JP2015511121A - 浸潤性および予後に関する乳がんバイオマーカーシグネチャー - Google Patents

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Abstract

マイクロＲＮＡプロファイルの正常な乳房から非浸潤性腺管癌への転換および浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）への転換、ならびにその使用の方法を記述する。浸潤癌を非浸潤癌から識別するためのマイクロＲＮＡシグネチャーを用いる診断および予後予測の方法を記述する。全生存および転移までの時間を予測するためのマイクロＲＮＡ発現の使用も記述する。【選択図】なし

Description

発明者：Carlo M. Croce, Stefano Volinia
関連出願への相互参照
[0001] この出願は２０１２年１月２０日に出願された米国仮出願第６１／５８８，７９０号の利益を主張し、その全開示を明確に全ての目的に関して参照により本明細書に援用する。
連邦政府により資金提供を受けた研究に関する記載
[0002] この発明は、国立衛生研究所により与えられた助成金番号Ｕ０１−ＣＡ１５２７５８およびＵ０１−ＣＡ１５４２００の下での政府援助によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
[0003] この発明は該して分子生物学の分野に関する。より詳細には、それはがん関連技術に関する。本発明の特定の観点には、乳がんの診断学、療法学、および予後における適用が含まれる。
[0004] 乳がん（ＢＣ）は、遺伝子の変化の不均一性を特徴とし、いくつかの環境要因の影響を受ける複雑な疾患である。非浸潤性腺管癌（ＤＣＩＳ）は、基底膜を通る浸潤のない乳管内の悪性細胞の増殖を反映する病変の不均一な群である。全乳がんの約８０％がＢＣの最も高頻度なタイプである浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）である。別個の分子亜型の乳房腫瘍（ｌｕｍｉｎａｌ Ａ／Ｂ、ＨＥＲ２＋、およびｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）は劇的に異なるｍＲＮＡプロファイルを有する。
[0005] １９８０年まで、ＤＣＩＳは稀にしか診断されず、ＢＣの１％未満に相当していた。マンモグラフィーの使用の増大と共に、ＤＣＩＳは米国における新規に診断されたＢＣの症例の１５％〜２５％を占めるＢＣの最も急速に増大する亜集団になった。
[0006] マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は制御的機能を有する保存された非コードＲＮＡのクラスであり、がんにおいて重要な役割を果たしている。近年、ｍｉＲＮＡのマイクロアレイ分析は多くの新しい知識をもたらしている。ｍｉＲＮＡの機能および活性に関する情報に関する、ならびにそれらの特性付けおよび分析のために用いることができる方法および組成物に関する必要性がなお存在する。しかし、ゲノムワイドなｍＲＮＡ発現研究は進行期特異的な遺伝子の同定に失敗した。
[0007] 第１の広い観点において、本明細書において、予後不良の乳がんに関する増大した危険性を示す乳がんシグネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を記述する。そのシグネチャーは、ヒトの対象からの組織の試験試料中のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーのレベルにおける変化の決定を含む。１態様において、そのｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーは、以下のｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、Ｔ
ＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなる。その試験試料中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ遺伝子産物のレベルにおける、がんを含まない組織の対照試料中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ遺伝子産物の対応するレベルのレベルと比較した変化は、そのヒトの対象がＢＣに関する生存予後不良を有することを示している。
[0008] 別の観点において、本明細書において、ヒトの対象が乳がん（ＢＣ）に関する生存予後不良を有するかどうかを決定する方法を提供する。その方法には、一般にそのヒトの対象からの組織の試験試料中のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーのレベルを測定することが含まれ、ここでそのｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーは以下のｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなる。その方法には一般にその対象の生存予後を決定することも含まれ；ここでその試験試料中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ遺伝子産物のレベルにおける、がんを含まない組織の対照試料中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ遺伝子産物の対応するレベルのレベルと比較した変化は、そのヒトの対象がＢＣに関する生存予後不良を有することを示している。
[0009] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、ヒトの対象が予後不良と関係するＢＣを有する、またはそれを発現する危険にさらされているかどうかを診断する方法を提供する：（１）ヒトの対象から得られた組織の試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し；（２）その標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、ここでそのマイクロアレイは以下のｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなるｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーに関するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含み；（３）その試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを転移を含まない組織の対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較し、そして（４）そのｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ遺伝子産物シグネチャーにおける変化に基づいて、そのヒトの対象が予後不良と関係するＢＣを有する、またはそれを発現する危険にさらされているかどうかを診断する。
[0010] 特定の態様において、浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）乳がん（ＢＣ）を有する対象の生存予後を決定する工程。
[0011] 特定の態様において、その対象の生存予後を決定する工程は全生存（ＯＳ）を予測する。
[0012] 特定の態様において、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡのシグネチャーセットは対照
試料と比較してそのようなｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡに特異的であるプローブにハイブリダイズし、それはヒトの患者における生存予後不良を示している。
[0013] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、乳がん（ＢＣ）を有するヒトの対象が生存転帰不良を有するかどうかを決定するための方法を提供する：そのヒトの対象の乳房細胞から得られた核酸試料をアッセイしてその核酸試料中のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーの発現レベルを決定し、そのｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーは以下のｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなり；そして、対照核酸試料と比較した場合にその核酸試料においてｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーの発現レベルにおける変化が存在する場合、そのヒトの対象は生存転帰不良を有すると決定する。
[0014] 別の観点において、本明細書において、結腸がん関連疾患に関する試験のためのＤＮＡチップであって、その上に以下のｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなるｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーをアッセイするためのプローブが固定されている前記ＤＮＡチップを提供する。
[0015] 別の観点において、本明細書において、以下のｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなるｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーに関する少なくとも１種類のマーカーに結合する少なくとも１種類の捕捉試薬を含む製品を提供する。
[0016] 別の観点において、本明細書において、乳がんに関するスクリーニングのためのキットを提供し、ここでそのキットは以下のｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１に
関する少なくとも１種類のマーカーの１種類以上の試薬を含む。
[0017] 特定の態様において、そのマーカーの存在は、少なくとも１種類のマーカーと特異的に結合する抗体または抗体断片を含む試薬を用いて検出される。
[0018] 特定の態様において、その試薬は標識、放射標識、もしくはビオチン標識されており、および／またはここでその抗体もしくは抗体断片は放射標識、発色団標識、蛍光体標識、もしくは酵素標識されている。
[0019] 特定の態様において、その試薬は以下の１種類以上を含む：抗体、その試薬が結合している、またはその試薬が結合することができるプローブ、および固定された金属キレート。
[0020] 別の観点において、本明細書において、以下のｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなるｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーに向けられた抗体を含む、対象における乳がん関連疾患の存在を予測するためのマイクロアレイを提供する。
[0021] 特定の態様において、そのマーカーの発現のレベルは転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の存在を検出することにより評価され、ここでその転写されたポリヌクレオチドはそのマーカーのコード領域を含む。
[0022] 特定の態様において、その試料は乳がんと関連する体液または組織である。
[0023] 特定の態様において、その試料はその患者から得られた細胞を含む。
[0024] 特定の態様において、少なくともｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーには、単離された変異体もしくはその生物学的に活性な断片もしくは機能的均等物、またはそれらに結合する抗体が含まれる。
[0025] 特定の態様において、その乳がん関連疾患は浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）である。
[0026] 特定の態様において、その試料は、時間の経過にわたって採取された、その患者から得られた細胞を含む。
[0027] 特定の態様において、その方法はさらにその診断に基づいて処置計画を設計することを含む。
[0028] 特定の態様において、その方法はさらにその診断に基づいて処置を施すことを含む。
[0029] 特定の態様において、その標準的なｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ発現レベルは代表的な個体のプールからのものであり、その対象中の対照組織におけるｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡレベルに関する、平均、中央値、または他の統計学的に操作された、
または他の方法で要約もしくは統合された（ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）代表的なｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ発現レベルである。
[0030] 別の観点において、本明細書において、複数のデジタル的にコード化された参照プロファイルを有するデータベースを含むコンピューターで読み取り可能な媒体を提供し、ここで少なくとも１つの第１の参照プロファイルは乳がん関連疾患応答の徴候を示す１以上の対象からの１個以上の試料における少なくとも１種類のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーのレベルを表し、ここでそのｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーは以下のｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなる。
[0031] 特定の態様において、そのコンピューターで読み取り可能な媒体には、乳がん関連疾患応答の徴候を示す１以上の対象または乳がん関連疾患を有する対象からの１個以上の試料における少なくとも１種類の追加のｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡのレベルを表す少なくとも１つの第２の参照プロファイルが含まれる。
[0032] 別の観点において、本明細書において、請求項１７に記載のデータベースを含む、対象が乳がん関連疾患を有する、有しやすい、または乳がん関連疾患に関する生存予後不良を有するかどうかを決定するためのコンピューターシステム、およびそのコンピューターに対象のプロファイルを受け取らせ、そのデータベースから診断的にその対象のプロファイルに関連する適合する参照プロファイルを同定させ、そしてその対象が乳がん関連疾患を有する、または有しやすいかどうかの表示を生成させるためのコンピューターが実行可能なコードを含むサーバーを提供する。
[0033] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、対象における乳がん関連疾患の存在、非存在、性質または程度を評価するためのコンピューター支援の方法を提供する：
（１）その対象から得られた試料からのデータを分類するためのモデルまたはアルゴリズムを含むコンピューターを提供し、
ここでその分類にはそのデータを少なくとも１種類のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーの存在、非存在または量に関して分析することが含まれ、かつ
ここでそのｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーは以下のｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなり；
（２）その対象から得られた生物学的試料からのデータを入力し；そして、
（３）その生物学的試料を分類して乳がん関連疾患の存在、非存在、性質または程度を示す。
[0034] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、乳がん患者における予後を予測するための方法を提供する：乳がんを有する対象からの生物学的試験試料中のシグネチャーのセットの試験発現レベルを検出し；その試験発現レベルに危険性スコアを割り当て；そしてその試験発現レベルが高い危険性スコアを割り当てられた場合、予後不良を予測し；そしてその試験発現レベルが低い危険性スコアを割り当てられた場合、良好な予後を予測し、
ここでそのシグネチャーは以下のｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなるｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーを含む。
[0035] 特定の態様において、その予後は全がん生存である。
[0036] 特定の態様において、その試験発現レベルはマイクロアレイにより決定される。
[0037] 特定の態様において、その試験発現レベルはＲＴ−ＰＣＲにより決定される。
[0038] 特定の態様において、そのｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーは乳房細胞対乳がん細胞におけるｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの発現における統計的に有意な変化を含む。
[0039] 別の観点において、本明細書において、ｍｉＲ−２１０遺伝子産物を含む、対象における浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）を検出するためのマーカーを提供する。
[0040] 別の観点において、本明細書において、試験試料と比較した場合のｍｉＲ−２１０遺伝子産物における増大を検出することを含む、対象において浸潤性乳管癌を検出するための方法を提供する。
[0041] 別の観点において、本明細書において、以下を含む、浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）を非浸潤性腺管癌（ＤＣＩＳ）から識別するためのマイクロＲＮＡシグネチャーを提供する：ｉ）ＩＤＣにおけるｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２１０およびｍｉＲ−２２１の少なくとも１種類の上方制御；ならびに、ｉｉ）ＩＤＣにおけるｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１８およびｍｉＲ−３３５−５ｐの少なくとも１種類の下方制御。
[0042] 別の観点において、本明細書において、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ｂ＊、ｍｉＲ−１９７および／またはｌｅｔ−７ｉを含む、乳がんを有する対象における全生存予後に関する、および転移までの時間の予後に関するマイクロＲＮＡシグネチャーを提供する。
[0043] 別の観点において、本明細書において、ｍｉＲ−２１０遺伝子産物を含む、乳がんを有する対象におけるＤＣＩＳからＩＤＣへの転換を検出するためのマイクロＲＮＡマーカーを提供する。
[0044] 別の広い観点において、本明細書において、以下の少なくとも１種類を含む、
浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）を非浸潤性腺管癌（ＤＣＩＳ）から識別するためのマイクロＲＮＡシグネチャーを提供する：非浸潤性転換において下方制御されているｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−２１０およびｍｉＲ−２２１；ならびに浸潤性転換において上方制御されているｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−２１０およびｍｉＲ−２２１。
[0045] 別の観点において、本明細書において、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ｂ＊、ｍｉＲ−１９７およびｌｅｔ−７ｉを含む、乳がんに関する全生存および転移までの時間に関するマイクロＲＮＡシグネチャーを提供する。
[0046] 別の観点において、本明細書において、ｍｉＲ−２１０に対する逆相関プロファイルを有するタンパク質をコードする遺伝子を含む、浸潤性転換に関するマーカーを提供し、ここでＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＤ、ＦＡＮＣＦ、ＰＡＲＰ１、Ｅ−カドヘリン、Ｒｂ１の１種類以上が非浸潤癌において活性化されており、浸潤癌において下方制御されている。
[0047] 別の観点において、本明細書において、少なくとも１種類の差次的スプライシングイソ型、例えばキナーゼドメインを欠く切り詰められたＥＧＦＲを含む非浸潤性腺管癌に関するマーカーを提供し、ここでそのようなマーカーは非浸潤性腺管癌においてのみ過剰発現されている。
