CN102191310A - 与喜树碱类药物敏感相关的miRNA的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种与喜树碱类药物敏感相关的miRNA在检测肿瘤细胞对喜树碱类药物产生耐药性中的用途，该miRNA选自SEQ ID NO：1～25所示序列。本发明还公开了上述miRNA在制备或筛选治疗肿瘤的药物中的用途。本发明与喜树碱类药物敏感相关的miRNA，可以用作预测病人对羟基喜树碱药物敏感程度的分子标志，为临床个性化用药提供依据，同时为抗耐药肿瘤药物设计和筛选提供新的靶点。

Description

与喜树碱类药物敏感相关的miRNA的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种与喜树碱类药物敏感相关的miRNA的应用。

背景技术

胃癌是世界上致死率第二位的癌症，占每年新增癌症患者的10％。喜树碱(CPTs)被称为拓扑异构酶I的“毒药”，已被批准用于包括胃癌在内的多种恶性肿瘤的化学治疗并且疗效显著。这类化合物能够与拓扑异构酶I和DNA形成的共价复合体结合形成三元可解离复合物，通过复制冲突模型造成DNA损伤，最终导致细胞死亡。但其在治疗肿瘤方面的疗效因人而异，耐药性仍然是临床治疗上的一个难题。细胞对喜树碱类药物原发性耐药和获得性耐药的机制仍不确定，以前的研究表明耐药表型可能是由肿瘤细胞内药物积累不足，药物靶标拓扑异构酶I发生改变或者细胞的药物反应如DNA修复和细胞凋亡发生改变等原因所造成。

Micro RNA(miRNA)是一类广泛存在于生物体内、长度在21-25bp之间、高度保守的非编码小RNA。它们以序列特异性方式调节基因表达，在发育、凋亡、代谢以及人类疾病方面都起着不容忽视的作用，从而受到广泛关注。结合到RISC复合物(asymmetric RISC assembly)上的miRNA通过与靶mRNA的3′UTR区结合，引起靶mRNA的降解或者翻译抑制从而改变靶基因的表达水平。目前人类基因组中鉴定出的miRNA已经超过1000个，据估计可调节约30％基因的表达和翻译。大约50％得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤发生相关的区域和脆性位点(fragile sites)，有些miRNA可能起到肿瘤抑癌基因或致癌基因的作用。

miRNA在许多肿瘤中表达异常，是潜在的药物靶点。但是，miRNA在药物敏感性方面的作用直到近几年才被揭示。2007年Bertino等人提出了“miRNA的药物基因组学”概念，指出通过研究miRNA及miRNA突变如何干扰miRNA的正常功能进而改变病人药物反应程度，最终可找出某些特定的miRNA用以指导病人的个性化用药。近年来的研究表明，miRNA相关的各种突变(miR-mutations)及miRNA表达水平的改变(misexpression)均能影响其对靶基因的转录后调节，从而改变靶蛋白的表达水平，最终影响肿瘤细胞的药敏性。2007年Mishra等首次证实miR-24结合位点的单碱基突变导致细胞对甲氨蝶呤的敏感性发生改变。正常情况下，miR-24可下调二氢叶酸还原酶(DHFR)的表达，使细胞对甲氨蝶呤敏感，但在有些细胞内，DHFR的3′UTR区靠近miR-24结合位点处发生829C→T的单碱基突变，致使miR-24无法正常与DHFR的mRNA配对，DHFR mRNA的半衰期延长为原来的两倍，DHFR的mRNA及蛋白水平均升高。因此同样剂量的甲氨蝶呤对细胞起不到原有作用，即产生了药物不敏感现象。此外，miRNA表达水平的异常也会影响肿瘤细胞的药物敏感度。Meng等证实胆管癌病人存在miR-21过表达现象，并且这种过表达导致病人对吉西他滨不敏感。2007年Si等发现用反义核酸技术下调miR-21可以增强MCF7细胞对拓扑替康的敏感性，这可能是由于抑制miR-21造成BCL-2蛋白的低表达，从而促进了细胞凋亡。Tsang等人的研究表明let-7a通过下调细胞凋亡中的启动酶Caspase-3抑制了细胞凋亡，在A431和HepG2细胞中过表达let-7a可增强它们对阿霉素、紫杉醇及干扰素-γ的耐药性，抑制let-7a则增加化疗药物引发的细胞凋亡。miR-214可靶向PTEN的3′UTR区导致PTEN蛋白低表达，Akt通路过度激活从而促进细胞增殖，致使过表达miR-214的卵巢癌病人对顺铂不敏感。其他研究揭示了miR-15b和miR-16、miR-221和miR-222、miR-328、miR-27a和miR-451的异常表达也与人类肿瘤细胞的耐药性相关。美国国家癌症研究中心(NCI)建立了60种肿瘤细胞系NCI-60的miRNA表达谱，并拟合出了用于预测肿瘤细胞对紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿霉素和环磷酰胺敏感程度的mRNA及miRNA特征谱。但NCI60细胞系中却缺少了原发性耐药极为明显的胃癌及肝癌细胞系，而且目前用样本或诱导细胞系进行获得性耐药的研究极为广泛，但实际上原发性耐药对于个性化治疗更具指导意义。

