CN102115785A

CN102115785A - 一种高通量筛选microRNA靶基因的新方法

Info

Publication number: CN102115785A
Application number: CN2010100339120A
Authority: CN
Inventors: 刘德培; 李振亚; 习杨; 朱文楠; 曾超; 吕湘
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS; Institute of Basic Medical Sciences of CAMS
Priority date: 2010-01-06
Filing date: 2010-01-06
Publication date: 2011-07-06

Abstract

本发明涉及一种高通量筛选microRNA靶基因的新方法。特别地，本发明涉及一种利用生物素修饰的microRNA模拟物高通量筛选microRNA靶基因的新方法，其主要特征在于设计与合成带有生物素修饰的microRNA模拟物及利用含对生物素具有强亲和性的配偶体的磁珠对生物素修饰的microRNA模拟物直接结合的靶基因mRNA进行富集和选择。本发明将microRNA直接相互作用的mRNA靶基因进行富集，避免了其他方法可能存在的“假阳性”问题，而且操作简便，费用相对较低，适用于大多数实验室。

Description

一种高通量筛选microRNA靶基因的新方法

技术领域

本发明涉及一种利用生物素修饰的microRNA模拟物高通量筛选microRNA靶基因的新方法。

背景技术

microRNA(简称miRNA)是与转录后基因沉默相关的一类长度为21-23nt的重要RNA，最早在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现[1]。现已证实，miRNA广泛存在于真核生物细胞内，是最大的基因家族之一，大约占整个基因组的1％-4％[2]。最近研究表明，miRNA功能广泛，在生物体内的多种生物学过程和调控途径中扮演着关键性角色，如发育进程控制、细胞生长与凋亡、细胞分裂、细胞分化与器官发育、病毒感染、维持机体生理活动的动态平衡等[3]。而且，一些重要的miRNA的失调将会导致细胞调控事件的剧变，甚至可能诱发癌症[4]。miRNA与其靶分子以及调控其自身表达的转录因子组成了一个复杂的调控网络[5]，使我们对于基因表达调控网络的认识更加全面和深入，上升到了一个新的高度。

目前，从microRNA(miRNA)基因的转录、加工到对靶基因的识别过程都有了较为深入地研究，这个过程通常被认为是一个从细胞核到细胞质逐渐加工的过程[6]：在细胞核内，microRNA是由RNA聚合酶II(PolII)[7]或RNA聚合酶III(PolIII)[8]转录的，一般初始转录本为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA[9，10]。这些pri-miRNA在核糖核酸酶Drosha[11]和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个左右的核苷酸组成的前体产物pre-miRNA[12，13]，转运蛋白RAN-GTP和exportin 5[14-16]将这种前体分子输送到细胞质中。随后，细胞质中另一个核糖核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA*双链[17，18]。同样，具有这样结构的双链RNA在转染入细胞后也会被内源性RNA酶系统识别，很快被引导进入miRNA沉默复合体(miRISC)中[19]，其中含有Argonaute、TRBP等蛋白，并且将成熟的单链miRNA保留在这一复合物中，形成活性miRNA沉默复合体。活性miRNA沉默复合体在所包裹的成熟miRNA引导下，结合到与成熟miRNA互补的mRNA的位点上，并会与mRNA 5’和3’结合蛋白发生竞争性相互作用，通过两种依赖于序列互补性的机制负调控基因表达[20]：如果miRNA与靶位点完全互补(或者几乎完全互补)，那么这些miRNA的结合往往引起靶mRNA的降解，通过这种机制作用的miRNAs的结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中；与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达或间接影响mRNA的稳定性，使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非翻译区。而且，microRNA沉默复合物与microRNA靶基因mRNA这种相互作用在一定时间内是很稳定的[21]，这就为进行microRNA靶基因的富集和筛选提供了可能。

microRNA在对其靶基因进行识别和作用过程中，其5’部分与对应靶基因mRNA的3’部分的配对十分重要，这一点最早在对线虫的研究中得以发现。当时的研究结果表明，lin-14UTR区存在一个核心元件，可以与lin-4miRNA的5’部分互补[22]。更多最近的研究结果支持microRNA的5’部分与对应靶基因mRNA的3’部分的配对的重要性：1)几个能够通过在转录后水平发挥抑制作用的无脊椎动物的miRNA，其2-8位核苷酸都分别与其靶基因的3’UTR精确互补；2)miRNA的2-8位核苷酸及与其相互补的mRNA上相对应的碱基位置在进化上都非常保守[23，24]；3)miRNA的2-8位核苷酸对于miRNA特异性识别非常重要[24]。另外，由于microRNA沉默复合物中的重要成分之一Argonaute蛋白会与microRNA的3’端相互作用，在对microRNA进行人工修饰的时候通常选择正义链的5’端碱基。