[0048] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、患者をｍｉＲ−２１０発現における増大に基づいて浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）と相関するマーカーを有すると同定するための方法を提供する：ａ）ＩＤＣを有することが疑われる患者からの乳がん試料におけるｍｉＲ−２１０発現を分析し；そしてｂ）患者をｉ）その患者からの試料中のｍｉＲ−２１０発現における非がん性乳房試料と比較した増大が検出された場合、ＩＤＣがんと相関するマーカーを有すると同定し、またはｉｉ）その増大が検出されなかった場合、ＩＤＣがんと相関するマーカーを有しないと同定する。
[0049] 特定の態様において、その方法はさらに、その試料を以下：ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−１８１ａの１種類以上における非がん性乳房試料と比較した増大；および／またはｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１８およびｍｉＲ−３３５−５ｐの１種類以上における非がん性乳房試料と比較した減少に関して分析することを含む。
[0050] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、対象が浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）を有するかどうかを診断する方法を提供する：その対象からの試験試料中の少なくとも１種類のｍｉＲ−２１０遺伝子産物のレベルを測定し、ここでその試験試料中の少なくともそのｍｉＲ−２１０遺伝子産物のレベルにおける対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した増大は、その対象がＩＤＣを有することを示している。
[0051] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、対象における乳がんの浸潤性を試験する方法を提供する：ａ）乳癌を有する対象からの試料中の少なくとも１種類のマーカーの発現レベルを決定し；その少なくとも１種類のマーカーには少なくとも１種類のｍｉＲ−２１０遺伝子産物が含まれ；ｂ）工程（ａ）において決定された発現レベルを健康な対象からの試料中のそのマーカーの対照発現レベルと比較し；そしてｃ）工程（ｂ）における比較の結果がその試験対象におけるその少なくとも１種類のマーカーの発現レベルが対照における発現レベルよりも高いことを示している場合、その対象が浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）の診断を有すると判定する。
[0052] 特定の態様において、その試料は乳房組織を含む。
[0053] 特定の態様において、その方法の工程はインビトロで実施される。
[0054] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、対象が浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）を有するかどうかを診断する方法を提供する：ａ）その対象から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、ここでその対象は乳房ＩＤＣを有し；ｂ）その標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲ−２１０特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；そしてｃ）その試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較し、ここでｍｉＲ−２１０のシグナルにおける増大はその対照がＩＤＣを有することを示している。
[0055] 特定の態様において、その方法はさらに、工程ｃ）がその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを非がん性試料と関係するｍｉＲレベルのデータベース、統計、または表と比較することを含むことを含む。
[0056] 特定の態様において、その方法はさらに、少なくとも１種類の追加のｍｉＲがそのマイクロアレイ中に含まれることを含む。
[0057] 特定の態様において、その方法はさらに、ｍｉＲ−２１０遺伝子産物の発現のレベルを転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の存在を検出することにより評価することを含み、ここでその転写されたポリヌクレオチドはｍｉＲ−２１０遺伝子産物のコード領域を含む。
[0058] 特定の態様において、その方法はさらに、その試料が時間の経過にわたって採取されたその患者から得られた細胞を含むことを含む。
[0059] 特定の態様において、その方法はさらに、その少なくとも１種類のｍｉＲ−２１０遺伝子産物に単離された変異体またはその生物学的に活性な断片が含まれることを含む。
[0060] 別の広い観点において、本明細書において、本明細書で記述されるマーカー（単数または複数）を含むキットを提供する。
[0061] 特定の態様において、その方法はさらに、そのキットがさらに乳がんを有する、または有することが疑われる対象から採取された試料をスクリーニングするための説明書を含むことを含む。
[0062] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、対象において浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）を診断する方法を提供する：ａ）対照と比較した相対的ｍｉＲ−２１０発現を同定し；そして、ｂ）ｉ）その対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１０発現を有する場合、その対象においてＩＤＣがあると診断し；または、ｉｉ）その対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１０発現を有しない場合、その対象においてＩＤＣがないと診断する。
[0063] 特定の態様において、その方法はさらに、ｌｅｔ−７ｄおよびｍｉＲ−２２１の少なくとも１種類の対照と比較した相対的発現を同定することを含む。
[0064] 特定の態様において、その方法はさらに、対照と比較して減少したｌｅｔ−７
ｄおよび／またはｍｉＲ−２２１発現が浸潤性乳がんの診断を確証することを含む。
[0065] 特定の態様において、その方法はさらに、その診断に基づいて処置計画を設計することを含む。
[0066] 特定の態様において、その方法はさらに、その診断に基づいて処置を施すことを含む。
[0067] 特定の態様において、その方法はさらに、ＩＤＣが診断された場合に抗血管新生処置を施すことを含む。
[0068] 特定の態様において、その方法はさらに、その診断に基づいて予後を決定することを含む。
[0069] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、対象において浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）がんを診断する方法を提供する：ａ）対照と比較した相対的ｍｉＲ−２１０発現を同定し、対照と比較したｌｅｔ−７ｄ発現を同定し、対照と比較したｍｉＲ−２２１発現を同定し；そしてｂ）ｉ）その対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１０発現、対照と比較して増大したｌｅｔ−７ｄ発現、および対照と比較して増大したｍｉＲ−２２１を有する場合、その対象においてＩＤＣがあると診断し、またはｉｉ）その対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１０発現、対照と比較して増大したｌｅｔ−７ｄ発現、および対照と比較して増大したｍｉＲ−２２１発現を有しない場合、その対象においてＩＤＣがないと診断する。
[0070] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）を有するヒトの対象を処置するための方法を提供する：ヒトＥＲ＋および／またはＨＥＲ２＋の発現または活性を阻害する薬剤をＩＤＣを有するヒトの対象に投与し、ここでその薬剤はＲＮＡ干渉により機能するオリゴヌクレオチドを含み、かつここでそのオリゴヌクレオチドには少なくとも１種類のｍｉＲ−２１０遺伝子産物が含まれる。
[0071] 別の観点において、本明細書において、以下の工程を含む、乳がん進行の可能性を決定するための方法を提供する：ａ）乳がんを有する対象からの乳がん細胞を含有する試料におけるｈｓａ−ｍｉＲ−２１０の発現レベルを決定し、そしてｂ）その発現レベルを対照組織における標準的なｍｉＲＮＡ発現レベルと比較し、ここでその乳がんを有する対象におけるｈｓａ−ｍｉＲ−２１０のより高い発現は、より高い進行の危険性と相関している。
[0072] 特定の態様において、その方法はさらに、その対照組織が乳がんが進行していなかった乳がんを有する代表的な個体または個体のプールからの組織を含むことを含む。
[0073] 特定の態様において、その方法はさらに、その対照組織が工程ａ）の発現レベルを決定する時点と比較した場合により早い時点で採取されたその対象からの組織を含むことを含む。
[0074] 特定の態様において、その方法はさらに、その標準的なｍｉＲＮＡ発現レベルが代表的な個体のプールからのものであり、その対象中の対照組織におけるｍｉＲＮＡレベルに関する、平均、中央値、または他の統計学的に操作された、または他の方法で要約もしくは統合された代表的なｍｉＲＮＡ発現レベルであることを含む。
[0075] 特定の態様において、その方法はさらに、ｌｅｔ−７ｄおよび／またはｍｉＲ
−２２１の１種類以上の発現レベルも対照組織における発現レベルと比較して測定すること、ならびにｌｅｔ−７ｄおよび／またはｍｉＲ−２２１の１種類以上の増大した発現レベルがより高い進行の危険性と相関していることを含む。
[0076] 特定の態様において、その方法はさらに、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１８およびｍｉＲ−３３５−５ｐの１種類以上の発現レベルも対照組織における発現レベルと比較して測定すること、ならびにｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１８およびｍｉＲ−３３５−５ｐの１種類以上の減少した発現レベルがより高い進行の危険性と相関していることを含む。
[0077] 本発明の他の系、方法、特徴、および利点は、以下の図面および詳細な記述を吟味すれば当業者には明らかであり、または明らかになるであろう。全てのそのような追加の系、方法、特徴、および利点はこの記述の範囲内に含まれ、本発明の範囲内であり、そして添付の特許請求の範囲により保護されることを意図している。
[0078] 本特許または出願ファイルは、カラーで作成された１個以上の図面および／または１個以上の写真を含んでいてよい。カラーの図面（単数または複数）および／または写真（単数または複数）を有するこの特許または特許出願公開のコピーは、要請して必要な料金を払えば特許庁により提供されるであろう。
[0079] 図１．４種類のＩＤＣ臨床亜群（ＥＲ＋／ＨＥＲ２−、ＨＥＲ２＋／ＥＲ−、ＥＲ＋／ＨＥＲ２＋およびトリプルネガティブ）において、ならびにＤＣＩＳおよび正常な乳房において脱制御されているｍｉＲＮＡ。乳がん細胞株は（ＢＴ４７４、ＨＣＣ３８、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ１３４、ＺＲ−７５１）であった。平均発現をそれぞれのクラス中のそれぞれのｍｉＲＮＡに関して示す。発現はそれぞれのｍｉＲＮＡに関して中心に置いた（ｃｅｎｔｅｒｅｄ）平均であった。 [0080] 図２．太字の書体を有する３種類のｍｉＲＮＡは、色により示されるような発現の逆転（赤、上方制御；緑、下方制御）を有するｍｉＲＮＡであった。６６種類のｍｉＲＮＡが正常な乳房からＤＣＩＳへの第１転換において脱制御されていた（最も有意なｍｉＲＮＡのみを列挙する）。９種類のｍｉＲＮＡが浸潤転換（ＤＣＩＳからＩＤＣへ）において脱制御されており、それを列挙する。この第２のシグネチャーは浸潤性マイクロシグネチャー（ｍｉｃｒｏ−ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）として同定される。浸潤転換に関わっているｍｉＲＮＡのいずれも、第１の癌転換では同じ傾向で差次的に制御されていなかった。 [0080] 図２．太字の書体を有する３種類のｍｉＲＮＡは、色により示されるような発現の逆転（赤、上方制御；緑、下方制御）を有するｍｉＲＮＡであった。６６種類のｍｉＲＮＡが正常な乳房からＤＣＩＳへの第１転換において脱制御されていた（最も有意なｍｉＲＮＡのみを列挙する）。９種類のｍｉＲＮＡが浸潤転換（ＤＣＩＳからＩＤＣへ）において脱制御されており、それを列挙する。この第２のシグネチャーは浸潤性マイクロシグネチャー（ｍｉｃｒｏ−ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）として同定される。浸潤転換に関わっているｍｉＲＮＡのいずれも、第１の癌転換では同じ傾向で差次的に制御されていなかった。 [0081] 図３Ａ〜３Ｂ．浸潤性腺管癌を有する患者の転移までの時間（図３Ｂ）および全生存（図３Ａ）におけるｍｉＲ−２１０に関するカプラン・マイヤー曲線。このデータは、ｍｉＲ−２１０が予後に関係しており浸潤性マイクロシグネチャー中に存在する唯一のｍｉＲＮＡであったことを示している。 [0081] 図３Ａ〜３Ｂ．浸潤性腺管癌を有する患者の転移までの時間（図３Ｂ）および全生存（図３Ａ）におけるｍｉＲ−２１０に関するカプラン・マイヤー曲線。このデータは、ｍｉＲ−２１０が予後に関係しており浸潤性マイクロシグネチャー中に存在する唯一のｍｉＲＮＡであったことを示している。 [0082] 図３Ｃ〜３Ｋ．転移までの時間に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0082] 図３Ｃ〜３Ｋ．転移までの時間に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0082] 図３Ｃ〜３Ｋ．転移までの時間に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0082] 図３Ｃ〜３Ｋ．転移までの時間に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0082] 図３Ｃ〜３Ｋ．転移までの時間に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0082] 図３Ｃ〜３Ｋ．転移までの時間に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0082] 図３Ｃ〜３Ｋ．転移までの時間に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0082] 図３Ｃ〜３Ｋ．転移までの時間に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0082] 図３Ｃ〜３Ｋ．転移までの時間に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0083] 図３Ｌ〜３Ｓ．全生存に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0083] 図３Ｌ〜３Ｓ．全生存に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0083] 図３Ｌ〜３Ｓ．全生存に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0083] 図３Ｌ〜３Ｓ．全生存に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0083] 図３Ｌ〜３Ｓ．全生存に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0083] 図３Ｌ〜３Ｓ．全生存に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0083] 図３Ｌ〜３Ｓ．全生存に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0083] 図３Ｌ〜３Ｓ．全生存に関するＩＤＣの予後予測シグネチャーにおける他のｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線（ログランク、ｐ＜０．０５）。 [0084] 図４．それぞれのＢＣ亜型に関する、および正常な乳房に関する、成熟ｍｉＲ−２１０、その一次ＲＮＡ（一次ｍｉＲ−２１０）およびＨＩＦ１Ａの発現。それぞれの群内で平均を計算し、異なる群の間のそのＲＮＡに関する合計の百分率として報告した。 [0085] 図５．乳がん経路と関係しており、ｍｉＲ−２１０に逆相関している遺伝子。乳がんは同定された唯一の重大な疾患であった（２５個の遺伝子；濃縮（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ） ｐ＜０．００１）。ＤＣＩＳ／ＩＤＣ進行軸に沿ってｍｉＲ−２１０に対して拮抗的様式で制御される乳がん遺伝子には、ＲＢ１、ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＤ、ＦＡＮＣＦ、ＰＰ２ＣＡ、ＰＡＲＰ１、ＮＬＫ、ＣＤＨ１およびＥＨＭＴ１が含まれていた。ＢＣにおいてｍｉＲ−２１０に逆相関する経路は以下の通りであった：アポトーシスにおけるカスパーゼカスケード、ＨＥＲ２受容体の再利用、ＴＮＦＲ１シグナル伝達、ＦＡＳシグナル伝達（ＣＤ９５）ならびにがんの易罹患性におけるＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２およびＡＴＲ。その経路における遺伝子の一部は、それらのスプライシングイソ型の差次的制御を有していた。例えば、ＥＧＦＲの古典的イソ型は正常な乳房において発現しており、ＤＣＩＳにおいて下方制御されていた。チロシンキナーゼドメインを欠いている、より短いＥＧＦＲ変種（ｕｃ００３ｔｑｉ．２）は、ＤＣＩＳにおいて特異的に過剰発現されていた。 [0085] 図５．乳がん経路と関係しており、ｍｉＲ−２１０に逆相関している遺伝子。乳がんは同定された唯一の重大な疾患であった（２５個の遺伝子；濃縮（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ） ｐ＜０．００１）。ＤＣＩＳ／ＩＤＣ進行軸に沿ってｍｉＲ−２１０に対して拮抗的様式で制御される乳がん遺伝子には、ＲＢ１、ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＤ、ＦＡＮＣＦ、ＰＰ２ＣＡ、ＰＡＲＰ１、ＮＬＫ、ＣＤＨ１およびＥＨＭＴ１が含まれていた。ＢＣにおいてｍｉＲ−２１０に逆相関する経路は以下の通りであった：アポトーシスにおけるカスパーゼカスケード、ＨＥＲ２受容体の再利用、ＴＮＦＲ１シグナル伝達、ＦＡＳシグナル伝達（ＣＤ９５）ならびにがんの易罹患性におけるＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２およびＡＴＲ。その経路における遺伝子の一部は、それらのスプライシングイソ型の差次的制御を有していた。例えば、ＥＧＦＲの古典的イソ型は正常な乳房において発現しており、ＤＣＩＳにおいて下方制御されていた。チロシンキナーゼドメインを欠いている、より短いＥＧＦＲ変種（ｕｃ００３ｔｑｉ．２）は、ＤＣＩＳにおいて特異的に過剰発現されていた。 [0086] 図６．特定の乳がん遺伝子はｍｉＲ−２１０に逆相関しており、乳がん進行経路に沿った発現の逆転を示した。 [0087] 図７．複雑性５０、すなわち配列決定運転（ｒｕｎｓ）から代表的なｍｉＲＮＡプロファイルを生成するために用いることができる最小限の複雑性の決定。複雑性５０は運転の複雑性に対応しており、それはｍｉＲＮＡ種の代表（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）５０数を有する。代表は特定の計数閾値に、またはその上に存在する異なるｍＲＮＡ種の数として定義される。代表５０は、データセットの単一の運転において同定されたｍｉＲＮＡ種の最大数である代表最大の半分である。複雑性は、運転（または配列決定された試料）におけるｍｉＲＮＡの読み（ｒｅａｄｓ）の総数である。散布図は、そのデータセット内の増大する複雑性における、その運転中の最大代表を示す。異なる計数閾値を用いて、ｍｉＲＮＡ種の存在を定義した：紫の十字＞＝２０読み、青＞＝１０読み、赤の正方形＞＝５読み、緑の三角＞＝３、青緑の星形＞＝１。複雑性（Ｘ軸）は数千の読み（Ｋの読み）における。 [0088] 図８．ＤＣＩＳ対正常な乳房試料のクラスタリングツリー。 [0089] 図９．（表１）．非浸潤性腺管癌（ＤＣＩＳ）の正常な乳房に対する比較における６６種類の差次的に発現されているｍｉＲＮＡの発現レベル（誤検出率＜０．０５）。 [0089] 図９．（表１）．非浸潤性腺管癌（ＤＣＩＳ）の正常な乳房に対する比較における６６種類の差次的に発現されているｍｉＲＮＡの発現レベル（誤検出率＜０．０５）。 [0090] 図１０．（表２）．ＩＤＣ対ＤＣＩＳにおいて差次的に発現されている６種類のｍｉＲＮＡ。ＨＥＲ２＋／ＥＰ−試料のみがこの比較において考慮された（誤検出率＜０．０５）。 [0091] 図１１．（表３）．非浸潤性腺管癌（ＤＣＩＳ）と比較した場合に浸潤性腺管癌（ＩＤＳ）において差次的に発現されている９種類のｍｉＲＮＡ。全ての入手可能なＩＤＣ試料がその亜型に関わらずその分析に含まれた（誤検出率＜０．０５）。 [0092] 図１２．（表４）．