性例子包括阿夫唑嗪(alfuzosin)、布那唑嗪(bunazosin)、多沙唑嗪(doxazosin)、哌唑嗪(prazosin)、特拉唑嗪(terazosin)和曲马唑嗪(trimazosin)。
在某些实施方案中，抗高血压药既是α肾上腺素能拮抗剂又是β肾上腺素能拮抗剂。α/β阻滞剂的非限制性例子包含拉贝洛尔(labetalol)(normodyne、trandate)。
抗血管紧张素II药的非限制性例子包括血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂。血管紧张素转化酶抑制剂(ACE抑制剂)的非限制性例子包括阿拉普利(alacepril)、依那普利(enalapril)(vasotec)、卡托普利(captopril)、西拉普利(cilazapril)、地拉普利(delapril)、依那普拉利(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、moveltopril、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril)。血管紧张素II受体阻滞剂(也称作血管紧张素II受体拮抗剂、ANG受体阻滞剂或ANG-II 1型受体阻滞剂(ARBS))的非限制性例子包括血管坎地沙坦(angiocandesartan)、依普罗沙坦(eprosartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、氯沙坦(losartan)和缬沙坦(valsartan)。
抗交感神经药的非限制性例子包括作用于中枢的抗交感神经药或作用于周围的抗交感神经药。作用于中枢的抗交感神经药(也称作中枢神经系统(CNS)抗交感神经药)的非限制性例子包括可乐定(clonidine)(catapres)、胍那苄(guanabenz)(wytensin)胍法辛(guanfacine)(tenex)和甲基多巴(methyldopa)(aldomet)。作用于周围的抗交感神经药的非限制性例子包括神经节阻断剂、肾上腺素能神经元阻断剂、β-肾上腺素能阻断剂或α1-肾上腺素能阻断剂。神经节阻断剂的非限制性例子包括美卡拉明(mecamylamine)(inversine)和曲美芬(trimethaphan)(arfonad)。肾上腺素能神经元阻断剂的非限制性例子包括胍乙啶(guanethidine)(ismelin)和利舍平(reserpine)(serpasil)。β-肾上腺素能阻滞剂的非限制性例子包括醋丁洛尔(acenitolol)(sectral)、阿替洛尔(atenolol)(天诺敏(tenormin))、倍他洛尔(betaxolol)(卡尔仑(kerlone))、卡替洛尔(carteolol)(cartrol)、拉贝洛尔(labetalol)(normodyne、trandate)、美托洛尔(metoprolol)(lopressor)、纳多洛尔(nadanol)(corgard)、喷布洛尔(penbutolol)(levatol)、吲哚洛尔(pindolol)(心得静(visken))、普萘洛尔(propranolol)(心得安(inderal))和噻吗洛尔(timolol)(blocadren)。α1-肾上腺素能阻滞剂的非限制性例子包括哌唑嗪(prazosin)(脉宁平(minipress))、多沙唑嗪(doxazocin)(卡杜雷(cardura))和特拉唑嗪(terazosin)(高特灵(hytrin))。
在某些实施方案中，心血管治疗剂可以包含血管扩张药(例如脑血管扩张药、冠状动脉血管扩张药或外周血管扩张药)。在某些优选的实施方案中，血管扩张药包含冠状动脉血管扩张药。冠状动脉血管扩张药的非限制性例子包括胺氧三苯(amotriphene)、地巴唑(bendazol)、半琥珀酸琥珀呋酮(benfurodilhemisuccinate)、苯碘达隆(benziodarone)、氯酚嗪(chloracizine)、乙胺香豆素(chromonar)、氯苯呋醇(clobenfurol)、氯硝甘油(clonitrate)、地拉卓(dilazep)、双嘧达莫(dipyridamole)、氢普拉明(droprenilamine)、乙氧黄酮(efloxate)、戊四硝酯(erythrityl tetranitrane)、依他苯酮(etafenone)、芬地林(fendiline)、夫洛地尔(floredil)、更利芬(ganglefene)、己烷雌酚二(β-二乙基氨基乙基醚)(herestrol bis(β-diethylaminoethyl ether))、海索苯定(hexobendine)、甲苯磺酸硝乙醇胺(itramin tosylate)、凯林(khellin)、利多氟嗪(lidoflanine)、六硝酸甘露醇酯(mannitol hexanitrane)、美地巴嗪(medibazine)、nicorglycerin、四硝酸季戊四醇酯(pentaerythritol tetranitrate)、戊硝醇(pentrinitrol)、哌克昔林(perhexiline)、匹美茶碱(pimefylline)、曲匹地尔(trapidil)、3-甲色酮(tricromyl)、曲美他嗪(trimetazidine)、磷酸三乙硝胺(trolnitrate phosphate)和维斯那定(visnadine)。
在某些实施方案中，血管扩张药可包含长期疗法血管扩张药或高血压突发血管扩张药。长期疗法血管扩张药的非限制性例子包括肼屈嗪(hydralazine)(apresoline)和米诺地尔(minoxidil)(loniten)。高血压突发血管扩张药的非限制性例子包括硝普盐(nitroprusside)(nipride)、二氮嗪(diazoxide)(hyperstat IV)、肼屈嗪(hydralazine)(apresoline)、米诺地尔(minoxidil)(loniten)和维拉帕米(verapamil)。
混杂型抗高血压药的非限制性例子包括阿义马林(ajmaline)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)、丁苯碘氨(bufeniode)、西氯他宁(cicletainine)、环西多明(ciclosidomine)、鞣酸绿藜胺(cryptenamine tannate)、非诺多泮(fenoldopam)、氟司喹南(flosequinan)、酮色林(ketanserin)、美布氨酯(mebutamate)、美卡拉明(mecamylamine)、甲基多巴(methyldopa)、甲基4-吡啶基酮氨硫脲(methyl4-pyridyl ketone thiosemicarbazone)、莫唑胺(muzolimine)、帕吉林(pargyline)、潘必啶(pempidine)、吡那地尔(pinacidil)、哌罗克生(piperoxan)、普立哌隆(primaperone)、原藜芦碱(protoveratrine)、罗巴新(raubasine)、瑞西美托(rescimetol)、利美尼定(rilmenidene)、沙拉新(saralasin)、硝普钠(sodiumnitrorusside)、替尼酸(ticrynafen)、樟脑磺酸曲美芬(trimethaphan camsylate)、酪氨酸酶(tyrosinase)和乌拉地尔(urapidil)。
在某些实施方案中，抗高血压药可包含芳基乙醇胺衍生物、苯并噻二嗪衍生物、N-羧基烃基(肽/内酰胺)衍生物、二氢吡啶衍生物、胍衍生物、肼/酞嗪、咪唑衍生物、季铵化合物、利舍平衍生物或磺磷酰胺衍生物。
芳基乙醇胺的非限制性例子包括氨磺洛尔(amosulalol)、丁呋洛尔(bufuralol)、地来洛尔(dilevalol)、拉贝洛尔(labetalol)、丙萘洛尔(pronethalol)、索他洛尔(sotalol)和硫氧洛尔(sulfinalol)。
苯并噻二嗪衍生物的非限制性例子包括阿尔噻嗪(althizide)、苄氟噻嗪(bendroflumethiazide)、苄噻嗪(benzthiazide)、苄氢氯噻嗪(benzylhydrochlorothiazide)、布噻嗪(buthiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、环戊噻嗪(cyclopenthiazide)、环噻嗪(cyclothiazide)、二氮嗪(diazoxide)、依匹噻嗪(epithiazide)、乙噻嗪(ethiazide)、芬噻嗪(fenquizone)、氢氯噻嗪(hydrochlorothizide)、氢氟噻嗪(hydroflumethizide)、甲氯噻嗪(methyclothiazide)、美替克仑(meticrane)、美托拉宗(metolazone)、对氟噻嗪(paraflutizide)、泊利噻嗪(polythizide)、四氯噻嗪(tetrachlormethiazide)和三氯噻嗪(trichlormethiazide)。
N-羧基烃基(肽/内酰胺)衍生物的非限制性例子包括阿拉普利(alacepril)、卡托普利(captopril)、西拉普利(cilazapril)、地拉普利(delapril)、依那普利(enalapril)、依那普利拉(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、莫维普利(moveltipril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril)。
二氢吡啶衍生物的非限制性例子包括氨氯地平(amlodipine)、非洛地平(felodipine)、伊拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼伐地平(nilvadipine)、尼索地平(nisoldipine)和尼群地平(nitrendipine)。
胍衍生物的非限制性例子包括倍他尼定(bethanidine)、异喹胍(debrisoquin)、胍那苄(guanabenz)、胍那克林(guanacline)、胍那决尔(guanadrel)、胍那佐定(guanazodine)、胍乙啶(guanethidine)、胍法辛(guanfacine)、胍氯酚(guanochlor)、胍诺沙苄(guanoxabenz)和胍生(guanoxan)。
肼/酞嗪的非限制性例子包括布屈嗪(budralazine)、卡屈嗪(cadralazine)、双肼屈嗪(dihydralazine)、恩屈嗪(endralazine)、肼卡巴嗪(hydracarbazine)、肼屈嗪(hydralazine)、苯异丙肼(pheniprazine)、匹尔屈嗪(pildralazine)和托屈嗪(todralazine)。
咪唑衍生物的非限制性例子包括可乐定(clonidine)、洛非西定(lofexidine)、酚妥拉明(phentolamine)、噻美尼定(tiamenidine)和托洛尼定(tolonidine)。
季铵化合物的非限制性例子包括溴化氮戊铵(azamethonium bromide)、松达氯铵(chlorisondamine chloride)、六甲季铵(hexamethonium)、二甲硫酸氰戊吗啉(pentacynium bis(methylsulfate))、五甲溴铵(pentamethonium bromide)、酒石酸喷托铵(pentolinium tartrate)、芬托氯铵(phenactropinium chloride)和甲硫曲美替定(trimethidinium methosulfate)。
利舍平衍生物的非限制性例子包括比他舍平(bietaserpine)、地舍平(deserpidine)、瑞西那明(rescinnamine)、利舍平(reserpine)和昔洛舍平(syrosingopine)。
磺胺衍生物的非限制性例子包括安布赛特(ambuside)、氯帕胺(clopamide)、呋塞米(furosemide)、吲达帕胺(indapamide)、喹乙宗(quinethazone)、曲帕胺(tripamide)和希帕胺(xipamide)。
血管加压药一般用来在手术期间可能发生的休克期间提高血压。血管加压药(也称作抗低血压药)的非限制性例子包括氨甲氧苯嗪甲基硫酸盐(amezinium methyl sulfate)、血管紧张素酰胺(angiotensin amide)、二甲福林(dimetofrine)、多巴胺(dopamine)、依替非明(etifelmin)、依替福林(etilefrin)、吉培福林(gepefrine)、间羟胺(metaraminol)、米多君(midodrine)、去甲肾上腺素(norepinephrine)、福来君(pholedrine)和昔奈福林(synephrine)。
用于治疗充血性心力衰竭的药剂的非限制性例子包括抗血管紧张素II药、后负荷-前负荷减轻处理(afterload-preload reduction treatment)、利尿药和肌力药(inotropic agent)。
在某些实施方案中，可以用组合疗法来治疗不能耐受血管紧张素拮抗剂的动物受试者。此类疗法可组合肼屈嗪(hydralazine)(阿比西林(apresoline))和二硝酸异山梨醇(isosorbide dinitrate)(isordil、sorbitrate)的施用。