microRNA靶基因的确定是microRNA功能研究中的一个核心问题，随着研究的不断深入，microRNA靶基因筛选和鉴定方法也在不断发展。在研究的早期，较多采用生物信息学预测结合荧光素酶报告基因系统在体外对microRNA的靶基因进行验证。但这种方法常常只能对microRNA进行一一分析，费时费力，且microRNA靶基因分析范围有限，并不适合进行高通量分析。microRNA抑制子修饰技术的发展为microRNA功能的研究提供了新的思路，利用经2’-O甲基化修饰后或用LNA合成的microRNA抑制子结合全基因组表达谱芯片分析技术，可以高通量分析内源性microRNA被敲低后的基因表达谱变化并进行聚类分析，从而推测microRNA的功能。但由于这些方法往往通过检测整个基因组表达谱的变化来推测microRNA的靶基因，而由于有些基因的变化并非microRNA直接作用而造成的，这就有可能造成筛选到的靶基因存在“假阳性”。

因此，迫切需要一种既能高通量筛选microRNA靶基因，又能降低或排除“假阳性”靶基因的技术。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种既能高通量筛选microRNA靶基因，又能降低或排除“假阳性”靶基因的技术。

因此，本发明的第一方面涉及一种高通量筛选microRNA靶基因的方法，其包含下述步骤：

a)根据要研究的microRNA的序列，进行带有生物素修饰的microRNA模拟物的设计与合成，

b)选择合适的目的细胞，进行microRNA模拟物的转染，并设立相应阴性对照和阳性对照，

c)利用含对生物素具有强亲和性的配偶体的磁珠对生物素修饰的microRNA模拟物直接结合的靶基因mRNA进行富集，并经过洗涤去除非特异性结合的mRNA，经洗脱后最终获得microRNA靶基因mRNA库。

优选地，所述方法进一步包括步骤：

d)将获得的microRNA靶基因mRNA两端分别加上已知序列的接头，经过PCR扩增后构建microRNA靶基因cDNA文库，并进行测序和序列比对，以确定microRNA靶基因的信息和功能。

优选地，所述方法进一步包括步骤：

e)在体外利用基因表达报告系统，将microRNA模拟物与含有microRNA靶基因3’UTR区的相应基因表达报告载体共转染，以确定microRNA对候选靶基因的负调节作用。

优选地，所述对生物素具有强亲和性的配偶体选自链霉亲和素、亲和素、抗生物素蛋白，更优选地，所述对生物素具有亲和性的配偶体是链霉亲和素。

优选地，所述基因表达报告系统选自荧光素酶报告系统、绿色荧光蛋白报告系统、半乳糖苷酶报告基因系统、硝基还原酶报告基因系统、氯霉素乙酰基转移酶报告基因系统或分泌型碱性磷酸酶报告基因系统，更优选地，所述基因表达报告系统是荧光素酶报告系统。

优选地，所述生物素修饰经由本领域常规方法进行。

本发明的第二方面涉及如上所述的方法在筛选microRNA靶基因中的用途。

换言之，为了更加准确地对microRNA靶基因进行筛选和鉴定，本技术采用生物化学方法对microRNA直接结合的靶基因mRNA进行了富集，该方法的原理如下：用生物素修饰后的microRNA模拟物转染细胞，利用内源性microRNA的加工系统将带有生物素修饰的microRNA包裹入microRNA沉默复合物，进而识别和结合其靶基因。然后，提取细胞质粗提物，通过生物素与抗生物素蛋白——链霉亲和素的强相互作用，利用表面带有链霉亲和素的磁珠将microRNA沉默复合物偶联的靶基因mRNA富集。将富集的mRNA洗脱后进行逆转录形成cDNA，构建文库，然后进行测序鉴定。

具体而言，本技术的操作要点主要包括以下几个步骤：

a)根据要研究的microRNA的序列，进行带有生物素修饰microRNA模拟物的设计与合成，

c)利用链霉亲和素磁珠对生物素修饰microRNA模拟物直接结合的靶基因mRNA进行富集，并经过洗涤去除非特异性结合的mRNA，经洗脱后最终获得microRNA靶基因mRNA库，及

d)可选地，将获得的microRNA靶基因mRNA两端分别加上已知序列的接头，经过PCR扩增后构建microRNA靶基因cDNA文库，并进行测序和序列比对，以确定microRNA靶基因的信息和功能，及

e)可选地，在体外利用荧光素酶报告系统，将microRNA模拟物与含有microRNA靶基因3’UTR区的荧光素酶报告载体共转染，以确定microRNA对候选靶基因的负调节作用。