ＥＲ−ＩＤＣと比較した場合にＥＲ＋ＩＤＣにおいて差次的に発現されている１０種類のｍｉＲＮＡ（誤検出率＜０．０５）。 [0093] 図１３．（表５）．ｍｉＲ−３４２は、全ての他のＩＤＣと比較した場合にＨＥＲ２＋／ＥＲ−ＩＤＣにおいて差次的に発現されている唯一のｍｉＲＮＡである（誤検出率＜０．０５）。 [0094] 図１４．（表６）．ＨＥＲ２＋／ＥＲ−ＩＤＣにおいて差次的に発現されているｍｉＲＮＡは、他のＩＤＣ亜型と比較した場合に全て下方制御されていた（誤検出率＜０．０５）。 [0095] 図１５．（表７）．他のＩＤＣ亜型と比較した場合にＴＮＢＣ ＩＤＣにおいて差次的に発現されているｍｉＲＮＡ（誤検出率＜０．０５）。 [0096] 図１６．（表８）．ＩＤＣの分子亜型において差次的に発現されているｍｉＲＮＡ（誤検出率＜０．０５）。 [0097] 図１７．（表９）．ＩＤＣにおける転移までの時間と関係するｍｉＲＮＡ。 [0098] 図１８．（表１０）．ＩＤＣにおける全生存と関係するｍｉＲＮＡ。 [0099] 図１９．（表１１）．ＤＡＶＩＤデータベースを用いて実施された、正常／ＤＣＩＳおよびＤＣＩＳ／ＩＤＣ転換においてｍｉＲ−２１０に逆相関する遺伝子の機能分析。遺伝的関連ＤＢからの２５個の遺伝子が乳がんに結び付けられている。（濃縮ｐ値＝１．４Ｅ−３）。乳がんはこれらの遺伝子に関連付けられた唯一の疾患であった。 [00100] 図２０．（表１２）．原発性浸潤性腺管癌を有する患者のＴＣＧＡコホート。 [00101] 図２１．（表１３）．４つのＢＣコホートにおけるＲＮＡシグネチャーの予後予測的価値。 [00102] 図２２．乳がんの異なる下位クラスにわたる共通の予後予測ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ（３４遺伝子のセット）を導き出し、検証するために用いられた戦略。ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡをＩＤＣに関する単一のＲＮＡプロファイルにおいて統合した（ＴＣＧＡコホート、ｎ＝４６６）。以下の臨床および分子クラスの様々な亜群内で生存分析を実施した：疾患の病期、リンパ節転移（Ｎ期）、外科的縁、閉経前または閉経後、固有の亜型、体細胞突然変異（ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ経路、ＴＰ５３／ＰＩＫ３ＣＡ二重変異体、ＧＡＴＡ３、および残りのより低い頻度で変化していた遺伝子）。クラス内の下位クラスは患者の素集合（ｄｉｓｊｏｉｎｔ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｅｔｓ）を表し、従ってそのクラスに関する予後予測ＲＮＡの即時の検証を可能にする。ハザード比（ＨＲ）およびカプラン・マイヤー曲線を、ＴＣＧＡコホートのそれぞれの独立した下位クラス中のＲＮＡに関して計算した。少なくとも２つの下位クラスにおいて有意なＨＲおよびログランク検定（ｐ＜０．０５）両方を有していたＲＮＡを選択した。コード遺伝子の選択のために必要とされる追加の基準は、ＤＮＡのメチル化のＯＳとの関係およびＣＯＳＭＩＣデータベース中の体細胞突然変異の存在であった。７つの独立した検証コホート（合計ｎ＝２１０４人の患者）を用いて、ＴＣＧＡコホート上で生成された予後予測的な３４遺伝子のセットを再評価した。 [00103] 図２３．浸潤性腺管癌の異なる臨床的および分子的下位クラス（ＴＣＧＡコホート）におけるＯＳと関係するｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ。そのマトリックスは、ＴＣＧＡ ＩＤＣコホートにおける３４種類の予後予測コード遺伝子およびｍｉＲＮＡに関する有意なハザード比（ＨＲ）を可視化している（図２２における手順に従い、図２８において列挙されている）。有意な一変量Ｃｏｘ回帰（ｐ＜０．０５）を有するｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡに関するＨＲを、ログランク検定に関係なくｌｏｇ２スケールで示す。赤い正方形はＨＲ＞１を示し、青い正方形はＨＲ＜１を示す。少なくとも１種類の遺伝子またはｍｉＲＮＡが有意であるクラスを示す。 [00104] 図２４Ａ〜２４Ｂ．ＩＤＣ（ＴＣＧＡコホート）における予後予測的な３４遺伝子のセットに関するカプラン・マイヤーおよびＲＯＣ曲線。図２４Ａ．予後予測的な３４遺伝子のセットを用いた、ＴＣＧＡコホート（ｎ＝４６６）から得られたＩＤＣ危険群に関する交差検証されたカプラン・マイヤー曲線。危険群間のログランク検定統計の並べ替えｐ値は１０００回の並べ替えに基づいていた（ｐ＜０．００１）。図２４Ｂ．ＲＯＣ曲線は０．７１の曲線下面積（ＡＵＣ）を有していた（ｐ＜０．００１）。並べ替えｐ値を、１０００回の並べ替えを用いた帰無仮説の試験（ＡＵＣ＝０．５）に関して計算した。 [00104] 図２４Ａ〜２４Ｂ．ＩＤＣ（ＴＣＧＡコホート）における予後予測的な３４遺伝子のセットに関するカプラン・マイヤーおよびＲＯＣ曲線。図２４Ａ．予後予測的な３４遺伝子のセットを用いた、ＴＣＧＡコホート（ｎ＝４６６）から得られたＩＤＣ危険群に関する交差検証されたカプラン・マイヤー曲線。危険群間のログランク検定統計の並べ替えｐ値は１０００回の並べ替えに基づいていた（ｐ＜０．００１）。図２４Ｂ．ＲＯＣ曲線は０．７１の曲線下面積（ＡＵＣ）を有していた（ｐ＜０．００１）。並べ替えｐ値を、１０００回の並べ替えを用いた帰無仮説の試験（ＡＵＣ＝０．５）に関して計算した。 [00105] 図２５Ａ〜２５Ｂ．ＵＫ検証コホートにおける予後予測的な３４遺伝子のセットに関するカプラン・マイヤーおよびＲＯＣ曲線。図２５Ａ．予後予測的な３４遺伝子のセットを用いた、検証コホート（ｎ＝２０７）から得られた乳がん危険群に関する交差検証されたカプラン・マイヤー曲線。危険群間のログランク検定統計の並べ替えｐ値は１０００回の並べ替えに基づいていた（ｐ＝０．００１）。図２５Ｂ．ＲＯＣ曲線は０．６９のＡＵＣを有していた（ｐ＜０．００１）。並べ替えｐ値を、１０００回の並べ替えを用いた帰無仮説の試験（ＡＵＣ＝０．５）に関して計算した。 [00105] 図２５Ａ〜２５Ｂ．ＵＫ検証コホートにおける予後予測的な３４遺伝子のセットに関するカプラン・マイヤーおよびＲＯＣ曲線。図２５Ａ．予後予測的な３４遺伝子のセットを用いた、検証コホート（ｎ＝２０７）から得られた乳がん危険群に関する交差検証されたカプラン・マイヤー曲線。危険群間のログランク検定統計の並べ替えｐ値は１０００回の並べ替えに基づいていた（ｐ＝０．００１）。図２５Ｂ．ＲＯＣ曲線は０．６９のＡＵＣを有していた（ｐ＜０．００１）。並べ替えｐ値を、１０００回の並べ替えを用いた帰無仮説の試験（ＡＵＣ＝０．５）に関して計算した。 [00106] 図２６．ＰＩＫ３ＣＡのｍＲＮＡ発現およびＣｐＧ ＤＮＡメチル化の間の負の相関（ＦＤＲ＜０．００１）を示す表。 [00107] 図２７．ＩＤＣにおける全生存と関係する（Ｐ値＜０．０５）ＤＮＡメチル化されたＣｐＧ部位を示す表。 [00107] 図２７．ＩＤＣにおける全生存と関係する（Ｐ値＜０．０５）ＤＮＡメチル化されたＣｐＧ部位を示す表。 [00107] 図２７．ＩＤＣにおける全生存と関係する（Ｐ値＜０．０５）ＤＮＡメチル化されたＣｐＧ部位を示す表。 [00108] 図２８．臨床転帰と関係しており、独立したＩＤＣ下位クラスにわたって検証された２４（２４）種類のｍＲＮＡおよび１０（１）種類のｍｉＲＮＡを示す表。コード遺伝子はさらにＤＮＡメチル化／ＯＳ分析および体細胞突然変異の存在により限定された。角括弧は検証のために用いられた独立したＩＤＣ下位クラスを示す。Ｍａｒｇ Ｎｅｇ＝断端陰性（Ｍａｒｇｉｎ Ｎｅｇａｔｉｖｅ）。Ｈｏｒｍ Ｒｅｃ＋はＥＲ＋および／またはＰＲ＋の腫瘍を意味する。変異率：低＜エキソーム中２５個の変異、２５個＜＝中程度＜＝５０個、高＞５０個。変異：ＰＩ３Ｋ（ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＫＴ１、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３Ｒ１）、ＴＰ５３ ＰＩＫ３ＣＡは二重変異体である。ｎｏＭａｊｏｒＭｕｔ＝ＰＩ３Ｋ、ＴＰ５３、ＭＡＰＫおよびＧＡＴＡ３以外のもの。 [00109] 図２９．ＴＣＧＡコホート（ｎ＝４６６）における転帰に関する統合されたＲＮＡ線形危険予測因子を示す表。 [00110] 図３０．浸潤性腺管癌における局所性リンパ節転移（Ｎ）によるカプラン・マイヤー生存推定（全体ログランク検定、Ｐ値＝０．００５）。 [00111] 図３１．浸潤性腺管癌における遠隔転移（Ｍ）によるカプラン・マイヤー生存推定（全体ログランク検定、Ｐ値＝０．０２６）。 [00112] 図３２．浸潤性腺管癌における固有亜型によるカプラン・マイヤー生存推定（全体ログランク検定、Ｐ値＝０．０４２）。 [00113] 図３３．浸潤性腺管癌におけるＡＪＣＣ病期によるカプラン・マイヤー生存推定（全体ログランク検定、Ｐ値＝０．００２）。 [00114] 図３４．浸潤性腺管癌におけるＴ期によるカプラン・マイヤー生存推定（全体ログランク検定、Ｐ＜０．００１）。 [00115] 図３５．浸潤性腺管癌におけるエストロゲン受容体（ＥＲ）状態によるカプラン・マイヤー生存推定（ブレスロー検定、Ｐ値＝０．０１６）。 [00116] 図３６．浸潤性腺管癌におけるトリプルネガティブ（ＴＮＢＣ）状態によるカプラン・マイヤー生存推定（ブレスロー検定、Ｐ値＝０．０４１）。 [00117] 図３７．浸潤性腺管癌におけるＴＰ５３体細胞突然変異状態によるカプラン・マイヤー生存推定（ログランク検定、有意ではない）。 [00118] 図３８．浸潤性腺管癌におけるＰＩＫ３ＣＡ経路体細胞突然変異状態によるカプラン・マイヤー生存推定（ログランク検定、有意ではない）。
[00119] この開示全体を通して、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書を、引用を同定することにより参照する。これらの刊行物、特許および公開された特許明細書の開示を、この発明が属する技術の現状をより完全に記述するために本開示の中に参照により援用する。
[00120] 定義および一般的論考
[00121] 本明細書において互換的に用いられる際、“ｍｉＲ遺伝子産物”、“マイクロＲＮＡ”、“ｍｉＲ”、または“ｍｉＲＮＡ”は、ｍｉＲ遺伝子からのプロセシングされていない、またはプロセシングされたＲＮＡ転写産物を指す。ｍｉＲ遺伝子産物はタンパク質に翻訳されないため、用語“ｍｉＲ遺伝子産物”にはタンパク質は含まれない。そのプロセシングされていないｍｉＲ遺伝子転写産物は“ｍｉＲ前駆体”とも呼ばれ、典型的には約７０〜１００ヌクレオチド長のＲＮＡ転写産物を含む。そのｍｉＲ前駆体はＲＮＡ分解酵素（例えばＤｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ（例えば大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ））による消化によりプロセシングされて活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子になることができる。この活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は“プロセシングされた”ｍｉＲ遺伝子転写産物または“成熟”ｍｉＲＮＡとも呼ばれる。
[00122] その活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体から、天然のプロセシング経路を通して（例えば完全な細胞または細胞溶解物を用いて）、または合成的プロセシング経路により（例えば単離されたプロセシング酵素、例えば単離されたＤｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、またはＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを用いて）得ることができる。その活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子はｍｉＲ前駆体からプロセシングされなければならないわけではなく、生物学的合成または化学合成により直接生成することもできることは理解されている。マイクロＲＮＡが本明細書において名前により言及される場合、別途示さない限り、その名前はその前駆体および成熟形態両方に対応する。
[00123] ＤＮＡ デオキシリボ核酸
[00124] ｍＲＮＡ メッセンジャーＲＮＡ
[00125] ｍｅＤＮＡ ＤＮＡメチル化
[00126] ｍｉＲ マイクロＲＮＡ
[00127] ＰＣＲ ポリメラーゼ連鎖反応
[00128] 前ｍｉＲＮＡ 前駆体マイクロＲＮＡ
[00129] ｑＲＴ−ＰＣＲ 定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
[00130] ＲＮＡ リボ核酸
[00131] 本明細書における記述は典型的かつ説明的なものでしかなく、本教示の範囲を限定することは意図していないことは理解されるべきである。この出願において、別途明確に記載しない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。
[00132] 別途言及しない限り、技術用語は慣習的な用法に従って用いられる。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press出版、1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al. (編者), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版、1994 (ISBN 0-632-02182-9)；およびRobert A. Meyers (編者), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk
Reference, VCH Publishers, Inc.出版、1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見つけることができる。
[00133] 本開示の様々な態様の再考を容易にするため、以下の特定の用語の説明を提供する：
[00134] 補助的療法：一次処置の作用を向上させるために一次処置との組み合わせで用いられる処置。
[00135] 臨床転帰：疾患もしくは障害に関する処置後の、または処置なしでの患者の健康状態を指す。臨床転帰には、死亡までの時間の長さにおける増大、死亡までの時間の長さにおける減少、生存の機会における増大、死亡の危険性における増大、生存、疾患なしでの生存、慢性疾患、転移、進行した、または侵攻性の疾患、疾患の再発、死亡、および療法に対する望ましい、または乏しい応答が含まれるが、それらに限定されない。
[00136] 生存における減少：本明細書で用いられる際、“生存における減少”は、患者の死亡前の時間の長さにおける減少、またはその患者の死亡の危険性における増大を指す。
[00137] 発現のレベルを検出すること：例えば、“ｍｉＲまたはｍｉＲＮＡ発現のレベルを検出すること”は、試料中に存在するｍｉＲまたはｍｉＲＮＡの量を定量化することを指す。特定のｍｉＲ、またはあらゆるマイクロＲＮＡの発現を検出することは、当技術で既知の、または本明細書で記述されるあらゆる方法を用いて、例えばｑＲＴ−ＰＣＲにより達成することができる。ｍｉＲの発現を検出することには、ｍｉＲＮＡの成熟形態またはｍｉＲＮＡの発現と相関している前駆体形態のどちらかの発現を検出することが含まれる。典型的には、ｍｉＲＮＡ検出法は、例えばＲＴ−ＰＣＲによる配列特異的検出を含む。ｍｉＲ特異的プライマーおよびプローブは、その前駆体および成熟したｍｉＲ核酸の配列を用いて設計することができ、それは当技術で既知である。
[00138] ＤＮＡメチル化は、メチル基のシトシンピリミジン環の５位またはアデニンプリン環の６位の窒素へのメチル基の付加を含む生化学的プロセスである。ＤＮＡメチル化は細胞における遺伝子発現パターンを安定して変化させ、遺伝子転写の重要な制御因子である。異常なＤＮＡメチル化パターンは多数のヒトの悪性腫瘍と関連付けられており、２つの別個の形態で見付かっている：正常組織と比較した過剰メチル化および低メチル化。過剰メチル化は典型的にはプロモーター領域中のＣｐＧアイランドにおいて起こり、遺伝子の不活性化と関係している。全体的な低メチル化もがんの発現および進行に関わっていることが示されてきた。
[00139] メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）はゲノム情報をＤＮＡからリボソームに運ぶＲＮＡ分子の大きなファミリーであり、そこでそれらは遺伝子発現のタンパク質産物のアミノ酸配列を指定する。ＲＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡの転写後、そのｍＲＮＡはアミノ酸のポリマーであるタンパク質へと翻訳される。
[00140] マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：遺伝子発現を制御する一本鎖ＲＮＡ分子。マイクロＲＮＡは一般に約２２ヌクレオチドの長さである。マイクロＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物からプロセシングされて前駆体（前）ｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステムループ構造になり、最終的に機能する成熟したマイクロＲＮＡになる。成熟したマイクロＲＮＡ分子は１種類以上のメッセンジャーＲＮＡ分子に部分的に相補的であり、それらの主な機能は遺伝子発現を下方制御することである。マイクロＲＮＡは遺伝子発現をＲＮＡｉ経路を通して制御する。
[00141] ｍｉＲ発現：本明細書で用いられる際、“低ｍｉＲ発現”および“高ｍｉＲ発現”は、試料中にあるｍｉＲＮＡのレベルを指す相対的な用語である。一部の態様において、低および高ｍｉＲ発現は、対照試料および試験試料の群中のｍｉＲＮＡレベルの比較により決定される。次いで低および高発現を、試料中の１種類以上のｍｉＲの発現が平均ｍｉＲ発現レベルまたはｍｉＲ発現レベルの中央値よりも上である（高い）か、または下である（低い）かに基づいて、それぞれの試料に割り当てることができる。個々の試料に関して、高または低ｍｉＲ発現は、その試料の正常な、高い、もしくは低い発現を有することが既知である対照もしくは基準試料に対する比較により、または標準値に対する比較により決定することができる。低および高ｍｉＲ発現には、ｍｉＲＮＡの前駆体もしくは成熟形態のどちらか、または両方の発現が含まれ得る。
[00142] 患者：本明細書で用いられる際、用語“患者”にはヒトおよび非ヒト動物が含まれる。処置に関する好ましい患者はヒトである。“患者”および“対象”は、本明細書において互換的に用いられている。
[00143] 医薬的に許容できるビヒクル：この開示において有用な医薬的に許容できるキャリヤー（ビヒクル）は従来のものである。E. W. Martin, Mack Publishing Co.（ペンシルベニア州イーストン）によるRemington’s Pharmaceutical Sciences、第１５版(1975)は、１種類以上の療法化合物、分子または薬剤の医薬的送達に適した組成物および配合物を記載している。
[00144] 一般に、そのキャリヤーの性質は、用いられる個々の投与方式に依存するであろう。例えば、非経口配合物は通常、医薬的および生理的に許容できる流体、例えば水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等が含まれる注射可能な流体をビヒクルとして含む。固体組成物（例えば粉末、丸剤、錠剤、またはカプセルの形態）に関して、一般に用いられる非毒性の固体のキャリヤーには、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性のキャリヤーに加えて、投与される予定の医薬組成物は、少量の非毒性の補助的物質、例えば湿潤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。
[00145] 疾患を予防、処置または改善すること：疾患を“予防すること”は、疾患の完全な発現を抑制することを指す。“処置すること”は、疾患の徴候もしくは症状または病的状態をそれが発現し始めた後に改善する療法的介入を指す。“改善すること”は、疾患の徴候または症状の数または重症度における低減を指す。
[00146] 予後不良：一般に生存における減少、または言い換えれば死亡の危険性における増大もしくは死亡までの時間における減少を指す。予後不良は、疾患の重症度における増大、例えばがんの他の組織および／または器官への拡散（転移）における増大も指し得る。
[00147] スクリーニング：本明細書で用いられる際、“スクリーニング”は、そのような疾患に影響を及ぼす候補薬剤を評価および同定するために用いられるプロセスを指す。マイクロＲＮＡの発現は、当技術で既知の、および本明細書で記述されるいくつかの技法のいずれか１つを用いて、例えばマイクロアレイ分析により、またはｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化することができる。
[00148] 小分子：典型的には約１０００ダルトン未満、または一部の態様において約５００ダルトン未満の分子量を有する分子、ここでその分子はある測定可能な程度まで標的分子の活性を調節することができる。
[00149] 療法的：診断および処置の両方が含まれる総称。