利尿药的非限制性例子包括噻嗪或苯并噻二嗪衍生物(例如阿尔噻嗪(althiazide)、苄氟噻嗪(bendroflumethazide)、苄噻嗪(benzthiazide)、苄氢氯噻嗪(benzylhydrochlorothiazide)、布噻嗪(buthiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、氯噻嗪(chlorothiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、环戊噻嗪(cyclopenthiazide)、依匹噻嗪(epithiazide)、乙噻嗪(ethiazide)、乙噻嗪(ethiazide)、芬喹唑(fenquizone)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、氢氟噻嗪(hydroflumethiazide)、甲氯噻嗪(methyclothiazide)、美替克仑(meticrane)、美托拉宗(metolazone)、对氟噻嗪(paraflutizide)、泊利噻嗪(polythizide)、四氯噻嗪(tetrachloromethiazide)、三氯噻嗪(trichlormethiazide))、有机汞(例如氯汞君(chlormerodrin)、美拉鲁利(meralluride)、汞罗茶碱(mercamphamide)、硫汞林钠(mercaptomerin sodium)、汞香豆酸(mercumallylic acid)、汞香豆林钠(mercumatilin dodium)、氯化亚汞(mercurous chloride)、汞撒利(mersalyl))、蝶啶(例如呋氨蝶啶(furterene)、氨苯蝶啶(triamterene))、嘌呤(例如acefylline、7-吗啉甲茶碱(7-morpholinomethyltheophylline)、pamobrom、丙可可碱(protheobromine)、可可碱(theobromine))、类固醇包括醛甾酮拮抗剂(例如坎利酮(canrenone)、夹竹桃苷(oleandrin)、螺内酯(spironolactone))、磺胺衍生物(例如乙酰唑胺(acetazolamide)、安布赛特(ambuside)、阿佐塞米(azosemide)、布美他尼(bumetanide)、布他唑胺(butazolamide)、氯米非那胺(chloraminophenamide)、氯非那胺(clofenamide)、氯帕胺(clopamide)、氯索隆(clorexolone)、二苯甲烷-4，4′-二磺胺(diphenylmethane-4，4′-disulfonamide)、二磺法胺(disulfamide)、依索唑胺(ethoxzolamide)、呋塞米(furosemide)、吲达帕胺(indapamide)、美夫西特(mefruside)、醋甲唑胺(methazolamide)、吡咯他尼(piretanide)、喹乙宗(quinethazone)、托拉塞米(torasemide)、曲帕胺(tripamide)、希帕胺(xipamide))、尿嘧啶(例如氨美啶(aminometradine)、阿米美啶(amisometradine))、保钾拮抗剂(potassium sparing antagonist)(例如阿米洛利(amiloride)、氨苯蝶啶(triamterene))或混杂利尿药(诸如aminozine、熊果苷(arbutin)、氯拉扎尼(chlorazanil)、依地尼酸(ethacrynic acid)、依托唑啉(etozolin)、肼卡巴嗪(hydracarbazine)、异山梨醇(isosorbide)、甘露醇(mannitol)、美托查酮(metochalcone)、莫唑胺(muzolimine)、哌克昔林(perhexiline)、替尼酸(ticrnafen)和尿素)。
正性肌力药(也称作强心剂)的非限制性例子包括acefylline、醋洋地黄毒苷(acetyldigitoxin)、2-氨基-4-皮考啉(2-amino-4-picoline)、氨力农(amrinone)、琥珀苯呋地尔(benfurodil hemisuccinate)、布拉地新(bucladesine)、cerberosine、樟吡他胺(camphotamide)、铃兰毒苷(convallatoxin)、磁麻苷(cymarin)、地诺帕明(denopamine)、去乙酰毛花苷(deslanoside)、吉他林(digitalin)、洋地黄(digitalis)、洋地黄毒苷(digitoxin)、地高辛(digoxin)、多巴酚丁胺(dobutamine)、多巴胺(dopamine)、多培沙明(dopexamine)、依诺昔酮(enoximone)、红皮素(erythrophleine)、非那可明(fenalcomine)、吉他林(gitalin)、芰毒素(gitoxin)、胍基乙酸(glycocyamine)、辛胺醇(heptaminol)、白毛茛分碱(hydrastinine)、异波帕胺(ibopamine)、毛花苷(lanatoside)、甲氧酚酰胺(metamivam)、米力农(milrinone)、黄花夹竹桃次苷B(nerifolin)、夹竹桃苷(oleandrin)、乌巴音(ouabain)、奥昔非君(oxyfedrine)、普瑞特罗(prenalterol)、proscillaridine、残余蟾蜍配基(resibufogenin)、海葱苷(scillaren)、海葱苷(scillarenin)、strphanthin、硫马唑(sulmazole)、可可碱(theobromine)和扎莫特罗(xamoterol)。
在具体的实施方案中，肌力药是心脏糖苷、β-肾上腺素能激动剂或磷酸二酯酶抑制剂。心脏糖苷的非限制性例子包括地高辛(digoxin)(拉诺辛(lanoxin))和洋地黄毒苷(digitoxin)(crystodigin)。β-肾上腺素能激动剂的非限制性例子包括沙丁胺醇(albuterol)、班布特罗(bambuterol)、比托特罗(bitolterol)、卡布特罗(carbuterol)、克仑特罗(clenbuterol)、氯丙那林(clorprenaline)、地诺帕明(denopamine)、双羟乙麻黄碱(dioxethedrine)、多巴酚丁胺(dobutamine)(独步催(dobutrex))、多巴胺(dopamine)(intropin)、多培沙明(dopexamine)、麻黄碱(ephedrine)、乙非君(etafedrine)、乙基去甲肾上腺素(ethylnorepinephrine)、非诺特罗(fenoterol)、福莫特罗(formoterol)、海索那林(hexoprenaline)、异波帕胺(ibopamine)、乙基异丙肾上腺素(isoetharine)、异丙肾上腺素(isoproterenol)、马布特罗(mabuterol)、奥西那林(metaproterenol)、甲氧那明(methoxyphenamine)、奥昔非君(oxyfedrine)、吡布特罗(pirbuterol)、丙卡特罗(procaterol)、普罗托醇(protokylol)、瑞普特罗(reproterol)、利米特罗(rimiterol)、利托君(ritodrine)、索特瑞醇(soterenol)、特布他林(terbutaline)、曲托喹酚(tretoquinol)、妥洛特罗(tulobuterol)和扎莫特罗(xamoterol)。磷酸二酯酶抑制剂的非限制性例子包括氨力农(amrinone)(inocor)。
抗心绞痛药可包括有机硝酸盐(organonitrate)、钙通道阻滞剂、β-阻滞剂及其组合。
有机硝酸盐(也称作硝酸血管扩张药)的非限制性例子包括硝酸甘油(nitro-bid、nitrostat)、二硝酸异山梨醇(isordil、sorbitrate)和亚硝酸异戊酯(amylnitrate)(aspirol、vaporole)。
内皮缩血管肽(ET)是一种21个氨基酸的肽，其具有有力的生理学和病理生理学效应，它们似乎涉及心力衰竭的形成。ET的效果经由与两类细胞表面受体的相互作用来介导。A型受体(ET-A)与血管收缩和细胞生长有关，而B型受体(ET-B)与内皮细胞介导的血管舒张和其它神经激素(诸如醛甾酮)的释放有关。能抑制ET的生成或其刺激有关细胞的能力的药理学药剂是本领域已知的。抑制ET的生成涉及使用阻断称作内皮缩血管肽转化酶的酶的药剂，内皮缩血管肽转化酶涉及自前体加工有活性的肽。抑制ET刺激细胞的能力涉及使用阻断ET与其受体相互作用的药剂。内皮缩血管肽受体拮抗剂(ERA)的非限制性例子包括波生坦(Bosentan)、恩拉生坦(Enrasentan)、Ambrisentan、达卢生坦(Darusentan)、替唑生坦(Tezosentan)、阿曲生坦(Atrasentan)、Avosentan、Clazosentan、Edonentan、sitaxsentan、TBC 3711、BQ 123、和BQ 788。
在某些实施方案中，第二治疗剂可包括一些类型的手术，这包括例如预防性的、诊断性的或分期的、治疗性的(curative)和治标性的手术。手术(特别是治疗性手术)可以与其它疗法(诸如本发明和一种或多种其它药剂)联合。
此类用于血管和心血管疾病和病症的手术治疗剂是本领域技术人员公知的，而且可以包括但不限于对生物体实施手术、提供心血管机械假体、血管成形术、冠状动脉再灌注、导管消融、给受试者提供埋藏式复率除颤器、机械循环支持或其组合。本发明中可使用的机械循环支持的非限制性例子包括主动脉内球囊反搏、左心室辅助装置或其组合。
治疗肌肉骨骼疾病的方法
本发明还提供了降低骨骼肌细胞中的快速骨骼肌收缩蛋白质基因的表达或活性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对骨骼肌细胞施用miR-499和/或miR-208b。
在两个miR-208等位基因都缺失的小鼠的心脏中观察到数种快速骨骼肌收缩蛋白质基因的上调。miR-208敲除小鼠的心脏中快速骨骼肌收缩蛋白质基因的这种上调指示miR-208在正常情况中发挥遏制快速骨骼肌基因程序的功能。在miR-208突变小鼠中观察到伴随的miR-499表达降低，提示miR-499可能还负面地调节快速骨骼肌收缩蛋白质基因的表达。由β-MHC基因的内含子编码的miR-208b与miR-208只相差三个碱基，而且仅仅在心脏和慢速骨骼肌肉中表达。如此，miR-208b可能还调节快速骨骼肌基因程序和决定纤维身份。
在骨骼肌中，对慢速纤维基因的遏制和对快速纤维基因的激活与众多肌肉骨骼病症有关，包括但不限于失用性萎缩、响应反重力而发生的肌肉萎缩、和去神经。如此，miR-208、miR-208b、或miR-499在骨骼肌细胞中的表达在遏制快速纤维基因并由此激活相反的慢速纤维基因表达中可能是有用的。因而，本发明还涵盖用于在有所需要的受试者中治疗或预防肌肉骨骼病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括鉴定具有肌肉骨骼病症或有肌肉骨骼病症风险的受试者，并提高所述受试者的骨骼肌细胞中miR-499和/或miR-208b的表达和/或活性。在一些实施方案中，提高miR-499和/或miR-208b的表达和/或活性可包括对具有肌肉骨骼病症或有风险发生肌肉骨骼病症的受试者的骨骼肌施用miR-499和/或miR-208b的激动剂。在另一个实施方案中，本发明提供了通过对骨骼肌施用miR-499和/或miR-208b的激动剂来治疗或预防响应降低的重力环境而发生的肌肉萎缩的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了通过对骨骼肌施用miR-499或miR-208b来治疗或预防肌肉萎缩的方法。
另外，本文所示结果提示通过提高miR-499或miR-208b表达来增强慢速纤维基因表达的策略可用于提升胰岛素敏感性。骨骼肌占据人类中胰岛素刺激的葡萄糖摄取的大半。胰岛素抗性是一种在具有II型糖尿病的患者中看到的胰岛素刺激的葡萄糖摄取的缺陷。在胰岛素抗性与慢速对快速颤动肌肉纤维的百分比之间有正关联。如此，在另一个实施方案中，本发明涵盖提升骨骼肌中胰岛素敏感性的方法，包括提高骨骼肌细胞中miR-499和/或miR-208b的表达和/或活性。
在本发明的一些实施方案中，提高细胞中miR-499或miR-208b的表达或活性可包括施用miR-499或miR-208b的激动剂。在一个实施方案中，miR-499或miR-208b的激动剂可以是包含成熟miR-499或miR-208b序列的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27。在另一个实施方案中，所述miR-499或miR-208b激动剂可以是包含miR-499或miR-208b之pri-miRNA或pre-miRNA序列的多核苷酸。所述包含成熟miR-499或miR-208b序列的多核苷酸可以是单链的或双链的。所述多核苷酸可含有一处或多处化学修饰，诸如锁定核酸(locked nucleic acid)、肽核酸、糖修饰(诸如2′-O-烃基(例如2′-O-甲基、2′-O-甲氧乙基)、2′-氟、和4′-硫修饰)、和主链修饰(诸如一个或多个硫代硫酸酯、吗啉代、或膦羧酸酯连接。在一个实施方案中，所述包含miR-499或miR-208b序列的多核苷酸偶联有胆固醇。在另一个实施方案中，所述miR-499或miR-208b激动剂可以是不同于miR-499或miR-208b，起提高、补充、或代替miR-499和/或miR-208b功能的作用的药剂。
在另一个实施方案中，可以在体内自载体表达所述miR-499或miR-208b激动剂。“载体”指可用于将感兴趣核酸递送至细胞内部的物质组合物。本领域已知众多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子的或两亲性的化合物有关的多核苷酸、质粒、和病毒。如此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。病毒载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、等等。表达构建体能在活细胞中复制，或者它能合成制备。为了本申请，术语“表达构建体”、“表达载体”、和“载体”可互换使用，以一般性的、例示性的意义演示本发明的应用，而且并非意图限制本发明。
在一个实施方案中，用于表达miR-499或miR-208b的表达载体包含与编码miR-499或miR-208b的多核苷酸“可操作连接”的启动子。如本文中所使用的，短语“可操作连接”或“在转录控制下”意味着启动子相对于多核苷酸处于正确的定位和取向以控制RNA聚合酶进行的转录的和多核苷酸的表达的启动。编码miR-499的多核苷酸可编码一级微小RNA-499序列(pri-miR-499)、前体微小RNA-499序列(pre-miR-499)或成熟miR-499序列。编码miR-208b的多核苷酸可编码一级微小RNA-208b序列(pri-miR-208b)、前体微小RNA-208b序列(pre-miR-208b)或成熟miR-208b序列。在一些实施方案中，所述表达载体包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27。所述包含序列SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27的多核苷酸可以是长约18个至约2000个核苷酸、长约70个至约200个核苷酸、长约20个至约50个核苷酸、或长约18个至约25个核苷酸。在其它实施方案中，所述编码miR-499或miR-208b的多核苷酸位于编码内含子的核酸中或编码mRNA之非翻译区的核酸中或非编码RNA中。在一个实施方案中，所述表达构建体可包含来自Myh7b基因第20内含子的序列。在另一个实施方案中，所述表达构建体可包含来自Myh7(β-MHC)基因第31内含子的序列。
在另一个实施方案中，表达载体可用于将miR-499和/或miR-208b的抑制剂递送至细胞或受试者。用于表达miR-499或miR-208b抑制剂的表达载体包含与编码反义寡核苷酸的多核苷酸可操作连接的启动子，其中所表达的反义寡核苷酸的序列与成熟miR-499或miR-208b序列部分或完美互补。在又一个实施方案中，用于表达miR-499或miR-208b抑制剂的表达载体包含与编码shRNA或siRNA的多核苷酸可操作连接的一个或多个启动子，其中所表达的shRNA或siRNA包含与成熟miR-499或miR-208b序列相同或部分相同的序列。“部分相同”指与靶多核苷酸序列至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的序列。
贯穿本申请，术语“表达构建体”意图包括任何类型的遗传构建体，其包含编码基因产物的核酸，其中部分或整个核酸编码序列能够被转录。所述转录物可被翻译成蛋白质，但不是必须的。在一些实施方案中，表达只包括编码感兴趣基因的核酸的转录。
