JP6231029B2 - マイクロmir - Google Patents
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Description
本発明は、インビボでマイクロRNAをターゲットとし、それを阻害する、極めて短いオリゴヌクレオチド、ならびに医薬および医薬組成物におけるそれらの使用に関する。
マイクロRNA(miRNA)は、そのターゲットmRNAとの塩基対形成によって遺伝子発現の転写後調節因子として作用する、豊富に存在する一群の短い内在性RNAである。これらは、プレ-miRNAと呼ばれる、より長い(約70〜80ntの)ヘアピン様前駆体から、RNAse III酵素ダイサー(Dicer)によってプロセシングされる。マイクロRNAはmiRNPと呼ばれるリボ核タンパク質複合体に組み立てられ、そのターゲット部位をアンチセンス相補性によって認識することにより、そのターゲット遺伝子のダウンレギュレーションを媒介する。miRNAとそのターゲット部位の間のほぼ完全なまたは完全な相補性が、ターゲットmRNAの切断をもたらすのに対し、マイクロRNAとターゲット部位の間の限定された相補性は、ターゲット遺伝子の翻訳阻害をもたらす。
本願は次に挙げる4つの出願に基づく優先権を主張する:US 60/977497(出願日2007年10月4日)、US 60/979217(出願日2007年10月11日)、US 61/028062(出願日2008年2月12日)、およびEP08104780(出願日2008年7月17日)(これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる)。さらにまた、我々は、同じ出願人による先の出願であるWO2007/112754およびWO2007/112753を参照し、それらを参照により本明細書に組み込む。
本発明は、マイクロRNAをターゲットとし、かつLNAヌクレオチドなどのヌクレオチド類似ヌクレオチド(nucleotide analogue nucleotide)の比率が高い、極めて短いオリゴヌクレオチドの使用が、インビボでのターゲットマイクロRNAによるmRNAなどのRNAの抑制を軽減するのに、極めて有効であるという発見に基づく。
LNAを組み込んだ短いオリゴヌクレオチドはインビトロ試薬領域では知られている(例えばWO2005/098029およびWO2006/069584参照)。しかし、診断用または試薬用に設計される分子は、インビボ用または薬学用の分子とは、デザインが著しく異なる。例えば、試薬オリゴの末端ヌクレオチドは典型的にはLNAではなくDNAであり、ヌクレオシド間結合は典型的には、本発明のオリゴヌクレオチドで使用される好ましい結合であるホスホロチオエート(phosphorothioate)ではない。したがって本発明は、それ自体、新しい種類のオリゴヌクレオチド(以下、オリゴマーという)を提供する。
本発明のオリゴマーは、LNAなどのヌクレオチド類似体を含み、それがそのオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の一部または全体を形成している、一本鎖オリゴヌクレオチドである。オリゴマーのヌクレオチド配列は、連続ヌクレオチド配列からなる。
驚いたことに、本発明者らは、上述の短い「アンチmiR」が、マイクロRNAターゲットに対する顕著な特異性を保ったまま、インビボで、マイクロRNAの、改善された特異的阻害をもたらすことを見いだした。もう一つの利点として、マイクロRNA種の間では相同な短い配列(例えば本明細書で説明するシード領域)が保存されているので、いくつかのマイクロRNAを同時に阻害できることがわかった。本発明によれば、7、8、9、10ヌクレオチド、例えば7、8または9ヌクレオチドの短いオリゴヌクレオチドが、特に有利であることがわかった。
連続ヌクレオチド配列は、哺乳動物、ヒトまたはウイルスのマイクロRNA(miRNA)配列、好ましくはヒトまたはウイルスのmiRNA配列の対応する領域に対して、相補的(例えば100%相補的−すなわち完全に相補的)である。
本発明者らは、ヌクレオチド類似体(例えばロックト核酸(LNA)単位などの高アフィニティーヌクレオチド類似体)を含むか、そのようなヌクレオチド類似体からなる、注意深く設計された短い一本鎖オリゴヌクレオチドが、マイクロRNAの著しいサイレンシングを示し、マイクロRNAレベルの低下をもたらすことを見いだした。ターゲットマイクロRNAのいわゆるシード配列(典型的には5'端から数えてヌクレオチド2〜8または2〜7)に対する前記オリゴヌクレオチドのタイトな結合が重要であることがわかった。ターゲットマイクロRNAのヌクレオチド1は非対形成塩基であり、おそらくAgo2タンパク質中の結合ポケットに隠されるだろう。特定の理論に束縛されることは望まないが、シード領域配列を選択すれば、特にLNAを含むオリゴヌクレオチド、好ましくはシード領域に相補的な領域にLNA単位を含むオリゴヌクレオチドを使用すれば、miRNAとオリゴヌクレオチドの間の二重鎖は、miRNAをターゲットとし、オフターゲット効果を回避し、おそらくは、RISC指向的(RISC directed)miRNA機能を妨げるさらにもう一つの特徴を得るのに、特に有効であると、本発明者らは考える。
本発明によれば、7、8、9、10ヌクレオチド、例えば7、8または9ヌクレオチドの短いオリゴヌクレオチドであって、オリゴマーのヌクレオチド単位の少なくとも50%、例えば55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または例えば100%が(好ましくは高アフィニティー)ヌクレオチド類似体、例えばロックト核酸(LNA)ヌクレオチド単位であるものは、特に有利であることがわかった。
本明細書で使用される「LNA単位」「LNAモノマー」「LNA残基」「ロックト(locked)核酸単位」「ロックト核酸モノマー」または「ロックト核酸残基」という用語は、二環式ヌクレオシド類似体を指す。LNA単位は、とりわけ、WO 99/14226、WO 00/56746、WO 00/56748、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 03/006475およびWO 03/095467に記載されている。LNA単位はその化学式に関して定義することもできる。例えば、本明細書にいう「LNA単位」は、下記のスキーム1に示す化学構造を持つ。
スキーム1
スキーム3
スキーム4
「ヌクレオシド間連結基」とは、2つのヌクレオチドを一つに共有結合させる能力を持つ基、例えばDNA単位間、DNA単位とヌクレオチド類似体の間、2つの非LNA単位間、非LNA単位とLNA単位の間、および2つのLNA単位間などを共有結合させる能力を持つ基を意味するものとする。その例には、ホスフェート基、ホスホジエステル基およびホスホロチオエート基が含まれる。
ある実施形態では、連続ヌクレオチド配列が、少なくとも2つのmiRNA配列、例えば2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のmiRNA配列の対応する配列に相補的である。単一のユニバーサル塩基を使用することにより、本発明の単一オリゴマーは、2つの別個のマイクロRNA(その一方または両方が、そのユニバーサルヌクレオチドが配置される位置で、オリゴマーに対応する領域中に単一のミスマッチを持つもの)をターゲットとすることができる。
ある実施形態では、3'端から数えて本発明のオリゴマーの1番目のヌクレオチドが、LNA単位などのヌクレオチド類似体である。同じであっても異なってもよい一実施形態では、3'端から数えて本発明のオリゴマーの最後のヌクレオチドが、LNA単位などのヌクレオチド類似体である。
少なくとも6個のLNAを含有するオリゴマー、例えば少なくとも7個のヌクレオチド単位を含有するオリゴマーが好ましいだろうと予想されるが、そのような短いオリゴマーがインビボで極めて効果的にマイクロRNAをターゲットとするという発見は、他のヌクレオチド類似体、例えば高アフィニティーヌクレオチド類似体を含む、短い本発明のオリゴマーを作製するために使用することができる。実際、LNAと他の高アフィニティーヌクレオチド類似体との組合せは、本発明の一部であるとみなされる。
i)少なくとも1個のホスホロチオエート結合、および/または
ii)少なくとも1個の3'末端LNA単位、および/または
iii)少なくとも1個の5'末端LNA単位
を含むものを提供する。
下記の表1に、本発明のオリゴヌクレオチドの有利なターゲットとなりうる短いマイクロRNA配列の限定でない例を記載する。
本発明は、本発明のオリゴマーと医薬上許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
本発明は、さらに、ヒトマイクロRNAをターゲットとするオリゴマー、例えば本明細書に記載のオリゴマーを合成するための方法であって、
a.場合によっては、3'端から数えて1番目の、LNAヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体であるヌクレオチドを選択するステップ、
b.場合によっては、3'端から数えて2番目の、LNAヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体であるヌクレオチドを選択するステップ、
c.本明細書に記載するmiRNAシード領域に対応するオリゴマーの領域を選択するステップ、
d.本明細書に記載する7番目および場合によっては8番目のヌクレオチドを選択するステップ、
e.場合によっては、本明細書に記載するとおり、オリゴマーのさらなる5'末端を1個または2個選択するステップ
を含み、合成がステップa〜eに記載の領域の逐次的合成によって行なわれる方法を提供し、ここで、前記合成は、3'-5'(aからf)方向または5'-3'(eからa)方向に行なうことができ、前記オリゴマーはmiRNAターゲットの配列に相補的である。
ある実施形態において、本発明のオリゴマーは、ホスホジエステルヌクレオシド間結合を持つ相補的一本鎖RNA核酸分子(典型的には前記一本鎖オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであるもの)と、二重鎖を形成する能力を持ち、ここで、その二重鎖は、30℃〜70℃または80℃、例えば30℃〜60℃もしくは70℃、または30〜50℃もしくは60℃のTmを持つ。ある実施形態では、Tmが少なくとも40℃である。Tmは、オリゴマーと相補的RNAターゲットとのTmを次のバッファー条件で決定することによって決定することができる:100mM NaCl、0.1mM EDTA、10mM Na-ホスフェート、pH 7.0(詳細なプロトコールについては実施例参照)。高アフィニティー類似体は、本発明のオリゴマー中に使用した場合に、DNA塩基だけを含有する同一オリゴマーと比較して、そのオリゴマーのTmを増加させる類似体と定義することができる。
ある実施形態では、前記オリゴマーが、1つ以上の非ヌクレオチド(またはポリ-ヌクレオチド)化合物とコンジュゲートされる。
本明細書で使用する「活性化オリゴマー」という用語は、オリゴマーを1つ以上の、コンジュゲートされる部分(すなわちそれ自身は核酸またはモノマーでない部分)に共有結合して、本明細書に記載のコンジュゲートを形成させることを可能にする、少なくとも1つの官能部分に共有結合(すなわち官能化)された本発明のオリゴマーを指す。典型的には、官能部分は、例えばアデニン塩基の3'-ヒドロキシル基または環外NH2基を介してオリゴマーに共有結合する能力を持つ化学基、好ましくは親水性であるスペーサー、およびコンジュゲートされる部分に結合する能力を持つ末端基(例えばアミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基)を含むだろう。いくつかの実施形態では、この末端基が保護されず、例えばNH2基である。別の実施形態では、末端基が、例えば任意の適切な保護基(例えば「Protective Groups in Organic Synthesis」Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 第3版(John Wiley & Sons, 1999)に記載されているもの)で保護される。適切なヒドロキシル保護基の例には、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチルなどのアラルキル基、およびテトラヒドロピラニルが含まれる。適切なアミノ保護基の例には、ベンジル、α-メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、およびアシル基、例えばトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルが含まれる。いくつかの実施形態では、官能部分が自己切断性である。別の実施形態では、官能部分が生分解性である。例えば参照によりそのまま本明細書に組み込まれる米国特許第7,087,229号参照。