[00150] 療法剤：対象に適切に投与された際に所望の療法的または予防的作用を誘導することができる化学化合物、小分子、または他の組成物、例えばアンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインまたはサイトカイン。
[00151] 本明細書で用いられる際、“候補薬剤”または“試験化合物”は、それが療法剤として機能することができるかどうかを決定するためのスクリーニングのために選択された化合物である。“保温すること”には、薬剤に関する細胞または組織と相互作用するための十分な長さの時間が含まれる。“接触させること”には、固体または液体形態の薬剤を細胞または組織と共に保温することが含まれる。細胞または組織を薬剤で“処置すること”には、その薬剤をその細胞もしくは組織と接触させること、またはその薬剤をその細胞もしくは組織と共に保温することが含まれる。
[00152] 療法上有効量：その薬剤で処置されている対象において、または細胞において所望の作用を達成するために十分な明記された医薬または療法剤の量。薬剤の有効量は、処置されている対象または細胞、およびその療法組成物の投与の方法が含まれるがそれらに限定されないいくつかの要因に依存するであろう。
[00153] 本方法の一部の態様において、対照の使用が望ましい。その点において、その対照は同じ患者から得られた非がん性組織試料、または健康な対象、例えば健康な組織提供者から得られた組織試料であってよい。別の例において、その対照は既存の（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）値から計算された標準である。１態様において、その対照は乳がんのがん性組織試料である。その対照は、既知の形成異常、既知のがんのタイプ、既知の変異状態、および／または既知の腫瘍の病期の組織に由来していてよい。１態様において、その対照は浸潤性腺管癌に由来する既存の平均値である。別の態様において、その対照は非浸潤性腺管癌に由来する既存の平均値である。１態様において、その対照はより早い時点におけるその患者の腫瘍試料からのものであり；この態様は、乳がんの進行または寛解を評価する場合に特に有用であり得る。
[00154] 腫瘍試料および非がん性組織試料は、当技術で既知のあらゆる方法に従って得ることができる。例えば、腫瘍および非がん性試料は、切除を受けたがん患者から得ることができ、またはそれらは皮下針を用いた抜き取りにより、顕微手術により、もしくはレーザー捕獲により得ることができる。対照（非がん性）試料は、例えば死体提供者から、または健康な提供者から得ることができる。
[00155] その対象から得られた試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した変化（例えば増大または減少）は、その対象におけるがん関連疾患の存在を示している。
[00156] １態様において、その試験試料中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルはその対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも大きい（すなわち、そのｍｉＲ遺伝子産物の発現は“上方制御されている”）。本明細書で用いられる際、ｍｉＲ遺伝子産物の発現は、対象からの細胞または組織試料中のｍｉＲ遺伝子産物の量が対照の細胞または組織試料中の同じ遺伝子産物の量よりも大きい場合に“上方制御されている”。
[00157] 別の態様において、その試験試料中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも小さい（すなわち、そ
のｍｉＲ遺伝子産物の発現は“下方制御されている”）。本明細書で用いられる際、ｍｉＲ遺伝子の発現は、対象からの細胞または組織試料中のその遺伝子から産生されたｍｉＲ遺伝子産物の量が対照の細胞または組織試料中の同じ遺伝子から産生された量よりも少ない場合に“下方制御されている”。
[00158] 対照および正常な試料中の相対的なｍｉＲ遺伝子発現は、１種類以上のＲＮＡ発現標準に関して決定することができる。その標準は、例えばゼロｍｉＲ遺伝子発現レベル、標準的な細胞株におけるそのｍｉＲ遺伝子の発現レベル、その対象の冒されていない組織におけるそのｍｉＲ遺伝子の発現レベル、または以前に正常なヒトの対照の集団に関して得られたｍｉＲ遺伝子発現の平均レベルを含み得る。
[00159] 試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、生物学的試料中のＲＮＡ発現レベルを検出するのに適したあらゆる技法を用いて測定することができる。生物学的試料（例えば細胞、組織）中のＲＮＡ発現レベルを決定するための適切な技法（例えばノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション）は、当業者には周知である。特定の態様において、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルはノーザンブロット分析を用いて検出される。例えば、細胞の全ＲＮＡを細胞から核酸抽出緩衝液の存在下でのホモジナイゼーション、続いて遠心分離により精製することができる。核酸が沈殿し、ＤＮＡをＤＮＡ分解酵素による処理および沈殿により除去する。次いでそのＲＮＡ分子を標準的な技法に従うアガロースゲル上でのゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィルターに転写する。次いでそのＲＮＡを加熱によりそのフィルター上に固定する。特定のＲＮＡの検出および定量化は、問題のＲＮＡに相補的な適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて成し遂げられる。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al.（編者）, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第７章を参照、その全開示を参照により援用する。
[00160] 一部の態様において、スクリーニングはその候補薬剤／試験化合物を細胞と接触させることを含む。その細胞は患者から得られた初代細胞であることができ、またはその細胞は不死化された、もしくは形質転換された細胞であることができる。
[00161] その候補薬剤／試験化合物は、あらゆるタイプの薬剤、例えばタンパク質、ペプチド、小分子、抗体または核酸であることができる。一部の態様において、その候補薬剤はサイトカインである。一部の態様において、その候補薬剤は小分子である。スクリーニングには、高スループットスクリーニングおよび個々の候補薬剤または候補薬剤の小さな群のスクリーニングの両方が含まれる。
[00162] マイクロＲＮＡの検出
[00163] 本明細書における一部の態様において、試料中に存在するｍｉＲＮＡを同定することが望ましい。
[00164] 前駆体マイクロＲＮＡ（前ｍｉＲＮＡ）および成熟ｍｉＲＮＡの配列は、例えばサンガー研究所によりオンラインで利用可能なｍｉＲＢａｓｅデータベースにより、公的に利用可能である(Griffiths-Jones et al., Nucleic Acids Res. 36:D154-D158, 2008; Griffiths-Jones et al., Nucleic Acids Res. 34:D140-D144, 2006;およびGriffiths-Jones, Nucleic Acids Res. 32:D109-D111, 2004を参照)。本明細書で開示される好ましいファミリーのメンバーの前駆体および成熟形態の配列は、本明細書で提供されている。
[00165] ＲＮＡ発現の検出および定量化は、当技術分野で周知のいくつかの方法のいずれか１つにより達成することができる。ＲＮＡファミリーのメンバーに関する既知の配
列を用いて、特異的なプローブおよびプライマーを適宜下記で記述される検出法における使用のために設計することができる。
[00166] 一部の場合において、ＲＮＡ検出法は試料、例えば細胞または組織試料からの核酸の単離を必要とする。ＲＮＡおよび特にｍｉＲＮＡが含まれる核酸は、当技術分野で既知のあらゆる適切な技法を用いて単離することができる。例えば、フェノールに基づく抽出はＲＮＡの単離のための一般的な方法である。フェノールに基づく試薬は、細胞および組織の破壊ならびにそれに続く夾雑物からのＲＮＡの分離のために、変性剤およびＲＮＡ分解酵素阻害剤の組み合わせを含有する。フェノールに基づく単離手順は、１０〜２００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ種（例えば、前駆体および成熟ｍｉＲＮＡ、５Ｓおよび５．８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ならびにＵ１核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ））を回収することができる。加えて、抽出手順、例えばＴＲＩＺＯＬ（商標）またはＴＲＩ ＲＥＡＧＥＮＴ（商標）を用いる抽出手順は、全てのＲＮＡ（大分子および小分子）を精製すると考えられ、ｍｉＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含有する生物学的試料から全ＲＮＡを単離するための効率的な方法である。
[00167] 一部の態様において、マイクロアレイの使用が望ましい。マイクロアレイは、複雑な生化学的試料の並行分析を可能にする、核酸、タンパク質、小分子、細胞または他の物質の微視的な整列したアレイである。ＤＮＡマイクロアレイは、マイクロチップ、スライドガラスまたはマイクロスフィアの大きさのビーズであることができる固体支持体に化学的に結合している捕捉プローブとして知られる異なる核酸プローブを有する。マイクロアレイは、例えば多数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および／またはｍｉＲＮＡの発現レベルを同時に測定するために用いることができる。
[00168] マイクロアレイは、微細に尖ったピンによるスライドガラス上への印刷、予め作られたマスクを用いたフォトリソグラフィー、動的マイクロミラー装置を用いたフォトリソグラフィー、インクジェット印刷、または微小電極アレイ上での電気化学が含まれる様々な技術を用いて製作することができる。
[00169] 例えばｍｉＲＮＡのマイクロアレイ分析は（これらの手順はあらゆるＲＮＡ分析のために改変した形態で用いることができるが）、当技術分野で既知のあらゆる方法に従って成し遂げることができる。１つの例において、ＲＮＡを細胞または組織試料から抽出し、低分子ＲＮＡ（１８〜２６ヌクレオチドのＲＮＡ）を全ＲＮＡから変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてサイズ選択する。オリゴヌクレオチドリンカーをその低分子ＲＮＡの５’および３’末端に結合させ、得られたライゲーション産物を、１０サイクルの増幅を用いるＲＴ−ＰＣＲ反応のための鋳型として用いる。センス鎖ＰＣＲプライマーはその５’末端に結合した蛍光体を有し、それによりそのＰＣＲ産物のセンス鎖を蛍光標識する。そのＰＣＲ産物を変性させ、次いでマイクロアレイにハイブリダイズさせる。ＰＣＲ産物（標的核酸と呼ばれ、そのアレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的である）は、塩基対合によりその捕捉プローブが固定されているスポットにハイブリダイズするであろう。次いでそのスポットはマイクロアレイレーザースキャナーを用いて励起した際に蛍光を発するであろう。次いでそれぞれのスポットの蛍光強度を、いくつかの陽性および陰性対照ならびにアレイデータ正規化法を用いて個々のｍｉＲＮＡのコピー数に換算して評価し、それは結果として個々のｍｉＲＮＡの発現のレベルの評価をもたらすであろう。
[00170] 代わりの方法において、細胞または組織試料から抽出された低分子ＲＮＡ画分（ｍｉＲＮＡが含まれる）を含有する全ＲＮＡを低分子ＲＮＡのサイズ選択なしで直接用いて、Ｔ４ＲＮＡリガーゼおよびどちらかの蛍光標識された短いＲＮＡリンカーを用いて３’末端標識する。そのＲＮＡ試料を３０℃で２時間の保温により標識し、続いて８０
℃で５分間のＴ４ＲＮＡリガーゼの熱不活性化を行う。アレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的な蛍光体標識されたｍｉＲＮＡは、塩基対合によりその捕捉プローブが固定されているスポットにハイブリダイズするであろう。マイクロアレイ走査およびデータ処理は上記で記述したように実施される。
[00171] スポットされたオリゴヌクレオチドのマイクロアレイ、予め製作された（ｐｒｅ−ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ）オリゴヌクレオチドのマイクロアレイおよびスポットされた長いオリゴヌクレオチドのアレイを含め、用いられるいくつかのタイプのマイクロアレイが存在する。スポットされたオリゴヌクレオチドのマイクロアレイでは、捕捉プローブはｍｉＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドである。このタイプのアレイは典型的には、２種類の異なる蛍光体で標識されている比較すべき２つの試料（例えば非がん性組織およびがん性または試料組織）からのサイズ選択された低分子ＲＮＡの増幅されたＰＣＲ産物とハイブリダイズさせる。あるいは、（ｍｉＲＮＡが含まれる）低分子ＲＮＡ画分を含有する全ＲＮＡをその２つの試料から抽出し、低分子ＲＮＡのサイズ選択なしで直接用いて、Ｔ４ＲＮＡリガーゼおよび２種類の異なる蛍光体で標識された短いＲＮＡリンカーを用いて３’末端標識する。その試料を混合して単一のマイクロアレイにハイブリダイズさせ、次いでそれを走査し、上方制御および下方制御されたｍｉＲＮＡ遺伝子の可視化が１アッセイで可能になる。
[00172] 予め製作されたオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたは単一チャンネルマイクロアレイでは、そのプローブは既知の、または予想されるｍｉＲＮＡの配列にマッチするように設計されている。完全なゲノムをカバーする商業的に入手可能な設計が存在する（例えば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘまたはＡｇｉｌｅｎｔからのもの）。これらのマイクロアレイは遺伝子発現の絶対値の推定を与え、従って２つの条件の比較は２つの別々のマイクロアレイの使用を必要とする。
[00173] スポットされた長いオリゴヌクレオチドのアレイは５０〜７０塩基長のオリゴヌクレオチドの捕捉プローブからなり、インクジェットまたはロボット印刷のどちらかにより製造される。短いオリゴヌクレオチドのアレイは２０〜２５塩基長のオリゴヌクレオチドのプローブからなり、フォトリソグラフィーでの合成により（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、またはロボット印刷により製造される。
[00174] 一部の態様において、定量的ＲＴ−ＰＣＲの使用が望ましい。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応の産物の量を迅速に測定するために用いられる、ポリメラーゼ連鎖反応の改変である。ｑＲＴ−ＰＣＲは一般に、ある遺伝子配列、例えばｍｉＲが試料中に存在するかどうか、そしてそれが存在する場合、その試料中のコピー数を決定する目的で用いられる。ｍｉＲＮＡを含め、核酸分子の発現を決定することができるあらゆるＰＣＲの方法が本開示の範囲内に入る。当技術で既知のｑＲＴ−ＰＣＲ法のいくつかのバリエーションが存在し、その３つを下記で記述する。
[00175] 定量的ポリメラーゼ連鎖反応のための方法には、アガロースゲル電気泳動、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（二本鎖ＤＮＡ色素）の使用、および蛍光レポータープローブの使用による方法が含まれるが、それらに限定されない。後者２つはリアルタイムで分析することができる。
[00176] アガロースゲル電気泳動により、未知の試料および既知の試料を、標的ＤＮＡの既知の濃度の同様にサイズ分けした区分を用いて増幅のために調製する。両方の反応を、同一の条件で（好ましくは同じプライマーまたは少なくとも類似のアニーリング温度のプライマーを用いて）同じ長さの時間の間運転する。アガロースゲル電気泳動を用いてその反応の産物をそれらの元のＤＮＡおよび余分なプライマーから分離する。既知および
未知の試料の相対的な量を測定して、未知の試料の量を決定する。
[00177] ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ色素の使用はアガロースゲル法よりも正確であり、結果をリアルタイムで与えることができる。ＤＮＡ結合色素は全ての新しく合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、蛍光強度における増大が測定され、そうして初期濃度を決定することが可能になる。しかし、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎはあらゆる予想外のＰＣＲ産物ならびにプライマーダイマーを含む全ての二本鎖ＤＮＡを標識し、それは混乱およびアーティファクトの可能性につながる。その反応は通常通り蛍光二本鎖ＤＮＡ色素の添加により調製される。その反応を運転し、蛍光のレベルを監視する（その色素は二本鎖ＤＮＡに結合した場合のみ蛍光を発する）。標準試料または標準曲線を参照して、そのＰＣＲにおける二本鎖ＤＮＡ濃度を決定することができる。
[00178] 蛍光レポータープローブ法は、全ての二本鎖ＤＮＡではなくプローブ配列のみを定量化するために、配列特異的な核酸に基づくプローブを用いる。それは一般に、隣接した位置に保持された蛍光レポーターおよび消光物質を有するＤＮＡに基づくプローブ（いわゆる二重標識プローブ）を用いて実施される。レポーターの消光物質への密接な近接はその蛍光を妨げ；その蛍光が検出されるのはそのプローブが壊れた際のみである。このプロセスは、関わっているポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性に依存している。
[00179] そのリアルタイム定量的ＰＣＲ反応は、二重標識プローブの添加により調製される。その二本鎖ＤＮＡ鋳型が変性すると、そのプローブはその鋳型ＤＮＡの対象の領域中のその相補配列に結合することができる。そのＰＣＲ反応混合物を加熱してポリメラーゼを活性化した際、そのポリメラーゼはプライマーが結合した（ｐｒｉｍｅｄ）一本鎖鋳型ＤＮＡに対する相補鎖の合成を開始する。重合が継続するにつれて、それはその相補配列に結合したプローブに到達し、次いでそれはそのポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により加水分解され、それによりその蛍光レポーターおよび消光物質分子が分離される。これは結果として蛍光の増大をもたらし、それが検出される。リアルタイムＰＣＲ反応の熱サイクルの間、それぞれのＰＣＲサイクルにおいて加水分解された二重標識プローブから放出されるような蛍光における増大が監視され、それは最終的な、従って最初のＤＮＡの量の正確な決定を可能にする。
[00180] 一部の態様において、インサイチュハイブリダイゼーションの使用が望ましい。インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、核酸ハイブリダイゼーションの技術を単一細胞レベルに適用および外挿し、細胞化学、免疫細胞化学、および免疫組織化学の技術分野との組み合わせで、形態の維持ならびに維持および同定されるべき細胞マーカーの同定を可能にし、集団、例えば組織および血液試料内の特定の細胞への配列の局在確認を可能にする。ＩＳＨは、相補的核酸を用いて組織の一部または切片中の（インサイチュ）、またはその組織が十分に小さい場合は組織全体中の（ホールマウントＩＳＨ）１種類以上の特定の核酸配列の位置を特定するタイプのハイブリダイゼーションである。ＲＮＡ ＩＳＨを用いて組織中の発現パターン、例えばｍｉＲＮＡの発現をアッセイすることができる。
[00181] プローブ、例えばｍｉＲＮＡ特異的プローブが細胞に入ることを可能にするため、試料細胞または組織を処理してそれらの透過性を増大させる。そのプローブを処理した細胞に添加し、適切な温度でハイブリダイズさせ、過剰なプローブを洗い流す。相補的プローブは、組織中のそのプローブの位置および量をオートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法または免疫アッセイを用いて決定することができるように、放射性、蛍光または抗原性タグで標識されている。その試料は、本明細書で記述されているようなあらゆる試料、例えば非がん性またはがん性組織試料であってよい。個々のｍｉＲの配列は既知である
ため、ｍｉＲ特異的プローブをそのプローブが特定のｍｉＲ遺伝子産物に特異的に結合するように適宜設計することができる。ｍＲＮＡに特異的なプローブを利用することもできる。
[00182] ＲＮＡの検出のため、インサイチュＰＣＲの前に細胞内逆転写工程を用いてＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡを生成することができる。これは低コピーＲＮＡ配列の検出を可能にする。