在某些实施方案中，编码感兴趣多核苷酸的核酸在启动子的转录控制下。“启动子”指受到细胞的合成机械、或导入的合成机械识别，启动基因的特异性转录所需要的DNA序列。术语启动子在本文中会用于指在RNA聚合酶的启动位点周围聚簇的一组转录控制模块。关于如何组织启动子的许多思考衍生自对数种病毒启动子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元的。这些研究(得到最近工作的扩充)显示了启动子是由离散功能模块构成的，其中每个模块由大约7-20bp DNA组成，且含有转录激活物或阻抑物蛋白质的一个或多个识别位点。
每种启动子中的至少一个模块发挥定位RNA合成起始位点的功能。这知道得最多的例子是TATA盒，但是在一些缺少TATA盒的启动子中，诸如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，与起始位点自身交叠的一个离散元件有助于固定启动位置。
别的启动子元件调节转录起始的频率。典型的是，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管许多启动子最近显示出在起始位点下游也含有功能元件。各启动子元件间的间距通常是灵活的，使得当各元件彼此相对被倒置或移动时启动子功能得到保留。在tk启动子中，各启动子元件间的间距能增加至相距50bp，之后活性才开始下降。取决于启动子，各元件表现出能协同地或独立地发挥激活转录的功能。
在其它实施方案中，人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子、SV40早期启动子、劳氏肉瘤病毒长末端重复、大鼠胰岛素启动子、RNA pol III启动子、和甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子可用于获得感兴趣多核苷酸的高水平表达。还涵盖本领域公知的用于实现感兴趣多核苷酸表达的其它病毒或哺乳动物细胞或细菌噬菌体启动子的使用，只要表达水平对于给定目的是足够的。
通过采用具有公知特性的启动子，可优化转染或转化后感兴趣多核苷酸的表达水平和样式。另外，响应特定生理学信号而受到调节的启动子的选择能容许基因产物的诱导型表达。表1和表2列举了在本发明的背景中可采用来调节感兴趣基因表达的数种调节元件。此列表并非意图是穷尽提高基因表达所涉及的所有可能的元件，但是仅仅是它们的例示。
增强子是提高来自位于同一DNA分子上不同位置处的启动子的转录的遗传元件。增强子的组织与启动子很像。也就是说，它们由许多单独的元件构成，其中每个元件结合一种或多种转录蛋白。
增强子与启动子之间的基本区别是运作。增强子区作为整体必须能够刺激远处的转录；而启动子区或其构成元件不必如此。另一方面，启动子必须具有一种或多种指导特定位点处和特定取向的RNA合成启动的元件，而增强子缺少这些特异性。启动子和增强子常常是交叠的且毗邻的，常常表现出具有非常相似地模块组构。
下文是可以在表达构建体中与编码感兴趣基因的核酸组合使用的病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子的列表(表1和表2)。另外，也可以使用任何启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库EPDB)来驱动所述基因的表达。如果提供适宜的细菌聚合酶(或是作为递送复合物的一部分或是作为另外的基因表达构建体)的话，真核细胞能支持来自某些细菌启动子的细胞质转录。
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特别感兴趣的是肌肉特异性启动子(例如肌肉肌酸激酶)，更特别的是心脏特异性启动子。这些包括肌球蛋白轻链-2启动子(Franz等，1994；Kelly等，1995)、α肌动蛋白启动子(Moss等，1996)、肌钙蛋白1启动子(Bhavsar等，1996)、Na+/Ca2+交换器启动子(Barnes等，1997)、抗肌萎缩蛋白启动子(Kimura等，1997)、α7整联蛋白启动子(Ziober和Kramer，1996)、脑钠肽启动子(LaPointe等，1996)和αB-晶体蛋白/小热休克蛋白启动子(Gopal-Srivastava，1995)、α肌球蛋白重链启动子(Yamauchi-Takihara等，1989)和ANF启动子(LaPointe等，1988)。
在采用cDNA插入物的情况中，通常会希望包括聚腺苷酸化信号来实现基因转录物的正确聚腺苷酸化。认为聚腺苷酸化信号的本质对于本发明的成功实施不是至关重要的，而且可采用任何此类序列，诸如人生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。作为表达盒元件还涵盖终止子。这些元件能用来增强信息水平和自该盒进入其它序列的通读最小化。
在本发明的某些实施方案中，含有本发明核酸构建体的细胞可以在体外或在体内通过在表达构建体中包括标志物来鉴定。此类标志物会赋予细胞以可鉴定的变化，容许容易地鉴定含有表达构建体的细胞。通常，包括药物选择标志物有助于克隆和选择转化体，例如赋予针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志。或者，可采用酶，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。还能采用免疫学标志物。认为所采用的选择标志不是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达。选择标志的其它例子是本领域技术人员公知的。
有多种方式可将表达载体导入细胞中。在本发明的某些实施方案中，表达构建体包含病毒或自病毒基因组衍生的工程改造的构建体。某些病毒经受体介导的胞吞进入细胞、整合入宿主细胞基因组和稳定且高效表达病毒基因的能力使得它们成为将外来基因转移入哺乳动物细胞中的诱人候选(Ridgeway，1988；Nicolas和Rubenstein，1988；Baichwal和Sugden，1986；Temin，1986)。
用于体内递送的优选方法之一涉及使用腺病毒表达载体。“腺病毒表达载体”意图包括那些含有足以(a)支持构建体的包装和(b)表达其中克隆的多核苷酸的腺病毒序列的构建体。表达载体包含遗传工程形式的腺病毒。关于腺病毒(一种36kB，线性，双链DNA病毒)的遗传组构的知识容许用长达7kB的外来序列替代大段腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒形成对比，宿主细胞的腺病毒感染不导致染色体整合，因为腺病毒DNA能以附加体方式复制，没有潜在的遗传毒性。而且，腺病毒在结构上是稳定的，而且广泛扩增后没有检测到基因组重排。腺病毒能感染实际上所有上皮细胞，不管它们的细胞周期阶段。
腺病毒特别适合于用作基因转移载体，因为它有中等大小的基因组、易于操作、滴度高、靶细胞范围广且感染性高。该病毒基因组的两个末端都含有100-200个碱基对的反向重复(ITR)，它们是病毒DNA复制和包装所必需的顺式元件。
在腺病毒载体是复制缺陷的或至少条件性缺陷的要求之外，认为腺病毒载体的本质对于本发明的成功实施不是至关重要的。所述腺病毒可以是42种不同的已知血清型或亚群A-F中的任一种。为了获得供本发明中使用的条件性复制缺陷型腺病毒载体，亚群C的5型腺病毒是优选的起始材料。这是因为5型腺病毒是人腺病毒，关于它知道极多的生化和遗传信息，而且它在历史上用于大多数采用腺病毒作为载体的构建。
如上所述，依照本发明的典型载体是复制缺陷的，而且不会具有腺病毒E1区。如此，在消除E1编码序列的位置导入编码感兴趣基因的多核苷酸会是最方便的。然而，腺病毒序列内插入构建体的位置对于本发明不是至关重要的。也可以将编码感兴趣基因的多核苷酸插入E3置换型载体中，代替被缺失的E3区，如Karlsson等(1986)所述，或者在E4区中，在这种情况中辅助细胞系或辅助病毒补足E4缺陷。
腺病毒载体已经用于真核基因表达(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1991)。最近，动物研究提示重组腺病毒可用于基因疗法(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。对不同组织施用重组腺病毒的研究包括气管滴注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周静脉内注射(Herz和Gerard，1993)和定向(stereotactic)接种入脑中(Le Gal La Salle等，1993)。
逆转录病毒载体也适合于在细胞中表达本发明的多核苷酸。逆转录病毒是以在受感染细胞中通过逆转录过程将它们的RNA转变成双链DNA的能力为特征的一组单链RNA病毒(Coffin，1990)。然后所得DNA稳定整合入细胞染色体中，作为原病毒，并指导病毒蛋白质的合成。所述整合导致病毒基因序列在受体细胞及其后代中的保持。逆转录病毒基因组含有分别编码壳体蛋白、聚合酶、和包膜成分的三种基因，即gag、pol、和env。在gag基因上游找到的一段序列含有将基因组包装入病毒体中的信号。在病毒基因组的5′和3′末端存在两段长末端重复(LTR)序列。这些含有强启动子和增强子序列，而且还是整合入宿主细胞基因组所需要的(Coffin，1990)。
为了构建逆转录病毒载体，将编码感兴趣基因的核酸插入病毒基因组中，代替某些病毒序列，以生成复制缺陷型病毒。为了生成病毒体，构建含有gag、pol、和env基因但没有LTR和包装构件的包装细胞系(Mann等，1983)。当含有cDNA以及逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒被导入此细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)时，包装序列容许重组质粒的RNA转录物被包装入病毒颗粒中，然后分泌入培养物的培养基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染极其多种细胞类型。然而，整合和稳定表达要求宿主细胞分裂(Paskind等，1975)。
可采用其它病毒载体作为本发明中的表达构建体。可采用自诸如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、腺伴随病毒(AAV)(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Hermonat和Muzycska，1984)和疱疹病毒等病毒衍生的载体。它们为各种哺乳动物细胞提供数项诱人特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。
为了实现有义或反义基因构建体的表达，必须将表达构建体递送入细胞中。此递送可以在体外(像用于转化细胞系的实验室规程中)或者在体内或回体(像某些疾病状态的治疗中)实现。一种递送机制是经病毒感染，其中将表达构建体包裹在感染性病毒颗粒的壳体中。
本发明还涵盖用于将表达构建体转移入培养的哺乳动物细胞中的数种非病毒方法。这些包括磷酸钙沉淀(Graham和Van Der Eb，1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)、DEAE-右旋糖苷(Gopal，1985)、电穿孔、(Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)、直接显微注射、(Harland和Weintraub，1985)、加载了DNA的脂质体(Nicolau and Sene，1982；Fraley等，1979)和Lipofectamine-DNA复合物、细胞超声处理(Fechheimer等，1987)、使用高速微弹进行的基因轰击(Yang等，1990)、和受体介导的转染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。这些技术中的一些可成功适应体内或回体使用。
一旦已经将表达构建体递送入细胞中，编码感兴趣基因的核酸可以在不同部位定位和表达。在某些实施方案中，编码基因的核酸可以稳定整合入细胞的基因组中。此整合可以经同源重组而处于相关定位和取向(基因替代)，或者它可以以随机的、非特异性的位置整合(基因增强)。在还有一些实施方案中，核酸可以作为分开的、附加型的DNA区段在细胞中稳定维持。此类核酸区段“附加体”编码足以容许不依赖宿主细胞周期地或与宿主细胞周期同步地维持和复制的序列。如何将表达构建体递送至细胞和核酸在细胞中保持在何处取决于所采用的表达构建体的类型。
在本发明的还有一个实施方案中，表达构建体可以仅仅由裸的重组DNA或质粒组成。所述构建体的转移可以通过上文所述物理或化学透化细胞膜的任何方法来实施。这特别适用于体外转移，但是它也可应用于体内使用。Dubensky等(1984)成功地以磷酸钙沉淀物的形式将多瘤病毒DNA注射入成年和新生小鼠的肝和脾中，展现出活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也证明了直接腹膜内注射磷酸钙沉淀的质粒导致所转染基因的表达。也可以在体内以相似方式转移编码感兴趣基因的DNA并表达基因产物。
在本发明的还有一个实施方案中，将裸的DNA表达构建体转移入细胞中可涉及颗粒轰击。此方法依赖于将DNA包被的微弹加速至高速的能力，所述高速容许微弹穿透细胞膜并进入细胞，但不杀死它们(Klein等，1987)。已经开发了数种用于加速小颗粒的装置。一种这样的装置依赖于高压放电来产生电流，该电流继而提供原动力(Yang等，1990)。所使用的微弹由生物学惰性物质组成，诸如钨或金珠。
已经在体内轰击了大鼠和小鼠的选定器官，包括肝、皮肤、和肌肉组织(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。这可能要求手术暴露组织或细胞，以消除枪与靶器官之间的任何居间组织，即回体处理。再次，编码特定基因的DNA可以经此方法递送，而且仍然收入本发明。
在本发明的又一个实施方案中，可以将表达构建体封装在脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有多个由水介质隔开的脂质层。它们在将磷脂悬浮在过量的水溶液中时自发形成。脂质成分在形成闭合的结构之前经历自我重排并在脂质双层间封装水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。还涵盖Lipofectamine-DNA复合物。
体外脂质体介导的核酸递送和外来DNA表达已经非常成功。Wong等，(1980)在培养的鸡胚、HeLa和肝瘤细胞中证明了脂质体介导的外来DNA递送和表达的可行性。Nicolau等，(1987)在大鼠中在静脉内注射后实现了成功的脂质体介导的基因转移。
在本发明的某些实施方案中，可以将脂质体与血细胞凝集病毒(HVJ)复合。这显示出促进与细胞膜的融和和提升脂质体封装的DNA进入细胞(Kaneda等，1989)。在其它实施方案中，可以将脂质体与细胞核中非组蛋白的染色体蛋白质(HMG-I)复合或联合采用(Kato等，1991)。在还有一些实施方案中，可以将脂质体与HVJ和HMG-I二者复合或联合采用。由于此类表达构建体已经成功用于体外和体内核酸转移和表达，所以它们适用于本发明。在DNA构建体中采用细菌启动子的情况中，还会希望在脂质体内包括适宜的细菌聚合酶。
