CN104342439B

CN104342439B - miR‑7及其应用

Info

Publication number: CN104342439B
Application number: CN201310311571.2A
Authority: CN
Inventors: 崔熠; 肖志峰; 魏建树; 陈冰; 陈同; 戴建武
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Beijing Zhongke kunkang Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2017-06-23
Anticipated expiration: 2033-07-23
Also published as: CN104342439A

Abstract

本发明提供了一种miR‑7及其应用。本发明通过三维胶原海绵支架培养细胞体系发现miR‑7通过调控Klf4基因进而促进神经干细胞分化，从而筛选到miR‑7。在神经干细胞内过表达或敲低miR‑7，进一步证实miR‑7具有促进神经干细胞定向分化为神经元的功能。

Description

miR-7及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种miRNA及其应用。

背景技术

当今颅脑和脊髓外伤、脑血管疾病、神经系统先天性疾病和罹患神经退变性疾病人数急剧上升，人类一旦发生脑出血、脑梗塞、脑外伤、脊髓损伤等疾病后，损伤的神经功能难以自我修复，多遗留严重的后遗症。神经干细胞作为一种具备自我更新能力及多向分化潜能的细胞,它来源于神经组织并可生成神经组织，在适当条件下可分化成神经元、少突胶质细胞和星形细胞。神经干细胞为神经系统功能重建和神经再生提供了一条新的途径，具有广泛的临床应用前景。寻找促进神经干细胞分化的因素对于组织再生、神经系统退行性疾病、脑外伤以及脑肿瘤的发生、发展和治疗有着非常重要的意义，许多研究发现小分子化合物AICAR、生长因子FGF，生物材料石墨烯等具有促进神经元分化的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种miRNA及其应用，所述miRNA命名为miR-7。

本发明提供的miRNA具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID№.1所示的核苷酸序列；

2）与1）限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且参与神经干细胞的分化或神经干细胞的自我更新的核苷酸序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。

所述参与神经干细胞的分化或神经干细胞的自我更新，具体指所述miRNA是通过调控其下游基因Klf4的表达来参与神经干细胞的分化或神经干细胞的自我更新。

所述参与神经干细胞的分化，具体指所述miRNA促进所述神经干细胞的分化。

所述参与神经干细胞的自我更新，具体指所述miRNA抑制所述神经干细胞的自我更新。

所述神经干细胞具体为大鼠神经干细胞。

本发明的另一个目的是提供所述miRNA在制备具有下述任意一种功能的产品中的应用：

1）调节神经干细胞的分化；

2）调节神经干细胞的自我更新；

3）调节神经干细胞的全能性。

所述调节神经干细胞的分化为促进神经干细胞的分化；

所述调节神经干细胞的自我更新为抑制神经干细胞的自我更新；

所述调节神经干细胞的全能性为抑制神经干细胞的全能性。

所述应用中，所述促进神经干细胞分化具体指促进神经干细胞分化为神经元。

本发明的另一个目的是提供所述的miRNA在制备具有调控Klf4、Nestin、Vimentin、Map2和/或Tuj1基因表达功能产品中的应用。

具体的，所述调控Klf4、Nestin、Vimentin、Map2和/或Tuj1基因表达指抑制Klf4、Nestin和/或Vimentin基因的表达；和/或促进Map2和/或Tuj1基因的表达。

本发明的再一个目的是提供一种筛选所述miRNA的方法，所述方法包括以下步骤：

1）将全能干细胞分别在二维培养体系或三维胶原海绵培养体系中培养；

2）分析miRNA在步骤1）所述的两个培养体系中培养的全能干细胞中的表达差异；

3）选取表达差异达到统计学显著水平的miRNA进行分离、测序即得。

所述步骤1）中，所述三维胶原海绵培养体系具体指以胶原海绵为三维支架的培养体系。

所述胶原海绵购自美国美敦力公司（Medtronic Sofamor Danek USA,Inc）。

所述方法中，所述全能干细胞具体为PA-1细胞或神经干细胞。

所述方法中，所述二维培养体系具体指常规的单层细胞平面培养体系。

本发明通过三维胶原海绵支架培养细胞体系筛选到miR-7，miR-7通过调控Klf4基因进而促进神经干细胞分化，进而通过在神经干细胞内过表达或敲低miR-7，检测miR-7表达情况对神经干细胞分化的影响，进一步证实miR-7具有促进神经干细胞定向分化为神经元的功能。