最初に説明したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、改善された特性を持つ適切な薬を構成するだろう。強力で安全な薬の設計には、アフィニティー/特異性、生物学的液体における安定性、細胞取り込み、作用様式、薬物動態特性および毒性など、さまざまなパラメータの微調整が必要である。
さらにもう一つの態様において、本発明は、がんを処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴヌクレオチドの使用に関する。もう一つの態様において、本発明は、がんを処置または予防するための方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明の医薬組成物を、その必要がある患者に投与することを含む方法に関する。
本発明の化合物は、広範囲にわたる感染性疾患、例えばジフテリア、破傷風、百日咳、ポリオ、B型肝炎、C型肝炎、インフルエンザ菌(hemophilus influenza)、麻疹、ムンプス、および風疹に、広く適用可能であるだろう。
炎症応答は、感染性因子の攻撃に対する生物の基本的防御機構であり、自己免疫障害を含む多くの急性および慢性疾患の病理発生にも関連づけられている。病原体と闘うことが必要とされているにもかかわらず、炎症バースト(inflammatory burst)の効果は壊滅的になる場合がある。したがって、抗炎症薬の使用により炎症の総体的症状を制限することがしばしば必要になる。炎症は、通常は組織損傷によってトリガーされる、複雑なプロセスであり、このプロセスには、数多くの一連の酵素の活性化、血管透過性の増大および血液(blood fluids)の血管外遊出、細胞移動および化学伝達物質の放出が含まれ、これらはすべて、損傷した組織の破壊と修復の両方を目的としている。
代謝性疾患は、体内で自然に産生される化学物質の蓄積によって引き起こされる障害である。これらの疾患は、通常、深刻であり、生死に関わるものさえある。他にも、身体発育を遅らせたり、精神遅滞を引き起こすものがある。これらの障害を持つ乳幼児の大半は、最初は、明白な疾患の徴候を示さない。これらの問題は、多くの場合、適正な出生時スクリーニングによって発見することができる。早期診断および早期処置によって、代謝性疾患は効果的に管理できることが多い。
法に関する。
さらにもう一つの態様において、本発明は、肝臓障害を処置するための医薬を製造するための、本発明のオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの使用に関すると共に、肝臓障害を処置するための方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドもしくはそのコンジュゲート、または本発明の医薬組成物をその必要がある患者に投与することを含む方法に関する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療および予防のための研究試薬として利用することができる。研究では、細胞および実験動物におけるターゲット遺伝子の合成を特異的に阻害し、それによってそのターゲットの機能解析を容易にするために、または治療的介入のターゲットとしてのその有用性の査定を容易にするために、本オリゴヌクレオチドを使用することができる。診断においては、ノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーションまたは同様の技法によって細胞および組織におけるターゲット発現を検出し定量するために、本オリゴヌクレオチドを使用することができる。治療においては、ターゲットの発現を調整することによって処置することができる疾患または障害を持つと疑われる動物またはヒトが、本発明に従ってオリゴヌクレオチド化合物を投与することによって処置される。さらに、ターゲットの発現に関連する疾患または状態を持つと疑われる、またはそのような疾患または状態に陥りやすいと疑われる、動物、特にマウスおよびラット、ならびにヒトを、治療的または予防的に有効な量の1つ以上の本発明のオリゴヌクレオチド化合物または組成物を投与することによって処置する方法も提供される。
本発明者らは、miR-122aをターゲットとするLNA-アンチmiRが、血漿中コレステロールレベルを低下させることを証明した。それゆえ、本発明のもう一つの態様は、miR-122aをターゲットとする上記オリゴヌクレオチドの医薬品としての使用である。
本発明の以下の実施形態は、本明細書に記載する他の実施形態と組み合わせて使用することができる。
LNAモノマーおよびオリゴヌクレオチド合成は、WO2007/112754の実施例1および2で言及されている方法を使って行なった。ヒトまたはラット血漿におけるLNAオリゴヌクレオチドの安定性は、WO2007/112754の実施例4で言及されている方法を使って測定される。LNAアンチmiRアンチセンスオリゴヌクレオチド(miR-122をターゲットとするもの)によるインビトロ細胞の処置は、WO2007/112754の実施例6で言及されている方法を使って行なわれる。マイクロRNA特異的定量PCRによるmiR発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析は、インビトロモデルでもインビボモデルでも、WO2007/112754の実施例7で言及されている方法を使って行なわれる。miRNAマイクロアレイ発現プロファイリングを使ったLNAアンチmirノックダウン特異性の評価は、WO2007/112754の実施例8で言及されている方法を使って行なわれる。インサイチューハイブリダイゼーションによるマイクロRNAの検出は、WO2007/112754の実施例9で言及されている方法を使って行なわれる。単離およびmRNA発現の解析(mRNA解析のための全RNA単離およびcDNA合成)は、インビトロモデルでもインビボモデルでも、WO2007/112754の実施例10で言及されている方法を使って行なわれる。マイクロRNA-122をターゲットとする本発明のオリゴマーを使ったインビボ実験と、その後の解析は、WO2007/112754の実施例11〜27に開示されている方法を使って行なわれる。上で言及したWO2007/112754の実施例は、特に、参照により本明細書に組み込まれる。
ターゲット核酸発現(量)に対するLNAオリゴヌクレオチドの影響は、ターゲット核酸が測定可能なレベルで存在する限り、さまざまな細胞タイプのどれにおいても試験することができる。ターゲットは、内在性に発現されるか、前記核酸をコードする核酸の一過性または安定トランスフェクションによって発現されうる。
PC3:ヒト前立腺がん細胞株PC3はATCCから購入し、グルタミン(Gibco)+10%FBS+ゲンタマイシンを含むF12 Coon's培地で培養した。
518A2:ヒト黒色腫がん細胞株518A2はB. Jansen博士(ウィーン大学臨床薬理学科分子薬理学実験腫瘍学部門(Section of experimental Oncology、Molecular Pharmacology、Department of Clinical Pharmacology、University of Vienna))から寄贈され、DMEM(Sigma)+10%ウシ胎仔血清(FBS)+Glutamax I+ゲンタマイシンで培養した。
HeLa:子宮頸癌細胞株HeLaは、10%ウシ胎仔血清およびゲンタマイシンを含有するMEM(Sigma)中、37℃、湿度95%および5%CO2で培養した。
MPC-11:マウス多発性骨髄腫細胞株MPC-11はATCCから購入し、4mM Glutamax+10%ウマ血清を含むDMEMで維持した。
DU-145:ヒト前立腺がん細胞株DU-145はATCCから購入し、Glutamax+10%FBSを含むRPMIで維持した。
RCC-4+/-VHL:VHLを発現させるプラスミドまたは空プラスミドで安定にトランスフェクトされたヒト腎がん細胞株RCC4はECACCから購入し、製造者の指示に従って維持した。
786-0:ヒト腎細胞癌細胞株786-0はATCCから購入し、製造者の指示に従って維持した。
HUVEC:ヒト臍静脈内皮細胞株HUVECはCamcrexから購入し、EGM-2培地で維持した。
K562:ヒト慢性骨髄性白血病細胞株K562はECACCから購入し、Glutamax+10%FBSを含むRPMIで維持した。
U87MG:ヒト膠芽腫細胞株U87MGはATCCから購入し、製造者の指示に従って維持した。
B16:マウス黒色腫細胞株B16はATCCから購入し、製造者の指示に従って維持した。
LNCap:ヒト前立腺がん細胞株LNCapはATCCから購入し、Glutamax+10%FBSを含むRPMIで維持した。
Huh-7:10%FBS、2mM Glutamax I、1×非必須アミノ酸、ゲンタマイシン25μg/mlを含む
イーグルMEMで培養されたヒト肝臓、上皮様。
L428:(Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen(DSM、ドイツ・ブラウンシュヴァイク):10%FCS、L-グルタミンおよび抗生物質を補足したRPMI 1640で維持されたヒトB細胞リンパ腫。
L1236:(Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen(DSM、ドイツ・ブラウンシュヴァイク)):10%FCS、L-グルタミンおよび抗生物質を補足したRPMI 1640で維持されたヒトB細胞リンパ腫。
使用したmiRBaseバージョンは、Griffiths-Jones, S., Grocock, R.J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A.J. 2006 "miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature" Nucleic Acids Res. 34:D140-4に報告されたバージョン12であり、http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtmlを通して利用することができる。
miR-21をターゲットとしてそれを拮抗する、完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR(SEQ ID #3205)の効率を評価するために、成熟miR-21用の完全マッチターゲット部位および対照としてシード内に2つの突然変異を持つターゲット部位を含有するルシフェラーゼセンサーコンストラクトを作製した(図6)。マイクロRNA-21阻害をモニターするために、乳癌細胞株MCF-7に、異なるルシフェラーゼコンストラクトを、さまざまな濃度のmiR-21アンタゴニストSEQ ID #3205と共にトランスフェクトし、miR-21に対する15マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3204と比較した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
細胞株:乳癌細胞株MCF-7はATCCから購入した(#HTB-22(商標))。MCF-7細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり400,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、MCF-7細胞に、0.8μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクター(SDS Promega)を、1μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーで収集した後、細胞を10,000rpmで5分間遠心分離した。上清を捨て、50μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を細胞ペレットに加えてから、細胞を氷上に30分間置いた。溶解した細胞を10,000rpmで30分間遠心した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