发明内容

本发明要解决缺少喜树碱类药物羟基喜树碱(HCPT)原发性耐药相关的miRNA的技术问题，提供一种与喜树碱类药物敏感相关的miRNA的应用，为临床个性化用药提供依据。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种miRNA的用途，用于制备检测肿瘤病人对于喜树碱类药物敏感程度的试剂或试剂盒；其中，所述miRNA选自SEQ ID NO：1～25所示序列的miRNA。

在本发明的另一方面，还提供了一种用于检测肿瘤病人对于喜树碱类药物敏感程度的试剂盒，所述的试剂盒包含：特异性地针对miRNA或其前体的引物或探针，所述miRNA选自SEQID NO：1～25所示序列的miRNA。

在本发明的另一方面，还提供了一种miRNA生物芯片，包括固相载体和探针，所述探针包含与喜树碱类药物敏感相关的miRNA序列的互补序列，该miRNA选自SEQ ID NO：1～25所示的序列。

利用本发明的miRNA生物芯片或试剂盒，可以检测细胞对喜树碱类药物的敏感性，从而判断病人对喜树碱类药物是否产生耐药性，进一步实现临床个性化用药。

在本发明的另一方面，还提供了一种miRNA的用途，用于制备或筛选治疗肿瘤的药物，所述药物用于改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性，所述miRNA选自SEQ ID NO：1～25所示序列的miRNA。

所述药物包含选自SEQ ID NO：5～13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25的miRNA或包含抗选自SEQ ID NO：1～4、SEQ ID NO：14～19、SEQ ID NO：21～22、SEQ ID NO：24的miRNA的反义寡核苷酸，该反义寡核苷酸与选自SEQ ID NO：1～4、SEQ ID NO：14～19、SEQID NO：21～22、SEQ ID NO：24的miRNA序列互补。

包含选自SEQ ID NO：5～13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25的miRNA的药物，可以施用于因低表达miRNA而引起对喜树碱类药物羟基喜树碱不敏感的HCPT耐药性病人，进而改善对HCPT的敏感性，提高HCPT的药效。

包含抗miRNA的反义寡核苷酸的药物，可以施用于因过表达miRNA而引起对喜树碱类药物羟基喜树碱不敏感的HCPT耐药性病人，进而改善对HCPT的敏感性，提高HCPT的药效。

在本发明的另一方面，还提供了一种筛选改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达miRNA的体系，所述的miRNA选自具有SEQ ID NO：1～4、SEQID NO：14～19、SEQ ID NO：21～22、SEQ ID NO：24所示的序列的miRNA；和