附图说明

图1为三维培养体系中表达下调的miRNA与PA-1细胞自我更新调控关键基因的调控网络图。

图2为Real-time PCR方法检测miR-7在三维培养体系（3D）或二维培养体系(2D)培养的PA-1细胞内的表达情况，其中**表示P<0.01。

图3为Real-time PCR方法检测三维培养体系（3D）或二维培养体系(2D)内大鼠神经干细胞自我更新及分化相关基因的表达情况，其中**表示P<0.01。

图4为Real-time PCR方法检测三维培养体系（3-D）和二维培养体系(2-D)内大鼠神经干细胞中miR-7（图4A）和Klf4基因（图4B）的表达情况。

图5为Real-time PCR方法检测过表达miR-7或敲低miR-7表达后，神经干细胞自我更新相关基因Nestin、Sox2、Vimentin和分化相关基因Tuj1、Map2的表达情况，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01。

图6为免疫荧光检测过表达miR-7或敲低miR-7表达后，神经干细胞自我更新相关基因Nestin（图6A），Sox2（图6B），Vimentin（图6C）和分化相关基因Tuj1（图6D），Map2（图6E）,的表达情况，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中如无特殊说明，所述液体与液体的比值为体积与体积比或体积百分含量；所述液体与固体的比值为体积与质量比；所述固体与固体的比值为质量与质量比或质量百分含量。

胶原海绵购自美国美敦力公司（Medtronic Sofamor Danek USA,Inc）

实施例1、以胶原海绵为支架的三维培养体系培养细胞

（一）细胞的二维培养

PA-1细胞的二维培养：

PA-1细胞购自中国协和医科大学基础医学院，为ATCC细胞库收录(CRL-1572^TM)。于37℃、5%CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱中无菌培养(Thermo Forma公司)。培养基为高糖DMEM（Hyclone），含体积百分比为10%的胎牛血清（Gibco）、青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml，在37℃、5%CO₂培养箱中培养，隔日传代。细胞传代时用0.25%的胰蛋白酶进行消化。

大鼠神经干细胞的分离与二维培养：

取8只SD乳鼠（出生12小时以内的乳鼠）（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），在75%酒精中浸泡处死，在超净台内断头，取出端脑，将端脑转移至预冷的含糖PBS（内含0.1M葡萄糖）中，仔细地剔除血管和脑膜，在预冷的含糖PBS中洗3次，将PBS吸干，弯剪剪碎脑组织，将组织转移至15ml离心管，加0.25%胰酶，37℃消化40分钟，消化20分钟时拿出来吹打一次，消化40分钟后用胰酶抑制剂终止消化，加基础培养基，吹散沉淀，注意尽量不要产生气泡，200目细胞筛过滤后，500g离心5分钟，去掉上清，加入添加有B27、20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于培养瓶中,置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中悬浮培养，培养3天后换液，继续培养至7天，形成直径100-200μm的神经球。将含神经球的悬浮培养基倒入离心管中，250g离心5分钟，去掉上清，收集沉淀。加入0.25%胰酶消化，室温孵育15-20分钟，在第8分钟时，轻轻将沉底的细胞团块吹散，继续孵育，孵育至20分钟后，用含体积百分比为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止胰酶作用，显微镜下计数细胞，细胞计数后按照1×10⁵细胞/cm²密度将细胞接种在用多聚赖氨酸处理（用1mg/ml多聚赖氨酸溶液将培养皿底部铺满，37℃孵育2小时后，洗掉多聚赖氨酸，在超净台中吹干，用PBS洗2遍）的细胞培养板或培养皿中。神经干细胞贴壁培养24小时后，用PBS洗两次，换为含体积百分比为2%的B27和30%葡萄糖的神经干细胞分化培养基。

（二）以胶原海绵为支架的三维培养体系培养细胞

以胶原海绵为支架的PA-1细胞的三维培养：

将二维培养的PA-1细胞用0.25%的胰酶消化，显微镜下计数细胞，在每块胶原海绵上接种20μl的5×10⁶/mL细胞，在37℃、5%CO₂培养箱中贴壁培养4小时后，将内含胶原海绵材料的10cm的细胞皿内补充10ml内含体积百分比为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，继续培养7天，隔日换液。