本技术最大的优势在于，将microRNA直接相互作用的mRNA靶基因进行富集，避免了其他方法可能存在的“假阳性”问题，而且操作简便，费用相对较低，适用于大多数实验室。

附图说明

图1：利用带有生物素标记的microRNA模拟物高通量捕获microRNA靶基因的技术路线图。

图2：带有荧光基团FAM的microRNA模拟物可以成功高效率转染HEK-293细胞，其中GFP作为阳性对照。

图3：利用Northern blot方法，以microRNA特异性探针检测microRNA模拟物在细胞内的正确表达。

图4：microRNA模拟物转染目的细胞后捕获的cDNA片段，两端连入接头后经过PCR扩增后得到的结果。

图5：microRNA模拟物miR-7与带有候选靶基因3’非编码区(3’-UTR)的报告基因质粒(luc-UTR)共转染293T细胞进行microRNA对靶基因负调节作用的验证。

图6：microRNA模拟物miR-122与带有候选靶基因3’非编码区(3’-UTR)的报告基因质粒(luc-UTR)共转染293T细胞进行microRNA对靶基因负调节作用的验证。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例1实验材料及方法

1.microRNA模拟物的设计、合成

microRNA模拟物是模拟内源性microRNA的成熟过程中的发夹形前体而人工合成的结构型双链RNA，其中正义链与microRNA成熟序列相同，其5’末端一个碱基在合成时带有生物素标记，而反义链与正义链5’端起19个核苷酸反向互补，并在正义和反义链的3’末端各有两个碱基突出。microRNA模拟物的合成由genepharma公司完成。本实验中选择两个代表性的miRNA进行后续实验，实验中涉及的寡聚核苷酸序列如表1所述：

表1：实验中涉及的寡聚核苷酸序列

SEQIDNO：	序列名称	序列
			1	miR-7序列	5’-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU-3’
2	miR-7模拟物序列正链	5’-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU-3’
			3	miR-7模拟物序列负链	5’-AACAAAAUCACUAGUCUUCCAUU-3’
4	miR-122序列	5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’
			5	miR-122模拟物序列正链	5’-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’
6	miR-122模拟	5’-AACACCAUUGUCACACUCCAUU-3’

	物序列负链
			7	阴性对照序列正链	5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUUU-3’
8	阴性对照序列负链	5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAUU-3’

注：其中microRNA模拟物5’末端一个碱基在合成时带有生物素标记。

2.microRNA模拟物的转染

将合成好的microRNA模拟物及其阴性对照用适量DEPC水溶解，使得终浓度均为20μM。

选择要研究的目标细胞，用100mm直径的培养皿培养细胞至70％汇合状态，细胞数量至少要达到4×106个，在转染前更换为无血清培养基OPTI-MEM I

使用10μl microRNA模拟物，然后用500μl OPTI-MEM I

稀释，同时取10μl microRNA模拟物专用转染试剂用500μlOPTI-MEM I

稀释，室温下静置5分钟。

将稀释后microRNA模拟物同稀释后的转染试剂混匀，室温下静置20分钟。

将上述混合物逐滴加入细胞培养皿，转染后6小时换液并继续培养24小时。

3.microRNA靶基因的富集

从这一部分开始，所有的操作均在冰浴上进行。对于贴壁细胞，可直接将培养基去除，用PBS快速清洗两次，用细胞刮子将细胞刮下并重悬于1ml细胞质提取缓冲液；对于悬浮细胞，要离心收集细胞后，用PBS离心清洗两次后用1ml细胞质提取缓冲液重悬。

将上述重悬液置于冰浴上10分钟，用5000rpm转速，4℃离心5分钟，收集上清。

加入100μl链霉亲和素磁珠，在4℃孵育3小时后，用磁珠分离装置将磁珠收集在EP管底部，然后去除上清。

加入磁珠漂洗液，4℃漂洗5分钟，用磁珠分离装置将磁珠收集在EP管底部，然后去除上清，重复本步骤两次。

加入200μl含有蛋白酶K和DNase I的洗脱缓冲液，37℃处理30分钟，然后进行酚/氯仿抽提，上清加入1/10体积的3M醋酸钠、核酸助沉剂和2.5倍体积的乙醇，-20℃放置1小时以上。离心沉淀，75％乙醇漂洗后晾干，用20μl DEPC水溶解。

