BR112020010090A2 - oligonucleotídeo gapmer, sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, conjugado, composição farmacêutica e uso dos mesmos - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo gapmer compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido na descrição e nas reivindicações. O oligonucleotídeo da invenção pode ser usado como um medicamento.

Description

“OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER ANTISSENSO, SAL FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL DE UM OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, CONJUGADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E INVENÇÃO” ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[001] O uso de oligonucleotídeos sintéticos como agentes terapêuticos tem presenciado um notável progresso nas últimas décadas, levando ao desenvolvimento de moléculas que atuam por diversos mecanismos, incluindo gapmers de ativação da RNase-H, oligonucleotídeos alteradores do splicing, inibidores microRNA, siRNA ou aptâmeros (S.T.
Crooke, Antisense drug technology: principles, strategies, and applications, 2ª ed., Boca Raton, FL: CRC Press, 2008) Entretanto, os oligonucleotídeos são inerentemente instáveis em relação à degradação nucleolítica em sistemas biológicos. Além disso, eles mostram um comportamento farmacocinético altamente desfavorável. Para melhorar essas desvantagens, uma grande variedade de modificações químicas foi investigada nas últimas décadas.
Indiscutivelmente, uma das modificações mais bem-sucedidas é a introdução de ligações de fosforotioato, onde um dos átomos oxigênio fosfato não ligados (non-bridging) é substituído por um átomo de enxofre (F. Eckstein, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009, 10117-121). Esses oligodesoxinucleotídeos de fosforotioato exibe um aumento da ligação às proteínas, bem como uma estabilidade nitidamente mais alta à degradação nucleolítica e, portanto, uma meia-vida no plasma, tecidos e células substancialmente mais alta do que seus análogos de fosfodiéster não modificados. Estas características cruciais permitiram o desenvolvimento da primeira geração de oligonucleotídeos terapêuticos, bem como abriram as portas para o aprimoramento adicional desses oligonucleotídeos através de modificações de gerações posteriores, como os Ácidos Nucleicos Bloqueados (LNAs, do inglês Locked Nucleic Acids). A substituição de uma ligação fosfodiéster por um fosforotioato, no entanto, cria um centro quiral no átomo de fósforo. Como consequência, todos os produtos terapêuticos aprovados para oligonucleotídeos de fosforotioato são utilizados como misturas de uma enorme quantidade de compostos diastereoisoméricos, os quais têm potencialmente propriedades físico-químicas e farmacológicas diferentes (e possivelmente opostas).
[002] Embora a síntese estereoespecífica de oligonucleotídeos fosforotioato individuais estereoquimicamente definidos seja atualmente possível (N. Oka, M. Yamamoto, T. Sato, T. Wada, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037), continua havendo um desafio em identificar o estereoisômero com propriedades ideais dentro do grande número possível de diastereoisômeros. Neste contexto, a redução da complexidade diastereoisomérica através da utilização de ligações tiofosfato não-quirais é de grande interesse. Por exemplo, a modificação simétrica de ditioato não ligado (non-bridging) (vide, por exemplo, W. T. Wiesler, M. H. Caruthers, J. Org.
Chem. 1996, 61, 4272-4281), em que ambos os átomos de oxigênio não ligados dentro da ligação de fosfato são substituídos por enxofre, aplicado a oligonucleotídeos imunoestimuladores (A. M. Krieg, S. Matson, E. Fisher, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996, 6, 133-139), siRNA (por exemplo, X.
Yang, M. Sierant, M. Janicka, L. Peczek, C. Martinez, T. Hassell, N. Li, X. Li, T.
Wang, B. Nawrot, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 1214-1220) e aptâmeros (por exemplo, X. Yang, S. Fennewald, B. A. Luxon, J. Aronson, N. K. Herzog, D. G.
Gorenstein, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 3357-3362). De modo interessante, as tentativas em fazer uso dessa modificação não quiral no contexto de oligonucleotídeos antissenso obtiveram sucesso limitado até o momento (consulte, por exemplo, M. K. Ghosh, K. Ghosh, O. Dahl, J. S. Cohen, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 5761-5766. e J. P. Vaughn, J. Stekler, S. Demirdji, J. K. Mills, M. H. Caruthers, J. D. Iglehart, J. R. Marks, Nucleic Acids Res. 1996,
24, 4558-4564).
[003] Para nossa surpresa, descobrimos agora que os fosforoditioatos não ligados podem ser introduzidos no oligonucleotídeo, particularmente em oligonucleotídeos gapmers ou mixmers em geral e particularmente nos gapmers LNA-DNA-LNA ou mixmers LNA/DNA. A modificação é bem tolerada e as moléculas resultantes exibem grande potencial para aplicações terapêuticas, enquanto toda modificação de fosforoditioato não ligado reduz o tamanho da biblioteca geral de possíveis diastereoisômeros em 50%. Quando a modificação é colocada nos flancos de LNA dos gapmers, os oligonucleotídeos resultantes, em geral, acabam sendo mais potentes do que os progenitores correspondentes apenas com fosforotioato. Em geral, a modificação é adicionalmente bem tolerada dentro da região de lacuna (região gap) e, ainda mais surpreendentemente, também pode levar a uma potência melhorada, quando posicionada adequadamente.
[004] Assim, nós descobrimos, surpreendentemente, que a invenção provê oligonucleotídeos com melhores propriedades físico-químicas e farmacológicas, incluindo, por exemplo, potência melhorada. Em alguns aspectos, o oligonucleotídeo da invenção mantém a atividade ou eficácia, e pode ser tão potente ou mais potente que o composto idêntico no qual as ligações de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) são substituídas pelas convencionais ligações de fosforotioato estereoaleatórias (composto fosforotioato de referência). Toda introdução da modificação de fosforoditioato não ligado remove um dos centros quirais do fósforo e, assim, reduz a complexidade diastereoisomérica do composto em 50%. Além disso, sempre que uma modificação de ditioato é introduzida, o oligonucleotídeo parece ser dramaticamente melhor absorvido nas células, em particular nos hepatócitos, células musculares, células cardíacas, por exemplo.
[005] A introdução de modificações de ditioato não ligado nos flancos LNA de gapmers parece ser particularmente benéfica, levando a formação de moléculas que demonstram uma maior redução de alvo e um comportamento de captação substancialmente melhor, maior estabilidade e bom perfil de segurança.
[006] A síntese química de ligações de fosforoditioato não ligado em oligonucleotídeos é mais bem alcançada por técnicas de síntese de oligonucleotídeos em fase sólida usando blocos de construção de tiofosforamidita apropriados. A aplicação bem-sucedida desses tiofosforamiditas foi descrita para DNA regular (X. Yang, Curr Protoc Nucleic Acid Chem 2016, 66, 4.71.71-74.71.14.), bem como para RNA (X. Yang, Curr Protoc Nucleic Acid Chem 2017, 70, 4.77.71–74.77.13) e os blocos de construção necessários estão disponíveis a partir de fontes comerciais.
Curiosamente, a síntese mais desafiadora das tiofosforamiditas de LNA correspondentes não foi divulgada. Dentro do presente pedido, também divulgamos a síntese bem-sucedida de todas as quatro tiofosforamiditas de LNA e sua incorporação em oligonucleotídeos.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[007] A presente invenção refere-se a um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) (I) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo do carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo do carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2), em que pelo menos um dentre os dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e em que R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato. A invenção refere-se ainda, em particular, a um oligonucleotídeo gapmer compreendendo uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I). A invenção também se refere a um processo para a fabricação de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção e a um monômero de nucleosídeo de LNA útil, particularmente, na fabricação de oligonucleotídeos de acordo com a invenção.
[008] A presente invenção refere-se, em particular, a um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2), e em que em (IA), R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato; e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio.
[009] Alternativamente, M é um metal, tal como um metal alcalino, como Na ou K; ou M é NH4.
[010] O oligonucleotídeo da invenção é preferencialmente um oligonucleotídeo antissenso de fita simples (única), que compreende um ou mais nucleosídeos modificados no açúcar 2', como um ou mais nucleosídeos de LNA ou um ou mais nucleosídeos 2' MOE. O oligonucleotídeo antissenso da invenção é capaz de modular a expressão de um ácido nucleico alvo, como um pré-mRNA alvo, mRNA, microRNA, RNA longo não codificante ou RNA viral,
em uma célula que está expressando o RNA alvo - in vivo ou in vitro. Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo antissenso de cadeia simples compreende ainda ligações internucleosídicas de fosforotioato. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples (única) pode, por exemplo, estar na forma de um oligonucleotídeo gapmer, um oligonucleotídeo mixmer ou um oligonucleotídeo totalmer. O mixmer de oligonucleotídeo antissenso de fita simples pode ser utilizado na modulação de um evento de splicing em um pré- mRNA alvo. O mixmer de oligonucleotídeo antissenso de fita simples pode ser utilizado na inibição da expressão de um microRNA alvo. O mixmer de oligonucleotídeo antissenso de fita simples pode ser utilizado na inibição da interação entre um RNA longo não codificante e a cromatina, aliviando assim a repressão mediada pela cromatina (como PRC2) de um ou mais mRNAs. O gapmer de oligonucleotídeo antissenso de fita simples pode ser para inibição de um pré-mRNA alvo, mRNA alvo, um RNA viral alvo ou um RNA longo não codificante alvo.
[011] A invenção refere-se ainda ao uso do oligonucleotídeo da invenção, como o oligonucleotídeo antissenso de fita simples como terapêutico.
[012] A invenção refere-se ainda, em particular, a um oligonucleotídeo gapmer compreendendo uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I). A invenção refere-se ainda, em particular, a um oligonucleotídeo mixmer compreendendo uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I). A invenção refere-se ainda, em particular, a um oligonucleotídeo totalmer compreendendo uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I).
[013] A invenção também se refere a um processo para a fabricação de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção e a um monômero de nucleosídeo de LNA útil, particularmente, na fabricação de oligonucleotídeos de acordo com a invenção.
[014] A invenção também se refere a um processo para a fabricação de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção e a um monômero de nucleosídeo MOE útil, particularmente, na fabricação de oligonucleotídeos de acordo com a invenção.
[015] A invenção fornece ainda novos monômeros MOE e LNA que podem ser utilizados na fabricação de oligonucleotídeos de acordo com a invenção.
[016] Durante a síntese de oligonucleotídeos, o uso de um grupo protetor R é frequentemente usado. Após a síntese do oligonucleotídeo, o grupo protetor é tipicamente trocado por um átomo de hidrogênio ou um cátion, tal como um metal alcalino ou cátion de amônio, como quando o oligonucleotídeo está na forma de um sal. O sal normalmente contém um cátion, como um cátion de metal, por exemplo, cátion de sódio ou potássio ou cátion de amônio. Com relação aos oligonucleotídeos antissenso, de preferência R é hidrogênio, ou o oligonucleotídeo antissenso está na forma de um sal (como mostrado em IB).
[017] A ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IB) pode, por exemplo, ser selecionada a partir do grupo que consiste em: em que M+ é um cátion, como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio. O oligonucleotídeo da invenção pode, portanto, estar na forma de um sal oligonucleotídico, um sal de metal alcalino, como um sal de sódio, um sal de potássio ou um sal de amônio.
[018] Alternativamente representado, o oligonucleotídeo da invenção pode compreender uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula IA’ ou IB’ (IA’) (IB’)
[019] A invenção refere-se ainda, em particular, a um oligonucleotídeo gapmer compreendendo uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I), por exemplo, de fórmula (IA) ou (IB), ou fórmula (IA’) ou fórmula (IB’).
[020] A invenção refere-se ainda, em particular, a um oligonucleotídeo mixmer compreendendo uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I), por exemplo, de fórmula (IA) ou (IB), ou fórmula (IA’) ou fórmula (IB’).
[021] A invenção refere-se ainda, em particular, a um oligonucleotídeo totalmer compreendendo uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I), por exemplo, de fórmula (IA) ou (IB), ou fórmula (IA’) ou fórmula (IB’).
[022] Em exemplos de realização preferidos do oligonucleotídeo da invenção pelo menos um dos dois nucleosídeos (A 1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA.
[023] Em exemplos de realização preferidos do oligonucleotídeo da invenção pelo menos um dos dois nucleosídeos (A 1) e (A2) é um nucleosídeo 2’-O-MOE.
[024] Em exemplos de realização preferidos do oligonucleotídeo da invenção, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso de cadeia simples, e pelo menos um dos dois nucleosídeos (A 1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA.
[025] Em exemplos de realização preferidos do oligonucleotídeo da invenção, o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso de cadeia simples e pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo 2’-O-MOE.
[026] A invenção fornece um oligonucleotídeo antissenso, para inibição de um RNA alvo em uma célula, em que o oligonucleotídeo gapmer antissenso compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que em (IA), R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em (IB), M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion de Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, em que o oligonucleotídeo antissenso é ou compreende um oligonucleotídeo gapmer antissenso (referido aqui como um gapmer ou oligonucleotídeo gapmer).
[027] O oligonucleotídeo antissenso da invenção pode, portanto, compreender ou consistir em um gapmer.
[028] A presente invenção provê um oligonucleotídeo antissenso compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2), em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em que em (IB), M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion de Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, em que A 2 é nucleosídeo 3' terminal do oligonucleotídeo.
[029] A presente invenção provê um oligonucleotídeo antissenso compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2), em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em que em (IB), M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion de Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, em que A 1 é nucleosídeo 5' terminal do oligonucleotídeo.
[030] A presente invenção provê um oligonucleotídeo antissenso compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2), em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo de 2-O-MOE e em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em que em (IB), M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion de Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, em que A 2 é nucleosídeo 3' terminal do oligonucleotídeo.
[031] A presente invenção provê um oligonucleotídeo antissenso compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2), em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo de 2-O-MOE e em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em que em (IB), M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion de Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, em que A1 é nucleosídeo 5' terminal do oligonucleotídeo.
[032] A presente invenção provê um oligonucleotídeo antissenso compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2), em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo com açúcar 2’ modificado e em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em que em (IB), M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion de Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, em que A2 é nucleosídeo 3' terminal do oligonucleotídeo.
[033] A presente invenção provê um oligonucleotídeo antissenso compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2), em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo com açúcar 2’ modificado e em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em que em (IB), M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion de Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, e em que A 1 é o nucleosídeo 5’ terminal do oligonucleotídeo.
[034] O nucleosídeo com açúcar 2' modificado pode ser independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em nucleosídeo com açúcar 2' modificado selecionado a partir do grupo que consiste em 2'- alcóxi-RNA, 2'-alcóxi-alcóxi-RNA, 2'-amino-DNA, 2'-flúor-RNA, 2'-flúor-ANA e um nucleosídeo LNA.
[035] A presente invenção provê um oligonucleotídeo antissenso de fita simples compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2), e em que em (IA), R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato; e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, e em que o oligonucleotídeo de fita simples compreende ainda pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido, (Sp, S) ou (Rp, R) em que N1 e N2 são nucleosídeos.
[036] A invenção também provê um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, para modulação de um alvo de RNA em uma célula, em que o oligonucleotídeo antissenso compreende ou consiste em uma sequência nucleotídica contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que a sequência nucleotídica contígua compreende um ou mais 2 nucleosídeos modificados pelo açúcar, e em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas presentes entre os nucleosídeos da sequência nucleotídica contígua é uma ligação de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB)
(IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo do carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo do carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2) e em que R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato.
[037] A invenção também provê um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, para modulação de um alvo de RNA em uma célula, em que o oligonucleotídeo antissenso compreende ou consiste em uma sequência nucleotídica contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que a sequência nucleotídica contígua compreende um ou mais 2 nucleosídeos modificados pelo açúcar, e em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas presentes entre os nucleosídeos da sequência nucleotídica contígua é uma ligação de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2); e em que em (IA), R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato; e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion Na + ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, e em que o oligonucleotídeo antissenso de fita simples é para uso na modulação do splicing de um pré-mRNA alvo.
[038] A invenção também provê um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, para modulação de um alvo de RNA em uma célula, em que o oligonucleotídeo antissenso compreende ou consiste em uma sequência nucleotídica contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que a sequência nucleotídica contígua compreende um ou mais 2 nucleosídeos modificados pelo açúcar, e em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas presentes entre os nucleosídeos da sequência nucleotídica contígua é uma ligação de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2); e em que em (IA), R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato; e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion Na + ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, e em que o oligonucleotídeo antissenso de fita simples é para uso na inibição da expressão de um RNA longo não codificante.
Consulte o documento WO 2012/065143 para exemplos de lncRNAs que podem ser direcionados pelos compostos da invenção.
[039] A invenção também provê um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, para modulação de um alvo de RNA em uma célula, em que o oligonucleotídeo antissenso compreende ou consiste em uma sequência nucleotídica contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que a sequência nucleotídica contígua compreende um ou mais 2 nucleosídeos modificados pelo açúcar, e em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas presentes entre os nucleosídeos da sequência nucleotídica contígua é uma ligação de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB)
em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2); e em que em (IA), R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato; e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion Na + ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, e em que o oligonucleotídeo antissenso de fita simples é para uso na inibição da expressão de um mRNA humano ou pré- mRNA alvo.
[040] A invenção também provê um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, para modulação de um alvo de RNA em uma célula, em que o oligonucleotídeo antissenso compreende ou consiste em uma sequência nucleotídica contígua de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que a sequência nucleotídica contígua compreende um ou mais 2 nucleosídeos modificados pelo açúcar, e em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas presentes entre os nucleosídeos da sequência nucleotídica contígua é uma ligação de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2); e em que em (IA), R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato; e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion Na + ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, e em que o oligonucleotídeo antissenso de fita simples é para uso na inibição da expressão de um RNA viral alvo. Um RNA viral alvo adequado pode ser, por exemplo, HCV ou HBV.
[041] A invenção também provê um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, para modulação de um alvo de RNA em uma célula, em que o oligonucleotídeo antissenso compreende ou consiste em uma sequência nucleotídica contígua de 7 – 30 nucleotídeos de comprimento, em que a sequência nucleotídica contígua compreende um ou mais 2 nucleosídeos modificados pelo açúcar, e em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas presentes entre os nucleosídeos da sequência nucleotídica contígua é uma ligação de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2); e em que em (IA), R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato; e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, como um cátion Na + ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, e em que o oligonucleotídeo antissenso de fita simples é para uso na inibição da expressão de um microRNA.
[042] Para ser direcionado a um RNA alvo, por exemplo, um pré- mRNA alvo, um mRNA alvo, um RNA viral alvo, um microRNA ou um alvo RNA longo não codificante, o oligonucleotídeo da invenção é adequadamente capaz de inibir a expressão do RNA alvo. Isto é alcançado pela complementaridade entre o oligonucleotídeo antissenso e o RNA alvo. A inibição do alvo de RNA pode ser alcançada reduzindo o nível do RNA alvo ou bloqueando a função do RNA alvo. A inibição de RNA de um alvo de RNA pode ser adequadamente alcançada através do recrutamento de uma RNAse celular como a RNase-H, por exemplo, através do uso de um gapmer, ou pode ser alcançada através de um mecanismo mediado por não-nuclease, como um mecanismo de bloqueio estérico (como pela inibição por microRNA, para modulação do splicing de pré-
mRNAs ou para bloquear a interação entre um RNA longo não codificante e a cromatina).
[043] A invenção também se refere a um processo para a fabricação de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção e a um monômero de nucleosídeo de LNA ou MOE útil, particularmente, na fabricação de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção.
[044] A invenção provê um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção, ou um conjugado do mesmo, em particular um sal de sódio ou potássio ou um sal de amônio.
[045] A invenção provê um conjugado compreendendo um oligonucleotídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e pelo menos uma porção conjugada covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo ou ao referido sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente através de uma porção ligante.
[046] A invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo, sal ou conjugado farmaceuticamente aceitável de acordo com a invenção e um veículo terapeuticamente inerte.
[047] A invenção provê um oligonucleotídeo, um sal farmaceuticamente aceitável ou um conjugado de acordo com qualquer invenção para uso como substância terapeuticamente ativa.
[048] A invenção fornece um método para a modulação de um RNA alvo em uma célula que está expressando o referido RNA, cujo método compreende a etapa de administrar uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo, sal, conjugado ou composição farmaceuticamente aceitável de acordo com a invenção para a célula, em que o oligonucleotídeo é complementar ao RNA alvo.
[049] A invenção provê um método de modulação do splicing de um pré-RNA alvo em uma célula que está expressando o referido pré-mRNA alvo, cujo método compreende a etapa de administrar uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo, do sal farmaceuticamente aceitável, do conjugado ou composição de acordo com a invenção para a célula, em que o oligonucleotídeo é complementar ao RNA alvo e é capaz de modular um evento de splicing no pré-mRNA.
[050] A invenção provê o uso de um oligonucleotídeo, sal farmacêutico, conjugado ou composição da invenção para inibição de um pré- mRNA, um mRNA ou um RNA longo não codificante em uma célula, tal como em uma célula humana.
[051] Os métodos ou usos acima podem ser um método in vitro ou um método in vivo.
[052] A invenção provê o uso de um oligonucleotídeo, sal farmacêutico, conjugado ou composição da invenção na fabricação de um medicamento.
[053] A invenção provê o uso de uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), para uso para melhorar a estabilidade in vitro ou in vivo de um oligonucleotídeo antissenso de fosforotioato de fita simples.
[054] A invenção provê o uso de uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), para uso para melhorar a duração da ação in vitro ou in vivo de um oligonucleotídeo antissenso de fosforotioato de fita simples.
[055] A invenção provê o uso de uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), para uso para aumentar a captação celular ou distribuição nos tecidos de maneira in vitro ou in vivo de um oligonucleotídeo antissenso de fosforotioato de fita simples.
[056] A invenção provê o uso de uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), usada para aumentar a captação de um oligonucleotídeo antissenso de fosforotioato de fita simples em um tecido selecionado a partir do grupo constituído por músculo esquelético, coração, células epiteliais, incluindo células epiteliais da retina (por exemplo, para compostos de direcionamento Htra1), livre, rim ou baço.
[057] Para o uso in vivo de um oligonucleotídeo antissenso de fosforotioato de fita simples pode ser um oligonucleotídeo terapêutico.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[058] As Figuras 1-4 mostram o nível de mRNA alvos em hepatócitos primários de rato após 24 e 74 horas de administração de oligonucleotídeos de acordo com a invenção.
[059] A Figura 1 mostra os níveis de mRNA alvo nos hepatócitos primários de rato após 24 e 74 horas da administração de oligonucleotídeos gapmers com uma única ligação internucleosídica de fosforoditioato de acordo com a invenção na região de lacuna (gap).
[060] A Figura 2 mostra os níveis de mRNA alvo nos hepatócitos primários de rato após 24 e 74 horas da administração de oligonucleotídeos gapmers com múltiplas ligações internucleosídicas de fosforoditioato de acordo com a invenção na região gap.
[061] A Figura 3 mostra os níveis de mRNA alvo nos hepatócitos primários de rato após 24 e 74 horas da administração de oligonucleotídeos gapmers com múltiplas ligações internucleosídicas de fosforoditioato de acordo com a invenção na região gap.
[062] A Figura 4 mostra os níveis de mRNA alvo nos hepatócitos primários de rato após 24 e 74 horas da administração de oligonucleotídeos gapmers com múltiplas ligações internucleosídicas de fosforoditioato de acordo com a invenção nos flancos.
[063] A Figura 5 mostra as temperaturas de fusão (Tm) de oligonucleotídeos contendo uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de acordo com a invenção hibridizada com RNA e DNA.
[064] A Figura 6 mostra a estabilidade de oligonucleotídeos contendo uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de acordo com a invenção no soro de rato.
[065] Figura 7: Exploração de fosforoditioato aquiral nas regiões de lacuna (região gap) e flanqueadora de gapmers - os níveis de mRNA residuais depois do tratamento de hepatócitos primários de rato.
[066] Figura 8: Exploração da dependência posicional e otimização de fosforoditioato aquiral nas regiões de lacuna (região gap) de gapmers - os níveis de mRNA residuais depois do tratamento de hepatócitos primários de rato.
[067] Figuras 9A e 9B: Exploração de fosforoditioato aquiral nas regiões de lacuna de gapmers - efeito sobre a absorção celular.
[068] Figuras 10A e 10B: Introdução de fosforoditioato aquiral nas regiões de flanco de gapmers proporciona maior potência, com uma correlação entre a carga de fosforotioato com potência aumentada (4 ligações > 3 ligações > 2 ligações > 1 ligação> sem ligações de fosforoditioato nos flancos).
[069] Figura 11: Valores de IC50 em diferentes tipos de células.
[070] Figura 12: estabilidade in vitro em soro de rato de oligonucleotídeos de LNA protegidos na extremidade 3’.
[071] Figura 13: Avaliação in vivo de gapmers contendo ligações de fosforoditioato aquirais nos flancos e regiões gap - inibição de alvo.
[072] Figura 14A: Avaliação in vivo de gapmers contendo ligações de fosforoditioato aquirais nos flancos e regiões de gap - absorção pelos tecidos.
[073] Figura 14B: Avaliação in vivo de gapmers contendo ligações de fosforoditioato aquirais nos flancos e regiões de gap - proporção fígado/rim.
[074] Figuras 15A e 15B: Avaliação in vivo de gapmers contendo ligações de fosforoditioato aquirais nos flancos e regiões de gap - análise de metabolitos.
[075] Figura 16: A duração prolongada de ação com os oligonucleotídeos antissenso compreendendo ligações de internucleosídeos de fosforoditioato aquiral pode ser adicionalmente melhorada pela combinação com ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido.
[076] Figura 17A: Determinação da EC50 in vitro de gapmers de fosforoditioato aquirais que visam Malat-1.
[077] Figura 17B: potência in vivo gapmers de fosforoditioato aquirais que visam MALAT-1.
[078] Figura 17C: Estudo in vivo de gapmers de fosforoditioato aquirais que visam MALAT-1 - teor tecidual.
[079] Figura 18A: Estudo in vitro de oligonucleotídeos gapmer modificados de monofosforotioato aquiral que visam ApoB. Dados da atividade.
[080] Figura 18B: Estudo in vitro de oligonucleotídeos gapmer modificados de monofosforotioato aquiral que visam ApoB. Dados de conteúdo celular.
[081] Figura 19A: Estudo in vitro de oligonucleotídeos gapmer modificados de fosforoditioato aquiral que visam ApoB. Dados da atividade.
[082] Figura 19B: Estudo in vitro de oligonucleotídeos gapmer modificados de fosforoditioato aquiral que visam ApoB. Dados de conteúdo celular.
[083] Figura 20: Efeitos de ligações internucleosídicas de fosforoditioatos aquirais (P2S) presentes em oligonucleotídeos alteradores do splicing (splice-switching oligonucleotides - SSOs) que visam o sítio de splicing 3’ do TNFRSF1B. As células Colo 205 humanas foram semeadas em uma placa de 96 poços e submetidas a 5 µM (A) e 25 µM (B) de oligo, respectivamente. A percentagem de salto do éxon 7 foi analisada por PCR digital de gotículas usando sondas direcionadas à junção do éxon 6-8 e comparada com a quantidade total de TNFRSF1B pelo ensaio direcionado ao exon 2-3. O SSO#26 é o oligo parental (original) e SSO#27 é um controle negativo não direcionado ao TNFRSF1B.
[084] Figura 21: Ensaio de estabilidade usando nuclease S1. Os oligos contendo ditioato foram incubados com nuclease S1 por 30 e 120 minutos, respectivamente. Os oligos foram visualizados em um gel de 15% de TBE-uréia. Como marcador da migração de oligos intactos, o (SSO#14) foi incluído sem ser submetido à nuclease S1.
DEFINIÇÕES
[085] Na presente descrição, o termo “alquila”, sozinho ou em combinação, significa uma cadeia linear ou um grupo alquila de cadeia ramificada com 1 a 8 átomos de carbono, particularmente um grupo alquila de cadeia linear ou de cadeia ramificada com 1 a 6 átomos de carbono, e mais particularmente um grupo alquila de cadeia linear ou ramificada com 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquila C1-C8 de cadeia linear e cadeia ramificada são metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, terc- butila, pentilas isoméricas, hexilas isoméricas, heptilas isoméricas e octilas isoméricas, particularmente metila, etila, propila, butila e pentila. Exemplos particulares de alquila são metila, etila e propila.
[086] O termo “cicloalquila”, sozinho ou em combinação, significa um anel cicloalquila com 3 a 8 átomos de carbono e particularmente um anel cicloalquila com 3 a 6 átomos de carbono. Exemplos de cicloalquila são ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila e ciclo-octila, mais particularmente ciclopropila e ciclobutila. Um exemplo específico de “cicloalquila” é ciclopropila.
[087] O termo “alcoxi”, sozinho ou em combinação, significa um grupo da fórmula alquil-O-, no qual o termo “alquila” tem o significado anteriormente atribuído, tal como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, sec.butoxi e terc.butoxi. Particularmente, “alcoxi” é metoxi e etoxi.
Metoxietóxi é um exemplo particular de “alcoxialcoxi”.
[088] O termo “oxi”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -O-.
[089] O termo “alquenila” ou “alcenila”, sozinho ou em combinação, significa um resíduo de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada compreendendo uma ligação olefínica e até 8, preferencialmente até 6, de modo particularmente preferido até 4 átomos de carbono. Exemplos de grupos alquenila são etenila, 1-propenila, 2-propenila, isopropenila, 1-butenila, 2-butenila, 3-butenila e isobutenila.
[090] O termo “alquinila” ou “alcinila”, sozinho ou em combinação, significa um resíduo de hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada compreendendo uma ligação tripla e até 8, preferencialmente até 2 átomos de carbono.
[091] Os termos “halogênio” ou “halo”, isoladamente ou em combinação, significam flúor, cloro, bromo ou iodo, e particularmente flúor, cloro ou bromo, mais particularmente flúor. O termo “halo”, em combinação com outro grupo, denota a substituição do referido grupo por pelo menos um halogênio, particularmente substituído por um a cinco halogênios, particularmente um a quatro halogênios, isto é, um, dois, três ou quatro halogênios.
[092] O termo “haloalquila”, sozinho ou combinado, denota um grupo alquila substituído por pelo menos um halogênio, particularmente substituído por um a cinco halogênios, particularmente um a três halogênios.
Exemplos de haloalquila incluem monofluoro-, difluoro- ou trifluoro-metila, -etila ou -propila, por exemplo 3,3,3-trifluoropropila, 2-fluororetila, 2,2,2-trifluoroetila, fluorometila ou trifluorometila. Fluorometila, difluorometila e trifluorometila são particularmente “haloalquila”.
[093] O termo “halocicloalquila”, sozinho ou combinado, denota um grupo alquila substituído por pelo menos um halogênio, particularmente substituído por um a cinco halogênios, particularmente um a três halogênios.
Um exemplo particular de “halocicloalquila” é halociclopropila, em particular fluorociclopropila, difluorociclociclopropila e trifluorociclopropila.
[094] Os termos “hidroxila” e “hidroxi”, isoladamente ou em combinação, significam o grupo -OH.
[095] Os termos “tio-hidroxila” e “tio-hidroxi”, isoladamente ou em combinação, significam o grupo -SH.
[096] O termo “carbonil”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -C(O)-.
[097] O termo “carboxi” ou “carboxila”, sozinho ou em combinação, significa o grupo –COOH.
[098] O termo “amino”, sozinho ou em combinação, significa o grupo amino primário (-NH2), o grupo amino secundário (-NH-), ou o grupo amino terciário (-N-).
[099] O termo “alquilamino”, sozinho ou em combinação, significa um grupo amino como definido acima substituído por um ou dois grupos alquila conforme definido acima.
[100] O termo “sulfonila”, sozinho ou em combinação, significa a grupo -SO2.
[101] O termo “sulfinila”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -SO-.
[102] O termo “sulfanila”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -S-.
[103] O termo “ciano”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -CN.
[104] O termo “azido”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -N3.
[105] O termo “nitro”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -NO2.
[106] O termo “formil”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -C(O)H.
[107] O termo “carbamoíla”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -C(O)NH2.
[108] O termo “carbamido”, sozinho ou em combinação, significa o grupo -NH-C(O)-NH2.
[109] O termo “arila”, sozinho ou em combinação, denota um sistema de anel carbocíclico, monociclo ou bicíclico, aromático monovalente compreendendo 6 a 10 átomos no anel de carbono, opcionalmente substituído com 1 a 3 substituintes independentemente selecionados a partir de halogênio, hidroxila, alquila, alcenila, alcinila, alcoxi, alcoxialquila, alceniloxi, carboxila, alcoxicarbonila, alquilcarbonila e formila. Exemplos de arila incluem fenila e naftila, particularmente fenila.
[110] O termo “heteroarila”, sozinho ou em combinação, denota um sistema de anel monocíclico heterocíclico aromático monovalente ou bicíclico de 5 a 12 átomos no anel, compreendendo 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O e S, o restante dos átomos no anel sendo carbono, opcionalmente substituído com 1 a 3 substituintes selecionados independentemente a partir de halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alcinila, alcoxi, alcoxialquila, alceniloxi, carboxila, alcoxicarbonila, alquilcarbonila e formila. Exemplos de heteroarila incluem pirrolila, furanila, tienila, imidazolila, oxazolila, tiazolila, triazolila, oxadiazolila, tiadiazolila, tetrazolila, piridinila,
pirazinila, pirazolila, piridazinila, pirimidinila, triazinila, azepinila, diazepinila, isoxazolila, benzofuranila, isotiazolila, benzotienila, indolila, isoindolila, isobenzofuranila, benzimidazolila, benzoxazolila, benzoisoxazolila, benzotiazolila, benzoisotiazolila, benzo-oxadiazolila, benzotiadiazolila, benzotriazolila, purinila, quinolinila, isoquinolinila, quinazolinila, quinoxalinila, carbazolil ou acridinila.
[111] O termo “heterociclila”, sozinho ou em combinação, significa um sistema de anel mono ou bicíclico, monovalente, saturado ou parcialmente insaturado de 4 a 12, em particular 4 a 9 átomos no anel, compreendendo 1, 2, 3 ou 4 heteroátomos selecionados a partir de N, O e S, o restante dos átomos no anel sendo carbono, opcionalmente substituído com 1 a 3 substituintes selecionados independentemente a partir de halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alcinila, alcoxi, alcoxialquila, alceniloxi, carboxila, alcoxicarbonila, alquilcarbonila e formila. Exemplos de heterociclila saturado monocíclico são azetidinila, pirrolidinila, tetrahidrofuranila, tetrahidro-tienila, pirazolidinila, imidazolidinila, oxazolidinila, isoxazolidinila, tiazolidinila, piperidinila, tetrahidropiranila, tetrahidrotiopiranila, piperazinila, morfolinila, tiomorfolinila, 1,1-dioxo-tiomorfolin-4-ila, azepanila, diazepanila, homopiperazinila ou oxazepanila. Exemplos de heterocicloalquila saturado bicíclico são 8-aza-biciclo [3.2.1]octila, quinuclidinila, 8-oxa-3-aza- biciclo[3.2.1]octila, 9-aza-biciclo[3.3.1]nonila, 3-oxa-9-aza-biciclo[3.3.1]nonila, ou 3-tia-9-aza-biciclo[3.3.1]nonila. Exemplos de heterocicloalquila parcialmente insaturados são di-hidrofurila, imidazolinila, di-hidro-oxazolila, tetra-hidro- piridinila ou di-hidropiranila.
[112] O termo “sais farmaceuticamente aceitáveis” refere-se aos sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades das bases livres ou ácidos livres, que não são biológicos ou indesejáveis. Os sais são formados com ácidos inorgânicos, como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, particularmente ácido clorídrico e ácidos orgânicos, como ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico ácido malônico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico, N-acetilcisteína. Além disso, estes sais podem ser preparados a partir da adição de uma base inorgânica ou de uma base orgânica ao ácido livre.+ Os sais derivados de uma base inorgânica incluem, mas não se limitam aos sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio, magnésio. Os sais derivados de bases orgânicas incluem, entre outros, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas, incluindo aminas substituídas naturalmente, aminas cíclicas e resinas de troca iônica básica, como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, resinas de etanolamina, lisina, arginina, N-etilpiperidina, piperidina, poliamina. O oligonucleotídeo da invenção também pode estar presente na forma de Zwitterion. Os sais farmaceuticamente aceitáveis da invenção particularmente preferidos são os sais de sódio, lítio, potássio e trialquilamônio.
[113] O termo “grupo protetor”, sozinho ou em combinação, significa um grupo que bloqueia seletivamente um local reativo em um composto multifuncional, de modo que uma reação química possa ser realizada seletivamente em outro local reativo não protegido. Os grupos de proteção podem ser removidos. Grupos protetores exemplares são grupos protetores de amino, grupos protetores de carboxi ou grupos protetores de hidroxi.
[114] “Grupo protetor de fosfato” é um grupo protetor do grupo fosfato. Exemplos de grupo protetor fosfato são 2-cianoetila e metila. Um exemplo particular de grupo protetor fosfato é 2-cianoetila.
[115] O “grupo protetor de hidroxila” é um grupo protetor do grupo hidroxila e também é usado para proteger os grupos tiol. Exemplos de grupos protetores de hidroxila são acetila (Ac), benzoíla (Bz), benzila (Bn), éter β-metoxietoximetílico (MEM), dimetoxitritila (ou bis-(4-metoxifenil)fenilmetila) (DMT), trimetoxitritila (ou tris-(4-metoxifenil)fenilmetila) (TMT), éter metoximetílico (MOM), metoxitritil[(4-metoxifenil)difenilmetila (MMT), éter p- metoxibenzila (PMB), éter metiltiometilico, pivaloíla (Piv), tetra-hidropiranila (THM), tetra-hidrofurano (THF), tritila ou trifenilmetila (Tr), éter silílico (por exemplo, trimetilsilila (TMS), terc-butildimetilsilila (TBDMS), tri- isopropilsililoximetila (TOM) e éteres de tri-isopropilsilila (TIPS), éteres de metila e éteres de etóxietila (EE). Exemplos específicos de grupo protetor de hidroxila são DMT e TMT, em particular DMT.
[116] “Grupo protetor de tio-hidroxila” é um grupo protetor do grupo tio-hidroxila. Exemplos de grupos protetores de tio-hidroxila são aqueles do “grupo protetor de hidroxila”.
[117] Se um dos materiais de partida ou compostos da invenção contiver um ou mais grupos funcionais que não são estáveis ou são reativos nas condições de reação de uma ou mais etapas da reação, grupos de proteção apropriados (como descrito, por exemplo, em “Protective Groups in Organic Chemistry” por T.W. Greene e P.G.M Wuts, 3ª Ed., 1999, Wiley, Nova Iorque) podem ser introduzidos antes da etapa crítico de aplicação de métodos bem conhecidos no etsado da técnica. Esses grupos protetores podem ser removidos numa etapa posterior da síntese usando métodos padrão descritos na literatura. Exemplos de grupos protetores são terc-butoxicarbonila (Boc), 9- fluorenilmetil-carbamato (Fmoc), 2-trimetilsililetil carbamato (Teoc), carbobenziloxi (Cbz) e p-metoxibenziloxicarbonila (Moz).
[118] Os compostos descritos na presente invenção podem conter vários centros assimétricos e podem estar presente sob a forma de enantiômeros opticamente puros, misturas de enantiômeros tais como, por exemplo, racematos, misturas de diasteroisômeros, racematos diastereoisoméricos ou misturas de racematos diastereoisoméricos.
OLIGONUCLEOTÍDEO
[119] O termo “oligonucleotídeo”, conforme utilizado na presente invenção, é definido tal como ele é geralmente entendido pelos especialistas como uma molécula compreendendo dois ou mais nucleosídeos covalentemente ligados. Esses nucleosídeos ligados covalentemente também podem ser referidos como moléculas de ácido nucleico ou oligômeros. Os oligonucleotídeos são comumente produzidos em laboratório por síntese química em fase sólida seguida de purificação. Ao se referir a uma sequência do oligonucleotídeo, é feita referência à sequência ou ordem das porções de nucleobases, ou modificações das mesmas, dos nucleotídeos ou nucleosídeos ligados covalentemente. O oligonucleotídeo da invenção é fabricado pelo homem e é quimicamente sintetizado e é tipicamente purificado ou isolado. O oligonucleotídeo da invenção pode compreender um ou mais nucleosídeos ou nucleotídeos modificados.
OLIGONUCLEOTÍDEOS ANTISSENSO
[120] O termo “oligonucleotídeo antissenso”, conforme utilizado na presente invenção, é definido como oligonucleotídeos capazes de modular a expressão de um gene alvo por hibridização com um ácido nucleico alvo, em particular com uma sequência contígua em um ácido nucleico alvo. Os oligonucleotídeos antissenso não são essencialmente de fita dupla e, portanto, não são siRNAs ou shRNAs. De preferência, os oligonucleotídeos antissenso da presente invenção são de fita simples (única). Entende-se que os oligonucleotídeos de fita simples da presente invenção podem formar grampos de cabelo (hairpin) ou estruturas duplex intermoleculares (duplex entre duas moléculas do mesmo oligonucleotídeo), desde que o grau de intra- ou inter- autocomplementaridade seja menor que 50% em todo o comprimento total do oligonucleotídeo.
MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO
[121] O termo “modulação da expressão”, conforme usado na presente invenção, deve ser entendido como um termo geral para a capacidade de um oligonucleotídeo de alterar a expressão ou alterar o nível do ácido nucleico alvo. A modulação da expressão pode ser determinada por comparação com a expressão ou nível do ácido nucleico alvo antes da administração do oligonucleotídeo, ou a modulação da expressão pode ser determinada por referência a uma experiência de controle em que o oligonucleotídeo da invenção não é administrado. É geralmente entendido que o controle é uma célula individual ou alvo tratada com uma composição salina ou uma célula individual ou alvo tratada com um oligonucleotídeo não direcionado (simulação).
[122] Um tipo de modulação é a capacidade de um oligonucleotídeo em inibir, regular, reduzir, suprimir, remover, parar, bloquear, impedir, diminuir, reduzir, evitar ou terminar a expressão do ácido nucleico alvo, por exemplo, pela degradação do alvo ácido nucleico (por exemplo, via degradação mediada por RNaseH1) ou bloqueio da transcrição. Outro tipo de modulação é a capacidade de um oligonucleotídeo em restaurar, aumentar ou melhorar a expressão do RNA alvo, por exemplo, modular o evento de splicing em um pré-mRNA alvo ou via bloqueio de mecanismos inibitórios, como a repressão por microRNA de um mRNA.
SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS CONTÍGUA
[123] O termo “sequência nucleotídica contígua” refere-se à região do oligonucleotídeo que é complementar, como totalmente complementar ao ácido nucleico alvo. O termo é usado na presente invenção de forma intercambiável com o termo “sequência de nucleobase contígua” e o termo “sequência motivo de oligonucleotídico”. Em alguns exemplos de realização, todos os nucleotídeos do oligonucleotídeo constituem a sequência nucleotídica contígua. Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo compreende a sequência nucleotídica contígua, como uma região gapmer de F-G-F’, e pode opcionalmente compreender nucleotídeos adicionais, por exemplo, uma região ligante de nucleotídeo que pode ser usada para conectar um grupo funcional à sequência contígua de nucleotídeo, por exemplo, região D ou D’. A região ligante de nucleotídeo pode ou não ser complementar ao ácido nucleico alvo. O oligonucleotídeo mixmer antissenso referido na presente invenção pode compreender ou pode consistir na sequência nucleotídica contígua.
NUCLEOTÍDEOS
[124] Os nucleotídeos são os blocos de construção de oligonucleotídeos e polinucleotídeos e, para os propósitos da presente invenção, incluem nucleotídeos de ocorrência natural e não natural. Na natureza, nucleotídeos, como nucleotídeos de DNA e RNA, compreendem uma porção de açúcar ribose, uma porção de nucleobase e um ou mais grupos fosfato (que está ausente nos nucleosídeos). Os nucleosídeos e nucleotídeos também podem ser intercambiavelmente referidos como “unidades” ou “monômeros”.
NUCLEOSÍDEO MODIFICADO
[125] O termo “nucleosídeo modificado” ou “modificação de nucleosídeo”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a nucleosídeos modificados em comparação com o nucleosídeo equivalente de DNA, RNA pela introdução de uma ou mais modificações da porção açúcar ou porção (nucleo)base nitrogenada. Em um exemplo de realização preferido, o nucleosídeo modificado compreende uma porção de açúcar modificada. O termo nucleosídeo modificado também pode ser usado na presente invenção de forma alternada com o termo “nucleosídeo análogo” ou “unidades” modificadas ou “monômeros” modificados. Os nucleosídeos com uma fração de açúcar de DNA ou RNA não modificada são denominados no presente documento como nucleosídeos de DNA ou RNA. Os nucleosídeos com modificações na região base do nucleosídeo de DNA ou RNA são geralmente denominados DNA ou RNA se eles permitirem o pareamento de bases de Watson Crick.
LIGAÇÃO INTERNUCLEOSÍDICA MODIFICADA
[126] O termo “ligação internucleosídica modificada” como geralmente é entendido pelo especialista no assunto, é definido como ligações diferentes das ligações fosfodiéster (PO) que acoplam covalentemente dois nucleosídeos. Os oligonucleotídeos da invenção podem, portanto, compreender ligações internucleosídicas modificadas. Em alguns exemplos de realização, a ligação internucleosídica modificada aumenta a resistência do oligonucleotídeo à nuclease em comparação com uma ligação fosfodiéster.
Para oligonucleotídeos de ocorrência natural, a ligação internucleosídica inclui grupos fosfato, criando uma ligação fosfodiéster entre os nucleosídeos adjacentes. As ligações internucleosídicas modificadas são particularmente úteis na estabilização de oligonucleotídeos para uso in vivo e podem servir para proteger contra a clivagem por nucleases em regiões de nucleosídeos de DNA ou RNA no oligonucleotídeo da invenção, por exemplo, na região gap de um oligonucleotídeo gapmer, bem como em regiões de nucleosídeos modificados, como a região F e F'.
[127] Em um exemplo de realização, o oligonucleotídeo compreende uma ou mais ligações internucleosídicas modificadas a partir do fosfodiéster natural, uma ou mais ligações internucleosídeos modificadas que são, por exemplo, mais resistentes ao ataque de nuclease. A resistência à nuclease pode ser determinada através da incubação do oligonucleotídeo no soro sanguíneo ou utilizando um ensaio de resistência à nuclease (por exemplo, fosfodiesterase de veneno de cobra (SVPD)), ambos bem conhecidos no estado técnica. As ligações internucleosídicas que são capazes de aumentar a resistência à nuclease de um oligonucleotídeo são referidas como ligações internucleosídicas resistentes à nuclease. Em alguns exemplos de realização, pelo menos 50% das ligações internucleosídeos no oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua dos mesmos, são modificadas, como pelo menos 60%, como pelo menos 70%, como pelo menos 80 ou como pelo menos 90% das ligações internucleosídicas no oligonucleotídeo, ou sua sequência nucleotídica contígua, são ligações internucleosídicas resistentes à nuclease. Em alguns exemplos de realização, todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo, ou sua sequência nucleotídica contígua, são ligações internucleosídicas resistentes à nuclease.
Será reconhecido que, em alguns exemplos de realização, os nucleosídeos que ligam o oligonucleotídeo da invenção a um grupo funcional não nucleotídico, como um conjugado, podem ser fosfodiéster.
[128] Uma ligação internucleosídica modificada preferida para uso no oligonucleotídeo da invenção é fosforotioato.
[129] As ligações internucleosídicas de fosforotioato são particularmente úteis devido à resistência à nuclease, farmacocinética benéfica e facilidade de fabricação. Em alguns exemplos de realização, pelo menos 50% das ligações de internucleosídeos no oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua dos mesmos, são de fosforotioato, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% das ligações internucleosídicas no oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua deste, são de fosforotioato. Em alguns exemplos de realização, além das ligações internucleosídicas de fosforoditioato, todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua dos mesmos, são de fosforotioato. Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo da invenção compreende ligações internucleosídicas de fosforotioato e pelo menos uma ligação fosfodiéster, como ligações de 2, 3 ou 4 fosfodiéster, além da(s) ligação(ões) de fosforoditioato. Em um oligonucleotídeo gapmer, as ligações fosfodiéster, quando presentes, não estão adequadamente localizadas entre nucleosídeos de DNA contíguos na região G do gap.
[130] As ligações resistentes à nuclease, tais como ligações de fosforotioato, são particularmente úteis nas regiões oligonucleotídicas capazes de recrutar nucleases quando formam um duplexo com o ácido nucleico alvo, tal como a região G para gapmers. As ligações de fosforotioato também podem ser úteis em regiões que não recrutam nucleases e/ou regiões que aumentam a afinidade, como as regiões F e F' para gapmers. Os oligonucleotídeos gapmer podem, em alguns exemplos de realização, compreender uma ou mais ligações fosfodiéster na região F ou F', ou ambas as regiões F e F', nas quais as ligações internucleosídicas na região G podem ser totalmente de fosforotioato.
[131] De forma vantajosa, todas as ligações internucleosídicas na sequência nucleotídica contígua do oligonucleotídeo, ou todas as ligações internucleosídicas do oligonucleotídeo, são ligações de fosforotioato.
[132] É reconhecido, tal como divulgado no documento EP 2742135, que os oligonucleotídeos antissenso podem compreender outras ligações internucleosídicas (exceto de fosfodiéster e fosforotioato), por exemplo, internucleosídeos alquilfosfonato / metilfosfonato, que de acordo com o documento EP 2742135 pode, por exemplo, ser tolerada de outro modo o fosforotioato DNA da região de lacuna.
LIGAÇÕES DE FOSFOROTIOATO ESTEREOALEATÓRIAS
[133] As ligações de fosforotioato são ligações de fosfato internucleosídicas em que um dos oxigênios não ligado foi substituído por um enxofre. A substituição de um dos oxigênios não ligados (non-bridging) por um enxofre introduz um centro quiral e, como tal, dentro de um único oligonucleotídeo fosforotioato, cada ligação internucleosídica de fosforotioato estará nas estereoisoformas S (Sp) ou R (Rp). Tais ligações internucleosídicas são denominadas “ligações internucleosídicas quirais”. Em comparação, as ligações internucleosídicas de fosfodiéster são não quirais, pois possuem dois átomos de oxigênio não terminais.
[134] A designação da quiralidade de um estereocentro é determinada pelas regras padrão de Cahn-Ingold-Prelog (regras de prioridade CIP) publicadas pela primeira vez em Cahn, R.S.; Ingold, C.K.; Prelog, V.
(1966) “Specification of Molecular Chirality” Angewandte Chemie International Edition 5 (4): 385–415. doi:10.1002/anie.196603851.
[135] Durante a síntese de oligonucleotídeos padrão a estereosseletividade do acoplamento e a seguinte sulfurização não é controlada. Por esse motivo, a estereoquímica de cada ligação internucleosídica de fosforotioato é aleatoriamente Sp ou Rp e, assim, um oligonucleotídeo fosforotioato produzido pela síntese tradicional de oligonucleotídeos pode realmente existir em até 2 X diastereoisômeros de fosforotioato diferentes, em que X é o número de ligações internucleosídicas de fosforotioato. Tais oligonucleotídeos são referidos aqui como oligonucleotídeos de fosforotioato estereoaleatório e eles não contêm nenhuma das ligações internucleosídicas estereodefinidas. Os oligonucleotídeos fosforotioato esterealeatórios são, portanto, misturas de diastereoisômeros individuais originários da síntese não estereodefinida. Neste contexto, a mistura é definida como até 2X diferentes diastereoisômeros de fosforotioato.
LIGAÇÕES INTERNUCLEOSÍDICAS ESTEREODEFINIDAS
[136] Uma ligação internucleosídica estereodefinida é uma ligação internucleosídica quiral com um excesso diastereoisomérico para uma de suas duas formas diastereoméricas, Rp ou Sp.
[137] Deve ser reconhecido que os métodos de síntese de oligonucleotídeos estereosseletivos utilizados na técnica proporcionam tipicamente pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% de diastereosseletividade em cada ligação internucleosídica quiral, e, portanto, até cerca de 10%, tal como cerca de 5%, das moléculas de oligonucleotídeos podem ter a forma diastereoisomérica alternativa.
[138] Em alguns exemplos de realização, a razão diastereoisomérica de cada ligação internucleosídica quiral estereodefinida é de pelo menos cerca de 90:10. Em alguns exemplos de realização, a razão diastereoisomérica de cada ligação internucleosídica quiral é de pelo menos cerca de 95:5.
[139] A ligação de fosforotioato estereodefinido é um exemplo específico de ligação internucleosídica estereodefinida.
LIGAÇÃO DE FOSFOROTIOATO ESTEREODEFINIDO
[140] Uma ligação de fosforotioato estereodefinido é uma ligação de fosforotioato com um excesso diastereoisomérico para uma de suas duas formas diastereoméricas, Rp ou Sp.
[141] As configurações Rp e Sp das ligações internucleosídicas de fosforotioato são apresentadas abaixo; 3' 5' 5' 3' Sp Rp onde o grupo 3’ R representa a posição 3’ do nucleosídeo adjacente (um nucleosídeo 5’) e o grupo 5’ R representa a posição 5’ do nucleosídeo adjacente (um nucleosídeo 3’).
[142] As ligações internucleosídicas Rp também podem ser representadas como srP, e as ligações internucleosídicas Sp podem ser representadas como ssP no presente pedido.
[143] Em um exemplo de realização específico, a razão diastereomérica de cada ligação fosforotioato estereodefinido é de pelo menos cerca de 90:10 ou pelo menos 95:5.
[144] Em alguns exemplos de realização, a razão diastereomérica de cada ligação fosforotioato estereodefinida é de pelo menos cerca de 97:3. Em alguns exemplos de realização, a razão diastereomérica de cada ligação fosforotioato estereodefinida é de pelo menos cerca de 98:2. Em alguns exemplos de realização, a razão diastereomérica de cada ligação fosforotioato estereodefinida é de pelo menos cerca de 99:1.
[145] Em alguns exemplos de realização de uma ligação de internucleosídeos estereodefinida está na mesma forma diastereomérica (Rp ou Sp) em pelo menos 97%, tal como pelo menos 98%, tal como pelo menos 99%, ou (essencialmente) a totalidade das moléculas de oligonucleotídeos presente em uma população da moléculas de oligonucleotídeos.
[146] A pureza diastereomérica pode ser medida em um sistema modelo que possui apenas uma cadeia central aquiral (ou seja, fosfodiésteres).
É possível medir a pureza diastereomérica de cada monômero, por exemplo, acoplando um monômero com uma ligação internucleosídica estereodefina ao seguinte sistema-modelo “5 't-po-t-po-t-po 3'”. O resultado disso fornecerá: 5' DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3' ou 5' DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3', que pode ser separado por HPLC. A pureza diastereomérica é determinada pela integração do sinal UV dos dois possíveis diastereoisômeros e fornecendo uma razão entre, por exemplo, 98:2, 99:1 ou > 99:1.
[147] Deve-se compreender que a pureza diastereomérica de um único diastereoisômero específico (uma única molécula de oligonucleotídeo estereodefinido) será uma função da seletividade de ligação para o estereocentro, definido em cada posição de internucleosídeos, bem como o número de ligações internucleosídicas estereodefinidas a ser introduzido. A título de exemplo, se a seletividade de acoplamento em cada posição for 97%, a pureza resultante do oligonucleotídeo estereodefinido com 15 ligações internucleosídicas estereodefinidas será de 0,9715, ou seja, 63% dos diastereoisômeros desejados em comparação com 37% dos outros diastereoisômeros. A pureza do diastereoisômero definido pode ser melhorada após a síntese por purificação, por exemplo, por HPLC, tal como cromatografia de troca iônica ou cromatografia de fase reversa.
[148] Em alguns exemplos de realização, um oligonucleotídeo estereodefinido refere-se a uma população de oligonucleotídeos em que pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50% da população, é do diastereoisômero desejado.
[149] Uma declaração alternativa, em alguns exemplos de realização, um oligonucleotídeo estereodefinido refere-se a uma população de oligonucleotídeos em que pelo menos cerca de 40%, tal como pelo menos cerca de 50%, da população consiste nos motivos de ligação internucleosídica estereodefinida (específica) desejados (também denominado motivo estereodefinido).
[150] Para oligonucleotídeos estereodefinidos que compreendem centros quirais internucleosídeos estereodefinidos e estereoaleatórios, a pureza do oligonucleotídeo estereodefinido é determinada com referência à % da população do oligonucleotídeo que retém o(s) motivo(s) de ligação internucleosídica estereodefinida desejado(s), sendo desconsideradas as ligações estereoaleatórias no cálculo.
NUCLEOBASE
[151] O termo nucleobase inclui as porções purina (por exemplo, adenina e guanina) e pirimidina (por exemplo, uracila, timina e citosina) presentes nos nucleosídeos e nucleotídeos que formam ligações de hidrogênio na hibridização de ácidos nucleicos. No contexto da presente invenção, o termo nucleobase também abrange nucleobases modificadas que podem diferir das nucleobases de ocorrência natural, mas são funcionais durante a hibridização de ácidos nucleicos. Nesse contexto, “nucleobase” refere-se às nucleobases de ocorrência natural, como adenina, guanina, citosina, timidina, uracila, xantina e hipoxantina, bem como variantes de ocorrência não natural. Tais variantes são, por exemplo, descritas em Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45, página 2055, e Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 1.4.1.
[152] Em alguns exemplos de realização, a porção de nucleobases é modificada alterando a purina ou pirimidina para uma purina ou pirimidina modificada, tais como a purina substituída ou pirimidina substituída, tal como uma nucleobase selecionada a partir de isocitosina, pseudoisocitosina, 5-metil citosina, 5-tiozol-citosina, 5-propinil-citosina, 5- propinil-uracil, 5-bromouracil 5-tiazol-uracila, 2-tio-uracila, 2'-tio-timina, inosina, diaminopurina, 6-aminopurina, 2-aminopurina, 2,6- diaminopurina e 2-cloro-6- aminopurina.
[153] As porções de nucleobases podem ser indicadas pelo código da letra para cada base nitrogenada (nucleobase) correspondente, por exemplo, A, T, G, C ou U, em que cada letra pode opcionalmente incluir nucleobases modificadas de função equivalente. Por exemplo, nos oligonucleotídeos exemplificados, as porções de nucleobases são selecionadas a partir de A, T, G, C e 5-metil-citosina. Opcionalmente, para gapmers de LNA, podem ser utilizados nucleosídeos de LNA 5-metil-citosina.
OLIGONUCLEOTÍDEO MODIFICADO
[154] O termo oligonucleotídeo modificado descreve um oligonucleotídeo compreendendo um ou mais nucleosídeos modificados no açúcar e/ou ligações internucleosídicas modificadas. O termo oligonucleotídeo “quimérico” é um termo que tem sido utilizado na literatura para descrever oligonucleotídeos com nucleosídeos modificados.
OLIGONUCLEOTÍDEO ESTEREODEFINIDO
[155] Um oligonucleotídeo estereodefinido é um oligonucleotídeo em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas é uma ligação internucleosídica estereodefinida.
[156] Um oligonucleotídeo fosforotioato estereodefinido é um oligonucleotídeo em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas é uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido.
COMPLEMENTARIDADE
[157] O termo “complementaridade” descreve a capacidade de pareamento de bases de Watson-Crick de nucleosídeos/nucleotídeos. Os pares de bases Watson-Crick são guanina (G) – citosina (C) e adenina (A) – timina (T) / uracila (U). Será entendido que os oligonucleotídeos podem compreender nucleosídeos com nucleobases modificadas, por exemplo, a 5- metil-citosina é frequentemente usada no lugar da citosina e, como tal, o termo complementaridade abrange o pareamento de bases de Watson Crick entre nucleobases não modificadas e modificadas (vide, por exemplo, Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 página 2055 e Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).
[158] O termo “% complementar”, conforme usado na presente invenção, refere-se à proporção de nucleotídeos em uma sequência nucleotídica contígua em uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, oligonucleotídeo) que, em uma determinada posição, são complementares (ou seja, formam pares de bases de Watson-Crick) uma sequência nucleotídica contígua, em uma determinada posição de uma molécula de ácido nucleico separada (por exemplo, o ácido nucleico alvo). A porcentagem é calculada contando o número de bases alinhadas que formam pares entre as duas sequências (quando alinhadas com a sequência alvo de 5' para 3' e a sequência oligonucleotídica de 3' para 5'), dividido pelo número total de nucleotídeos no oligonucleotídeo e multiplicando por 100. Nessa comparação, uma nucleobase/nucleotídeo que não se alinha (isto é, não formam um par de bases) é denominado incompatibilidade ou não pareamento (mismatch). De preferência, não são permitidas inserções e deleções no cálculo da % de complementaridade de uma sequência nucleotídica contígua.
[159] O termo “totalmente complementar” refere-se a 100% de complementaridade.
IDENTIDADE
[160] O termo “identidade”, conforme usado na presente invenção, refere-se ao número de nucleotídeos em porcentagem de uma sequência nucleotídica contígua em uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, oligonucleotídeo) que, em uma determinada posição, são idênticos a (ou seja, têm a capacidade de formar os pares de bases de Watson-Crick com o nucleosídeo complementar) uma sequência nucleotídica contígua, em uma determinada posição de uma molécula de ácido nucleico separada (por exemplo, o ácido nucleico alvo). A porcentagem é calculada contando o número de bases alinhadas que são idênticas entre as duas sequências, dividindo pelo número total de nucleotídeos no oligonucleotídeo e multiplicando por 100. O percentual de identidade = (Correspondentes x 100)/Comprimento da região alinhada. De preferência, não são permitidas inserções e deleções no cálculo da % de complementaridade de uma sequência nucleotídica contígua.
HIBRIDIZAÇÃO
[161] O termo “hibridização” ou “hibridiza”, conforme utilizado na presente invenção, deve ser entendido como duas cadeias de ácidos nucleicos (por exemplo, um oligonucleotídeo e um ácido nucleico alvo) formando ligações de hidrogênio entre pares de bases nas cadeias opostas, formando um duplexo. A afinidade da ligação entre duas cadeias de ácidos nucleicos é a força da hibridização. Ela é frequentemente descrita em termos da temperatura de fusão (Tm) definida como a temperatura na qual metade dos oligonucleotídeos são duplexados com o ácido nucleico alvo. Em condições fisiológicas a Tm não é estritamente proporcional à afinidade (Mergny e Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13: 515-537). O estado padrão da energia livre de Gibbs ΔGº é uma representação mais precisa da afinidade de ligação e está relacionada à constante de dissociação (Kd) da reação por ΔGº=-RTln(Kd), onde R é a constante dos gases e T é a temperatura absoluta. Portanto, uma ΔGº muito baixa da reação entre um oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo reflete uma forte hibridização entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo.
A ΔGº é a energia associada a uma reação em que as concentrações aquosas são 1M, o pH é 7 e a temperatura é de 37ºC. A hibridização de oligonucleotídeos com um ácido nucleico alvo é uma reação espontânea e para reações espontâneas a ΔGº é menor que zero. A ΔGº pode ser medida experimentalmente, por exemplo, pela utilização do método de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) como descrito em Hansen et al., 1965, Chem. Comm.
36–38 e Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. O especialista no assunto saberá que estão disponíveis equipamentos comerciais para medições de ΔGº.
A ΔGº também pode ser estimada numericamente usando o modelo do vizinho mais próximo, conforme descrito por SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465, utilizando parâmetros termodinâmicos derivados de maneira apropriada, descritos por Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 e McTigue et al., 2004, Biochemistry 43: 5388-5405. Para ter a possibilidade de modular seu ácido nucleico alvo pretendido por hibridização, os oligonucleotídeos da presente invenção hibridizam com um ácido nucleico alvo com valores estimados de ΔG∫ abaixo de -10 kcal para oligonucleotídeos com 10 a 30 nucleotídeos de comprimento. Em alguns exemplos de realização, o grau ou a força da hibridização é medido pelo estado padrão de energia livre de Gibbs ΔGº. Os oligonucleotídeos podem hibridizar com um ácido nucleico alvo com valores estimados de ΔGº abaixo da faixa de -10 kcal, como abaixo de -15 kcal, como abaixo de -20 kcal e abaixo de -25 kcal para oligonucleotídeos com 8 a 30 nucleotídeos de comprimento. Em alguns exemplos de realização, os oligonucleotídeos hibridizam com um ácido nucleico alvo com um valor estimado de ΔGº de -10 a -60 kcal, como -12 a -40, como de -15 a -30 kcal ou de 16 a -27 kcal, como -18 a -25 kcal.
MODIFICAÇÕES NO AÇÚCAR
[162] O oligômero da invenção pode compreender um ou mais nucleosídeos que possuem uma porção de açúcar modificada, ou seja, uma modificação da porção de açúcar quando comparada à porção de açúcar ribose encontrada no DNA e RNA.
[163] Diversos nucleosídeos com modificação da porção de açúcar ribose foram feitos, principalmente com o objetivo de melhorar determinadas propriedades dos oligonucleotídeos, como a afinidade e/ou resistência às nucleases.
[164] Essas modificações incluem aquelas em que a estrutura em anel da ribose é modificada, por exemplo, por substituição com um anel de hexose (HNA), ou um anel bicíclico, que, tipicamente, tem um birradical em ponte entre os átomos de carbono C2 e C4 no anel de ribose (LNA), ou um anel de ribose não ligado que normalmente não possui uma ligação entre os carbonos C2 e C3 (por exemplo, UNA). Outros nucleosídeos com açúcar modificado incluem, por exemplo, ácidos nucleicos de biciclohexose (WO 2011/017521) ou ácidos nucleicos tricíclicos (WO 2013/154798). Os nucleosídeos modificados também incluem nucleosídeos onde a porção de açúcar é substituída por uma porção que não seja de açúcar, por exemplo, no caso de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) ou ácidos nucleicos de morfolino.
[165] As modificações de açúcar incluem modificações feitas através de alterações nos grupos substituintes no anel de ribose por outros grupos que não o hidrogênio, ou o grupo 2'-OH naturalmente encontrado em nucleosídeos de DNA e RNA. Os substituintes podem, por exemplo, ser introduzidos nas posições 2', 3', 4 'ou 5'.
NUCLEOSÍDEOS AÇÚCAR 2'-MODIFICADOS.
[166] Um nucleosídeo “modificado com açúcar em 2’” ou ainda nucleosídeo “açúcar 2'-modificado” é um nucleosídeo que tem um substituinte diferente de H ou -OH na posição 2' (nucleosídeo 2'-substituído) ou compreende um birradical 2' ligado capaz de formar uma ponte entre o carbono 2’ e um segundo carbono no anel ribose, como os nucleosídeos LNA (birradical ligado 2'-4').
[167] Na verdade, muita atenção foi despendida no desenvolvimento de nucleosídeos substituídos em 2' (2’-substituídos) e vários nucleosídeos substituídos em 2' foram encontrados como possuindo propriedades benéficas quando incorporados aos oligonucleotídeos. Por exemplo, o açúcar modificado em 2' pode fornecer maior afinidade de ligação e/ou resistência à nuclease aumentada para o oligonucleotídeo. Exemplos de nucleosídeos modificados substituídos em 2' são 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil- RNA, 2'-alcoxi-RNA, 2'-O-metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino- DNA, 2'- flúor-RNA e nucleosídeo 2'-F-ANA. Exemplos adicionais podem ser encontrados, por exemplo, em Freier e Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 e Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 e Deleavey e Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Abaixo estão ilustrações de alguns nucleosídeos modificados substituídos em 2'.
[168] Em relação à presente invenção, 2'-substituído não inclui moléculas em ponte 2' como o LNA.
NUCLEOSÍDEOS DE ÁCIDO NUCLEICO BLOQUEADO (NUCLEOSÍDEOS DE LNA)
[169] Um “nucleosídeo de LNA” é um nucleosídeo modificado em 2' que compreende uma ligação birradical do C2' e C4' do anel de açúcar ribose do referido nucleosídeo (também referido como uma “ponte 2'-4'”), que restringe ou bloqueia a conformação do anel ribose. Estes nucleosídeos são também denominados na literatura de ácido nucleico em ponte ou ácido nucleico bicíclico (BNA). O bloqueio da conformação da ribose está associado a uma afinidade aumentada de hibridização (estabilização do duplexo) quando o LNA é incorporado em um oligonucleotídeo para uma molécula de RNA ou DNA complementar. Isso pode ser determinado rotineiramente medindo a temperatura de fusão do duplexo oligonucleotídeo/complemento.
[170] Exemplos não limitantes de nucleosídeos de LNA são divulgados nos documentos WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352, WO 2004/046160, WO 00/047599, WO 2007/134181, WO 2010/077578, WO 2010/036698, WO 2007/090071, WO 2009/006478, WO 2011/156202, WO 2008/154401, WO 2009/067647, WO 2008/150729, e em Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76, Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75 (5) pp. 1569-81 e Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37 (4), 1225-
1238.
[171] A ligação (ponte) 2’-4’ compreende 2 a 4 átomos em ponte e é, em particular, de fórmula -X-Y-, sendo X ligado ao C4’ e Y ligado ao C2’ em que:
X é oxigênio, enxofre, -CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(=CRaRb)-, -
C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-; -O-NRa-, -NRa-O-, -C(=J)-,
Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- ou -O-CRaRb-;
Y é oxigênio, enxofre, -(CRaRb)n-, -CRaRb-O-CRaRb-, -
C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-, -C(=J)-, Se,
-O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- ou -O-CRaRb-;
com a condição de que -X-Y- não é -O-O-, Si(Ra)2-Si(Ra)2-, -
SO2-SO2-, -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N-C(Ra)=N-, -
C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb) , -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N- ou -Se-Se-;
Jé oxigênio, enxofre, =CH2 ou =N(Ra);
Ra e Rb são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, halogênio, hidroxila, ciano, tiohidroxila, alquila,
alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila,
alquinila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, alcóxialquila,
alqueniloxi, carboxila, alcóxicarbonila, alquilcarbonila,
formila, arila, heterociclila, amino, alquilamino, carbamoíla,
alquilaminocarbonila, aminoalquilaminocarbonila,
alquilaminoalquilaminocarbonila, alquilcarbonilamino,
carbamido, alcanoiloxi, sulfonila, alquilsulfoniloxi, nitro, azido,
tiohidroxilsulfetoalquilsulfanila, ariloxicarbonila, ariloxi,
arilcarbonila, heteroarila, heteroariloxicarbonila, heteroariloxi,
heteroarilcarbonila, -OC(=Xa)Rc, -OC(=Xa)NRcRd e -
NReC(=Xa)NRcRd;
ou dois geminais Ra e Rb juntos formam metileno opcionalmente substituído;
ou dois geminais Ra e Rb, juntos com o átomo de carbono ao qual eles estão ligados, formam cicloalquila ou halocicloalquila, com apenas um átomo de carbono de -X-Y-;
em que a alquila substituída, alquenila substituída, alquinila substituída, alcóxi substituído e metileno substituído são alquila, alquenila, alquinila e metileno substituído com 1 a 3 substituíntes independentemente selecionados a partir de halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alcóxialquila, alqueniloxi, carboxila, alcóxicarbonila, alquilcarbonila, formila, heterociclila, aril e heteroarila; Xa é oxigênio, enxofre ou -NRc; Rc, Rd e Re são independentemente selecionados a partir de hidrogênio e alquila; e n é 1, 2 ou 3.
[172] Em outro exemplo de realização específico da invenção, X é oxigênio, enxofre, -NRa-, -CRaRb- ou -C(=CRaRb)-, particularmente oxigênio, enxofre, -NH-, -CH2- ou -C(=CH2)-, mais particularmente oxigênio.
[173] Em outro exemplo de realização específico da invenção, Y é -CRaRb-, -CRaRb-CRaRb- ou -CRaRb-CRaRb-CRaRb-, particularmente -CH2- CHCH3-, -CHCH3-CH2-, -CH2-CH2- ou -CH2-CH2-CH2-.
[174] Em um exemplo de realização específico da invenção, -X- Y- é -O-(CRaRb)n-, -S-CRaRb-, -N(Ra)CRaRb-, -CRaRb-CRaRb-, -O-CRaRb-O- CRaRb-, -CRaRb-O-CRaRb-, -C(=CRaRb)-CRaRb-, -N(Ra)CRaRb-, -O-N(Ra)- CRaRb- ou -N(Ra)-O-CRaRb-.
[175] Em um exemplo de realização específico da invenção, R a e Rb são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, hidroxila, alquil e alcóxialquila, em particular hidrogênio, halogênio, alquila e alcóxialquila.
[176] Em outro exemplo de realização da invenção, Ra e Rb são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, flúor, hidroxila, metila e -CH2-O-CH3, em particular hidrogênio, flúor, metila e - CH2-O-CH3.
[177] De maneira vantajosa, um dentre Ra e Rb de -X-Y- é conforme definido acima e os outros são todos hidrogênio ao mesmo tempo.
[178] Em outro exemplo de realização específico da invenção, Ra é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila.
[179] Em outro exemplo de realização específico da invenção, Rb é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila.
[180] Em um exemplo de realização específico da invenção, um ou ambos dentre Ra e Rb são hidrogênio.
[181] Em um exemplo de realização específico da invenção, apenas um dentre Ra e Rb é hidrogênio.
[182] Em um exemplo de realização específico da invenção, um dentre Ra e Rb é metila e o outro é hidrogênio.
[183] Em um exemplo de realização específico da invenção, ambos Ra e Rb são metila ao mesmo tempo.
[184] Em um exemplo de realização específico da invenção, -X- Y- é -O-CH2-, -S-CH2-, -S-CH(CH3)-, -NH-CH2-, -O-CH2CH2-, -O-CH(CH2-O- CH3)-, -O-CH(CH2CH3)-, -O-CH(CH3)-, -O-CH2-O-CH2-, -O-CH2-O-CH2-, -CH2- O-CH2-, -C(=CH2)CH2-, -C(=CH2)CH(CH3)-, -N(OCH3)CH2- ou -N(CH3)CH2-.
[185] Em um exemplo de realização específico da invenção, -X- Y- é -O-CRaRb- em que Ra e Rb são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio, alquila e alcóxialquila, em particular hidrogênio, metila e -CH2-O-CH3.
[186] Em um exemplo de realização específico -X-Y- é -O-CH2- ou -O-CH(CH3)-, particularmente -O-CH2-.
[187] A ligação (ponte) 2'-4' pode ser posicionada abaixo do plano do anel ribose (configuração beta-D) ou acima do plano do anel (configuração alfa-L-), conforme ilustrado na fórmula (A) e fórmula (B), respectivamente.
[188] O nucleosídeo de LNA de acordo com a invenção é, em particular, de fórmula (B1) ou (B2); R5 R5*
Z B
B R3 R2 Y R1 Z* X
Y Z R1 X R5 R5* (B1); R3 R2 (B2); em que: W é oxigênio, enxofre, -N(Ra)- ou -CRaRb-, em particular oxigênio; B é uma nucleobase ou uma nucleobase modificada; Z é uma ligação internucleosídica a um nucleosídeo adjacente ou um grupo 5’-terminal; Z* é uma ligação internucleosídica a um nucleosídeo adjacente ou um grupo 3’-terminal; R1, R2, R3, R5 e R5* são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, halogênio, alquila, haloalquila, alquenila, alquinila, hidroxi, alcóxi, alcóxialquila, azida, alqueniloxi, carboxila, alcóxicarbonila, alquilcarbonila, formil e arila; e X, Y, Ra e Rb são conforme definido acima.
[189] Em um exemplo de realização particular, na definição de - X-Y-, Ra é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila. Em outro exemplo de realização específico na definição de -X-Y-, Rb é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila. Em um exemplo de realização específico adicional na definição de -X-Y-, um ou ambos dentre Ra e Rb são hidrogênio. Em um exemplo de realização específico na definição de -X-Y-, apenas um dentre Ra e Rb é hidrogênio. Em um exemplo de realização específico na definição de -X-Y-, um dentre Ra e Rb é metila e o outro é hidrogênio. Em um exemplo de realização específico na definição de -X-Y-, ambos, Ra e Rb, são metila ao mesmo tempo.
[190] Em um exemplo de realização específico adicional, na definição de X, Ra é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila.
Em outro exemplo de realização específico na definição de X, R b é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila. Em um exemplo de realização específico na definição de X, um ou ambos dentre Ra e Rb são hidrogênio. Em um exemplo de realização específico na definição de X, apenas um dentre R a e Rb é hidrogênio. Em um exemplo de realização específico na definição de X, um dentre Ra e Rb é metila e o outro é hidrogênio. Em um exemplo de realização específico na definição de X, ambos, Ra e Rb, são metila ao mesmo tempo.
[191] Em um exemplo de realização específico adicional, na definição de Y, Ra é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila.
Em outro exemplo de realização específico na definição de Y, Rb é hidrogênio ou alquila, em particular hidrogênio ou metila. Em um exemplo de realização específico na definição de Y, um ou ambos dentre R a e Rb são hidrogênio. Em um exemplo de realização específico na definição de Y, apenas um dentre Ra e Rb é hidrogênio. Em um exemplo de realização específico na definição de Y, um dentre Ra e Rb é metila e o outro é hidrogênio. Em um exemplo de realização específico na definição de Y, ambos, Ra e Rb são metila ao mesmo tempo.
[192] Em um exemplo de realização específico da invenção R 1, R2, R3, R5 e R5* são independentemente selecionados a partir de hidrogênio e alquila, em particular hidrogênio e metila.
[193] Em outro exemplo de realização da invenção vantajoso, R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo.
[194] Em outro exemplo de realização específico da invenção,
R1, R2, R3, são todos hidrogênio ao mesmo tempo, um dentre R 5 e R5* é hidrogênio e o outro é conforme definido acima, em particular alquila, mais particularmente metila.
[195] Em um exemplo de realização específico da invenção, R 5 e R5* são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, halogênio, alquila, alcóxialquila e azida, em particular a partir de hidrogênio, flúor, metila, metoxietila e azida. Em exemplos de realização vantajosos específicos da invenção, um dentre R5 e R5* é hidrogênio e o outro é alquila, em particular metila, halogênio, em particular flúor, alcóxialquila, em particular metoxietil ou azida; ou ambos, R5 e R5*, são hidrogênio ou halogênio ao mesmo tempo, em particular ambos hidrogênio de flúor ao mesmo tempo. Em tais exemplos de realização específicos, W pode ser, de maneira vantajosa, oxigênio, e -X-Y- pode ser, de maneira vantajosa, -O-CH2-.
[196] Em um exemplo de realização específico da invenção, -X- Y- é -O-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos de LNA são divulgados nos documentos WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 e WO 2004/046160 que são todos incorporados ao presente por referência, e incluem o que é comumente conhecido no estado da técnica como beta-D-oxi LNA e alfa-L-oxi Nucleosídeos de LNA.
[197] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -S-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos de tio-LNA são divulgados nos documentos WO 99/014226 e WO 2004/046160 que são incorporados ao presente por referência.
[198] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -NH-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Such nucleosídeos de amino-LNA são divulgados nos documentos WO 99/014226 e WO 2004/046160 que são incorporados ao presente por referência.
[199] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -O-CH2CH2- ou -OCH2CH2CH2-, W é oxigênio, e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos de LNA são divulgados no documento WO 00/047599 e em Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett.
12, 73-76, que são incorporados ao presente por referência, e incluem o que é comumente conhecido no estado da técnica como ácidos nucleicos 2’-O-4’C- etileno em ponte (ENA).
[200] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -O-CH2-, W é oxigênio, R1, R2, R3 são todos hidrogênio ao mesmo tempo, um dentre R5 e R5* é hidrogênio e o outro não é hidrogênio, tal como alquila, por exemplo, metila. Tais nucleosídeos de LNA 5’ substituídos são divulgados no documento WO 2007/134181 que é incorporado ao presente por referência.
[201] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -O-CRaRb-, em que um ou ambos dentre Ra e Rb não são hidrogênio, em particular alquil tal como metila, W é oxigênio, R1, R2, R3 são todos hidrogênio ao mesmo tempo, um dentre R5 e R5* é hidrogênio e o outro não é hidrogênio, em particular alquila, por exemplo, metila. Tais nucleosídeos de LNA bis-modificados são divulgados no documento WO 2010/077578 que é incorporado ao presente por referência.
[202] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -O-CHRa-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos de LNA substituídos em 6’ são divulgados nos documentos WO 2010/036698 e WO 2007/090071 que ambos são incorporados ao presente por referência. Em tais nucleosídeos de LNA substituídos em 6’, Ra é, em particular, alquila C1-C6, tal como metila.
[203] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -O-CH(CH2-O-CH3)- (“ácido nucleico 2’ O-metoxietil bicíclico”, Seth et al.
J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81).
[204] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -O-CH(CH2CH3)-.
[205] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -O-CH(CH2-O-CH3)-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos de LNA também são conhecidos no estado da técnica como MOEs cíclicos (cMOE) e são divulgados no documento WO 2007/090071.
[206] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -O-CH(CH3)- (“2’-O-etil bicíclico ácido nucleico”, Seth at al., J. Org.
Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81).
[207] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -O-CH2-O-CH2- (Seth et al., J. Org. Chem 2010 op. cit.).
[208] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -O-CH(CH3)-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos de 6’-metil LNA também são conhecidos no estado da técnica como cET nucleosídeos, e e podem ser diastereoisômeros (S)-cET ou (R)-cET, tal como divulgado no documento WO 2007/090071 (beta-D) e WO 2010/036698 (alfa-L) ambos incorporados ao presente por referência.