其它能采用来将编码特定基因的核酸递送入细胞中的表达构建体是受体介导的递送媒介物(vehicle)。这些利用几乎在所有真核细胞中的受体介导的胞吞对高分子的选择性摄取。因为各种受体的细胞类型特异性分布，所以所述递送会是高度特异性的(Wu和Wu，1993)。
受体介导的基因靶向媒介物一般由两种成分组成：细胞受体特异性配体和DNA结合剂。数种配体已经用于受体介导的基因转移。最广泛表征的配体是脱唾液酸血清类粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987)和运铁蛋白(Wagner等，1990)。最近，一种合成的拟糖蛋白(neoglycoprotein)(其与ASOR识别相同受体)已经用作基因递送媒介物(Ferkol等，1993；Perales等，1994)，而且表皮生长因子(EGF)也已经用于将基因递送至鳞癌细胞(Myers，EPO 0273085)。
在其它实施方案中，递送媒介物可包含配体和脂质体。例如，Nicolau等(1987)采用掺入脂质体中的乳糖基-神经酰胺(一种末端为半乳糖的脱唾液酸的神经节苷脂)，并观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取增加。如此，可行的是也可以通过多种受体-配体系统在有或无脂质体的情况中将编码特定基因的核酸特异性递送入某细胞类型中。例如，表皮生长因子(EGF)可用作受体，用于介导将核酸递送入展现出EGF受体上调的细胞中。甘露糖可用于靶向肝细胞上的甘露糖受体。而且，针对CD5(CLL)、CD22(淋巴瘤)、CD25(T细胞白血病)和MAA(黑素瘤)的抗体能类似地用作靶向模块。
在一个具体的例子中，可以与阳离子脂质组合地施用多核苷酸。阳离子脂质的例子包括但不限于Lipofectin、DOTMA、DOPE、和DOTAP。WO/0071096(通过述及明确收入本文)的公开文本记载了不同配制剂，诸如能有效用于基因疗法的DOTAP:胆固醇或胆固醇衍生物配制剂。其它公开文本也讨论了不同脂质或脂质体配制剂，包括纳米颗粒和施用方法；这些包括但不限于美国专利公开文本20030203865，20020150626，20030032615，和20040048787，通过述及明确收入本文，其程度为它们公开了施用和递送核酸的配制剂和其它相关方面。用于形成颗粒的方法还记载于美国专利5,844,107，5,877,302，6,008,336，6,077,835，5,972,901，6,200,801，和5,972,900，那些方面通过述及而收入本文。
在某些实施方案中，可以在回体(ex vivo)条件下更容易地实施基因转移。回体基因疗法指自动物分离细胞，在体外将核酸递送入细胞中，然后将经修饰的细胞返还入动物中。这可涉及自动物手术取出组织/器官或细胞和组织的原代培养。
用于对受试者施用的药物配制剂和路径
本发明还涵盖包含miR-499和/或miR-208b抑制剂或激动剂的药物组合物。在临床应用的情况中，药物组合物会以对于预定应用适宜的形式制备。一般而言，这会需要制备基本上不含热原以及其它对人类或动物会有害的杂质的组合物。
可以使用胶状分散系统(诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠、和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束(micelle)、混合胶束、和脂质体)作为微小RNA功能的寡核苷酸抑制剂或表达特定微小RNA的构建体的递送媒介物。对于将本发明的核酸递送至心肌和骨骼肌组织合适地商品化脂肪乳剂包括
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II、III、Nutrilipid、和其它类似的脂质乳剂。一种作为体内递送媒介物使用的优选的胶状系统是脂质体(即人工膜囊泡)。此类系统的制备和使用是本领域公知的。例示性的配制剂还披露于US 5,981,505；US 6,217,900；US 6,383,512；US 5,783,565；US7,202,227；US 6,379,965；US 6,127,170；US 5,837,533；US 6,747,014；和WO03/093449，通过述及完整收入本文。
一般会希望采用适宜的盐和缓冲剂来使得递送媒介物稳定且容许被靶细胞摄取。当将重组细胞导入受试者中时，也会采用缓冲液。本发明的水性组合物包含有效量的递送媒介物，其包含溶解或分散在药学可接受载体或水性介质中的抑制剂多核苷酸或miRNA多核苷酸序列(例如脂质体或其它复合物或表达载体)或细胞。短语“药学可接受的”或“药理学可接受的”指在对动物或人类施用时不产生不利的、变应性的、或其它不想要的反应的分子实体和组合物。如本文中所使用的，“药学可接受载体”包括溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等可接受用于配制药物(诸如适合对人施用的药物)的。此类介质和试剂用于药学活性物质的使用是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与本发明的活性成分不相容，否则就涵盖它在治疗性组合物中的使用。还可以将补充性活性成分掺入组合物中，只要它们不灭活所述组合物的载体或细胞。
本发明的活性组合物可包括经典的药学制备物。依照本发明的这些组合物的施用可以经由任何常用路径，只要靶组织经由该路径可及。这包括口服、鼻、或含服。或者，施用可以是经过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内注射，或者通过直接注射入心脏组织。包含miRNA抑制剂的药物组合物或包含miRNA序列的表达构建体也可以通过导管系统或为将治疗剂递送至心脏而分离冠状循环的系统来施用。本领域知道用于将治疗剂递送至心脏和冠状脉管系统的多种导管系统。美国专利No.6,416,510；美国专利No.6,716,196；美国专利No.6,953,466；WO 2005/082440；WO 2006/089340；美国专利公开文本No.2007/0203445；美国专利公开文本No.2006/0148742；和美国专利公开文本No.2007/0060907(通过述及完整收入本文)中披露了适用于本发明的基于导管的递送方法或冠状动脉分离方法的一些非限制性例子。此类组合物通常会作为如上所述的药学可接受组合物来施用。
活性化合物也可以胃肠外或腹膜内施用。举例而言，可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备游离碱或药理学可接受盐形式的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中及在油中制备分散体。在普通贮存和使用条件下，这些制备物一般含有防腐剂以防止微生物生长。
对于注射使用或导管递送合适的药物形式包括例如无菌水溶液或分散体及用于临场制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。一般而言，这些制备物是无菌的，而且以存在易于注射性的程度流动。制备物在制造和贮存条件下应当是稳定的，而且应当针对微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用进行防腐。适宜的溶剂或分散介质可含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇、等等)、它们的合适混合物、及植物油。可以通过例如使用涂层(诸如卵磷脂)、通过维持所需粒度(在分散体的情况中)和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来实现对微生物作用的预防，例如paraben、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、等等。在许多情况中，会优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂来实现可注射组合物的吸收的延长，例如单硬脂酸铝和明胶。
可如下制备无菌注射液，即以适宜的量将活性化合物掺入根据需要含有任何其它成分(例如上文所列)的溶剂中，接着过滤除菌。一般而言，如下制备分散体，即将各种经灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和想要的其它成分(例如上文所列)的无菌媒介物中。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况中，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，它们自先前无菌过滤的溶液产生其活性成分加任何别的想要的成分的粉末。
本发明的组合物一般可配制成中性或盐形式。药学可接受盐包括例如自无机酸(例如盐酸或磷酸)或自有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸、等等)衍生的酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成的)。也可以自无机碱(例如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁)或自有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等等)衍生与蛋白质的游离羧基形成的盐。
配制后，优选以与剂型相容的方式和以治疗上有效的量施用溶液。所述配制剂可以容易地以多种剂量形式来施用，诸如注射液、药物释放胶囊等等。例如，为了以水溶液形式胃肠外施用，一般将溶液适当缓冲，并且首先例如用足够的盐或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。此类水溶液可用于例如静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。优选的是，采用无菌水介质，正如本领域技术人员知道的，特别是根据本公开内容。举例而言，可以将单个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并且或是添加至1000ml皮下输液或是在建议的输注部位注射(参加例如《Remington′s Pharmaceutical Sciences》第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。取决于所治疗的受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况中，负责施用的人会为各受试者决定适宜的剂量。此外，对于人类施用，制备物应当达到FDA生物制剂标准室要求的无菌度、热原度、一般安全和纯度标准。
本文所述任何成分可以包含在试剂盒中。在一个非限制性的例子中，各miRNA包括在试剂盒中。所述试剂盒可进一步包括水和杂交缓冲液以便于所述miRNA的两条链的杂交。在一些实施方案中，所述试剂盒可包括一种或多种用于抑制靶miRNA功能的寡核苷酸。所述试剂盒还可包括一种或多种转染试剂以便于将miRNA或miRNA抑制剂递送至细胞。
试剂盒的成分可以在水介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器手段一般包括至少一个管形瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器手段，其中装有(优选合适地分配)成分。在试剂盒中有超过一种成分的情况中(标记用试剂和标记物可以包装在一起)，试剂盒一般还会包含第二、第三或其它别的容器，其中可以分开装纳别的成分。然而，可以在管形瓶中装纳各种成分组合。本发明的试剂盒一般还会包括为了销售而牢固地安置核酸，和任何其它试剂容器的手段。此类容器可包括用于安放所需管形瓶的注射或吹塑成形的塑料容器。
当所述试剂盒的成分在一种和/或多种液体溶液中提供时，所述液体溶液是水溶液，特别优选无菌的水溶液。
然而，试剂盒的成分可以以干粉形式提供。当试剂和/或成分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来将所述粉剂重建。所述溶剂也可以在另一容器手段中提供。
容器手段一般会包括至少一个管形瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中装有(优选合适地分配)核酸配制剂。所述试剂盒还可包含第二容器手段，用于装纳无菌的药学可接受缓冲剂和/或其它稀释剂。
本发明的试剂盒通常还会包括为了销售而牢固地安置管形瓶的手段，诸如例如用于安放所需管形瓶的注射和/或吹塑成形的塑料容器。
此类试剂盒还可包括保存或维持miRNA或miRNA抑制性寡核苷酸或者保护它们免于降解的成分。此类成分可以不含RNA酶或针对RNA酶提供保护。此类试剂盒一般会以合适的手段为每种试剂或溶液包含独特的容器。
试剂盒还会包括关于采用试剂盒成分以及使用试剂盒中没有包括的任何其它试剂的指令。指令可包括能执行的变化形式。试剂盒还可包括通过各种施用路径(诸如胃肠外或导管施用)施用miRNA激动剂或拮抗剂的器具或装置。
此类试剂是本发明试剂盒的实施方案。然而，此类试剂盒不限于上文鉴定的具体项，而且可包括任何用于miRNA操作或表征的试剂。
用于鉴定调控物的方法
本发明进一步包含用于鉴定miR-499和/或miR-208b的调控物的方法。鉴定得到的miR-499和/或miR-208b抑制剂在心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的预防或治疗或逆转中是有用的。鉴定得到的miR-499和/或miR-208b激动剂在肌肉骨骼病症的治疗或预防中是有用的。miR-499和/或miR-208b的调控物可以包括在药物组合物中，用于依照本发明的方法治疗心脏病症和/或肌肉骨骼病症。
这些测定法可包含随机筛选候选物质的大型文库；或者，所述测定法可用于聚焦于特定类别的化合物，它们是以针对认为使得化合物更有可能抑制或增强miR-499和/或miR-208b表达和/或功能的结构属性的视角选择的。
为了鉴定miR-499或miR-208b的调控物，一般会在存在和不存在候选物质的情况中测定miR-499和/或miR-208b的功能。例如，所述方法一般包含：
(a)提供候选物质；
(b)将所述候选物质与miR-499和/或miR-208b混合；
(c)测量miR-499和/或miR-208b活性；并
(d)比较步骤(c)中的活性与不存在所述候选物质时的活性，
其中测量得到的活性间的差异指示所述候选物质确实是miR-499和/或miR-208b的调控物。
也可以在分离的细胞、器官、或活的生物体中进行测定法。