(2)检测所述体系中miRNA的表达；

其中，若所述候选物质可降低miRNA的表达，则表明该候选物质是能改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性的潜在物质。

在本发明的另一方面，还提供了一种筛选改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达miRNA的体系，所述的miRNA选自具有SEQ ID NO：5～13、SEQID NO：20、SEQ ID NO：23所示的序列的miRNA；和

(2)检测所述体系中miRNA的表达；

其中，若所述候选物质可提高miRNA的表达，则表明该候选物质是能改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性的潜在物质。

优选的，上述肿瘤细胞为胃癌细胞。

在本发明中，所述喜树碱类药物包括：羟基喜树碱、拓普替康、伊立替康、7-乙基-10-羟基喜树碱、或9-氨基、9-硝基喜树碱。

本发明与喜树碱类药物敏感相关的miRNA，可以用作预测病人对羟基喜树碱药物敏感程度的分子标志，为临床个性化用药提供依据，同时为抗耐药肿瘤药物设计和筛选提供新的靶点。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1中6株胃癌细胞系对HCPT的敏感性检测图；

图2是本发明实施例2区分胃癌细胞系对HCPT敏感程度的miRNA特征谱图；

图3是本发明实施例3实时定量PCR验证miRNA芯片结果的检测图；

图4是本发明实施例4区分胃癌细胞系对HCPT敏感程度的mRNA特征谱图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

实施例1羟基喜树碱(HCPT)对人胃癌细胞的作用

分析6株人类胃癌细胞系：BGC823，SGC7901，MGC803，HGC27，NCI-N87和AGS对HCPT的敏感程度，具体实验步骤如下：

(1)细胞培养

将6株胃癌细胞系BGC823，SGC7901，MGC803，HGC27，NCI-N87和AGS(购自上海生科院细胞资源中心)培养于含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液(Gibco BRL，Grand Island，NY)中，培养箱条件为37℃，5％CO2及完全湿度。

将增殖良好处于对数生长期的细胞经0.25％胰酶消化分散后计数，制成细胞悬液，接种于96孔板内，100μL/孔(视倍增时间的不同，每孔5000-10000个细胞)，预培养24h。每孔加预先制备好的羟基喜树碱药物(黄石飞云制药有限公司)100μL，共5个药物浓度，分别为羟基喜树碱临床用药血浆峰值(1.0μg/ml)的100倍、10倍，1倍、0.1倍及0.01倍。每个药物浓度设5个复孔，并设空白对照(只加RPMI1640培养液)和正常对照孔(不加药物，加等量RPMI1640培养液)，置于37℃、5％CO2培养箱在全湿条件下培养48h。

(2)磺酰罗丹明(SRB)显色方法测定细胞生长

细胞在加药培养结束后，取出培养板，每个小孔加入预冷的50％TCA液50ul(终浓度为10％)固定；加TCA时必须轻轻加在培养液表面，静置5分钟后再将平板移至4度放置1h。倒掉固定液，培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA。在空气中干燥后，每孔加入100ul0.4％(w/v)SRB(溶于1％醋酸)液，在室温放置10-30分钟。弃去各孔内液体后用1％醋酸洗涤5遍，去除未结合的染料，空气中干燥后用150ul pH为10.5、10mmol/L unbuffered Trisbase(三羟甲基胺基甲烷)溶解，在平板振荡器上振荡5min，用酶联免疫检测仪在515nm波长处测定每个小孔的OD值，用空白对照调零。用7个OD515数值计算细胞在各个浓度下的生长抑制率(GI)，公式如下：Ti＞/＝Tz时，GI＝[(Ti-Tz)/(C-Tz)]x100；Ti＜Tz时，GI＝[(Ti-Tz)/Tz]x100。其中，Ti是不同药物浓度下测得的OD515，Tz是给药之前细胞的初始OD515，C是未加药物的对照组细胞的OD515。GI50是与对照组相比，加药组细胞的生长抑制率达到50％时的药物浓度值，该值可以由生长抑制率曲线估得。所有的实验都重复至少三次。