[00183] 細胞内ＰＣＲ産物の検出は一般に、ＰＣＲ産物特異的プローブを用いたＩＳＨによる間接的インサイチュＰＣＲ、または熱サイクルの間にＰＣＲ産物中に組み込まれた標識されたヌクレオチド（例えばジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、３Ｈ−ＣＴＰまたはビオチン−１６−ｄＵＴＰ）の直接検出によるＩＳＨなしの直接的インサイチュＰＣＲのような技法により達成される。
[00184] 一般的論考
[00185] エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性およびＥＲ陰性乳がんは、分子的な点で別個の疾患である。２つの重要な分子シグネチャー：ＰＲおよびヒト上皮成長因子受容体２型（ＨＥＲ２）は、現在分類および処置の線引き（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）において基礎的であると信じられている。ＥＲ、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびＨＥＲ２の発現を欠いている“トリプルネガティブ”乳がん（ＴＮＢＣ）は、現在の標的化療法に反応しない侵攻性の悪性腫瘍である。非浸潤性腺管癌（ＤＣＩＳ）は、基底膜を通る浸潤のない乳管内の悪性細胞の増殖を反映する病変の不均一な群である。全乳がんの約８０％がＢＣの最も高頻度なタイプである浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）である。別個の分子亜型の乳房腫瘍（ｌｕｍｉｎａｌ Ａ／Ｂ、ＨＥＲ２＋、およびｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）は劇的に異なるｍＲＮＡプロファイルを有する。乳房腫瘍発生の１つの仮説は、上皮の過剰増殖からＤＣＩＳへ、次いで浸潤癌（ＩＤＣ）への漸進的な転換を仮定する。この進行モデルは、臨床および疫学的データにより、ならびに分子的クローン性研究により強く支持されている。１９８０年まで、ＤＣＩＳは稀にしか診断されず、ＢＣの１％未満に相当していた。マンモグラフィーの使用の増大と共に、ＤＣＩＳは米国における新規に診断されたＢＣの症例の１５％〜２５％を占めるＢＣの最も急速に増大する亜集団になった。
[00186] 正常からＤＣＩＳへの転換の間に劇的な変化が起こるが、驚くべきことに、同じ組織学的亜型の非浸潤性および浸潤性乳癌は一般に同じ遺伝的および後成的変化ならびに発現パターンを共有している。
[00187] 対照的に、異なる亜型（ｌｕｍｉｎａｌ、ＨＥＲ２＋、およびｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ）の乳房腫瘍のｍＲＮＡプロファイルは劇的に異なる。ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＥＲＢＢ２、ＭＹＣが含まれる数多くの腫瘍抑制因子およびがん遺伝子の発現および変異状態がＤＣＩＳおよびＩＤＣにおいて分析されており、腫瘍亜型による違いが見付かっているが、組織学的病期による違いは見付かっていない。例えば、ＴＰ５３における変異はｂａｓａｌ−ｌｉｋｅおよびＨＥＲ２＋亜型においてｌｕｍｉｎａｌ腫瘍と比較してより高頻度であり；ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅの症例ではＰＩＫ３ＣＡは稀にしか変異していないがＰＴＥＮは高頻度で失われており、ＥＲＢＢ２の増幅はＨＥＲ２＋亜型に特異的である。それらの生物学的機能に基づいて選択されたいくつかの候補遺伝子の発現がＤＣＩＳにおいても分析されてきた。
[00188] 本明細書において、正常な乳房から非浸潤性腺管癌への転換に関して確立されたマイクロＲＮＡプロファイルは大部分が非浸潤性腺管癌から浸潤性腺管癌への転換において維持されていることが示されている。
[00189] 加えて、９マイクロＲＮＡシグネチャーを用いて浸潤癌を非浸潤癌から識別することができることが示されている。具体的には、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−２１０および−２２１は非浸潤癌において下方制御され、浸潤性転換において上方制御されており、従ってがんの進行経路に沿った発現の逆転を特徴としていることが示された。
[00190] 全生存および転移までの時間に関するマイクロＲＮＡシグネチャーも記述する。５種類の非コード遺伝子：ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ｂ＊、ｍｉＲ−１９７およびｌｅｔ−７ｉが両方の予後予測シグネチャーと関係しており；ｍｉＲ−２１０は浸潤性転換にも関わっている唯一の非コード遺伝子である。浸潤性転換において影響を受ける重要な細胞機能を特定するため、ｍｉＲ−２１０に対して逆相関するプロファイルを有するタンパク質コード遺伝子：ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＤ、ＦＡＮＣＦ、ＰＡＲＰ１、Ｅ−カドヘリン、Ｒｂ１の同定が行われ、それは全て非浸潤癌において活性化されており、浸潤癌において下方制御されていた。
[00191] 加えて、キナーゼドメインを欠き、非浸潤性腺管癌においてのみ過剰発現されている切り詰められたＥＧＦＲのような、特別な特徴を有する差次的スプライシングイソ型を本明細書において記述する。
[00192] 正常な乳房、非浸潤性および浸潤性腺管癌が含まれる乳がんに関する高度に情報価値のあるｍｉＲＮＡプロファイルを発見するため、大規模配列決定からのマイクロＲＮＡデータを調べた。本明細書で記述されるような本発明の態様は、ＢＣの進行、診断の実施、進行の予測、生存時間の推定、および転移の予測においてｍｉＲＮＡを適用する知識および方法を実質的に拡張する。
[00193] 本明細書において、正常な乳房／ＤＣＩＳおよびＤＣＩＳ／ＩＤＣ転換に関わるｍｉＲ−２１０および他の重要なｍｉＲＮＡの役割を記述する。
[00194] 本明細書において、組織学的および分子的ＢＣタイプにおいて差次的に制御されているマイクロＲＮＡも記述する。これは、それがここで転移までの時間および全生存と関係するマイクロＲＮＡを同定するため、特に有用であり、特別な臨床的関連性を有する。予後予測シグネチャーにおいて同定された全ての非コード遺伝子は、ｍｉＲ−２１を除いて、転帰不良と関係している。ＤＣＩＳにおいて高度に増大するｍｉＲ−２１の発現は、ＩＤＣにおいて維持されており、または低下してさえいた。
[00195] 本明細書における実施例において特筆されるように、整えられた（ｔｒｉｍｍｅｄ）データセットにおいて、ｍｉＲ−４２３−３ｐはなお全生存において多変量Ｃｏｘ回帰により、および一変量分析により有意であった。予後と関係するｍｉＲＮＡの数は拡張され、ｍｉＲ−２１０は確証された。
[00196] 本明細書における実施例において、ｍｉＲ−１２６および−３３５はＤＣＩＳ／ＩＤＣ転換において下方制御される５種類のｍｉＲＮＡの中にあった。それでもなお、それらは転移までの時間または全生存とは関係していなかった。ＤＣＩＳ／ＩＤＣ転換において下方制御される別のｍｉＲＮＡはｍｉＲ−１０ｂであった；しかし、ｍｉＲ−１０ｂの転移への関連付けは存在しなかった。
[00197] 本明細書で記述される浸潤性マイクロＲＮＡシグネチャーを用いて、ＢＣの進行に関連付けられる遺伝子および機能を同定するためにさらなる分析を実施した。浸潤性シグネチャー中の９種類のｍｉＲＮＡの中で、ｍｉＲ−２１０は予後に関連付けられ発現の逆転を示す唯一のｍｉＲＮＡであった。従って、次いで本発明者らはＢＣの進行の間にｍｉＲ−２１０に対して拮抗的に振る舞うタンパク質コード遺伝子を決定した。これら
の遺伝子に関して、本発明者らは脱制御された経路を同定し、それは今度は重要な乳がん遺伝子の小さな群に対応していた。ＤＣＩＳにおいて活性化され、ＩＤＣにおいて下方制御されるこれらの遺伝子には、ＢＲＣＡ１、ＲＢ１、ＦＡＮＣＤ、ＦＡＮＣＦ、ＰＰ２ＣＡ、ＥＧＦＲ、ＰＡＲＰ１、ＮＬＫ、ＣＤＨ１およびＥＨＭＴ１が含まれていた（図５および図６）。
[00198] 従って、１つの広い観点において、本明細書において、ＩＤＣ患者における浸潤性に特異的な９種類のｍｉＲＮＡのマイクロシグネチャーならびに転移までの時間および全生存に関連付けられた５種類のｍｉＲＮＡを記述する。
[00199] 特定の観点において、本明細書において、ｍｉＲ−２１０はＢＣの進行の間に制御されており、２つの予後予測シグネチャーの構成要素でもあるという発見を記述する。
[00200] 別の特定の観点において、本明細書において、ｍｉＲ−２１０に拮抗的な様式で発現されている非常に顕著なＢＣ遺伝子のセットを記述する。
[00201] 本発明は以下の実施例においてさらに定義され、別途記載しない限り、ここで全ての部および百分率は重量によるものであり、度はセ氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すものであるが、説明としてのみ与えられていることは理解されるべきである。上記の論考およびこれらの実施例から、当業者はこの発明の本質的な特徴を確かめることができ、その精神および範囲から逸脱せずに、本発明の様々な変更および修正を行ってそれを様々な使用および条件に適応させることができる。この明細書中で言及される特許および非特許文献が含まれる全ての刊行物は、参照により明確に援用される。以下の実施例は本発明の特定の好ましい態様を説明することを意図しており、そのように明記されない限り、特許請求の範囲において定義される通りの本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
[00202] 従って、本発明の価値は本明細書における実施例への参照により理解することができる。
[00203]
[00204] 実施例１
[00205] 材料および方法
[00206] 乳房ｍｉＲＮＡプロファイルの最適代表に関する９８，０００の読みの最小運転複雑性を、複雑性５０を用いることにより決定した。代表５０を中心とした最近傍の複雑性の中央値としての複雑性５０を計算した（図７）。従って、この試験に含まれたのは、複雑性５０よりも大きい複雑性を有する運転のみであった（１８５個の試料から１０７個の試料が保持された）。異なる運転の正規化を、ＲＰＫＭの改変を用いて実施した（Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, & Wold B (2008) Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods 5(7):621-628）。一部の短いＲＮＡ配列に関する生データをFarazi et al. (2011) MicroRNA Sequence and Expression Analysis in Breast Tumors by Deep Sequencing,” Cancer Res. 71(13):4443-4453から得た。
[00207] 異なるｍｉＲＮＡ種の長さはほとんど一定であるため、ｍｉＲＮＡの長さは正規化に含まれず、従ってそれは単に１００万あたりの読み（ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）（ＲＰＭ）として計算された。その発現データは２００ＲＰＭにおける閾値
であり、発現値の２０％未満がｍｉＲＮＡの中央値からどちらの方向においても１．５倍未満の変化を有するｍｉＲＮＡを除外した。最終的な発現マトリックスは、１０７個の試料における１５９種類のｍｉＲＮＡに関する測定を含有していた。２標本Ｔ検定を２つのクラスの比較（すなわちＩＤＣ対ＤＣＩＳ）のために用いた。多変量並べ替え検定を、１０００回のランダムな並べ替えに基づいて計算した。誤検出率を用いて多重検定誤差を評価した。偽発見率の評価の信頼水準は８０％であり、偽陽性遺伝子の最大の許容される割合は５％であった。本発明者らは、その発現が転移までの時間および全生存に有意に関連しているｍｉＲＮＡをＣｏｘ比例ハザードモデルを用いることにより発見した。並べ替え検定を実施し、ここで時間および打ち切り指標（ｃｅｎｓｏｒｉｎｇ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ）を試料間でランダムに並べ替えた。有意な遺伝子に関する並べ替えｐ値を１００００回のランダムな並べ替えに基づいて計算した。ハザード比をｍｉＲＮＡ発現レベルにおける２倍変化に関して計算した。Ｃｏｘ回帰に基づくそれぞれの有意なｍｉＲＮＡに関して、カプラン・マイヤー生存曲線をプロットし、ここでその患者を発現の中央値において２つの群に分け、曲線間の差をログランク検定を用いて評価した。ヒト正常乳房、ＤＣＩＳおよびＩＤＣに関する全トランスクリプトームプロファイルは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０アレイに由来していた。４２の正常な乳房、１７のＤＣＩＳ、５１のＥＲ＋／ＨＥＲ２− ＩＤＣ、１７のＨＥＲ２＋／ＥＲ− ＩＤＣ、１７のＨＥＲ２＋／ＥＲ＋ ＩＤＣおよび３３のトリプルネガティブＩＤＣ試料（２５、２９）。ＣＥＬファイルまたはＲＭＡデータはＧＥＯデータベースから得た（ＧＳＥ３８９３、ＧＳＥ２１０９、ＧＳＥ２１４２２およびＧＳＥ２１４４４）。ＲＭＡを分位数正規化と共に用いた。アノテーション、可視化および統合型発見発現分析系統的エクスプローラーのためのデータベース（Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ， Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）（ＤＡＶＩＤ ＥＡＳＥ）を遺伝子オントロジー、疾患関連付けおよびＢｉｏｃａｒｔａ経路分析のために用いた。
[00208] ｍｉＲＮＡは非浸潤性腺管癌から浸潤性腺管癌への転換を定める
[00209] 浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）、非浸潤性腺管癌（ＤＣＩＳ）および正常な乳房に関するｍｉＲＮＡプロファイルを発見した。配列決定運転の複雑性選択に対する偏りのないアプローチを用いて、乳がんに関する堅牢かつ高度に情報価値のあるｍｉＲＮＡプロファイルを得た。
[00210] 本明細書において、ヒトのレパートリーを代表するｍｉＲＮＡプロファイルを生成するために必要な読みの最小数を決定するための手順を記述する（図７）。このＢＣデータセットに関して、最小限の必要とされる複雑性は９８，０００の読みのものであった。この閾値を適用して、７８の低い複雑性の乳がんの運転を除外し（４３％）、１０７（５７％）をさらなる統計分析のために保持した。この整えられたデータセットを用いて、高、中、および低存在量のｍｉＲＮＡ種を代表する発現マトリックスを生成した。６６種類のｍｉＲＮＡがＤＣＩＳにおいて正常な乳房と比較して差次的に制御されていた（図９−表１および図１）。
[00211] 腫瘍浸潤において特異的に変化しているｍｉＲＮＡを同定するため、ＤＣＩＳおよびＩＤＣの試料を比較した。９種類のｍｉＲＮＡがＤＣＩＳのＩＤＣへの転換において差次的に調節されていた（図１０−表２および図１１−表３）。この差次的調節は本明細書において一般に“浸潤性マイクロシグネチャー”と呼ばれ、ここで：ｍｉＲ−２１０、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−２２１が活性化されており、一方でｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３５−５ｐおよびｍｉＲ−１４３が抑制されていた（図１）。
[00212] これらの９種類のｍｉＲＮＡの中で、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−２１０およびｍｉＲ−２２１は、まずＤＣＩＳにおいて正常と比較して下方制御され、次いでＩＤＣにおいて上方制御される、最も極度の発現における変化を有するｍｉＲＮＡであった。ＤＣＩＳ／ＩＤＣ転換に関わっているｍｉＲＮＡのいずれも、類似の傾向で、早期の正常／ＤＣＩＳ転換には関わっていなかった。腫瘍の悪性度と相関しているｍｉＲＮＡはなかった。
[00213] 図１２−表４、図１３−表５、図１４−表６および図１５−表７において示されるように、ＩＤＣ亜型において発現を分析し、差次的に発現されているｍｉＲＮＡを同定した。例は以下の通りである：ｍｉＲ−１９０はＥＲ＋／ＨＥＲ２− ＩＤＣにおいて過剰発現されており；トリプルネガティブＩＤＣはＭｙｃに制御されるｍｉＲ１７／９２発がんｍｉｒ（ｏｎｃｏｍｉｒ）クラスター、ｍｉＲ−２００ｃおよびｍｉＲ−１２８の活性化を特徴とし；ｍｉＲ−２００ｃはｍｉＲ−１４８ａおよびｍｉＲ−９６と一緒にＥＲ＋／ＨＥＲ２＋二重陽性ＢＣにおいて最も抑制されるｍｉＲＮＡの中にあった。
[00214] ４つのＩＤＣ臨床亜群（ＥＲ＋／ＨＥＲ２−、ＨＥＲ２＋／ＥＲ−、ＥＲ＋／ＨＥＲ２＋およびトリプルネガティブ）において脱制御されているｍｉＲＮＡを、ＤＣＩＳおよび正常な乳房において顕著であるｍｉＲＮＡと共に図２において示す。乳がん細胞株がその分析に含まれていた。ＢＣ分子亜型のｍｉＲＮＡプロファイルも調べた。Ｌｕｍｉｎａｌ ＢおよびＢａｓａｌはｍｉＲＮＡにより最もよく特性付けられた亜型であった。ｍｉＲ−１９０およびｍｉＲ−４２５はＬｕｍｉｎａｌ Ｂと関係していた。ｍｉＲ−４５２、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−９およびｍｉＲ−１７／９２クラスターはＢａｓａｌと関係していた。（図１６−表８）
[00215] 腫瘍中に存在するが正常な乳房中には存在せず、ＢＣ細胞株中にも存在しないｍｉＲＮＡは、おそらく混入している細胞型の結果であり；ｍｉＲ−１４２およびｍｉＲ−２２３が２つのそのようなｍｉＲＮＡであった（図２）。ｍｉＲ−１４２およびｍｉＲ−２２３は両方とも、同じ発現クラスター中の別のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−３４２と同様に、造血系に高度に特異的であることを特筆する（図２）。この非乳房遺伝子クラスター中の他の造血性ｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−２９およびｍｉＲ−２６が含まれていた。
[00216] 実施例２
[00217] 乳癌における転移までの時間および全生存に関する予後予測ｍｉＲＮＡシグネチャー
[00218] ｍｉＲＮＡおよび予後の間の関係は、２つの臨床パラメーター：転移までの時間および全生存を用いて発見された。正常／ＤＣＩＳ、ＤＣＩＳ／ＩＤＣ転換および異なるＩＤＣ亜型において差次的に発現しているｍｉＲＮＡ（図２）が同定された。
[00219] ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１４３＊およびｌｅｔ−７ｂは、一変量および多変量解析により決定されたように、転移までの時間と有意に関係しているｍｉＲＮＡの中にあった（図１７−表９）。
[00220] ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−６５２は全生存と相関するｍｉＲの中にあり（図１８−表１０）、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ｂ＊、ｍｉＲ−１９７およびｌｅｔ−７ｉは両方の予後予測シグネチャーに共通していた。これらの５種類の共通のｍｉＲＮＡの中で、ｍｉＲ−２１０は浸潤性マイクロシグネチャー中に存在する唯一のｍｉＲＮＡであった。
[00221] ＩＤＣ患者の転移までの時間におけるｍｉＲ−２１０に関するカプラン・マイヤー曲線を図３Ｂにおいて、全生存におけるｍｉＲ−２１０に関するカプラン・マイヤー曲線を図３Ａにおいて示す。
[00222] ＩＤＣにおける転移までの時間と関係しているｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線を図３Ｃ〜３Ｊにおいて示し、ここで図３ＣはｍｉＲ−１２７を示し；図３ＤはｍｉＲ−１８５を示し；図３ＥはｍｉＲ−１４５＊を示し；図３Ｆはｌｅｔ−７ｂを示し；図３ＧはｍｉＲ−１９７を示し；図３ＨはｍｉＲ−１０６＊を示し；図３ＩはｍｉＲ−２１を示し；そして、図３Ｊはｌｅｔ−７ｉを示す。
[00223] ＩＤＶにおける全生存と関係しているｍｉＲＮＡに関するカプラン・マイヤー曲線を図３Ｋ〜３Ｓにおいて示し、ここで図３ＫはｍｉＲ−２１を示し；図３ＬはｍｉＲ−２２１を示し；図３ＭはｍｉＲ−６５２を示し；図３ＮはｍｉＲ−１０６ｂ＊を示し；図３ＯはｍｉＲ−２８−３ｐを示し；図３ＰはｍｉＲ−１９７を示し；図３Ｑはｌｅｔ−７ｉを示し；図３ＲはｍｉＲ−４２３−３ｐを示し；そして、図３ＳはｍｉＲ−２７８を示す。
[00224] 実施例３
[00225] 乳がん進行におけるｍｉＲ−２１０およびＨＩＦ１Ａのカップリング
[00226] ｍｉＲ−２１０は低酸素状態により誘導可能であり、腫瘍開始に関わる遺伝子を制御しているため、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータを用いて乳がん進行におけるＨＩＦ１ＡおよびｍｉＲ−２１０に関する一次ＲＮＡ（一次ｍｉｒ−２１０）の分析を行った。そのデータは、ＨＩＦ１Ａおよび一次ｍｉｒ−２１０のＲＮＡの間の非常に優れた相関を示している（ｐ＜０．００１）。