miR-21をターゲットとする完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3205の効率をさらに評価するために、子宮頸癌細胞株HeLaにも、上述のmiR-21ルシフェラーゼセンサーコンストラクトを、上記の項で説明したように、さまざまな濃度のSEQ ID #3205と共にトランスフェクトした(図3)。
細胞株:ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した(#93021013)。HeLa細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、0.2μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRがmiR-155を効果的に拮抗できるかどうかを調べるために、miR-155用の完全マッチターゲット部位を同じルシフェラーゼベクター(psiCHECK2)にクローニングし、マウス白血病単球マクロファージRAW細胞株にトランスフェクトした。miR-155の内在性レベルはRAW細胞株では低いので、miR-155蓄積を誘発するために、細胞を100ng/ml LPSで24時間処理した。
細胞株:マウス白血病単球マクロファージRAW 264.7はATCCから購入した(TIB-71)。RAW細胞は、10%ウシ胎仔血清、4mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり500,000個の細胞を播種して、翌日には50%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、MCF-7細胞に、0.3μgのmiR-155または空psiCHECK2ベクターを、10μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。miR-155蓄積を誘発するために、トランスフェクション複合体と共に4時間インキュベートしてから、LPS(100ng/ml)をRAW細胞に加えた。さらに24時間の後、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーで収集した後、細胞を2,500rpmで5分間遠心分離した。上清を捨て、50μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を細胞ペレットに加えてから、細胞を氷上に30分間置いた。溶解した細胞を10,000rpmで30分間遠心した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
miR-122に対する完全に修飾された8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3208の力価を、ヒトヘパトーマ細胞株HuH-7で評価した。HuH-7細胞に、完全マッチmiR-122ターゲット部位を含有するルシフェラーゼセンサーコンストラクトをトランスフェクトした。24時間後にルシフェラーゼ測定を行なった(図5)。
細胞株:ヒトヘパトーマ細胞株HuH-7は、R. Bartenschlager(ハイデルベルク)から寄贈された。Huh-7細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、96穴プレートに、1ウェルあたり8,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HuH-7細胞に、57ngのmiR-122または空psiCHECK2ベクターを、1μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共にトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:50μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた後、その96穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。各ウェルに、Dual-luciferase Reporterアッセイシステム(Promega)を加え、ルシフェラーゼ測定を製造者の指示(Promega)に従って行なった。
本発明者らは、完全にLNA修飾されホスホロチオレート化された8マーLNA-アンチmiRが、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaにおいてmiR-21ルシフェラーゼレポーターレベルを完全に抑制解除することができ、ヒト乳癌細胞株MCF-7においてmiR-21ルシフェラーゼレポーターレベルを部分的に抑制解除することができるということを、先に示した(特許出願1051)。本発明者らは次にこのスクリーニングアプローチをヒト前立腺がん細胞株PC3に拡張した。miR-21に対する異なるLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドの効率を評価するために、成熟miR-21用の完全マッチターゲット部位およびシード中に2つのミスマッチを持つターゲット部位がウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR中にクローニングされたルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作製した(図7)。miR-21阻害をモニターするために、PC3細胞に、異なるルシフェラーゼコンストラクトを、さまざまな濃度のmiR-21アンタゴニストSEQ ID #3205(8マー)および比較のための15マーLNA-アンチmiR完全マッチSEQ ID #3204と共にトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
細胞株:ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した(#90112714)。PC3細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、12穴プレートに、1ウェルあたり100,000個の細胞を播種して、翌日には50%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に、0.3μgのmiR-21または空psiCHECK2ベクターを、1.2μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、250μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)をウェルに加えた。プレートを振盪機上に30分間置いた後、細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移した。細胞溶解物を2,500rpmで10分間遠心分離した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
miR-21をターゲットとする、本発明者らの短いLNA-アンチmiRの特異性を調べるために、シード認識配列中に2つのミスマッチを含有する8マーのミスマッチ対照LNA-アンチmiR(SEQ ID #3218)を設計した(図8参照)。実施例1で説明したルシフェラーゼレポーターコンストラクトを、ヒト子宮頸癌細胞株HeLaに、LNAミスマッチ対照オリゴSEQ ID #3218と共にトランスフェクトし、その効力を、miR-21をターゲットとする8マーLNA-アンチmiR(SEQ ID #3205)と比較した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
細胞株:ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した(#93021013)。HeLa細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に0.2μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた後、その24ウェルプレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
LNA-アンチmiRの長さの要件をさらに調べるために、miR-21をターゲットとする、7マーおよび6マーのLNA-アンチmiR(どちらも完全にLNA修飾されホスホロチオレート化されたオリゴヌクレオチド)を設計した。miR-21ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを、さまざまな濃度のLNA-アンチmiRと共に、HeLa細胞にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
細胞株:ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した(#93021013)。HeLa細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、0.2μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集めてエッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
次に、本発明者らは、完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRの長さを9マーから14マーまで増加させることが、HeLa細胞におけるmiR-21の拮抗に及ぼす影響を調べた。得られたLNA-アンチmiRをHeLa細胞に、miR-21ルシフェラーゼレポーターコンストラクトと共にトランスフェクトした(図10)。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
細胞株:ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した(#93021013)。HeLa細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、0.2μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2またはターゲット部位を持たない空psiCHECK2対照ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた後、その24ウェルプレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
本発明者らの実験により、最も強力な完全にLNA修飾されたホスホロチオレート化LNA-アンチmiRは、8ヌクレオチド長であることが示された。miRターゲット認識配列内で8マーLNA-アンチmiRにとって最適な位置を評価するために、図11に示すように、成熟miR21-配列の全体を覆う、4つの異なる完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRを設計した。異なるLNA-アンチmiRを、miR-21ルシフェラーゼレポーターコンストラクトと共に、HeLa細胞に同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
細胞株:ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した(#93021013)。HeLa細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、0.2μgのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