以胶原海绵为支架的大鼠神经干细胞的三维培养：

1、神经干细胞悬浮培养（悬浮培养为三维成球培养方法）：

神经干细胞扩增培养基(100ml)：

非必需氨基酸100×1ml；丙酮酸钠100×1ml；双抗100×1ml；B2750×2ml；30%Glu2ml；EGF(0.1mg/ml)20μl；bFGF(0.1mg/ml)20μl；肝素(0.05g/2ml)7.32μl；DMEM/F12(1:1)92.07ml；

培养条件：在37℃、5%CO₂培养箱中培养7天扩增形成的神经球，用0.25%的胰酶消化，室温孵育15-20分钟，在第8分钟时，轻轻将沉底的细胞团块吹散，继续孵育，孵育至20分钟后，用含体积百分比为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止胰酶作用。

2、以胶原海绵为支架的三维培养体系培养细胞：

显微镜下计数上述悬浮培养的细胞，每块胶原海绵上接种20μl的5×10⁷/mL细胞，在37℃、5%CO₂培养箱中贴壁培养4小时后，将内含胶原海绵材料的10cm的细胞皿内补充10ml内含体积百分比为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，继续培养1天，第二日，将细胞培养基更换为内含体积百分比为2%的B27和30%葡萄糖的神经干细胞分化培养基中，培养7天，隔代换液。

实施例2、microRNA表达谱基因芯片检测、miRNA-靶基因调控网络构建及miR-7的制备

（一）miRNA提取

利用mirVanaTM miRNA Isolation miRNA提取试剂盒(Cat#1560，Ambion)分别提取由实施例1得到的二维培养体系和三维胶原海绵培养体系中培养的PA-1细胞的总miRNA。根据试剂盒的说明提取和富集样品的miRNA，具体操作步骤如下：

（1）收获1×10⁶细胞，加入1:10（w/v）的Lysis/BindingBuffer，旋涡振荡混匀。

（2）加入1/10体积的miRNA Homogenate Additive。旋涡振荡混匀或上下颠倒数次，冰浴10分钟。

（3）加入一倍体积的Acid-Phenol:Chloroform（体积是在没有加入miRNAHomogenate Additive前的体积），旋涡振荡30-60秒，以最大速度（10，000×g）室温离心5分钟，以确保液相分层，如分层不明显，再次离心。

（4）将滤过液的上清液（水相）转移到新的离心管中，注意转移液体的体积。

（5）加入1/3体积的100﹪乙醇，混匀。

（6）将细胞裂解液和乙醇混合液转移到Filter Cartridge，10，000×g(10，000rpm)离心15秒，保留滤过液，滤过管可参照下述步骤（10）-（16）提取滤过管中残留的总RNA。

（7）滤过液中加入2/3体积的无水乙醇，混匀。

（8）将细胞裂解液和乙醇混合液转移到Filter Cartridge，10，000×g(10，000rpm)离心15秒，弃滤过液，保留滤过管。

（9）如果体积大于700μl，继续将液体转移到Filter Cartridge后离心。

（10）加入700μl miRNA Wash Solution1到Filter Cartridge中，离心5–10秒，弃滤过液，保留收集管。

（11）加入500μl Wash Solution2/3到Filter Cartridge中，离心5–10秒，弃滤过液，保留收集管。

（12）再加入500μl Wash Solution2/3到Filter Cartridge中，离心5–10秒洗柱。

（13）为除尽Filter Cartridge中液体，更换收集管（用户自备）后以最大转速离心1分钟。

（14）将洗脱液或无核酸酶水预热到95℃，洗脱液是无核酸酶的0.1mM EDTA（如果影响实验分析，可选用无核酸酶水替代）。

（15）将Filter Cartridge转移到提供的收集管中，直接将100μl预热好的洗脱液或是无核酸酶水加到胶床上，以最大转速离心20-30秒洗脱RNA。

（16）为获得更高产量的RNA，重复步骤（16）一次，将离心洗脱液收集到同一收集管中。

（17）用1%变性的琼脂糖凝胶电泳检测所得到的总RNA，并用紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度。

（18）剩余的含miRNA的洗脱液保存在-20℃。

（二）microRNA表达谱基因芯片检测

（1）芯片及探针的制备

采用美国LC Sciences公司提供的microRNA微阵列芯片，对SangermiRBase数据库最新报道的人的microRNA进行检测，从而确保了对microRNA进行直接检测的高灵敏性和高特异性。