[209] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -O-CRaRb-, em que nem Ra nem Rb é hidrogênio, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Em um exemplo de realização específico ambos, Ra e Rb, são alquila ao mesmo tempo, em particular ambos são metila ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos de LNA 6’-di- substituídos são divulgados no documento WO 2009/006478 que é incorporado ao presente por referência.
[210] Em outro exemplo de realização específico da invenção, - X-Y- é -S-CHRa-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Tais nucleosídeos de tio-LNA substituídos em 6’ são divulgados no documento WO 2011/156202 que é incorporado ao presente por referência.
Em um exemplo de realização específico de tal tio-LNA 6’-substituído, Ra é alquila, em particular metila.
[211] Em um exemplo de realização específico da invenção, -X- Y- é -C(=CH2)C(RaRb)-, -C(=CHF)C(RaRb)- ou -C(=CF2)C(RaRb)-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Ra e Rb são, de maneira vantajosa, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, halogênio, alquila e alcóxialquila, em particular hidrogênio, metila, flúor é metoximetila. Ra e Rb são em particular hidrogênio ou metila ao mesmo tempo ou um dentre Ra e Rb é hidrogênio e o outro é metila. Tais nucleosídeos de vinil carbo LNA são divulgados nos documentos WO 2008/154401 e WO 2009/067647, ambos incorporados ao presente pedido por referência.
[212] Em um exemplo de realização específico da invenção, -X- Y- é -N(ORa)-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Em um exemplo de realização específico R a é alquila tal como metila. Tais nucleosídeos de LNA também são conhecidos como LNAs N substituídos e são divulgados no documento WO 2008/150729 que é incorporado ao presente por referência.
[213] Em um exemplo de realização específico da invenção, -X- Y- é -O-N(Ra)-, -N(Ra)-O-, -NRa-CRaRb-CRaRb- ou -NRa-CRaRb-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Ra e Rb são, de maneira vantajosa, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, halogênio, alquila e alcóxialquila, em particular hidrogênio, metila, flúor é metoximetila. Em um exemplo de realização específico Ra é alquila, tal como metila, Rb é hidrogênio ou metila, em particular hidrogênio. (Seth et al., J. Org.
Chem 2010 op. cit.).
[214] Em um exemplo de realização específico da invenção, -X- Y- é -O-N(CH3)- (Seth et al., J. Org. Chem 2010 op. cit.).
[215] Em um exemplo de realização específico da invenção, ambos R5 e R5* são hidrogênio ao mesmo tempo. Em outro exemplo de realização específico da invenção, um dentre R5 e R5* é hidrogênio e o outro é alquila, tal como metila. Em tais exemplos de realização, R1, R2 e R3 podem ser em particular hidrogênio e -X-Y- pode ser particularmente -O-CH2- ou -O- CHC(Ra)3-, tal como -O-CH(CH3)-.
[216] Em um exemplo de realização específico da invenção, -X- Y- é -CRaRb-O-CRaRb-, tal como -CH2-O-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Em tais exemplos de realização específicos, Ra pode ser em particular alquila tal como metila, Rb hidrogênio ou metila, em particular hidrogênio. Tais nucleosídeos de LNA também são conhecidos como nucleotídeos restritos conformacionalmente (CRNs) e são divulgados no documento WO 2013/036868 que é incorporado ao presente por referência.
[217] Em um exemplo de realização específico da invenção, -X- Y- é -O-CRaRb-O-CRaRb-, tal como -O-CH2-O-CH2-, W é oxigênio e R1, R2, R3, R5 e R5* são todos hidrogênio ao mesmo tempo. Ra e Rb são, de maneira vantajosa, independentemente selecionados a partir de hidrogênio, halogênio, alquila e alcóxialquila, em particular hidrogênio, metila, flúor é metoximetila. Em tal exemplo de realização específico Ra pode ser em particular alquila tal como metila, Rb hidrogênio ou metila, em particular hidrogênio. Tais nucleosídeos de LNA também são conhecidos como nucleotídeos COC e são divulgados em Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238, que é incorporado ao presente por referência.
[218] Será reconhecido que, a menos que especificado, os nucleosídeos de LNA pode estar na estereoisoforma beta-D ou alfa-L.
[219] Exemplos específicos de nucleosídeos LNA da invenção são apresentados no Esquema 1 (em que B é conforme definido acima).
ESQUEMA 1
[220] Os nucleosídeos de LNA específico são beta-D-oxi-LNA, 6'- metil-beta-D-oxi LNA, como (S)-6'-metil-beta-D-oxi-LNA ((S)-cET) e ENA.
NUCLEOSÍDEO MOE
[221] O termo “MOE” significa “metoxi-etil” e refere-se por meio de abreviação a um nucleosídeo substituído na posição 2' por um grupo metoxi-etoxi, como representado abaixo.
[222] O nucleosídeo acima pode, portanto, ser denominado “MOE” ou “nucleosídeo 2'-O-MOE”.
ATIVIDADE DE RNASE E RECRUTAMENTO
[223] A atividade da RNase-H de um oligonucleotídeo antissenso refere-se à sua capacidade de recrutar a RNase-H quando em um duplexo com uma molécula de RNA complementar. O documento WO 01/23613 proporciona métodos in vitro para determinar a atividade de RNAaseH, que pode ser usada para determinar a capacidade de recrutar a RNAaseH. Tipicamente, um oligonucleotídeo é considerado capaz de recrutar RNase-H se, quando fornecido com uma sequência alvo complementar de ácido nucleico, tiver uma taxa inicial, medida em pmol/L/min, de pelo menos 5%, como pelo menos 10% ou mais de 20% da taxa inicial determinada ao usar um oligonucleotídeo com a mesma sequência de bases que o oligonucleotídeo modificado sendo testado, mas contendo apenas monômeros de DNA com ligações fosforotioato entre todos os monômeros no oligonucleotídeo e usando a metodologia fornecida pelo Exemplo 91 - 95 do documento WO01/23613 (incorporado ao presente por referência). Para uso na determinação da atividade da RHase-H, a RNase-H1 humana recombinante está disponível pela Lubio Science GmbH, Lucerne, Suíça.
GAPMER
[224] O oligonucleotídeo antissenso da invenção ou sua sequência nucleotídica contígua pode ser um gapmer. Os gapmers antissenso são comumente usados para inibir um ácido nucleico alvo via degradação mediada pela RNase-H. Um oligonucleotídeo gapmer compreende pelo menos três regiões estruturais distintas, um flanco 5', uma região gap (de lacuna) e um flanco-3', F-G-F' na orientação 5’ ->3’. A região “gap” (G) compreende uma extensão de nucleotídeos de DNA contíguos que permitem ao oligonucleotídeo recrutar a RNase-H. A região gap é flanqueada por uma região flanqueadora 5' (F) que compreende um ou mais nucleosídeos modificados no açúcar, vantajosamente nucleosídeos modificados no açúcar de afinidade elevada, e por uma região flanqueadora 3' (F') compreendendo um ou mais nucleosídeos modificados no açúcar, vantajosamente nucleosídeos modificados no açúcar de afinidade elevada. Um ou mais nucleosídeos modificados no açúcar na região F e F' aumentam a afinidade do oligonucleotídeo para o ácido nucleico alvo (ou seja, são nucleosídeos modificados no açúcar que aumentam a afinidade). Em alguns exemplos de realização, um ou mais nucleosídeos modificados no açúcar na região F e F' são nucleosídeos modificados no açúcar 2', como modificações de açúcar 2' de alta afinidade, tal como selecionado independentemente a partir de LNA e 2'-MOE.
[225] Em um design de gapmer, os nucleosídeos 5' e 3' da região gap são nucleosídeos de DNA e estão posicionados adjacentes a um nucleosídeo modificado por açúcar da região 5' (F) ou 3' (F'), respectivamente.
Os flancos podem ser adicionalmente definidos por terem pelo menos um nucleosídeo modificado por açúcar na extremidade mais distante da região gap, ou seja, na extremidade 5' do flanco 5' e na extremidade 3' do flanco 3'.
[226] As regiões F-G-F' formam uma sequência nucleotídica contígua. Os oligonucleotídeos antissenso da invenção, ou a sequência nucleotídica contígua dos mesmos, podem compreender uma região gapmer de fórmula F-G-F'.
[227] O comprimento total do design gapmer F-G-F' pode ser, por exemplo, de 12 a 32 nucleosídeos, tal como 13 a 24, tal como 14 a 22 nucleosídeos, tal como de 14 a 17, tal como 16 a 18 nucleosídeos.
[228] A título de exemplo, o oligonucleotídeo gapmer da presente invenção pode ser representado pelas seguintes fórmulas: F1-8-G5-16-F’1-8, tal como F1-8-G7-16-F’2-8 com a condição de que o comprimento total das regiões de gapmer F-G-F' é de pelo menos 12, tal como pelo menos 14 nucleotídeos de comprimento.
[229] As regiões F, G e F' são adicionalmente definidas abaixo e podem ser incorporadas na fórmula F-G-F’.
GAPMER - REGIÃO G
[230] A região G (região gap) do gapmer é uma região de nucleosídeos que permite ao oligonucleotídeo recrutar RNase-H, como a RNase-H1 humana, tipicamente nucleosídeos de DNA. A RNase-H é uma enzima celular que reconhece o duplexo entre o DNA e o RNA, e quebra enzimaticamente a molécula de RNA. Os gapmers adequados podem ter uma região gap (G) de pelo menos 5 ou 6 nucleosídeos de DNA, tais como 5-16 nucleosídeos de DNA contíguos, tais como 6-15 nucleosídeos de DNA contíguos, tais como 7-14 nucleosídeos de DNA contíguos, tais como o 8-12 nucleotídeos de DNA contíguos, como 8-12 nucleotídeos de DNA contíguos de comprimento. A região gap (G) pode, em alguns exemplos de realização, consistir em 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleosídeos de DNA contíguos. O DNA da citosina (C) na região gap pode, em alguns casos, ser metilado, esses resíduos são anotados como 5-metil-citosina (meC ou com um ‘e’ em vez de um ‘c’). A metilação do DNA da citosina no intervalo é vantajosa se os dinucleotídeos cg estiverem presentes no intervalo para reduzir a toxicidade potencial, a modificação não tem impacto significativo na eficácia dos oligonucleotídeos.
[231] Em alguns exemplos de realização, a região de gap G pode consistir em 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleosídeos de DNA ligados por fosforotioato contíguos. Em alguns exemplos de realização, todas as ligações internucleosídicas no intervalo são ligações de fosforotioato.
[232] Embora gapmers tradicionais tenham uma região gap de DNA, há numerosos exemplos de nucleosídeos modificados que permitem recrutamento RNAase-H quando eles são utilizados dentro da região de gap.
Os nucleosídeos modificados que foram relatados como capazes de recrutar RNase-H quando incluídos em uma região gap incluem, por exemplo, alfa-L- LNA, DNA alquilado em C4' (como descrito em PCT/EP2009/050349 e Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300, ambos incorporados ao presente por referência), nucleosídeos derivados de arabinose como ANA e 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. Am. Chem. Soc. 125, 654- 661), UNA (ácido nucleico desbloqueado) (como descrito em Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 incorporado ao presente por referência). O UNA é compreendido por ácido nucleico desbloqueado onde tipicamente a ligação C2 e C3 da ribose foi removida, formando um resíduo de "açúcar" desbloqueado. Os nucleosídeos modificados utilizados em tais gapmers podem ser nucleosídeos que adotam uma estrutura 2' endo (semelhante a DNA) quando introduzidos na região gap, ou seja, modificações que permitem o recrutamento de RNase-H). Em alguns exemplos de realização, a região gap (G) de DNA descrita na presente invenção pode opcionalmente conter 1 a 3 nucleosídeos modificados no açúcar que adotam uma estrutura 2' endo (semelhante a DNA) quando introduzidos na região gap.
REGIÃO G - “GAP-BREAKER” (DISRUPTOR DE GAP)
[233] Alternativamente, existem numerosos relatos da inserção de um nucleosídeo modificado que confere uma conformação 3’ endo na região gap de gapmers, mantendo certa atividade da RNase-H. Esses gapmers com uma região gap compreendendo um ou mais nucleosídeos 3’endo modificados são referidos como gapmers “gap breaker” (ou “romped gap” (gap interrompido), vide, por exemplo, o documento WO2013/022984. Os oligonucleotídeos gap breakers retêm região de nucleosídeos de DNA suficiente dentro da região gap para permitir o recrutamento de RNase-H. A capacidade do oligonucleotídeo gap-breaker recrutar RNase-H é tipicamente sequência-específica ou mesmo composto-específica - vide Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487, que descreve oligonucleotídeos “gap- breaker” que recrutam RNase-H que, em alguns casos, fornecem uma clivagem mais específica do RNA alvo. Os nucleosídeos modificados usados na região de lacuna dos oligonucleotídeos gap-breaker podem, por exemplo, ser nucleosídeos modificados que conferem uma confirmação 3'endo, tais como nucleosídeos 2'-O-metil (OMe) ou 2'-O-MOE (MOE) ou nucleosídeos de LNA beta-D (a ponte entre C2' e C4' do anel de açúcar ribose de um nucleosídeo está na conformação beta), como nucleosídeos de beta-D-oxi LNA ou ScET.
[234] Assim como os gapmers contendo a região G descrita acima, a região gap do gap-breaker ou gapmers gap-disrupted, possui um nucleosídeo de DNA na extremidade 5' da lacuna (gap) (adjacente ao nucleosídeo 3' da região F) e um nucleosídeo de DNA na extremidade 3' do gap (adjacente ao nucleosídeo 5' da região F'). Os gapmers que compreendem um gap interrompido retêm tipicamente uma região de pelo menos 3 ou 4 nucleosídeos de DNA contíguos na extremidade 5' ou 3' da região gap.
[235] Designs exemplares para oligonucleotídeos gap-breakers incluem: F1-8-[D3-4-E1- D 3-4]-F’1-8 F1-8- [D 1-4-E1- D 3-4]-F’1-8 F1-8- [D 3-4-E1- D 1-4]-F’1-8 onde a região G está entre parênteses [Dn-Er-Dm], D é uma sequência contígua de nucleosídeos de DNA, E é um nucleosídeo modificado (o nucleosídeo gap-breaker (disruptor de gap)) e F e F' são as regiões flanqueadoras como as aqui definidas e com a condição de que o comprimento total das regiões gapmer F-G-F' seja de pelo menos 12, tal como pelo menos 14 nucleotídeos de comprimento.
[236] Em alguns exemplos de realização, a região G de um gapmer com gap rompido (gap disrupted) compreende pelo menos 6 nucleosídeos de DNA, como 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 nucleosídeos de DNA. Conforme descrito acima, os nucleosídeos de DNA podem ser contíguos ou opcionalmente podem ser intercalados com um ou mais nucleosídeos modificados, com a condição de que a região G do gap seja capaz de mediar o recrutamento de RNase-H.
GAPMER - REGIÕES FLANQUEADORAS, F E F'
[237] A região F está posicionada imediatamente adjacente ao nucleosídeo de DNA 5' da região G. O nucleosídeo mais a 3' da região F é um nucleosídeo modificado por açúcar, como um nucleosídeo modificado por açúcar de alta afinidade, por exemplo um nucleosídeo substituído em 2', como um nucleosídeo MOE ou um nucleosídeo de LNA.
[238] A região F’ está posicionada imediatamente adjacente ao nucleosídeo de DNA 3’ da região G. O nucleosídeo mais a 5' da região F é um nucleosídeo modificado por açúcar, como um nucleosídeo modificado por açúcar de alta afinidade, por exemplo um nucleosídeo substituído em 2', como um nucleosídeo MOE ou um nucleosídeo de LNA.
[239] A região F é de 1-8 nucleotídeos contíguos de comprimento, tal como 2-6, tal como 3-4 nucleotídeos contíguos de comprimento. Vantajosamente, o nucleosídeo mais a 5' da região F é um nucleosídeo modificado por açúcar. Em alguns exemplos de realização, os dois nucleosídeos mais na extremidade 5’-terminal da região F são nucleosídeos modificados no açúcar. Em alguns exemplos de realização, o maior nucleosídeo 5' da região F é um nucleosídeo LNA. Em alguns exemplos de realização, os dois nucleosídeos mais a 5' da região F são nucleosídeos de LNA. Em alguns exemplos de realização, os dois nucleosídeos mais a 5’ da região F são nucleosídeos substituídos em 2', como dois nucleosídeos MOE 3'.
Em alguns exemplos de realização, o nucleosídeo mais a 5’ da região F é um nucleosídeo substituído em 2', como um nucleosídeo MOE.
[240] A região F’ é de 2-8 nucleotídeos contíguos em comprimento, tal como 3-6, tal como 4-5 nucleotídeos contíguos de comprimento. Vantajosamente, o nucleosídeo mais a 3' da região F’ é um nucleosídeo modificado por açúcar. Em alguns exemplos de realização, os dois nucleosídeos mais a 3' da região F’ são nucleosídeos modificados no açúcar.
Em alguns exemplos de realização, os dois nucleosídeos mais a 3' da região F’ são nucleosídeos de LNA. Em alguns exemplos de realização, o nucleosídeo mais a 3’ da região F é um nucleosídeo LNA. Em alguns exemplos de realização, os dois nucleosídeos mais a 3’ da região F’ são nucleosídeos substituídos em 2', tal como dois nucleosídeos MOE 3'. Em alguns exemplos de realização, o nucleosídeo mais a 3’ da região F’ é um nucleosídeo substituído em 2', tal como um nucleosídeo MOE.
[241] Deve-se notar que quando o comprimento da região F ou F' é um, ele é vantajosamente um nucleosídeo LNA.
[242] Em alguns exemplos de realização, as regiões F e F' consistem independentemente ou compreendem de uma sequência contígua de nucleosídeos modificados no açúcar. Em alguns exemplos de realização, os nucleosídeos modificados no açúcar da região F podem ser selecionados independentemente a partir de unidades de 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, unidades de 2'-amino-DNA, unidades de 2'-flúor-DNA, 2'-alcoxi-RNA, unidades de MOE, unidades de LNA, unidades de ácido arabinonucleico (ANA) e unidades 2'-flúor-ANA.
[243] Em alguns exemplos de realização, as regiões F e F' compreendem independentemente LNA e um nucleosídeo modificado substituído em 2' (design de asa mista).
[244] Em alguns exemplos de realização, as regiões F e F’ consistem em apenas um tipo de nucleosídeo modificado por açúcar, como apenas MOE ou apenas beta-D-oxi LNA ou apenas ScET. Tais designs também são denominados design de gapmers de flancos uniformes ou gapmers uniformes.
[245] Em alguns exemplos de realização, todos os nucleosídeos da região F ou F’, ou F e F' são nucleosídeos LNA, como selecionados independentemente a partir de nucleosídeos beta-D-oxi LNA, ENA ou ScET.
Em alguns exemplos de realização, a região F consiste em 1-5, como 2-4, como 3-4, como 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleosídeos de LNA contíguos. Em alguns exemplos de realização, todos os nucleosídeos da região F e F’ são nucleosídeos beta-D-oxi LNA.
[246] Em alguns exemplos de realização, todos os nucleosídeos da região F ou F’, ou F e F' são nucleosídeos substituídos em 2', como nucleosídeos OMe ou MOE. Em alguns exemplos de realização, a região F consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 nucleosídeos OMe ou MOE contíguos. Em alguns exemplos de realização, apenas uma das regiões flanqueadoras pode consistir em nucleosídeos substituídos em 2', como nucleosídeos OMe ou MOE. Em alguns exemplos de realização, é a região flanqueadora 5' (F) que consiste em nucleosídeos substituídos em 2', como nucleosídeos OMe ou MOE, enquanto a região flanqueadora 3' (F') compreende pelo menos um nucleosídeo LNA, como nucleosídeos de beta-D-oxi LNA ou nucleosídeos cET.
Em alguns exemplos de realização, é a região flanqueadora 3' (F') que consiste em nucleosídeos substituídos em 2', como nucleosídeos OMe ou MOE, enquanto a região flanqueadora 5' (F) compreende pelo menos um nucleosídeo LNA, como beta-D-oxi Nucleosídeos LNA ou nucleosídeos cET.
[247] Em alguns exemplos de realização, todos os nucleosídeos modificados da região F e F’ são nucleosídeos LNA, independentemente selecionados a partir de nucleosídeos beta-D-oxi LNA, ENA ou ScET, em que a região F ou F' ou F e F’ pode compreender opcionalmente nucleosídeos de DNA (um flanco alternado, veja a definição deles para mais detalhes). Em alguns exemplos de realização, todos os nucleosídeos modificados da região F e F’ são nucleosídeos beta-D-oxi LNA, em que a região F ou F', ou F e F’ pode compreender opcionalmente nucleosídeos de DNA (um flanco alternado, consulte a definição destes para mais detalhes).
[248] Em alguns exemplos de realização, os nucleosídeos mais a 5' e mais a 3' da região F e F’ são nucleosídeos de LNA, como nucleosídeos beta-D-oxi LNA ou nucleosídeos ScET.
[249] Em alguns exemplos de realização, a ligação internucleosídica entre a região F e a região G é uma ligação internucleosídica de fosforotioato. Em alguns exemplos de realização, a ligação internucleosídica entre a região F` e a região G é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
Em alguns exemplos de realização, as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região F ou F’, F e F' são ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[250] Outros designs gapmers são divulgados nos documentos WO 2004/046160, WO 2007/146511 e WO 2008/113832, incorporados ao presente por referência.
GAPMERS DE LNA:
[251] Um gapmer de LNA é um gapmer em que uma ou ambas as regiões F e F’ compreendem ou consistem em nucleosídeos de LNA. Um gapmer beta-D-oxi é um gapmer em que uma ou ambas as regiões F e F’ compreendem ou consistem em nucleosídeos de beta-D-oxi LNA.
[252] Em alguns exemplos de realização, o gapmer de LNA é de fórmula: [LNA]1– 5-[região G] -[LNA]1-5, em que a região G é conforme definido na definição da região G do Gapmer.
GAPMERS MOE
[253] Um gapmer MOE é um gapmer em que as regiões F e F’ consistem em nucleosídeos MOE. Em alguns exemplos de realização, o gapmer MOE é de design [MOE]1-8-[Região G]-[MOE]1-8, tal como [MOE]2-7- [Região G]5-16-[MOE]2-7, tal como [MOE]3-6-[Região G]-[MOE]3-6, em que a região G é conforme definida na definição de Gapmer. Os gapmers MOE com um design 5-10-5 (MOE-DNA-MOE) têm sido amplamente utilizados no estado da técnica.
GAPMER DE ASA MISTA (MIXED WING GAPMER)
[254] Um gapmer de asa mista é um gapmer de LNA em que uma ou ambas as regiões F e F’ compreendem um nucleosídeo substituído 2', tal como um nucleosídeo substituído em 2' independentemente selecionado a partit do grupo que consiste em unidades 2'-O-alquil-RNA, unidades 2'-O-metil- RNA, 2'-amino-DNA, 2'-flúor-DNA, 2'-alcoxi-RNA, unidades de MOE, unidades de ácido arabinonucleico (ANA) e 2'-flúor-ANA, tal como um nucleosídeo MOE.
Em alguns exemplos de realização em que pelo menos uma das regiões F e F’, ou ambas as regiões F e F' compreendem pelo menos um nucleosídeo de LNA, os nucleosídeos restantes da região F e F’ são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em MOE e LNA. Em alguns exemplos de realização em que pelo menos uma das regiões F e F’, ou ambas as regiões F e F' compreendem pelo menos dois nucleosídeos de LNA, os demais nucleosídeos da região F e F’ são selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em MOE e LNA. Em alguns exemplos de realização de asa mista, um ou ambas as regiões F e F’ podem compreender ainda um ou mais nucleosídeos de DNA.
[255] Designs de gapmer de asa mista são divulgados nos documentos WO 2008/049085 e WO 2012/109395, ambas incorporadas ao presente por referência.
GAPMERS DE FLANCO ALTERNADO
[256] Regiões flanqueadoras podem compreender ambos os nucleosídeos, de LNA e DNA, e são denominadas “de flancos alternados”, pois compreendem um motivo alternado de nucleosídeos LNA-DNA-LNA. Os gapmers que compreendem esses flancos alternados são referidos como
“gapmers de flancos alternados”. Os “gapmers de flanco alternado” são, assim, oligonucleotídeos gapmer de LNA, onde pelo menos um dos flancos (F ou F’) compreende DNA além do(s) nucleosídeo(s) de LNA. Em alguns exemplos de realização, pelo menos uma das regiões F ou F’, ou ambas as regiões F e F', compreendem nucleosídeos de LNA e nucleosídeos de DNA. Em tais exemplos de realização, a região flanqueadora F ou F’, ou ambas as regiões F e F', compreendem pelo menos três nucleosídeos, em que os nucleosídeos mais a 5' e 3' da região F e/ou F’ são nucleosídeos de LNA.
[257] Gapmers de LNA de flanco alternado são divulgados no documento WO 2016/127002.
[258] Uma região de flanco alternado pode compreender até 3 nucleosídeos de DNA contíguos, como 1 a 2 ou 1 ou 2 ou 3 nucleosídeos de DNA contíguos.
[259] O flanco alternado pode ser anotado como uma série de números inteiros, representando um número de nucleosídeos de LNA (L) seguidos por um número de nucleosídeos de DNA (D), por exemplo; [L]1-3-[D]1-4-[L]1-3 [L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2.
[260] Em designs de oligonucleotídeos, estes são frequentemente representados como números, de modo que 2-2-1 representa 5’ [L]2-[D]2-[L] 3’ e 1-1-1-1-1 representa 5’ [L]-[D]-[L]-[D]-[L] 3’. O comprimento do flanco (região F e F’) em oligonucleotídeos com flancos alternados pode ser independentemente de 3 a 10 nucleosídeos, como 4 a 8, como 5 a 6 nucleosídeos, como 4, 5, 6 ou 7 nucleosídeos modificados. Em alguns exemplos de realização, apenas um dos flancos do oligonucleotídeo gapmer está alternando enquanto o outro é constituído por nucleotídeos de LNA. Pode ser vantajoso ter pelo menos dois nucleosídeos de LNA na extremidade 3' do flanco 3' (F’), para conferir resistência adicional à exonuclease. Alguns exemplos de oligonucleotídeos com flancos alternados são: [L]1-5-[D]1-4-[L]1-3-[G]5-16-[L]2-6 [L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[G]5-16-[L]1-2-[D]1-3-[L]2-4 [L]1-5-[G]5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2 com a condição de que o comprimento total das regiões de gapmer é de pelo menos 12, tal como pelo menos 14 nucleotídeos de comprimento.
REGIÃO D’ OU D” EM UM OLIGONUCLEOTÍDEO
[261] O oligonucleotídeo da invenção pode, em alguns exemplos de realização, compreender ou consistir na sequência nucleotídica contígua do oligonucleotídeo que é complementar ao ácido nucleico alvo, como o gapmer F-G-F’ e outros nucleosídeos 5’ e/ou 3’. Os outros nucleosídeos 5' e/ou 3' podem ou não ser totalmente complementares ao ácido nucleico alvo. Tais nucleosídeos 5' e/ou 3' adicionais podem ser referidos no presente pedido como região D’ e D’’.
[262] A adição da região D’ ou D’’ pode ser usada com a finalidade de unir a sequência nucleotídica contígua, como o gapmer, a uma porção conjugada ou outro grupo funcional. Quando utilizado para unir a sequência nucleotídica contígua a uma porção conjugada, pode servir como um ligante bioclivável. Alternativamente, pode ser usado para fornecer proteção à exonuclease ou para facilitar a síntese ou fabricação.
[263] A região D’ e D’’ podem ser anexadas à extremidade 5' da região F ou à extremidade 3’ da região F', respectivamente, para gerar designs das seguintes fórmulas D'-F-G-F’, F-G-F’-D’’ ou D’-F-G-F’-D’’. Neste caso, o FG-F’ é a porção gapmer do oligonucleotídeo e a região D' ou D’’ constitui uma parte separada do oligonucleotídeo.
[264] A região D’ ou D’’ pode compreender independentemente ou consistir em 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos adicionais, que podem ser complementares ou não complementares ao ácido nucleico alvo. O nucleotídeo adjacente à região F ou F’ não é um nucleotídeo modificado por açúcar, como um DNA ou RNA ou versões modificadas nas bases dos mesmos. A região D’ ou D’’ pode servir como um ligante bioclivável suscetível à nuclease (consulte a definição de ligantes). Em alguns exemplos de realização, os nucleotídeos da extremidade 5’ e/ou 3’ adicionais estão ligados a ligações fosfodiéster e são DNA ou RNA. Os ligantes biocliváveis à base de nucleotídeos adequados para uso como região D’ ou D’’ são divulgados no documento WO 2014/076195, que inclui a título de exemplo um dinucleotídeo de DNA ligado por fosfodiéster. O uso de ligantes biocliváveis em construções de poli-oligonucleotídeo é divulgado no documento WO 2015/113922, onde estes são usados para ligar várias construções antissenso (por exemplo, regiões gapmer) dentro de um único oligonucleotídeo.
[265] Em um exemplo de realização, o oligonucleotídeo da invenção compreende uma região D’ e/ou D’’ além da sequência nucleotídica contígua que constitui o gapmer.
[266] Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo da presente invenção pode ser representado pelas seguintes fórmulas: F-G-F’; em particular F1-8-G5-16-F’2-8 D’-F-G-F’, em particular D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8 F-G-F’-D’’, em particular F1-8-G5-16-F’2-8-D’’1-3 D’-F-G-F’-D’’, em particular D’1-3- F1-8-G5-16-F’2-8-D’’1-3.
[267] Em alguns exemplos de realização, a ligação internucleosídica posicionada entre a região D’ e a região F é uma ligação fosfodiéster. Em alguns exemplos de realização, a ligação internucleosídica posicionada entre a região F’ e a região D’’ é uma ligação fosfodiéster.
TOTALMERS
[268] Em alguns exemplos de realização, todos os nucleosídeos do oligonucleotídeo, ou sua sequência nucleotídica contígua, são nucleosídeos modificados no açúcar. Tais oligonucleotídeos são referidos no presente pedido como totalmers.
[269] Em alguns exemplos de realização, todos os nucleosídeos modificados por açúcar de um totalmer compreendem a mesma modificação de açúcar, por exemplo, todos podem ser nucleosídeos de LNA ou todos podem ser nucleosídeos 2'O-MOE. Em alguns exemplos de realização, os nucleosídeos modificados no açúcar de um totalmer podem ser selecionados independentemente a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos substituídos em 2’, como nucleosídeos 2'-substituídos selecionados a partir do grupo que consiste em 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil -RNA, 2'-alcoxi-RNA, 2'-O- metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'-flúor-RNA e nucleosídeos 2'-F-ANA.
Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo compreende os nucleosídeos de LNA e os nucleosídeos substituídos em 2', como o nucleosídeo substituído em 2' selecionado a partir do grupo que consiste nos nucleosídeos 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-alcoxi RNA, 2'-O-metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'-flúor-RNA e 2'-F-ANA. Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo compreende nucleosídeos de LNA e 2'-O-MOE. Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo compreende nucleosídeos LNA (S)cET e nucleosídeos 2'-O-MOE. Em alguns exemplos de realização, cada unidade de nucleosídeo do oligonucleotídeo é um nucleosídeo substituído em 2’. Em alguns exemplos de realização, cada unidade de nucleosídeo do oligonucleotídeo é um nucleosídeo 2'-O-MOE.
[270] Em alguns exemplos de realização, todos os nucleosídeos do oligonucleotídeo ou sua sequência nucleotídica contígua são nucleosídeos de LNA, como nucleosídeos beta-D-oxi-LNA e/ou nucleosídeos (S)cET. Em alguns exemplos de realização, tais oligonucleotídeos totalmer de LNA têm entre 7-12 nucleosídeos de comprimento (vide, por exemplo, documentos WO
2009/043353). Esses oligonucleotídeos completamente curtos de LNA são particularmente eficazes na inibição de microRNAs.
[271] Diversos compostos totalmer são altamente eficazes como oligômeros terapêuticos, particularmente quando visam microRNA (antimiRs) ou como oligômeros alteradores do splicing (SSOs).
[272] Em alguns exemplos de realização, o totalmer compreende ou consiste em pelo menos uma porção de sequência XYX ou YXY, como uma sequência repetida de XYX ou YXY, em que X é LNA e Y é um análogo de nucleotídeo alternativo (ou seja, diferente de LNA), como uma unidade de RNA 2'-OMe e uma unidade de DNA 2'-flúor. A porção da sequência acima pode, em algumas modalidades, ser, por exemplo, XXY, XYX, YXY ou YYX.
[273] Em alguns exemplos de realização, o totalmer pode compreender ou consistir de uma sequência de nucleotídeos contígua entre 7 e 16 nucleotídeos, tal como 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 nucleotídeos, como entre 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos.
[274] Em alguns exemplos de realização, a sequência de nucleotídeos contígua do totalmer compreende pelo menos 30%, como pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%, como 95%, como 100% de unidades de LNA. Para compostos completamente de LNA, é vantajoso que eles tenham menos de 12 nucleotídeos de comprimento, tal como 7 - 10.
[275] As unidades restantes podem ser selecionadas dentre os análogos de nucleotídeo diferentes de LNA referidos na presente invenção, como aqueles selecionados do grupo consistindo em uma unidade 2'-O-alquil- RNA, uma unidade 2' OMe- RNA, uma unidade 2'-amino-DNA, uma unidade 2'- flúor-DNA, uma unidade de LNA, uma unidade de PNA, uma unidade de HNA, uma unidade de INA e uma unidade de 2' MOE RNA, ou grupo 2’-OMe RNA e a unidade 2'- flúor DNA.
MIXMERS
[276] O termo 'mixmer' refere-se aos oligômeros que compreendem nucleosídeos de DNA e nucleosídeos modificados no açúcar em que há comprimento insuficiente de nucleosídeos de DNA contíguos para recrutar RNase-H. Os mixmers adequados podem compreender até 3 ou até 4 nucleosídeos de DNA contíguos. Em alguns exemplos de realização, os mixmers, ou sua sequência nucleotídica contígua, compreendem regiões alternadas de nucleosídeos modificados no açúcar e nucleosídeos de DNA. Ao alternar as regiões nucleosídeos modificados no açúcar que formam uma conformação do tipo RNA (3'endo) quando incorporados no oligonucleotídeo, com regiões curtas de nucleosídeos de DNA, podem ser feitos oligonucleotídeos não recrutadores da RNase-H. Vantajosamente, os nucleosídeos modificados no açúcar são nucleosídeos com modificações do açúcar que aumentam a afinidade.
[277] Os oligonucleotídeos mixmers são frequentemente usados para fornecer modulação baseada na ocupação dos genes alvo, como moduladores de splicing ou inibidores de microRNA.
[278] Em alguns exemplos de realização, os nucleosídeos modificados no açúcar no mixmer, ou sua sequência nucleotídica contígua, compreendem ou são todos nucleosídeos LNA, como nucleosídeos (S)cET ou beta-D-oxi LNA.
[279] Em alguns exemplos de realização, todos os nucleosídeos modificados por açúcar de um mixmer compreendem a mesma modificação de açúcar, por exemplo, todos podem ser nucleosídeos de LNA ou todos podem ser nucleosídeos 2'O-MOE. Em alguns exemplos de realização, os nucleosídeos modificados no açúcar de um mixmer podem ser selecionados independentemente a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos substituídos em 2’, como nucleosídeos 2'-substituídos selecionados a partir do grupo que consiste em 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil -RNA, 2'-alcoxi-RNA, 2'-O- metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'-flúor-RNA e nucleosídeos 2'-F-ANA.
Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo compreende os nucleosídeos de LNA e os nucleosídeos substituídos em 2', como o nucleosídeo substituído em 2' selecionado a partir do grupo que consiste nos nucleosídeos 2'-O-alquil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-O-metil-RNA, 2'-alcoxi RNA, 2'-O-metoxietil-RNA (MOE), 2'-amino-DNA, 2'-flúor-RNA e 2'-F-ANA. Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo compreende nucleosídeos de LNA e 2'-O-MOE. Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo compreende nucleosídeos LNA (S)cET e nucleosídeos 2'-O-MOE.
[280] Em alguns exemplos de realização, o mixmer, ou sua sequência nucleotídica contígua, compreende apenas nucleosídeos de LNA e DNA, tais oligonucleotídeos de mixmer de LNA que podem, por exemplo, ter entre 8 e 24 nucleosídeos de comprimento (consulte, por exemplo, o documento WO2007112754, que descreve inibidores de LNA antmiR de microRNAs).
[281] Diversos compostos mixmer são altamente eficazes como oligômeros terapêuticos, particularmente quando visam microRNA (antimiRs) ou como oligômeros alteradores do splicing (SSOs).
[282] Em alguns exemplos de realização, o mixmer compreende um motivo: …[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m… ou …[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m …or …[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m … ou …[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m … …[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m… ou …[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m … ou …[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m.. ou
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[ L]m … em que L representa nucleosídeo modificado no açúcar, como um nucleosídeo LNA substituído em 2' (por exemplo, 2'-O-MOE), D representa nucleosídeo de DNA e em que cada m é selecionado independentemente a partir de 1 a 6 e cada n é selecionado independentemente a partir de 1, 2, 3 e 4, tal como 1-3. Em alguns exemplos de realização, cada L é um nucleosídeo de LNA. Em alguns exemplos de realização, pelo menos um L é um nucleosídeo de LNA e pelo menos um L é um nucleosídeo 2'-O-MOE. Em alguns exemplos de realização, cada L é independentemente selecionado a partir de LNA e nucleosídeo 2'-O-MOE.
[283] Em alguns exemplos de realização, o mixmer pode compreender ou consistir de uma sequência de nucleotídeos contígua entre 10 e 24 nucleotídeos, tal como 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 nucleotídeos.
[284] Em alguns exemplos de realização, a sequência nucleotídica contígua do mixmer compreende pelo menos 30%, tal como pelo menos 40%, como pelo menos 50% de unidades de LNA.
[285] Em alguns exemplos de realização, o mixmer compreende ou consiste em uma sequência nucleotídica contígua de padrão repetitivo de análogos de nucleotídeos e nucleotídeos de ocorrência natural, ou um tipo de análogo de nucleotídeo e um segundo tipo de análogo de nucleotídeo. O padrão de repetição pode ser, por exemplo: cada segundo ou cada terceiro nucleotídeo é um análogo de nucleotídeo, como LNA, e os nucleotídeos restantes são nucleotídeos de ocorrência natural, como DNA, ou são um análogo de nucleotídeo substituído em 2', como análogos 2'-MOE e 2'-flúor, tal como referido na presente invenção, ou, em alguns exemplos de realização eles são selecionados a partir dos grupos de análogos nucleotídicos referidos na presente invenção. É reconhecido que o padrão de repetição de análogos de nucleotídeos, como unidades de LNA, pode ser combinado com análogos de nucleotídeos em posições fixas - por exemplo, nas extremidades 5’ ou 3'.
[286] Em alguns exemplos de realização, o primeiro nucleotídeo do oligômero, contado a partir da extremidade 3’, é um análogo de nucleotídeo, tal como um nucleotídeo de LNA ou um nucleosídeo 2'-O-MOE.
[287] Em alguns exemplos de realização, que talvez sejam iguais ou diferentes, o segundo nucleotídeo do oligômero, contado a partir da extremidade 3’, é um análogo de nucleotídeo, como um nucleotídeo LNA ou um nucleosídeo 2'-O-MOE.
[288] Em alguns exemplos de realização, que talvez sejam iguais ou diferentes, o 5’-terminal do oligômero é um análogo de nucleotídeo, como um nucleotídeo LNA ou um nucleosídeo 2'-O-MOE.
[289] Em alguns exemplos de realização, o mixmer compreende pelo menos uma região compreendendo pelo menos duas unidades consecutivas de análogos de nucleotídeos, tal como pelo menos duas unidades de LNA consecutivas.
[290] Em alguns exemplos de realização, o mixmer compreende pelo menos uma região compreendendo pelo menos três unidades consecutivas de análogos de nucleotídeos, tal como pelo menos três unidades de LNA consecutivas.
EXOSSOMOS
[291] Os exossomos são nanovesículas biológicas naturais, tipicamente no intervalo de tamanho de 30 a 500 nm, envolvidas na comunicação célula-célula por meio da carga funcionalmente ativa (como miRNA, mRNA, DNA e proteínas).