腫瘍抑制因子タンパク質Pdcd4は、TPAが誘発する新生物トランスフォーメーション、腫瘍の促進および進行を阻害する。Pdcd4は、異なる誘導因子に呼応して起こるアポトーシスに際して、アップレギュレートされることも示されている。さらにまた、肺がんおよび結腸直腸がんにおけるPdcd4のダウンレギュレーションは、患者の予後不良とも関連づけられている。最近、AsanganiらとFrankelらは、Pdcd4-3'-UTRにはmiR-21用のターゲット部位が保存されていること、および細胞にアンチmiR-21をトランスフェクトすることにより、Pdcd4タンパク質の増加が起こることを示した。そこで本発明者らは、前述のmiR-21ターゲット部位を包含するPdcd4の3'UTR領域の313ntを保持しているルシフェラーゼレポータープラスミドを構築し、それを、異なるLNA-アンチmiRと共に、HeLa細胞に同時トランスフェクトした。異なるLNA-アンチmiRとは、SEQ ID #3205(8マー、完全マッチ)またはSEQ ID #3218(8マー、ミスマッチ)である。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
細胞株:ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した(#93021013)。HeLa細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、24穴プレートに、1ウェルあたり60,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、0.2μgのPdcd4-3'UTR/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.7μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、100μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心分離した後、10μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
短いLNA-アンチmiRを使用する本発明者らのアプローチを他のmiRNAのターゲティングに適合させることができるかどうかを調べるために、マイクロRNA-155に対する完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRを設計した。miR-155用の完全マッチターゲット部位をレポータープラスミドpsiCHECK2中のルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングし、それを、マウスRAWマクロファージ細胞株に、8マーまたは15マーのLNA-アンチmiRと共にトランスフェクトした。miR-155の内在性レベルはRAW細胞株では低いので、miR-155蓄積を誘発するために、細胞を100ng/ml LPSで24時間処理した。24時間後に、ルシフェラーゼ解析を行なった。
細胞株:マウスマクロファージRAW 264.7細胞株はATCCから購入した(TIB-71)。RAW細胞は、10%ウシ胎仔血清、4mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり500,000個の細胞を播種して、翌日には50%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、RAW 264.7細胞に、0.3μgのmiR-155完全マッチ/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、10μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。miR-155蓄積を誘発するために、トランスフェクション複合体と共に4時間インキュベートしてから、LPS(100ng/ml)をRAW細胞に加えた。さらに24時間の後、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーで収集した後、細胞を2,500rpmで5分間遠心した。上清を捨て、50μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を細胞ペレットに加えてから、細胞を氷上に30分間置いた。溶解した細胞を10,000rpmで30分間遠心した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
短いLNA-アンチmiR(SEQ ID #3207)によるmiR-155拮抗作用に関する機能的読出しとして、新規miR-155ターゲットc/EBPβのタンパク質レベルを決定した。マウスマクロファージRAW細胞株に、8マー(SEQ ID #3207)または15マー(SEQ ID #3206)のLNA-アンチmiRを、プレ-miR-155の存在下または非存在下でトランスフェクトした。15マー用のミスマッチ対照として、miR-122をターゲットとするSEQ ID #4を使用し、8マー用には、miR-21をターゲットとするSEQ ID #3205を使用した。これら2つの対照miRNAはc/EBPβ発現レベルを調節しない。LPSを使ってmiR-155蓄積を誘発し、LPSで16時間処理した後に、細胞を収集した。c/EBPβは3つのアイソフォームLIP、LAPおよびLAP*を持つ。それらをウェスタンブロット解析で検出し、同じメンブレンをローディングコントロールとしてのβ-チューブリンで再プローブした。
細胞株:マウスマクロファージRAW 264.7細胞株はATCCから購入した(TIB-71)。RAW細胞は、10%ウシ胎仔血清、4mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり500,000個の細胞を播種して、翌日には50%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、RAW 264.7細胞に、5nmolのプレ-miR-155(Ambion)および/または5nM LNA-アンチmiRを、10μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。miR-155蓄積を誘発するために、トランスフェクション複合体と共に4時間インキュベートしてから、LPS(100ng/ml)をRAW細胞に加えた。16時間後に、タンパク質抽出およびウェスタンブロット解析のために、細胞を収集した。
ウェスタンブロット:細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、エッペンドルフチューブに移し、250μlの溶解バッファー(1×RIPA)を加えた。細胞溶解物を氷上に20分間置き、10,000rpmで10分間遠心した。Coomassie Plusを使用し、製造者の指示に従って、タンパク質濃度を測定し、80μgを4-12%BIS-TRISゲルにのせた。メンブレンを1:100濃度の一次モノクローナルマウス抗体C/EBPβ(Santa Cruz)と共に4℃で終夜インキュベートした。免疫活性バンドをECL Plus(Amersham)で可視化した。
短いLNA-アンチmiRを使用する本発明者らのアプローチを他のmiRNAのターゲティングに適合させることができることを確認するために、マイクロRNA-106bに対する完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRを設計した。miR-106b用の完全マッチターゲット部位を、ベクター(psiCHECK2)中のルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングし、それを、ヒト子宮頸癌HeLa細胞株に、さまざまな濃度の短いLNA-アンチmiR(SEQ ID #3221)または15マーLNA-アンチmiR(SEQ ID #3228)と共にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
細胞株:ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した(#93021013)。HeLa細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、96穴プレートに、1ウェルあたり5,200個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、57ngのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.14μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、30μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心した後、ルシフェラーゼ測定を製造者の指示(Promega)に従って行なった。
短いLNA-アンチmiRを使用する本発明者らのアプローチを他のmiRNAのターゲティングに容易に適合させることができることをさらに確認するために、マイクロRNA-19aに対する完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRを設計した。miR-19a用の完全マッチターゲット部位を、psiCHECK2ベクター中のルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングした。そのレポータープラスミドを、ヒト子宮頸癌HeLa細胞株に、miR-19aをターゲットとするさまざまな濃度の短いLNA-アンチmiR(SEQ ID #3222)または15マーLNA-アンチmiR(SEQ ID #3229)と共にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
細胞株:ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した(#93021013)。HeLa細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、96穴プレートに、1ウェルあたり5,200個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、57ngのmiR-21完全マッチ/psiCHECK2、miR-21.mm2/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、0.14μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、30μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた後、その24穴プレートをオービタルシェーカー上に30分間置いた。細胞を集め、エッペンドルフチューブに移し、10,000rpmで30分間遠心した後、ルシフェラーゼ測定を製造者の指示(Promega)に従って行なった。
次に、本発明者らは、すべてのファミリーメンバーに共通するシード配列に相補的な単一の短い7マーLNA-アンチmiRを使ってマイクロRNAファミリーをターゲットとすることが可能かどうかを調べた(図17参照)。この実験では、結腸、膵臓、前立腺および胃の固形腫瘍において過剰発現されるmiR-221およびmiR-222に的を絞った。miR-221とmiR-222は多形性神経膠芽腫において最も著しくアップレギュレートされるマイクロRNAであることも示されている。さらにまた、miR-221とmiR-222の過剰発現は、少なくとも一つには、腫瘍抑制因子タンパク質p27をブロックすることにより、前立腺癌の成長と進行の一因にもなりうる。それぞれmiR-221用およびmiR-222用である完全マッチターゲット部位を、どちらもルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングして、2つのレポーターコンストラクトを得た。次に、これらのコンストラクトを、別々に、または組み合わせて、前立腺癌細胞株PC3にトランスフェクトした。miR-221とmiR-222の両方をターゲットとする7マーの他に、miR-221(SEQ ID #3223)またはmiR-222(SEQ ID #3224)のどちらか一方をターゲットとする15マーのLNA-アンチmiR(15マー)も、それぞれ別個に、または一緒に、同時トランスフェクトした(図18左参照)。