芯片探针序列信息来自于Sanger miRBase Release19.0版本数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences）。

每个检测探针是由PGR（光敏试剂）化学试剂原位合成，包含了一段编码区域和一个延伸臂片段。编码区域是一个经化学修饰的核苷酸编码片段，这些片段与靶miRNA或其它靶RNA互补，可以提高检测的灵敏度和特异性，同时还能提高杂交亲和活性从而平衡探针的Tm值。延伸臂片段能使与它连接的编码片段片基有一定的距离，减少杂交空间阻碍。每个探针在同张芯片里重复5个点，进一步提高了芯片的可靠性。

（2）芯片的杂交、显色、洗涤和扫描

分别将上述提取得到的二维培养体系和三维胶原海绵培养体系培养得到的PA-1细胞的总miRNA，通过YM-100(Millipore)微离心过滤柱得到片段小于300nt的小RNA。Poly(A)聚合酶在分离到的小RNA3＇端加上poly(A)尾巴，再连接一个寡聚核苷酸标记，使用Cy3和Cy5特异性荧光标记进行双样品杂交试验。用Cy3和Cy5特异性荧光分别标记二维培养PA-1细胞和三维胶原海绵培养体系培养的PA-1细胞，

将两个标记好的样品杂交到一张制备好的microRNA微阵列芯片上。杂交反应通过微循环泵杂交仪器在微流体芯片上过夜（Atactic Technologies）。杂交使用含有体积百分比为25%的甲酰胺的100μL6xSSPE缓冲液(0.90M NaCl、60mMNa2HPO4、6mM EDTA、pH6.8，溶剂为水)，杂交温度34℃。

杂交后的芯片采用激光扫描仪(GenePix4000B，Molecular Device)采集杂交图象；将采集的杂交图像再经Array-Pro(Media Cybernetics)软件进行处理分析，把图像信号转化为数字信号，得扫描图谱；检测样品在扫描图谱中会出现红色，绿色或黄色的杂交点，其中，红色表示基因表达上调；绿色表示表示基因表达下调，黄色表示两个样本间的基因表达量基本相当。

（3）芯片扫描结果的分析

将上述获得的扫描图谱保存为标签图像文件格式（Tagged Image File Format，TIFF），通过Axon GenePix4000B Microarray Scanner将图像的像素质转化为数字信号，并导出成分析软件可识别得文件格式（.dat和.cel文件）。在进行芯片的比较分析前，对每一张芯片进行扣除背景，计算重复点平均值和标准偏差，然后通过LOWESS(Locally-WeightedRegression)过滤进行标准化。对于双色标记实验，计算三维胶原海绵培养体系培养的PA-1细胞和二维培养PA-1细胞两组样本检测信号的比值(log2)和t-test的p值。以p值<0.01定义显著差异性表达。

芯片扫描分析结果显示，共鉴定出326个在三维胶原海绵培养体系培养的PA-1细胞中的miRNA的表达与在二维培养体系培养的PA-1细胞中的miRNA的表达有显著性差异。

（4）miRNA-靶基因网络的构建

使用TargetScan（release6.2）对上述鉴定出的326个miRNA的靶基因进行预测。对其中30个在三维胶原海绵培养体系中下调表达的miRNA，使用Cytoscape（version3.0.1）网络构建工具构建了这些miRNA对其靶基因即多能性因子Oct4,Sox2,Klf4和Nanog的调控网络，结果见图1。图1显示，在网络图中，节点的大小与节点的入度相关；边的样式与靶位点的保守性相关，从实体线到短划线再到虚线表示保守性依次降低；边的粗细从细到粗对应于miRNA在三维胶原海绵培养体系培养的PA-1细胞中的表达与在二维培养体系培养的PA-1细胞中的表达的差异倍数由小到大；其中，miR-7调控的靶基因之一为Klf4，且miR-7在三维胶原海绵培养体系培养的PA-1细胞中的表达与在二维培养体系培养的PA-1细胞中的表达的差异倍数较大。构建的miRNA-靶基因网络结果部分解释了三维胶原海绵培养体系相较于二维培养体系，能更好的维持干细胞自我更新机制的分子机理。