[292] Os exossomos são secretados por todos os tipos de células e também são encontrados em abundância nos fluidos corporais, como:
saliva, sangue, urina e leite. O principal papel dos exossomos é transportar as informações, entregando vários efetores ou moléculas de sinalização entre células específicas (Acta Pol Pharm. 2014 Jul-Aug; 71 (4): 537-43). Tais efetores ou moléculas de sinalização podem, por exemplo, ser proteínas, miRNAs ou mRNAs. Atualmente, os exossomos estão sendo explorados como um veículo de entrega para várias moléculas de fármacos, incluindo moléculas terapêuticas de RNA, para expandir as aplicações terapêuticas e diagnósticas de tais moléculas. Existem divulgações na técnica de exossomos carregados com moléculas sintéticas como siRNA, oligonucleotídeos antissenso e moléculas pequenas que sugerem ou mostram vantagens em termos de entrega e eficácia de tais moléculas em comparação com as moléculas de fármacos livres (consulte, por exemplo, Andaloussi et al 2013 Advanced Drug Delivery Reviews 65: 391-397, e documentos WO2014/168548, WO2016/172598, WO2017/173034 e WO 2018/102397).
[293] Exossomos podem ser isolados a partir de fontes biológicas, tais como o leite (exossomos de leite), em particular o leite bovino é uma fonte abundante para o isolamento de exossomos de leite bovino. Vide, por exemplo, Manca et al., Scientific Reports (2018) 8:11321.
[294] Em alguns exemplos de realização da invenção, o oligonucleotídeo de fita simples é encapsulado em um exossomo (formulação de exossomo), exemplos de carregamento de um exossomo com um oligonucleotídeo antissenso de fita simples estão descritos no pedido de patente de invenção norte-americana US 18192614.8. Nos métodos da invenção, o oligonucleotídeo antissenso pode ser administrado à célula ou ao sujeito na forma de uma formulação de exossomo, em particular por administração oral das formulações de exossomo.
[295] Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo antissenso pode ser conjugado, por exemplo, com um conjugado lipofílico,
como o colesterol, que pode ser covalentemente ligado ao oligonucleotídeo antissenso por meio de um ligante bioclivável (por exemplo, uma região de nucleotídeos de DNA ligados por fosfodiéster). Tais conjugados lipofílicos podem facilitar a formulação de oligonucleotídeos antissenso em exossomos e podem melhorar ainda mais a entrega para a célula alvo.
CONJUGADO
[296] O termo conjugado, conforme utilizado na presente invenção, refere-se a um oligonucleotídeo que está covalentemente ligado a uma porção não nucleotídica (porção conjugada ou região C ou terceira região).
[297] A conjugação do oligonucleotídeo da invenção a uma ou mais porções não nucleotídicas pode melhorar a farmacologia do oligonucleotídeo, por exemplo, afetando a atividade, distribuição celular, captação celular ou estabilidade do oligonucleotídeo. Em alguns exemplos de realização, a porção conjugada modifica ou aprimora as propriedades farmacocinéticas do oligonucleotídeo, melhorando a distribuição celular, biodisponibilidade, metabolismo, excreção, permeabilidade e/ou captação celular do oligonucleotídeo. Em particular, o conjugado pode direcionar o oligonucleotídeo para um órgão, tecido ou tipo de célula específico e, assim, aumentar a eficácia do oligonucleotídeo nesse órgão, tecido ou tipo de célula.
Ao mesmo tempo o conjugado pode servir para reduzir a atividade do oligonucleotídeo em tipos de células, tecidos ou órgãos ‘não alvos’, por exemplo, atividade fora do alvo ou a atividade em tecidos, órgãos ou tipos de células ‘não-alvo’.
[298] Os documentos WO 93/07883 e WO 2013/033230 fornecem porções conjugadas adequadas, que são incorporadas ao presente por referência. As porções conjugadas adequadas adicionais são aquelas capazes de se ligar ao receptor de asialoglicoproteína (ASGPR). Em particular,
porções conjugadas trivalentes de N-acetilgalactosamina são adequadas para ligação ao ASGPR, consulte, por exemplo, os documentos WO 2014/076196, WO 2014/207232 e WO 2014/179620 (incorporado ao presente por referência).
Tais conjugados servem para aumentar a captação do oligonucleotídeo para o fígado enquanto reduzem sua presença no rim, aumentando assim a razão fígado/rim de um oligonucleotídeo conjugado em comparação com a versão não conjugada do mesmo oligonucleotídeo.
[299] Os conjugados de oligonucleotídeos e a síntese dos mesmos também foram divulgados em revisões abrangentes por Manoharan em Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T.
Crooke, ed., Cap. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 e Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103, cada um deles integralmente incorporado ao presente pela referência.
[300] Em um exemplo de realização, a porção não nucleotídica (porção conjugada) é selecionada a partir do grupo que consiste em carboidratos, ligantes de receptores da superfície celular, substâncias medicamentosas, hormônios, substâncias lipofílicas, polímeros, proteínas, peptídeos, toxinas (por exemplo, toxinas bacterianas), vitaminas, proteínas virais (por exemplo, capsídeos) ou combinações dos mesmos.
LIGANTES
[301] Uma ligação ou ligante é uma ligação entre dois átomos que vincula um grupo químico ou segmento de interesse a outro grupo químico ou segmento de interesse por meio de uma ou mais ligações covalentes.
Porções conjugadas podem ser ligadas ao oligonucleotídeo diretamente ou através de uma porção ligante (ligante ou tirante). Os ligantes servem para conectar covalentemente uma terceira região, por exemplo, uma porção conjugada (Região C), a uma primeira região, por exemplo, uma sequência oligonucleotídica ou nucleotídica contígua complementar ao ácido nucleico alvo
(região A).
[302] Em alguns exemplos de realização da invenção, o conjugado ou conjugado de oligonucleotídeo da invenção pode opcionalmente compreender uma região ligante (segunda região ou região B e/ou região Y) que está posicionada entre o oligonucleotídeo ou a sequência nucleotídica contígua complementar ao ácido nucleico alvo (região A ou primeira região) e a porção conjugada (região C ou terceira região).
[303] A região B refere-se a ligantes biocliváveis que compreendem ou consistem em uma ligação fisiologicamente lábil que é clivável sob condições normalmente encontradas ou análogas às encontradas dentro de um corpo de mamífero. As condições sob as quais os ligantes fisiologicamente instáveis sofrem transformação química (por exemplo, clivagem) incluem condições químicas como pH, temperatura, condições ou agentes oxidativos ou redutores e concentração de sal encontrada, ou análoga à encontrada, nas células de mamíferos. As condições intracelulares de mamífero também incluem a presença de atividade enzimática normalmente presentes em uma célula de mamífero, tal como a partir de enzimas proteolíticas, enzimas hidrolíticas ou nucleases. Em um exemplo de realização, o ligante bioclivável é suscetível à clivagem de nuclease S1. Em um exemplo de realização preferido, o ligante suscetível a nuclease compreende entre 1 e 10 nucleosídeos, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleosídeos, mais preferencialmente entre 2 e 6 nucleosídeos e mais preferencialmente entre 2 e 4 nucleosídeos ligados compreendendo pelo menos duas ligações fosfodiéster consecutivas, tais como pelo menos 3 ou 4 ou 5 ligações fosfodiéster consecutivas. Preferencialmente, os nucleosídeos são DNA ou RNA. Os ligantes biocliváveis contendo fosfodiéster são descritos em mais detalhes no documento WO 2014/076195 (incorporado ao presente por referência).
[304] A região Y refere-se a ligantes que não são necessariamente biocliváveis, mas servem principalmente para conectar covalentemente uma porção conjugada (região C ou terceira região) a um oligonucleotídeo (região A ou primeira região). Em alguns exemplos de realização, o ligante compreende uma estrutura de cadeia ou um oligômero de unidades de repetição, tais como etileno glicol, unidades de aminoácidos ou grupos aminoalquila. Os conjugados de oligonucleotídeos da presente invenção podem ser construídos dos seguintes elementos regionais A-C, A-B- C, A-B-Y-C, A-Y-B-C ou A-Y-C. Em alguns exemplos de realização, o ligante (região Y) é um aminoalquila, como um grupo aminoalquila–C2-C36, incluindo, por exemplo, grupos aminoalquila C6 a C12. Em um exemplo de realização preferido, o ligante (região Y) é um grupo amino alquila–C6.
ADMINISTRAÇÃO
[305] Os oligonucleotídeos ou composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administrados de maneira tópica (como na pele, inalação, oftalmologia ou ótica) ou enteral (tal como por via oral ou através do trato gastrointestinal) ou parenteral (tal como por via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular ou intratecal).
[306] Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo ou as composições farmacêuticas da presente invenção são administrados por via parenteral, incluindo a injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular, administração intratecal ou intracraniana, por exemplo, intracerebral ou intraventricular, intravítrea. Em um exemplo de realização, o oligonucleotídeo ativo ou o conjugado de oligonucleotídeo é administrado por via intravenosa. Em outro exemplo de realização, o oligonucleotídeo ativo ou o conjugado de oligonucleotídeo é administrado por via subcutânea.
[307] Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo, conjugado de oligonucleotídeo ou composição farmacêutica da invenção é administrado em uma dose de 0,1 – 15 mg/kg, tal como de 0,2 a 10 mg/kg, 0,25 a 5 mg/kg. A administração pode ser feita uma vez por semana, a cada 2 semanas, a cada três semanas ou uma vez por mês ou duas vezes por mês.
[308] A invenção também provê o uso do oligonucleotídeo ou conjugado de oligonucleotídeo da invenção, conforme descrito para a fabricação de um medicamento em que o medicamento está em uma forma de dosagem para a administração oftálmica, tal como injeção intravítrea. Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo para alvos oftálmicos é o Htra-1.
[309] A invenção também provê o uso do oligonucleotídeo ou conjugado de oligonucleotídeo da invenção, conforme descrito para a fabricação de um medicamento em que o medicamento está em uma forma de dosagem para a administração (por exemplo, injeção) intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular ou intratecal.
VANTAGENS EXEMPLIFICATIVAS
[310] Conforme ilustrado no presente documento, a ligação internucleosídica de fosforoditioato aquiral usada nos compostos da invenção permite a redução da complexidade de um oligonucleotídeo de fosforotioato não estereodefinido, enquanto mantém a atividade, eficácia ou potência do oligonucleotídeo.
[311] De fato, tal como ilustrado na presente invenção, a utilização destes nos compostos da invenção fornece benefícios únicos em combinação com fosforotioatos estereodefinidos, proporcionando a oportunidade de reduzir ainda mais a complexidade de oligonucleotídeos fosforotioato, embora mantendo ou melhorando a atividade, eficácia ou potência do oligonucleotídeo.
[312] Conforme ilustrado na presente invenção, a ligação internucleosídica de fosforoditioato aquiral usada nos compostos da invenção permite melhorar a captação celular in vitro ou in vivo.
[313] Conforme ilustrado no presente documento, a ligação internucleosídica de fosforoditioato aquiral usada nos compostos da invenção permite a alteração ou melhora da biodistribuição in vitro (medida como conteúdo no tecido ou célula, ou atividade/potência nos tecidos alvo).
Notavelmente, observamos melhora da captação tecidual, teor e/ou potência em células musculares esqueléticas, do coração, baço, fígado, rim, fibroblastos e epiteliais.
[314] No contexto de oligonucleotídeos mixmer, os inventores identificaram que a incorporação de ligações de fosforoditioato (como mostrado em (IA) ou (IB)), entre ou adjacente a um ou mais nucleosídeos de DNA, fornece melhorias, como estabilidade aprimorada e/ou potência melhorada. No contexto de oligonucleotídeos gapmer, os inventores observaram que a incorporação de ligações de fosforoditioato (como mostrado em (IA) ou (IB)) entre os nucleosídeos da região do flanco (como entre os nucleosídeos modificados no açúcar 2’) também fornece melhorias, como estabilidade aprimorada e/ou potência aprimorada.
[315] Conforme ilustrado no presente documento, a ligação internucleosídica de fosforoditioato aquiral usada nos compostos da invenção permite melhorar a estabilidade do oligonucleotídeo. A incorporação do internucleosídeo de fosforoditioato aquiral nos compostos da invenção fornece resistência aprimorada às exonucleases séricas e celulares, particularmente exonucleases 3’, mas também exonucleases 5', e também a exonucleases 5’, e a notável estabilidade dos compostos da invenção indica ainda uma resistência às endonucleases para compostos que incorporam as ligações de fosforoditioato aquiral. A estabilização dos oligonucleotídeos é de particular importância na redução ou prevenção do acúmulo de produtos de degradação tóxica e no prolongamento da duração da ação do oligonucleotídeo antissenso.
Como ilustrado nos exemplos, a estabilidade em soro de rato pode ser utilizada para testar a estabilidade melhorada. Para avaliação da estabilidade celular, pode ser utilizado extrato de homogenato de tecido (por exemplo, fígado) - consulte, por exemplo, o documento WO2014076195 que fornece tais métodos. Outros ensaios mensurar a estabilidade de oligonucleotídeos incluem ensaios de estabilidade de fosfodiesterase de veneno de cobra e estabilidade de nuclease S1.
[316] O risco de toxicidade reduzida dos oligonucleotídeos reivindicados é testado em ensaios in vitro de hepatotoxicidade (por exemplo, conforme divulgado no documento WO 2017/067970) ou ensaios in vitro de nefrotoxicidade (por exemplo, conforme divulgado no documento WO 2017/216340). Alternativamente, a toxicidade pode ser analisada in vivo, por exemplo, em camundongos ou ratos.
[317] A estabilidade aprimorada pode fornecer benefícios para a duração da ação dos oligonucleotídeos da invenção, o que é particularmente benéfico quando a via de administração é invasiva, por exemplo, administração parenteral, como intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracerebral, intraocular, intracerebroventricular ou administração intratecal.
EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO GERAIS DE OLIGONUCLEOTÍDEOS
[318] 1. Um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3' de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5' de outro nucleosídeo adjacente (A2), em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, como um cátion de metal alcalino, tal como um cátion de Na + ou K+; ou M+ é um cátion de amônio.
[319] 2. Um oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 1, em que um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e o outro é um nucleosídeo de DNA, um nucleosídeo de RNA ou um nucleosídeo modificado no açúcar.
[320] 3. Um oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 1 ou 2, em que um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e o outro é um nucleosídeo de DNA ou um nucleosídeo modificado no açúcar.
[321] 4. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, em que um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e o outro é um nucleosídeo de DNA.
[322] 6. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, em que um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e o outro é um nucleosídeo modificado no açúcar.
[323] 7. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 2 a 6, em que o referido nucleosídeo modificado no açúcar é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado.
[324] 8. Um oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 7, em que o referido nucleosídeo com açúcar 2’-modificado é 2’- alcóxi-RNA, 2’-alcóxi-alcóxi-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-flúor-RNA, 2’-flúor-ANA ou um nucleosídeo LNA.
[325] 9. Um oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 7 ou 8, em que o referido nucleosídeo com açúcar 2’-modificado é um nucleosídeo de LNA.
[326] 10. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 9, em que os nucleosídeos de LNA são independentemente selecionados a partir de beta-D-oxi LNA, 6’-metil-beta- D- oxi LNA e ENA.
[327] 11. Um oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 9 ou 10, em que ambos os nucleosídeos de LNA são beta-D-oxi LNA.
[328] 12. Um oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 7 ou 8, em que o referido nucleosídeo com açúcar 2’-modificado é 2’-alcóxi-alcóxi-RNA.
[329] 13. Um oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 10, em que 2’-alcóxi-RNA é 2’-metoxi-RNA.
[330] 14. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12, em que 2’-alcóxi-alcóxi-RNA é 2’- metoxietoxi-RNA.
[331] 15. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 14, compreende entre 1 e 15, em particular entre 1 e 5, mais particularmente 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) conforme definido no exemplo de realização 1.
[332] 16. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 15, compreende ligações internucleosídicas adicionais independentemente selecionadas a partir de ligação internucleosídica de fosfodiéster, ligação internucleosídica de fosforotioato e ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) conforme definido no exemplo de realização 1.
[333] 17. Um oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 16, em que as ligações internucleosídicas adicionais são independentemente selecionadas a partir de ligação internucleosídica de fosforotioato e ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) conforme definido no exemplo de realização 1.
[334] 18. Um oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 16 ou 17, em que as ligações internucleosídicas adicionais são todas ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[335] 19. Um oligonucleotídeo de acordo com os exemplos de realização de 16 a 17, em que as ligações internucleosídicas adicionais são todas ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) conforme definido no exemplo de realização 1.
[336] 20. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19, em que o oligonucleotídeo tem de 7 a 30 nucleotídeos de comprimento.
[337] 21. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 20, em que um ou mais nucleosídeos é um nucleosídeo de nucleobase modificada.
[338] 22. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 21, em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso, um siRNA, um microRNA mimético ou uma ribozima.
[339] 23. Um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 22, em particular um sal de sódio ou potássio ou sal de amônio.
[340] 24. Um conjugado compreendendo um oligonucleotídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 23 e pelo menos uma porção de conjugado covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo ou referido sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente por uma porção ligante.
[341] 25. Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 24 e um veículo terapeuticamente inerte.
[342] 26. Um oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 24 para uso como uma substância terapeuticamente ativa.
[343] 27. Um processo para a fabricação de um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 24 compreendendo as seguintes etapas: (a) Acoplamento de um nucleosídeo de tiofosforamidita ao átomo de oxigênio 5’ terminal de um nucleotídeo ou oligonucleotídeo para produzir um intermediário triéster de tiofosfito; (b) Tio-oxidação do intermediário triéster de tiofosfito obtido na etapa a); e (c) Opcionalmente alongando mais o oligonucleotídeo.
[344] 28. Um oligonucleotídeo fabricado de acordo com um processo do exemplo de realização 27.
EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO DE GAPMER
[345] 1. Um oligonucleotídeo gapmer antissenso, para inibição de um RNA alvo em uma célula, em que o oligonucleotídeo gapmer antissenso compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB)
em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, tal como um cátion de metal alcalino, tal como um cátion Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio.
[346] 2. O oligonucleotídeo gapmer antissenso de acordo com o exemplo de realização 1, em que a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato é de fórmula (IA), e R é hidrogênio; ou a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato é de fórmula (IB), e M+ é Na+, K+ ou amônio.
[347] 3. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com o exemplo de realização 1 ou 2, em que um dos dois átomos de oxigênio da referida pelo menos uma ligação internucleosídica de fórmula (I) está ligado ao átomo de carbono 3’ de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5’ de outro nucleosídeo (A2), em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado.
[348] 4. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, em que um dentre (A 1) e (A2) é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado e o outro é um nucleosídeo de DNA.
[349] 5. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, em que ambos (A 1) e (A2) são ao mesmo tempo nucleosídeos 2’-modificados.
[350] 6. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, em que ambos (A 1) e (A2) são nucleosídeos de DNA ao mesmo tempo.
[351] 7. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 6, em que o oligonucleotídeo gapmer compreende uma sequência nucleotídica contígua de fórmula 5’-F-G- F’-3’, em que G é uma região de 5 a 18 nucleosídeos que é capaz de recrutar
RNase-H, e a referida região G é flanqueada 5’ e 3’ por regiões flanqueadoras F e F’, respectivamente, em que as regiões F e F’ compreendem ou consistem independentemente de 1 a 7 nucleotídeos com açúcar 2’-modificado, em que o nucleosídeo de região F que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado e em que o nucleosídeo da região F’ que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado.
[352] 8. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 7, em que os nucleosídeos açúcar 2’-modificados são independentemente selecionados a partir de 2’- alcóxi-RNA, 2’-alcóxi-alcóxi-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-flúor-RNA, 2’-flúor-ANA e Nucleosídeos de LNA.
[353] 9. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com o exemplo de realização 8, em que 2’-alcóxi-alcóxi-RNA é um 2’-metoxietoxi-RNA (2’-O-MOE).
[354] 10. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 8, em que região F e região F’ compreendem ou consistem de nucleotídeos 2’-metoxietoxi-RNA.
[355] 11. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 10, em que pelo menos um ou todos os nucleosídeos açúcar 2’-modificados na região F ou região F’, ou em ambas as regiões F e F’, são nucleosídeos de LNA.
[356] 12. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 11, em que região F ou região F’, ou ambas as regiões F e F’, compreendem pelo menos um nucleosídeo de LNA e pelo menos um nucleosídeo de DNA.
[357] 13. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 12, em que região F ou região F’, ou ambas as regiões F e F’ compreendem pelo menos um nucleosídeo de
LNA e pelo menos um nucleosídeo não LNA com açúcar 2’-modificado, tal como pelo menos um nucleosídeo 2’-metoxietoxi-RNA.
[358] 14. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 13, em que a região gap compreende de 5 a 16, em particular de 8 a 16, mais particularmente 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 nucleosídeos de DNA contíguos.
[359] 15. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 14, em que região F e região F’ são independentemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 nucleosídeos de comprimento.
[360] 16. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 15, em que cada região F e região F’ compreende independentemente 1, 2, 3 ou 4 nucleosídeos de LNA.
[361] 17. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 8 a 16, em que os nucleosídeos de LNA são independentemente selecionados a partir de beta-D-oxi LNA, 6’- metil-beta-D-oxi LNA e ENA.
[362] 18. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com os exemplos de realização de 8 a 18, em que os nucleosídeos de LNA são beta- D-oxi LNA.
[363] 19. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 18, em que o oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua do mesmo (F-G-F’), é de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em particular 12 a 22, mais particularmente de 14 a 20 oligonucleotídeos de comprimento.
[364] 20. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19, em que pelo menos uma das regiões flanqueadoras, tal como a região F e F’ compreende uma ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), conforme definido em qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19.
[365] 21. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19, em que ambas as regiões flanqueadoras, tal como a região F e F’, compreendem uma ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), conforme definido em qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19.
[366] 22. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 21, em que pelo menos uma das regiões flanqueadoras, tal como F ou F’, compreendem pelo menos duas ligações fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), conforme definido em qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19.
[367] 23. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 21, em que ambas as regiões flanqueadoras, F e F’, compreendem pelo menos duas ligações fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), conforme definido em qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19.
[368] 24. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 23, em que uma ou ambas as regiões flanqueadoras compreendem um nucleosídeo de LNA que possui uma ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) que liga um LNA a um nucleosídeo 3’.
[369] 25. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 24, em que uma ou ambas as regiões flanqueadoras compreendem dois ou mais nucleosídeos adjacentes de LNA que são ligados por ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) que liga um LNA a um nucleosídeo 3’.
[370] 26. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 25, em que cada uma ou ambas as regiões flanqueadoras compreendem um nucleosídeo MOE que possui uma ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) que liga o MOE a um nucleosídeo 3’.
[371] 27. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 26, em que uma ou ambas as regiões flanqueadoras compreendem dois ou mais nucleosídeos MOE adjacentes que são ligados por ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) que liga o MOE a um nucleosídeo 3’.
[372] 28. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 27, em que as regiões flanqueadoras, F e F’, compreendem juntas 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), e em que opcionalmente, uma ligação internucleosídica entre o nucleosídeo mais a 3’ da região F e o nucleosídeo mais a 5’ da região G também é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB).
[373] 29. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 28, que compreende l uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) posicionada entre os nucleosídeos adjacentes na região F ou região F’, entre a região F e a região G ou entre a região G e a região F’.
[374] 30. A região de gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 29, em que a região gap compreende 1, 2, 3 ou 4 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), em que as ligações internucleosídicas remanescentes são ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[375] 31. O gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 30, em que uma região gap compreende uma região de pelo menos 5 nucleotídeos de DNA contíguos, tal como uma região de 6 – 18 nucleotídeos de DNA contíguos, ou 8 – 14 nucleotídeos de DNA contíguos.
[376] 32. O gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 31, que compreende ainda uma ou mais ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido (Sp, S) ou (Rp, R) em que N1 e N2 são nucleosídeos.
[377] 33. O gapmer de acordo com o exemplo de realização 32, em que o gapmer compreende pelo menos uma ligação internucleosídica estereodefinida (Sp, S) ou (Rp, R) entre dois nucleosídeos de DNA, tal como entre dois nucleosídeos de DNA na região gap.
[378] 34. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com o exemplo de realização 32 ou 33, em que a região gap compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas Rp e Sp.
[379] 35. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 32 - 33, em que a região G compreende ainda pelo menos 2, 3, ou 4 ligações internucleosídicas de fórmula IB.
[380] 34. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com os exemplos de realização 32 – 35, em que (i) todas as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G (ou seja, entre o nucleosídeo na região G) são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas Rp e Sp, ou (ii) todas as ligações internucleosídicas dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas Rp e Sp.
[381] 35. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 34, em que todas as ligações internucleosídicas dentro das regiões flanqueadoras são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), em que, opcionalmente, uma ligação internucleosídica entre o nucleosídeo mais a 3’ da região F e o nucleosídeo mais a 5’ da região G também é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), e uma ligação internucleosídica entre o nucleosídeo mais a 3’ da região G e nucleosídeo mais a 5’ da região F’ é uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido.
[382] 36. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 35, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1.
[383] 37. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 36 em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreendem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1, em particular 0 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I).
[384] 38. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 37, em que as ligações internucleosídicas remanescentes são independentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em fosforotioato, fosfodiéster e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1.
[385] 39. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 38, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos de região F e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região F’ são independentemente selecionadas a partir de fosforotioato e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1.
[386] 40. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 39, em que cada região flanqueadora, F e F’, compreende independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1.
[387] 41. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 40, em que todas as ligações internucleosídicas de regiões flanqueadoras F e/ou F’ são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1.
[388] 42. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 41, em que o oligonucleotídeo gapmer compreende pelo menos uma ligação internucleosídica estereodefinida, tal como pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido.
[389] 43. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 42, em que a região gap compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido.
[390] 44. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 43, em que todas as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região gap são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido.
[391] 45. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 44, em que a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) está posicionada entre os nucleosídeos da região F, ou entre os nucleosídeos da região F’, ou entre a região F e a região G, ou entre a região G e a região F’, e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região F e F’, entre a região F e a região G e entre a região G e a região F’, são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, ligações internucleosídicas estereoaleatórias, ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) e ligações internucleosídicas de fosfodiéster.
[392] 46. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com o exemplo de realização 45, em que as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região F, dentro da região F’ ou dentro de ambas as regiões, F e F’, são todas ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB).
[393] 47. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 33, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreendem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1 e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, ligações internucleosídicas estereoaleatórias e ligações internucleosídicas de fosfodiéster.
[394] 48. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 47, em que o nucleosídeo 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso é um nucleosídeo de LNA ou um nucleosídeo 2’-O- MOE.
[395] 49. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 48, em que o nucleosídeo 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso é um nucleosídeo de LNA ou um nucleosídeo 2’-O- MOE.
[396] 50. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 49, em que os dois nucleosídeos mais na extremidade 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
[397] 51. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 50, em que os dois nucleosídeos mais na extremidade 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
[398] 52. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 51, em que os três nucleosídeos mais na extremidade 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
[399] 53. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 52, em que os três nucleosídeos mais na extremidade 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
[400] 54. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 53, em que os dois nucleosídeos mais na extremidade 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são nucleosídeos de LNA.
[401] 55. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 54, em que os dois nucleosídeos mais na extremidade 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são nucleosídeos de LNA.
[402] 56. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 55, em que o nucleosídeo (A 2) de fórmula (IA) ou (IB) é o nucleosídeo 3’-terminal do oligonucleotídeo.
[403] 57. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 56, em que o nucleosídeo (A 1) de fórmula (IA) ou (IB) é o nucleosídeo 5’-terminal do oligonucleotídeo.
[404] 58. O oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 – 57, em que o oligonucleotídeo gapmer compreende uma sequência nucleotídica contígua de fórmula 5’-D’-F-G-F’-D’’- 3’, em que F, G e F’ são conforme definido em qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 45 e em que cada região D’ e D’’ consiste independentemente de 0 a 5 nucleotídeos, em particular de 2, 3 ou 4 nucleotídeos, particularmente nucleotídeos de DNA tal como nucleosídeos de DNA ligados com fosfodiéster.
[405] 59. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 58, em que o oligonucleotídeo gapmer é capaz de recrutar a RNase-H1 humana.
[406] 60. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 59, em que o oligonucleotídeo gapmer é para a inibição in vitro ou in vivo de um mRNA ou pré-mRNA alvo de mamífero, tal como humano, ou um RNA alvo viral, ou RNA não codificante longo.
[407] 61. Um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 60, em particular um sal de sódio ou potássio.
[408] 62. Um conjugado compreendendo um oligonucleotídeo gapmer ou um sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 61 e pelo menos uma porção de conjugado covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo ou referido sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente por uma porção ligante.
[409] 63. Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo gapmer, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 62 e um veículo terapeuticamente inerte.
[410] 64. Um oligonucleotídeo gapmer, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 63 para uso como uma substância terapeuticamente ativa.
EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO OLIGONUCLEOTÍDEO ANTISSENSO
[411] A invenção diz respeito a um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3’ de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5’ de outro nucleosídeo adjacente (A2), e em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, tal como um cátion de metal alcalino, tal como um cátion Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio.
[412] Alternativamente, M é um metal, tal como um metal alcalino, como Na ou K; ou M é NH4.
[413] O oligonucleotídeo pode, por exemplo, ser um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, que é capaz de modular a expressão de um ácido nucleico alvo, tal como um microRNA alvo, ou é capaz de modular o splicing de um pré-mRNA alvo que compreende uma sequência nucleotídica contígua. O oligonucleotídeo antissenso da invenção compreende uma sequência nucleotídica contígua que é complementar ao ácido nucleico alvo, e é capaz de hibridizar e modular a expressão do ácido nucleico alvo. Em um exemplo de realização preferido, o oligonucleotídeo antissenso, ou a sequência nucleotídica contígua do mesmo, é um oligonucleotídeo mixmer em que (A1) ou (A2) é um nucleosídeo de DNA, ou ambos (A1) e (A2) são nucleosídeos de DNA.
[414] No contexto da presente invenção um oligonucleotídeo antissenso é um oligonucleotídeo de fita simples que é complementar a um ácido nucleico alvo, tal como um RNA alvo, e é capaz de modular (por exemplo, modulação de splicing de um pré-mRNA alvo) ou inibir a expressão do ácido nucleico alvo (por exemplo, um mRNA alvo, um pré-mRNA taget, um RNA viral alvo, ou um RNA não codificante longo alvo). Dependendo do alvo, o comprimento do oligonucleotídeo ou o comprimento da região do qual ele é complementar (isto é, antissenso - de preferência a região complementar é totalmente complementar ao alvo) pode ser de 7 a 30 nucleotídeos (a região que é chamada de sequência nucleotídica contígua). Por exemplo, os inibidores de nucleotídeos LNA de microRNAs podem ser tão curtos quanto 7 nucleotídeos complementares contíguos (e podem ter até 30 nucleotídeos), os oligonucleotídeos de recrutamento da RNase-H são tipicamente de pelo menos 12 nucleotídeos complementares contíguos de comprimento, tal como 12-26 nucleotídeos de comprimento. Os oligonucleotídeos antissenso moduladores do splicing têm tipicamente uma região de nucleotídeos contíguos de 10 a 30 nucleotídeos complementares.
[415] Os oligonucleotídeos moduladores de splicing, também conhecidos como oligonucleotídeos alteradores do splicing (SSOs, do inglês splice-switching oligonucleotides), são ácidos nucleicos modificados, sintéticos, antissenso e curtos, que pareiam com um pré-mRNA e perturbam o repertório de splicing normal do transcrito, bloqueando as interações de bases RNA-RNA entre pares de proteínas ou proteínas-RNA que ocorrem entre os componentes do maquinário de splicing e o pré-mRNA. O splicing de pré-mRNA é necessário para a expressão adequada da grande maioria dos genes codificantes de proteínas e, portanto, o direcionamento do processo oferece um meio de manipular a produção de proteínas a partir de um gene. A modulação do splicing é particularmente valiosa em casos de doenças causadas por mutações que levam à interrupção do splicing normal ou quando a interferência no processo de splicing normal de uma transcrição gênica pode ser terapêutica. os SSOs oferecem uma maneira eficaz e específica de direcionar e alterar o splicing de maneira terapêutica. Consulte Haven's e Hasting NAR (2016) 44, 6549-6563. Os SSOs podem ser complementares a um limite de éxon/íntron no pré-mRNA alvo ou podem ter como alvo elementos facilitadores (enhancers) ou silenciadores de splicing (referidos coletivamente como elementos de splicing cis-atuantes) dentro do pré-mRNA que regula o splicing do pré-mRNA. A modulação do splicing pode resultar em pular éxon ou incluir éxon e, desse modo, modular o splicing alternativo de um pré-mRNA. Os SSOs funcionam por modulação não mediada por nuclease do pré-mRNA alvo e, portanto, não são capazes de recrutar RNase-H, geralmente são oligonucleotídeos totalmente modificados, ou seja, cada nucleosídeo compreende uma porção de açúcar modificada, como uma porção de açúcar 2’ substituída (por exemplo, oligonucleotídeos 2'-O-MOE completos, por exemplo, 15 - 25 nucleotídeos de comprimento, geralmente 18 - 22 ou 20 nucleotídeos de comprimento, com base em uma cadeia principal de fosforotioato) ou oligonucleotídeos mixmer de LNA (oligonucleotídeos de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento que compreende nucleosídeos de DNA e LNA e, opcionalmente, outros nucleosídeos modificados no açúcar 2', tal como 2'-O- MOE. Também estão previstos oligonucleotídeos LNA que não compreendem nucleosídeos de DNA, mas compreendem LNA e outros nucleosídeos modificados no açúcar 2’, como nucleosídeos 2'-O-MOE. A Tabela 1 de Haven's e Hasting NAR (2016) 44, 6549-6563, incorporada ao presente por referência, ilustra uma série de alvos SSO e a química dos oligonucleotídeos usados que possuem atividade in vivo divulgada e é reproduzida abaixo na Tabela A:
TABELA A Condição Gene alvo Estágio/Modelo SSO Alvo (Ação) Rota Ref. (vide Haven’s e Hasting Bloqueio críptico/Splicing aberrante causado por mutações β-Talassemia HBB camundongo PPMO íntron 2 IV (144) aberrante 5'ss (splicing correto) Distrofia muscular FKTN camundongo VPMO éxon 10 IM (145) congênita de aberrante Fukuyama 3'ss; alternative 5'ss; ESE (splicing correto)
Condição Gene alvo Estágio/Modelo SSO Alvo (Ação) Rota Ref. (vide Haven’s e Hasting Progeria de LMNA camundongo VPMO; 2′- éxon 10 IV/IP (146,147) Hutchinson-Gilford MOE /PS 5'ss; éxon 11 críptico 5'ss; éxon 11 ESE (bloqueio do splicing do éxon 11) Amaurose CEP290 camundongo 2′-OMe /PS; Íntron 26 IVI (56) congênita liberiana AAV críptico éxon (splicing correto) Distrofia miotrópica CLCN1 camundongo PMO éxon 7a 3'ss IM (53,148) (salto do éxon 7a) Síndrome de Usher USH1C camundongo 2′-MOE /PS éxon 3 IP (40) críptico 5'ss (splicing correto) gamaglobulinemia BTK camundongo PPMO pseudoéxon IV/SC (149) ligada ao 4A ESS cromossomo X (salto do pseudoéxon) Alteração do splicing alternativo Doença de LRP8 camundongo 2′-MOE /PS íntron 19 ICV (42) Alzheimer ISS (inclusão do éxon 19) Susceptibilidade CTLA4 camundongo PPMO éxon 2 3'ss IP (150) autoimune à (salto do diabetes éxon) Câncer BCL2L1 camundongo 2′-MOE /PS éxon 2 5'ss IV/NP (151) (alternative 5'ss) Câncer ERBB4 camundongo LNA éxon 26 5'ss IP (152) (salto do éxon) Câncer MDM4 camundongo PMO éxon 6 5'ss ITM (153) (salto do éxon) Câncer STAT3 camundongo VPMO éxon 23 α ITM (154) 3'ss (β 3'ss use) Inflamação IL1RAP camundongo 2-OMe éxon 9 ESE IV/NP (155) /PS;LNA (salto do éxon)
Condição Gene alvo Estágio/Modelo SSO Alvo (Ação) Rota Ref. (vide Haven’s e Hasting Inflamação TNFRSF1B camundongo LNA /PS éxon 7 5'ss IP (156) (salto do éxon) Neovascularização FLT1 camundongo PMO éxon 13 5'ss IVI / (157) (sítio pA ITM alternativo) Neovascularização KDR camundongo PMO éxon 13 5'ss IVI / (158) (sítio pA SCJ alternativo) Atrofia muscular SMN2 ensaios clínicos 2′-MOE /PS íntron 7 ISS IT (43,142) espinhal (inclusão do éxon 7) Fase de leitura aberta correta cardiomiopatia MYBPC3 camundongo AAV Exon 5 e 6 IV (159) ESEs (salto do éxon 5, 6) cardiomiopatia TTN camundongo VPMO éxon 326 IP (160) ESE (salto do éxon) Distrofia muscular DMD ensaios clínicos 2′-OMe / PMO éxon 51 IV/SC (46,98) de Duchenne ESE (salto (DMD) do éxon) síndrome de NBN camundongo VPMO éxon 6/7 IV (161) quebras de ESEs (salto Nijmegen (NBS) do éxon) Fase de leitura aberta interrompida/Função da proteína Ébola IL10 camundongo PPMO éxon 4 3'ss IP (162) (salto do éxon) Doença de HTT camundongo 2′-OMe /PS salto éxon IS (163) Huntington 12 Hipercolesterolemia APOB camundongo 2′-OMe /PS éxon 27 3'ss IV (164) (salto do éxon) distrofia muscular MSTN camundongo PPMO/VPMO/ éxon 2 ESE IV/ (165,166) de Duchenne 2′-OMe (salto do IM/ IP (DMD) éxon) doença de Pompe GYS2 camundongo PPMO éxon 6 5'ss IM/IV (167) (salto do éxon) ataxia ATXN3 camundongo 2′-OMe /PS salto do ICV (168) espinocerebelosa éxon 9, 10 tipo 3
[416] Em alguns exemplos de realização da invenção, o oligonucleotídeo antissenso é um oligonucleotídeo modulador de splicing que é complementar a um pré-mRNA selecionado a partir do grupo que consiste em um HBB, FKTN, LMNA, CEP290, CLCN1, USH1C, BTK, LRP8, CTLA4, BCL2L1, ERBB4, MDM4, STAT3, IL1RAP, TNFRSF1B, FLT1, KDR, SMN2, MYBPC3, TTN, DMD, NBN, IL10, HTT, APOB, MSTN, GYS2 e ATXN3.
Exemplos de doenças que podem ser tratadas com os SSOs da invenção, em função de cada alvo, são fornecidos na Tabela A.