細胞株:ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した(#90112714)。PC3細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、12穴プレートに、1ウェルあたり100,000個の細胞を播種して、翌日には50%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に、0.3μgのmiR-221用もしくはmiR-222用のルシフェラーゼレポータープラスミド、または対照としてmiRNAターゲット部位を持たない空psiCHECK2ベクターを、1.2μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、250μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)をウェルに加えた。プレートを振盪機上に30分間置いた後、細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移した。細胞溶解物を2,500rpmで10分間遠心した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
先の研究(le Sageら 2007、Galardiら, 2007)により、miR-221とmiR-222は、細胞周期調節に関与する腫瘍抑制因子遺伝子p27の発現を、転写後調節することが示されている。これらの研究では、miR-221およびmiR-222のダウンレギュレーションが、p27の発現レベルを増加させることが示された。そこで、7マーSEQ ID #3225 LNA-アンチmiRによるmiR-221/222ファミリーの拮抗作用に関する機能的読出しとして、本発明者らは、PC3細胞へのLNA-アンチmiR SEQ ID #3225のトランスフェクション後に、p27のタンパク質レベルを決定し、8マーLNAミスマッチ対照と比較した。24時間後に、ウェスタンブロット解析のために細胞を収集した(図19)。
細胞株:ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した(#90112714)。PC3細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり250,000個の細胞を播種して、翌日には50%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に、さまざまな濃度のLNA-アンチmiRを、Lipofectamine 2000と共にトランスフェクトした。24時間後に、タンパク質抽出およびウェスタンブロット解析のために細胞を収集した。
ウェスタンブロット:細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、エッペンドルフチューブに移し、250μlの溶解バッファー(1×RIPA)を加えた。細胞溶解物を氷上に20分間置いてから、10,000rpmで10分間遠心した。Coomassie Plusを使用し、製造者の指示に従って、タンパク質濃度を測定し、100μgを4-12%BIS-TRISゲルにのせた。メンブレンを1:1000希釈の一次モノクローナルマウス抗体p27(BD Biosciences)と共に4℃で終夜インキュベートした。免疫活性バンドをECL Plus(Amersham)で可視化した。
表5に示すように、完全に修飾された短いLNA-アンチmiRの長さが増加するに連れて、Tm値は増加する(表7のSEQ ID #3205、SEQ ID #3209〜3214のTm値を参照)。最適な阻害効果がmiR-21に対する8マーLNA-アンチmiR SEQ ID #3205によって達成されたのに対し、6マーSEQ ID #3209の極めて低いTmは、おそらく、miR-21ターゲットの拮抗作用を媒介するには十分でないのだろう。一方、10マー(SEQ ID #3212)を上回る長さにするとTmは著しく増加するが、それと同時に、ルシフェラーゼmiR-21レポーターを使って測定される阻害活性も減少する。これはおそらく、完全に修飾された12マーおよび14マーのLNA-アンチmiRは、ホモ二量体を形成する傾向が高いからだろう。mir-21認識配列の全体にわたる完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmirのスライディングウインドウ(sliding window)を使った実験により、miRNA機能にとっては、LNA-アンチmiRの十分なTm値に加えて、シード領域が、したがってLNA-アンチmiRによってターゲットとされる最適な領域が、最も重要であることが、明確に証明される。
(表5)相補的RNAオリゴヌクレオチドに対して測定されたmiR-21 LNA-アンチmiRのTm値
T m 測定:オリゴヌクレオチド:miR-21 RNA二重鎖を500μlのRNaseフリーH2Oに希釈して3μMにし、500μlの2×Tm-バッファー(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM Na-リン酸、pH 7.0)と混合した。その溶液を95℃に3分間加熱してから、室温で30分間アニールさせた。二重鎖融解温度(Tm)は、Peltier温度プログラマーPTP6を装備したLambda 40 UV/VIS分光測光器で、PE Templabソフトウェア(Perkin Elmer)を使って測定した。260nmでの吸収を記録しながら、温度を20℃から95℃まで昇温し、次に25℃まで降温させた。融解およびアニーリングの両方の一次導関数および極大を使って、二重鎖融解温度を評価した。
本発明者らは、本願において、完全にLNA修飾されホスホロチオレート化された8マーLNA-アンチmiRが、ヒト子宮頸癌細胞株HeLa、ヒト乳癌細胞株MCF-7およびヒト前立腺がん細胞株PC3において、miR-21を効果的に拮抗することを、先に示した。本発明者らは、このスクリーニングアプローチを、ヒト肝細胞がん細胞株HepG2に拡張した。miR-21に対する8マーLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドの効率を評価するために、成熟miR-21用の完全マッチターゲット部位がウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングされたルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作製した。miR-21阻害をモニターするために、HepG2細胞に、ルシフェラーゼコンストラクトを、さまざまな濃度のmiR-21アンタゴニストSEQ ID #3205(8マー)ならびに特異性を比較するための8マーLNA-アンチmiRミスマッチ(SEQ ID #3218)および力価を比較するための15マー(SEQ ID #3204)と共に、トランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
細胞株:ヒト肝細胞HepG2細胞株はECACCから購入した(#85011430)。HepG2細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:6穴プレートに1ウェルあたり650,000個の細胞を播種し、リバーストランスフェクションを行なった。HepG2細胞に、0.6μgのmiR-21または空psiCHECK2ベクターを、2.55μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、300μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)をウェルに加えた。プレートを振盪機上に30分間置いた後、細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移した。細胞溶解物を2,500rpmで10分間遠心分離した後、50μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
腫瘍抑制因子タンパク質Pdcd4は腫瘍の促進および進行を阻害する。さらにまた、肺がんおよび直腸結腸がんにおけるPdcd4のダウンレギュレーションは、患者の予後不良とも関連づけられている。最近、Asanganiら(Oncogene 2007)およびFrankelら(J Biol Chem 2008)は、Pdcd4 3'-UTRにはmiR-21用のターゲット部位が保存されていること、および細胞にアンチmiR-21をトランスフェクトすることにより、Pdcd4タンパク質の増加が起こることを示した。そこで本発明者らは、前述のmiR-21ターゲット部位を包含するPdcd4の3'UTR領域の313ntを保持しているルシフェラーゼレポータープラスミドを構築し、それを、異なるLNA-アンチmiRおよびプレ-miR-21(10nM)と共に、Huh-7細胞に同時トランスフェクトした。異なるLNA-アンチmiRとは、SEQ ID #3205(8マー、完全マッチ)、SEQ ID #3218(8マー、ミスマッチ)およびSEQ ID #3204(15マー、DNA/LNAミックスマー)である。ルシフェラーゼ測定を24時間後に行なった。
細胞株:ヒトヘパトーマ細胞株Huh-7は、R. Bartinschlager (ハイデルベルク大学分子ウイルス学科)から寄贈された。Huh-7細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、96ウェルプレートに、1ウェルあたり11,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、Huh-7細胞に、20ngのPdcd4 3'UTR/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、10nMプレ-miR-21(Ambion)および0.14μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞を洗浄し、30μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた後、その96ウェルプレートをオービタルシェーカー上に置いた。30分後に、Luciferase Assay Buffer II(Promega製のDual-Luciferase Reporter Assay System、カタログ番号E1910)に溶解した50μlのルシフェラーゼ基質を、溶解した細胞を含むウェルに加え、ルシフェラーゼ測定を製造者の指示(Promega)に従って行なった。
さらに本発明者らは、HeLa細胞にSEQ ID #3205(完全マッチ)、SEQ ID #3218(ミスマッチ)、SEQ ID #3219(スクランブル)をトランスフェクトし、24時間後のPdcd4タンパク質レベルをウェスタンブロットで解析するということも行なった(図22)。図示するように、SEQ ID #3205が添加された細胞から得られるタンパク質抽出物では、SEQ ID #3205によるmir-21の拮抗作用ゆえに、2つの対照LNAオリゴヌクレオチドとは対照的に、Pdcd4タンパク質レベルが増加する。
細胞株:ヒト子宮頸癌細胞株HeLaはECACCから購入した(#93021013)。HeLa細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり200,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、HeLa細胞に、5nMのLNAオリゴヌクレオチドおよび2.5μg/mlのLipofectamine2000(Invitrogen)を、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ウェスタンブロット解析のために細胞を収集した。