（5）miR-7的制备及Real-time RT-PCR验证芯片检测结果

抽取miRNA芯片中筛选的差异表达的miRNA-7进行Real-time PCR，验证芯片结果。

分别提取由实施例1培养得到二维培养体系和三维胶原海绵培养体系中的PA-1细胞的总miRNA，miNA提取方法同本实施例（一）所述。使用invitrogen miRNA反转录试剂盒（Taqman microRNA reverse transcription kit cat NO.4366596）将制备得到的miRNA分别逆转录为相应的cDNA。反转录反应体系如表1所示。

表1

反转录反应条件为：16℃反应30min，42℃反应30min，85℃反应5min，冷却到4℃保存。

以上述反转录得到的cDNA用作Real-time PCR反应模板，使用试剂盒TaqmanmicroRNA assays cat NO.4427975进行Real-time PCR，具体反应体系如表2所示。

表2

Real-time PCR扩增条件为：95℃10min；95°C15sec，60℃60sec共40个循环。

对Real-time PCR扩增产物进行测序，其中miR-7的核苷酸序列为序列表中SEQ ID№.1所示。

Real-time PCR验证miRNA芯片结果见图2，图2结果显示，Real-time PCR结果与芯片结果吻合，表明miRNA芯片结果数据可靠。

实施例3、Real-time RT-PCR检测神经干细胞在常规二维培养体系内与三维胶原海绵培养体系内神经干细胞分化相关基因的表达

在三维胶原海绵体系中用撤掉维持神经干细胞自我更新相关的生长因子培养基培养神经干细胞，通过Real-time PCR方法检测神经干细胞自我更新维持及神经分化相关基因的表达情况。

(1)Trizol提取大鼠神经干细胞总RNA

用细胞刮分别收获实施例1培养的二维培养体系和三维胶原海绵培养体系的大鼠神经干细胞1×10⁶细胞，加入1ml Trizol，吹打混匀，4℃，12000g离心10min；取上清加0.2ml三氯甲烷，剧烈振荡15秒，室温静置30min，4℃，12000g离心10min；离心后液体分为上中下三层，取上层无色液体，加入等体积的异丙醇，颠倒数次，在-20℃冰箱中静置过夜；第二天取出后于4℃，12000rpm离心10min；离心后，可见乳白色的RNA沉于管底，弃上清，加1mlDEPC水配制的75%乙醇洗涤RNA；4℃12000g离心5min；弃去上清，空气干燥5min至乳白色RNA块转为透明加适量去RNA酶水充分溶解RNA。用紫外分光光度计测定RNA样品在260nm和280nm处的OD值，通过OD260/OD280比值鉴定RNA的质量和纯度，选择比值在1.8-2.0之间的样品，计算其浓度。另取1μg RNA于0.75%甲醛变性琼脂糖凝胶中电泳观察RNA的完整性，其余样本置于-80℃冰箱保存备用。

(2)RNA反转录合成cDNA

使用invitrogen（Cat.NO.18064）反转录试剂盒将制备得到的总RNA分别逆转录为相应的cDNA。

cDNA第一条链的合成反应体系如表3所示。

表3

cDNA第一条链的合成反应条件为：65℃温浴5分钟，立即放置冰上，瞬时离心。

反转录的反应体系如表4所示。

表4

反转录的反应条件为：混匀，42℃温浴2分钟，加入1μL(200units)的SuperScript^TMII RT酶，42℃温浴50分钟，70℃温浴15分钟。

（3）荧光定量PCR：

将上述反转录制备的cDNA作为real-time PCR检测的模板，每个样本需要三个重复；real-time PCR检测的目的基因及扩增反应所使用的引物序列如表5所示。

表5

使用罗氏FastStart SYBR试剂盒进行real-time PCR，反应体系如表6所示。

表6

real-time PCR反应条件为：50℃2min，95℃10min，40个循环：95℃15s，60℃30s，72℃5min。

(4)Real-time RT-PCR数据分析

在SDS软件上，经自动分析(个别基因需手动设置基线和阈值)，查看每个基因的扩增情况，导出相应的域值循环数(Cycle at threshold)，即Ct值，在Microsoft Excel软件上进行统计分析。以GAPDH为阳性内对照基因，校正cDNA模板的细胞拷贝数，计算相对量采用2-△△Ct方法，△Ct目标基因=Ct目标基因一Ct同一样本18s;△△Ct目标基因=处理组△Ct目标基因一对照组△Ct目标基因。统计检验采用student'S双侧配对(剂量效应基于微流卡的验证实验)或非配对t-检验，p<0.05，为显著性差异。