[417] Os seguintes exemplos de realização se referem, em geral, a oligonucleotídeos antissenso de fita simples da invenção e, particularmente, a oligonucleotídeos antissenso de modulação de splicing (SSOs):
1. Um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, para modulação de um RNA alvo em uma célula, em que o oligonucleotídeo antissenso compreende ou consiste em uma sequência nucleotídica contígua de 10 – 30 nucleotídeos de comprimento, em que a sequência nucleotídica contígua compreende um ou mais nucleosídeos 2’-modificados no açúcar, e em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas presentes entre os nucleosídeos de uma sequência nucleotídica contígua é uma ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA’) (IB’) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3’ de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5’ de outro nucleosídeo adjacente (A2), e em que R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato;
2. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com o exemplo de realização 1, em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A 1) e (A2) é um nucleosídeo modificado no açúcar 2’;
3. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com o exemplo de realização 1, em que ambos os nucleosídeos, (A1) e (A2), são nucleosídeos modificados no açúcar 2’;
4. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2), ou ambos os nucleosídeos, (A1) e (A2), são um nucleosídeo de DNA;
5. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 4, em que pelo menos um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado ou os nucleosídeos são independentemente selecionados a partir de 2’-alcóxi-RNA, 2’-alcóxi-alcóxi- RNA, 2’-amino-DNA, 2’-flúor-RNA, 2’-flúor-ANA ou um nucleosídeo de LNA;
6. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 5, em que pelo menos um dentre (A 1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA;
7. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 5, em que ambos, (A1) e (A2), são nucleosídeos de LNA;
8. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 6, em que pelo menos um dentre (A 1) e (A2) é um nucleosídeo 2’-O-metoxietil;
9. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 5, em que ambos dentre (A 1) e (A2) são um nucleosídeo 2’-O-metoxietil;
10. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 8, em que os nucleosídeos de LNA são selecionados a partir do grupo que consiste em beta-D-oxi LNA, 6’-metil-beta- D-oxi LNA e ENA;
11. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 8, em que os nucleosídeos de LNA são beta-D-oxi LNA;
12. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 11, em que a sequência nucleotídica contígua compreende um ou mais nucleosídeos açúcar 2’-modificados adicionais, tal como um ou mais nucleosídeos modificados no açúcar 2’ adicionais selecionados a partir do grupo que consiste em 2’-alcóxi-RNA, 2’- alcóxi-alcóxi-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-flúor-RNA, 2’-flúor-ANA ou um nucleosídeo de LNA;
13. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1-12, em que a sequência nucleotídica contígua compreende nucleosídeos de LNA e nucleosídeos de DNA;
14. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1- 12, em que a sequência nucleotídica contígua compreende nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-metoxietil;
15. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1- 13, em que a sequência nucleotídica contígua compreende nucleosídeos de LNA e nucleosídeos de RNA 2’-flúor;
16. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1- 13, em que a sequência nucleotídica contígua compreende; (i) apenas LNA e nucleosídeos de DNA, (ii) apenas LNA e nucleosídeos 2’-O-metoxietil, (iii) apenas LNA, DNA e nucleosídeos 2’-O-metoxietil, (iv) apenas LNA, 2’-flúor RNA e nucleosídeos 2’-O-metoxietil,
(v) apenas LNA, DNA, 2’-flúor RNA e nucleosídeos 2’-O- metoxietil ou apenas LNA, 2’-flúor RNA e nucleosídeos 2’-O- metoxietil, (vi) apenas nucleosídeos 2’-O-metoxietil,
17. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 16, em que a sequência nucleotídica contígua não compreende uma sequência de 4 ou mais nucleosídeos de DNA contíguos, ou não compreende uma sequência de três ou mais nucleosídeos de DNA contíguos;
18. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 17, em que o oligonucleotídeo antissenso ou a sequência nucleotídica contígua do mesmo é um oligonucleotídeo mixmer ou um oligonucleotídeo totalmer;
19. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 18, em que o oligonucleotídeo antissenso não é capaz de recrutar RNase-H1 humana;
20. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19, em que o nucleosídeo (A2) é o nucleosídeo 3’-terminal de uma sequência nucleotídica contígua ou do oligonucleotídeo;
21. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 20, em que o nucleosídeo (A1) é o nucleosídeo 5’-terminal de uma sequência nucleotídica contígua ou do oligonucleotídeo;
22. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 21, que compreende pelo menos duas ligações internucleosídica de fosforoditioato de fórmula I, tal como 2, 3, 4, 5, ou 6 ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula I;
23. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 22, em que uma ligação internucleosídica entre os 2 nucleosídeos mais a 3’ de uma sequência nucleotídica contígua é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula I, e em que uma ligação internucleosídica entre os 2 nucleosídeos mais a 5’ de uma sequência nucleotídica contígua é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula I;
24. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 23 que compreende ainda ligações internucleosídicas de fosforotioato;
25. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 24 que compreende ainda ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido;
26. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 25, em que as ligações internucleosídicas remanescentes são independentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em ligações internucleosídicas de fosforoditioato, ligações internucleosídicas de fosforotioato, e ligações internucleosídicas de fosfodiéster;
27. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 26, em que as ligações internucleosídicas remanescentes são ligações internucleosídicas de fosforotioato;
28. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 27, em que a referida sequência nucleotídica contígua é complementar, tal como 100% complementar, a um pré-mRNA de mamífero, um mRNA alvo maduro de mamífero, um RNA viral alvo, ou um RNA não codificante longo de mamífero;
29. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 28, em que o RNA alvo é um RNA alvo humano;
30. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 29, em que o oligonucleotídeo antissenso modula o splicing de um pré-mRNA de mamífero, tal como um pré-mRNA alvo humano, por exemplo, oligonucleotídeo antissenso que promove um salto no splicing ou a modulação do splicing;
31. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 30, em que o oligonucleotídeo antissenso é complementar, tal como 100% complementar a um sítio de splicing de íntron/éxon de um pré-mRNA humano, ou uma região de modulação de splicing de um pré-mRNA humano;
32. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 30, em que o oligonucleotídeo antissenso ou sequência nucleotídica contígua do mesmo é complementar, tal como totalmente complementar a uma sequência de pré-mRNA humano selecionada a partir do grupo que consiste em TNFR2, HBB, FKTN, LMNA, CEP290, CLCN1, USH1C, BTK, LRP8, CTLA4, BCL2L1, ERBB4, MDM4, STAT3, IL1RAP, TNFRSF1B, FLT1, KDR, SMN2, MYBPC3, TTN, DMD, NBN, IL10, HTT, APOB, MSTN, GYS2, e ATXN3;
33. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 32, em que o oligonucleotídeo antissenso consiste ou compreende de uma sequência nucleotídica contígua selecionada a partir do grupo que consiste em SSO#1 – SSO#25;
34. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 33, em que a célula é uma célula humana;
35. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 34, em que o comprimento do oligonucleotídeo antissenso é de 10 – 30 nucleotídeos de comprimento;
36. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 34, em que o comprimento do oligonucleotídeo antissenso é de 12 – 24 nucleotídeos de comprimento;
37. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 36, em que o nucleosídeo 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso ou o oligonucleotídeo antissenso ou a sequência nucleotídica contígua do mesmo é um nucleosídeo de LNA ou um nucleosídeo 2-O-metoxietil;
38. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 27, em que o nucleosídeo 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso ou a sequência nucleotídica contígua do mesmo é um nucleosídeo de LNA ou um nucleosídeo 2-O-metoxietil;
39. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 38, em que o nucleosídeo 5’-terminal e o nucleosídeo 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso ou a sequência nucleotídica contígua do mesmo são nucleosídeos de LNA;
40. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 39, em que a sequência nucleotídica contígua compreende pelo menos uma região de dois ou três nucleotídeos LNA contíguos, e/ou pelo menos uma região de dois ou três nucleotídeos 2’-O- metoxietil contíguos;
41. Um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 40, em particular um sal de sódio ou potássio ou um sal de amônio;
42. Um conjugado compreendendo um oligonucleotídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 41 e pelo menos uma porção de conjugado covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo ou referido sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente por uma porção ligante;
43. Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 42 e um veículo terapeuticamente inerte;
44. Um oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 43 para uso como uma substância terapeuticamente ativa;
45. Um método para a modulação de um RNA alvo em uma célula que está expressando o referido RNA, cujo método compreende a etapa de administrar uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável, conjugado ou composição de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 44 para a célula;
46. Um método para a modulação do splicing de um pré-RNA alvo em uma célula que está expressando o referido pré-mRNA alvo, cujo método compreende a etapa de administrar uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável, conjugado ou composição de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 44 para a célula;
47. O método de acordo com os exemplos de realização 45 ou 46 em que o referido método é um método in vitro ou um método in vivo;
48. Uso de um oligonucleotídeo, sal farmacêutico, conjugado, ou composição de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 44, para inibição de um RNA em uma célula, tal como em uma célula humana, em que o referido uso é in vitro ou in vivo.
ALGUNS EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO DE MIXMERS
[418] 1. Um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, para modulação de um RNA alvo em uma célula, em que o oligonucleotídeo antissenso compreende ou consiste em uma sequência nucleotídica contígua de 10 – 30 nucleotídeos de comprimento, em que a sequência nucleotídica contígua compreende regiões alternadas de nucleosídeos modificados no açúcar 2’, em que o comprimento máximo do nucleosídeo de DNA contíguo com a sequência nucleotídica contígua é de 3 ou 4, e em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas presentes entre os nucleosídeos de uma sequência nucleotídica contígua é uma ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA’) (IB’) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3’ de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5’ de outro nucleosídeo adjacente (A2), e em que R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato.
[419] 2. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com o exemplo de realização 1, em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo modificado no açúcar 2’.
[420] 3. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com o exemplo de realização 1, em que ambos os nucleosídeos (A 1) e (A2) é um nucleosídeo modificado no açúcar 2’.
[421] 4. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2), ou ambos os nucleosídeos (A1) e (A2) é/são nucleosídeo(s) de DNA.
[422] 5. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 4, em que pelo menos um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado ou os nucleosídeos são independentemente selecionados a partir de 2’-alcóxi-RNA, 2’-alcóxi-alcóxi-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-flúor-RNA, 2’-flúor-ANA ou um nucleosídeo de LNA.
[423] 6. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 5, em que pelo menos um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA.
[424] 7. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 5, em que ambos, (A 1) e (A2), são nucleosídeos de LNA.
[425] 8. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 6, em que pelo menos um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo 2’-O-metoxietil.
[426] 9. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 5, em que ambos dentre (A 1) e (A2) são um nucleosídeo 2’-O-metoxietil.
[427] 10. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 8, em que os nucleosídeos de LNA são selecionados a partir do grupo que consiste em beta-D-oxi LNA, 6’- metil-beta- D-oxi LNA e ENA.
[428] 11. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 8, em que os nucleosídeos de LNA são beta-D-oxi LNA.
[429] 12. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 11, em que a sequência nucleotídica contígua compreende um ou mais nucleosídeos modificado no açúcar 2’ (nucleosídeos açúcar 2’-modificados) adicionais, tal como um ou mais nucleosídeos modificados no açúcar 2’ adicionais selecionados a partir do grupo que consiste em 2’-alcóxi-RNA, 2’-alcóxi-alcóxi-RNA, 2’-amino-DNA, 2’- flúor-RNA, 2’-flúor-ANA ou um nucleosídeo de LNA.
[430] 13. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12, em que a sequência nucleotídica contígua compreende nucleosídeos de LNA e nucleosídeos de DNA.
[431] 14. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12, em que a sequência nucleotídica contígua compreende nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O- metoxietil.
[432] 15. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 13, em que a sequência nucleotídica contígua compreende nucleosídeos de LNA e nucleosídeos de RNA 2’-flúor.
[433] 16. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 13, em que a sequência nucleotídica contígua compreende; (i) LNA e nucleosídeos de DNA (ii) LNA, DNA e nucleosídeos 2’-O-metoxietil (iii) LNA, DNA, 2’-flúor RNA e nucleosídeos 2’-O-metoxietil.
[434] 17. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 16, em que a sequência nucleotídica contígua não compreende uma sequência de 3 ou mais nucleosídeos de DNA contíguos, ou não compreende uma sequência de 2 ou mais nucleosídeos de DNA contíguos.
[435] 18. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 17, em que o oligonucleotídeo antissenso ou a sequência nucleotídica contígua do mesmo é um oligonucleotídeo mixmer, tal como um oligonucleotídeo modulador do splicing ou um oligonucleotídeo inibidor de microRNA.
[436] 19. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com o exemplo de realização 18 em que o miximer consiste ou compreende o motivo de região alternada [L]m[D]n[L]m[D]n[L]m ou [L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m ou [L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m ou [L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m ou [L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m ou [L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m ou [L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m ou [L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L] m em que L representa o nucleosídeo modificado no açúcar 2’, D representa nucleosídeo de DNA, e em que cada m é independentemente selecionado a partir de 1 – 6, e cada n é independentemente selecionado a partir de 1, 2, 3 e 4, tal como 1- 3.
[437] 20. O oligonucleotídeo antissensos de acordo com o exemplo de realização 19, em que cada nucleosídeo L é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em LNA, nucleosídeos 2’-O-MOE ou 2’-flúor, ou cada L é independentemente LNA ou 2’-O-MOE.
[438] 21. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com o exemplo de realização 20, em que cada L é LNA.
[439] 22. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 21, em que o oligonucleotídeo antissenso não é capaz de recrutar RNase-H1 humana.
[440] 23. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 22, em que o nucleosídeo (A 2) é o nucleosídeo 3’-terminal de uma sequência nucleotídica contígua ou do oligonucleotídeo.
[441] 24. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 23, em que o nucleosídeo (A 1) é o nucleosídeo 5’-terminal de uma sequência nucleotídica contígua ou do oligonucleotídeo.
[442] 25. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 24, que compreende pelo menos duas ligações internucleosídica de fosforoditioato de fórmula I, tal como 2, 3, 4, 5, ou 6 ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula I.
[443] 26. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 25, em que a sequência nucleotídica contígua compreende dois nucleotídeos de DNA contíguos em que a ligação nucleosídica entre os dois nucleotídeos de DNA contíguos é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), ou seja, um par de nucleotídeos de DNA ligado a P2S.
[444] 27. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 26, em que a sequência nucleotídica contígua compreende mais do que um par de nucleotídeos de DNA ligado a P2S.
[445] 28. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 26, em que todas as ligações nucleosídicas entre os dois nucleotídeos de DNA contíguos presentes na sequência nucleotídica contígua são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB).
[446] 29. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 27, em que pelo menos uma ligação internucleosídica entre um nucleosídeo modificado no açúcar 2’ e um nucleosídeo de DNA são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB).
[447] 30. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 27, em que mais do que uma ligação internucleosídica entre um nucleosídeo modificado no açúcar 2’ e um nucleosídeo de DNA são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB).
[448] 31. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 27, em que todas as ligações internucleosídicas entre um nucleosídeo modificado no açúcar 2’ e um nucleosídeo de DNA são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB).
[449] 32. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 27, em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas entre dois nucleosídeos modificados no açúcar 2’ não é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), tal como é uma ligação internucleosídica de fosforotioato.
[450] 33. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 27, em que todas as ligações internucleosídicas entre dois nucleosídeos modificados no açúcar 2’ não são uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), de modo que são ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[451] 34. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 33, em que uma ligação internucleosídica entre os 2 nucleosídeos mais a 3’ de uma sequência nucleotídica contígua é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula I, e em que uma ligação internucleosídica entre os 2 nucleosídeos mais a 5’ de uma sequência nucleotídica contígua é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula I.
[452] 35. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 34 que compreende ainda ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[453] 36. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 35 que compreende ainda ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido.
[454] 37. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 35, em que as ligações internucleosídicas remanescentes são independentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em ligações internucleosídicas de fosforoditioato, ligações internucleosídicas de fosforotioato, e ligações internucleosídicas de fosfodiéster.
[455] 38. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 36, em que as ligações internucleosídicas remanescentes são ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[456] 39. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 37, em que a referida sequência nucleotídica contígua é complementar, tal como 100% complementar, a um pré-RNA de mamífero, tal como um pré-mRNA humano.
[457] 40. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 38, em que o oligonucleotídeo antissenso modula o splicing de um pré-RNA de mamífero, tal como um pré- mRNA alvo humano, por exemplo, oligonucleotídeo antissenso que promove o salto no splicing ou a modulação do splicing.
[458] 41. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 39, em que o oligonucleotídeo antissenso é complementar, tal como 100% complementar a um sítio de splicing de íntron/éxon de um pré-mRNA humano, ou uma região de modulação de splicing de um pré-mRNA humano.
[459] 42. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 41, em que o oligonucleotídeo antissenso ou sequência nucleotídica contígua do mesmo é complementar, tal como totalmente complementar a uma sequência de pré-mRNA humano selecionada a partir do grupo que consiste em TNFR2, HBB, FKTN, LMNA, CEP290, CLCN1, USH1C, BTK, LRP8, CTLA4, BCL2L1, ERBB4, MDM4, STAT3, IL1RAP, TNFRSF1B, FLT1, KDR, SMN2, MYBPC3, TTN, DMD, NBN, IL10, HTT, APOB, MSTN, GYS2, e ATXN3.
[460] 43. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 42, em que o oligonucleotídeo antissenso consiste ou compreende de uma sequência nucleotídica contígua selecionada a partir do grupo que consiste em SSO#1 – SSO#25.
[461] 44. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 43, em que a célula é uma célula de mamífero.
[462] 45. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 44, em que o comprimento do oligonucleotídeo antissenso é de 10 – 30 nucleotídeos de comprimento.
[463] 46. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 44, em que o comprimento do oligonucleotídeo antissenso é de 12 – 24 nucleotídeos de comprimento.
[464] 47. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 46, em que o nucleosídeo 3’- terminal do oligonucleotídeo antissenso ou o oligonucleotídeo antissenso ou a sequência nucleotídica contígua do mesmo é um nucleosídeo de LNA ou um nucleosídeo 2-O-metoxietil.
[465] 48. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 47, em que o nucleosídeo 5’- terminal do oligonucleotídeo antissenso ou a sequência nucleotídica contígua do mesmo é um nucleosídeo de LNA ou um nucleosídeo 2-O-metoxietil.
[466] 49. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 48, em que o nucleosídeo 5’- terminal e o nucleosídeo 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso ou a sequência nucleotídica contígua do mesmo são nucleosídeos de LNA.
[467] 50. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 49, em que a sequência nucleotídica contígua compreende pelo menos uma região de dois ou três nucleotídeos LNA contíguos, e/ou pelo menos uma região de dois ou três nucleotídeos 2’-O-metoxietil contíguos.
[468] 51. Um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 50, em particular um sal de sódio ou potássio ou um sal de amônio.
[469] 52. Um conjugado compreendendo um oligonucleotídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 51 e pelo menos uma porção de conjugado covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo ou referido sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente por uma porção ligante.
[470] 53. Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 52 e um veículo terapeuticamente inerte.
[471] 54. Um oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 53 para uso como uma substância terapeuticamente ativa.
[472] 55. Um método para a modulação de um RNA alvo em uma célula que está expressando o referido RNA, cujo método compreende a etapa de administrar uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável, conjugado ou composição de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 54 para a célula.
[473] 56. Um método para a modulação do splicing de um pré- RNA alvo em uma célula que está expressando o referido pré-mRNA alvo, cujo método compreende a etapa de administrar uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável, conjugado ou composição de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 54 para a célula.
[474] 57. O método de acordo com os exemplos de realização 55 ou 56 em que o referido método é um método in vitro ou um método in vivo.
[475] 58. Uso de um oligonucleotídeo, sal farmacêutico, conjugado, ou composição de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 54, para inibição de um RNA em uma célula, tal como em uma célula de mamífero, em que o referido uso é in vitro ou in vivo.
ALGUNS EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO RELACIONADOS COM A PROTEÇÃO DA EXTREMIDADE 3’
[476] 1. Um oligonucleotídeo antissenso de fita simples compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB)
(IA) (IB) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3’ de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5’ de outro nucleosídeo adjacente (A2), e em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, tal como um cátion de metal alcalino, tal como um cátion Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, e em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo modificado no açúcar 2’, tal como um nucleosídeo de LNA ou um nucleosídeo 2’-O-MOE, e em que R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, em que A2 é o nucleosídeo 3’-terminal do oligonucleotídeo.
[477] 2. O antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 1, em que (A2) é um nucleosídeo de LNA, ou ambos, (A1) e (A2), são nucleosídeos de LNA.
[478] 3. O antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 1, em que (A2) é um nucleosídeo de LNA e (A1) é um nucleotídeo com açúcar modificado.
[479] 4. O antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 1, em que (A2) é um nucleosídeo de LNA e (A1) é nucleotídeo de DNA.
[480] 5. O antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 1, em que (A1) é um nucleosídeo de LNA e (A2) é um nucleotídeo com açúcar modificado.
[481] 6. O antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 1, em que (A1) é um nucleosídeo de LNA e (A2) é um nucleotídeo de DNA.
[482] 7. O antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 3 ou 5, em que o referido nucleosídeo modificado no açúcar é um nucleosídeo modificado no açúcar 2’.
[483] 8. O antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 7, em que o referido nucleosídeo com açúcar 2’- modificado é 2’-alcóxi-RNA, 2’-alcóxi-alcóxi-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-flúor-RNA, 2’-flúor-ANA ou um nucleosídeo de LNA.
[484] 9. O antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 7 ou 8, em que o referido nucleosídeo com açúcar 2’- modificado é um nucleosídeo 2’-O-metoxietil.
[485] 10. O antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 9, em que o nucleosídeo de LNA ou nucleotídeos estão na configuração beta-D.
[486] 11. O antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 10, em que os nucleosídeos de LNA são independentemente selecionados a partir de beta-D-oxi LNA, 6’-metil-beta- D- oxi LNA e ENA.
[487] 12. O antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização 1 a 11, em que o LNA é beta-D-oxi LNA.
[488] 13. O antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12, em que o antissenso de fita simples consiste ou compreende 7 – 30 nucleotídeos contíguos que são complementares ao ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico alvo selecionado a partir do grupo que consiste em um pré-mRNA, e mRNA, um microRNA, um RNA viral, e um RNA não codificante longo [referido como sequência nucleotídica contígua de um antissenso de fita simples].
[489] 14. O antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 13, em que a sequência nucleotídica contígua compreende uma região de gapmer de fórmula 5’-F-G-F’-3’, em que G é uma região de 5 a 18 nucleosídeos que é capaz de recrutar RNase-H, e a referida região G é flanqueada 5’ e 3’ por regiões flanqueadoras F e F’, respectivamente, em que as regiões F e F’ compreendem ou consistem independentemente de 1 a 7 nucleotídeos com açúcar 2’-modificado, em que o nucleosídeo de região F que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado e em que o nucleosídeo da região F’ que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado.
[490] 14. O antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 13, em que a sequência nucleotídica contígua é um oligonucleotídeo mixmer, em que o oligonucleotídeo mixmer compreende nucleosídeos de LNA e nucleosídeo de DNA, e opcionalmente nucleosídeos modificados no açúcar 2’ [tal como aqueles de acordo com os exemplos de realização 8 – 9], em que o antissenso de fita simples não compreende uma região de 4 ou mais nucleosídeos de DNA contíguos.
[491] 15. O antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 13, em que a sequência nucleotídica contígua compreende apenas nucleosídeos modificados no açúcar.
[492] 16. O oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 14 ou 15, em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo modulador do splicing [capaz de modular o splicing de um evento de splicing de pré-mRNA].
[493] 17. O oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 14 ou 15, em que o oligonucleotídeo é complementar a um microRNA, tal como um inibidor de microRNA.
[494] 18. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 17, que compreende ligações internucleosídicas adicionais independentemente selecionadas a partir de ligação internucleosídica de fosfodiéster, ligação internucleosídica de fosforotioato e ligações internucleosídicas de fosforoditioato; ou em que as ligações internucleosídicas adicionais dentro do oligonucleotídeo ou dentro da sequência nucleotídica contígua deste, são independentemente selecionadas a partir de ligação internucleosídica de fosforotioato e ligações internucleosídicas de fosforoditioato.
[495] 18. Um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 18, em que as ligações internucleosídicas adicionais do oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua do mesmo, são todas ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[496] 19. O oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 18, em que o oligonucleotídeo compreende uma posição 5’ de região 5’ para a sequência nucleotídica contígua, em que a região nucleosídica 5’ compreende pelo menos uma ligação fosfodiéster.
[497] 20. O oligonucleotídeo de acordo com o exemplo de realização 19, em que a região 5’ compreende 1 – 5 nucleosídeos de DNA ligados com fosfodiéster, e opcionalmente pode ligar o oligonucleotídeo ou sequência nucleotídica contígua do mesmo a uma porção de conjugado.
[498] 21. O oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 20, em que um ou mais nucleosídeos é um nucleosídeo de nucleobase modificada.
[499] 22. O oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 21, em que um ou mais nucleosídeos é 5-metil citosina, tal como uma 5-metil citosina LNA ou uma 5-metil citosina de DNA.
[500] 23. Um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 22, em particular um sal de sódio ou potássio ou sal de amônio.
[501] 24. Um conjugado compreendendo um oligonucleotídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 23 e pelo menos uma porção de conjugado covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo ou referido sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente por uma porção ligante.
[502] 25. Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 24 e um veículo terapeuticamente inerte.
[503] 26. Um oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 25 para uso como uma substância terapeuticamente ativa.
[504] 27. O oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 24 para uso na terapia, para a administração a um sujeito via administração parenteral, tal como, administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular ou intratecal.
EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO RELACIONADOS AOS OLIGONUCLEOTÍDEOS COM LIGAÇÕES DE FOSFORODITIOATO AQUIRAL E FOSFOROTIOATO ESTERODEFINIDO
[505] 1. Um oligonucleotídeo antissenso de fita simples compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA’) (IB’) em que um dos dois átomos de oxigênio está ligado ao átomo de carbono 3’ de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5’ de outro nucleosídeo adjacente (A2), e em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, tal como um cátion de metal alcalino, tal como um cátion Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio, e em que o oligonucleotídeo de fita simples compreende ainda pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido, (Sp, S) ou (Rp, R) em que N1 e N2 são nucleosídeos. (Nota: Em alguns exemplos de realização não limitantes N1 e/ou N2 são nucleotídeos de DNAs).
[506] 2. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 1, em que A2 é o nucleosídeo 3’-terminal do oligonucleotídeo.
[507] 3. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 1, em que A1 é o nucleosídeo 5’-terminal do oligonucleotídeo.
[508] 4. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, em que o referido oligonucleotídeo de fita simples compreende 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 ligações internucleosídicas de fórmula IB.
[509] 5. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 4, em que a ligação internucleosídica mais a 5’ do oligonucleotídeo antissenso, e a ligação internucleosídica mais a 3’ do oligonucleotídeo antissenso são ligações internucleosídicas de fórmula IB.
[510] 6. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 5, em que em pelo menos uma das ligações internucleosídicas de fórmula IB, pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo modificado no açúcar 2’, tal como um nucleosídeo modificado no açúcar 2’ selecionado a partir do grupo que consiste em 2’-alcóxi-RNA, 2’-alcóxi-alcóxi-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-flúor- RNA, 2’-flúor-ANA e um nucleosídeo de LNA.
[511] 7. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 6, em que em pelo menos uma das ligações internucleosídicas de fórmula IB, pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA.
[512] 8. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 6, em que em pelo menos uma das ligações internucleosídicas de fórmula IB, pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo 2’-O-MOE.
[513] 9. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 8, em que o nucleosídeo 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso é um nucleosídeo de LNA ou um nucleosídeo 2’-O-MOE.
[514] 10. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 9, em que o nucleosídeo 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso é um nucleosídeo de LNA ou um nucleosídeo 2’-O-MOE.
[515] 11. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 10, em que os dois nucleosídeos mais na extremidade 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
[516] 12. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 11, em que os dois nucleosídeos mais na extremidade 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
[517] 13. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12, em que os três nucleosídeos mais na extremidade 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
[518] 14. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 13, em que os três nucleosídeos mais na extremidade 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
[519] 15. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 14, em que os dois nucleosídeos mais na extremidade 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são nucleosídeos de LNA.
[520] 16. O oligonucleotídeo de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 15, em que os dois nucleosídeos mais na extremidade 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso são nucleosídeos de LNA.
[521] 17. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 16, em que o oligonucleotídeo antissenso compreende ainda uma região de 2 a 16 nucleotídeos de DNAs, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleotídeos de DNA são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido.
[522] 18. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 17, em que os nucleosídeos de LNA são independentemente selecionados a partir de beta-D- oxi LNA, 6’-metil-beta- D-oxi LNA e ENA.
[523] 19. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 17, em que os nucleosídeos de LNA são beta-D-oxi LNA.
[524] 20. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19, em que o oligonucleotídeo consiste ou compreende 7 – 30 nucleotídeos contíguos que são complementares to, tal como totalmente complementar ao ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico alvo selecionado a partir do grupo que consiste em um pré-mRNA, e mRNA, um microRNA, um RNA viral, e um RNA não codificante longo [o oligonucleotídeo antissenso].
[525] 21. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 20, em que o oligonucleotídeo de fita simples é capaz de modular o RNA alvo.
[526] 22. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 20, em que o oligonucleotídeo antissenso de fita simples é capaz de inibir o RNA alvo, tal como pelo recrutamento de RNase-H1.
[527] 23. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 22, em que a sequência nucleotídica contígua do oligonucleotídeo compreende uma região de gapmer de fórmula 5’-F-G-F’-3’, em que G é uma região de 5 a 18 nucleosídeos que é capaz de recrutar RNase-H1, e a referida região G é flanqueada 5’ e 3’ por regiões flanqueadoras F e F’, respectivamente, em que as regiões F e F’ compreendem ou consistem independentemente de 1 a 7 nucleotídeos com açúcar 2’-modificado, em que o nucleosídeo de região F que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado e em que o nucleosídeo da região F’ que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado.
[528] 24. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com os exemplos de realização de 23, em que as regiões F ou F’ compreendem uma ligação internucleosídica de fórmula IB, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19.
[529] 25. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 24, em que ambas as regiões F e F’ compreendem uma ligação internucleosídica de fórmula IB, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19.
[530] 26. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com os exemplos de realização de 23 a 25, em que todas as ligações internucleosídicas dentro das regiões F e/ou F’ são ligações internucleosídicas de fórmula IB, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a
19.
[531] 27. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com os exemplos de realização de 23 a 26, em que ambas as regiões F e F’ compreendem ou consistem de nucleosídeos de LNA.
[532] 28. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com os exemplos de realização de 23 a 27, em que ambas as regiões F e F’ compreendem ou consistem de nucleosídeos MOE.
[533] 29. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com os exemplos de realização de 23 a 28, em que as regiões F compreendem nucleosídeo(s) de LNA e F’ compreende ou consiste de nucleosídeos MOE.
[534] 30. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com os exemplos de realização de 23 a 29, em que a região G compreende ainda pelo menos uma ligação internucleosídica de fórmula IB posicionada entre o nucleosídeo mais a 3’ da região F e o nucleosídeo mais a 5’ da região G.
[535] 31. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com os exemplos de realização de 23 a 30, em que a região G compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato estereodefinido posicionada entre dois nucleosídeos de DNA.
[536] 32. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com os exemplos de realização de 23 a 31, em que a região G compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fórmula IB posicionada entre dois nucleosídeos de DNA.
[537] 33. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com os exemplos de realização de 23 a 32, em que a região G compreende ainda pelo menos 2, 3, ou 4 ligações internucleosídicas de fórmula IB.
[538] 34. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com os exemplos de realização de 23 a 31, em que todas as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas Rp e Sp.
[539] 35. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com os exemplos de realização de 23 a 31, em que todas as ligações internucleosídicas dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas Rp e Sp, opcionalmente diferentes de uma ligação internucleosídica entre o nucleosídeo mais a 3’ da região F e o nucleosídeo mais a 5’ da região G.
[540] 36. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 22, em que o oligonucleotídeo antissenso compreende menos do que 4 nucleotídeos de DNA contíguos.
[541] 37. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 22 ou 36, em que o oligonucleotídeo antissenso é um oligonucleotídeo mixmer ou totalmer.
[542] 38. O oligonucleotídeo de fita simples de acordo com o exemplo de realização 37 em que o oligonucleotídeo mixmer compreende nucleosídeos de LNA e nucleosídeos de DNA, e opcionalmente nucleosídeos modificados no açúcar 2’ (por exemplo, consulte a lista no exemplo de realização 6), como nucleosídeo(s) 2’-O-MOE.
[543] 39. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 38 em que o oligonucleotídeo antissenso compreende uma região de 3 ou mais nucleosídeos MOE contíguos, e opcionalmente em que todos os nucleosídeos do oligonucleotídeo são nucleosídeos 2’ MOE.
[544] 40. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 39, em que o alvo é um mRNA ou um pré-mRNA alvo.
[545] 41. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 40, em que os oligonucleotídeos alvos são um sítio de splicing de pré-mRNA ou uma região do pré-mRNA que regula o evento de splicing em um sítio de splicing de pré- mRNA.
[546] 42. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 41, que é um oligonucleotídeo modulador do splicing capaz de modular o splicing de um pré-
mRNA alvo.
[547] 43. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 42, em que o alvo é um microRNA.
[548] 44. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 42, em que o oligonucleotídeo antissenso é de 10 a 20 nucleotídeos de comprimento, tal como 12 a 24 nucleotídeos de comprimento.
[549] 45. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 43, em que o comprimento do oligonucleotídeo antissenso é de 7 a 30, tal como de 8 a 12 ou de 12 a 23 nucleotídeos de comprimento.
[550] 46. Um oligonucleotídeo antissenso de fita simples compreendendo o oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 45, em que o oligonucleotídeo compreende ainda uma posição 5’ de região 5’ para a sequência nucleotídica contígua, em que a região nucleosídica 5’ compreende pelo menos uma ligação fosfodiéster.
[551] 47. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com o exemplo de realização 46, em que a região 5’ compreende de 1 a 5 nucleosídeos de DNA ligados com fosfodiéster, e opcionalmente pode ligar o oligonucleotídeo ou sequência nucleotídica contígua do mesmo a uma porção de conjugado.
[552] 48. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 47, em que um ou mais nucleosídeos é um nucleosídeo de nucleobase modificada.
[553] 49. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 48, em que um ou mais nucleosídeos é 5-metil citosina, tal como uma 5-metil citosina LNA ou uma
5-metil citosina de DNA.
[554] 50. Um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo antissenso de fita simples de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 49, em particular um sal de sódio ou potássio ou sal de amônio.
[555] 51. Um conjugado compreendendo um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, ou um sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 49 e pelo menos uma porção de conjugado covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo ou referido sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente por uma porção ligante.
[556] 52. Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 51 e um veículo terapeuticamente inerte.
[557] 53. Um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 52 para uso como uma substância terapeuticamente ativa.
[558] 54. O oligonucleotídeo antissenso de fita simples, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 53 para uso na terapia, para a administração a um sujeito via administração parenteral, tal como, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular ou intratecal.
[559] 55. O uso in vitro de um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, sal, ou composição de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores para uso na inibição de um RNA alvo em uma célula, em que o oligonucleotídeo antissenso de fita simples é complementar, tal como totalmente complementar, ao RNA alvo.
[560] 56. Um método in vivo ou in vitro para a inibição de um RNA alvo em uma célula que está expressando o referido RNA alvo, cujo método compreende a administração de uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo antissenso, sal, conjugado ou composição de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores para a célula, de modo a inibir o RNA alvo.
[561] 57. O uso in vitro ou in vivo de um oligonucleotídeo antissenso de fita simples, sal, ou composição de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores para uso na modulação do splicing de um pré-mRNA alvo em uma célula.
[562] 58. Um método in vivo ou in vitro para modular o splicing de um pré-RNA alvo em uma célula que expressa o referido pré-RNA alvo, cujo método compreende a administração de uma quantidade eficaz do oligonucleotídeo antissenso, sal, conjugado ou composição de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores para a célula, de modo a modular o splicing do RNA alvo.
OLIGONUCLEOTÍDEOS ANTISSENSO DA INVENÇÃO QUE VISAM A HTRA-1
[563] Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo antissenso da invenção é complementar ao mRNA ou pré-mRNA que codifica a Serina Peptidase A1 de Requerimento de Alta Temperatura A (Htra1) humana – consulte, por exemplo, o documento WO 2018/002105. A inibição da expressão de Htra1 usando os oligonucleotídeos antissenso da invenção que visam o mRNa ou o pré-RNA de Htra1 são benéficos para o tratamento de uma variedade de distúrbios médicos, como a degeneração macular, por exemplo, degeneração macular relacionada à idade (atrofia geográfica). As seguintes sequências alvo de pré-mRNA e mRNA da Htra1 humana estão disponíveis:
Nº de acesso da Coordenadas Genômicas Espécie Cr. Fita Montagem seq. de referência Início Fim NCBI* para mRNA direto GRCh38.p2 Humano 10 122461525 122514908 NM_002775.4 (fwd) release 107
[564] Os compostos da invenção que visam Htra-1 estão listados como Htra1#1 – 38 nos exemplos.
[565] 1. Um oligonucleotídeo antissenso da invenção que tem de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em que o referido oligonucleotídeo antissenso visa o mRNA ou pré-mRNA da HTRA1 humana, em que o referido oligonucleotídeo antissenso compreende uma região contígua de nucleotídeos de 10 – 22 nucleotídeos que são pelo menos 90%, tal como 100% complementares à SEQ ID NO 1 ou 2 do documento WO 2018/002105, que estão descritos na listagem de sequências como SEQ ID NO 9 e 10, em que o referido oligonucleotídeo antissenso compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula IA ou fórmula IB.
[566] 2. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com o exemplo de realização 1 ou 2, em que a região de nucleotídeo contígua é idêntica a uma sequência presente em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18: SEQ ID NO 11: CAAATATTTACCTGGTTG SEQ ID NO 12: TTTACCTGGTTGTTGG SEQ ID NO 13: CCAAATATTTACCTGGTT SEQ ID NO 14: CCAAATATTTACCTGGTTGT SEQ ID NO 15: ATATTTACCTGGTTGTTG SEQ ID NO 16: TATTTACCTGGTTGTT SEQ ID NO 17: ATATTTACCTGGTTGT SEQ ID NO 18: ATATTTACCTGGTTGTT.
[567] 3. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, em que a região de nucleotídeo contígua compreende a sequência SEQ ID NO 19: TTTACCTGGTT.
[568] 4. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 4, em que a região de nucleotídeo contígua do oligonucleotídeo consiste ou compreende uma sequência selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID NOs 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18.
[569] 5. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 5 em que a região de nucleotídeo contígua do oligonucleotídeo compreende um ou mais nucleosídeos modificados no açúcar 2’ tal como um ou mais nucleosídeos modificados no açúcar 2’ independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em 2’-O-alquil-RNA, 2’-O-metil-RNA, 2’-alcóxi-RNA, 2’-O- metoxietil-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-flúor-DNA, ácido arabinonucleico (ANA), 2’- flúor-ANA e nucleosídeos de LNA.
[570] 6. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 5, em que a região de nucleotídeo contígua do oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação internucleosídica modificada, tal como uma ou mais ligações internucleosídicas de fosforotioato, ou tal como todas as ligações internucleosídicas dentro da região de nucleotídeo contígua são ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[571] 7. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 6, em que o oligonucleotídeo ou sequência nucleotídica contígua do mesmo é ou compreende um gapmer tal como um gapmer de fórmula 5’-F-G-F’-3’, em que as regiões F e F’ compreendem independentemente 1 - 7 nucleosídeos modificados no açúcar e G é uma região 6 - 16 nucleosídeos que é capaz de recrutar RNase-H, em que os nucleosídeos de regiões F e F’ que são adjacentes a região G são nucleosídeos modificados no açúcar.
[572] 8. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com o exemplo de realização 7, em que pelo menos uma ou ambas as regiões F e F’ compreendem (cada uma) pelo menos um nucleosídeo LNA.
[573] 9. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 8, selecionado a partir de: Htra1#1 – 38, em que uma letra maiúscula representa unidade de nucleosídeo beta-D-oxi LNA, uma letra minúscula representa uma unidade de nucleosídeo de DNA, sublinhado representa uma ligação internucleosídica de fosforotioato, em que todas as citosinas de LNA são 5-metil citosina, P representa uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula IB, S representa uma ligação Sp internucleosídica de fosforotioato estereodefinido, R representa uma ligação Rp internucleosídica de fosforotioato estereodefinido, e X representa uma ligação de fosforotioato estereoaleatória.
[574] 10. O oligonucleotídeo antissenso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores na forma de um sal, tal como um sal de sódio, um sal de potássio ou um sal de amônio (por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável).
[575] 11. Um conjugado compreendendo o oligonucleotídeo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 10, e pelo menos uma porção de conjugado covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo, ou sal do mesmo.
[576] 12. Uma composição farmacêutica compreendendo o oligonucleotídeo do exemplo de realização 1 – 10 ou o conjugado do exemplo de realização 11 e um diluente, solvente, veículo, sal e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.
[577] 13. Um método in vivo ou in vitro para modular a expressão de HTRA1 em uma célula alvo que está expressando HTRA1, cujo método compreende administrar um oligonucleotídeo de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 10 ou o conjugado de acordo com o exemplo de realização 11 ou a composição farmacêutica do exemplo de realização 12 em uma quantidade eficaz para a referida célula.
[578] 14. Um método para tratar ou prevenir uma doneça compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um oligonucleotídeo de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 10 ou o conjugado de acordo com o exemplo de realização 11 ou a composição farmacêutica do exemplo de realização 12 para um sujeito que sofre da doença ou é suscetível a ela.
[579] 15. O oligonucleotídeo de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 10 ou o conjugado de acordo com o exemplo de realização 11 ou a composição farmacêutica do exemplo de realização 12 para uso na medicina.
[580] 16. O oligonucleotídeo de qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 10 ou o conjugado de acordo com o exemplo de realização 11 ou a composição farmacêutica do exemplo de realização 12 para uso no tratamento ou prevenção de uma doneça é selecionado a partir do grupo que consiste em degeneração macular (tal como AMD úmida, AMD seca, atrofia geográfica, AMD seca intermediária, retinopatia diabética), doença de Parkinson, doença de Alzheimer, distrofia muscular de Duchenne, artrite, tal como osteoartrite, e doença isquêmica cerebral familiar dos pequenos vasos sanguíneos.
[581] 17. Uso do oligonucleotídeo do exemplo de realização 1 – 10 ou do conjugado de acordo com o exemplo de realização 11 ou da composição farmacêutica do exemplo de realização 12, para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doneça selecionada a partir do grupo que consiste em degeneração macular (tal como AMD úmida, AMD seca, atrofia geográfica, AMD seca intermediária, retinopatia diabética), doença de Parkinson, doença de Alzhiemer, distrofia muscular de Duchenne, artrite, tal como osteoartrite, e doença isquêmica cerebral familiar dos pequenos vasos sanguíneos.
[582] 18. O oligonucleotídeo, conjugado, sal ou composição ou o uso de acordo com qualquer um dos exemplos de realização anteriores, para uso no tratamento de atrofia geográfica.
EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO ADICIONAIS DA INVENÇÃO
[583] Portanto, a invenção refere-se especificamente a: Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso capaz de modular a expressão de um RNA alvo em uma célula que expressa o referido RNA alvo; Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso capaz de inibir a expressão de um RNA alvo em uma célula que expressa o referido RNA alvo; Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e o outro é um nucleosídeo de DNA, um nucleosídeo de RNA ou um nucleosídeo modificado no açúcar; Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e o outro é um nucleosídeo de DNA ou um nucleosídeo modificado no açúcar; Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e o outro é um nucleosídeo de DNA; Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo de LNA e o outro é um nucleosídeo modificado no açúcar; Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que o referido nucleosídeo modificado no açúcar é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que o referido nucleosídeo com açúcar 2’-modificado é 2’-alcóxi-RNA, 2’-alcóxi-alcóxi-RNA,
2’-amino-DNA, 2’-flúor-RNA, 2’-flúor-ANA ou um nucleosídeo de LNA;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que o referido nucleosídeo com açúcar 2’-modificado é um nucleosídeo de LNA;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que os nucleosídeos de LNA são independentemente selecionados a partir de beta-D-
oxi LNA, 6’-metil-beta- D-oxi LNA e ENA;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que ambos os nucleosídeos de LNA são beta-D-oxi LNA;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que o referido nucleosídeo com açúcar 2’-modificado é 2’-alcóxi-alcóxi-RNA;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que 2’-alcóxi-
RNA é 2’-metoxi-RNA;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que 2’-alcóxi-
alcóxi-RNA é 2’-metoxietoxi-RNA;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção compreendendo entre 1 e 15, em particular entre 1 e 5, mais particularmente 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção compreendendo ligações internucleosídicas adicionais independentemente selecionadas a partir de ligação internucleosídica de fosfodiéster, ligação internucleosídica de fosforotioato e ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I)
conforme definido acima; Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas adicionais são independentemente selecionadas a partir de ligação internucleosídica de fosforotioato e ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas adicionais são todas ligações internucleosídicas de fosforotioato;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas adicionais são todas ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que o oligonucleotídeo é um gapmer, em particular um gapmer de LNA, um gapmer de asa mista, um gapmer de flanco alternado, um oligômero alterador do splicing, um mixmer ou um totalmer;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção que é um gapmer e em que a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) está compreendida em uma região gap e/ou em uma ou mais regiões flanqueadoras do gapmer;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção, em que a sequência nucleotídica contígua, tal como a região F-G-F’ do gapmer, é flanqueada pela região flanqueadora D’ ou D’’ ou D’ e D’’, compreendendo um ou mais nucleosídeos de DNA conectados ao resto do oligonucleotídeo através de ligações internucleosídicas de fosfodiéster;
Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção que é um gapmer em que uma ou ambas, particularmente uma, das regiões flanqueadoras F e F’,
são adicionalmente flanqueadas por nucleosídeos de DNA ligados com fosfodiéster, em particular 1 a 5 nucleosídeos de DNA ligados com fosfodiéster
(região D’ e D’’); e Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que o oligonucleotídeo tem de 7 a 30 nucleotídeos de comprimento.
[584] Quando o oligonucleotídeo da invenção é um gapmer, ele é vantajosamente de 12 a 26 nucleotídeos de comprimento. 16 nucleotídeos é um comprimento de oligonucleotídeo gapmer particularmente vantajoso.
[585] Quando o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo completamente de LNA, ele é vantajosamente de 7 a 10 nucleotídeos de comprimento.
[586] Quando o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo mixmer, ele é vantajosamente de 8 a 30 nucleotídeos de comprimento.
[587] A invenção diz respeito em particular a: Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que um ou mais nucleosídeos é um nucleosídeo de nucleobase modificada; Um oligonucleotídeo de acordo com a invenção em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso, um siRNA, um microRNA mimético ou uma ribozima; Um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção, em particular um sal de sódio ou potássio; Um conjugado compreendendo um oligonucleotídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a invenção e pelo menos uma porção de conjugado covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo ou referido sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente por uma porção ligante; Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com a invenção e um veículo terapeuticamente inerte; Um oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com a invenção para uso como uma substância terapeuticamente ativa; e O uso de um oligonucleotídeo, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com a invenção como um medicamento.
[588] Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo da invenção tem uma atividade mais alta na modulação do seu ácido nucleico alvo, em comparação com o oligonucleotídeo correspondente totalmente ligado por fosforotioato. Em alguns exemplos de realização, a invenção fornece oligonucleotídeos com atividade aprimorada, potência aprimorada, atividade específica aprimorada ou captação celular aprimorada. Em alguns exemplos de realização, a invenção fornece oligonucleotídeos que têm uma duração de ação in vitro ou in vivo alterada, tal como uma duração de ação in vitro ou in vivo prolongada. Em alguns exemplos de realização, a atividade mais alta na modulação do ácido nucleico alvo é determinada in vitro ou in vivo em uma célula que está expressando o ácido nucleico alvo.
[589] Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo da invenção possui propriedades farmacológicas alteradas, como toxicidade reduzida, por exemplo, nefrotoxicidade reduzida, hepatotoxicidade reduzida ou imunoestimulação reduzida. A hepatotoxicidade pode ser determinada, por exemplo, in vivo, ou usando os ensaios in vitro divulgados no documento WO 2017/067970, incorporado ao presente como referência. A nefrotoxicidade pode ser determinada, por exemplo, in vitro, ou usando os ensaios divulgados na publicação PCT/EP2017/064770, incorporada ao presente como referência.
Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo da invenção compreende um dinucleotídeo 5’ CG 3’, tal como um dinucleotídeo DNA 5’ CG 3', em que a ligação internucleosídica entre C e G é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima.
[590] Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo da invenção melhorou a resistência à nuclease, como melhor bioestabilidade no soro sanguíneo. Em alguns exemplos de realização, o nucleosídeo terminal 3’ do oligonucleotídeo da invenção tem uma base A ou G, tal como um nucleosídeo LNA-A ou LNA-G 3' terminal. Adequadamente, a ligação internucleosídica entre os dois nucleosídeos mais a 3’ do oligonucleotídeo pode ser uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de acordo com a fórmula (I) como definido acima.
[591] Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo da invenção aumentou a biodisponibilidade. Em alguns exemplos de realização, o oligonucleotídeo da invenção tem uma maior exposição sanguínea, tal como um tempo de retenção no sangue mais longo.
[592] A modificação de fosforoditioato sem ligação (ponte) é introduzida nos oligonucleotídeos por meio de síntese em fase sólida usando o método de fosforamidita. As sínteses são realizadas usando vidro de poro controlado (CPG) equipado com um ligante universal como suporte. Em tal suporte sólido, um oligonucleotídeo é tipicamente construído na direção de 3’ a 5' por meio de ciclos sequenciais que consistem no acoplamento de blocos de construção fosforamidita de nucleosídeo protegido com 5'O-DMT, seguido por (tio)oxidação, capeamento (capping) e desproteção do grupo DMT. A introdução de fosforoditioatos sem ponte é conseguida usando blocos de construção de tiofosforamidita apropriados, seguidos da tio-oxidação do intermediário primário.
[593] Embora as tiofosforamiditas de DNA correspondentes estejam comercialmente disponíveis, os respectivos blocos de construção de LNA não foram descritos anteriormente. Eles podem ser preparados a partir dos nucleosídeos de alcoóis-3' protegidos com 5'-O-DMT, por exemplo, pela reação com etanoditiol protegido com mono-benzoíla e tripirrolidin-1-ilfosfano.
[594] O oligonucleotídeo de acordo com a invenção pode, por exemplo, ser fabricado de acordo com Esquema 2, em que R 1, R2a, R2b, R4a, R4b, R5, Rx, Ry e V são conforme definido abaixo.
ESQUEMA 2
[595] A invenção também diz respeito a um processo para a fabricação de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção compreendendo as seguintes etapas: (a) Acoplamento de um nucleosídeo tiofosforamidita ao átomo de oxigênio 5’ terminal de um nucleotídeo ou oligonucleotídeo para produzir um intermediário triéster de tiofosfito; (b) Tio-oxidação do intermediário triéster de tiofosfito obtido na etapa (a); e (c) Opcionalmente alongando mais o oligonucleotídeo.
[596] A invenção diz respeito em particular a um processo para a fabricação de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção compreendendo as seguintes etapas: (a1) Acoplamento de um composto de fórmula (A) (A)
ao átomo de oxigênio 5’ de um nucleotídeo ou oligonucleotídeo de fórmula (B) (B); (b1) Tio-oxidação do intermediário triéster de tiofosfito obtido na etapa (a1); e (c1) Opcionalmente alongando mais o oligonucleotídeo; em que: R2a e R4a juntos formam -X-Y- conforme definido acima; ou R4a é hidrogênio e R2a é selecionado a partir de alcóxi, em particular metoxi, halogênio, em particular flúor, alcóxi-alcóxi, em particular metoxietoxi, alqueniloxi, em particular aliloxi e aminoalcóxi, em particular aminoetiloxi; R2b e R4b juntos formam -X-Y- conforme definido acima; ou ambos, R2b e R4b, são hidrogênio ao mesmo tempo; ou R4b é hidrogênio e R2b é selecionado a partir de alcóxi, em particular metoxi, halogênio, em particular flúor, alcóxi-alcóxi, em particular metoxietoxi, alqueniloxi, em particular aliloxi e aminoalcóxi, em particular aminoetiloxi; V é oxigênio ou enxofre e em que R5, Rx, Ry e Nu são conforme definido abaixo.
[597] A invenção diz respeito em particular a um processo para a fabricação de um oligonucleotídeo de acordo com a invenção compreendendo as seguintes etapas:
(a2) Acoplamento de um composto de fórmula (II)
O (A1) ao átomo de oxigênio 5’ de um nucleotídeo ou oligonucleotídeo de fórmula (IV) (B1); (b2) Tio-oxidação do intermediário triéster de tiofosfito obtido na etapa (a2); e (c2) Opcionalmente alongando mais o oligonucleotídeo; em que: R2b e R4b juntos formam -X-Y- conforme definido acima; ou R2b e R4b são, ambos, hidrogênio ao mesmo tempo; ou R4b é hidrogênio e R2b é selecionado a partir de alcóxi, em particular metoxi, halogênio, em particular flúor, alcóxi-alcóxi, em particular metoxietoxi, alqueniloxi, em particular aliloxi e aminoalcóxi, em particular aminoetiloxi; e em que R5, Rx, Ry e Nu são conforme definido abaixo.
[598] A invenção também diz respeito a um oligonucleotídeo fabricado de acordo com um processo da invenção.
[599] A invenção diz respeito ainda a:
Um oligonucleotídeo gapmer compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I)
(I) em que R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato;
Um oligonucleotídeo gapmer conforme definido acima em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso capaz de modular a expressão de um RNA alvo em uma célula que expressa o referido RNA alvo;
Um oligonucleotídeo gapmer conforme definido acima em que o oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo antissenso capaz de inibir a expressão de um RNA alvo em uma célula que expressa o referido RNA alvo;
Um oligonucleotídeo gapmer conforme definido acima capaz de recrutar RNase-H, tal como RNase-H1 humana;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que um dos dois átomos de oxigênio da referida pelo menos uma ligação internucleosídica de fórmula (I) está ligado ao átomo de carbono 3’ de um nucleosídeo adjacente (A1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5’ de outro nucleosídeo (A2), em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e
(A2) é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que um dentre (A1) e (A2) é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado e o outro é um nucleosídeo de DNA;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que ambos (A1) e (A2) são ao mesmo tempo nucleosídeos 2’-modificados;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que ambos (A1) e (A2) são ao mesmo nucleosídeos de DNA;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que o oligonucleotídeo gapmer compreende uma sequência nucleotídica contígua de fórmula 5’-F-G-F’-3’, em que G é uma região de 5 a 18 nucleosídeos que é capaz de recrutar RNase-H, e a referida região G é flanqueada 5’ e 3’ por regiões flanqueadoras F e F’, respectivamente, em que as regiões F e F’
compreendem ou consistem independentemente de 1 a 7 nucleotídeos com açúcar 2’-modificado, em que o nucleosídeo de região F que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado e em que o nucleosídeo da região F’ que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-
modificado;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que os nucleosídeos açúcar 2’-modificados são independentemente selecionados a partir de 2’-alcóxi-RNA, 2’-alcóxi-alcóxi-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-flúor-RNA, 2’-
flúor-ANA e nucleosídeos de LNA;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que
2’-alcóxi-alcóxi-RNA é um 2’-metoxietoxi-RNA (2’-O-MOE);
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que região F e região F’ compreendem ou consistem de nucleotídeos 2’-
metoxietoxi-RNA;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção, em que ambas as regiões F e F’ consistem em nucleotídeos 2’-metoxietoxi-RNA, tal como um gapmer compreendendo o F-G-F’ de fórmula [MOE]3-8[DNA]8-
16[MOE]3-8, por exemplo, [MOE]5[DNA]10[MOE]5 – ou seja, onde as regiões F e
F’ consistem em cinco nucleotídeos 2’-metoxietoxi-RNA cada, e região G consiste de 10 nucleotídeos de DNA;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que pelo menos um ou todos os nucleosídeos açúcar 2’-modificados na região F ou região F’, ou em ambas as regiões F e F’, são nucleosídeos de LNA;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que região F ou região F’, ou ambas as regiões F e F’, compreendem pelo menos um nucleosídeo de LNA e pelo menos um nucleosídeo de DNA;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que região F ou região F’, ou ambas as regiões F e F’ compreendem pelo menos um nucleosídeo de LNA e pelo menos um nucleosídeo não LNA com açúcar 2’-
modificado, tal como pelo menos um nucleosídeo 2’-metoxietoxi-RNA;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que a região gap compreende de 5 a 16, em particular de 8 a 16, mais particularmente 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 nucleosídeos de DNA contíguos;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que região F e região F’ são independentemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 nucleosídeos de comprimento;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que cada região F e F’ compreende independentemente 1, 2, 3 ou 4 nucleosídeos de LNA;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que os nucleosídeos de LNA são independentemente selecionados a partir de beta-
D-oxi LNA, 6’-metil-beta-D-oxi LNA e ENA;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que os nucleosídeos de LNA são beta-D-oxi LNA;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que o oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua do mesmo (F-G-F’), é de
10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em particular 12 a 22, mais particularmente de 14 a 20 oligonucleotídeos de comprimento;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que o oligonucleotídeo gapmer compreende uma sequência nucleotídica contígua de fórmula 5’-D’-F-G-F’-D’’-3’, em que F, G e F’ são conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 4 a 17 e em que a cada região D’ e D’’
consiste independentemente de 0 a 5 nucleotídeos, em particular 2, 3 ou 4 nucleotídeos, particularmente nucleotídeos de DNA tal como nucleosídeos de
DNA ligados com fosfodiéster;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que o oligonucleotídeo gapmer é capaz de recrutar a RNase-H1 humana;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que a referida pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula
(I) definida acima é posicionada entre os nucleosídeos adjacentes na região F ou região F’, entre a região F e a região G ou entre a região G e a região F’;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção que compreende ainda ligações internucleosídicas de fosforotioato;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I)
conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreendem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas remanescentes são independentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em fosforotioato, fosfodiéster e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima; Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos de região F e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região F’ são independentemente selecionadas a partir de fosforotioato e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que cada região flanqueadora, F e F’, compreende independentemente 1, 2, 3, 4, 5,
6 ou 7 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que as regiões flanqueadoras F e F’ juntas ou individualmente compreendem 1, 2,
3, 4, 5 ou 6 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I)
conforme definido acima, ou todas as ligações internucleosídicas na região F e/ou região F’ são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I)
conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que as regiões flanqueadoras F e F’ compreendem juntas 1, 2, 3 ou 4 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que cada região flanqueadora F e F’ comprendem 2 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que todas as ligações internucleosídicas de regiões flanqueadoras F e/ou F’ são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que o oligonucleotídeo gapmer compreende pelo menos uma ligação internucleosídica estereodefinida, tal como pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que a região gap compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que todas as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região gap são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I)
definida acima é posicionada entre os nucleosídeos da região F, ou entre os nucleosídeos da região F’, ou entre a região F e a região G, ou entre a região G e a região F’, e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região
F e F’, entre a região F e a região G e entre a região G e a região F’, são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, ligações internucleosídicas estereoaleatórias,
ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) e ligações internucleosídicas de fosfodiéster;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I)
definida acima é posicionada entre pelo menos dois nucleosídeos adjacentes da região F, ou entre os dois nucleosídeos adjacentes da região F’, ou entre a região F e a região G, ou entre a região G e a região F’, e as ligações internucleosídicas remanescentes entre os nucleotídeos de região F e F’ são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato, ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) e ligações internucleosídicas de fosfodiéster.
As ligações internucleosídicas de fosforotioato de região F e F’ podem ser estereoaleatórias ou estereodefinidas,
ou podem ser independentemente selecionadas a partir de estereoaleatória e estereodefinida;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I)
definida acima é posicionada entre pelo menos dois nucleosídeos adjacentes da região F, ou entre pelo menos dois nucleosídeos adjacentes da região F’, ou entre a região F e a região G, ou entre a região G e a região F’, e as ligações internucleosídicas remanescentes entre os nucleotídeos de região F e F’ são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato, e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I). As ligações internucleosídicas de fosforotioato de região F e F’ podem ser estereoaleatórias ou estereodefinidas, ou podem ser independentemente selecionadas a partir de estereoaleatória e estereodefinida;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I)
definida acima é posicionada entre pelo menos dois nucleosídeos adjacentes da região F, ou entre pelo menos dois nucleosídeos adjacentes da região F’, ou entre a região F e a região G, ou entre a região G e a região F’, e as ligações internucleosídicas remanescentes entre os nucleotídeos de região F e F’, entre a região F e a região G e entre a região G e a região F’, são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato e ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I); As ligações internucleosídicas de fosforotioato de região F e F’ podem ser estereoaleatórias ou estereodefinidas, ou podem ser independentemente selecionadas a partir de estereoaleatória e estereodefinida;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I)
definida acima é posicionada entre pelo menos dois nucleosídeos adjacentes da região F, ou entre pelo menos dois nucleosídeos adjacentes da região F’, ou entre a região F e a região G, ou entre a região G e a região F’, e as ligações internucleosídicas remanescentes entre os nucleotídeos de região F e F’ e entre a região F e a região G e entre a região G e a região F’, são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido e ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I);
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I)
definida acima é posicionada entre pelo menos dois nucleosídeos adjacentes da região F, ou entre pelo menos dois nucleosídeos adjacentes da região F’, ou entre a região F e a região G, ou entre a região G e a região F’, e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região F e F’, entre a região F e a região G e entre a região G e a região F’, são ligações internucleosídicas de fosforotioato, em que todas podem ser ligações internucleosídicas estereoaleatórias de fosforotioato, todas as ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, ou podem ser independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato estereoaleatório e estereodefinido;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região F, dentro da região F’ ou dentro de ambas as regiões, F e F’, são todas ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreendem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido e ligações internucleosídicas estereoaleatórias de fosforotioato;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreendem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima e pelo menos uma das ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G, ou todas as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreendem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato, tal como ligações internucleosídicas estereoaleatórias de fosforotioato;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que pelo menos uma região F ou F’ compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima e todas as ligações internucleosídicas dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato, tal como ligações internucleosídicas estereoaleatórias de fosforotioato;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que pelo menos uma região F ou F’ compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima e todas as ligações internucleosídicas dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato, em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas de fosforotioato dentro da região G é uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido; Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que pelo menos uma região F ou F’ compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima e todas as ligações internucleosídicas dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que uma ligação internucleosídica entre as regiões F e G, ou uma ligação internucleosídica entre as regiões G e F’, ou ambas as ligações internucleosídicas entre as regiões F e G e entre as regiões G e F’, são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, e em que, no caso em que apenas uma das ligações internucleosídicas entre as regiões F e G e entre as regiões G e F’ é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, a outra ligação internucleosídica entre as regiões F e G ou entre as regiões G e
F’ é uma ligação internucleosídica de fosforotioato;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que pelo menos uma região F ou F’ compreende a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, em que uma ligação internucleosídica entre as regiões F e G, ou uma ligação internucleosídica entre as regiões G e F’, ou ambas as ligações internucleosídicas entre as regiões F e G e entre as regiões G e F’, são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima e em que no caso em que apenas uma das ligações internucleosídicas entre as regiões F e G e entre as regiões G e F’ é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, a outra ligação internucleosídica entre as regiões F e G ou entre as regiões G e
F’ é uma ligação internucleosídica de fosforotioato;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreendem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato, em que uma ligação internucleosídica entre as regiões F e G, ou uma ligação internucleosídica entre as regiões G e F’, ou ambas as ligações internucleosídicas entre as regiões F e G e entre as regiões G e F’, são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima e em que no caso em que apenas uma das ligações internucleosídicas entre as regiões F e G e entre as regiões G e F’ é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, a outra ligação internucleosídica entre as regiões F e G ou entre as regiões G e
F’ é uma ligação internucleosídica de fosforotioato;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que pelo menos uma região F ou F’ compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreendem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato, em que uma ligação internucleosídica entre as regiões F e G, ou uma ligação internucleosídica entre as regiões G e F’, ou ambas as ligações internucleosídicas entre as regiões F e G e entre as regiões G e F’, são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, e em que, no caso em que apenas uma das ligações internucleosídicas entre as regiões F e G e entre as regiões G e F’ é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, a outra ligação internucleosídica entre as regiões F e G ou entre as regiões G e F’ é uma ligação internucleosídica de fosforotioato;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que região F ou região F’ compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, ou em que uma ligação internucleosídica entre região F e região G, ou entre a região G e a região F’
compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, a região G compreende 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que região F ou região F’ compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, ou em que uma ligação internucleosídica entre região F e região G, ou entre a região G e a região F’
compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, todas as ligações internucleosídicas dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato e em que pelo menos uma das ligações internucleosídicas de fosforotioato dentro da região G é uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido;
Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que região F ou região F’ compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, ou em que uma ligação internucleosídica entre região F e região G, ou entre a região G e a região F’
compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, todas as ligações internucleosídicas dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato e em que todas as ligações internucleosídicas de fosforotioato dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido; Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que exceto as ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima, todas as ligações internucleosídicas remanescentes na região F-G-F’ do gapmer são ligações internucleosídicas de fosforotioato; Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que pelo menos uma região F ou F’ compreende pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido acima e todas as ligações internucleosídicas dentro da região G são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido; Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção em que exceto as ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) todas as ligações internucleosídicas remanescentes na região F-G-F’ do gapmer são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido; Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção que é uma gapmer de LNA, um gapmer de asa mista, um gapmer de flanco alternado ou um gapmer gap-breaker.
Um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção, em particular um sal de sódio ou potássio; Um conjugado compreendendo um oligonucleotídeo gapmer ou um sal farmaceuticamente aceitável de acordo com a invenção e pelo menos uma porção de conjugado covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo ou referido sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente por uma porção ligante, em particular via um ligante bioclivável, particularmente via 2 a 4 nucleosídeos de DNA ligados com fosfodiéster (por exemplo, região D’ ou D’’); Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo gapmer, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com a invenção e um veículo terapeuticamente inerte; Um oligonucleotídeo gapmer, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com a invenção para uso como uma substância terapeuticamente ativa;
O uso de um oligonucleotídeo gapmer, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado como um medicamento; Um método para modular a expressão de um RNA alvo em uma célula compreendendo administrar um oligonucleotídeo ou oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção para uma célula que expressa o referido RNA alvo de modo a modular a expressão do referido RNA alvo; Um método para inibir a expressão de RNA alvo em uma célula compreendendo administrar um oligonucleotídeo ou oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção para uma célula que expressa o referido RNA alvo de modo a inibir a expressão do referido RNA alvo; e Um método in vitro de modular ou inibir um RNA alvo em uma célula compreendendo administrar um oligonucleotídeo ou oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção para uma célula que expressa o referido RNA alvo, de modo a modular uo inibir o referido RNA alvo na referida célula.
[600] O RNA alvo pode, por exemplo, ser um mRNA de mamífero, tal como um pré-mRNA ou mRNA maduro, um mRNA humano, um RNA viral ou um RNA não codificante, tal como um microRNA ou um RNA não codificante longo.
[601] Em alguns exemplos de realização, a modulação é uma modulação do mecanismo de splicing de um pré-mRNA resultando em um padrão de splicing alterado do pré-mRNA alvo.
[602] Em alguns exemplos de realização, a modulação é a inibição que pode ocorrer por degradação do alvo (por exemplo, através do recrutamento de RNase-H, como RNase-H1 ou RISC), ou a inibição pode ocorrer por meio de um mecanismo de mediação de ocupação que inibe a função biológica normal do RNA alvo (por exemplo, mixmer ou totalmer de inibição de microRNAs ou RNAs não codificantes longos).
[603] O mRNA humano pode ser um RNA maduro ou um pré-
mRNA.
[604] A invenção também diz respeito a um composto de fórmula (II)
Y (II) em que X é oxigênio, enxofre, -CRaRb-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(=CRaRb)-, - C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-; -O-NRa-, -NRa-O-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- ou -O-CRaRb-; Y é oxigênio, enxofre, -(CRaRb)n-, -CRaRb-O-CRaRb-, - C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -Si(Ra)2-, -SO2-, -NRa-, -C(=J)-, Se, -O-NRa-, -NRa-CRaRb-, -N(Ra)-O- ou -O-CRaRb-; com a condição de que -X-Y- não é -O-O-, Si(Ra)2-Si(Ra)2-, -SO2- SO2-, -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb), -C(Ra)=N-C(Ra)=N-, - C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb) , -C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N- ou -Se-Se-; Jé oxigênio, enxofre, =CH2 ou =N(Ra); Ra e Rb são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, halogênio, hidroxila, ciano, tiohidroxila, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alquinila, alquinila substituída, alcóxi, alcóxi substituído, alcóxialquila, alqueniloxi, carboxila, alcóxicarbonila, alquilcarbonila, formila, arila, heterociclila, amino, alquilamino, carbamoíla, alquilaminocarbonila, aminoalquilaminocarbonila, alquilaminoalquilaminocarbonila, alquilcarbonilamino, carbamido, alcanoiloxi, sulfonila, alquilsulfoniloxi, nitro, azida,
tiohidroxilsulfetoalquilsulfanila, ariloxicarbonila, ariloxi, arilcarbonila, heteroarila, heteroariloxicarbonila, heteroariloxi, heteroarilcarbonila, -OC(=Xa)Rc, -OC(=Xa)NRcRd e - NReC(=Xa)NRcRd; ou dois geminais Ra e Rb juntos formam metileno opcionalmente substituído; ou dois geminais Ra e Rb, juntos com o átomo de carbono ao qual eles estão ligados, formam cicloalquila ou halocicloalquila, com apenas um átomo de carbono de -X-Y-; em que a alquila substituída, alquenila substituída, alquinila substituída, alcóxi substituído e metileno substituído são alquila, alquenila, alquinila e metileno substituído com 1 a 3 substituíntes independentemente selecionados a partir de halogênio, hidroxila, alquila, alquenila, alquinila, alcóxi, alcóxialquila, alqueniloxi, carboxila, alcóxicarbonila, alquilcarbonila, formila, heterociclila, aril e heteroarila; Xa é oxigênio, enxofre ou -NRc; Rc, Rd e Re são independentemente selecionados a partir de hidrogênio e alquila; n é 1, 2 ou 3.
R5 é um grupo protetor de hidroxila; Rx é fenila, nitrofenila, fenilalquila, halofenilalquila, cianoalquila, fenilcarbonilsulfanilalquila, halofenilcarbonilsulfanilalquil alquilcarbonilsulfanilalquila ou alquilcarbonilcarbonilsulfanilalquila; Ry é dialquilamino ou pirrolidinila; e Nu é uma nucleobase ou uma nucleobase protegida.
[605] A invenção diz respeito ainda a:
Um composto de fórmula (II) em que -X-Y- é -CH2-O-, -CH(CH3)- O- ou -CH2CH2-O-; A invenção provê ainda um composto de fórmula (IIb) (IIb) em que R5 é um grupo protetor de hidroxila, RX é fenila, nitrofenila, fenilalquila, halofenilalquila, cianoalquila, fenilcarbonilsulfanilalquila, halofenilcarbonilsulfanilalquil alquilcarbonilsulfanilalquila ou alquilcarbonilcarbonilsulfanilalquila; Ry é dialquilamino ou pirrolidinila; e Nu é uma nucleobase ou uma nucleobase protegida; Um composto de fórmula (II) que é de fórmula (III) ou (IV)
O O (III); (IV); em que R5, Rx, Ry e Nu são conforme definido acima; Um composto de fórmula (II), (IIb), (III) ou (IV) em que RX é fenila, nitrofenila, fenilmetila, diclorofenilmetila, cianoetila, metilcarbonilsulfaniletila, etilcarbonilsulfaniletila, isopropilcarbonilsulfaniletila, terc- butilcarbonilsulfaniletila, metilcarbonilcarbonilsulfaniletil ou difluorofenilcarbonilsulfaniletila; Um composto de fórmula (II), (IIb), (III) ou (IV) em que RX é fenila,
4-nitrofenila, 2,4-diclorofenilmetila, cianoetila, metilcarbonilsulfaniletila, etilcarbonilsulfaniletila, isopropilcarbonilsulfaniletila, terc- butilcarbonilsulfaniletila, metilcarbonilcarbonilsulfaniletil ou 2,4- difluorofenilcarbonilsulfaniletila; Um composto de fórmula (II), (IIb), (III) ou (IV) em que R X é fenilcarbonilsulfanilalquila; Um composto de fórmula (II), (IIb), (III) ou (IV) em que R X é fenilcarbonilsulfaniletila; Um composto de fórmula (II), (IIb), (III) ou (IV) em que Ry é di- isopropilamino ou pirrolidinila; Um composto de fórmula (II), (IIb), (III) ou (IV) em que R y é pirrolidinila; Um composto de fórmula (II) que é de fórmula (V)
O (V) em que R5 e Nu são conforme definido acima; Um composto de fórmula (IIb) que é de fórmula (Vb) (Vb) em que R5 e Nu são conforme definido acima;
Um composto de fórmula (II), (IIb), (III), (IV) ou (V) ou (Vb) em que Nu é timina, timina protegida, adenosina, adenosina protegida, citosina, citosina protegida, 5-metilcitosina, 5-metilcitosina citosina, guanina, guanina protegida, uracila ou uracila protegida; Um composto de fórmula (IIb) em que Nu é timina, timina protegida, adenosina, adenosina protegida, citosina, citosina protegida, 5- metilcitosina, 5-metilcitosina citosina, guanina, guanina protegida, uracila ou uracila protegida; Um composto de fórmula (Vb) em que Nu é timina, timina protegida, adenosina, adenosina protegida, citosina, citosina protegida, 5- metilcitosina, 5-metilcitosina citosina, guanina, guanina protegida, uracila ou uracila protegida; Um composto de fórmula (II) selecionado a partir de
O ; ; O O ; ; O O ; ; O O ; ;
O O ;e . Um composto de fórmula (IIb) selecionado a partir de ; ;
; ;
; ;
; ;
;e .
[606] A presença de impurezas no composto de fórmula (II) e (IIb) resulta em subprodutos durante a fabricação de oligonucleotídeos e dificulta o sucesso da síntese. Além disso, na presença de impurezas, o composto de fórmula (II) ou (IIb) é instável ao armazenamento.
[607] Os compostos de fórmula (X1), (X2), X (11) e (X21)
Y Y (X1); Y (X2);
O O (X11); O (X21); são, entre outros, exemplos de tais impurezas.
[608] Havia, portanto, a necessidade de um composto de fórmula (II) ou (IIb) em uma forma suficientemente pura para fins de armazenamento e fabricação de oligonucleotídeos.
[609] A invenção também diz respeito a um composto de fórmula (II), (Ilb) com uma pureza de pelo menos 98%, particularmente de 99%, mais particularmente de 100%.
[610] A invenção refere-se, assim, em particular a um composto de fórmula (II) compreendendo menos de 1%, particularmente 0%, do composto de fórmula (X1) e/ou do composto de (X2) como impurezas.
[611] A invenção diz respeito ainda a um processo para a fabricação de um composto de fórmula (II) conforme definido acima, compreendendo a reação de um nucleosídeo LNA protegido por 5' com uma fosfina e um ditiol monoprotegido na presença de um agente de acoplamento ácido e um agente de sililação.
[612] A invenção diz respeito ainda a um processo para a fabricação de um composto de fórmula (IIb) como definido acima, compreendendo a reação de um nucleosídeo MOE protegido em 5' com uma fosfina e um ditiol monoprotegido na presença de um agente de acoplamento ácido e um agente de sililação.
[613] A invenção refere-se a um processo para a fabricação de um composto de fórmula (II) compreendendo a reação de um composto de fórmula (C) (C) com um composto de fórmula P(Ry)3 e um composto da fórmula HSRx na presença de um agente de acoplamento ácido e um agente de sililação, em que X, Y, R5, Nu, Rx e Ry são conforme definidos acima.
[614] A invenção refere-se ainda a um processo para a fabricação de um composto de fórmula (II) que compreende a reação de um composto de fórmula (C1)
O (C1) com um composto de fórmula P(Ry)3 e um composto da fórmula HSRx na presença de um agente de acoplamento ácido e um agente de sililação, em que R5, Nu, Rx e Ry são conforme definidos acima.
[615] A invenção também se refere a um processo para a fabricação de um composto de fórmula (IIb) compreendendo a reação de um composto de fórmula (Cb)
(Cb) com um composto de fórmula P(Ry)3 e um composto da fórmula HSRx na presença de um agente de acoplamento ácido e um agente de sililação, em que R5, Nu, Rx e Ry são conforme definidos acima.
[616] Exemplos de agentes de acoplamento ácidos, também conhecidos como ativadores ácidos, são ativadores à base de azóis, tais como tetrazol, 5-nitrofenil-1H-tetrazol (TNP), 5-etiltio-1H-tetrazol (TET), 5-benziltio- 1H-tetrazol (BTT), 5-metiltio-1H-tetrazol (MTT), 5-mercapto-tetrazóis (MCT), 5- (3,5-bis (trifluorometil)fenil)-1H-tetrazol e 4,5-dicianoimidazol (DCI), ou sais ácidos como cloridrato de piridínio, triflato de imidazólio, triflato de benzimidazólio, triflato de 5-nitrobenzimidazólio ou ácidos fracos, como ácido 2,4-dinitrobenzóico ou 2,4-dinitrofenol. O tetrazol é um agente de acoplamento ácido particular.
[617] Exemplos de agentes de sililação, também conhecidos como bloqueadores de grupos hidroxila, são bis(dimetilamino)dimetilsilano, N,O-bis(trimetilsilil)acetamida (BSA), N,O-bis(trimetilsilil)carbamato (BSC), N,N- bis(trimetilsilil)metilamina, N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA), N,N′- bis(trimetilsilil)uréia (BSU), bromotrimetilsilano (TMBS), N-terc-butildimetilsilil-N- metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA), clorodimetil(pentafluorofenil)silano, clorotrietilsilano (TESCI), clorotrimetilsilano (TMCS), 1,3-dimetil-1,1,3,3- tetrafenildisilazano (TPDMDS), N,N-dimetiltrimetilsililamina (TMSDMA), hexametildisilazano (HMDS), hexametildisiloxano (HMDSO), N-metil-N- trimetilsililacetamida (MSA), N-metil-N-trimetilsililheptafluorobutiramida (MSHFA), N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida (MSTFA), 1,1,3,3-tetrametil- 1,3-difenildisilazano (DPTMDS), 4-(trimetilsiloxi)-3-penten-2-ona (TMS acac), 1-
(trimetilsilil)imidazol (TMSI) ou metalilsulfinato de trimetilsilila (SILMAS-TMS). 1- (Trimetilsilil)imidazol é um agente de sililação particular.
[618] A invenção refere-se ainda a um processo para a fabricação de um composto de fórmula (II), (IIb) ou (III) em que o composto bruto de fórmula (II) ou (IIb) é purificado por HPLC preparativa.
[619] A invenção refere-se ainda a um processo para a fabricação de um composto de fórmula (II), (IIb) ou (III) em que o composto bruto de fórmula (II), (IIb) ou (III) é purificado por HPLC preparativa e eluído com um gradiente de acetonitrila contra hidróxido de amônio em água.
[620] O teor de hidróxido de amônio em água é de pelo menos cerca de 0,05% v/v, em particular entre 0,05% e 1% v/v, mais particularmente entre 0,05 % e 0,5% v/v, mais particularmente. 0,05% v/v.
[621] O gradiente de acetonitrila está particularmente entre 0% e 25% até entre 75% e 100% de acetonitrila, em especial dentro de 20 min a 120 min, mais particularmente entre 10% e 20% a entre 75% e 90% de acetonitrila, em particularmente dentro de 25 minutos a 60 minutos, mais particularmente em torno de 25% a 75% de acetonitrila, em particular dentro de 30 minutos.
[622] A invenção também diz respeito ao uso de um composto de fórmula (II), (IIb) ou (III) na fabricação de um oligonucleotídeo, em particular de um oligonucleotídeo ou um oligonucleotídeo gapmer de acordo com a invenção.
EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO DE GAPMERS ADICIONAIS
[623] 1. Um oligonucleotídeo gapmer compreendendo pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) (I)
em que R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato.
[624] 2. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com o exemplo de realização 1, em que um dos dois átomos de oxigênio da referida pelo menos uma ligação internucleosídica de fórmula (I) está ligado ao átomo de carbono 3’ de um nucleosídeo adjacente (A 1) e o outro está ligado ao átomo de carbono 5’ de outro nucleosídeo (A2), em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado.
[625] 3. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com o exemplo de realização 1 ou 2, em que um dentre (A 1) e (A2) é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado e o outro é um nucleosídeo de DNA.
[626] 4. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com o exemplo de realização 1 ou 2, em que ambos (A1) e (A2) são ao mesmo tempo um nucleosídeo 2’-modificado.
[627] 5. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com o exemplo de realização 1, em que ambos (A1) e (A2) são ao mesmo tempo um nucleosídeo de DNA.
[628] 6. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 5, em que o oligonucleotídeo gapmer compreende uma sequência nucleotídica contígua de fórmula 5’-F-G- F’-3’, em que G é uma região de 5 a 18 nucleosídeos que é capaz de recrutar RNase-H, e a referida região G é flanqueada 5’ e 3’ por regiões flanqueadoras F e F’, respectivamente, em que as regiões F e F’ compreendem ou consistem independentemente de 1 a 7 nucleotídeos com açúcar 2’-modificado, em que o nucleosídeo de região F que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado e em que o nucleosídeo da região F’ que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado.
[629] 7. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 6, em que os nucleosídeos açúcar 2’-modificados são independentemente selecionados a partir de 2’- alcóxi-RNA, 2’-alcóxi-alcóxi-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-flúor-RNA, 2’-flúor-ANA e nucleosídeos de LNA.
[630] 8. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com o exemplo de realização 7, em que 2’-alcóxi-alcóxi-RNA é um 2’-metoxietoxi-RNA (2’-O-MOE).
[631] 9. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 8, em que região F e região F’ compreendem ou consistem de nucleotídeos 2’-metoxietoxi-RNA.
[632] 10. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 9, em que pelo menos um ou todos os nucleosídeos açúcar 2’-modificados na região F ou região F’, ou em ambas as regiões F e F’, são nucleosídeos de LNA.
[633] 11. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 10, em que região F ou região F’, ou ambas as regiões F e F’, compreendem pelo menos um nucleosídeo de LNA e pelo menos um nucleosídeo de DNA.
[634] 12. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 11, em que região F ou região F’, ou ambas as regiões F e F’ compreendem pelo menos um nucleosídeo de LNA e pelo menos um nucleosídeo não LNA com açúcar 2’-modificado, tal como pelo menos um nucleosídeo 2’-metoxietoxi-RNA.
[635] 13. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12, em que a região gap compreende de 5 a 16, em particular de 8 a 16, mais particularmente 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 nucleosídeos de DNA contíguos.
[636] 14. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 13, em que região F e região
F’ são independentemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 nucleosídeos de comprimento.
[637] 15. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 14, em que cada região F e F’ compreende independentemente 1, 2, 3 ou 4 nucleosídeos de LNA.
[638] 16. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 17, em que os nucleosídeos de LNA são independentemente selecionados a partir de beta-D-oxi LNA, 6’- metil-beta-D-oxi LNA e ENA.
[639] 17. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com o exemplo de realização 7 ou 10, em que os nucleosídeos de LNA são beta-D-oxi LNA.
[640] 18. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 17, em que o oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua do mesmo (F-G-F’), é de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em particular 12 a 22, mais particularmente de 14 a 20 oligonucleotídeos de comprimento.