ウェスタンブロット:細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、エッペンドルフチューブに移し、50μlの溶解バッファー(1×RIPA)を加えた。細胞溶解物を氷上に20分間置き、10,000rpmで10分間遠心した。等量(15μlの細胞溶解物)を4-12%BIS-TRISゲルにのせた。iBlot(Invitrogen)を使用し、製造者の指示に従って、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。そのメンブレンを、1:2000濃度の一次アフィニティー精製ウサギ血清抗体Pdcd4(Rockland)と共に、4℃で終夜インキュベートした。対照として、抗β-チューブリン抗体(Thermo Scientific)を1:5000希釈で使用した。免疫活性バンドをECL Plus(Amersham)で可視化した。
各化合物を、雌NMRIマウスに、25mg/kg、5mg/kgおよび1mg/kgの用量で、1日おきに2週間注射した。動物を屠殺し、ALTおよびAST分析のために、血清を全身から集めた。図23に示すように、ALTおよびASTレベルは、食塩水またはSEQ ID #3218(ミスマッチ対照)と比較して、SEQ ID #3205では、上昇しなかった。ただし1匹のマウスは、血漿と比較して6〜8倍高レベルのALTおよびASTを含有する赤血球が血清試料に混入したため、増加したレベル(赤色で示す)を示した。5mg/kgおよび1mg/kgを投与されたマウスも、ALTおよびASTレベルについて分析され、食塩水処置対照動物との比較で変化を示さなかった(データ未掲載)。
実験計画:
ALT/AST用の血清試料採取:動物を70%CO2-30%O2で麻酔してから、後眼窩静脈洞(retro orbital sinus)血を集めた。血液はS-monovette Serum-Gelバイアルに集めた。血清試料を個々のマウスから収集し、保存した。血液試料は室温で2時間保存した後、3000rpm、室温で10分間遠心分離した。血清画分を湿った氷(wet ice)上のエッペンドルフチューブ中に収集した。
ALTおよびAST測定:ALTおよびAST測定は、96穴プレートで、ABX Pentra製のALT試薬およびAST試薬(A11A01627-ALT、A11A01629-AST)を使って、製造者の指示に従って行なった。簡単に述べると、血清試料をH2Oで2.5倍に希釈し、各試料を二重にアッセイした。50μlの希釈試料または標準(ABX Pentraのmultical-A11A01652)を各ウェルに加えた後、200μlの37℃ASTまたはALT試薬ミックスを各ウェルに加えた。速度論的測定を、340nm、37℃において、30秒間隔で5分間行なった。
本発明者らは、miR-155を拮抗する8マー(SEQ ID #3207)が、マウスマクロファージRAW細胞において、miR-155ターゲットc/EBPベータの抑制解除をもたらすことを、先に示した。SEQ ID #3207の力価をさらに実証するために、もう一つのmiR-155ターゲットPU.1のタンパク質レベルを決定した。短いLNA-アンチmiR(SEQ ID #3207)によるmiR-155拮抗作用に関する機能的読出しとして、ウェスタンブロットを行なった。拮抗作用は、8マー(SEQ ID #3207)完全マッチまたは8マー対照LNAのどちらか一方を、プレ-miR-155の存在下または非存在下でトランスフェクトしたヒト単球THP-1細胞株で実証した。LPSを使ってmiR-155蓄積を誘発し、24時間後に細胞を収集した。
細胞株:ヒト単球THP-1細胞株はECACCから購入した(#88081201)。THP-1細胞は、10%ウシ胎仔血清を補足したL-グルタミン含有RPMIで培養した。
トランスフェクション:前日に、12穴プレートに、1ウェルあたり200,000個の細胞を播種した。トランスフェクションの日に、THP-1細胞に、5nmolのプレ-miR-155(Ambion)および/または5nMのLNA-アンチmiRを、Lipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。トランスフェクション複合体と共に4時間インキュベートしてから、LPS(100ng/ml)を細胞に加えた。24時間後に、タンパク質抽出およびウェスタンブロット解析のために細胞を収集した。
ウェスタンブロット:細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、エッペンドルフチューブに移し、50μlの溶解バッファー(1×RIPA)を加えた。細胞溶解物を氷上に20分間置き、10,000rpmで10分間遠心した。等量(15μlの細胞溶解物)を4-12%BIS-TRISゲルにのせた。iBlot(Invitrogen)を使用し、製造者の指示に従って、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを1:2000濃度のウサギモノクローナルPU.1抗体(Cell Signaling)と共に4℃で終夜インキュベートした。イコールローディングコントロールとして、チューブリン(Thermo Scientific)を1:5000希釈で使用した。免疫活性バンドをECL Plus(Amersham)で可視化した。
先の研究(le Sageら 2007、Galardiら, 2007)により、miR-221とmiR-222は、細胞周期調節に関与する腫瘍抑制因子遺伝子p27の発現を、転写後調節することが示されている。これらの研究では、miR-221およびmiR-222のダウンレギュレーションが、p27の発現レベルを増加させることが示された。そこで、7マーSEQ ID #3225 LNA-アンチmiRによるmiR-221/222ファミリーの拮抗作用に関する機能的読出しとして、本発明者らは、PC3細胞へのLNA-アンチmiR SEQ ID #3225のトランスフェクション後に、p27のタンパク質レベルを決定した。
細胞株:ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した(#90112714)。PC3細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり250,000個の細胞を播種して、翌日には50%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に、さまざまな濃度のLNA-オリゴヌクレオチド(図25参照)をLipofectamine2000と共にトランスフェクトした。24時間後に、タンパク質抽出およびウェスタンブロット解析のために、細胞を収集した。
ウェスタンブロット:細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理し、エッペンドルフチューブに移し、50μlの溶解バッファー(1×RIPA)を加えた。細胞溶解物を氷上に20分間置いてから、10,000rpmで10分間遠心した。等量(15μlの細胞溶解物)を4-12%BIS-TRISゲルにのせた。iBlot(Invitrogen)を使用し、製造者の指示に従って、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを1:1000希釈の一次モノクローナルマウス抗体p27(BD Biosciences)と共に4℃で終夜インキュベートした。ローディングコントロールとして、チューブリン(Thermo Scientific)を1:5000希釈で使用した。免疫活性バンドをECL Plus(Amersham)で可視化した。
細胞トランスフォーメーションの特徴は、半固形培地で足場非依存的に成長するという腫瘍細胞の能力である。そこで本発明者らは、がんに関連する表現型アッセイである軟寒天アッセイで腫瘍細胞の減少が測定されることから、このアッセイを行なった。本発明者らは、SEQ ID #3225(完全マッチ)およびSEQ ID #3231(スクランブル)をPC3細胞にトランスフェクトし、24時間後に、細胞を軟寒天にプレーティングした。12日後にコロニーを計数した。SEQ ID #3225によるmiR-221およびmiR-222の阻害は、スクランブル対照LNA-アンチmiRと比較して、軟寒天中で成長するコロニーの量を減少させる(これは腫瘍細胞の減少を示す)ことができるということを、図26に示す。
細胞株:ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した(#90112714)。PC3細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり250,000個の細胞を播種して、翌日には50%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に25nMの異なるLNAオリゴヌクレオチドをLipofectamine 2000と共にトランスフェクトした。
軟寒天におけるクローン増殖:0.5%寒天を含有する基層上の0.35%寒天に2.5×103個のPC3細胞を播種した。トランスフェクションの24時間後に細胞をプレーティングした。プレートを湿潤培養器中、37℃、5%CO2で12日間インキュベートし、0.005%クリスタルバイオレットで1時間染色した後、細胞を計数した。アッセイは3重に行なった。
miRNAのlet-7ファミリーのターゲティングおよび拮抗に関して、完全にLNA修飾された6〜9マーのオリゴヌクレオチドの効率を評価するために、HMGA2 3'UTRのおよそ800bpを含有するルシフェラーゼセンサーコンストラクトを作製した。ベクターにクローニングされた配列は、Mayrら(Science, 2007)ならびにLeeおよびDutta(Genes Dev, 2007)が先に証明したとおり、7つの機能的let-7結合部位のうちの4つ(部位2〜5)を含有する。let-7阻害をモニターするために、肝細胞癌細胞株Huh-7(内在性let-7のレベルは低〜非存在)に、ルシフェラーゼセンサーコンストラクト、let-7a前駆体miRNA、および増加する一連の濃度の6〜9マーlet-7アンタゴニスト(SEQ ID #3232、-3233、-3227、-3234、-3235;図27参照)をトランスフェクトした。6〜9マーLNA-アンチmiRを、陽性対照としての、let-7aに対する15マーであるSEQ ID #3226と比較した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
細胞株:肝細胞癌細胞株Huh-7は、R. Bartinschlager(ハイデルベルク大学分子ウイルス学科)から寄贈された。Huh-7細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、96穴プレートに、1ウェルあたり8,000個の細胞を播種して、翌日には60〜80%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、各ウェル中のHuh-7細胞に、20ngのHMGA2 3'UTR/psiCHECK2プラスミド、let-7a前駆体miRNA(Dharmacon;最終濃度10nM)、LNA-アンチmiR SEQ ID #3232、-3233、-3227、-3234、-3235、-3226;最終濃度0〜50nM)を、0.17μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:成長培地を捨て、30μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた。オービタルシェーカー上で15〜30分インキュベートした後、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ測定を、製造者の指示(Promega)に従って行なった。
miRNAの全let-7ファミリーの拮抗に関して、完全にLNA修飾された8マーオリゴヌクレオチドの効率を評価するために、先の実施例で述べたものと同じルシフェラーゼセンサーコンストラクトを使用した。ここでも、Huh-7細胞(内在性let-7のレベルは低〜非存在)に、センサーコンストラクト、ファミリーを代表するlet-7a、let-7d、let-7e、またはlet-7i前駆体の一つ、および増加する一連の濃度のアンタゴニストSEQ ID #3227をトランスフェクトした。8マーLNA-アンチmiRを、強力な陽性対照としての、let-7aに対する15マーであるSEQ ID #3226と比較した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。