4.microRNA靶基因cDNA文库的构建与测序鉴定

取上述纯化后的RNA，用T4RNA连接酶将其3′末端连接上寡核苷酸接头(5′AppCTGTAGGCACCATCAddA3′(SEQ ID NO：9)，其中5′经磷酸化修饰，3′经双脱氧修饰)，连接产物用RNA纯化试剂盒进行纯化。随后，将连接后的产物通过以上方法再连接到5′杂合寡核苷酸接头(5′ATCGTaggcacctgaaa3′(SEQ ID NO：10)，其中大写字母部分代表DNA，小写字母代表RNA部分)。

连接产物纯化后用Invitrogen公司的Superscript-II型反转录酶和3′反转录引物(5′ATTGATGGTGCCTAC3′(SEQ ID NO：11))将其反转录成cDNA。

以反转录好的cDNA为模板，用3′接头引物：5′-ATTGATGGTGCCTACAG-3′(SEQ ID NO：12)和5′接头引物：5′-ATCGTAGGCACCTGAAA-3′(SEQ ID NO：13)进行PCR扩增。PCR反应过程为(100μl反应体系)：分别加71μlddH2O，10μl 10×Buffer，10μl dNTPs(10mmol/L)，3′接头和5′接头引物各1μl(100pmol/μl)，2μl DNA聚合酶(2U/μl)，5μl cDNA模板。PCR反应程序：95℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火复性30s，72℃延伸30s，30个循环，4℃保存。

PCR产物经纯化后连接入pGEM-T载体，转化DH5α感受态细胞后进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆后进行质粒提取和测序鉴定。

5.microRNA靶基因的验证

在经过测序确定了microRNA直接结合的候选靶基因后，还要进行microRNA对于靶基因是否具有负调节作用的验证实验，具体方法如下：

将microRNA的靶基因的3’-UTR区域克隆到报告基因的下游，构建luc-UTR系列质粒，然后与microRNA模拟物(microRNAmimics)共转染目的细胞，以pRL-TK-Renilla质粒作为内对照，并设立阴性对照(在lucifease报告基因下游不含任何靶基因的UTR区域)和阳性对照(在lucifease报告基因下游含有与microRNA完全互补的序列)。

按说明书操作：转染后24h弃去培养基，用50微升1×passivelysis buffer裂解细胞20min。将荧光素酶底物反应液混匀备用。接下来的操作在荧光检测仪前进行。首先检测空管荧光值3次，用均值校0。在荧光检测管中加入10微升细胞裂解液和40微升LAR底物溶液，检测目的基因的firefly荧光值；接着反应体系中再加入40微升Stop&Glo试剂，在灭活firefly荧光的同时激活Renilla荧光，混匀后，立即检测对照质粒荧光值。用相对荧光值作为衡量启动子活性的指标，相对荧光值＝目的基因荧光值/对照基因荧光值。以上所有报告检测检测均设3个复孔，以校正数据可能造成的偏差。将所得数据用SPSS10.0软件进行统计学分析，进行组内标准偏差分析，结果用均数±标准差(±SEM)表示，两组间比较用student t检验，p＜0.05认为有统计差异(以^*表示)，p＜0.01认为差异极显著(以^**表示)。

实施例2试验结果与主要结论

利用生物素修饰的microRNA模拟物高通量筛选microRNA靶基因的新技术，我们随机选取的两个microRNA(miR-7和miR-122)，进行了microRNA双链模拟物的设计与合成。我们首先将带有FAM修饰的microRNA模拟物转染目的细胞，并通过激光共聚焦成像(图2)和Northern blot(图3)可以确定microRNA模拟物能够有效持续地在目的细胞内表达，以保证本技术系统后续步骤的进行。随后利用链霉亲和素磁珠对转染后目的细胞胞浆粗提物中的microRNA靶基因mRNA进行了捕获，并建立了miR-7和miR-122靶基因的cDNA文库，PCR结果显示microRNA模拟物捕获的片段长度分布广泛，但分别具有不同的特异性条带(图4)。通过在体外利用荧光素酶报告基因系统对miR-7和miR-122靶基因进行随机验证发现，microRNA对各个随机选取的靶基因具有明显的负调节作用(图5)。同时，将我们获得的miR-7和miR-122靶基因信息进行数据分析后发现，miR-7的功能主要是参与AKT信号通路调节与细胞增殖(表1)，miR-122主要参与脂肪酸与胆固醇的代谢(表2)，这些都与相关文献中的报道相吻合。