(3)结果

6株人类胃癌细胞系(BGC823，SGC7901，MGC803，HGC27，NCI-N87和AGS)经过上述细胞培养、并用五种不同浓度的HCPT(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5mg/ml)处理细胞、然后SRB方法测定细胞生长，结果表明该6个胃癌细胞系对羟基喜树碱的敏感程度各不相同，并且导致细胞50％生长抑制的药物浓度GI50值在不同细胞间有显著差异，尤其是BGC823和AGS之间(见图1a)。当用血浆峰值浓度(1.0μg/ml)的HCPT处理细胞时，AGS细胞系死亡而BGC823细胞系的生长与未加药的对照组相比受到的抑制很小(见图1b)。SGC7901，MGC803，HGC27和NCI-N87对HCPT的敏感度居中。根据药物敏感程度，这6株细胞系可以分为两大类：第一类(AGS)在HCPT中死亡，完全无法增殖；第二类(其余5个)与不加药的对照相比，以较慢的速率增殖。实际上羟基喜树碱对第二类细胞的生长抑制率在不同细胞系间具有显著差异。

实施例2HCPT-不敏感和HCPT-敏感细胞系的miRNA表达谱

为研究miRNA在HCPT原发性耐药中的作用，利用Agilent的microRNA芯片V2.0对6株胃癌细胞系的miRNA表达谱进行全面分析，具体实验方法如下：

(1)总RNA提取和质量评估

取培养至对数生长期的6株细胞系(每个细胞系3个生物重复)，使用mirVanaTM miRNAIsolation Kit(Ambion，Austin，Texas)抽提总RNA。通过NanoDrop 1000测定浓度，使用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent，Santa Clara，California)评估总RNA的质量，结果表明抽提得到的RNA符合下一步芯片实验的要求。

(2)Agilent miRNA芯片实验

利用Agilent的miRNA Complete Labeling和Hyb Kit(Agilent，Santa Clara，Cali-fornia)进行标记和杂交反应。具体如下：用适量体积的1×TE(pH7.5)或DNase/RNase-free水将抽提后的Total RNA样品稀释至约50-100ng/μL，然后按100ng的总量吸取RNA样品，用DNase/RNase-free水补至3μL。加入1μL的去磷酸化混合液，置于37℃金属浴中，保温30分钟。在每管样品中添加2.8μL 100％DMSO，置于100℃金属浴中加热5-10分钟。上述反应结束后，将样品管迅速转入冰水浴中冷却，立即取4.5μL已配制的连接反应混合液加入到样品管中，置于16℃温育2小时。反应结束后，将样品置于真空浓缩仪中完全抽干，重新溶解在18μL无菌水(无核酸酶)中，在每管中加入4.5μL配制好的10×GE Blocking Agent，22.5μL2×Hi-RPM杂交液(室温放置)，轻微涡旋混匀，在100℃金属浴中加热5分钟，反应结束后，迅速将其转至冰水浴中冷却5分钟。用移液器缓慢地将约45μL反应液吸至盖片上，将芯片点样面(带有“Agilent”字样面)朝下缓慢放置在盖片，组装杂交室并拧紧，稍微晃动组装好的杂交室以使里面所有的气泡可以自由移动。将杂交室平衡放置在杂交炉的架子上，温度设定在55℃，转速为20rpm，杂交20小时。从杂交炉中取出杂交装置，经基因表达洗涤液(GeneExpression Wash Buffer)1和基因表达洗涤液(Gene Expression Wash Buffer)2洗涤后利用Agilent扫描仪获取图像，通过Agilent特征提取(Feature Extraction，FE)软件版本9.5.3(Agilent，Santa Clara，California)提取数据。在GeneSpring GX软件(zcomSiliconGenetics，Redwood City，CA，USA)中对数据进行归一化及统计分析。