細胞株:肝細胞癌細胞株Huh-7は、R. Bartinschlager (ハイデルベルク大学分子ウイルス学科)から寄贈された。Huh-7細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、96穴プレートに、1ウェルあたり8,000個の細胞を播種して、翌日には60〜80%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、各ウェル中のHuh-7細胞に、20ngのHMGA2 3'UTR/psiCHECK2プラスミド、let-7a、-7d、-7e、または-7i前駆体miRNA(Dharmacon;最終濃度10nM)、およびLNA-アンチmiR(SEQ ID #3227およびSEQ ID #3226;最終濃度0〜50nM)を、0.17μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:成長培地を捨て、30μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた。オービタルシェーカー上で15〜30分インキュベートした後、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ測定を、製造者の指示(Promega)に従って行なった。
内在性let-7のターゲティングおよび拮抗に関する、完全にLNA修飾された8マーオリゴヌクレオチドの効率を決定するために、先の2つの実施例で述べたものと同じルシフェラーゼセンサーコンストラクトを、SEQ ID #3227と共に、子宮頸がん細胞株HeLa(これは、Q-PCRで決定すると、中〜高レベルのlet-7を発現させている;データ未掲載)にトランスフェクトした。空psiCHECK-2ベクターを陰性対照として含めた。
細胞株:子宮頸がん細胞株HeLaはATCCから購入した(#CCL-2(商標))。HeLa細胞は10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamax、1×NEAAおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したイーグルMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、96穴プレートに1ウェルあたり8,000個の細胞を播種して、翌日には50〜70%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、各ウェル中のHeLa細胞に、20ngのHMGA2 3'UTR/psiCHECK2プラスミドまたはpsiCHECK-2(空ベクター)、およびLNA-アンチmiR SEQ ID #3227(最終濃度0〜50nM)を、0.17μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従って同時トランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:成長培地を捨て、30μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を各ウェルに加えた。オービタルシェーカー上で15〜30分インキュベートした後、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ測定を、製造者の指示(Promega)に従って行なった。
本発明者らは、本願において、完全にLNA修飾されホスホロチオレート化された8マーLNA-アンチmiRがヒト子宮頸癌細胞株HeLa、ヒト乳癌細胞株MCF-7、ヒト前立腺がん細胞株PC3およびヒト肝細胞癌HepG2細胞株において、miR-21を効果的に拮抗することを、先に示した。本発明者らは、このスクリーニングアプローチをヒト大腸癌細胞株HCT116に拡張した。miR-21に対する8マーLNA-アンチmiRオリゴヌクレオチドの効率を評価するために、成熟miR-21用の完全マッチターゲット部位がウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR中にクローニングされたルシフェラーゼレポーターコンストラクトを作製した。miR-21阻害をモニターするために、HCT116細胞に、そのルシフェラーゼコンストラクトを、miR-21アンタゴニスト#3205(8マー)および特異性を比較するための8マーLNAスクランブル対照(#3219)と共にトランスフェクトした。24時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
細胞株:ヒト大腸癌HCT116細胞株はATCCから購入した(CCL-247)。HCT116細胞は、10%ウシ胎仔血清および25μg/mlゲンタマイシンを補足したRPMI培地で培養した。
トランスフェクション:12穴プレートに、1ウェルあたり110,000個の細胞を播種し、トランスフェクションを行なった。HCT116細胞に、0.3μgのmiR-21ルシフェラーゼセンサープラスミドまたは空psiCHECK2ベクターを、1.2μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRおよび対照オリゴヌクレオチドもトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、250μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)をウェルに加えた。プレートを振盪機上に30分間置いた後、細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移した。細胞溶解物を2,500rpmで10分間遠心分離した後、50μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
細胞トランスフォーメーションの特徴は、半固形培地で足場非依存的に成長するという腫瘍細胞の能力である。そこで本発明者らは、がんに関連する表現型アッセイである軟寒天アッセイで腫瘍細胞の減少が測定されることから、このアッセイを行なった。本発明者らは、#3205(完全マッチLNA-アンチmiR-21)および#3219(LNAスクランブル対照)をPC3細胞にトランスフェクトし、24時間後に、細胞を軟寒天にプレーティングした。12日後にコロニーを計数した。#3205によるmiR-21の阻害は、スクランブル対照LNA処理対照または無処理対照(トランスフェクトはするが、LNAを添加しないもの)と比較して、軟寒天中で成長するコロニーの量を減少させる(これは腫瘍細胞の減少を示す)ことができるということを、図32に示す。
細胞株:ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した(#90112714)。PC3細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり250,000個の細胞を播種して、翌日には50%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、PC3細胞に、25nMの異なるLNAオリゴヌクレオチドをLipofectamine 2000と共にトランスフェクトした。
軟寒天におけるクローン増殖:0.5%寒天を含有する基層上の0.35%寒天に2.5×103個のPC3細胞を播種した。トランスフェクションの24時間後に細胞をプレーティングした。プレートを湿潤培養器中、37℃、5%CO2で12日間インキュベートし、0.005%クリスタルバイオレットで1時間染色した後、細胞を計数した。アッセイは3重に行なった。
ヒト肝細胞癌細胞株HepG2ではmiR-21が過剰発現される。これらの細胞では#3205を使ってmiR-21センサープラスミドのルシフェラーゼ活性を調節できることを、本発明者らは先に示した。HepG2細胞に#3205および#3219(スクランブル8マー)をトランスフェクトし、24時間後に軟寒天中にプレーティングした。17日後に顕微鏡でコロニーを計数した。
細胞株:ヒト肝細胞HepG2細胞株はECACCから購入した(#85011430)。HepG2細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したEMEM培地で培養した。
トランスフェクション:6穴プレートに1ウェルあたり650,000個の細胞を播種し、リバーストランスフェクションを行なった。HepG2細胞に、0.6μgのmiR-21ルシフェラーゼセンサープラスミドまたは空psiCHECK2ベクターを、2.55μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と一緒に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。LNA-アンチmiRおよび対照オリゴヌクレオチドもさまざまな濃度でトランスフェクトした。24時間後に、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
軟寒天におけるクローン増殖:0.5%寒天を含有する基層上の0.35%寒天に2.0×103個のHepG2細胞を播種した。トランスフェクションの24時間後に細胞をプレーティングした。プレートを湿潤培養器中、37℃、5%CO2で17日間インキュベートし、0.005%クリスタルバイオレットで1時間染色した後、細胞を計数した。アッセイは3重に行なった。
細胞移動は、創傷治癒アッセイ(=引っ掻き傷アッセイ)を行なうことによってモニターすることができる。このアッセイでは、「引っ掻き傷」を細胞単層に作り、画像を最初にキャプチャすると共に、細胞移動中も定期的にキャプチャする。画像を比較することにより、細胞の移動速度を定量化することができる。これをヒト前立腺がん細胞株PC3で行なった。細胞を播種し、3日目に、細胞にトランスフェクトし、翌日、100%コンフルエントに達したら、引っ掻き傷(=創傷)を作った。引っ掻き傷を作ったら、初期の創傷を記録するために写真撮影をした。その後、異なる時点において、フリーソフトウェアプログラムImage Jで、創傷閉鎖の面積を測定した。図34Aに示すように、PC3細胞は、25nMの#3205(完全マッチ、miR-21)、または対照#3219で処理されていたか、トランスフェクトされていなかった。24時間後に写真を撮影し、各時点における創傷閉鎖に関して、面積を計算した。非トランスフェクト細胞および対照#3219の場合、miR-21に対する本発明者らのLNA-アンチmiR、#3205と比較して、創傷閉鎖が速かったことから、#3205はmiR-21を阻害し、細胞の移動を妨げることが示された(図34B)。
細胞株:ヒト前立腺癌PC3細胞株はECACCから購入した(#90112714)。PC3細胞は、10%ウシ胎仔血清、2mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
引っ掻き傷アッセイ:トランスフェクションの3日前に、6穴プレートに、1ウェルあたり150,000個の細胞を播種して、翌日には100%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの24時間後に、細胞単層に200μlチップで引っ掻き傷を作った。0時間時点および24時間後に、顕微鏡に接続したデジタルカメラを使って、写真を撮影した。ソフトウェアプログラムImage Jを使って創傷閉鎖を決定した。
本発明者らは、先に、miR-21について、完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRに関する長さ評価を示し、最も強力なLNA-アンチmiRが7nt、8ntまたは9nt長であることを示した。同じ実験をmiR-155で繰り返した。miR-155用の完全マッチターゲット部位を、レポータープラスミドpsiCHECK2中のルシフェラーゼ遺伝子の3'UTR内にクローニングし、それを、マウスRAWマクロファージ細胞株に、異なる長さの完全にLNA置換されたLNA-アンチmiRと一緒にトランスフェクトした。RAW細胞株ではmiR-155の内在性レベルが低いので、miR-155蓄積を誘発するために、細胞を100ng/ml LPSで24時間処理した。24時間後に、ルシフェラーゼ解析を行なった。