[00227] それぞれのＢＣ亜型を、成熟ｍｉＲ−２１０、一次ｍｉｒ−２１０およびＨＩＦ１Ａの相対量に関して比較した（図４）。成熟ｍｉＲ−２１０の発現は、それぞれのＢＣ亜型に関して、および正常な乳房に関して、一次ｍｉｒ−２１０およびＨＩＦ１ＡのＲＮＡの発現と並んでいることが示されている。そのＲＮＡの測定は、それぞれのＲＮＡに関して群内で全体のパーセントとして示されている。ＨＩＦ１Ａ、一次ｍｉｒ−２１０、および成熟ｍｉＲ−２１０のレベルは常にＨＥＲ２＋／ＥＲ−腫瘍において最大であり、一方でＨＩＦ１Ａおよび一次ｍｉｒ−２１０の最も低いレベルは正常な乳房においてであった。ＨＩＦ１Ａのレベルは低酸素状態を示すと信じられており、正常な乳房組織におけるＨＩＦ１Ａの低いレベルは酸素正常状態と一致していた。ＨＩＦ１ＡのｍＲＮＡはＤＣＩＳにおいて強く誘導されており、従ってそこで低酸素状態が起こっているようである。従って、低酸素感受性プロモーターにより駆動される一次ｍｉｒ−２１０の転写がＤＣＩＳにおいて活性化されていた。ＨＩＦ１Ａ／一次ｍｉｒ−２１０の比率は多様なＩＤＣ亜群にわたって維持されていた。ＤＣＩＳにおいて、成熟ｍｉＲ−２１０および一次ｍｉｒ−２１０ ＲＮＡのカップリングに対する１つの例外が存在した。ＤＣＩＳは高レベルのＨＩＦ１Ａおよび一次ｍｉｒ−２１０を発現していた（低酸素状態を示唆している）が、その系列における成熟ｍｉＲ−２１０のはるかに最低のレベルは、厳しい下方制御に関する強い圧力を示している。
[00228] 実施例４
[00229] 乳がん遺伝子の限られたセットが非浸潤性および浸潤性転換を定めている
[00230] 本明細書において記述される結果ならびに浸潤および予後におけるｍｉＲ−２１０の独特の役割を考慮して、ＢＣにおけるその発現により制御されるタンパク質および機能をさらに調べた。４２の正常な乳房、１７のＤＣＩＳおよび１１８のＩＤＣ試料（５１のＥＲ＋／ＨＥＲ２−、１７のＨＥＲ２＋／ＥＲ−、１７のＨＥＲ２＋／ＥＲ＋および３３のＴＮＢＣ）からの全トランスクリプトームを調べた。ｍｉＲ−２１０の直接的または間接的な標的であることと適合する遺伝子、すなわちｍｉＲ−２１０の挙動に対して拮抗挙動を有し、ＤＣＩＳにおいて上方制御され、かつＩＤＣにおいて下方制御される遺伝子を探した。ＤＣＩＳの症例は４５２４種類の上方制御されたプローブのセット（８９
３０種類から、ＦＤＲ＜０．０５）を有し；その中で、１７６１種類のプローブセット（１３５３種類の遺伝子に対応する）がＩＤＣにおいて下方制御されており、従ってｍｉＲ−２１０の標的またはその下流の作用を表している。乳がんはこれらの遺伝子と有意に関係している唯一の疾患であった（２５種類の遺伝子、濃縮ｐ＜０．００１；図１９−表１１）
[00231] ＤＣＩＳ／ＩＤＣ進行軸に沿ってｍｉＲ−２１０に対して拮抗的様式で制御される乳がん遺伝子には、ＲＢ１、ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＤ、ＦＡＮＣＦ、ＰＰ２ＣＡ、ＰＡＲＰ１、ＮＬＫ、Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）およびＥＨＭＴ１が含まれていた（図５および図６）。ＢＣにおいてｍｉＲ−２１０に対して逆相関する遺伝子により制御される経路は以下の通りであった：アポトーシスにおけるカスパーゼカスケード、ＨＥＲ２受容体の再利用、ＴＮＦＲ１シグナル伝達、ＦＡＳシグナル伝達（ＣＤ９５）ならびにがんの易罹患性におけるＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２およびＡＴＲ。これらの遺伝子の一部はまた、それらのスプライシングイソ型に応じて差次的に制御されていた。ＥＧＦＲの古典的イソ型は正常な乳房において発現しており、ＤＣＩＳにおいて下方制御されていた。興味深いことに、チロシンキナーゼドメイン全体を欠いている切り詰められたＥＧＦＲ変種（ｕｃ００３ｔｑｉ．２）は、正常な乳房においてもＩＤＣにおいても発現されていなかったが、ＤＣＩＳにおいて特異的に過剰発現されていた。差次的腫瘍亜群発現を示す他の遺伝子のスプライシング変種は、ニブリンおよびＥｒｂＢ３であった。
[00232] 実施例５
[00233] ＴＣＧＡ ＩＤＣコホートにおける患者の特徴および統合されたプロファイル
[00234] 統合されたｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ腫瘍プロファイル（１９２６２種類のｍＲＮＡおよび５８１種類のｍｉＲＮＡ）を、前処理なしの４６６個の女性患者からの原発性ＩＤＣ（ＴＣＧＡ ＩＤＣコホート）において研究した。完全に特性付けられた（ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡプロファイル）腫瘍を有し、少なくとも１ヶ月の全生存（ＯＳ）を有する患者のみがその研究に含められた。ＴＣＧＡコンソーシアムにより特性付けられたこれらの患者に関する拡張された人口統計を図２０において提供する。生のＲＮＡ、ＤＮＡメチル化（ｍｅＤＮＡ）、体細胞突然変異および臨床データをＴＣＧＡデータポータルから得た。統合されたｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを確立するため、我々はｍＲＮＡをＲＰＫＭとして、ｍｉＲＮＡを整列させたｍｉＲＮＡの読み全体の１００万あたりの読みとして正規化した。それぞれの遺伝子に関する正規化された読みのｌｏｇ２の分散を、全ての分散の中央値に対して比較した。その中央値の遺伝子よりも変動性の大きい遺伝子を、統合されたプロファイル中に保持した（ｐ＜０．０５）。この強度変動フィルターを用いた後、７７３５種類のｍＲＮＡおよび２４７種類のｍｉＲＮＡがその統合されたＲＮＡプロファイル中に存在していた。ＤＮＡメチル化（ｍｅＤＮＡ）を、同じＩＤＣコホートからの２９６人の患者に対してＩｎｆｉｎｉｕｍ ４５０Ｋプラットフォームを用いて研究した。Ｍ値、すなわちメチル化されたプローブの強度対その対応するメチル化されていないプローブの強度の比率のｌｏｇ２を用いてＣｐＧメチル化を測定した。Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒデータベース（バージョン６０）を用いて、がんにおいて機能的体細胞突然変異を有することが知られている遺伝子を同定した。その乳がんデータセットを、大きい腫瘍の標本サイズを評価するため、高度に関連する卵巣がんデータセットを用いて増加させた。結果として一次タンパク質構造の変化をもたらす少なくとも２個の検証された体細胞突然変異を有する遺伝子を同定した。
[00235] 生存分析
[00236] ＩＤＣ腫瘍および患者に関する臨床的共変量を図２０において要約する。カプラン・マイヤー分布を計算するため、遺伝子の過剰発現を有する群を発現の中央値より大きい発現を有する試料に割り当てた。生存分布に関する質の試験は、明確に記載された
場合を除いて、ログランク法（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）を用いて実施した。ハザード比（ＨＲ）およびカプラン・マイヤー曲線をそれぞれの独立した下位クラス中のＲＮＡに関して計算した。（同じ臨床または分子クラス内で）少なくとも２つの下位クラスにおいて有意なＨＲおよびログランク検定（ｐ＜０．０５）両方を有するＲＮＡを選択した。コード遺伝子の選択のために必要とされる追加の基準は、ＤＮＡメチル化のＯＳとの関係およびＣＯＳＭＩＣデータベース中の体細胞突然変異の存在であった。ＤＮＡメチル化およびＯＳの間の関連付けは、一変量Ｃｏｘ回帰を用いて実施された(図２６〜図２７)。多数決原理投票手順（ｍａｊｏｒｉｔｙ ｒｕｌｅ ｖｏｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）をそれぞれの予後予測遺伝子に関するＣｐＧ部位の全ての有意なハザード比に適用し（ＦＤＲ＜０．００１）；例えば１より低い最も有意なＣｐＧ ＨＲを有する遺伝子のＤＮＡメチル化は転帰に対して負に相関していると定義されると考えられ、また逆も同様である。多変量解析に関して、そのＣｏｘ比例ハザードモデルを一変量レベルで統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示した全ての共変量に適用した。ワルド検定を後退段階的（ｂａｃｋｗａｒｄ
ｓｔｅｐｗｉｓｅ）選択手順で用いて、有意な独立した予測値を有する遺伝子または共変量を同定し、ハザード比（ＨＲ）および９５％信頼区間（ＣＩ）を概算した。全ての報告されたｐ値は両側であった。全ての分析はＳＰＳＳ（バージョン２１）またはＲ／ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒ（バージョン２．１０）を用いて実施された。
[00237] 危険予測因子およびＲＯＣ曲線の定義
[00238] 線形ＲＮＡ危険予測因子に関する遺伝子の重みを、教師あり主成分法を用いて計算した。低または高危険性（中央値で切った）を有すると予測された症例に関するカプラン・マイヤー生存曲線を、１０分割交差検証を用いて生成した。共変量、例えばＮ期、病期、固有の亜型、年齢、ＥＲ状態、ＰＲ状態、ＴＰ５３変異、およびＰＩＫ３ＣＡ変異を組み込んだ多変量モデルを同様に構築した。交差検証されたカプラン・マイヤー曲線およびログランク統計の統計的有意性を、そのプロセスをその生存データのランダム並べ替えにおいて１０００回繰り返すことにより決定した。そのＲＮＡモデルに関して、ｐ値は発現データおよび生存の間に関連は存在しないという帰無仮説を試験した。組み合わせたＲＮＡおよび臨床共変量モデルに関して、そのｐ値は遺伝子に関する発現データがその共変量と比較した場合に危険予測に有意に加えられる（ａｄｄｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｔｏ）かどうかに取り組んだ。
[00239] そのモデルの転帰を予測する能力を、それぞれのＲＯＣ曲線のＡＵＣを比較することにより評価した。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線に関する曲線下面積（ＡＵＣ）の分析を、打ち切られたデータを用いた時間依存性ＲＯＣ曲線推定を可能にするＲでのｓｕｒｖｉｖａｌＲＯＣパッケージを用いて実施した。生存分析の全てにおいて、より少ない事象が６０ヶ月より後に起こった（カプラン・マイヤー曲線参照）ため、モデルのこの時点における、およびこの時点の周辺における転帰を予測する能力を比較した。ＲＯＣ曲線は真陽性対偽陽性の予測をプロットし、従ってより高いＡＵＣはよりよいモデルの性能を示す（ＡＵＣ＝０．５はランダムな性能を示す）。ＲＮＡ危険性スコアおよび群（上記で定義された高危険性および低危険性）は、その線形危険予測因子における加重に基づいていた。
[00240] ３４遺伝子の予後予測シグネチャーの検証のための独立したコホート
[00241] ＴＣＧＡ ＩＤＣコホートから得られた予後予測シグネチャーを検証するため、合計２１０４人の患者に関する完全な１０年間の追跡調査を有する原発性乳がん患者の７つの遡及的な系列を用いた。ＵＫコホート（ｎ＝２０７）において、その患者の７４パーセントがＩＤＣを有し、一方で残りの乳がん患者は大部分が小葉性（１２％）または混合型（７％）であった。遠隔再燃なしの生存（ＤＲＦＳ）に向けたＵＫコホートに関する臨床エンドポイントは、遠隔転移の検出もしくは死亡、またはそのような事象一切なしでの最後の評価の日付（打ち切られた観察）であった。ｍｉＲＮＡ（ＧＳＥ２２２１６）
の発現をＩｌｌｕｍｉｎａ ｍｉＲＮＡ ｖ．１ビーズチップを用いて測定し、ｍＲＮＡ（ＧＳＥ２２２１９）の発現をＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ ＲｅｆＳｅｑ−８ビーズチップを用いて測定した。そのアッセイは２４３３２種類のｍＲＮＡおよび４８８種類のｍｉＲＮＡを測定した。分位数正規化を両方のアッセイに関して、および統合されたプロファイルに関して用いた。ｍＲＮＡ予後予測構成要素の検証を６つの追加のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ乳がんプロファイルに対して実施した。Ｗａｎｇコホートは１８０人のリンパ節陰性の再燃のない患者および１０６人の遠隔転移を発現したリンパ節陰性の患者により構成されていた（ＧＳＥ２０３４、ｎ＝２８６）。Ｈａｔｚｉｓコホートはネオアジュバントタキサン−アントラサイクリン化学療法後の応答および生存を研究するために用いられた（ＧＳＥ２５０６６、ｎ＝５０８）。Ｋａｏコホートは、３２７個の乳がん試料の遺伝子発現プロファイルを通して乳がんの分子亜型を同定し、異なる乳がん亜型の分子的および臨床的特徴を決定するために用いられた（ＧＳＥ２０６８５、ｎ＝３２７）。Ｂｏｓコホートは、がんの最も恐れられる合併症および成人における最も一般的な頭蓋内悪性腫瘍の１つである脳転移を研究するために用いられた（ＧＳＥ１２２７６、ｎ＝１９５）。ＴＮＢＣコホートは、トリプルネガティブ乳がんを特性付けるためにドイツ人の患者から集められた（ＧＳＥ３１５１９、ｎ＝３８３）。ＴＲＡＮＳＢＩＧコホートはベルギー人の患者で構成されており、リンパ節陰性の患者における遠隔転移の予測のために７６遺伝子の予後予測シグネチャーの検証に適用された（ＧＳＥ７３９０、ｎ＝１９８）。ＤＲＦＳは、ＯＳが用いられたＫａｏおよびＴＲＡＮＳＢＩＧを除いて全ての検証コホートに関する臨床エンドポイントであった。その７つの検証コホートは、その３４遺伝子の統合されたシグネチャーの他の予後予測ＢＣシグネチャーに対する比較のためにも用いられた。
[00242] 共通のリスク遺伝子に関連付けられた生物学的プロセス
[00243] 単一の遺伝子（マイクロＲＮＡさえも）と関係する細胞機能を調べるため、ＧＯ分析をその遺伝子がそれとの正または負のスピアマン相関（ＦＤＲ＜０．００１）を有するｍＲＮＡに対して実施した。Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ中のＢｉＮＧＯプラグインを用いて関連するＧＯアノテーションを検索し、それらをＧＯ階層を通して上方へ伝達した。標本抽出が置き換えなしで行われる超幾何検定を用いて、生存遺伝子セットにおいて、Ｐ値の形態で、遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームのエンリッチメント（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を評価した。ＧＯのＰ値をベンジャミン・ホッホバーグ法を用いて補正した。
[00244] 共通のリスク遺伝子と関連して活性化または抑制される生物学的プロセスを調べた。脂質修飾およびホスホイノシチドリン酸化（ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１およびＣＰＴ１）を除いて、危険予測因子中の全てのコード遺伝子を一緒に考慮した場合に機能的濃縮は存在しなかった。この発見は、個々の経路に影響を与えるリスク遺伝子と一致していた。それぞれの単一の遺伝子を、ｍＲＮＡでもｍｉＲＮＡでも、それが統合されたＲＮＡプロファイルにおいてそれと相関しているｍＲＮＡに対するＧＯ分析を実施することにより調べた。有糸分裂細胞周期および核分裂に関わる遺伝子は、ｍｉＲ−４８４と正に関連していた。ｍｉＲ−３２８はＭ期の、およびＤＮＡ修復の遺伝子と相関しており、ｍｉＲ−８７４は細胞接着に関わる遺伝子と相関していた。ｍｉＲ−４８４は形態形成および血管新生における遺伝子と負に相関しており、表皮の発生および上皮細胞を基底層のような細胞外マトリックス構成要素に係留する半接着斑の集合における遺伝子とも負に相関していた。ＣＰＴ１Ａは、出生後の乳房発達の開始であり通常は思春期の開始時に起こる乳房発育開始に関わる乳腺の分枝ならびにＲａｌ ＧＴＰアーゼの制御と関係していた。Ｃ２ＣＤ２は、ＮＭＥ１およびＮＭＥ２（転移抑制性ＮＭ２３ファミリーのメンバー）が含まれる、生殖腺中胚葉の発生に、およびミュラー管の退行に関わる遺伝子の抑制と関係していた。ＰＩＫ３ＣＡの発現は、タンパク質リン酸化の活性化および転写開始と、ならびにミトコンドリアＡＴＰ合成と共役したプロトン輸送の抑制と関係していた。
[00245] 結果
[00246] ＴＣＧＡ ＩＤＣコホートにおける統合された分子プロファイルおよび臨床パラメーター
[00247] 統合されたｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ腫瘍プロファイル（７７３５種類のｍＲＮＡおよび２４７種類のｍｉＲＮＡ）を、ＴＣＧＡ ＩＤＣコホートにおける４６６個の原発性ＩＤＣに関して研究した（図２０）。非浸潤性腺管癌（ＤＣＩＳ）からＩＤＣへの転換と、および予後不良と関係しているｍｉＲ−２１０は、遠隔転移を有する原発腫瘍において最も上方制御されていたｍｉＲＮＡであった（ｐ＝０．０２）。ＲＮＡ発現およびＤＮＡメチル化の予後予測的価値を研究する前に、一変量生存検定を実施してＴＣＧＡ ＩＤＣコホートにおける臨床パラメーターおよび転帰の間の関係を評価した。Ｎ期、Ｍ期、病期、Ｔ期、および固有の亜型（図３０〜図３４）は、ＯＳと有意に関係していた。ＥＲ陽性患者はより好ましい転帰を示し、トリプルネガティブ乳がんを有する患者はより悪い予後を示した（図３５〜図３６）。閉経状態および年齢はＯＳと関係していなかった。ＩＤＣにおける体細胞突然変異は特定の固有の亜型と（ＴＰ５３はＢａｓａｌ−ｌｉｋｅおよびＨＥＲ２豊富型と、一方でＰＩＫ３ＣＡはＬｕｍｉｎａｌ Ａと）関係しており、それらはＯＳとは関係していなかった（図３７〜図３８）。この評価の結果は、ＴＣＧＡ ＩＤＣコホートに関する生存データは、大部分の打ち切られたデータを含有するが、情報価値があり、さらなる分子研究における使用に適していたことを示している。
[00248] ＴＣＧＡ ＩＤＣコホートにおけるＯＳのｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ／ｍｅＤＮＡとの関係
[00249] 次いで、ＯＳのｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびＤＮＡメチル化プロファイルとの関係をＴＣＧＡ ＩＤＣコホートに関して詳細に研究した。目的は、もし存在するのであれば、異なる臨床または分子亜型にわたって一貫してその疾患の転帰を左右する共通の遺伝子のセットの同定であった。その戦略および基礎となる理論的根拠を図２２において図式的に示す。
[00250] ＯＳに関する一変量生存分析を、以下の独立したクラスのそれぞれの内の統合されたｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡプロファイルを用いて実施した：病期、リンパ節転移、外科的縁、閉経前または閉経後、固有の亜型、体細胞突然変異（ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ経路、ＴＰ５３／ＰＩＫ３ＣＡ二重変異体、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰＫ類、および残りのより低い頻度で変化していた遺伝子）。異なる臨床的または分子的特徴を有する患者の下位クラスはそれぞれのクラス内の素集合を表していた。ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡは、同じクラスからの少なくとも２個の独立した下位クラス内で有意である場合のみ選択された。ＤＮＡメチル化は転写制御における重要な機序であるため、コード遺伝子のＤＮＡメチル化はＯＳとの関係に関する追加の基準として用いられた。第１の焦点は、ＰＩＫ３ＣＡ予後予測遺伝子をモデルとして用いるＣｐＧメチル化およびｍＲＮＡ発現の間の関連に置かれた。ＰＩＫ３ＣＡの発現と相関しているメチル化されたＣｐＧ部位は、全てその第１エキソンの周囲の２．２Ｋｂの領域中に位置しており（図２６）、それはヒストンＨ３中のリシン２７の強いアセチル化および転写因子の高密度結合を有する領域であった。この領域中の重要なＣｐＧ部位の大部分（６の内の５）は、ＤＮＡメチル化およびＰＩＫ３ＣＡ発現の間の予想される負の相関を有していた。この発見に基づいて、多数決原理を用いて遺伝子のメチル化およびＯＳの間の関係のタイプを決定した。遺伝子に関する重要なメチル化部位（図２７）のほとんどが１より低いＨＲを有していた場合、その遺伝子のメチル化および転帰の間の相関は“負”であると定義された。この手順は、転帰不良のＲＮＡ過剰発現およびＤＮＡ低メチル化の両方との対の関係を有する遺伝子の発見を可能にし、また逆も同様であった。そのＤＮＡメチル化試験はｍｉＲＮＡには適用されず、これはそれらの非常に小さい遺伝子中のアッセイされるＣｐＧ部位の限られた数のためであった。それでもなお、ほとんどのｍｉＲＮＡはそのメチル化試験に合格した（データは示していない）。リスク遺伝子セットを洗練するための最後の工程として、（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒに従って）がんにおける
既知のタンパク質変異を有するｍＲＮＡのみを保持した。
[00251] 適用されたストリンジェントな多工程選択（図２２において示されている）は、以下の発見をもたらす：ｉ）特定の腫瘍下位クラスに限定されない、ＩＤＣ患者にわたる臨床転帰に関連する共通のＲＮＡの同定、ｉｉ）重複しない患者の下位クラスにおける予後予測遺伝子の検証、ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化のＲＮＡ発現を確証するための独立した分子パラメーターとしての使用、およびｉｖ）本物のがん活性を用いた予後的遺伝子の同定（図２８）。
[00252] 予後予測マトリックス（図２３）は、提案された基準を満たした２４種類のｍＲＮＡおよび１０種類のｍｉＲＮＡに関する全ての有意なハザード比（ｐ＜０．０５）を可視化する。そのマトリックス中の遺伝子は本明細書において“予後予測的な３４遺伝子のセット”と呼ばれる。いくつかの既知のＢＣ遺伝子（例えばＮＭ２３ファミリーのイソ型であるＮＭＥ３）は単一の下位クラス内でのみ転帰と関係しており、従って選択必要条件を満たさなかった。本質的に、全ての選択されたｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは１より大きいハザード比を有し、従ってそれらの過剰発現は予後不良と相関していた。Ｗｎｔに誘導されるｄｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（Ｄｖｌ）−Ｒｈｏ複合体の会合に関する足場タンパク質として機能すると考えられているＤＡＡＭ１は、リンパ節転移との最高の相関を有する予後予測遺伝子であった（スピアマン相関検定、ｐ＜０．００１、ＦＤＲ＝０．００１）。