评估miR-499或miR-208b活性或表达可包含评估miR-499或miR-208b的表达水平。本领域技术人员会熟悉多种用于评估RNA表达水平的方法，包括例如Northern印迹或RT-PCR。评估miR-499或miR-208b活性或表达可包含评估miR-499或miR-208b的活性。在一些实施方案中，评估miR-499或miR-208b的活性包含评估受miR-499或miR-208b调节的基因的表达或活性。受miR-499调节的基因包括例如β-肌球蛋白重链和快速骨骼肌蛋白质基因(诸如肌钙蛋白I2、肌钙蛋白T3、肌球蛋白轻链、和α骨骼肌动蛋白)。受miR-208b调节的基因包括例如Sp3、Myostatin、PURβ、THRAP1、和快速骨骼肌蛋白质基因。在本发明的某些实施方案中，评估miR-499或miR-208b的活性包含评估心脏中α-肌球蛋白重链表达水平对β-肌球蛋白重链表达水平的比率。在其它实施方案中，评估miR-499或miR-208b的活性包含评估骨骼肌中β-肌球蛋白重链不同同等型的表达水平。本领域技术人员会熟悉多种用于评估受miR-499或miR-208b调节的基因的活性或表达的方法。此类方法包括例如Northern印迹、RT-PCR、ELISA、或Western印迹。
当然要理解，本发明的所有筛选方法自身就是有用的，尽管事实上可能没有找到有效的候选物。本发明提供了用于筛选此类候选物的方法，不仅仅是找到它们的方法。
如本文中所使用的，“候选物质”指任何可潜在调控miR-499和/或miR-208b的β-MHC调节方面的分子。通常会从各种商业来源获得认为达到有用药物基本标准的分子文库，从而试图“推动”有用化合物的鉴定。对此类文库(包括通过组合产生的文库，例如微小RNA拮抗剂文库)的筛选是对大量相关(和无关)化合物筛选活性的一种快速且有效的方式。通过在有活性但其它方面不合适的化合物的原型上创建第二代、第三代、和第四代化合物，组合法还将它们自身用于潜在药物的快速进化。可依照本发明方法筛选的候选物质的非限制性例子有蛋白质、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸或小分子。miR-499和/或miR-208b的调控物也可以是miR-499和/或miR-208b的上游调节物(诸如miR-208)的激动剂或拮抗剂。
体外测定法是一种快速、便宜且容易的测定法。此类测定法一般使用分离的分子，能快速且大量运行，由此提高一小段时间里可获得的信息量。可使用多种容器来运行此类测定法，包括试管、板、盘和其它表面，诸如量杆(dipstick)或珠。
WO 84/03564(通过述及完整收入本文)中记载了一种用于高通量筛选化合物的技术。可以在固体基底(诸如塑料针或一些其它表面)上合成大量小的微小RNA拮抗剂化合物。可以对此类分子快速筛选它们与miR-499或miR-208b杂交的能力。
本发明还涵盖，对化合物筛选它们调控细胞中miR-499或miR-208b活性和表达的能力。此类筛选测定法可利用各种细胞系，包括自骨骼肌细胞衍生的那些，包括专门为此目的而改造的细胞。也可以使用原代心脏细胞，正如H9C2细胞系。
体内测定法涉及心脏病或肌肉骨骼疾病的各种动物模型的使用，包括转基因动物，它们已经进行改造以具有特定缺陷或携带可用于测量候选物质到达和影响生物体内不同细胞的能力的标志物。由于它们的体型、易于操作、及关于它们生理学和遗传构成的信息，小鼠是一种优选的实施方案，尤其对于转基因的。然而，其它动物也是合适的，包括大鼠、家兔、仓鼠、豚鼠、沙鼠、旱獭、猫、犬、绵羊、山羊、猪、牛、马和猴(包括黑猩猩、长臂猿和狒狒)。可以使用自任何这些物种衍生的动物模型来进行对抑制剂的测定法。
用测试化合物治疗动物会涉及对动物施用适宜形式的化合物。施用会是任何可用于临床目的的路径。在体内测定化合物的有效性可涉及多种不同标准，包括但不限于肥大信号传导途径和肥大身体症状的改变。而且，可以以比体内或细胞内测定法更有意义的方式在动物中实施对毒性和剂量响应的测量。
在一个实施方案中，本发明提供了调节心脏和/或骨骼肌收缩性的方法，包括对心脏和/或骨骼肌细胞施用miR-499和/或miR-208b表达或活性的调控物。在另一个实施方案中，提供了调节心脏收缩蛋白质基因表达的方法，包括对心脏细胞施用miR-499和/或miR-208b表达或活性的调控物。在另一个实施方案中，提供了调节骨骼肌收缩蛋白质基因表达的方法，包括对骨骼肌细胞施用miR-499和/或miR-208b表达或活性的调控物。在还有一个实施方案中，本发明提供了诱导骨骼肌细胞的纤维类型转换的方法，包括对骨骼肌细胞施用miR-499和/或miR-208b表达或活性的调控物。所述调控物可以是miR-499和/或miR-208b表达或活性的激动剂或拮抗剂。在一些实施方案中，通过使细胞接触miR-499抑制剂来提高THRAP1、PURβ、myostatin、和Sox 6的表达。在其它实施方案中，通过使细胞接触miR-499激动剂来降低THRAP1、PURβ、myostatin、和Sox 6的表达。在另一个实施方案中，通过使细胞接触miR-208b抑制剂来提高Sp3、myostatin、PURβ、和THRAP1的表达。在还有一个实施方案中，通过使细胞接触miR-208b激动剂来降低Sp3、Myostatin、PURβ、和THRAP1的表达。
在本发明的某些实施方案中，提供了降低心脏细胞中的β-MHC表达的方法，包括对心脏细胞施用miR-499和/或miR-208b表达或活性的抑制剂。在本发明的其它实施方案中，提供了提高心脏细胞中的β-MHC表达的方法，包括提高内源miR-499和/或miR-208b表达或活性或对心脏细胞施用外源miR-499和/或miR-208b。在本发明的一个实施方案中，提供了提高心脏细胞中的快速骨骼肌收缩蛋白质基因表达的方法，包括对心脏细胞施用miR-499和/或miR-208b表达或活性的抑制剂。在本发明的另一个实施方案中，提供了降低心脏细胞中的快速骨骼肌收缩蛋白质基因表达的方法，包括提高内源miR-499和/或miR-208b表达或活性或对心脏细胞施用外源miR-499和/或miR-208b。可依照本发明的方法升高或降低的快速骨骼肌收缩蛋白质基因的例子包括但不限于肌钙蛋白I2、肌钙蛋白T3、肌球蛋白轻链、或α骨骼肌动蛋白。
在一个实施方案中，本发明提供了用于在有所需要的受试者中治疗病理性心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的方法，包括：鉴定具有心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的受试者；并对所述受试者施用miR-499和/或miR-208b抑制剂。在本发明的某些实施方案中，所述miR-499和/或miR-208b抑制剂可以通过包括如下步骤的方法来鉴定：(a)使细胞接触候选物质；(b)评估miR-499和/或miR-208b活性或表达；并(c)比较步骤(b)中的活性或表达与不存在所述候选物质时的活性或表达，其中与所述候选物质接触的细胞中miR-499和/或miR-208b的活性或表达与不存在所述候选物质的细胞中的活性或表达相比的降低指示所述候选物质是miR-499和/或miR-208b的抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于在有所需要的受试者中治疗肌肉骨骼病症的方法，包括：鉴定具有肌肉骨骼病症或有风险发生肌肉骨骼病症的受试者；并对所述受试者施用miR-499和/或miR-208b激动剂。在本发明的某些实施方案中，所述miR-499和/或miR-208b激动剂可以通过包括如下步骤的方法来鉴定：(a)使细胞接触候选物质；(b)评估miR-499和/或miR-208b活性或表达；并(c)比较步骤(b)中的活性或表达与不存在所述候选物质时的活性或表达，其中与所述候选物质接触的细胞中miR-499和/或miR-208b的活性或表达与不存在所述候选物质的细胞中的活性或表达相比的升高指示所述候选物质是miR-499和/或miR-208b的激动剂。
转基因动物
本发明的一个具体实施方案提供了缺少两个功能性miR-499和/或miR-208b等位基因中的一个或两个的转基因动物。而且，在诱导型的、组织选择性的或组成型的启动子控制下表达miR-499和/或miR-208b的转基因动物，自此类动物衍生的重组细胞系，及转基因胚在确定miR-499或miR-208b在心肌细胞发育和分化中及在病理性心脏肥大和心力衰竭的发生中发挥的确切作用中可能是有用的。另外，这些转基因动物可洞察心脏发育。可诱导的或可遏制的miR-499和/或miR-208b编码核酸的使用为过度调节的或不受调节的表达提供了模型。而且，涵盖“敲除”了miR-499和/或miR-208b的两个等位基因中一个或两个的转基因动物。
在一个一般的实施方案中，通过以容许转基因表达的方式使给定的转基因整合入基因组中生成了转基因动物。用于生成转基因动物的方法一般性记载于Wagner和Hoppe(美国专利4,873,191；通过述及收入本文)；及Brinster等(1985；通过述及收入本文)。
典型的是，通过显微注射将侧翼为基因组序列的基因转移入受精卵。将显微注射后的卵植入宿主雌兽，并对后代筛选转基因表达。可以自来自许多动物(包括但不限于爬行类、两栖类、鸟类、哺乳类、和鱼类)的受精卵生成转基因动物。
可以通过本领域已知的任何手段来制备用于显微注射的DNA克隆。例如，可以用适宜于清除细菌质粒序列的酶切割用于显微注射的DNA克隆，并使用标准技术在TBE缓冲液中在1％琼脂糖凝胶上对DNA片段电泳。通过溴化乙锭染色来显现DNA条带，并切出含有表达序列的条带。然后将切出的条带置于装有0.3M乙酸钠，pH 7.0的透析袋中。将DNA电洗脱入透析袋中，用1∶1酚∶氯仿溶液抽提，并用两倍体积的乙醇沉淀。将DNA在1ml低盐缓冲液(0.2M NaCl，20mM Tris，pH 7.4，和1mM EDTA)中重新溶解，并在Elutip-DTM柱上纯化。首先用3ml高盐缓冲液(1M NaCl，20mM Tris，pH 7.4，和1mM EDTA)预先准备柱，接着用5ml低盐缓冲液清洗。使DNA溶液穿过柱三次以使DNA结合至柱基质。用3ml低盐缓冲液清洗一次后，用0.4ml高盐缓冲液洗脱DNA，并用两倍体积的乙醇沉淀。在UV分光光度计中通过260nm吸收来测量DNA浓度。为了显微注射，将DNA浓度在5mM Tris，pH 7.4和0.1mM EDTA中调节至3μg/ml。用于纯化用于显微注射的DNA的其它方法记载于Palmiter等(1982)；及Sambrook等(2001)。
在一种例示性的显微注射规程中，通过5IU注射(0.1cc，ip)怀孕母马血清促性腺激素(PMSG；Sigma)，接着48小时后5IU注射(0.1cc，ip)人绒毛膜促性腺激素(hCG；Sigma)，诱导六周龄雌性小鼠超排卵。hCG注射后立即将雌性与雄性放在一起。hCG注射后21小时，通过CO2窒息或颈脱位法处死交配后的雌性，并自切开的输卵管取出胚，放在含0.5％牛血清清蛋白(BSA；Sigma)的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水中。用透明质酸酶(1mg/ml)清除周围的丘细胞。然后在含0.5％BSA的Earle氏平衡盐溶液(EBSS)中清洗前核胚并放置在具有5％CO2、95％空气的增湿大气的37.5℃温箱中，直至注射时间。可以在两细胞阶段进行胚的植入。
将随机循环的成年雌性小鼠与切除了输精管的雄性配对。为此目的可使用C57BL/6或Swiss小鼠或其它相当的品系。使受体雌性在与供体雌性相同的时间交配。在转移胚时，通过腹膜内注射0.015ml 2.5％阿佛丁每克体重来麻醉受体雌性。通过一个中线背部切口来暴露输卵管。然后穿过刚好在输卵管上方的体壁做一个切口。然后用制表镊撕裂卵巢囊。将要转移的胚放在DPBS(Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水)中且在转移移液管的尖端中(约10-12个胚)。将移液管尖端插入漏斗中并转移胚。转移后，通过两次缝合来关闭切口。
定义
如本文中所使用的，术语“心力衰竭”广泛用于表示降低心脏泵血能力的任何疾患。结果是，在组织中发生充血和水肿。最常见的是，心力衰竭是由源自冠状动脉血流降低的心肌收缩性降低引起的；然而，许多其它因素可导致心力衰竭，包括对心脏瓣膜的损害、维生素缺乏、和原发性心脏肌肉疾病。虽然尚未完全了解心力衰竭的精确生理机制，但是一般认为心力衰竭涉及数项心脏自主特性(包括交感神经的、副交感神经的、和压力感受器应答)中的病症。短语“心力衰竭的表现”广泛用于涵盖与心力衰竭有关的所有后遗症，诸如呼吸短促、压凹性水肿、肝肿大且触痛、颈部静脉充血、肺部罗音等等，包括与心力衰竭有关的实验室发现。
术语“治疗”或“处理”或语法等同形式涵盖心力衰竭症状的改善和/或逆转(即心脏泵血的能力)。可以使用本文所述任何度量(例如测量射血分数、缩短分数、左心室内径、心率等)以及对动物存活的任何效果来评估心脏“生理功能的改善”。在使用动物模型时，使用本文所述任何测定法比较接受治疗的转基因动物和不接受治疗的转基因动物的响应(另外，可以包括经接受治疗的和不接受治疗的非转基因动物作为对照)。在本发明的筛选方法中使用的、引起与心力衰竭有关的任何参数改善的化合物可由此鉴定为治疗性化合物。
术语“扩张性心肌病”指以存在收缩期收缩功能差的对称性扩张左心室为特征且另外常常涉及右心室的一种心力衰竭类型。
术语“化合物”指可用于治疗或预防身体功能的疾病(disease)、病(illness)、不适(sickness)、或病症(disorder)的任何化学实体、药剂、药物等等。化合物包含已知的和潜在的治疗性化合物。可以通过使用本发明的筛选方法进行的筛选来确定化合物是治疗性的。“已知的治疗性化合物”指已经显示出(例如经由动物试验或对人类施用的在先经验)在此类治疗中有效的治疗性化合物。换言之，已知的治疗性化合物不限于在心力衰竭的治疗中有效的化合物。
如本文中所使用的，术语“心脏肥大”指其中成年心脏肌细胞经由肥大性生长来响应压力的过程。此类生长的特征在于细胞大小增大细胞而在没有细胞分裂，在细胞内装配另外的肌节以使力量生成最大化，及胎心基因程序的激活。心脏肥大常常与升高的发病和死亡风险有关，因此致力于了解心脏肥大的分子机制的研究会对人类健康具有重大影响。
如本文中所使用的，术语“调控”指生物性活性的变化或改变。调控可以是蛋白质活性的升高或降低、激酶活性的变化、结合特征的变化、或与蛋白质或其它感兴趣结构的活性有关的生物学、功能、或免疫学特性的任何其它变化。术语“调控物”指如上所述能够变化或改变生物学活性的任何分子或化合物。
术语“β-肾上腺素能受体拮抗剂”指能够阻断(部分地或完全地)贝塔(β)型肾上腺素受体(即响应儿茶酚胺(尤其是去甲肾上腺素)的肾上腺素能系统受体)的化学化合物或实体。有些β-肾上腺素能受体拮抗剂展现出一定程度的对一种受体亚型(一般是β1)的特异性；此类拮抗剂叫作“β1特异性肾上腺素能受体拮抗剂”和“β2特异性肾上腺素能受体拮抗剂”。术语“β-肾上腺素能受体拮抗剂”指作为选择性和非选择性拮抗剂的化学化合物。β-肾上腺素能受体拮抗剂的例子包括但不限于醋丁洛尔(acebutolol)、阿替洛尔(atenolol)、丁氧胺(butoxamine)、卡替洛尔(carteolol)、艾司洛尔(esmolol)、拉贝洛尔(labetolol)、美托洛尔(metoprolol)、纳多洛尔(nadolol)、喷布洛尔(penbutolol)、普萘洛尔(propanolol)、和噻吗洛尔(timolol)。本发明的方法涵盖已知的β-肾上腺素能受体拮抗剂的衍生物的使用。事实上，本发明的方法涵盖在功能上表现像β-肾上腺素能受体拮抗剂的任何化合物。