細胞株:マウスマクロファージRAW 264.7細胞株はATCCから購入した(TIB-71)。RAW細胞は、10%ウシ胎仔血清、4mM Glutamaxおよび25μg/mlゲンタマイシンを補足したDMEM培地で培養した。
トランスフェクション:トランスフェクションの前日に、6穴プレートに、1ウェルあたり500,000個の細胞を播種して、翌日には50%コンフルエントになるようにした。トランスフェクションの日に、RAW 264.7細胞に、0.3μgのmiR-155完全マッチ/psiCHECK2または空psiCHECK2ベクターを、10μlのLipofectamine2000(Invitrogen)と共に、製造者の指示に従ってトランスフェクトした。さまざまな濃度のLNA-アンチmiRもトランスフェクトした。miR-155蓄積を誘発するために、トランスフェクション複合体と共に4時間インキュベートしてから、LPS(100ng/ml)をRAW細胞に加えた。さらに24時間の後、ルシフェラーゼ測定のために細胞を収集した。
ルシフェラーゼアッセイ:細胞をPBSで洗浄し、セルスクレーパーで収集した後、細胞を2,500rpmで5分間遠心した。上清を捨て、50μlの1×Passive Lysis Buffer(Promega)を細胞ペレットに加えてから、細胞を氷上に30分間置いた。溶解した細胞を10,000rpmで30分間遠心した後、20μlを96穴プレートに移し、製造者の指示(Promega)に従ってルシフェラーゼ測定を行なった。
図36Aに示す実験における血漿中濃度において、血漿タンパク質は#3205で飽和されない。図36Bにおいて、広範囲にわたる血漿中#3205濃度で、タンパク質結合は#3205 LNA-アンチmiR-21の約95%である。50.1μM(174μg/mL)の#3205濃度では、FAM標識#3205に関して、血漿タンパク質の結合能は飽和されていなかった。
完全にLNA修飾された短いLNA-アンチmiR(#3205、8マー)の体内分布を決定するために、放射標識化合物の全身組織分布をマウスで調べた。35S標識#3205を単回静脈内投与でマウスに投与し、5分から21日までにわたる異なる時点で屠殺した。
投薬:投与前にすべてのマウスの重量を測定した。9匹の雌マウスに10mg/kgの35S-#3205を尾静脈に静脈内投与した。各動物に与える体積は10mL/kgの試験製剤とした。比活性75.7μCi/mg。個々のマウスを、#3205の投与の5分後、15分後、1時間後、4時間後、24時間後、2日後、4日後、7日後および21日後に屠殺した。全身オートラジオグラフィー:マウスをセボフルランで麻酔した後、直ちにヘプタンに浸漬し、ドライアイスで-80℃に冷却した(ABR-SOP-0130)。標準的方法ABR-SOP-0131に従って、凍結屠殺体を水性カルボキシメチルセルロース(CMC)のゲルに包埋し、エタノール中で凍結し、ドライアイス(-80℃)で冷却し、全身オートラジオグラフィー用に矢状断切片を作成した。クリオミクロトーム(Leica CM 3600)を使って、約-20℃の温度で、各動物から20μm切片を異なるレベルで切り取った。得られた切片をテープ(Minnesota Mining and Manufacturing Co., No. 810)上に捕捉し、放射性インクで連番を付した。-20℃で約24時間凍結乾燥した後、選択した切片をマイラーホイルの薄層で覆い、イメージングプレート(富士、日本)上に置いた。露光は、イメージプレートを環境放射線から保護するために、-20℃において、鉛遮蔽箱中の遮光カセットで行なった。露光後に、イメージングプレートを50μmの画素サイズでスキャンし、生体イメージング解析システム(Bas 2500、富士、日本)を使用する、ABR-SOP-0214に記載のラジオルミノグラフィーによって解析した。35S放射能の水溶性標準試験溶液を全血と混合して、較正スケールの作成に使用した(ABR-SOP-0251)。ただし、異なる血液標準を500μLのSoluene-35に溶解した。次に、溶解した試料に4.5mLのUltima Goldを加えた。35Sと14Cは極めてよく似たエネルギースペクトルを持つので、異なる血液試料の放射能を決定する際には、標準的14C-プログラム(Packard 2200CA)を使用した。
インビボで豊富に発現されるlet-7ファミリーを拮抗する可能性を調べ得るために、マウスに8マーLNA-アンチmiRアンタゴニストまたは食塩水を静脈内(i.v.)注射した。処置効果を測定するために、タンパク質を肺および腎臓から単離した。タンパク質のRasファミリー(N-Ras、K-Ras、およびH-Ras)、特にN-RasおよびK-Rasはlet-7ファミリーによる調節(抑制)を受けることが、Johnsonら(Cell, 2005)によって先に示されているので、目標は、これらのlet-7ターゲットがインビボで抑制解除されうるかどうかを解析することだった。
ウェスタンブロット解析:食塩水処置マウスおよびLNA-アンチmiR処置マウスから得た肺および腎臓タンパク質を、1試料あたり100μgを使って、NuPAGE Bis Tris 4-12%(Invitrogen)で分離した。iBlot(Invitrogen)を使用し、製造者の指示に従って、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。ブロッキング、抗体希釈および検出は、製造者の説明書に従って行なった。Ras検出には、一次ウサギ抗Ras抗体(SC-3339、Santa Cruz Biotechnology)および二次HRPコンジュゲートブタ抗ウサギ抗体(P0399、Dako)を使用し、チューブリン検出には、一次チューブリンアルファ(MS-581-P1、Neomarkers)および二次HRPコンジュゲートヤギ抗マウス抗体(P0447、Dako)を使用した。
本発明者らは、完全にLNA修飾された8マーLNA-アンチmiRがmiR-21を拮抗し、miR-21ターゲットPdcd4のタンパク質レベルをインビトロで調節する能力を持つことを示した。そこで本発明者らは、インビボでのLNA-アンチmiRの効果を決定するために、LNA-アンチmiRをマウスに注射した。マウスには、25mg/kgの#3205をi.v.注射により、1日おきに14日間(全部で5回)投与した。14日目にマウスを屠殺し、腎臓を摘出し、タンパク質を単離した。ターゲット調節を決定するために、ウェスタンブロット解析を行なった。
動物および投薬:初回投薬時の体重が平均20gのC57BL/6雌マウスをすべての実験で使用し、マウスには通常飼料(Altromin no 1324、Brogaarden、デンマーク・ゲントフトテ)を与えた。物質は生理食塩水(0.9%NaCl)中に製剤した。動物には、25mg/kgを1日おきに14日間、全部で5回注射することにより、LNA-アンチmiRまたは食塩水(0.9%NaCl)を投与した。14日目に動物を屠殺した。
ウェスタンブロット解析:食塩水処置マウスまたはLNA処置マウスから得た80μgの腎臓組織を、NuPAGE Bis Tris 4-12%(Invitrogen)で分離した。iBlot(Invitrogen)を使用し、製造者の指示に従って、タンパク質をニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンをPdcd4抗体(Bethyl Laboratories)と共にインキュベートした後、HRP-コンジュゲートブタ抗ウサギ抗体(Dako)と共にインキュベートした。イコールローディングコントロールとして、GAPDH(Abcam)を使用し、続いてHRP-コンジュゲートブタ抗マウス抗体を使用した。メンブレンを化学ルミネセンス(ECL、Amersham)で可視化した。
Claims (17)
- 細胞におけるマイクロRNAターゲットの有効量を減少させるために使用される、7〜12核酸塩基の長さのオリゴマーであって、オリゴマーの連続核酸塩基配列の核酸塩基単位の全てがロックト核酸(LNA)核酸塩基単位であり、連続核酸塩基配列が、少なくとも2つの哺乳動物、ヒトまたはウイルスのマイクロRNA(miRNA)配列の対応する配列に相補的であり、連続核酸塩基配列の核酸塩基単位の間に存在するヌクレオシド間結合の少なくとも75%がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、少なくとも2つの哺乳動物、ヒトまたはウイルスのmiRNA配列が、同一のシード配列を共有し、連続核酸塩基配列が、少なくとも2つの哺乳動物、ヒトまたはウイルスのmiRNA配列と相補的であり、連続核酸塩基配列が、少なくとも2つの哺乳動物、ヒトまたはウイルスのmiRNAシード配列と完全に相補的である配列を含む、オリゴマー。
- 細胞におけるマイクロRNAターゲットの有効量を減少させるために使用される、医薬としての使用のための、7〜12核酸塩基の長さのオリゴマーであって、オリゴマーの連続核酸塩基配列の核酸塩基単位の全てがロックト核酸(LNA)核酸塩基単位であり、連続核酸塩基配列が、少なくとも2つの哺乳動物、ヒトまたはウイルスのmiRNA配列の対応する配列に相補的であり、連続核酸塩基配列の核酸塩基単位の間に存在するヌクレオシド間結合の少なくとも75%がホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、連続核酸塩基配列が、哺乳動物、ヒトまたはウイルスのmiRNA配列と相補的であり、連続核酸塩基配列が、少なくとも2つの哺乳動物、ヒトまたはウイルスのmiRNAシード配列と完全に相補的である配列を含む、オリゴマー。
- 該オリゴマーが、少なくとも2つの哺乳動物、ヒトまたはウイルスのマイクロRNAターゲットの量を減少させるためのものである、請求項1または2に記載のオリゴマー。
- 該少なくとも2つの哺乳動物、ヒトまたはウイルスのmiRNA配列のシード配列と相補的な配列が、少なくとも6個または少なくとも7個の核酸塩基の長さであり、該少なくとも2つの哺乳動物、ヒトまたはウイルスのマイクロRNA配列のシード配列と100%相補的である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のオリゴマー。
- 連続核酸塩基配列の核酸塩基単位の間に存在するすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のオリゴマー。
- オリゴマーが、7個の連続する核酸塩基の長さである、請求項1〜7のいずれか1項に記載のオリゴマー。
- オリゴマーが、8個の連続する核酸塩基の長さである、請求項1〜8のいずれか1項に記載のオリゴマー。
- オリゴマーが、9個の連続する核酸塩基の長さである、請求項1〜9のいずれか1項に記載のオリゴマー。
- オリゴマーが、10個の連続する核酸塩基の長さである、請求項1〜10のいずれか1項に記載のオリゴマー。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のオリゴマーと、それに共有結合する少なくとも1つの非ヌクレオチド部分、を含むコンジュゲート。
- 医薬として使用される、請求項12に記載のコンジュゲート。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のオリゴマーまたは請求項12に記載のコンジュゲート、ならびに医薬上許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む医薬組成物。
- 細胞におけるマイクロRNAターゲットの有効量を減少させるためのインビトロ方法であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載のオリゴマー、または請求項12に記載のコンジュゲートを、細胞に投与することを含む、方法。
- 細胞におけるターゲットmRNAの抑制解除のためのインビトロ方法であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載のオリゴマー、または請求項12に記載のコンジュゲートを、細胞に投与することを含む方法。
- 該方法が、該細胞中の少なくとも2つのマイクロRNAの量を減少させるための方法である、請求項15または16に記載の方法。
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