Real-time RT-PCR数据分析结果见图3。图3结果显示，与二维培养体系相比，三维胶原海绵培养体系培养的神经干细胞中，干性维持相关基因Nestin、Sox2、Vimentin表达量高，神经元分化相关基因Map2、Tuj1表达量低，并且均达到了显著性差异。Real-time PCR结果表明，与传统二维培养体系相比，三维胶原海绵培养体系能够更好的维持神经干细胞的自我更新能力，抑制其分化能力。

实施例4、Real-time PCR方法检测miR-7和Klf4基因在常规二维培养体系与三维胶原海绵培养体系中培养的神经干细胞中的表达

（一）miR-7的检测

利用Real-time PCR方法检测miR-7分别在常规二维培养体系或三维胶原海绵培养体系中培养了24、48、72、96小时的神经干细胞中的表达情况，检测方法同实施例2中的Real-time RT-PCR验证芯片检测结果过程相同，不同的只是将实施例2中的PA-1细胞相应的替换为在实施例1中的二维培养体系和三维胶原海绵培养体系中培养了24、48、72、96小时的大鼠神经干细胞。此处的24、48、72、96小时是以实施例1中的二维培养体系和三维胶原海绵培养体系中，将细胞培养基更换为内含体积百分比为2%的B27和30%葡萄糖的神经干细胞分化培养基时开始计算的。

（二）Klf4基因的检测

利用Real-time PCR方法检测Klf4基因分别在常规二维培养体系或三维胶原海绵培养体系中培养了24、48、72、96小时的神经干细胞中的表达情况，检测方法同实施例3，不同的是将实施例3中的大鼠神经干细胞1×10⁶细胞替换为在实施例1中的二维培养体系和三维胶原海绵培养体系中培养了24、48、72、96小时的大鼠神经干细胞，此处的24、48、72、96小时是以实施例1中的二维培养体系和三维胶原海绵培养体系中，将细胞培养基更换为内含体积百分比为2%的B27和30%葡萄糖的神经干细胞分化培养基时开始计算的；此外，实施例3中real-time PCR检测的目的基因替换为Klf4，扩增反应所使用的引物序列替换为：

上游引物序列:ACTTGTGACTATGCAGGCTG;

下游引物序列：ACAGTGGTAAGGTTTCTCGC。

（三）Real-time PCR检测结果分析

Real-time PCR检测结果见图4。图4（A）结果显示，miR-7的表达在二维培养体系中呈时间依赖性增加，然而其表达在三维胶原海绵培养体系中表达相对稳定；同时，图4（B）结果显示，miR-7调控的其下游Klf4基因的表达在二维培养体系中呈时间依赖性降低，然而其表达在三维胶原海绵培养体系中表达相对稳定。图4结果表明，miR-7在三维胶原海绵培养体系中参与了神经干细胞自我更新的维持。

实施例5、细胞内过表达miR-7或敲低miR-7表达后检测其对神经干细胞分化的影响

（一）细胞转染

通过Lipofectamine^TM2000试剂盒分别转染miR-7-5p mimics，miR-7-5pinhibitor，miR-7模拟物阴性对照（negative control）和抑制物阴性对照（miRNAinhibitor negative control）核酸序列至神经干细胞内，过表达或敲低神经干细胞中的miR-7，同时设置针对Klf4基因的siRNA实验对照组和Klf4siRNA+inhibitor实验对照组。

各组转染的核酸序列如下所示：

miR-7-5p mimics序列为双链：

5’-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU-3’,

5’-AACAAAAUCACUAGUCUUCCAUU-3’；

miR-7-5p inhibitor序列为单链：

5’-ACAACAAAAUCACUAGUCUUCCA-3’；

negative control序列为双链：

5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’,

5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；

miRNA inhibitor negative control：

5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。

由吉玛公司合成上述miR-7-5p mimics，miR-7-5p inhibitor，negativecontrol，miRNA inhibitor negative control核酸片段。

针对Klf4基因的siRNA实验对照组转染的核酸序列如下所示：

Klf4siRNA1：

5’-UGAGAUGGGAACUCUUUGUGUAGGUTT-3’,

5’-ACCUACACAAAGAGUUCCCAUCUCATT-3’；

Klf4siRNA2：

5’-AUCGUUGAACUCCUCGGUCUCUCUCTT-3’,

5’-GAGAGAGACCGAGGAGUUCAACGAUTT-3’