[00253] ＴＣＧＡ ＩＤＣコホートにおける統合されたＩＤＣ危険予測因子
[00254] その予後予測的な３４遺伝子のセットを用いて２つの多変量モデルを開発し、ＩＤＣを有する患者においてＯＳを予測した。
[00255] ａ）ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ発現データのみを用いる、遺伝子のみからなる“ＲＮＡモデル”；ならびに、
[00256] ｂ）加えて分子的および臨床的共変量を含んだ“組み合わせモデル”。
[00257] 生存高および低危険群を、教師あり主成分法を用いて構成した。次いでＩＤＣにおけるＯＳに関する線形危険予測因子（図２９および図２４Ａ）を発見した。
[00258] 受信者動作特性（ＲＯＣ）に関する曲線下面積（ＡＵＣ）の分析を実施して、打ち切られたデータによる時間依存性ＲＯＣ曲線推定を可能にした（図２４Ｂ）。統合されたＩＤＣ危険予測因子に関するＡＵＣは、６０ヶ月のＯＳにおいて０．７１であった（ｐ＜０．００１）。統合されたＲＮＡ予測因子の独立した予後予測的価値を評価するため、リンパ節転移（Ｎ期）、病期、Ｔ期、分子亜型、診断時の年齢、ＴＰ５３変異状態、ＰＩＫ３ＣＡ経路の変異状態、ＥＲ状態、およびＰＲ状態が含まれる組み合わせたモデルを開発した。最終的な組み合わせたモデルには、線形危険予測因子およびＮ期が唯一の残っている臨床または分子共変量として含まれていた。その組み合わせたモデルに関するＲＯＣ曲線はかなりのＡＵＣを有していたが、ＲＮＡモデルのＡＵＣよりは大きくなかった。従って、そのＩＤＣ危険予測因子のＲＮＡレベルは独立した予後予測的価値を有していたが、他の臨床および分子共変量は、Ｎ期を除いて有していなかった。
[00259] 独立したＢＣコホートにおける３４遺伝子の予後予測シグネチャーの検証
[00260] ３４遺伝子の予後予測シグネチャーの検証を３つの独立したＢＣコホートに対して実施した。最初に用いられたのは、２０７人の乳がん患者のＵＫコホートであった。ここでそのｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡ予後予測遺伝子のセットを遠隔再燃のない生存（ＤＲＦＳ）の予測に関して再評価した。３４種類の予後予測遺伝子の２／３未満である９種類のｍｉＲＮＡおよび１１種類のｍＲＮＡをそのＵＫコホートにおいて測定した。それでも
なお、ＫＭ曲線（ｐ＝０．０１３）および予後予測シグネチャーに関するＲＯＣ曲線（ＡＵＣ＝０．６５、ｐ＝０．００１）は両方とも有意であった（図２５ａ〜２５Ｂ）。大きなコホートに関する利用可能なｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの組み合わせた発現データが他に存在しなかったため、Ｈａｔｚｉｓ（ｎ＝５０８）、Ｋａｏ（ｎ＝３２７）、ＴＮＢＣ（ｎ＝３８３）、Ｂｏｓ（ｎ＝１９５）、Ｗａｎｇ（ｎ＝２８６）、およびＴＲＡＮＳＢＩＧ（ｎ＝１９８）コホートにおける予後予測シグネチャーのｍＲＮＡ構成要素も評価した。その予後予測シグネチャーはこれらのＢＣコホートに関して予測的であり、それはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロファイルにより特性付けられた（図２１）。
[00261] 他の予後予測ＢＣシグネチャーを用いた３４遺伝子シグネチャーの比較
[00262] その３４遺伝子の統合されたシグネチャーの予後予測的価値を、ＢＣの危険性層別化に関する５種類の異なるシグネチャー：２１遺伝子、ゲノムグレードインデックス（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｇｒａｄｅ Ｉｎｄｅｘ）に関して用いられた９７遺伝子、７０遺伝子、７６遺伝子、および１０ｍｉＲＮＡシグネチャーの予後予測的価値と比較した。６種類の予後予測シグネチャーのそれぞれ１つを８つの異なるＢＣコホートに、合計２５７０人の患者に関して適用した（図２１）。ＲＯＣ曲線のＡＵＣをそれぞれのシグネチャー／コホートの組み合わせに関して計算し、そうして予後予測的価値のマトリックスを生成した（図２１）。
[00263] その１０ｍｉＲＮＡシグネチャーはＵＫデータセットにおいてＤＲＦＳを予測し、そこでそれは決定されたが（ＡＵＣ＝０．７５、ｐ＜０．００１）、ＴＣＧＡコホートでは決定されなかった。ＴＮＢＣコホートにおいて、試験した全てのシグネチャーは類似の性能（ｐ＜０．００１）で成功であった。２１遺伝子シグネチャーは全てのコホートで非常によく働き、注目に値する例外はＴＣＧＡ ＩＤＣコホートであり、そこではそれは有意ではなかった（ＡＵＣ＝０．５８、ｐ＝０．１２）。Ｂｏｓコホートのみにおいて、統合された３４遺伝子、２１遺伝子および７０遺伝子シグネチャーは優れた予後予測的価値を有していた。３４遺伝子（ｐ＜０．００１）および９７遺伝子（ボーダーラインであるｐ＝０．０５３であったが）シグネチャーは、大きく不均一なＴＣＧＡ ＩＤＣコホートにおいて有意な予後予測的価値を有するただ２つのシグネチャーであった。
[00264] 実施例５の論考
[00265] ＩＤＣを臨床転帰に関連する細胞経路に影響を与える異なる分子亜型により特性付けた。本発明者らは、本明細書において、共通の機序がＩＤＣの分子および臨床クラスにわたって全生存（ＯＳ）と関係しているかどうかを決定した。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）はがんの原因となる細胞プロセスの調節因子であり、それはｍＲＮＡによりコードされており、それは今度はＤＮＡメチル化により制御されている。これらの多重の関係のため、統合された生存分析を４６６人の患者の大きな乳がんコホートに対してｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ発現およびＤＮＡメチル化に関するゲノムワイドなデータを用いて実施した。発見された３４遺伝子の予後予測的シグネチャーは、７つの乳がんコホートにおいて、合計２１０４人の追加の患者に関してうまく検証された。
[00266] ３４遺伝子のシグネチャー
[00267] これらのコホートは処置未経験ではなかったため、同定されたＲＮＡは予後予測的であり得るだけでなく、処置に対する応答を予測するものでもあり得た。しかし、患者は異なる処置を受けており、従ってそのＲＮＡは処置と無関係である。加えて、ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡのプロファイルの統合はその危険予測因子の予後予測的強度を増大させた。また、ＤＮＡメチル化を基準として用いて、ｍＲＮＡ発現およびＯＳの間の関係を確証した。発見されたバイオマーカーは、８つの異なる、かつ不均一な乳がんコホートにわたって、合計２５００人を超える患者に関して一貫していた。
[00268] 注目すべきことに、その３４種類の予後予測遺伝子のほとんどは以前にＢＣにおいて記述されていなかった。その予後予測シグネチャー中の少数の既知のがん遺伝子の中で、ＰＩＫ３ＣＡは最も有名なものの１つであった。ＰＩＫ３ＣＡは、それが変異していない場合でも、がん遺伝子依存性の１つの例であり、従って療法に関する主要な標的である。逆に、ＢＣにおいて高頻度で変異している別のがん遺伝子であるＴＰ５３は、そのような関連性を示さなかった。最後に、ＴＰ５３またはＰＩＫ３ＣＡのいずれの遺伝子型もＲＮＡに基づく危険予測因子に予後予測的価値を追加しなかった。
[00269] マーカーの妥当性は、それがその関係を生成したデータのセットと無関係なデータのセットに適用される場合、強化される。その予後予測的な３４遺伝子のセットは、それが研究された全てのコホートにおいて予後予測的であったため、そのような妥当なマーカーであることが証明された。
[00270] 実施例６
[00271] がん関連疾患を診断する、病期を分類する、予後予測する、監視する、および処置するための方法、試薬およびキット
[00272] 本明細書における全ての実施例はそれらの範囲において限定的ではないと考えられるべきであることは理解されるべきである。様々な観点は以下の小節においてさらに詳細に記述される。
[00273] 診断法
[00274] １態様において、患者試料におけるマーカーの発現のレベルおよび対照、例えばがん関連疾患を有しない患者からの試料におけるそのマーカーの発現の正常なレベルを比較する工程を含む、患者ががん関連疾患を有する、またはがん関連疾患の発現に関する通常より高い危険性を有するかどうかを評価する診断法を提供する。
[00275] 患者試料におけるそのマーカーの発現の、正常なレベルと比較した場合に有意に変化したレベルは、その患者ががん関連疾患に冒されている、またはがん関連疾患の発現に関する通常より高い危険性を有することを示すものである。
[00276] 特定の態様において、そのマーカーは、その方法の陽性の予測値が少なくとも約１０％、特定の限定的でない態様において約２５％、約５０％または約９０％であるように選択される。少なくとも約２０％、特定の限定的でない態様において約５０％または約７５％において正常な細胞と比較した場合に少なくとも２倍差次的に発現しているマーカーも、その方法における使用に関して好ましい。
[00277] 患者ががん関連疾患に冒されているかどうかを評価する１つの診断法（例えば、新規の検出（“スクリーニング”）、再発の検出、反射検査）において、その方法は、ａ）患者試料におけるマーカーの発現のレベル、およびｂ）対照のがん関連疾患でない試料におけるそのマーカーの発現の正常なレベルを比較することを含む。患者試料におけるそのマーカーの発現の、正常なレベルと比較した場合に有意に変化したレベルは、その患者ががん関連疾患に冒されていることを示すものである。
[00278] 患者においてがん関連疾患を抑制するための療法の有効性を評価するための診断法も提供する。そのような方法は、ａ）その療法の少なくとも一部をその患者に提供する前にその患者から得た第１試料におけるマーカーの発現、およびｂ）その療法の一部の提供後にその患者から得られた第２試料におけるそのマーカーの発現を比較することを含む。第２試料におけるそのマーカーの発現の、第１試料におけるそのマーカーの発現のレベルと比較して有意に変化したレベルは、その療法がその患者におけるがん関連疾患の抑制に有効であることを示すものである。
[00279] これらの方法において、“療法”は、医薬組成物、遺伝子療法および生物学的療法、例えば抗体およびケモカイン類の投与が含まれるがそれらに限定されない、がん関連疾患を処置するためのあらゆる療法であることができる。従って、本明細書において記述される方法は、例えば疾患状態における低減を評価するために療法の前、間および後に患者を評価するために用いることができる。
[00280] 特定の観点において、その診断法は化学的または生物学的薬剤を用いる療法に向けられている。これらの方法は、ａ）その患者から得られ、その化学的または生物学的薬剤の存在下で維持された第１試料におけるマーカーの発現、およびｂ）その患者から得られ、その薬剤の非存在下で維持された第２試料におけるマーカーの発現を比較することを含む。第２試料におけるそのマーカーの発現の、第１試料におけるそのマーカーの発現のレベルと比較して有意に変化したレベルは、その薬剤がその患者におけるがん関連疾患の抑制に有効であることを示すものである。１態様において、その第１および第２試料は、その患者から得られた単一の試料の一部またはその患者から得られたプールされた試料の一部であることができる。
[00281] 予後を評価するための方法
[00282] 患者においてがん関連疾患の進行を評価するための監視法も提供し、その方法は以下の工程を含む：ａ）最初の時点において患者試料中でマーカーの発現を検出し；ｂ）その後の時点において工程ａ）を繰り返し；そしてｃ）工程ａ）およびｂ）において検出された発現のレベルを比較し、そしてそれからその患者におけるがん関連疾患の進行を監視する。後の時点における試料中のマーカーの発現の、最初の時点における試料中のマーカーの発現のレベルから有意に変化したレベルは、そのがん関連疾患が進行していたことを示すものであり、一方で逆向きでの発現の有意に変化したレベルは、そのがん関連疾患が退行していたことを示すものである。
[00283] さらに、がん関連疾患が悪化した、または将来悪化しそうであるかどうかを決定するための診断法を提供し、その方法はａ）患者試料におけるマーカーの発現のレベル、およびｂ）対照試料におけるそのマーカーの発現の正常なレベルを比較することを含む。患者試料中の発現の、正常なレベルと比較した場合に有意に変化したレベルは、そのがん関連疾患が悪化した、または将来悪化しそうであることを示すものである。
[00284] 抑制性、療法的および／または有害な組成物を評価するための方法
[00285] 患者においてがん関連疾患を抑制するための組成物を選択するための試験法も提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）その患者から細胞を含む試料を得て；ｂ）その試料の分割量（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を複数の試験組成物の存在下で別々に維持し；ｃ）その分割量のそれぞれにおけるマーカーの発現を比較し；そしてｄ）その試験組成物を含有する分割量におけるそのマーカーの発現のレベルをその他の試験組成物の存在下でのそのマーカーの発現のレベルと比較して有意に変化させる試験組成物の１つを選択する。
[00286] 加えて、がん関連疾患の誘発における化合物の有害な可能性を評価する試験法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）その化合物の存在下および非存在下で細胞の別々の分割量を維持し；そしてｂ）その分割量のそれぞれにおけるマーカーの発現を比較する。その化合物の存在下で維持された分割量におけるそのマーカーの発現の、その化合物の非存在下で維持された分割量におけるそのマーカーの発現のレベルと比較して有意に変化したレベルは、その化合物がそのような有害な可能性を有することを示すものである。
[00287] 加えて、さらに患者においてがん関連疾患を抑制する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む：ａ）その患者から細胞を含む試料を得て；ｂ）その試料の分割量を複数の組成物の存在下で別々に維持し；ｃ）その分割量のそれぞれにおけるマーカーの発現を比較し；そしてｄ）その組成物を含有する分割量におけるそのマーカーの発現のレベルをその他の組成物の存在下でのそのマーカーの発現のレベルと比較して有意に変化させる組成物の少なくとも１つをその患者に投与する。
[00288] 試料中のマーカーの発現のレベルは、例えばその試料中の、対応するマーカータンパク質またはそのタンパク質の断片（例えばそのタンパク質またはタンパク質断片と特異的に結合する抗体、抗体誘導体、抗体断片または単鎖抗体のような試薬を用いることにより）、対応するマーカー核酸（例えばヌクレオチド転写産物、またはその相補物）、またはその核酸の断片（例えば、その試料から得られた転写されたポリヌクレオチドを、それに固定された核酸配列またはその相補配列の全体または部分（ｓｅｇｍｅｎｔ）を有する１種類以上の核酸を有する支持体と接触させることにより）、対応するマーカータンパク質により直接（例えば触媒される）または間接的に生成される代謝産物の存在を検出することにより評価することができる。
[00289] 前記の方法のいずれも、少なくとも１つ（１）または複数（例えば２、３、５、または１０以上）のがん関連疾患マーカーを用いて実施することができる。そのような方法において、複数のマーカー（その少なくとも１つはマーカーである）のそれぞれのその試料における発現のレベルを、がん関連疾患に冒されていない対照のヒトから得られた同じタイプの試料におけるその複数のマーカーのそれぞれの発現の正常なレベルと比較する。その試料における１種類以上のマーカーまたはそのある組み合わせの発現の、そのマーカーの対応する正常または対照レベルと比較して有意に変化した（すなわち、単一のマーカーを用いる上記で記述された方法において明記されているように増大または減少した）レベルは、その患者ががん関連疾患に冒されていることを示すものである。前記の方法の全てに関して、そのマーカー（単数または複数）はその方法の陽性の予測値が少なくとも約１０％であるように選択される。
[00290] 候補薬剤の例
[00291] その候補薬剤は当技術分野で既に知られている薬剤であることができ、または薬理学的活性を有することが以前に一切知られていない薬剤であることができる。その薬剤は天然に存在する、または実験室で設計されたものであることができる。それらは微生物、動物または植物から単離することができ、または組み替えにより生成することができ、またはあらゆる適切な化学的方法により合成することができる。それらは小分子、核酸、タンパク質、ペプチド、またはペプチド模倣体であることができる。特定の態様において、候補薬剤は５０ダルトンより大きく約２，５００ダルトンより小さい分子量を有する小さい有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基を含む。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド類、プリン類、ピリミジン類、誘導体、構造類似体、またはそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない生体分子の中でも見付かる。
[00292] 候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーが含まれる多種多様な源から得られる。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現が含まれる、多種多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および方向付けられた合成のために利用可能な数多くの手段が存在する。あるいは、細菌、真菌、植物および動物性抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であり、または容易に生成される。加えて、天然の、または合成により生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを生成するために用いることができる。特定の態様において、その候補薬剤は、限定
的でない例により以下のライブラリー法が含まれる、コンビナトリアルライブラリー法の技術分野における数多くのアプローチのいずれを用いて得ることもできる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス指定可能な並行固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；“１ビーズ１化合物”ライブラリー法；および親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法。
[00293] 特定のさらなる態様において、特定の薬剤に対して、方向付けられた、またはランダムな化学修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等を施して構造類似体を生成することができる。
[00294] がん関連疾患を処置するための療法剤を同定するための方法と同じ方法を用いて、インビトロ研究から生成されたリード化合物／薬剤を検証することもできる。
[00295] その候補薬剤は、１つ以上のがん関連疾患反応経路を上方または下方制御する薬剤であることができる。特定の態様において、その候補薬剤はそのような経路に影響を及ぼす拮抗薬であることができる。
[00296] がん関連疾患を処置するための方法
[00297] 本明細書において、がん関連疾患反応を処置する、阻害する、軽減する、または逆転させるための方法を提供する。本明細書で記述される方法において、シグナル伝達カスケードを妨げる薬剤をそれを必要とする個体、例えば（それらに限定されないが）そのような合併症がまだ明らかではないがん関連疾患の患者および既に少なくとも１種類のがん関連疾患反応を有するがん関連疾患の患者に投与する。
[00298] 前者の例において、そのような処置は、そのようながん関連疾患反応の発生を予防する、および／またはそれらが起こる程度を低減するために有用である。後者の例において、そのような処置は、そのようながん関連疾患反応が起こる程度を低減する、それらのさらなる発達を予防する、またはそのがん関連疾患反応を逆転させるために有用である。
[00299] 特定の態様において、そのがん関連疾患反応カスケードを妨げる薬剤は、そのような反応に特異的な抗体であることができる。
[00300] マーカーの発現および／または検出