(3)结果

上述Agilent的microRNA芯片有15744个探针，包括723个人的miRNA，每个miRNA重复16次。芯片得到的miRNA信号值经quantile归一化和flag筛选(present或者marginal)后，剩余279个miRNA。ANOVA分析显示HCPT-不敏感(BGC823)和HCPT-敏感(AGS)细胞系之间有137个显著差异miRNA(P＜0.05)，倍数差异在1.5倍以上。图2是利用归一化后的探针信号强度的log₂值进行的层次聚类图，图2a是利用对HCPT最不敏感的细胞系BGC823和最敏感的细胞系AGS之间的137个显著差异的miRNA构建的层次聚类图，表明利用这些差异miRNA进行层次聚类可以按药物敏感度正确区分6株细胞系。进一步结合HCPT敏感度居中的细胞系(SGC7901，MGC803，HGC27和NCI-N87)中这些miRNA的表达情况，找到25个表达水平与药物敏感度线性相关的miRNA，其中12个miRNA在HCPT-不敏感的细胞系中低表达，13个miRNA高表达(表1)。这25个miRNA可能在胃癌细胞对HCPT的原发性耐药中发挥了一定作用，以它们进行的层次聚类可以按照药物敏感度很好的将6株细胞系区分开来(见图2b)，说明这25个miRNA特征谱的有效性。

表1 25个表达水平与药物敏感度线性相关的miRNA

实施例3实时定量PCR验证miRNA芯片结果

为验证miRNA芯片的结果，随机选取12个差异miRNA进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，包括miR-196a，miR-365，miR-424，miR-99b，miR-98，miR-224，miR-338-3p，miR-141，miR-200a，miR-200b，miR-372和miR-373。对miRNA而言，利用miScript ReverseTranscription试剂盒将六株胃癌细胞系的总RNA反转录为cDNA，以该cDNA为模板，通过miScript Primer Assay及miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen，Germany)进行实时定量PCR反应。反应体系为20μL，包括1μl的反转录产物cDNA，10μl的2x SYBR Green MasterMix，1μl 10x miScript通用引物，1μl 10x特异性引物(上海生工)和7μl RNase-free水。在7900HT核酸序列定量检测仪(Sequence Detection System，Applied Biosystems，Austin，TX，USA)上进行反应，程序如下：首先95℃反应15min；然后进行40个如下循环：94℃，15s；55℃，30s；70℃，34s。反应结束测定溶解曲线以判断产物特异性。将每个miRNA的Ct值与U6进行比较，计算相对表达水平，然后乘以10²。每个数据点都有三次重复实验，通过SDS2.3软件(Bio-Rad)进行数据分析。如图3所示，定量结果与芯片结果基本吻合。miR-196a，miR-365，miR-424，miR-99b和miR-98所有的细胞系中均有表达，并且表达水平与HCPT敏感度相关。高表达miR-196a，miR-365，miR-424，miR-98或者低表达miR-99b的细胞系对HCPT的敏感度更小。miR-224和miR-338-3p只在第二类细胞中表达，而mir-141，miR-200a，miR-200b，miR-372和miR-373只在第一类细胞(AGS)中表达。这在一定程度上暗示某些miRNA的表达可能影响细胞对HCPT的敏感程度。

实施例4 HCPT-不敏感和HCPT-敏感细胞系的mRNA表达谱

为研究不同药物敏感度的细胞系在基因表达谱上的差异，用Affymetrix HG-U133+PM芯片对6株胃癌细胞系做了全基因组表达谱分析。每个细胞系取3个生物学重复。探针的标记、杂交及扫描均依照说明进行。简言之，首先利用带有T7启动子的poly-(T)引物对500ng总RNA进行反转录，然后通过cDNA二链合成将单链cDNA转变为双链。通过体外转录得到生物素标记的aRNA，片段化后与Affymetrix HG-U133+PM Array Plate在48℃杂交16小时。利用Affymetrix Titan系统对芯片洗涤、染色和扫描。使用Expression Console软件(Affymetrix，Santa Clara，California)提取数据。在GeneSpring GX软件(zcomSiliconGenetics，Redwood City，CA，USA)中对数据进行归一化及统计分析，利用归一化后的探针信号强度的log₂值可进一步制出层次聚类图(见图4)。