Klf4siRNA+inhibitor实验对照组转染的核酸序列如下所示：

Klf4siRNA1：

5’-UGAGAUGGGAACUCUUUGUGUAGGUTT-3’,

5’-ACCUACACAAAGAGUUCCCAUCUCATT-3’；

Klf4siRNA2：

5’-AUCGUUGAACUCCUCGGUCUCUCUCTT-3’,

5’-GAGAGAGACCGAGGAGUUCAACGAUTT-3’。

miR-7-5p inhibitor序列：

5’-ACAACAAAAUCACUAGUCUUCCA-3’

由吉玛公司合成上述核酸片段。

细胞转染过程如下所述：

1）转染前一天，将实施例1悬浮培养扩增后的大鼠神经干细胞以合适的细胞密度接种到48孔培养板上，接种密度是1×10⁵/ml；用神经干细胞贴壁培养基（贴壁培养基内含10%胎牛血清，1%双抗的高糖DMEM培养基）进行培养，转染时，细胞要达到80-90%的融合；

2）配制溶液1：49μl无血清培养基+1ul lipofectamine2000（总体积50μl）（温育5min）；（无血清、无双抗的DMEM高糖培养基）

3）配制溶液2：50μl含有不同的转染物的无血清培养基（无血清、无双抗的DMEM高糖培养基），所含转染物的名称及其在50μl体系中的浓度分别为：10nM miR-7-5p mimics；10nM miR-7-5p inhibitor；10nM negative control；10nM miRNA inhibitor negativecontrol；1μM Klf4siRNA1+1μM Klf4siRNA2；1μM Klf4siRNA1+1μM Klf4siRNA2+10nM miR-7-5p inhibitor）；此外，设置加入等体积的无血清培养基作为空白对照CTR。

4）将溶液1和溶液2混合，室温静置20分钟

5）将48孔板细胞用无血清培养基清洗3遍，加入100μl无血清无双抗DMEM高糖培养基；

6）将混合后静置的溶液加入48孔板里，100μl/孔

7）培养8小时后换成含血清、双抗的；DMEM高糖培养基；，37℃、5%CO₂培养48h。

（二）Real-time PCR检测转染后神经干细胞中干性维持及神经分化相关基因的表达

将上述步骤7）培养的细胞在神经干细胞分化培养基（神经干细胞分化培养基100ml：非必需氨基酸100×1ml；丙酮酸钠100×1ml；双抗100×1ml；谷氨酰胺100×1ml；B2750×2ml；30%Glu2ml；DMEM/F12(1:1)92ml）中培养4天后，通过实时定量PCR方法检测神经干细胞中干性维持及神经分化相关基因的表达，Real-time PCR检测过程同实施例3，不同的只是将实施例3中的二维培养体系和三维胶原海绵培养体系中的大鼠神经干细胞替换为本实施例中处理后的大鼠神经干细胞。

Real-time PCR检测结果见图5。图5结果显示，与CTR对照组（未转染细胞的空白对照）的神经干细胞相比，转染了miR-7-5p mimics的神经干细胞（为图5中的Mi）中干性维持相关基因Nestin、Sox2、Vimentin表达量降低，其中Nestin、Vimentin基因的表达量分别达到了P<0.05的显著性差异和P<0.01的极显著性差异,但是sox2基因的表达量降低没有统计学意义；神经元分化相关基因Map2、Tuj1表达量升高，并且均达到了P<0.01的极显著性差异；而转染了miR-7-5p inhibitor的神经干细胞（为图5中的In），中干性维持相关基因Nestin、Sox2、Vimentin表达量升高，其中Nestin、Vimentin基因的表达量分别达到了显著和极显著的差异，神经元分化相关基因Map2、Tuj1表达量降低，并且均达到了极显著性差异。negative control组与miRNAinhibitor negative control组与对照组相比无统计学差异。针对Klf4基因的siRNA实验对照组的结果见图5中siRNA和siRNA+In所示结果，其中siRNA代表siRNA实验对照组结果，siRNA+In代表Klf4siRNA+inhibitor实验对照组结果，实验结果表明miR-7与针对Klf4基因的siRNA在促进神经干细胞的分化方面作用相当。