术语“血管紧张素转化酶抑制剂”或“ACE抑制剂”指能够抑制(部分地或完全地)肾素-血管紧张素系统中相对无活性的血管紧张素I转化成有活性的血管紧张素II所涉及的酶的化学化合物或实体。另外，ACE抑制剂伴随地抑制缓激肽的降解，这有可能显著增强ACE抑制剂的抗高血压效果。ACE抑制剂的例子包括但不限于贝那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalopril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、喹那普利(quiapril)和雷米普利(ramipril)。本发明的方法涵盖已知的ACE抑制剂的衍生物的使用。事实上，本发明的方法涵盖在功能上表现像ACE抑制剂的任何化合物。
如本文中所使用的，术语“基因型”指生物体的实际遗传组成，而“表型”指个体所展示的身体性状。另外，“表型”是基因组选择性表达的结果(即它是细胞历史的表达及其对细胞外环境的响应)。事实上，人类基因组含有估计30,000-35,000个基因。在每种细胞类型中，这些基因只有一小部分(即10-15％)表达。
在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”联合使用时，词语“一个/种”的使用可以表示“一个/种”，但是也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”、和“一个/种或超过一个/种”的含义一致。本文中讨论的任何实施方案可以用本发明的任何方法或组合物来执行，反之亦然。另外，本发明的组合物和试剂盒可用于实现本发明的方法。贯穿本申请，术语“约”用于表示某数值包括用于测定该数值的装置或方法的误差的标准偏差。权利要求书中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指明指只选一项或各备选项相互排斥，即使公开文本支持只选一项的定义和“和/或”。
如本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包含”(及其任何变形)、“具有”(及其任何变形)、“包括”(及其任何变形)或“含有”(及其任何变形)是包含性/包括性的或开放式的，不排除别的未述及的成分或方法步骤。
虽然已经在本申请中插入了章节标题以便于阅读，但是此类标题不应解释为对实施方案的分割。
包括下列实施例来进一步例示本发明的各个方面。本领域技术人员会领会，下文实施例中公开的技术代表了发明人发现在实施本发明时运转良好且因此能视为构成实施本发明的优选模式的技术和/或组合物。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应领会可以在所公开的具体实施方案中进行许多改变且仍然获得类似或相似的结果而不背离本发明的精神和范围。
实施例
miR-208在α-MHC基因的内含子内编码(图1A)。像α-MHC一样，miR-208在心脏中特异性表达，在肺中有痕量表达(图1B)。miR-208是自α-MHCpre-mRNA加工出来的，而不是作为分开的转录物转录得到的。然而，有趣的是，miR-208展现出长得引人注目的、至少14天的半衰期，而且由此甚至能在α-MHC mRNA表达已经下调时发挥功能。虽然小鼠中的miR-208遗传缺失未能诱发明显表型，但是对来自2月龄野生型和miR-208-/-动物的心脏进行的微阵列分析揭示了miR-208的消除导致众多快速骨骼肌收缩蛋白质基因的显著表达，它们在正常情况中在心脏中不表达。如此，这些结果提示在正常条件下，miR-208与唯一的心脏特异性MHC基因共表达，通过遏制骨骼肌基因在心脏中的表达来维持心肌细胞身份。
miR-208无效(null)小鼠对心脏压力的异常响应揭示了miR-208的最显著功能(van Rooij，Science 2007)。在对通过胸主动脉收缩超载的压力或对钙依赖磷酸酶(一种驱动心脏病理性重塑的钙/钙调蛋白依赖性磷酸酶)的信号传导的响应中，miR-208无效小鼠实际上不显示心肌细胞肥大或纤维化，而不没有能力上调β-MHC表达(图6-8)。相反，其它压力响应性基因(诸如那些编码ANF和BNP的)在miR-208突变动物中被强烈诱导，证明了miR-208专门从事对β-MHC表达的控制，它能与心脏压力应答的其它方面脱钩。
β-MHC表达受甲状腺激素信号传导遏制，且在甲状腺功能减退状态中上调(Leung等，2006)。miR-208-/-动物还对T3抑制剂丙基硫尿嘧啶(PTU)(它诱发甲状腺功能减退)处理后的β-MHC表达上调有抗性。然而，有趣的是，miR-208突变小鼠中出生前的β-MHC表达是正常的，指示miR-208专门从事对β-MHC表达的出生后调节，这与β-MHC基因的甲状腺激素响应性的获得一致(图5)。
miR-208作用机制的一条线索来自miR-208-/-心脏与甲状腺机能亢进心脏的类似，二者都展示出对β-MHC表达的阻断、压力响应基因的上调和针对病理性肥大和纤维化的保护(图6-10)。miR-208-/-心脏中快速骨骼肌基因的上调(图22和27)也模仿甲状腺机能亢进状态中快速骨骼肌纤维的诱导(Wei等，2005)。
这些发现提示miR-208(至少部分)通过遏制心脏中压力应答与甲状腺激素信号传导途径的一个共同成分的表达来起作用。miR-208的最强的预测靶物是甲状腺激素受体(TR)辅调节物THRAP1，它能对转录发挥积极和消极效果(Pantos等，2006；Yao和Eghbali，1992；图12)。TR经消极甲状腺激素响应元件(TRE)起作用来遏制成年心脏中的β-MHC表达(Zhao等，2005)。如此，在miR-208缺失的情况中THRAP1表达的升高预测会增强TR对β-MHC表达的遏制活性，与miR-208-/-心脏中对β-MHC表达的阻断一致。然而，虽然THRAP1表现为miR-208的真(bone fide)靶物(图25和26)，但是这些数据不排除别的靶物可能参与对β-MHC表达的调节。
由于对β-MHC的甚至细微变化降低成年心脏的机械性能和功效，因此探索miR-208调节对于在心脏病期间预防β-MHC表达升高会有治疗价值。miR-208对心脏压力应答(而非正常心脏发育)的心脏特异性和专注性使得miR-208(及其下游效应物(effector))成为操作β-MHC水平的诱人治疗靶(图13)。
材料和方法
Northern印迹分析。自Gilead Colorado(Westminster，CO)获得诊断为具有非衰竭或衰竭心脏的匿名人士的左心室的心脏组织样品。使用Trizol试剂(Gibco/BRL)，自小鼠、大鼠和人类心脏组织样品分离总RNA。如先前所述(1)实施Northern印迹来检测微小RNA。U6探针充当加载对照(U6正向：5-GTGCTCGCTTCGGCAGC-3，(SEQ ID NO：28)；U6反向：5-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTGCG-3，(SEQ ID NO：29))。为了检测α-MHC表达，用覆盖第一外显子和5′UTR区一部分的α-MHC cDNA片段探查含有10μg来自成年野生型和miR-208突变型动物二者心脏组织的RNA的Northern印迹。
PTU处理。通过用补充有0.15％PTU(购自Harlan Teklad Co.，TD 97061，Madison，WI)的无碘食物喂养动物指定持续时间来诱发甲状腺激素缺乏。
微阵列和实时PCR分析。使用Trizol(Invitrogen)自心脏组织分离总RNA。使用小鼠基因组4302.0阵列(Affymetrix)实施微阵列分析。用随机六聚物引物(Invitrogen)对RNA样品进行RT-PCR，之后使用购自ABI的Taqman探针通过定量实时PCR分析一个基因子集的表达。
miR-208突变小鼠的生成。为了生成miR-208靶向载体，将向miR-208编码区上游延伸的0.4kb片段(5′臂)用SacII和NotI消化并连接入pGKneoF2L2dta打靶向质粒，在loxP位点和侧翼为Frt的新霉素盒的上游。将3.3kb片段(3′臂)用SalI和HindIII消化并连接入载体，在新霉素抗性与和Dta负选择盒之间。用5′和3′探针通过Southern印迹分析来鉴定携带被破坏的等位基因的靶定ES细胞。鉴定出三个miR-208靶定ES克隆并用于胚泡注射。将所得嵌合小鼠与C57BL/6交配以获得突变等位基因的种系传递。
Western印迹。如文献所述(Morkin，2000)自心脏组织提取肌球蛋白。通过SDS PAGE将MHC同等型分开，并用小鼠单克隆α-MHC(BA-G5)(ATCC，Rockville，MD)和小鼠单克隆抗肌球蛋白(慢速，骨骼M8421)(Sigma，MO)(它是对β-MHC高度特异性的)实施Western印迹。为了检测所有成纹的肌球蛋白，使用泛特异性抗体(pan specific antibody)(小鼠单克隆3-48；Accurate Chemical& Scientific Corporation，NY)。通过来自400μg心脏蛋白质溶胞物的免疫沉淀来检测THRAP1。将样品于4℃预澄清1小时后，将上清液与1μl家兔多克隆抗THRAP1(由Rockefeller University的R.Roeder馈赠)和15μl蛋白质A珠一起于4℃温育过夜。将珠用裂解缓冲液清洗三次并在SDS样品缓冲液中煮沸。通过SDS-PAGE解析免疫沉淀的THRAP1蛋白质，并使用1∶3000稀释的家兔多克隆抗THRAP1和1∶5000稀释的偶联有辣根过氧化物酶的抗家兔IgG分析，其中通过鲁米诺试剂(Santa Cruz)来检测。
组织学分析和RNA原位杂交。将用于组织学的组织在Krebs-Henselheit溶液中温育，在4％低聚甲醛中固定，切片，并为苏木精和曙红(H&E)加工，及Masson氏三色染色或通过标准技术进行的原位杂交(Krenz和Robbins，2004)。使用Maxiscript试剂盒(Amersham)生成35S标记的RNA探针。使用AdobePhotoshop将信号假着色成红色。
经胸超声心动图显象。使用Vingmed System(GE Vingmed Ultrasound，Horten，Norway)和11.5MHz线性阵列转换器，通过有意识的小鼠中的二维超声心动图显象来评估心脏功能和心脏尺度。使用M模式描记来测量心舒末期和心缩末期的前后壁厚。作为心舒期(LVIDd)或心缩期(LVIDs)的最大前后径，测量左心室(LV)内径(LVID)。由一名对小鼠基因型不知情的观察员分析了数据。依照下式计算了LV缩短分数(FS)：FS(％)＝[(LVIDd-LVIDs)/L VIDd]x 100。
转基因小鼠的生成。将感兴趣miRNA侧翼的小鼠基因组片段亚克隆入含有α-MHC和人GH poly(A)+信号(Kiriazis和Kranias，2000)的心脏特异性表达质粒。自小鼠尾部活检分离基因组DNA，并使用对人GH poly(A)+信号特异性的引物通过PCR来分析。
LacZ和MCK转基因小鼠的生成。为了搜索负责myh7b/miR-499的心肌和骨骼肌表达的顺式调节元件，将小鼠myh7b基因的0.8Kb基因组片段融合至lacZ报告基因上游的hsp68基础启动子并在F0转基因小鼠胚胎中测试表达。为了生成转基因小鼠，用SalI消化构建体以消除载体序列。将DNA片段使用QiaQuick旋转柱(Qiagen，MD)纯化，注射入来自B6C3F1雌性小鼠的受精卵，并植入假孕ICR小鼠，如先前所述(Lien等，1999)。收集胚胎并对β-半乳糖苷酶活性染色。其它地方记载了在来自肌肉肌酸激酶(MCK)基因的肌肉特异性增强子控制下组成性表达活性形式miR-499的转基因小鼠(Naya等(2000)J.Biol.Chem.，Vol.275：4545-4548)。自小鼠尾部活检分离基因组DNA，并使用对人类GH poly(A)+信号特异性的引物通过PCR来分析。
质粒和转染测定法。通过PCR扩增涵盖miR-208编码区的305bp基因组片段并连接入pCMV6。PCR扩增涵盖整个鼠THRAP1-UTR的1kb片段并连接入带HA标签的pCMV6表达构建体和萤火虫萤光素酶(f-luc)报告构建体(pMIR-REPORTTM，Ambion)。经由基于PCR的诱变构建了UCGUCUUAmiR-208种子结合序列的一种突变形式。
实施例1：miR-499表达需要miR-208
为了进一步探索miR-208在心脏中的作用机制，发明人通过微阵列分析定义了来自野生型和miR-208无效小鼠的心脏的微小RNA表达样式。在突变心脏中上调和下调的数种微小RNA中，发明人发现miR-499在正常心脏中高度丰富，但是在miR-208突变体中表达水平不超过背景。这些发现得到了Northern印记的证实(图14)。对miR-499基因的基因组定位的分析显示了它包含在Myh7b基因(α-MHC基因的一种同系物)的第20内含子内(图15)。miR-208表现出在转录水平调节Myh7b并由此调节miR-499表达，因为针对Myh7b的RT-PCR指示宿主基因的mRNA在不存在miR-208的情况中被剂量依赖性地消除(图14)。Myh7b基因在脊椎动物中是保守的，而且仅仅在心脏和慢速骨骼肌(例如比目鱼肌)中表达(图16A)。miR-499的这种表达样式得到了miR-499实时PCR分析的证实(国16B)。使用针对Myh7b基因3′端的探针进行的原位杂交指示此肌球蛋白在心脏中表达，而且有时早达E 10.5(图16C)。miR-208遗传缺失特异性抑制miR-499的心脏表达，而留下骨骼肌表达不受影响(图16D)。这些数据指示miR-208是驱动另一种肌球蛋白(即Myh7b，它产生相关的miR-499)所需要的。另外，miR-499在心脏肥大期间下调(图17)。
实施例2：MEF2调节心肌和骨骼肌中的miR-499表达
在Myh7基因的5′侧翼区内，发明人鉴定出一种潜在的MEF2共有序列，它在物种间是保守的。此序列在凝胶迁移率移位测定法中强烈结合MEF2(图37A)，而且此序列的突变消除MEF2对萤光素酶报告物的结合(图37A)和转录激活(图37B)。将Myh7基因的启动子区融合至lacZ报告物，并生成了转基因小鼠。如图37C所示，此基因组区域足以在E12.5的心脏中特异性指导lacZ表达。在出生后的心脏中，只在心室中观察到lacZ染色，与原位杂交一致(数据未显示)。MEF2位点的突变完全消除lacZ转基因的表达(图37C)。对体内小鼠模型的Northern印迹分析也显示了miR-499表达对MEF2敏感。MEF2D的心脏特异性过表达导致miR-499表达升高，而MEF2C和D二者的心脏缺失引起miR-499表达降低(图37D)。MEF2对Myh7b启动子的直接结合是体内Myh7b和miR-499表达所需要的。
MEF2位点毗邻保守的E盒序列(CANNTG)，后者与MEF2一起充当驱动骨骼肌基因表达的bHLH蛋白质的MyoD家族成员的结合位点。确实，MyoD与普遍存在的bHLH蛋白质E12一起结合来自启动子的E盒。此序列的突变预防lacZ转基因在骨骼肌中的表达，但不影响在心脏中的表达。
实施例3：miR-499的靶物的鉴定