表2：miR-122候选靶基因信息表(部分)

靶基因名称	miR-122识别序列	靶基因功能
			细胞周期蛋白G1(CCNG1)	5’-GUUUGUGGUAACAGUGUGAGGU-3’(SEQID NO：14)	细胞周期调节
柠檬酸合成酶(CS)	5’-gaGAAAGGAUUAAGAUACACUCCu-3’(SEQID NO：15)	三羧酸循环关键酶
			胞嘧啶脱氨基酶(CDA)	5’-guuugugguaacAGUGUGAGGU-3’(SEQ IDNO：16)	核酸代谢
支链氨基转移酶2(BCAT2)	5’-cccAUGUGGUUGCGACACUCCc-3’(SEQ IDNO：17)	氨基酸代谢
			39S核糖体蛋白L9(MRPL9)	5’-CAAGCACCCUGAUCUCACUCCC-3’(SEQ IDNO：18)	线粒体组装
低密度脂蛋白相关蛋白10(LRP10)	5’-aGAGGAUCAUAGGUCUGGACACUCCA-3’(SEQ ID NO：19)	脂肪酸代谢
			脂肪酸结合蛋白1(FABP1)	5’-ACAACAUCAGAUGAACACUUCA-3’(SEQID NO：20)	脂肪酸代谢
琥珀酸辅酶A连接酶2(SUCLA2)	5’-uaAACAGAGCUUUCAAACACUCCu-3’(SEQID NO：21)	脂肪酸代谢
			磷酸甲羟戊酸激	5’-UGUUUGUGGUAAC	胆固醇合成

酶(PMVK)	AGUGUGAGG-3’(SEQID NO：22)
			磷酸二羟丙酮酰基转移酶(GNPAT)	5′-gAGACACAUCCUCUCAUACUCCc-3’(SEQID NO：23)	磷脂合成

表3：miR-7候选靶基因信息表(部分)

靶基因名称	miR-7识别序列	靶基因功能
			胰岛素受体底物1(IRS1)	5′-aaGAGGAAAUUAAAGUCUUCCa-3’(SEQ ID NO：24)	胰岛素信号传递
胰岛素受体底物2(IRS2)	5′-uuAAUGGCAAUGCAAAAGUCUUCCu-3′(SEQ ID NO：25)5′-uuAACUUAUCUUGCUCUGUCUUCCa-3′(SEQ ID NO：26)	胰岛素信号传递
			胰岛素降解酶(IDE)	5′-ugGAUGCAUUCCUGA GUCUUCCa-3′(SEQ ID NO：27)	胰岛素信号传递
6磷酸肌醇激酶1(IP6K1)	5′-ugguCACAAAUUACAGUCUUCUc-3′(SEQ ID NO：28)	磷酸肌醇代谢
			胁迫相关内质网蛋白1(SERP1)	5’-auAAUGAUCAGUCUUUAGUCUUCCc-3′(SEQ ID NO：29)	跨膜转运
磷酸烯醇丙酮酸羧激	5’-ugGGCAAGAUGA	糖质新生

酶(PCK1)	CCUACUAGUUUUCCu-3’(SEQ ID NO：30)	关键酶
			硬脂酸去饱和酶(SCD)	5’-acuAUAAGGUGCCUCAGUUUUCCu-3’(SEQ ID NO：31)	脂肪酸代谢
长链酰基辅酶A合成酶4(ACSL4)	5′-agAAGAAAAUGUCUGUCUUUCu-3′(SEQID NO：32)	脂肪酸代谢
			过氧化物酶体增殖物激活受体A(PPARA)	5’-aaAAAAAAAUCUUGGGUCUUCgu-3’(SEQ ID NO：33)	脂肪酸代谢

过氧化物酶体增殖物激活受体gamma共激活因子(PPARGC1)

5′ucAGAGAGGUUAUUUGUUUUCCc 3′(SEQID NO：34)

线粒体合成/脂肪酸代谢

以上结果证明了本技术对于鉴定microRNA靶基因的有效性，为microRNA的功能研究提供了新的技术手段。

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序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>一种高通量筛选microRNA靶基因的新方法