细胞转染实验和Real-time PCR检测结果显示，在神经干细胞中过表达miR-7后，干性维持相关基因表达量降低，而神经元分化相关基因表达量升高。在神经干细胞中敲低miR-7表达后，干性维持相关基因表达量升高，而神经元分化相关基因表达量降低。细胞转染实验和Real-time PCR检测结果表明miR-7可促进神经干细胞的分化、抑制神经干细胞的全能性或抑制神经干细胞的自我更新，并且miR-7与针对Klf4基因的siRNA在促进神经干细胞的分化方面作用相当。

（三）免疫荧光法检测转染后神经干细胞中干性维持及神经分化相关基因的表达

免疫荧光方法如下所述：

1）将上述在分化培养基中培养了4天后的神经干细胞，经PBS洗去培养基，4%多聚甲醛固定30分钟；

2）PBS洗涤2次，每次5分钟；

3）含0.5%的TritonX-100的PBS缓冲液中室温下孵育5min；

4）PBS洗涤2次，每次5分钟；

5）用含体积百分比为5%正常羊血清的PBS液中孵育30min；

6）PBS洗涤2次，每次5分钟；

7）分别滴加相应的免疫荧光一抗4℃过夜；一抗具体为：Tuj1(Millipore)，Nestin(eBioscience)，MAP2(Sigma)，Sox2(Life Technologies)，Vimentin(Sigma)；

8）PBS洗涤3次，每次5分钟；

9）分别加入相应的免疫荧光二抗，37℃孵育30min；二抗具体为：Dylight488-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG(Jackson ImmunoResearch)，AlexaFluor488donkey anti-rabbit IgG(Life Technologies)和Hochest33342(Sigma)；

10）PBS洗涤3次，每次5分钟；

显微镜下观察并随机选择4个视野记阳性细胞数,拍照。

用PBS代替一抗做空白对照，排除非特异荧光及细胞自发荧光。

免疫荧光检测结果见图6。图6中，柱状图的纵坐标代表免疫荧光阳性细胞比例，数据是随机选取三个视野，统计视野内阳性细胞比例，阳性细胞是发绿色荧光信号的细胞。

图6（A）-(E)结果显示，与CTR对照组的（CTR对照指的是未转染细胞的的空白对照）神经干细胞相比，转染了miR-7-5p mimics的神经干细胞中（为图6中的mimics）干性维持相关基因Nestin、Sox2、Vimentin表达量降低，并且相应的阳性细胞数减少，其中Nestin、Vimentin基因的表达量和阳性细胞数分别达到了显著（P<0.05）和极显著（P<0.01）性差异,神经元分化相关基因Map2、Tuj1表达量升高，相应的阳性细胞数增加，并且均达到了极显著性差异；而转染了miR-7-5p inhibitor的神经干细胞（为图6中的inhibitor，中干性维持相关基因Nestin、Sox2、Vimentin表达量升高，并且相应的阳性细胞数增加，其中Nestin、Vimentin基因的表达量和阳性细胞数分别达到了显著和极显著的差异，神经元分化相关基因Map2、Tuj1表达量降低，阳性细胞数减少，并且均达到了极显著性差异；模拟物阴性对照（negative control）和抑制物阴性对照（miRNA inhibitor negative control）（图6中分别用NC和INNC来表示）与空白对照CTR的结果基本一致。针对Klf4基因的siRNA实验对照组的结果见图6中siRNA和siRNA+In所示结果，其中siRNA代表siRNA实验对照组结果，siRNA+In代表Klf4siRNA+inhibitor实验对照组结果，实验结果表明miR-7与针对Klf4基因的siRNA在促进神经干细胞的分化方面作用相当。

细胞转染实验和免疫荧光检测结果显示，在神经干细胞中过表达miR-7后，干性维持相关基因表达量降低，并且相应的阳性细胞数减少；而神经元分化相关基因表达量升高，相应的阳性细胞数增加。在神经干细胞中敲低miR-7表达后，干性维持相关基因表达量升高，并且相应的阳性细胞数增加；而神经元分化相关基因表达量降低，相应的阳性细胞数减少。细胞转染实验和免疫荧光检测结果表明miR-7可促进神经干细胞的分化、抑制神经干细胞的全能性或抑制神经干细胞的自我更新，并且miR-7与针对Klf4基因的siRNA在促进神经干细胞的分化方面作用相当。

Claims

1.miRNA在制备具有调控Map2和/或Tuj1基因表达功能产品中的应用；所述miRNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。