[641] 19. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 18, em que o oligonucleotídeo gapmer compreende uma sequência nucleotídica contígua de fórmula 5’-D’-F- G-F’-D’’-3’, em que F, G e F’ são conforme definido em qualquer um dos exemplos de realização 4 to 17 e em que cada região D’ e D’’ consiste independentemente de 0 a 5 nucleotídeos, em particular 2, 3 ou 4 nucleotídeos, particularmente nucleotídeos de DNA tal como nucleosídeos de DNA ligados com fosfodiéster.
[642] 20. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 19, em que o oligonucleotídeo gapmer é capaz de recrutar a RNase-H1 humana.
[643] 21. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 20, em que a referida pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1 é posicionada entre os nucleosídeos adjacentes na região F ou região F’, entre a região F e a região G ou entre a região G e a região F’.
[644] 22. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 21, que compreende ainda ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[645] 23. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 22, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1.
[646] 24. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 23 em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreendem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1, em particular 0 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I).
[647] 25. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 24, em que as ligações internucleosídicas remanescentes são independentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em fosforotioato, fosfodiéster e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1.
[648] 26. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 25, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos de região F e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região F’ são independentemente selecionadas a partir de fosforotioato e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1.
[649] 27. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 26, em que cada região flanqueadora, F e F’, compreende independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1.
[650] 28. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 27, em que todas as ligações internucleosídicas de regiões flanqueadoras F e/ou F’ são ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1.
[651] 29. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 28, em que o oligonucleotídeo gapmer compreende pelo menos uma ligação internucleosídica estereodefinida, tal como pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido.
[652] 30. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 29, em que a região gap compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido.
[653] 31. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 30, em que todas as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região gap são ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido.
[654] 32. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 27, em que a pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1 é posicionada entre os nucleosídeos da região F, ou entre os nucleosídeos da região F’, ou entre a região F e a região G, ou entre a região G e a região F’, e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região F e F’, entre a região F e a região G e entre a região G e a região F’, são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, ligações internucleosídicas estereoaleatórias, ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) e ligações internucleosídicas de fosfodiéster.
[655] 33. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com o exemplo de realização 32, em que as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região F, dentro da região F’ ou dentro de ambas as regiões, F e F’, são todas ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1.
[656] 34. Um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 6 a 33, em que as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreendem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1 e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, ligações internucleosídicas estereoaleatórias e ligações internucleosídicas de fosfodiéster.
[657] 35. Um sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo gapmer de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 34, em particular um sal de sódio ou potássio.
[658] 36. Um conjugado compreendendo um oligonucleotídeo gapmer ou um sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 35 e pelo menos uma porção de conjugado covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo ou referido sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente por uma porção ligante.
[659] 37. Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleotídeo gapmer, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 36 e um veículo terapeuticamente inerte.
[660] 38. Um oligonucleotídeo gapmer, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 36 para uso como uma substância terapeuticamente ativa.
[661] 39. A invenção conforme descrito anteriormente.
[662] A invenção será agora ilustrada pelos seguintes exemplos que não têm caráter limitante da invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
SÍNTESE DE MONÔMERO
1.1: Benzenocarbotioato de S-(2-sulfaniletila)
[663] Em uma solução de 1,2-etanoditiol (133,57 mL, 1592 mmol, 1 eq) e piridina (64,4 mL, 796 mmol, 0,5 eq) em clorofórmio (200 mL) foi adicionado cloreto de benzoíla (92,4 mL, 796 mmol, 0,5 eq) em clorofórmio (200 mL) por gotejamento durante 1 hr, e a reação foi agitada a 0ºC durante 1 hr. A mistura foi lavada com água (300 mL) e salina (300 mL). A fase orgânica foi seca em Na2SO4 e concentrada em um óleo amarelo. O óleo foi destilado (135~145°C) para proporcionar benzenocarbotioato de S-(2-sulfaniletila) (40 g,
202mmol, 13% de rendimento) como um óleo incolor. RMN H 1 (400 MHz, CDCl3) δ 7,97 (d, J=7,34 Hz, 2H), 7,53-7,64 (m, 1H), 7,47 (t, J=7,58 Hz, 2H), 3,31 (t, J=7,34 Hz, 2H), 2,77-2,86 (m, 2H), 1,70 (t, J=8,56 Hz, 1H).
1.2: Benzenocarbotioato de S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-1-[[bis(4- metoxifenil)-fenil-metoxi]metil]-3-(5-metil-2,4-dioxo-pirimidin-1-il)-2,5- dioxabiciclo[2.2.1]heptan-7-il]oxi-pirrolidin-1-il-fosfanil]sulfaniletila]
[664] 1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[bis(4-metoxifenil)-fenil-metoxi]metil]-7- hidroxi-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptan-6-il]-5-metil-pirimidina-2,4-diona (2,29 g, 4,00 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido em 60 mL de diclorometano anidro ao qual foi adicionada uma espátula de peneira molecular de 3 Å. Tripirrolidin-1-ilfosfano (960 mg, 3,98 mmol, 0,99 eq) foi adicionado por uma seringa seguido por sete alíquotas de 0,1 mmol de tetrazol (7 * 0,4 mL de uma soluçao de 0,5 M em acetonitrila anidra armazenada sobre peneiras moleculares de 3 Å) em intervalos de 2 min. N-trimetilsililimidazol (56,0 mg, 0,400 mmol, 0,1 eq) foi então adicionado à reação. Após 5 min, tetrazol (21,6 mL de uma soluçao de 0,5 M em acetonitrila anidra) foi adicionado, imediatamente seguido pela adição de benzenocarbotioato de S-(2-sulfaniletila) (1,04 g, 5,24 mmol, 1,31 eq). A reação foi desenvolvida durante 120 seg. Quatro lotes idênticos de uma reação foram reunidos e a reação foi interrompida vertendo a solução em 600 mL de diclorometano contendo 40 mL de trietilamina. A mistura foi imediatamente lavada com bicarbonato de sódio saturado (800 mL) seguido por carbonato de sódio a 10% (2 * 800 mL) e salina (800 mL). A camada orgânica foi seca em Na2SO4. Após 10-15 min o agente secante foi removido por filtração.
Trietilamina (40 mL) foi adicionada à solução que foi concentrada em um xarope utilizando um evaporador rotativo. O xarope foi dissolvido em tolueno (200 mL) e trietilamina (40 mL), e essa solução foi pipetada em 4500 mL de heptano vigorosamente agitado para precipitar o produto branco macio. Após a maior parte de o heptano ter sido decantada, o precipitado branco foi coletado por filtração através de um funil de vidro sinterizado médio e subsequentemente seco em vácuo para dar um sólido branco. O sólido foi purificado por HPLC preparativa (coluna Phenomenex Gemini C18, 250x50mm, 10 mm, 0,05% hidróxido de amônio em água / CH3CN), e foi liofilizado para proporcionar 4,58 g do composto alvo como um sólido branco. RMN P 31 (162 MHz, CD3CN) δ 167.6, 164.2. RMN H1 (400 MHz, CD3CN) δ 9,16 (br s, 1H), 7,93 (t, J=7,41 Hz, 2H), 7,60-7,71 (m, 1H), 7,45-7,57 (m, 4H), 7,24-7,45 (m, 7H), 6,90 (d, J=8,93 Hz, 4H), 5,53-5,63 (m, 1H), 4,41-4,64 (m, 2H), 3,74-3,88 (m, 8H), 3,39-3,63 (m, 2H), 3,03-3,32 (m, 5H), 2,77-2,94 (m, 2H), 1,66-1,84 (m, 4H), 1,54-1,66 (m, 3H).
1.3: Benzenocarbotioato de S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-3-(6- benzamidopurin-9-il)-1-[[bis(4-metoxifenil)-fenil-metoxi]metil]-2,5- dioxabiciclo[2.2.1]heptan-7-il]oxi-pirrolidin-1-il-fosfanil]sulfaniletila]
[665] N-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[bis(4-metoxifenil)-fenil- metoxi]metil]-7-hidroxi-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptan-6-il]purin-6-il]benzamida (2,74g, 4,00 mmol, 1,0 eq) foi dissolvido em 60 mL de diclorometano anidro ao qual foi adicionada uma espátula de peneira molecular de 3 Å. Tripirrolidin-1-
ilfosfano (960 mg, 3,98 mmol, 0,99 eq) foi adicionado por uma seringa seguido por sete alíquotas de 0,1 mmol de tetrazol (7 * 0,4 mL de uma soluçao de 0,5 M em acetonitrila anidra armazenada sobre peneiras moleculares de 3 Å) em intervalos de 2 min. 1-(trimetilsilil)-1H-imidazol (56,0 mg, 0,400 mmol, 0,1 eq) foi então adicionado à reação. Após 5 min, tetrazol (21,6 mL de uma soluçao de 0,5 M em acetonitrila anidra) foi adicionado, imediatamente seguido pela adição de benzenocarbotioato de S-(2-sulfaniletila) (1,04 g, 5,24 mmol, 1,31 eq). A reação foi desenvolvida durante 120 s.
[666] Quatro lotes idênticos de uma reação foram reunidos e a reação foi interrompida vertendo a solução em 600 mL de diclorometano contendo 40 mL de trietilamina. A mistura foi imediatamente lavada com bicarbonato de sódio saturado (800 mL) seguido por carbonato de sódio a 10% (2 * 800 mL) e salina (800 mL). A camada orgânica foi seca em Na2SO4. Após 10-15 min o agente secante foi removido por filtração. Trietilamina (10 mL) foi adicionada à solução que foi concentrada em um xarope utilizando um evaporador rotativo. O xarope foi dissolvido em tolueno (100 mL) e trietilamina (20 mL), e essa solução foi pipetada em 4500 mL de heptano vigorosamente agitado para precipitar o produto branco macio. Após a maior parte de o heptano ter sido decantada, o precipitado branco foi coletado por filtração através de um funil de vidro sinterizado médio e foi subsequentemente seco em vácuo para dar um sólido branco. O sólido foi purificado por HPLC preparativa (coluna Phenomenex Gemini C18, 250x50mm, 10 mm, 0,05% hidróxido de amônio em água / CH3CN), e foi liofilizado para proporcionar 5,26 g do composto alvo como um sólido branco. RMN P31 (162 MHz, CD3CN) 165.6,
164.7. RMN H1 (400 MHz, CD3CN) δ 8,56 (d, J=10,76 Hz, 1H), 8,24 (d, J=10,27 Hz, 1H), 7,82-7,93 (m, 2H), 7,71-7,80 (m, 2H), 6,92-7,54 (m, 14H), 6,68-6,83 (m, 4H), 6,03 (d, J=6,48 Hz, 1H), 4,70-4,90 (m, 2H), 3,81-3,98 (m, 2H), 3,59- 3,68 (m, 7H), 3,25-3,47 (m, 2H), 2,81-3,02 (m, 6H), 2,56-2,81 (m, 2H), 1,44-
1,72 (m, 4H).
1.4: Benzenocarbotioato de S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-3-(4- benzamido-5-metil-2-oxo-pirimidin-1-il)-1-[[bis(4-metoxifenil)-fenil- metoxi]metil]-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptan-7-il]oxi-pirrolidin-1-il- fosfanil]sulfaniletila]
[667] N-[1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[bis(4-metoxifenil)-fenil- metoxi]metil]-7-hidroxi-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptan-6-il]-5-metil-2-oxo-pirimidin- 4-il]benzamida (2,70 g, 4,00 mmol, 1,0 eq) foi dissolvida em 60 mL de diclorometano anidro ao qual foi adicionada uma espátula de peneira molecular de 3 Å. Tripirrolidin-1-ilfosfano (965 mg, 4,00 mmol, 1,0 eq) foi adicionado por uma seringa seguido por sete alíquotas de 0,1 mmol de tetrazol (7 * 0,4 mL de uma soluçao de 0,5 M em acetonitrila anidra armazenada sobre peneiras moleculares de 3 Å) em intervalos de 2 min. 1-(trimetilsilil)-1H-imidazol (56,0 mg, 0,400 mmol, 0,1 eq) foi então adicionado à reação. Após 5 min, tetrazol (21,6 mL de uma soluçao de 0,5 M em acetonitrila anidra) foi adicionado, imediatamente seguido pela adição de benzenocarbotioato de S-(2-sulfaniletila) (1,04 g, 5,24 mmol, 1,31 eq). A reação foi desenvolvida durante 120 seg.
Quatro lotes idênticos de uma reação foram reunidos e a reação foi interrompida vertendo a solução em 600 mL de diclorometano contendo 40 mL de trietilamina. A mistura foi imediatamente lavada com bicarbonato de sódio saturado (800 mL) seguido por carbonato de sódio a 10% (2 * 800 mL) e salina (800 mL). A camada orgânica foi seca em Na2SO4. Após 10-15 min o agente secante foi removido por filtração. Trietilamina (40 mL) foi adicionada à solução que foi concentrada em um xarope utilizando um evaporador rotativo. O xarope foi dissolvido em tolueno (100 mL) e trietilamina (30 mL), e essa solução foi pipetada em 4500 mL de heptano vigorosamente agitado para precipitar o produto branco macio. Após a maior parte do heptano ter sido decantada, o precipitado branco foi coletado por filtração através de um funil de vidro sinterizado médio e subsequentemente seco em vácuo para dar um sólido branco. O sólido foi purificado por HPLC preparativa (coluna Phenomenex Gemini C18, 250x50mm, 10 mm, 0,05% hidróxido de amônio em água / CH3CN) e foi liofilizado para proporcionar 2,05 g do composto alvo como um sólido branco. RMN P31 (162 MHz, CD3CN) δ 171.2, 167.4. RMN H1 (400 MHz, CD3CN) δ 8,18-8,32 (m, 2H), 7,81-7,93 (m, 3H), 7,35-7,60 (m, 14H), 7,17-7,35 (m, 2H), 6,93 (d, J=8,93 Hz, 4H), 5,65 (d, J=15,04 Hz, 1H), 4,56-4,72 (m, 2H), 3,69-3,90 (m, 8H), 3,45-3,61 (m, 2H), 3,03-3,26 (m, 6H), 2,76-3,02 (m, 2H), 1,65-1,93 (m, 7H).
1.5: Benzenocarbotioato de S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-1-[[bis(4- metoxifenil)-fenil-metoxi]metil]-3-[2-[(E)-dimetilaminometilenoamino]-6- oxo-1H-purin-9-il]-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptan-7-il]oxi-pirrolidin-1-il- fosfanil]sulfaniletila]
[668] N'-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[bis(4-metoxifenil)-fenil- metoxi]metil]-7-hidroxi-2,5-dioxabiciclo[2.2.1]heptan-6-il]-6-oxo-1H-purin-2-il]- N,N-dimetil-formamidina (2,62 mg, 4,00 mmol, 1,0 eq) foi dissolvida em 200 mL de diclorometano anidro ao qual foi adicionada uma espátula de peneira molecular de 3 Å. Tripirrolidin-1-ilfosfano (965 mg, 4,00 mmol, 1,0 eq) foi adicionado por uma seringa seguido por sete alíquotas de 0,1 mmol de tetrazol
(7 * 0,4 mL de uma soluçao de 0,5 M em acetonitrila anidra armazenada sobre peneiras moleculares de 3 Å) em intervalos de 2 min. 1-(Trimetilsilil)-1H- imidazol (56,0 mg, 0,400 mmol, 0,1 eq.) foi então adicionado à reação. Após 5 min, tetrazol (21,6 mL de uma soluçao de 0,5 M em acetonitrila anidra) foi adicionado, imediatamente seguido pela adição de benzenocarbotioato de S- (2-sulfaniletila) (1,04 g, 5,24 mmol, 1,31 eq.). A reação foi desenvolvida durante 180 s.
[669] Quatro lotes idênticos foram combinados e bloquados ao verter as soluções em 600 mL de diclorometano contendo 40 mL de trietilamina. A mistura foi imediatamente lavada com bicarbonato de sódio saturado (800 mL) seguido por carbonato de sódio a 10% (2 * 800 mL) e salina (800 mL). A camada orgânica foi seca em Na2SO4. Após 10-15 min o agente secante foi removido por filtração. Trietilamina (40 mL) foi adicionada à solução que foi concentrada utilizando um evaporador rotativo em um xarope. O xarope foi dissolvido em tolueno (100 mL) e trietilamina (30 mL), e essa solução foi pipetada em 4500 mL de heptano vigorosamente agitado para precipitar o produto branco macio. Após a maior parte do heptano ter sido decantada, o precipitado branco foi coletado por filtração através de um funil de vidro sinterizado médio e subsequentemente seco em vácuo para dar um sólido branco. O sólido foi purificado por HPLC preparativa (coluna Phenomenex Gemini C18, 250x50mm, 10 mm, 0,05% hidróxido de amônio em água / CH3CN) e foi liofilizado para proporcionar 3,82 g do composto alvo como um sólido amarelo. RMN P31 (162 MHz, CD3CN) δ 167.1, 162.2. RMN H1 (400 MHz, CD3CN) δ 9,36 (br s, 1H), 8,63 (d, J=16,51 Hz, 1H), 7,78-8,00 (m, 3H), 7,66 (t, J=7,62 Hz, 1H), 7,42-7,57 (m, 4H), 7,24-7,40 (m, 7H), 6,89 (d, J=8,68 Hz, 4H), 5,92-5,98 (m, 1H), 4,72-4,97 (m, 2H), 3,86-4,05 (m, 2H), 3,78 (2s, 6H), 3,27-3,70 (m, 3H), 2,87-3,20 (m, 12H), 2,67-2,82 (m, 2H), 1,54-1,79 (m, 4H).
EXEMPLO 2
SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS
[670] Os oligonucleotídeos foram sintetizados usando um sintetizador de DNA automatizado MerMade 12 pela Bioautomation. As sínteses foram conduzidas em uma escala de 1 µmol usando um suporte de vidro de poro controlado (500Å) que possui um ligante universal.
[671] Nos procedimentos de ciclo padrão para o acoplamento de DNA e LNA a desproteção de fosforamiditas DMT foi realizada com 3% (p/v) de ácido tricloroacético em CH2Cl2 em três aplicações de 200 μL durante 30 seg.
As respectivas fosforamiditas foram acoplados três vezes com 100 µL de soluções a 0,1 M em acetonitrila (ou acetonitrila/CH2Cl2 1:1 para o bloco de construção LNA-MeC) e 110 µL de uma solução 0,1 M de 5-(3,5- bis(trifluorometilfenil))-1H-tetrazol em acetonitrila como ativador e um tempo de acoplamento de 180 segundos. Para a tio-oxidação, foi utilizada uma solução de 0,1M de 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona em acetonitrila/piridina 1:1 (3x190 µL, 55 s). O capeamento foi realizado utilizando THF/lutidina/Ac2O 8:1:1 (CapA, 75 μmol) e THF/N- metilimidazol 8:2 (CapB, 75 μmol), durante 55 seg.
[672] Os ciclos de síntese para a introdução de tiofosforamidita incluído a desproteção DMT usando 3% (p/v) de ácido tricloroacético em CH2Cl2 em três aplicações de 200 μL durante 30 seg. As tiofosforamiditas de DNA comercialmente disponíveis ou as tiofosforamiditas de LNA preparadas recentemente foram acopladas três vezes com 100 µL de soluções 0,15 M em 10% (v/v) de CH2Cl2 em acetonitrila e 110 µL de uma solução de 0,1 M de 5- (3,5-bis(trifluorometilfenila))-1H-tetrazol em acetonitrila como ativador e um tempo de acoplamento de 600 segundos cada. A tio-oxidação foi realizada usando uma solução 0,1 M de 3-amino-1,2,4-ditiazol-5-tiona em acetonitrila/piridina em três aplicações por 55 segundos. O capeamento foi realizado utilizando THF/lutidina/Ac2O 8:1:1 (CapA, 75 μmol) e THF/N- metilimidazol 8:2 (CapB, 75 μmol), durante 55 seg.
[673] Após a conclusão da síntese automatizada, a remoção dos grupos protetores de nucleobases e a clivagem do suporte sólido são realizadas usando uma mistura de amônia (32%):etanol (3:1, v:v) contendo DTT 20 mM a 55ºC por 15-16 h.
[674] Os oligonucleotídeos brutos de DMT-on foram purificados usando um cartucho de extração em fase sólida e repurificação com cromatografia de troca iônica ou por purificação por RP-HPLC usando uma coluna C18 seguida da remoção de DMT com ácido acético aquoso a 80% e precipitação com etanol.
[675] Nos exemplos a seguir nós usamos os seguintes produtos químicos de tio-ligação;
[676] Nos seguintes exemplos, a menos que indicado de outra forma, as ligações fosforoditioato aquirais (também referidas como P2S) são ditioates não ponte (tal como ilustrado na fórmula (IA) ou (IB)), e são rotuladas como *. Os compostos usados no exemplo incluem compostos com a seguinte sequência de nucleobases: SEQ ID NO 1: GCATTGGTATTCA SEQ ID NO 2: TCTCCCAGCGTGCGCCAT
SEQ ID NO 3: GAGTTACTTGCCAACT SEQ ID NO 4: TATTTACCTGGTTGTT SEQ ID NO 5: CAATCAGTCCTAG.
[677] As seguintes moléculas foram preparadas seguindo o procedimento acima. Composto ID Composto (SEQ ID NO) Massa calculada Massa encontrada No. #1 GmCa*ttggtatTmCA 4341,6 4341,6 #2 GmCat*tggtatTmCA 4341,6 4341,6 #3 GmCatt*ggtatTmCA 4341,6 4341,6 #4 GmCattg*gtatTmCA 4341,6 4341,6 #5 GmCattgg*tatTmCA 4341,6 4341,6 #6 GmCattggt*atTmCA 4341,6 4341,6 #7 GmCattggta*tTmCA 4341,6 4341,6 #8 GmCattggtat*TmCA 4341,6 4341,6 #9 GmCat*t*ggtatTmCA 4357,6 4356,8 #10 GmCattggt*at*TmCA 4357,6 4356,8 #11 GmCat*tggt*atTmCA 4357,6 4357,2 #12 GmCatt*ggtat*TmCA 4357,6 4356,8 #13 GmCat*tggtat*TmCA 4357,6 4356,9 #14 GmCat*t*ggtat*TmCA 4373,7 4373,5 #15 GmCatt*ggt*at*TmCA 4373,7 4373,1 #16 GmCat*t*ggt*atTmCA 4373,7 4373,0 #17 GmCat*t*ggt*at*TmCA 4389,8 4389,1 #18 GmCa*ttg*gta*tTmCA 4373,7 4373,0 #19 GmCa*tt*gg*ta*tTmCA 4389,8 4389,0 #20 GmCa*ttggta*tTmCA 4357,6 4356,9 #21 GmCa*ttggtat*TmCA 4357,6 4357,1 #22 GmCat*tggta*tTmCA 4357,6 4356,9 #23 GmCattg*gt*atTmCA 4357,6 4357,6 #24 GmCattg*g*t*atTmCA 4373,7 4373,7 #25 GmCattg*g*t*at*TmCA 4389,8 4389,8 #26 GmCattg*g*t*a*t*TmCA 4405,8 4405,8 #27 GmCattggtatTmC*A 4341,6 4342,0 #28 G*mCattggtatTmCA 4341,6 4342,5 #29 G*mCattggtatTmC*A 4357,6 4359,0 #30 G*mCattggtatT*mC*A 4373,7 4368,5 #31 G*mC*attggtatTmC*A 4373,7 4369,2 #32 G*mC*attggtatT*mC*A 4389,8 4390,6 * Modificação de ditioato entre nucleotídeos adjacentes A, G, mC, T representa nucleotídeos LNA a, g, c, t representa nucleotídeos DNA todas as outras ligações foram preparadas como fosforotioatos EXEMPLO 3
EFICÁCIA IN VITRO E EXPERIMENTOS DE CAPTAÇÃO CELULAR
[678] Os hepatócitos primários de ratos foram semeados em placas de 96 poços e tratados em meio Williams E contendo 10% de SBF sem antibióticos. As células foram tratadas com soluções de LNA nas concentrações indicadas em meio de cultura celular completo. Após um tempo de incubação de 24 e 72 horas, respectivamente, as células foram lavadas 3 vezes com PBS contendo Ca2+ e Mg2+ e lisadas com 165 μL de tampão de lise PureLink Pro. O RNA total foi isolado usando o Kit PureLink PRO 96 RNA da Thermo Fisher de acordo com as instruções do fabricante e a RT-qPCR foi realizada usando o LightCycler Multiplex RNA Virus Master (Roche) com conjunto de iniciadores - sondas para RnApoB (Invitrogen). Os dados obtidos foram normalizados pelo método fluorescente Ribogreen.
[679] As concentrações intracelulares dos oligonucleotídeos de LNA foram determinadas utilizando um ensaio ELISA baseado em hibridização para uma variedade de compostos. Todos os pontos de dados foram realizados em triplicatas e os dados são fornecidos como a média das mesmas.
[680] Os resultados são exibidos nas Figuras de 1 a 4.
EXEMPLO 4 TEMPERATURA DE FUSÃO (TM) DE OLIGONUCLEOTÍDEOS CONTENDO UMA
LIGAÇÃO INTERNUCLEOSÍDICA DE FOSFORODITIOATO HIBRIDIZADA A RNA E DNA
[681] Os seguintes oligonucleotídeos foram preparados. As ligações de fosforotioato são designadas pelo S subescrito; As ligações de fosforoditioato de acordo com a invenção são designadas pelo PS2 subscrito. Composto 1 5'-GS mCS aS tS tS gS gS tS aS tS TS mCPS2 A -3' 2 5'-GPS2 mCS aS tS tS gS gS tS aS tS TS mCS A -3'
Composto 3 5'-GPS2 mCS aS tS tS gS gS tS aS tS TS mCPS2 A -3' 4 5'-GPS2 mCS aS tS tS gS gS tS aS tS TPS2 mCPS2 A -3' 5 5'-GPS2 mCPS2 aS tS tS gS gS tS aS tS TS mCPS2 A -3' 6 5'-GPS2 mCPS2 aS tS tS gS gS tS aS tS TPS2 mCPS2 A -3' Controle 5'-GS mCS aS tS tS gS gS tS aS tS TS mCS A -3' DNA Controle 5'-tS cS tS cS cS cS aS gS cS gS tS gS cS gS cS cS aS t -3' SEQ ID NO 2
[682] Os compostos 1 - 6 têm o motivo de sequência SEQ ID NO
1.
[683] A temperatura de fusão (Tm) dos compostos 1-6 hibridizados ao RNA e DNA foi medida de acordo com o procedimento a seguir.
[684] Uma solução de uma quantidade equimolar de RNA ou DNA e do oligonucleotídeo LNA (1,5 μM) em tampão (100 mM de NaCl, 0,1 mM de EDTA, 10 mM de Na2HPO4, pH 7) foi aquecida a 90ºC durante 1 min e em seguida deixada arrefecer à temperatura ambiente. A absorbância UV a 260 nm foi registrada usando um espectrofotômetro Cary Series UV-Vis (taxa de aquecimento de 1ºC por minuto; taxa de leitura de uma leitura por min). A absorbância foi plotada contra a temperatura e os valores da Tm foram calculados tomando a primeira derivada de cada curva.
[685] Os resultados estão resumidos na tabela abaixo e na Figura 5.
RNA DNA Td Ta ΔTm Td Ta ΔTm Controle 59,1 57,7 1,5 50,1 47,7 2,4 1 58,0 54,8 3,2 50,0 46,9 3,1 2 58,1 55,7 2,5 49,1 46,7 2,4 3 58,3 55,5 2,8 50,2 47,6 2,6 4 57,5 54,4 3,1 48,4 46,5 1,8 5 57,6 56,3 1,3 48,5 47,4 1,1
RNA DNA Td Ta ΔTm Td Ta ΔTm 6 58,0 55,8 2,2 50,0 46,9 3,1 Td: Temperatura de dissociação (desnaturação); Ta: Temperatura da associação (renaturação)
[686] Os compostos de acordo com a invenção retêm a alta afinidade para o RNA e DNA do controle.
EXEMPLO 5
ESTABILIDADE SÉRICA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS CONTENDO UMA LIGAÇÃO INTERNUCLEOSÍDICA DE FOSFORODITIOATO
[687] A estabilidade dos oligonucleotídeos 1-6 no soro de ratos Sprague-Dawling machos foi mensurada de acordo com o seguinte procedimento.
[688] Uma solução de oligonucleotídeo a 25 µM em soro de rato misturada com tampão Nuclease (acetato de sódio 30 mM, sulfato de zinco 1 mM, NaCl 300 mM, pH 4,6) 3:1 foi incubada a 37ºC por 0, 5, 25, 52 ou 74 horas. As amostras de 2 µL foram injetadas para análise por UPLC-MS em um dispositivo UPLC da Water Acquity equipado com uma coluna Water Acquity BEH C 18, 1,7 µm. As áreas de pico análogas medidas a 260 nm compensadas com as constantes de extensão dos diferentes tempos de degradação foram usadas para estabelecer a % de oligonucleotídeo não clivado.
[689] Eluentes UPLC: A: 2,5% MeOH, 0,2 M HEP, 16,3 mM TEA B: 60% MeOH, 0,2 M HEP, 16,3 mM TEA TEMPO MÍN. FLUXO ML/MIN % TAMPÃO A % TAMPÃO B 0 0,5 90 10 0,5 0,5 90 10 5 0,5 70 30 6 0,5 70 30 7 0,5 0 100 8 0,5 0 100
TEMPO MÍN. FLUXO ML/MIN % TAMPÃO A % TAMPÃO B 9 0,5 90 10 14,9 0,5 90 10 15 0,5 90 10
[690] Os resultados estão resumidos na Figura 6.
[691] Os compostos com pelo menos uma ligação internucleosídica fosforoditioato, de acordo com a invenção, têm uma resistência à nuclease superior à dos compostos apenas com ligações internucleosídicas de fosforotioato.
[692] Os compostos que possuem pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de acordo com a invenção têm uma resistência superior à nuclease do que os compostos que possuem apenas ligações internucleosídicas de fosforotioato.
EXEMPLO 7 GAPMERS MODIFICADOS POR DITIOATO: EXPLORANDO OS DITIOATOS NA REGIÃO GAP DE GAPMERS DE LNA.
[693] Compostos testados modificação única no gap #1 GCa*ttggtatTCA #5 GCattgg*tatTCA #2 GCat*tggtatTCA #6 GCattggt*atTCA #3 GCatt*ggtatTCA #7 GCattggta*tTCA #4 GCattg*gtatTCA #8 GCattggtat*TCA acúmulo na região gap ditioato nos flancos de LNA #9 GCattg*gt*atTCA #13 GC*attggtatTCA #10 GCattg*g*t*atTCA #14 GCattggtatT*CA #11 GCattg*g*t*at*TCA #15 GCattggtatTC*A #12 GCattg*g*t*a*t*TCA #16 GC*attggtatT*C*A Ref. GCattggtatTCA modificação única no gap Compostos #1 - #16 e Ref. têm o motivo de sequência mostrado na SEQ ID NO 1. Letras em maiúscula: nucleosídeo beta-D-oxi LNA; Letras em minúscula: nucleosídeo DNA; * = ligações modificadas com fosforoditioato aquiral; todas as outras ligações são ligações fosforotioato
[694] Experimental: Os compostos acima que visam o mRNA de ApoB, foram testados em hepatócitos primários de rato utilizando a captação gimnótica, com incubação durante 72 horas com uma concentração do composto de 2 μM. Os níveis de mRNA alvo foram então medidos usando RT- PCR. Os resultados são exibidos na Figura 7.
[695] Os resultados mostrados na figura 7 ilustram que os fosforoditioatos aquirais simples e múltiplos são acomodados nas regiões gap e de flanco. O uso de mais de 3 ou 4 fosforoditioatos aquirais na região gap pode tender a reduzir a potência em comparação com o uso de múltiplos fosforoditioatos aquirais na região do flanco.
EXEMPLO 8 DEPENDÊNCIA POSICIONAL SOBRE A ATIVIDADE - OTIMIZAÇÃO DO DESIGN
[696] Compostos testados 2 modificações #1 GCat*t*ggtatTCA #6 GCat*tggtat*TCA #2 GCattggt*at*TCA #7 GCa*ttggta*tTCA #3 GCat*tggt*atTCA #8 GCa*ttggtat*TCA #4 GCatt*ggt*atTCA #9 GCat*tggta*tTCA #5 GCatt*ggtat*TCA 3 modificações 4 modificações #10 GCat*tggt*at*TCA #15 GCat*t*ggt*at*TCA #11 GCat*t*ggtat*TCA #16 GCa*tt*gg*ta*tTCA #12 GCatt*ggta*t*TCA #13 GCat*t*ggt*atTCA
2 modificações #14 GCa*ttg*gta*tTCA Ref. GCattggtatTCA Os compostos #1 - #16 e Ref. têm o motivo de sequência mostrado na SEQ ID NO 1. Letra em maiúscula: nucleosídeo beta-D-oxi LNA; Letra em minúscula: nucleosídeo DNA * = ligações modificadas com fosforoditioato aquiral; todas as outras ligações são ligações fosforotioato
[697] Experimental: Os compostos acima que visam o mRNA de ApoB, foram testados em hepatócitos primários de rato utilizando a captação gimnótica, com incubação durante 72 horas com uma concentração do composto de 2 μM. Os níveis de mRNA alvo foram então medidos usando RT- PCR. Os resultados são exibidos na Figura 8.
EXEMPLO 9
CAPTAÇÃO CELULAR DE GAPMERS DE FOSFORODITIOATO AQUIRAL
[698] Compostos testados Modificação única no gap #1 GCa*ttggtatTCA #5 GCattgg*tatTCA #2 GCat*tggtatTCA #6 GCattggt*atTCA #3 GCatt*ggtatTCA #7 GCattggta*tTCA #4 GCattg*gtatTCA #8 GCattggtat*TCA Ref. GCattggtatTCA Os compostos #1 - #16 e Ref. têm o motivo de sequência mostrado na SEQ ID NO 1.
Letra em maiúscula: nucleosídeo beta-D-oxi LNA; Letra em minúscula: nucleosídeo DNA * = ligações modificadas com fosforoditioato aquiral; todas as outras ligações são ligações fosforotioato
[699] Experimental: Os compostos acima que visam o mRNA de ApoB, foram testados em hepatócitos primários de rato utilizando a captação gimnótica, com incubação durante 72 horas com uma concentração do composto de 2 μM. O teor de oligonucleotídeo foi determinado usando um ensaio ELISA baseado em hibridização. Os resultados são mostrados nas Figuras 9A e 9B.
[700] Sem exceção, a inclusão de um fosforoditioato aquiral fornecido aumentou a captação celular. No entanto, houve uma diversidade na melhora da captação, dependendo da posição da ligação do fosforoditioato aquiral.
EXEMPLO 10
CARGA CRESCENTE DE FOSFORODITIOATO AQUIRAL NA REGIÃO DE FLANCO DE UM GAPMER
[701] Compostos testados (motivo de sequência = SEQ ID NO 1) modificações nos flancos IC50 IC50 [nM] [nM] • GCattggtatTC*A 7,3 ▼ G*CattggtatT*C*A 9,2 ◼ G*CattggtatTCA 10,4 ♦ G*C*attggtatTC*A 8,9 ▲ G*CattggtatTC*A 6,8  G*C*attggtatT*C*A 4,9 Ref. GCattggtatTCA 33,3 Letra em maiúscula: nucleosídeo beta-D-oxi LNA; Letra em minúscula: nucleosídeo DNA * = ligações modificadas com fosforoditioato aquiral; todas as outras ligações são ligações fosforotioato
[702] Experimental: Os compostos acima que visam o mRNA de ApoB, foram testados em hepatócitos primários de rato utilizando a captação gimnótica, com incubação durante 72 horas com uma concentração do composto de 2 μM. Os níveis de mRNA alvo foram então medidos usando RT-
PCR. Os resultados são mostrados nas Figuras 10A e 10B.
[703] A introdução de modificações de fosforoditioato aquiral nas regiões de flanco dos gapmers proporcionou, sem exceção, um aumento pronunciado de potência, com uma redução de 3 - 7x no IC50. Curiosamente, um aumento no número de modificações de fosforoditioato quirais nos flancos resulta em um valor de IC50 inferior.
EXEMPLO 11
EFEITO DE LIGAÇÕES DE FOSFORODITIOATO AQUIRAL EM DIFERENTES TIPOS DE CÉLULAS, IN VITRO.
[704] Compostos testados (motivo de sequência = SEQ ID NO 3) modificação nos flancos #1 GAGttacttgccaAC*T #5 G*A*GttacttgccaAC*T #2 G*AGttacttgccaACT #6 G*A*GttacttgccaA*C*T #3 G*AGttacttgccaAC*T #7 G*A*G*ttacttgccaA*C*T #4 G*AGttacttgccaA*C*T Ref. GAGttacttgccaACT Letra em maiúscula: nucleosídeo beta-D-oxi LNA; Letra em minúscula: nucleosídeo DNA * = ligações modificadas com fosforoditioato aquiral; todas as outras ligações são ligações fosforotioato
[705] Os compostos acima que visam Malat-1 foram testados em três sistemas in vitro de células: células musculares esqueléticas humanas primárias, células epiteliais brônquicas humanas primárias e fibroblastos de camundongos (células LTK) utilizando a captação gimnótica durante 72 horas, em um intervalo de concentrações para determinar a potência do composto (IC50).
[706] Intervalo de concentração para células LTK: 50 µM,
diluição ½log, 8 concentrações.
[707] Os níveis de RNA de Malat1 foram quantificados usando qPCR (nível Normalizado por GAPDH) e os valores de IC50 foram determinados.
[708] Os resultados dos valores IC50 são exibidos na Figura 11. A introdução do fosforoditioato aquiral proporcionou uma potência aprimorada confiável nas células musculares esqueléticas e, em geral, proporcionou uma potência aprimorada aos fibroblastos de camundongos. O efeito nas células epiteliais brônquicas humanas foi mais composto-específico, no entanto, alguns compostos (#5) foram notavelmente mais potentes que o composto de referência.
EXEMPLO 12
ESTABILIDADE IN VITRO EM SORO DE RATO DOS OLIGONUCLEOTÍDEOS DE LNA PROTEGIDOS NA EXTREMIDADE 5’ E 3’ Compostos testados (motivo de sequência = SEQ ID NO 1) #1 Oligonucleotídeo DNA/PS #2 GCattggtatTCA #3 G*CattggtatTCA #4 GCattggtatTC*A #5 G*CattggtatTC*A #6 G*CattggtatT*C*A #7 G*C*attggtatTC*A #8 G*C*attggtatT*C*A Letra em maiúscula: nucleosídeo beta-D-oxi LNA; Letra em minúscula:
nucleosídeo DNA * = ligações modificadas com fosforoditioato aquiral; todas as outras ligações são ligações fosforotioato
[709] Experimental - consulte o Exemplo 5.
[710] Os resultados são exibidos na Figura 12. Identificamos que a extremidade 3’ dos oligonucleotídeos LNA de fosforotioato é mais suscetível às nucleases séricas do que se acreditava anteriormente e isso parece estar relacionado à quiralidade da(s) ligação(ões) de fosforotioato na extremidade 3' do oligonucleotídeo - conforme ilustrado pela rápida clivagem de 50% do oligonucleotídeo parental #1. A proteção da extremidade 5’ com um fosforoditioato aquiral proporcionou uma proteção aprimorada. A proteção da extremidade 3’ com um fosforoditioato aquiral forneceu proteção completa às exonucleases séricas de rato - a ligeira redução observada para os compostos #4 - #8 foi correlacionada à impureza de monotioato.
[711] A proteção de extremidade 5’ e/ou 3’ de oligonucleotídeos antissenso com as ligações de fosforotioato aquiral é, portanto, considerada uma solução para um grande problema de instabilidade com fosforotioatos estereoaleatórios e estereodefinidos.
EXEMPLO 13
AVALIAÇÃO IN VIVO DOS GAPMERS COM LIGAÇÕES FOSFORODITIOATO AQUIRAL NOS FLANCOS.
[712] Compostos testados (motivo de sequência = SEQ ID NO 1) #1 GCattggtatTC*A #2 G*CattggtatTCA #3 G*CattggtatTC*A #4 G*CattggtatT*C*A
#5 G*C*attggtatTC*A #6 G*C*attggtatT*C*A #7 G*C*attggtatT*C*A #8 GCat*tggt*at*TCA GCat*tggt*at*TCA #9 Ref. GCattggtatTCA Letra em maiúscula: nucleosídeo beta-D-oxi LNA; Letra em minúscula: nucleosídeo DNA * = ligações modificadas com fosforoditioato aquiral; todas as outras ligações são ligações fosforotioato. Deve-se observar que os nucleosídeos em negrito sublinhados estão ligados na posição 3’ por ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido. O composto #7 tem um motivo estereodefinido na região gap de SSRSSRSR (S = Sp, R = Rp). O motivo central do composto #9 = RRSPRSSPSPSS, em que S = Sp, R = Rp e P = ligação PS2 aquiral (*).