结果：307个基因在HCPT-不敏感和HCPT-敏感细胞系中的表达有显著差异(P＜0.05)，倍数在2倍以上，且表达水平与HCPT敏感程度线性相关。利用表达程度与胃癌细胞系对HCPT的敏感程度线性相关的307个mRNA构建的层次聚类图如图4a所示。其中，经过文献检索发现33个基因已被报道与肿瘤发生、发展或化疗敏感性相关，包括凋亡相关基因如BAX，TIAL1，TPD52L1，BAG，SP3，RPS27L，PLSCR3和TP53INP1，细胞分裂相关基因如MCM2，细胞黏附或转移相关基因如TIMP2，VSNL1，FUT8，TBX3，检测点基因如RAD1等。利用33个基因做的层次聚类能够将6个细胞系按照药物敏感程度正确聚类(见图4b)。

实施例5miRNA靶基因的分析

miRNA通过引起靶mRNA的降解或者翻译抑制来调节基因表达，因此有必要分析miRNA的下游靶基因。针对上述25个miRNA，利用miRGen数据库(http://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen)预测它们的靶基因，该数据库整合了多种miRNA靶基因预测方法，包括TargetScanS，miRanda和PicTar。为减少假阳性率，采用至少在两种预测方法中都被预测出来的靶基因。

通过以上方法预测，获得25个差异miRNA的潜在靶基因，各差异miRNA的潜在靶基因数目见下表2。许多靶基因是化疗敏感性相关基因，包括CDKN1B(p27)，ANXA1(p35)，PDCD4，UGT1A1，TOP1，CYP3A4，ABCG2(BCRP)，CHEK1，TDP1，BCL-2和SUMO1。

表2 25个差异miRNA的潜在靶基因数目

                              

miRNA          预测靶基因

                              

数目

miR-132        177

miR-224        194

miR-338-3p     140

miR-452        146

miR-141        280

miR-200a       13

miR-200b       396

miR-200c       396

miR-371-3p     24

miR-371-5p

miR-372        250

miR-373        392

miR-429        527

let-7g         413

miR-126        13

miR-196a       101

miR-196b       101

miR-19b        465

miR-27a        510

miR-31         88

miR-365        136

miR-424        657

miR-7          184

miR-98         412

miR-99b        23

                                

利用GenMAPP2(http://www.genmapp.org/)对miRNA的预测靶基因及芯片得到的差异mRNA进行了GO和通路的富集分析，P值的cutoff设为0.05，Z值设为2.即Z＞2且P＜0.05时视为显著富集。用这些靶基因富集到的通路有47条(P＜0.05)，包括经典的肿瘤相关通路如EGFR1、Wnt、MAPK、Kit-Receptor和focal adhesion通路，药物代谢相关通路如细胞色素P450和细胞凋亡相关通路如S1P信号通路。47条信号通路中有50％被报道与肿瘤发生或化疗敏感性相关。此外，这些靶基因的GO条目包括细胞周期、细胞增殖、G1/S转换、细胞凋亡负调控、细胞黏附、细胞迁移正调控、细胞-细胞外基质黏附和DNA修复调节等。推测HCPT-不敏感的细胞可能有更强的细胞增殖、迁移、抗凋亡或DNA修复能力，从而影响了HCPT的抑制作用。