鉴于miR-208与miR-499之间的序列同源性和发明人先前证明miR-208的遗传破坏导致心脏中对快速骨骼肌基因的特异性强烈诱导和对β-MHC的遏制的数据，有可能的是miR-499在骨骼肌中具有相当的功能且能起纤维类型支配性调节物的作用。miR-499及其宿主转录物的表达受到肌源性转录因子MEF2(慢速纤维基因表达和肌肉耐力的一种正调节物)的调节。发明人提出miR-499的纤维类型调节有可能依赖于涉及纤维类型调节的miR-499的靶基因。
miR-208与miR-499高度同源，而且值得注意的事实(即这两种微小RNA都是由Mhc基因的内含子编码的)提示它们共享共同的调节机制。由于miRNA以序列特异性方式对基因表达有负影响，因此高度的同源性使miR-208和miR-499因靶基因的交叠而倾向于发挥相当的功能。发明人鉴定了表现为充当miR-499靶物的MHC表达的转录调节物。他们还显示了心脏中的miR-499表达受到miR-208的控制，使得miR-208的敲低消除miR-499表达。
由于发明人先前的数据证明了miR-208的遗传破坏导致心脏中对快速骨骼肌基因的特异性强烈诱导，有可能的是miR-499在骨骼肌中具有相当的功能且能起纤维类型的支配性调节物的作用。根据这种假说，此转录物的启动子分析指示miR-499及其宿主转录物的表达受到肌源性转录因子MEF2(骨骼肌纤维类型和慢速纤维基因表达的一种中枢调节物)的调节。发明人显示了MEF2活性提升肌肉耐力且预防长时间锻炼后的肌肉疲劳，并提出MEF2的这些作用(至少部分)依赖于对miR-499表达的直接激活(图18)。
这些数据指示受MEF2调节的Myh7b基因的表达另外诱导慢速肌肉和心脏特异性miRNA即miR-499的表达，后者下调快速骨骼肌基因程序的表达。另外，这些数据为miR-499作为骨骼肌纤维类型的中枢调节物提供了证据(图19)。预测miRNA-499靶向THRAP1、PURβ和GDF8(也叫作myostatin)，即已知是肌球蛋白表达和肌肉纤维类型的关键调节物且有可能是肌纤维身份中miR-499功能性的效应物的基因(图20)。THRAP1先前被鉴定为是miR-208的靶物且调节甲状腺受体信号传导(van Rooij等，2007)。成年骨骼肌保留转录重新编程的能力。此属性易于在不承重(NWB)的比目鱼肌中观察到，该肌肉经历慢速至快速纤维类型转变，伴有降低的β-肌球蛋白重链(βMyHC)基因表达。NWB条件下MyHC基因表达的这种降低是由Sp3、Purα、和Purβ蛋白质之间的相互作用介导的。这些数据证明了Pur蛋白质与Sp3合作来调节使得肌肉细胞能够重塑它们表型的转录程序(Ji等，2007)。由于miR-499直接靶向PURβ，因此纤维类型调节可能是由PURβ的靶向介导的。肌肉调节中所涉及的另一种靶物是myostatin。myostatin是转化生长因子-β家族成员，起骨骼肌生长负调节物的作用。在小鼠中，myostatin基因的遗传破坏导致体重和肌肉量的显著增加。类似地，mdx敲除小鼠中的体内myostatin药理学干预导致营养不良表型的功能改善(Tang等，2007)。因此，myostatin是与肌肉萎缩有关的疾病的治疗的重要治疗靶。操作miR-499功能性来调节肌肉特异性纤维类型会对临床病理(像肌肉营养不良)有深远含意。另外，这些结果提示通过提高miR-499表达来增强慢速纤维基因表达的策略通会提升慢速纤维基因程序的胰岛素敏感度、持续性和其它有益方面。
实施例4：miR-208被miR-208b抗衡
miR-208b位于β-MHC(也叫作myh7)基因内，与其宿主基因共表达(图28)。成熟miR-208b序列与miR-208相比相差3个碱基，但是具有相同的种子区。这两种miRNA与它们的宿主基因之间的同源性可能是产生α-MHC(myh6)和β-MHC的基因组重复的结果(图29)。进行了Northen印迹分析来检查miR-208b的表达样式。在基线时，miR-208b显示与其宿主基因(β-MHC)相当的表达样式，也就是说主要在比目鱼肌(一种慢速骨骼肌)中观察到表达，而在心脏和快速骨骼肌类型中观察到很少的表达(图30A)。
出生后，T3信号传导经正T3响应元件(TRE)诱导α-MHC转录，而β-MHC基因的启动子中的负TRE介导转录遏制(Qjamaa等(2000)Endocrinology，Vol.141：2139-2144)。为了测试miR-208、miR-208b、和miR-499(即肌miR)响应肌球蛋白调节的表达，给大鼠喂含PTU的食物2周以阻断T3信号传导，随后给PTU处理大鼠补充T3以逆转PTU效果。正如预期的，PTU诱导响应PTU的α-MHC降低和β-MHC升高，这能被T3逆转(图30B)。虽然在较低的程度上，Myh7b的表达遵循β-MHC的表达样式；响应PTU诱导表达，并响应PTU加T3消除表达(图30B)。Northern印迹分析指示miR-208b和miR-499分别精确遵循β-MHC和myh7b的表达样式(图31)。此升高表现为剂量依赖性的，因为更长地暴露于PTU随时间升高miR-208b表达(图32)。
由于α-和β-MHC在心脏中抗衡，因此miR-208/miR-208b的表达有可能维持在相对恒定的水平。小鼠中的β-MHC是胚胎发生期间和出生后不久表达的优势MHC基因，而α-MHC在成年期期间接管。由于发明人先前的数据指示成年心脏中的miR-208是miR-499表达所需要的，因此发明人测试了miR-208b是否能替代miR-208。对p1时、p6时和成年心脏中肌miR的Northem分析指示在没有miR-208的情况中，在存在miR-208b时miR-499仍然表达(图30C)。为了测试miR-208b是否也以与β-MHC相当的方式响应肌球蛋白转换，用PTU处理野生型和miR-208突变型动物二者。在响应PTU时，α-MHC表达受到严重遏制，这导致野生型动物中pre-miRNA-208的丢失(以星号标示)。正如预期的，miR-499在miR-208突变动物中完全不存在，而且在野生型动物中只响应PTU而略微诱导。然而，miR-208b(像β-MHC一样)被PTU强烈诱导，而在没有miR-208的情况中，此诱导只是轻微的(图30D)。总之，这些结果提示位于肌球蛋白基因内的肌miR调节肌球蛋白基因的表达水平并因此调节它们包含的miRNA的表达水平。
先前，发明人显示了miR-208的心脏特异性缺失抑制压力刺激对β-MHC表达的诱导(图8)。虽然β-MHC表达在基线时非常低，但是miR-208的Northern印迹显示miR-208b表达的剂量依赖性降低，与两个miR-208等位基因中一个或两个的消除对应(图33A)。然而，已经显示出诱导β-MHC表达(图9)的miR-208转基因过表达诱导miR-208b表达(图33B)。这些数据暗示虽然miR-208表现为对心脏β-MHC表达的效果的上游调节物，但是病理性心脏重塑可能也是由于对miR-499和miR-208b的调节(图33C和34)。
实施例5：miR-208和miR-499遏制快速骨骼肌表型
miR-208无效小鼠心脏中与miR-499的慢速纤维特异性表达组合的快速骨骼肌基因的上调提示这些miRNA可能发挥遏制快速骨骼肌基因表达的功能。为了解决这个问题，生成了在快速骨骼肌中在MCK启动子和增强子控制下表达miR-499的转基因小鼠。获得了多个在快速纤维中表达miR-499的稳定转基因系(图38A)。与心脏表达相比，这些转基因动物在比目鱼肌和快速骨骼肌类型中有效过表达miR-499(图38B)。对纤维类型特异性基因表达的分析显示了快速纤维因miR-499的被迫表达向慢速肌纤维表型转化。野生型和miR-499转基因动物中所有五种肌肉类型的基因表达分析指示miR-499足以驱动比目鱼肌、TA和EDL中的β-MHC表达，而miR-499在心脏、比目鱼肌和EDL中遏制快速骨骼肌钙蛋白I和T(图38C)。这些转基因动物的快速肌肉纤维易于通过它们的深红色来鉴定，该深红色指示高水平的肌红蛋白表达和血管化。类似地，组织学切片的异染性ATP酶染色显示了转基因小鼠快速纤维(EDL)中慢速肌纤维基因表达的显著升高(图38D)。
为了确定miR-208敲除动物中miR-499的丢失是否与对β-MHC和快速骨骼基因的调节串联或并联，在miR-208无效背景中转基因过表达miR-499。β-MHC的Northern印迹分析和实时PCR指示PTU在野生型(WT)动物中有力诱导β-MHC和miR-208b但在miR-208突变动物(KO)中不然。然而，通过转基因过表达重新引入miR-499在没有miR-208的情况中消除对β-MHC的遏制效应(图38E)。而且，在没有miR-208的情况中快速骨骼肌钙蛋白的诱导表达在存在miR-499转基因的情况中受到遏制(图38F)。这些数据指示miR-499在miR-208突变动物中足以驱动慢速骨骼纤维表型且负责对β-MHC和快速骨骼基因的作用。
由于miR-208b在慢速骨骼肌中表达，因此很可能的是它在骨骼肌中调节纤维类型身份，或是直接的或是经由对miR-499的调节。先前的数据显示了miR-208(miR-208b的心脏家族成员)的心脏消除导致miR-499的心脏抑制和快速骨骼肌基因的上调(图22和27)。自骨骼肌消除miR-208b有可能会抑制miR-499表达并产生快速骨骼肌基因表达，由此诱导纤维类型自慢速向快速转换。为了更详细地调查miR-208b的功能参与，设计了一种靶向策略来非常精确地自小鼠基因组消除miR-208b(图35)。也可以采取别的办法来清除miR-499和miR-208b二者。使用骨骼和心肌特异性启动子(肌肉肌酸激酶(MCK))进行的miR-499和miR-208b二者结合位点区的骨骼肌特异性过表达应清除心脏和骨骼肌二者中的miR-208b和miR-499，由此生成这两种miRNA的敲除(图36)。
实施例6：miR-208对Myh7b/miR-499的控制
在心脏中，miR-208是负责维持心肌细胞身份的系统的上游调节物(通过遏制快速骨骼基因表达来进行)，而且另外促成响应压力而发生的病理性重塑。miR-208这样做时至少部分通过调节另一种miRNA(即位于肌球蛋白基因myh7b内的miR-499)的表达来进行。虽然骨骼肌中不存在miR-208，但是慢速骨骼肌中自β-MHC转录物表达一种密切相关的miR，即miR-208b。基于miR-499局限于慢速骨骼肌纤维的表达，miR-208b可诱导miR-499来遏制慢速骨骼肌中的快速纤维基因程序。然而，我们的数据指示miR-499是β-MHC表达所需要的，这会生成前馈环，其中β-MHC经由对miR-208b和miR-499的激活而刺激其自身表达。
值得注意的是miR-208+/-小鼠心脏中miR-208表达降低50％导致Myh7b/miR-499表达相应降低，而且miR-208缺失完全消除Myh7b/miR-499表达。Myh7b/miR-499对miR-208表达水平的敏感性提示miR-208的靶物受到精确调节，这是例外的，因为通常认为miRNA是基因表达的微调器而非开关转换器。
发明人先前确定了THRAP1(一种甲状腺激素受体辅调节物)是miR-208的靶物。由于miR-208与miR-499之间种子序列的显著交叠，这些miRNA可具有交叠靶物。如此，miR-499可调节THRAP1，并由此控制β-MHC和快速骨骼基因表达。在THRAP1之外，Sox6(转录因子Sox家族的一个成员)也可促成表型。Sox6(在骨骼肌中高度表达且已知负调节心肌和骨骼肌中的β-MHC表达)在其3′UTR中含有多个保守miR-499结合位点且代表miR-499对肌肉基因表达的作用的可能介导物。
实施例7：miR-208和miR-499对心脏重塑的调节
miR-208无效小鼠对心脏压力的异常响应揭示了miR-208的最显著功能(von Rooij等(2007)Science，Vol.316：575-579)。在对通过胸主动脉收缩超载的压力或对钙依赖磷酸酶的信号传导的响应中，miR-208无效小鼠实际上不显示肥大或纤维化，而且没有能力上调β-MHC表达。相反，其它压力响应性基因(诸如那些编码ANF和BNP的)在miR-208突变动物中被强烈诱导，证明了miR-208专门从事对β-MHC表达的控制，它能与心脏压力应答的其它方面脱钩。由于发明人的数据指示miR-499负责在miR-208突变动物中看到的一些基因调节效果，因此miR-499突变动物可能也对心脏病理性重塑有抗性，像miR-208突变动物一样。miR-208和miR-499二者的缺失可诱导保护效应。
由于α-和β-MHC在心脏中抗衡，因此miR-208/miR-208b表达有可能维持在相对恒定的水平。然而，虽然α-MHC是小鼠中的优势MHC同等型而β-MHC在人类中占优，但是miR-208对miR-208b的相对表达在小鼠对人类中相应地不同。由于miR-208是小鼠中响应压力和甲状腺功能减退的心脏β-MHC表达所需要的，因此miR-208b可能在人类心脏病期间朝向β-MHC的转变中发挥重要作用。无论如何，这些数据指示这些miRNA和肌球蛋白基因之间必然存在亲密形式的交谈。操作miR-208b功能性来调节肌肉特异性纤维类型会对临床病理(像肌肉营养不良)有深远含意。另外，这些结果提示通过提高miR-208b表达来增强慢速纤维基因表达的策略会提升慢速纤维基因程序的胰岛素敏感度、持续性和其它有益方面。
通过述及将本文中所讨论和引用的所有出版物、专利和专利申请完整收入本文。根据本公开文本，无需过度实验就能做出和执行本文中所公开的和要求保护的所有组合物和方法。虽然已经在优选实施方案方面描述了本发明的组合物和方法，但是对本领域技术人员会显而易见的是，可以对本文所述组合物和方法，及所述方法的各步骤或各步骤的顺序进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体的说，会显而易见的是，在化学和生理学这两方面相关的某些试剂可以替代本文所述药剂，而会实现相同或相似的结果。认为对本领域技术人员显而易见的所有此类相似替代和修改在本发明的精神、范围和概念内，它们由所附权利要求限定。
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序列表
<110>得克萨斯系统大学董事会
<120>控制肌球蛋白表达和肌纤维身份的微小RNA
<130>UTFD：1992WO
<150>US 60/952,911
<151>2007-07-31
<150>US 60/980,113
<151>2007-10-15
<150>US 60/980,314
<151>2007-10-16
<160>39
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>71
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
tgacgggcga gcttttggcc cgggttatac ctgatgctca cgtataagac gagcaaaaag    60
cttgttggtc a                                                         71
<210>2
<211>71
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus sp.)