[713] Experimental: Os compostos que visam ApoB acima foram administrados a camundongos C57BL/6JBom fêmeas, utilizando doses i.v.
únicas de 1 mg/kg, e os camundongos foram sacrificados no dia 7, n = 5. A redução do mRNA no fígado foi medida usando RT-PCR e os resultados são mostrados na Figura 13.
[714] Os resultados mostram que, em geral, a introdução das ligações internucleosídicas de fosforoditioato aquiral fornece uma potência melhorada, notadamente todos os compostos com ligações fosforoditioato aquiral nas regiões de flanco mostram potência melhorada. Conforme ilustrado no experimento in vitro, o uso de múltiplas ligações de fosforoditioato na região de gap (#8) foi instalada sem uma perda notável de potência. É de particular interesse o efeito combinado de designs de gapmers com ligações de fosforotioato estereodefinido na região de gap, com ligações de fosforoditioato aquiral nos flancos, ilustrando uma sinergia na combinação dessas tecnologias de ligação com um oligonucleotídeo antissenso.
EXEMPLO 14
TEOR IN VIVO DE GAPMERS COM FOSFORODITIOATOS AQUIRAIS COM A REGIÃO DE FLANCO E DE GAP MODIFICADAS EM TECIDO HEPÁTICO
[715] Compostos e experimentos - consulte o Exemplo 13. Os resultados do teor tecidual (determinado por ELISA baseada em hibridização para medir o teor em amostras de fígado e rins a partir dos animais sacrificados) são mostrados nas Figuras 14A&B. Observe que houve um erro experimental para o composto n#1 - consulte os dados da Figura 14B.
[716] Resultados: Figura 14A. Todos os oligonucleotídeos antissenso que continham as ligações de fosforoditioato aquiral tinham uma maior captação/teor tecidual em comparação com o composto de referência. A Figura 14B mostra que a introdução da ligação de fosforoditioato aquiral melhorou a biodistribuição (tal como determinado pela razão fígado/rim) de todos os compostos testados.
EXEMPLO 15
ANÁLISE DE METABÓLITOS A PARTIR DE EXPERIMENTO IN VIVO
[717] Compostos e experimentos - consulte o Exemplo 13. A análise do metabolito foi realizada utilizando os métodos divulgados em C.
Husser et al., Anal. Chem. 2017, 89, 6821.
[718] Os resultados são exibidos na Figura 15. A modificação de fosforoditioato evita eficientemente a degradação 3'-exonucleolítica in vivo.
Ainda permanece alguma clivagem por endonuclease (observe que os compostos #1 - 6 testados têm regiões gap de fosforotioato de DNA, portanto, isso era esperado). Dada a notável proteção contra exonucleases, considera-
se que o uso de ligações de fosforoditioato aquiral dentro de oligonucleotídeos antissenso pode ser usado para prevenir ou limitar a clivagem por endonucleases. Espera-se que a resistência aumentada à nuclease dos fosforitioatos aquirais proporcione benefícios farmacológicos notáveis, como atividade aprimorada e duração prolongada da ação, e possivelmente a prevenção de produtos da degradação tóxicos.
EXEMPLO 16 IN VIVO - ATIVIDADE HEPÁTICA EM LONGO PRAZO (APOB)
[719] Compostos testados (motivo de sequência = SEQ ID NO 1) Ref. GCattggtatTCA #1 G*C*attggtatT*C*A #2 GCattggtatTCA #3 G*C*attggtatT*C*A Letra em maiúscula: nucleosídeo beta-D-oxi LNA; Letra em minúscula: nucleosídeo DNA * = ligações modificadas com fosforoditioato aquiral; todas as outras ligações são ligações fosforotioato. Deve-se observar que os nucleosídeos em negrito sublinhados estão ligados na posição 3’ por ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido. O composto #3 tem um motivo estereodefinido na região gap de SSRSSRSR (S = Sp, R = Rp). O motivo central do composto #2 = RRSSRSSRSRSS, em que S = Sp, R = Rp e P = ligação PS2 aquiral (*).
[720] Experimental: Como no exemplo 13, o sacrifício foi executado no dia 7 ou 21.
[721] Os resultados são exibidos na Figura 16. Comparado com o composto de referência de fosforotioato, a introdução do fosforoditioato aquiral proporciona uma duração de ação prolongada no fígado e isso foi correlacionado com um maior teor tecidual em 21 dias. De maneira notável, a combinação de regiões de flanco ligadas por fosforoditioato com ligações de fosforotioato estereodefinido na região gap proporcionou benefícios adicionais em relação à potência e duração de ação prolongada, enfatizando novamente a sinergia notável na combinação de ligações internucleosídicas de fosforoditioato aquiral com ligações de fosforotioato estereodefinido em oligonucleotídeos antissenso.
EXEMPLO 17
ESTUDO IN VIVO UTILIZANDO GAPMERS MODIFICADOS COM FOSFORODITIOATOS AQUIRAIS QUE VISAM MALAT-1
[722] Compostos testados (motivo de sequência = SEQ ID NO 3) Ref. GAGttacttgccaACT Carga de P2S aumentada nos flancos #1 G*AGttacttgccaACT #2 GAGttacttgccaAC*T #3 G*AGttacttgccaAC*T #4 G*AGttacttgccaA*C*T #5 G*A*GttacttgccaAC*T #6 G*A*GttacttgccaA*C*T #7 G*A*G*ttacttgccaA*C*T Letra em maiúscula: nucleosídeo beta-D-oxi LNA; Letra em minúscula: nucleosídeo DNA * = ligações modificadas com fosforoditioato aquiral; todas as outras ligações são ligações fosforotioato.
EXPERIMENTAL
[723] In vitro: células LTK de camundongo foram utilizadas para determinar a curva dose-resposta da concentração in vitro - medição da inibição do mRNA malat-1.
[724] In vivo: Os camundongos (C57/BL6) foram administrados com doses subcutâneas de 15 mg/kg do oligonucleotídeo em três doses no dia 1, 2 e 3 (n = 5). Os camundongos foram sacrificados no dia 8, e a redução do RNA MALAT-1 e o teor tecidual foram mensurados para fígado, coração, rim, baço e pulmão. Os compostos parentais foram administrados em duas doses 3 * 15 mg/kg e 3 * 30 mg/kg.
[725] Resultados: Os resultados in vitro são mostrados na Figura 17 - compostos com 1, 2, 3 e 4 fosforoditioatos aquirais nos flancos foram encontrados por serem altamente potentes nos ensaios in vitro. Verificou-se que o composto #7 com 5 fosforoditioatos aquirais nos flancos possui uma potência menor do que aqueles com 1 a 4 fosforoditioatos aquirais nos flancos.
Os compostos mais potentes #1, #2 e #6 foram selecionados para o estudo in vivo. Os resultados in vivo são mostrados na Figura 17B (coração) - que ilustra que os compostos de fosforoditioato aquiral eram cerca de duas vezes mais potentes no silenciamento gênico de MALAT-1 no coração do que o composto de referência. Notavelmente, a utilização da ligação internucleosídica de fosforoditioato aquiral entre os dois nucleosídeos terminais 3’ dos oligonucleotídeos antissenso proporcionou uma melhora acentuada em relação ao oligonucleotídeos equivalentes protegidos na extremidade 5'.
[726] A Figura 17C mostra os resultados da análise do teor tecidual do estudo in vivo. Todos os três oligonucleotídeos contendo as ligações internucleosídicas de fosforoditioato aquiral apresentaram maior teor tecidual no fígado. Os ditioatos resultam em teor semelhante ou superior no coração e no fígado, e menor teor no rim, ilustrando novamente superioridade sobre os oligonucleotídeos antissenso modificados com PS. Notavelmente, o teor tecidual no coração foi maior para o composto 1, o que indica que a potência in vivo melhorada pode não ser uma consequência do teor tecidual, mas um atividade específica maior.
EXEMPLO 18
MODIFICAÇÕES COM MONOFOSFOTIOATO AQUIRAL TESTADAS NÃO FORNECEM AS VANTAGENS TRANSPORTÁVEIS OBSERVADAS COM LIGAÇÕES DE FOSFORODITIOATO AQUIRAL.
[727] Compostos testados (motivo de sequência = SEQ ID NO 1) #1 GCa◼ttggtatTCA #9 GC†attggtatTCA #2 GCat◼tggtatTCA #10 GCa†ttggtatTCA #3 GCatt◼ggtatTCA #11 GCat†tggtatTCA #4 GCattg◼gtatTCA #12 GCatt†ggtatTCA #5 GCattgg◼tatTCA #13 GCattg†gtatTCA #6 GCattggt◼atTCA #14 GCattgg†tatTCA #7 GCattggta◼tTCA #15 GCattggt†atTCA #8 GCattggtat◼TCA #16 GCattggta†tTCA Ref. GCattggtatTCA Letra em maiúscula: nucleosídeo beta-D-oxi LNA; Letra em minúscula: nucleosídeo DNA ◼ = ligação de 3'-S fosforotioato, todas as outras ligações são fosforotioato. † = ligação de 5'-S fosforotioato, todas as outras ligações são fosforotioato.
[728] Neste estudo nós sintetizados uma série de oligonucleotídeos gapmers com fosforotioatos 3- ou 5'-S modificados direcionados para a ApoB - o posicionamento do enxofre nas ligações na estrutura central resulta em uma ligação internucleosídica aquiral. Para métodos de síntese, consulte o documento WO2018/019799.
[729] Os compostos foram testados in vitro conforme descrito anteriormente - por exemplo, vide o Exemplo 8.
[730] Os resultados são mostrados na Figura 18A: Os resultados mostram que, em geral, os monofosfotioatos aquirais eram prejudiciais à potência dos compostos, embora em alguns casos os compostos retivessem a potência. Isso parece estar correlacionado com o conteúdo celular (Figura 18B).
EXEMPLO 19
MODIFICAÇÕES COM FOSFORODITIOATO QUIRAL PODEM FORNECER BENEFÍCIOS PARA OLIGONUCLEOTÍDEOS GAPMERS ANTISSENSO.
[731] Compostos testados (motivo de sequência = SEQ ID NO 1) #1 GCa♦ttggtatTCA #2 GCat♦tggtatTCA #3 GCatt♦ggtatTCA #4 GCattg♦gtatTCA #5 GCattgg♦tatTCA #6 GCattggt♦atTCA #7 GCattggta♦tTCA #8 GCattggtat♦TCA Ref. GCattggtatTCA Letra em maiúscula: nucleosídeo beta-D-oxi LNA; Letra em minúscula: nucleosídeo DNA ♦ = ligação de fosforoditioato quiral, todas as outras ligações são fosforotioato.
[732] Neste estudo nós sintetizados uma série de oligonucleotídeos gapmers com fosforoditioatos quirais estereoaleatórios direcionados para a ApoB - o posicionamento do enxofre nas ligações da estrutura central resulta em uma ligação internucleosídica quiral.
[733] Os compostos foram testados in vitro conforme descrito anteriormente - por exemplo, vide o Exemplo 8.
[734] Os resultados são mostrados na Figura 19A: Os resultados mostram que em algumas posições os compostos de fosforoditioato quiral eram tão potentes quanto o composto de referência, indicando que o fosforoditioato quiral não era incompatível com a funcionalidade antissenso - entretanto, o benefício era composto-específico (ou seja, não parece ser transportável). Um quadro semelhante é observado no que diz respeito à captação celular (Figura 19B), embora não parece haver uma correlação entre a atividade antissenso e a captação celular.
EXEMPLO 20
ESTUDO IN VIVO UTILIZANDO GAPMERS MODIFICADOS COM FOSFORODITIOATOS AQUIRAIS QUE VISAM HTRA-1
[735] Compostos testados.
[736] Todos os compostos tem a sequência: TATttacctggtTGTT (SEQ ID NO 4), em que as letras maiúsculas são nucleosídeos beta-D-oxi LNA, as letras minúsculas são nucleosídeos de DNA. Na tabela a seguir, o motivo de estrutura principal representa o padrão de modificações na estrutura principal para cada ligação internucleosídica iniciando na ligação entre o dinucleotídeo 5’ e terminando com a ligação internucleosídica entre o dinucleotídeo 3' (da esquerda para a direita). X = ligação internucleosídica de fosforotioato estereoaleatório, P = fosforoditioato aquiral (*), S = ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido Sp, R = ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido Rp. Htra1#Parental TATttacctggtTGTT XXXXXXXXXXXXXXX Htra1#1 TATttacctggtTGTT XXXPXXXXXXXXXXX Htra1#2 TATttacctggtTGTT XXXXPXXXXXXXXXX
Htra1#3 TATttacctggtTGTT XXXXXPXXXXXXXXX Htra1#4 TATttacctggtTGTT XXXXXXPXXXXXXXX Htra1#5 TATttacctggtTGTT XXXXXXXPXXXXXXX Htra1#6 TATttacctggtTGTT XXXXXXXXPXXXXXX Htra1#7 TATttacctggtTGTT XXXXXXXXXPXXXXX Htra1#8 TATttacctggtTGTT XXXXXXXXXXPXXXX Htra1#9 TATttacctggtTGTT XXXXXXXXXXXPXXX Htra1#10 TATttacctggtTGTT XXXXPPPPXXXXXXX Htra1#11 TATttacctggtTGTT XXXXXXPPPPXXXXX Htra1#12 TATttacctggtTGTT XXXXXXXXPPPPXXX Htra1#13 TATttacctggtTGTT PSRRRSSSRRRRRRP Htra1#14 TATttacctggtTGTT PSRRRSSSRRRRPXP Htra1#15 TATttacctggtTGTT PRRRRSSSSRRRRSP Htra1#16 TATttacctggtTGTT PRRRRSSSSRRRRSS Htra1#17 TATttacctggtTGTT RRRRRSSSSRRRRSP Htra1#18 TATttacctggtTGTT PXPRRSSSSRRRPXP Htra1#19 TATttacctggtTGTT PXXRRSSSSRRRXXP Htra1#20 TATttacctggtTGTT PXXXXXXXXXXXXXX Htra1#21 TATttacctggtTGTT XXPXXXXXXXXXXXX Htra1#22 TATttacctggtTGTT XXXXXXXXXXXXPXX Htra1#23 TATttacctggtTGTT XXXXXXXXXXXXXXP Htra1#24 TATttacctggtTGTT PXXXXXXXXXXXXXP Htra1#25 TATttacctggtTGTT PXPXXXXXXXXXPXP Htra1#26 TATttacctggtTGTT XPXXXXXXXXXXXXX Htra1#27 TATttacctggtTGTT PPPXXXXXXXXXPXP Htra1#28 TATttacctggtTGTT PXXXXXXXXXXXXPP Htra1#29 TATttacctggtTGTT PPXXXXXXXXXXXXP Htra1#30 TATttacctggtTGTT PPXXXXXXXXXXXPP Htra1#31 TATttacctggtTGTT PPXXXXXXXXXXPPP Htra1#32 TATttacctggtTGTT PPPXXXXXXXXXXPP Htra1#33 TATttacctggtTGTT PPPXXXXXXXXXPPP Htra1#34 TATttacctggtTGTT PSPRRSSSSRRRPRP Htra1#35 TATttacctggtTGTT PSPRRSSSSRRRPSP Htra1#36 TATttacctggtTGTT PRPRRSSSSRRRPSP Htra1#37 TATttacctggtTGTT PRPRRSSSSRRRPRP
Htra1#38 TATttacctggtTGTT PPPRRSSSSRRRPPP
EXPERIMENTAL
[737] A linhagem de células de glioblastoma U251 foi adquirida da ECACC e as céluals foram mantidas como recomendado pelo fornecedor, em uma estufa umidificada a 37ºC com 5% de CO 2. Para os ensaios, 15000 células U251/poço foram semeadas em uma placa de 96 poços em meio de inanição (meio recomendado pelo fornecedor, com exceção de 1% de SBF em vez de 10%). As células foram incubadas por 24 horas antes da adição de oligonucleotídeos dissolvidos em PBS. Concentração de oligonucleotídeos: 5,1 e 0,2 µM. 4 dias após a adição de oligonucleotídeos, as células foram coletadas. O RNA foi extraído usando o kit de purificação de RNA PureLink Pro 96 RNA Purification (Ambion, de acordo com as instruções do fabricante). O cDNA foi então sintetizado usando a transcriptase reversa M-MLT Reverse Transcriptase, decâmetros aleatórios RETROscript, inibidor de RNase (Ambion, de acordo com as instruções do fabricante) com 100mM de dNTP definido com grau PCR (Invitrogen) e DNase/RNase Water (Gibco). Para a análise de expressões gênicas ou foi realizada uma qPCR usando o TagMan Fast Advanced Master Mix (2X) (Ambion) em uma configuração de duplexo. Os iniciadores TaqMan a seguir foram utilizados para a qPCR: HTRA1, Hs01016151_m1 (FAM-MGB) e gene housekeeping, TBP, Hs 4326322E (VIC- MGB) da Life Technologies. As determinações de EC50 foram realizadas utilizando o programa estatístico Graph Pad Prism6. O nível de expressão relativo de mRNA de HTRA1 na tabela é mostrado como % do controle (células tratadas com PBS).
[738] Resultados: Potência Nível de mRNA remanescente em doses variadas Eficácia máxima 5 µM 1 µM 0,2 µM 1 µM EC50 [µM] nível de mRNA [% do contr.] Htra1#Parental 18 38 116 58 1,16 5,9
Potência Nível de mRNA remanescente em doses variadas Eficácia máxima
5 µM 1 µM 0,2 µM 1 µM EC50 [µM] nível de mRNA [% do contr.]
Htra1#1 34
Htra1#2 50
Htra1#3 28
Htra1#4 44
Htra1#5 39
Htra1#6 47
Htra1#7 41
Htra1#8 44
Htra1#9 47
Htra1#10 36
Htra1#11 53
Htra1#12 36
Htra1#13 11 57 97
Htra1#14 3 18 83
Htra1#15 3 18 85
Htra1#16 4 24 85
Htra1#17 3 19 108
Htra1#18 2 10 76 0,15 4,0
Htra1#19 4 35 90 0,44 3,7
Htra1#20 25 87 96 57
Htra1#21 22 73 78
Htra1#22 24 100
Htra1#23 20 50 117 53 0,91 9,0
Htra1#24 5 51 136 44
Htra1#25 3 27 69
Htra1#26 27 72 93
Htra1#27 7 30 99 0,35 4,7
Htra1#28 67
Htra1#29 55
Htra1#30 56
Htra1#31 54
Htra1#32 61
Htra1#33 54
Potência Nível de mRNA remanescente em doses variadas Eficácia máxima 5 µM 1 µM 0,2 µM 1 µM EC50 [µM] nível de mRNA [% do contr.] Htra1#34 54 0,78 5,1 Htra1#35 20 0,17 3,6 Htra1#36 15 0,13 3,1 Htra1#37 42 0,69 3,9 Htra1#38 24 0,23 4,2 EXEMPLO 21 PS2 WALK EM UM MIXMER DE LNA VISANDO O TNFRSF1B COM SALTO NO ÉXON 7
[739] Nós identificamos anteriormente que o salto do éxon 7 no TNFRSF1B usando um mixmer (com 13'mer) SSO #26 - é altamente eficaz em alvejar ao sítio de splicing 3' do íntron 6 - éxon 7 do TNFRSF1B (consulte o documento WO2008131807 e WO2007058894 para informações de referência).
[740] Este experimento foi estabelecido para determinar se a presença de ligações de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (PS2) podem ser úteis em ainda aumentar a atividade de modulação do splicing de oligonucleotídeos alteradores do splicing. Para determinar o efeito, introduzimos ligações de fosforoditioatos de fórmula (IA) ou (IB) em diferentes posições do oligonucleotídeo parental SSO #26 e sintetizamos os seguintes compostos (Tabela abaixo).
[741] Compostos testados: Oligonucleotídeos modificado com ditioato do oligonucleotídeo parental (SSO #26). As ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula ((IA) ou (IB)) foram introduzidas nas posições marcadas com *, todas as outras ligações internucleosídicas são ligações internucleosídicas de fosforotioato (estereoaleatórias), as letras maiúsculas representam nucleosídeos beta-D-oxi LNA e LNA C são 5-metil-citosina, as letras minúsculas representam nucleosídeos de DNA.
Compostos (Motivo de Sequência = SEQ ID NO 5) Compostos SSO#1 CAaT*cAG*tcCtA*G SSO#14 CAaTcAGtcCt*AG SSO#2 CAaTcAG*tcCtA*G SSO#15 CAaTcAGtcCtA*G SSO#3 C*AaTcAGtcC*tAG SSO#16 C*A*aT*cA*G*tcC*tA*G SSO#4 C*AaTcAGtcCtAG SSO#17 C*AaT*cAG*tcC*tA*G SSO#5 CA*aTcAGtcCtAG SSO#18 C*A*aTc*A*GtcCt*A*G SSO#6 CAa*TcAGtcCtAG SSO#19 C*A*aTcAG*t*cCt*A*G SSO#7 CAaT*cAGtcCtAG SSO#20 C*A*a*T*cA*G*t*cCtAG SSO#8 CAaTc*AGtcCtAG SSO#21 CAaTcA*G*t*cCt*A*G SSO#9 CAaTcA*GtcCtAG SSO#22 CAa*Tc*AGt*c*Ct*AG SSO#10 CAaTcAG*tcCtAG SSO#23 CAa*Tc*AGt*cCt*AG SSO#11 CAaTcAGt*cCtAG SSO#24 CAa*TcAGt*c*Ct*AG SSO#12 CAaTcAGtc*CtAG SSO#25 CAa*Tc*AGtc*CtAG SSO#13 CAaTcAGtcC*tAG SSO#26 CAaTcAGtcCtAG
EXPERIMENTAL
[742] A captação de oligonucleotídeo e o salto do éxon em células Colo 205 (adenocarcinoma colorretal humano) foram analisados por captação gimnótica em duas concentrações diferentes (5 µM e 25 µM). As células foram semeadas em placas de 96 poços (25.000 células por poço) e o oligonucleotídeo foi adicionado. Três dias após a adição dos oligonucleotídeos, o RNA total foi isolado a partir de placas de 96 poços usando configuração Qiagen. A porcentagem de alteração do splicing foi analisada por PCR digital em gotas (BioRad) com uma sonda marcada com FAM que abrange a junção do éxon 6–8 (salto do éxon 7) e a quantidade total de TNFRSF1B (tipo selvagem e com salto no éxon 7) foi analisada com uma sonda marcada com HEX e iniciadores IDT abrangendo o éxon 2-3. A presença de uma ligação de fosforoditioato tem um efeito sobre a capacidade de um oligonucleotídeo de introduzir o salto do éxon (Figura 20). A 5 µM, o oligonucleotídeo PS2 mais potente aumenta o salto do éxon em mais de duas vezes, onde o oligo parental (SSO #26) mostra aproximadamente 10% de salto do éxon, SSO #25 mostra mais de 20% de salto do éxon 7. A 25 µM, o oligonucleotídeo mais potente atinge mais de 60% de salto do éxon (SSO #7), novamente mais de 2 vezes melhor que o oligo parental. O oligonucleotídeo SSO #22, no qual todos os nucleotídeos de DNA têm uma modificação de ditioato (PS2) em vez da modificação de fosforotioato (PS) mostra atividade aumentada, em comparação com o oligonucleotídeo parental, e é o terceiro oligonucleotídeo mais potente a 5 µM e o segundo oligonucleotídeo mais potente na alteração/comutação do splicing a 25 µM (Figura 20). A troca de todas as ligações entre os nucleosídeos LNA com uma ligação PS2 (SSO #16), no entanto, reduziu a potência de alteração do splicing em comparação com o oligonucleotídeo parental (Figura 20). Além disso, fica claro que a introdução de PS2 em determinadas posições pode não ser benéfica para a atividade de saltar o éxon e a 5 µM, SSO#1, SSO#9, SSO#11, SSO#12 e SSO#14 não mostram significância na atividade de alteração do splicing na concentração mais baixa, mas todos foram eficazes na concentração mais elevada (Figura 20). Estes exemplos ilustram que a ligação PS2 é compatível com oligonucleotídeos moduladores de splicing e enfatiza ainda um benefício claro na introdução de ligações PS2 adjacentes aos nucleosídeos de DNA ou entre nucleosídeos de DNA adjacentes, dentro do oligonucleotídeo mixmer, como mixmer de LNA - esses designs foram notavelmente mais eficazes em modular o mecanismo de splicing.
[743] Materiais e Métodos.
[744] Um ensaio para detectar TNFRSF1B com salto no éxon 7 por PCR digital em gotas: Sequência direta (Forward): CAACTCCAGAACCCAGCACT (SEQ ID NO 6) Sequência reversa (Reverse): CTTATCGGCAGGCAAGTGAG (SEQ ID NO 7)
Sequência da sonda: GCACAAGGGCTTCTCAACTGGAAGAG (SEQ ID NO 8) Fluoróforo: FAM.
[745] Ensaio para detectar a quantidade total de TNFRSF1B.
[746] Ensaio IDT Hs.PT.58.40638488 abrangendo éxons 2-3.
EXEMPLO 22
ESTABILIDADE DOS OLIGOS MIXMER CONTENDO MODIFICAÇÕES DE FOSFORODITIOATOS
[747] Os três oligonucleotídeos modificados com ditioato do oligonucleotídeo parental (SSO # 26) foram selecionados para o ensaio de estabilidade usando nuclease S1 (Tabela 2). Os oligonucleotídeos selecionados foram incubados a 37ºC a 25 µM por 30 min ou 2 h em 100 µL de tampão de reação contendo 1x tampão de Nuclease S1 e 10U de nuclease S1 de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Catálogo nº. 18001- 016). A reação de nuclease S1 foi interrompida pela adição de 2 µL de solução de EDTA 500 mM à mistura de reação de 100 µL. Diluiu-se 2,5 µL da mistura da reação em tampão de amostra Novex® TBE-Ureia 2x (LC6876 Invitrogen) e a mistura foi carregada em géis Novex® 15% TBE-Ureia (EC6885BOX, Invitrogen). Os géis foram corridos por aproximadamente 1 hora a 180 V, depois as imagens dos géis foram adquiridas com coloração SYBR gold (S11494, Invitrogen) e o sistema ChemiDoc® Touch Imaging System (BIO- RAD).
[748] A estabilidade dos oligonucleotídeos contendo PS2 foi testada com 30 e 120 minutos de incubação da nuclease S1. A posição da ligação PS2 está influenciando a estabilidade, e a presença de um PS2 3’ em um nucleotídeo de DNA (SSO #14) tem o maior impacto (Figura 21). Após 30 minutos de incubação com nuclease S1, o oligonucleotídeo parental está quase degradado, enquanto os oligos modificados com PS2 mostram uma banda forte representando o 13'mer. Além disso, o SSO#14 mostra bandas mais fortes que representam produtos de degradação, indicando uma estabilização do oligo remanescente, mesmo após a clivagem inicial pela nuclease S1 (Figura 21, pista 5+9).
[749] Estes dados ilustram que a presença de um fosforoditioato quando introduzido em oligonucleotídeos, tais como oligonucleotídeos mixmer, fornece proteção contra a atividade de endonucleases - e surpreendentemente isto é alcançado enquanto se mantém a eficácia dos oligonucleotídeos, de fato, tal como mostrado nos presentes experimentos, a atividade de modulação do splicing pode ser notavelmente melhorada. Considera-se que as ligações PS2 adjacentes aos nucleosídeos de DNA, ou entre nucleosídeos de DNA, em um oligonucleotídeo mixmer, ilustrado na presente invenção por mixmers compreendendo nucleosídeos de LNA e DNA, aumentam a estabilidade para endonuclease. Para uso em oligonucleotídeos antissenso, tal como mixmer (SSOs ou antimiRs, por exemplo), considera-se, portanto, que o uso de ligações PS2 entre nucleosídeos de DNA contíguos é benéfico. Tais benefícios também podem ser proporcionados usando uma ligação PS2 5’ ou 3' adjacente a um nucleosídeo de DNA que é flanqueado 5’ ou 3' (respectivamente) por um nucleosídeo modificado no açúcar 2', tal como LNA ou MOE.
[750] A invenção, portanto, fornece adicionalmente oligonucleotídeos antissenso aprimorados para uso em mecanismos baseados em ocupação, tal como modulação de splicing ou para inibição de microRNA.

Claims (67)

REIVINDICAÇÕES
1. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER ANTISSENSO, para inibição de um RNA alvo em uma célula, caracterizado pelo oligonucleotídeo gapmer antissenso compreender pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) (IA) (IB) em que em (IA) R é hidrogênio ou um grupo protetor fosfato, e em (IB) M+ é um cátion, tal como um cátion metálico, tal como um cátion de metal alcalino, tal como um cátion Na+ ou K+; ou M+ é um cátion de amônio.
2. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER ANTISSENSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato ser de fórmula (IA), e em que R é hidrogênio; ou pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato é de fórmula (IB), e M+ é Na+, K+ ou NH4+.
3. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por um dos dois átomos de oxigênio da referida pelo menos uma ligação internucleosídica de fórmula (I) estar ligado ao átomo de carbono 3’ de um nucleosídeo adjacente (A 1) e o outro estar ligado ao átomo de carbono 5’ de outro nucleosídeo (A 2), em que pelo menos um dos dois nucleosídeos (A1) e (A2) é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado.
4. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por um dentre (A1) e (A2) ser um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado e o outro ser um nucleosídeo de
DNA.
5. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por (A1) e (A2) serem ao mesmo tempo nucleosídeos 2’-modificados.
6. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por (A1) e (A2) serem ao mesmo tempo nucleosídeos de DNA.
7. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por pelo oligonucleotídeo gapmer compreender uma sequência nucleotídica contígua de fórmula 5’-F-G- F’-3’, em que G é uma região de 5 a 18 nucleosídeos que é capaz de recrutar RNase-H, e a referida região G é flanqueada 5’ e 3’ por regiões flanqueadoras F e F’, respectivamente, em que as regiões F e F’ compreendem ou consistem independentemente de 1 a 7 nucleotídeos com açúcar 2’-modificado, em que o nucleosídeo de região F que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado e em que o nucleosídeo da região F’ que é adjacente à região G é um nucleosídeo com açúcar 2’-modificado.
8. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelos nucleosídeos açúcar 2’- modificados serem independentemente selecionados a partir de 2’-alcóxi-RNA, 2’-alcóxi-alcóxi-RNA, 2’-amino-DNA, 2’-flúor-RNA, 2’-flúor-ANA e Nucleosídeos de LNA.
9. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo 2’-alcoxi-alcoxi-RNA ser um 2’-metoxietoxi- RNA (2’-O-MOE).
10. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 8, caracterizado pela região F e região F’ compreenderem ou consistirem de nucleotídeos 2’-metoxietoxi-RNA.
11. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 10, caracterizado por pelo menos um ou todos os nucleosídeos açúcar 2’-modificados na região F ou região F’, ou em ambas as regiões F e F’, serem nucleosídeos de LNA.
12. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 11, caracterizado pela região F ou região F’, ou ambas as regiões F e F’, compreenderem pelo menos um nucleosídeo de LNA e pelo menos um nucleosídeo de DNA.
13. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 12, caracterizado pela região F ou região F’, ou ambas as regiões F e F’ compreenderem pelo menos um nucleosídeo de LNA e pelo menos um nucleosídeo não LNA com açúcar 2’-modificado, tal como pelo menos um nucleosídeo 2’-metoxietoxi-RNA.
14. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pela região gap compreender de 5 a 16, em particular de 8 a 16, mais particularmente 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 nucleosídeos de DNA contíguos.
15. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelas regiões F e F’ serem independentemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 nucleosídeos de comprimento.
16. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado por cada região F e região F’ compreender independentemente 1, 2, 3 ou 4 nucleosídeos de LNA.
17. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 16, caracterizado pelos nucleosídeos de LNA serem independentemente selecionados a partir de beta-D-oxi LNA, 6’-metil- beta-D-oxi LNA e ENA.
18. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 18, caracterizado pelos nucleosídeos de LNA serem beta-D-oxi LNA.
19. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado pelo oligonucleotídeo, ou sequência nucleotídica contígua do mesmo (F-G-F’), ser de 10 a 30 nucleotídeos de comprimento, em particular de 12 a 22, mais particularmente de 14 a 20 oligonucleotídeos de comprimento.
20. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado por pelo menos uma das regiões flanqueadoras, tal como a região F e F’, compreender uma ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19.
21. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado por ambas as regiões flanqueadoras, tais como as regiões F e F’, compreenderem uma ligação de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19.
22. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizado por pelo menos uma das regiões flanqueadoras, como F ou F’, compreenderem pelo menos duas ligações de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19.
23. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, caracterizado por ambas as regiões flanqueadoras, F e F’, compreenderem pelo menos duas ligações de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19.
24. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 23, caracterizado por uma ou ambas as regiões flanqueadoras compreenderem um nucleosídeo de LNA que possui uma ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) que liga um LNA a um nucleosídeo 3’.
25. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 24, caracterizado por uma ou ambas as regiões flanqueadoras compreenderem dois ou mais nucleosídeos adjacentes de LNA que são ligados por ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) que liga um LNA a um nucleosídeo 3’.
26. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 25, caracterizado por cada uma ou ambas as regiões flanqueadoras compreenderem um nucleosídeo MOE que possui uma ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) que liga o MOE a um nucleosídeo 3’.
27. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 26, caracterizado por uma ou ambas as regiões flanqueadoras compreenderem dois ou mais nucleosídeos MOE adjacentes que são ligados por ligação fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) que liga o MOE a um nucleosídeo 3’.
28. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 27, caracterizado pelas regiões flanqueadoras, F e F’, compreenderem juntas 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), e em que opcionalmente, uma ligação internucleosídica entre o nucleosídeo mais a 3’ da região F e o nucleosídeo mais a 5’ da região G também é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB).
29. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 21, caracterizado por compreender uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) posicionada entre os nucleosídeos adjacentes na região F ou região F’, entre a região F e a região G ou entre a região G e a região F’.
30. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 29, caracterizado pela região gap compreender 1, 2, 3 ou 4 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), em que as ligações internucleosídicas remanescentes são ligações internucleosídicas de fosforotioato.
31. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 30, caracterizado pela região gap compreender uma região de pelo menos 5 nucleotídeos de DNA contíguos, tal como uma região de 6 a 18 nucleotídeos de DNA contíguos, ou de 8 a 14 nucleotídeos de DNA contíguos.
32. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 31, caracterizado por compreender ainda uma ou mais ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido (Sp, S) ou (Rp, R) em que N1 e N2 são nucleosídeos.
33. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo gapmer compreender pelo menos uma ligação internucleosídica estereodefinida (Sp, S) ou (Rp, R) entre dois nucleosídeos de DNA, tal como entre dois nucleosídeos de DNA na região gap.
34. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pela região gap compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas Rp e Sp.
35. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 32 a 33, caracterizado pela região G compreender ainda pelo menos 2, 3, ou 4 ligações internucleosídicas de fórmula IB.
36. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 32 a 35, caracterizado por (i) todas as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G (ou seja, entre o nucleosídeo na região G) serem ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas Rp e Sp, ou (ii) todas as ligações internucleosídicas dentro da região G serem ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas Rp e Sp.
37. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 35, caracterizado por todas as ligações internucleosídicas dentro das regiões flanqueadoras serem ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), em que, opcionalmente, uma ligação internucleosídica entre o nucleosídeo mais a 3’ da região F e o nucleosídeo mais a 5’ da região G também é uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB), e uma ligação internucleosídica entre o nucleosídeo mais a 3’ da região G e nucleosídeo mais a 5’ da região F’ é uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido.
38. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 37, caracterizado pelas ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G serem independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido na reivindicação 1.
39. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 38, caracterizado pelas ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreenderem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido na reivindicação 1, em particular 0 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I).
40. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 39, caracterizado pelas ligações internucleosídicas remanescentes serem independentemente selecionadas a partir do grupo que consiste em fosforotioato, fosfodiéster e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido na reivindicação 1.
41. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 40, caracterizado pelas ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos de região F e as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região F’ serem independentemente selecionadas a partir de fosforotioato e ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido na reivindicação 1.
42. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 41, caracterizado por cada região flanqueadora, F e F’, compreender independentemente 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido na reivindicação 1.
43. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 42, caracterizado por todas as ligações internucleosídicas de regiões flanqueadoras F e/ou F’ serem ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido na reivindicação 1.
44. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 43, caracterizado pelo oligonucleotídeo gapmer compreender pelo menos uma ligação internucleosídica estereodefinida, tal como pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforotioato estereodefinido.
45. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 44, caracterizado pela região gap compreender 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido.
46. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 45, caracterizado por todas as ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região gap serem ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido.
47. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 46, caracterizado por pelo menos uma ligação internucleosídica de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) estar posicionada entre os nucleosídeos da região F, ou entre os nucleosídeos da região F’, ou entre a região F e a região G, ou entre a região G e a região F’, e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região F e F’, entre a região F e a região G e entre a região G e a região F’, são independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, ligações internucleosídicas estereoaleatórias, ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB) e ligações internucleosídicas de fosfodiéster.
48. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelas ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região F, dentro da região F’ ou dentro de ambas as regiões, F e F’, serem todas ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (IA) ou (IB).
49. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 48, caracterizado pelas ligações internucleosídicas entre os nucleosídeos da região G compreenderem 0, 1, 2 ou 3 ligações internucleosídicas de fosforoditioato de fórmula (I) conforme definido no exemplo de realização 1 e as ligações internucleosídicas remanescentes dentro da região G serem independentemente selecionadas a partir de ligações internucleosídicas de fosforotioato estereodefinido, ligações internucleosídicas estereoaleatórias e ligações internucleosídicas de fosfodiéster.
50. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 49, caracterizado pelo nucleosídeo 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso ser um nucleosídeo de LNA ou um nucleosídeo 2’-O-MOE.
51. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 50, caracterizado pelo nucleosídeo 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso ser um nucleosídeo de LNA ou um nucleosídeo 2’-O-MOE.
52. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 51, caracterizado pelos dois nucleosídeos mais na extremidade 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso serrem independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
53. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 52, caracterizado pelos dois nucleosídeos mais na extremidade 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso serrem independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
54. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 53, caracterizado pelos três nucleosídeos mais na extremidade 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso serem independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
55. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 54, caracterizado pelos três nucleosídeos mais na extremidade 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso serem independentemente selecionados a partir de nucleosídeos de LNA e nucleosídeos 2’-O-MOE.
56. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 55, caracterizado pelos dois nucleosídeos mais na extremidade 3’-terminal do oligonucleotídeo antissenso serem nucleosídeos de LNA.
57. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 55, caracterizado pelos dois nucleosídeos mais na extremidade 5’-terminal do oligonucleotídeo antissenso serem nucleosídeos de LNA.
58. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 57, caracterizado pelo nucleosídeo (A 2) de fórmula (IA) ou (IB) ser o nucleosídeo 3’-terminal do oligonucleotídeo.
59. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 58, caracterizado pelo nucleosídeo (A 1) de fórmula (IA) ou (IB) ser o nucleosídeo 5’-terminal do oligonucleotídeo.
60. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 59, caracterizado pelo oligonucleotídeo gapmer compreender uma sequência nucleotídica contígua de fórmula 5’-D’-F-G-F’-D’’- 3’, em que F, G e F’ são conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 47; e cada região D’ e D’’ consiste independentemente de 0 a 5 nucleotídeos, em particular 2, 3 ou 4 nucleotídeos, particularmente nucleotídeos de DNA tal como nucleosídeos de DNA ligados com fosfodiéster [um oligonucleotídeo que compreende o oligonucleotídeo gapmer e uma sequência flanqueadora].
61. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60, caracterizado pelo oligonucleotídeo gapmer ser capaz de recrutar a RNase-H1 humana.
62. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 61, caracterizado pelo oligonucleotídeo gapmer ser para a inibição in vitro ou in vivo de um mRNA ou pré-mRNA alvo de mamífero, tal como humano, ou um RNA alvo viral, ou RNA não codificante longo.
63. SAL FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEL DE UM OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 62, caracterizado por, em particular um sal de sódio ou de potássio.
64. CONJUGADO, caracterizado por compreender um oligonucleotídeo gapmer ou um sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 63 e pelo menos uma porção de conjugado covalentemente ligada ao referido oligonucleotídeo ou referido sal farmaceuticamente aceitável, opcionalmente por uma porção ligante.
65. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um oligonucleotídeo gapmer, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 64 e um veículo terapeuticamente inerte.
66. OLIGONUCLEOTÍDEO GAPMER, sal farmaceuticamente aceitável ou conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 65, caracterizado por ser para uso como substância terapeuticamente ativa.
67. A INVENÇÃO caracterizada por, conforme descrito anteriormente no presente pedido.
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