另外，本发明还做了实施例4中的307个差异基因与25个miRNA的关联分析，发现有50个差异基因是25个miRNA的预测靶基因，形成了79个对应的miRNA-mRNA关系对(表3)。这50个基因包括抑癌基因、蛋白激酶、解旋酶、组蛋白甲基转移酶、转录因子和蛋白酶体相关蛋白。抑癌基因BTG2能够抑制细胞增殖，促进胃癌细胞的凋亡，预测是miR-98、let-7g和miR-132的靶基因，而这3个miRNA在HCPT-不敏感细胞中高表达，从而降低了BTG2的水平；另一个抑癌基因VSNL1抑制细胞迁移，是let-7g和miR-98的预测靶基因。TP53INP1可以促进TP53“Ser-46”的磷酸化进而诱导凋亡，被预测是miR-19b的靶基因，而miR-19b在HCPT-不敏感的细胞系中高表达，这与TP53INP1的低表达相对应。另外，肿瘤相关通路的组分如SMAD2和PIK3R1也在这些关系对中。

表3差异基因与25个miRNA的关系对

本发明的25个miRNA中，miR-196a和miR-200家族(miR-200a，-200b，-200c，-141and-429)分别参与调节细胞凋亡和肿瘤细胞迁移。miR-338、miR-126和miR-31参与胃癌发展，miR-7可以抑制EGFR和Akt通路。12个低表达的miRNA包括miR-200家族(miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-141，miR-429)，miR-371/372/373，miR-7，miR-31和miR-99b。其中，miR-200家族只在HCPT-敏感细胞系(AGS)中表达。据报道，miR-200家族通过靶向E-cadherin的转录抑制因子ZEB1和ZEB2从而抑制EMT转换和肿瘤细胞的迁移。此外，miR-141在胃癌细胞中过表达，抑制细胞的增殖。miR-7在很多肿瘤细胞(肺癌、乳腺癌和胶质细胞癌)中通过抑制EGFR和Akt通路诱导了细胞周期的停止和细胞死亡。miR-31可以抑制乳腺癌细胞的转移，在胃癌组织中表达下调。推测这些miRNA的下调最终促进了肿瘤细胞的迁移和增殖，削弱了HCPT的生长抑制作用。13个高表达的miRNA中，miR-338和miR-126已被鉴定为胃癌病人的生存预测标志物。miR-98和let-7g在凋亡和细胞增殖通路中都有作用，并且抑癌基因FUS1已被证实是miR-98的靶基因。miR-196a的高表达可激活Akt信号通路，促进肿瘤细胞的分离、迁移和入侵从而推进结直肠癌的发展，Luthra等人报道miR-196a能够靶向介导细胞凋亡且抑制细胞增殖的蛋白annexinA1，从而促进细胞增殖，抑制细胞死亡。miR-27a在胃癌中被鉴定为原癌基因，能够下调抗增殖基因prohibitin的表达，且miR-27a的下调可以逆转食管癌的多药耐药现象。上述miRNA的高表达可能增强了细胞的增殖，削弱了细胞凋亡从而使得细胞对HCPT不敏感。

实施例6抗耐药肿瘤药物的筛选

以选自SEQ ID NO：1～25所示序列的miRNA作为靶点，设计和筛选抗耐药肿瘤药物。具体方法如下。

用候选物质处理表达miRNA的体系，该miRNA选自SEQ ID NO：1～4、SEQ ID NO：14～19、SEQ ID NO：21～22、SEQ ID NO：24所示序列的miRNA，然后检测上述体系中miRNA的表达水平。若候选物质可降低miRNA的表达，则表明该候选物质是能改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性的潜在物质。

同样的，用候选物质处理表达miRNA的体系，该miRNA选自SEQ ID NO：5～13、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23所示序列的miRNA，然后检测上述体系中miRNA的表达水平。若候选物质可提高miRNA的表达，则表明该候选物质是能改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性的潜在物质。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>与喜树碱类药物敏感相关的miRNA的应用

<160>25

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>1

uaacagucua cagccauggu cg                                            22

<210>2

<211>21

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>2

caagucacua gugguuccgu u                                             21

<210>3

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

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uccagcauca gugauuuugu ug                                            22