<130>890307CG

<160>34

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>miR-7序列

<400>1

uggaagacua gugauuuugu ugu 23

<210>2

<211>23

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>miR-7模拟物序列正链

<400>2

uggaagacua gugauuuugu ugu 23

<210>3

<211>23

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>miR-7模拟物序列负链

<400>3

aacaaaauca cuagucuucc auu 23

<210>4

<211>22

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>miR-122序列

<400>4

uggaguguga caaugguguu ug 22

<210>5

<211>22

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>miR-122模拟物序列正链

<400>5

uggaguguga caaugguguu ug 22

<210>6

<211>22

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>miR-122模拟物序列负链

<400>6

aacaccauug ucacacucca uu 22

<210>7

<211>21

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>阴性对照序列正链

<400>7

uucuccgaac gugucacguu u 21

<210>8

<211>21

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>阴性对照序列负链

<400>8

acgugacacg uucggagaau u 21

<210>9

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>3′末端寡核苷酸接头

<400>9

actgtaggca ccatcaa 17

<210>10

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>5′杂合寡核苷酸接头

<400>10

atcgtaggca cctgaaa 17

<210>11

<211>15

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>3′反转录引物

<400>11

attgatggtg cctac 15

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>3′接头引物

<400>12

attgatggtg cctacag 17

<210>13

<211>17

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>5′接头引物

<400>13

atcgtaggca cctgaaa 17

<210>14

<211>22

<212>RNA

<213>人类

<400>14

guuuguggua acagugugag gu 22

<210>15

<211>24

<212>RNA

<213>人类

<400>15

gagaaaggau uaagauacac uccu 24

<210>16

<211>22

<212>RNA

<213>人类

<400>16

guuuguggua acagugugag gu 22

<210>17

<211>22

<212>RNA

<213>人类

<400>17

cccauguggu ugcgacacuc cc 22

<210>18

<211>22

<212>RNA

<213>人类

<400>18

caagcacccu gaucucacuc cc 22

<210>19

<211>26

<212>RNA

<213>人类

<400>19

agaggaucau aggucuggac acucca 26

<210>20

<211>22

<212>RNA

<213>人类

<400>20

acaacaucag augaacacuu ca 22

<210>21

<211>24

<212>RNA

<213>人类

<400>21

uaaacagagc uuucaaacac uccu 24

<210>22

<211>22

<212>RNA

<213>人类

<400>22

uguuuguggu aacaguguga gg 22

<210>23

<211>23

<212>RNA

<213>人类

<400>23

gagacacauc cucucauacu ccc 23

<210>24

<211>22

<212>RNA

<213>人类

<400>24

aagaggaaau uaaagucuuc ca 22

<210>25

<211>25

<212>RNA

<213>人类

<400>25

uuaauggcaa ugcaaaaguc uuccu 25

<210>26

<211>25

<212>RNA

<213>人类

<400>26

uuaacuuauc uugcucuguc uucca 25

<210>27

<211>23

<212>RNA

<213>人类

<400>27

uggaugcauu ccugagucuu cca 23

<210>28

<211>23

<212>RNA

<213>人类

<400>28

uggucacaaa uuacagucuu cuc 23

<210>29

<211>25

<212>RNA

<213>人类

<400>29

auaaugauca gucuuuaguc uuccc 25

<210>30

<211>27

<212>RNA

<213>人类

<400>30

ugggcaagau gaccuacuag uuuuccu 27

<210>31

<211>24

<212>RNA

<213>人类

<400>31

acuauaaggu gccucaguuu uccu 24

<210>32

<211>22

<212>RNA

<213>人类

<400>32

agaagaaaau gucugucuuu cu 22

<210>33

<211>23

<212>RNA

<213>人类

<400>33

aaaaaaaaau cuugggucuu cgu 23

<210>34

<211>23

<212>RNA

<213>人类

<400>34

ucagagaggu uauuuguuuu ccc 23

Claims

1.一种高通量筛选microRNA靶基因的方法，其包含下述步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法进一步包括步骤：

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述方法进一步包括步骤：

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述对生物素具有强亲和性的配偶体选自链霉亲和素、亲和素、抗生物素蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述对生物素具有强亲和性的配偶体是链霉亲和素。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述基因表达报告系统选自荧光素酶报告系统、绿色dd荧光蛋白报告系统、半乳糖苷酶报告基因系统、硝基还原酶报告基因系统、氯霉素乙酰基转移酶报告基因系统或分泌型碱性磷酸酶报告基因系统。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述基因表达报告系统是荧光素酶报告系统。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述生物素修饰经由本领域常规方法进行。

9.根据权利要求1到8任一项所述的方法在筛选microRNA靶基因中的用途。