<400>2
tgacgggtga gcttttggcc cgggttatac ctgactctca cgtataagac gagcaaaaag    60
cttgttggtc a                                                         71
<210>3
<211>71
<212>DNA
<213>家鼠(Rattus sp.)
<400>3
tgacgggtga gcttttggcc cgggttatac ctgactctca cgtataagac gagcaaaaag    60
cttgttggtc a                                                         71
<210>4
<211>71
<212>DNA
<213>犬(Canis sp.)
<400>4
tgacgcatga gcttttggct cgggttatac ctgatgctca cgtataagac gagcaaaaag    60
cttgttggtc a                                                         71
<210>5
<211>22
<212>RNA
<213>未知的
<220>
<223>成熟miR-208序列
<400>5
auaagacgag caaaaagcuu gu                                             22
<210>6
<211>69
<212>RNA
<213>人
<400>6
uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aaaguugcag    60
uaggguugc                                                            69
<210>7
<211>69
<212>RNA
<213>黑猩猩(Pan sp.)
<400>7
uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag    60
uaggguugc                                                            69
<210>8
<211>69
<212>RNA
<213>小家鼠
<400>8
uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aagcuugcag    60
uaggguugc                                                            69
<210>9
<211>69
<212>RNA
<213>家鼠
<400>9
uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag    60
uaggguugc                                                            69
<210>10
<211>69
<212>RNA
<213>犬
<400>10
uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag    60
uaggguugc                                                            69
<210>11
<211>69
<212>RNA
<213>原鸡(Gallus sp.)
<400>11
uucuugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuuaauuaa aacguugcag    60
uaggguugc                                                            69
<210>12
<211>72
<212>RNA
<213>东方鲀(Takifugu)
<400>12
uuccugcuuu aagcaauugg uugaaaauau auguauguaa uggucuuaau uaaaaaaaca    60
aacuaagaca aa                                                        72
<210>13
<211>69
<212>RNA
<213>短担尼鱼(Danio sp.)
<400>13
uuccugcuuu aaagcaauug gucuaaaaua uauguaaucg ucuucauuac aaaaacgaac    60
caucaaacg                                                            69
<210>14
<211>71
<212>DNA
<213>人
<400>14
acgggcgagc ttttggcccg ggttatacct gatgctcacg tataagacga gcaaaaagct    60
tgttggtcag a                                                         71
<210>15
<211>71
<212>DNA
<213>小家鼠
<400>15
acgggtgagc ttttggcccg ggttatacct gactctcacg tataagacga gcaaaaagct    60
tgttggtcag a                                                         71
<210>16
<211>71
<212>DNA
<213>家鼠
<400>16
acgggtgagc ttttggcccg ggttatacct gactctcacg tataagacga gcaaaaagct    60
tgttggtcag a                                                         71
<210>17
<211>71
<212>DNA
<213>犬
<400>17
acgcatgagc ttttggctcg ggttatacct gatgctcacg tataagacga gcaaaaagct    60
tgttggtcag a                                                         71
<210>18
<211>76
<212>DNA
<213>小家鼠
<400>18
tccctgtgtc ttgggtgggc agctgttaag acttgcagtg atgtttagct cctctgcatg    60
tgaacatcac agcaag                                                    76
<210>19
<211>74
<212>DNA
<213>家鼠
<400>19
tccctgtctt gggtgggcag ctgttaagac ttgcagtgat gtttagctcc tctccatgtg    60
aacatcacag caag                                                      74
<210>20
<211>76
<212>DNA
<213>人
<400>20
cccctgtgcc ttgggcgggc ggctgttaag acttgcagtg atgtttaact cctctccacg    60
tgaacatcac agcaag                                                    76
<210>21
<211>76
<212>DNA
<213>犬
<400>21
cccttgcacc ctgggcgggc ggccgttaag acttgcagtg atgtttaact cctctccacg    60
tgaacatcac agcaag                                                    76
<210>22
<211>76
<212>DNA
<213>负鼠(Monodelphis sp.)
<400>22
cccctgcctc cccggcgggc agctgttaag acttgcagtg atgtttaatt cttctctatg    60
tgaacatcac aacaag                                                    76
<210>23
<211>62
<212>DNA
<213>原鸡
<400>23
ggagcggcag ttaagacttg tagtgatgtt tagataatgt attacatgga catcacttta    60
ag                                                                   62
<210>24
<211>68
<212>DNA
<213>非洲蟾蜍(Xenopus tropicalis)
<400>24
gtcttagcga ggcagttaag acttgcagtg atgtttagtt aaaatctttt catgaacatc    60
actttaag                                                             68
<210>25
<211>79
<212>RNA
<213>未知的
<220>
<223>Pre-miR-499序列
<400>25
gggugggcag cuguuaagac uugcagugau guuuagcucc ucugcaugug aacaucacag    60
caagucugug cugcugccu                                                 79
<210>26
<211>21
<212>RNA
<213>未知的
<220>
<223>miR-499序列
<400>26
uuaagacuug cagugauguu u                                              21
<210>27
<211>22
<212>RNA
<213>未知的
<220>
<223>miR-208b序列
<400>27
auaagacgaa caaaagguuu gu                                             22
<210>28
<211>17
<212>DNA
<213>未知的
<220>
<223>U6正向引物
<400>28
gtgctcgctt cggcagc                                                   17
<210>29
<211>28
<212>DNA
<213>未知的
<220>
<223>U6反向引物
<400>29
aaaatatgga acgcttcacg aatttgcg                     28
<210>30
<211>43
<212>DNA
<213>人
<400>30
tttctgatcc gaatataaga cgaacaaaag gtttgtctga ggg    43
<210>31
<211>43
<212>DNA
<213>小家鼠
<400>31
tttctgatcc gaatataaga cgaacaaaag gtttgtctga ggg    43
<210>32
<211>43
<212>DNA
<213>家鼠
<400>32
tttctgatcc gaatataaga cgaacaaaag gtttgtctga ggg    43
<210>33
<211>43
<212>DNA
<213>犬
<400>33
tttctgatcc gaatataaga cgaacaaaag gtttgtctga ggg    43
<210>34
<211>43
<212>DNA
<213>负鼠
<400>34
ttttggatct gaatataaga cgaacaaaag gtttgtctgt gtg    43
<210>35
<211>43
<212>DNA
<213>非洲蟾蜍
<400>35
ttttctgttg ttgtataaga cgagcataaa gcttgtttgt tag    43
<210>36
<211>77
<212>RNA
<213>未知的
<220>
<223>Pre miR-208b序列
<400>36
ccucucaggg aagcuuuuug cucgcguuau  guuucucauc cgaauauaag acgaacaaaa    60
gguuugucug agggcug                                                    77
<210>37
<211>71
<212>RNA
<213>未知的
<220>
<223>Pre miR-208序列
<400>37
ugacgggcga gcuuuuggcc cggguuauac cugaugcuca cguauaagac gagcaaaaag    60
cuuguugguc a                                                         71
<210>38
<211>24
<212>RNA
<213>未知的
<220>
<223>miR-208序列
<400>38
auaagacgag caaaaagcuu guuu                                           24
<210>39
<211>23
<212>RNA
<213>未知的
<220>
<223>miR-499序列
<400>39
uuaagacuug cagugauguu uaa                                            23

Claims (13)

1.miR-499或miR-208b的抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于在有所需要的受试者中治疗或预防病理性心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死，其中所述抑制剂是由与SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27互补的序列组成的微小RNA拮抗剂或反义寡核苷酸，并且其中所述药物抑制所述受试者的心脏细胞中的miR-499或miR-208b的表达或活性。 
2.权利要求1的用途，其中所述药物配制用于胃肠外施用或直接注射入心脏组织。 
3.权利要求1的用途，其中所述药物配制用于口服、经皮、持续释放、受控释放、延迟释放、栓剂、导管、或舌下施用。 
4.权利要求1的用途，其中所述药物包含miR-499和miR-208b二者的抑制剂。 
5.权利要求1的用途，其中所述药物与第二心脏肥大疗法组合使用。 
6.权利要求5的用途，其中所述第二疗法是在与所述miR-499或miR-208b抑制剂同一时间、在所述miR-499或miR-208b抑制剂之前或之后施用的。 
7.权利要求1的用途，其中所述药物改善病理性心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的一种或多种症状。 
8.权利要求7的用途，其中改善的所述一种或多种症状是升高的运动能力、升高的心脏射血体积、降低的左心室舒张末期压、降低的肺毛细血管楔压、升高的心输出量、升高的心指数、降低的肺动脉压、降低的左心室收缩和舒张末期内径、降低的左和右心室壁压、降低的壁张力、升高的生命质量、降低的疾病相关发病率或死亡率、或其组合。 
9.权利要求1的用途，其中所述药物延迟所述受试者中的心脏肥大转变成心力衰竭。 
10.权利要求1的用途，其中所述受试者展现出一种或多种选自下组的风险因素：长期存在的不受控制的高血压、未矫正的瓣膜病、慢性心绞痛、近期的心肌梗死、对心脏病的先天性因素 、和病理性肥大。 
11.权利要求1的用途，其中所述受试者已经诊断为具有对心脏肥大的遗传因素或心脏肥大的家族史。 
12.miR-499或miR-208b的抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于在有所需要的受试者中预防心脏肥大和扩张性心肌病，其中所述抑制剂是由与SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27互补的序列组成的微小RNA拮 抗剂或反义寡核苷酸，并且其中所述药物抑制所述受试者的心脏细胞中的miR-499或miR-208b的表达或活性。 
13.miR-499或miR-208b的抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于在有所需要的受试者中抑制心脏肥大进展，其中所述抑制剂是由与SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27互补的序列组成的微小RNA拮 抗剂或反义寡核苷酸，并且其中所述药物抑制所述受试者的心脏细胞中的miR-499或miR-208b的表达或活性。 
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