<210>4

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>4

aacuguuugc agaggaaacu ga                                            22

<210>5

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>5

uaacacuguc ugguaaagau gg                                            22

<210>6

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>6

uaacacuguc ugguaacgau gu                                            22

<210>7

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<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>7

uaauacugcc ugguaaugau ga                                            22

<210>8

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<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>8

uaauacugcc ggguaaugau gga                                           23

<210>9

<211>23

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>9

aagugccgcc aucuuuugag ugu                                           23

<210>10

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<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>10

acucaaacug ugggggcacu                                               20

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<211>23

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>11

aaagugcugc  gacauuugag cgu                                          23

<210>12

<211>23

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>12

gaagugcuuc gauuuugggg ugu                                           23

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<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>13

uaauacuguc ugguaaaacc gu                                            22

<210>14

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>14

ugagguagua guuuguacag uu                                            22

<210>15

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>15

ucguaccgug aguaauaaug cg                                            22

<210>16

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>16

uagguaguuu cauguuguug gg                                            22

<210>17

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>17

uagguaguuu ccuguuguug gg                                            22

<210>18

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<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>18

ugugcaaauc caugcaaaac uga                                           23

<210>19

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<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>19

uucacagugg cuaaguuccg c                                             21

<210>20

<211>21

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>20

aggcaagaug cuggcauagc u                                             21

<210>21

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<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>21

uaaugccccu aaaaauccuu au                                            22

<210>22

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>22

cagcagcaau ucauguuuug aa                                            22

<210>23

<211>23

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>23

uggaagacua gugauuuugu ugu                                           23

<210>24

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>24

ugagguagua aguuguauug uu                                            22

<210>25

<211>22

<212>RNA

<213>Homo sapiens

<400>25

cacccguaga accgaccuug cg                                            22

Claims (9)

1.一种miRNA的用途，其特征在于，用于制备检测肿瘤病人对于喜树碱类药物敏感程度的试剂或试剂盒；其中，所述的miRNA选自具有SEQ ID NO：1～25所示的序列的miRNA。

2.一种用于检测肿瘤病人对于喜树碱类药物敏感程度的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含特异性地针对miRNA或其前体的引物或探针，所述的miRNA选自具有SEQ ID NO：1～25所示的序列的miRNA。

3.一种miRNA的用途，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的组合物；或用于筛选治疗肿瘤的组合物，所述组合物用于改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性；所述的miRNA选自具有SEQ ID NO：1～25所示的序列的miRNA。

4.一种筛选改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达miRNA的体系，所述的miRNA选自具有SEQ ID NO：1～4、SEQID NO：14～19、SEQ ID NO：21～22、SEQ ID NO：24所示的序列的miRNA；和

(2)检测所述体系中miRNA的表达；

其中，若所述候选物质可降低miRNA的表达，则表明该候选物质是能改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性的潜在物质。

5.一种筛选改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括：

(1)用候选物质处理表达miRNA的体系，所述的miRNA选自具有SEQ ID NO：5～13、SEQID NO：20、SEQ ID NO：23所示的序列的miRNA；和

(2)检测所述体系中miRNA的表达；

其中，若所述候选物质可提高miRNA的表达，则表明该候选物质是能改善肿瘤细胞对喜树碱类药物的敏感性的潜在物质。

6.根据权利要求1或3所述的miRNA的用途，其特征在于，所述喜树碱类药物包括：羟基喜树碱、拓普替康、伊立替康、7-乙基-10-羟基喜树碱、或9-氨基、9-硝基喜树碱。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述喜树碱类药物包括：羟基喜树碱、拓普替康、伊立替康、7-乙基-10-羟基喜树碱、或9-氨基、9-硝基喜树碱。

8.根据权利要求1或3所述的miRNA的用途，其特征在于，所述肿瘤为胃癌。

9.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为胃癌细胞。

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