[00301] マーカーの発現は、限定的でない例として、アンチセンスオリゴヌクレオチドをそのマーカー（単数または複数）の転写、翻訳、または両方を阻害／増進するためにそのがん関連疾患細胞に提供することができることが含まれる、いくつかの方法で阻害／増進することができる。代わりに、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体、または抗体断片をコードし、適切なプロモーター／レギュレーター領域と作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されたポリヌクレオチドを、そのタンパク質の機能または活性を阻害／増進するであろう細胞内抗体を生成するためにその細胞に提供することができる。マーカーの発現および／または機能は、そのがん関連疾患細胞をマーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体または抗体断片で処理することにより阻害／増進することもできる。本明細書で記述された方法を用いて、マーカーの発現を阻害／増進する、またはマーカータンパク質の機能を阻害する分子を同定するために、特にそれらが細胞膜を越えることができるように十分に小さい分子が含まれる様々な分子をスクリーニングすることができる。そのようにして同定された化合物を、その患者のがん関連疾患細胞を阻害するためにその患者に提供することができる。
[00302] あらゆるマーカーまたはマーカーの組み合わせ、ならびにそのマーカーとの
組み合わせでのあらゆる特定のマーカーを、本明細書で記述される組成物、キットおよび方法において用いることができる。一般に、がん関連疾患細胞におけるそのマーカーの発現のレベルおよび正常な細胞における同じマーカーの発現のレベルの間の差が可能な限り大きいマーカーを用いることが望ましい。この差はそのマーカーの発現を評価するための方法の検出限界と同じくらい小さいことができるが、その差は少なくともその評価法の標準誤差よりも大きく、そして特定の態様において正常な組織における同じマーカーの発現のレベルよりも少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、１００、５００、１０００倍、またはより大きな差であることが望ましい。
[00303] 特定のマーカータンパク質はその細胞の周囲の細胞外空間に分泌されることが認識されている。これらのマーカーは、そのようなマーカータンパク質はがん関連体液試料中で検出することができ、それはヒトの患者から組織生検試料よりも容易に収集することができるという事実のため、その組成物、キットおよび方法の特定の態様において用いられる。加えて、マーカータンパク質の検出のためのインビボの技法には、対象中にそのタンパク質に対して向けられた標識された抗体を導入することが含まれる。例えば、その抗体は、対象中のその存在および位置を標準的な画像化技法により検出することができる放射性マーカーを用いて標識することができる。
[00304] あらゆる特定のマーカータンパク質が分泌されるタンパク質であるかどうかを決定するため、そのマーカータンパク質を、例えば哺乳類細胞、例えばヒト細胞株中で発現させ、細胞外液を収集し、その細胞外液中のそのタンパク質の存在または非存在を（例えばそのタンパク質と特異的に結合する標識された抗体を用いて）評価する。
[00305] 細胞を含有する患者試料を本明細書で記述される方法において用いることができることは理解されるであろう。これらの態様において、そのマーカーの発現のレベルは試料中のそのマーカーの量（例えば絶対量または濃度）を評価することにより評価することができる。当然、その試料中のそのマーカーの量を評価する前に、その細胞試料に対して様々な収集後の調製および保管技法（例えば核酸および／またはタンパク質抽出、固定、貯蔵、凍結、限外濾過、濃縮、蒸発、遠心分離等）を施すことができる。
[00306] その組成物、キットおよび方法を用いて、それを発現する細胞の表面上に提示されている少なくとも１つの部分を有するマーカータンパク質の発現を検出することができる。例えば、免疫学的方法を用いて細胞全体上でそのようなタンパク質を検出することができ、またはコンピューターに基づく配列分析法を用いて少なくとも１種類の細胞外ドメイン（すなわち、分泌されるタンパク質および少なくとも１個の細胞表面ドメインを有するタンパク質の両方が含まれる）の存在を予測することができる。それを発現する細胞の表面上に提示されている少なくとも１つの部分を有するマーカータンパク質の発現は、必ずしもその細胞を溶解する必要なく（例えばそのタンパク質の細胞表面ドメインと特異的に結合する標識された抗体を用いて）検出することができる。
[00307] マーカーの発現は、転写された核酸またはタンパク質の発現を検出するための多種多様な方法のいずれにより評価することもできる。そのような方法の限定的でない例には、分泌、細胞表面、細胞質または核タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法および核酸増幅法が含まれる。
[00308] 特定の態様において、マーカーの発現は、その正常な翻訳後修飾の全部または一部を経たマーカータンパク質を含め、マーカータンパク質またはその断片と特異的に結合する抗体（例えば放射標識された、発色団標識された、蛍光体標識された、または酵素標識された抗体）、抗体誘導体（例えば支持体と、またはタンパク質−リガンド対のタ
ンパク質もしくはリガンドとコンジュゲートされた抗体）、または抗体断片（例えば単鎖抗体、単離された抗体の超可変ドメイン等）を用いて評価される。
[00309] 別の特定の態様において、マーカーの発現を、患者試料中の細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（すなわち転写されたポリヌクレオチド）を調製することにより、そしてそのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡをマーカー核酸の相補物またはその断片である参照ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせることにより評価する。ｃＤＮＡは、場合により、その参照ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの前に様々なポリメラーゼ連鎖反応法のいずれかを用いて増幅することができ；好ましくはそれは増幅されない。１種類以上のマーカーの発現を同様に定量的ＰＣＲを用いて検出してそのマーカー（単数または複数）の発現のレベルを評価することができる。あるいは、マーカーの変異または変異体（例えば一塩基多型、欠失等）を検出する多くの方法のいずれかを用いて患者におけるマーカーの出現を検出することができる。
[00310] 関連する態様において、その試料から得られた転写されたポリヌクレオチドの混合物を、それに固定されたマーカー核酸の少なくとも一部（例えば少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、５００、またはより多くのヌクレオチド残基）に相補的な、またはそれと相同なポリヌクレオチドを有する支持体と接触させる。相補的または相同なポリヌクレオチドがその支持体上で差次的に検出可能である（例えば、異なる発色団もしくは蛍光体を用いて検出可能である、または異なる選択された位置に固定されている）場合、複数のマーカーの発現のレベルを単一の支持体（例えば選択された位置に固定されたポリヌクレオチドの“遺伝子チップ”マイクロアレイ）を用いて同時に評価することができる。ある核酸の別の核酸とのハイブリダイゼーションが含まれるマーカー発現を評価する方法を用いる場合、そのハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施されることが望ましい。
[00311] バイオマーカーアッセイ
[00312] 特定の態様において、そのバイオマーカーアッセイは質量分析または表面プラズモン共鳴を用いて実施することができる。様々な態様において、がん関連疾患に対して有効な薬剤を同定する方法には以下の工程が含まれることができる：ａ）１種類以上のマーカーまたはその誘導体を含有する細胞の試料を提供し；ｂ）その細胞から抽出物を調製し；ｃ）その抽出物をマーカー結合部位を含有する標識された核酸プローブと混合し；そして、ｄ）その試験薬剤の存在下または非存在下でそのマーカーおよび核酸プローブの間の複合体の形成を決定する。その決定工程には、その抽出物／核酸プローブ混合物に対して電気泳動移動度シフトアッセイを行うことが含まれることができる。
[00313] 特定の態様において、その決定工程は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光に基づくアッセイおよび超高スループットアッセイ、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または蛍光相関分光（ＦＣＳ）アッセイから選択されるアッセイを含む。そのような態様において、そのＳＰＲセンサーは、ＳＰＲは金属誘電体表面における微小な屈折率の変化に敏感であるため、生体分子相互作用のリアルタイム観察を方向付けるために有用である。ＳＰＲはＳＰＲセンサー／試料境界面のおおよそ２００ｎｍの範囲内の１０５〜１０−６の屈折率（ＲＩ）単位の変化に敏感な表面技法である。従って、ＳＰＲ分光法はその検出層上に堆積した薄い有機性薄膜の成長を監視するために有用である。
[00314] その組成物、キット、および方法は１種類以上のマーカーの発現レベルにおける差異の検出に頼っているため、そのマーカーの発現のレベルは正常な細胞およびがんに冒された細胞の少なくとも一方における発現を評価するために用いられる方法の最小検出限界よりもかなり大きいことが望ましい。
[00315] そのマーカーの１種類以上を用いた追加の患者試料のルーチン的なスクリーニングにより、そのマーカーのあるものが特定のがん関連疾患が含まれる様々なタイプの細胞において過小または過剰発現されていることが認識されるであろうことは理解されている。
[00316] 加えて、より多くの患者試料がそのマーカーの発現に関して評価され、その試料を得た個々の患者の転帰が相互に関連付けられるにつれて、そのマーカーのあるものの変化した発現はがん関連疾患と強く相関しており、他のマーカーの変化した発現は他の疾患と強く相関していることも確証されるであろう。従って、その組成物、キット、および方法は、患者におけるがん関連疾患の病期、悪性度、組織学的タイプ、および性質の１つ以上を特性付けるために有用である。
[00317] その組成物、キットおよび方法が患者におけるがん関連疾患の病期、悪性度、組織学的タイプ、および性質の１つ以上を特性付けるために用いられる場合、そのマーカーまたはマーカーのパネル（ｐａｎｅｌ）は、陽性の結果がその対応する病期、悪性度、組織学的タイプ、または性質のがん関連疾患に冒された患者の少なくとも約２０％、特定の態様において少なくとも約４０％、６０％、または８０％において、そして実質的に全てにおいて得られるように選択されることが望ましい。そのマーカーまたはマーカーのパネルは、（限定的でない例において、８０％より大きいアッセイ特異性と合わせて）一般集団に関して約１０％より大きい陽性の予測値が得られるように選択することができる。
[00318] 複数のマーカーがその組成物、キット、および方法において用いられる場合、患者試料におけるそれぞれのマーカーの発現のレベルを、同じタイプのがんではない試料におけるその複数のマーカーのそれぞれの発現の正常なレベルと、単一の反応混合物中で（すなわちそれぞれのマーカーに関して異なる蛍光プローブのような試薬を用いて）、またはそのマーカーの１種類以上に対応する個々の反応混合物中でのどちらかで比較することができる。１態様において、その試料におけるその複数のマーカーの１種類より多くの発現の、対応する正常なレベルと比較して有意に変化したレベルは、その患者ががん関連疾患に冒されていることを示すものである。複数のマーカーが用いられる場合、２、３、４、５、８、１０、１２、１５、２０、３０、もしくは５０種類、またはより多くの個々のマーカーを用いることができ；特定の態様において、より少ないマーカーの使用が望ましい可能性がある。
[00319] その組成物、キット、および方法の感受性を（すなわち患者試料中の非組織および／または流体由来の細胞に起因し得る干渉により）最大化するため、そこで用いられるマーカーは限られた組織分布を有する、例えば通常は非組織細胞において発現していないマーカーであることが望ましい。
[00320] その組成物、キット、および方法はがん関連疾患を発現する高められた危険性を有する患者および彼らの指導医に特に有用であろうことが認識されている。がん関連疾患を発現する高められた危険性を有すると認められる患者には、例えばがん関連疾患の家族暦を有する患者が含まれる。
[00321] 正常なヒト細胞におけるマーカーの発現のレベルは、様々な方法で評価することができる。１態様において、この正常な発現のレベルは、正常であるように見える細胞の一部におけるそのマーカーの発現のレベルを評価することにより、そしてこの正常な発現のレベルを異常であることが疑われる細胞の一部における発現のレベルと比較することにより評価される。代わりに、そして特にさらなる情報が本明細書において記述される方法のルーチン的な実施の結果として利用可能になるにつれて、そのマーカーの正常な発
現に関する集団平均値を用いることができる。他の態様において、マーカーの発現の“正常な”レベルは、がんに冒されていない患者から、患者におけるがん関連疾患の疑わしい開始の前に患者から得られた患者試料から、記録された患者試料等から得られた患者試料におけるそのマーカーの発現を評価することにより決定することができる。
[00322] 本明細書において、試料（例えば保存された組織試料または患者から得られた試料）中のがん関連疾患細胞の存在を評価するための組成物、キット、および方法も提供する。これらの組成物、キット、および方法は、必要である場合にその組成物、キット、および方法を患者試料以外の試料での使用に適合させることを除いて、上記で記述された組成物、キット、および方法と実質的に同じである。例えば、用いられるべき試料がパラフィン処理された（ｐａｒａｆｉｎｉｚｅｄ）保存されたヒト組織試料である場合、その組成物中、そのキット中の化合物の比率、またはその試料中のマーカー発現のレベルを評価するために用いられる方法を調節する必要がある可能性がある。
[00323] 抗体を産生する方法
[00324] 本明細書において、患者ががん関連疾患に冒されているかどうかを評価するために有用な抗体を産生する単離されたハイブリドーマを作る方法も提供する。この方法において、マーカータンパク質の全体または部分を含むタンパク質またはペプチドを（例えばそれが発現されている細胞からの精製により、またはインビボもしくはインビトロでのそのタンパク質もしくはペプチドをコードする核酸の転写および翻訳により）合成または単離する。脊椎動物、例えば哺乳類、例えばマウス、ラット、ウサギ、またはヒツジをそのタンパク質またはペプチドを用いて免疫する。その脊椎動物を、その脊椎動物がそのタンパク質またはペプチドに対して強い免疫反応を示すように、場合により（そして好ましくは）そのタンパク質またはペプチドで少なくとももう１回免疫することができる。様々な方法のいずれかを用いて、その免疫された脊椎動物から脾臓細胞を単離し、不死化された細胞株と融合させてハイブリドーマを形成する。次いでこのように形成されたハイブリドーマを標準的な方法を用いてスクリーニングして、そのマーカータンパク質またはその断片と特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマを同定する。本明細書において、この方法により作製されたハイブリドーマおよびそのようなハイブリドーマを用いて作製された抗体も提供する。
[00325] 有効性を評価する方法
[00326] 本明細書において、試験化合物のがん関連疾患細胞の阻害に関する有効性を評価する方法も提供する。本明細書において記述されるように、そのマーカーの発現のレベルにおける差は、その細胞の異常な状態と相関している。そのマーカーのあるものの発現のレベルにおける変化はおそらくその細胞の異常な状態に起因することが認識されているが、そのマーカーの他のものの発現のレベルにおける変化がそれらの細胞の異常な状態を誘導、維持、および促進することが同様に認識されている。従って、患者においてがん関連疾患を抑制する化合物は、そのマーカーの１種類以上の発現のレベルをそのマーカーに関する発現の正常なレベル（すなわち、正常な細胞におけるそのマーカーに関する発現のレベル）により近いレベルに変化させるであろう。
[00327] 従って、この方法は、試験化合物の存在下で維持された第１細胞試料におけるマーカーの発現およびその試験化合物の非存在下で維持された第２細胞試料におけるそのマーカーの発現を比較することを含む。試験化合物の存在下でのマーカーの有意に変化した発現は、その試験化合物ががん関連疾患を抑制することを示すものである。例えば、その細胞試料は、患者から得られた正常細胞の単一の試料の分割量、患者から得られた正常細胞のプールされた試料、正常な細胞株の細胞、患者から得られたがん関連疾患細胞の単一の試料の分割量、患者から得られたがん関連疾患細胞のプールされた試料、がん関連疾患細胞株の細胞等であってよい。
[00328] １態様において、その試料は患者から得られたがん関連疾患細胞であり、様々ながん関連疾患を抑制するのに有効であると信じられている複数の化合物をその患者におけるがん関連疾患を最高に抑制しそうである化合物を同定するために試験する。
[00329] この方法は同様に患者におけるがん関連疾患の抑制に関する療法の有効性を評価するために用いることができる。この方法において、１対の試料（一方はその療法を受け、他方はその療法を受けていない）における１種類以上のマーカーの発現のレベルを評価する。試験化合物の有効性を評価する方法と同様に、その療法がマーカーの発現の有意に変化したレベルを誘導する場合、その療法はがん関連疾患を抑制するために有効である。上記のように、選択された患者からの試料をこの方法において用いる場合、その患者においてがん関連疾患を抑制するために最も有効でありそうである療法を選択するため、代わりの療法をインビトロで評価することができる。
[00330] 有害な可能性を評価するための方法
[00331] 本明細書で記述されるように、ヒト細胞の異常な状態はそのマーカーの発現のレベルにおける変化と相関している。試験化合物の有害な可能性を評価するための方法も提供する。この方法は、ヒト細胞の別々の分割量をその試験化合物の存在下および非存在下で維持することを含む。その分割量のそれぞれにおけるマーカーの発現を比較する。その試験化合物の存在下で維持された分割量におけるマーカーの発現の（その試験化合物の非存在下で維持された分割量と比較して）有意に変化したレベルは、その試験化合物が有害な可能性を有することを示すものである。様々な試験化合物の相対的な有害な可能性を、関連するマーカーの発現のレベルの増進もしくは阻害の程度を比較することにより、発現のレベルが増進もしくは阻害されたマーカーの数を比較することにより、または両方を比較することにより評価することができる。
[00332] 単離されたタンパク質および抗体
[00333] １観点は、マーカータンパク質またはその断片に対して向けられた抗体を産生させるための免疫原としての使用に適した単離されたマーカータンパク質およびその生物学的に活性な部分、ならびにポリペプチド断片に関する。１態様において、その未変性のマーカータンパク質を細胞または組織源から標準的なタンパク質精製技法を用いる適切な精製スキームにより単離することができる。別の態様において、そのマーカータンパク質の全体または部分を含むタンパク質またはペプチドを組み替えＤＮＡ技法により生成する。組み換え発現の代わりに、そのようなタンパク質またはペプチドを標準的なペプチド合成技法を用いて化学的に合成することができる。
[00334] “単離された”または“精製された”タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、そのタンパク質が由来する細胞もしくは組織源からの細胞性物質もしくは他の混入するタンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成された場合は化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。用語“細胞性物質を実質的に含まない”には、そのタンパク質を、それが単離された、または組み替えにより生成された細胞の細胞構成要素から分離するタンパク質の調製が含まれる。従って、細胞性物質を実質的に含まないタンパク質には、（乾燥重量により）約３０％、２０％、１０％、または５％未満の異種タンパク質（本明細書において“混入タンパク質”とも呼ばれる）を有するタンパク質の調製物が含まれる。
[00335] タンパク質またはその生物学的に活性な部分が組み替えにより生成される場合、それは好ましくは培地も実質的に含まず、すなわち培地はそのタンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、または５％未満に相当する。そのタンパク質が化学合成により生成される場合、それは好ましくは化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すな
わちそれはそのタンパク質の合成に関わる化学前駆体または他の化学物質から分離されている。従って、そのタンパク質のそのような調製物は、（乾燥重量により）約３０％、２０％、１０％、５％未満の化学前駆体または対象のポリペプチド以外の化合物を有する。
[00336] マーカータンパク質の生物学的に活性な部分には、その完全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、その対応する完全長タンパク質の少なくとも１種類の活性を示す、そのマーカータンパク質のアミノ酸配列と十分に同一の、またはそれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。典型的には、生物学的に活性な部分は、その対応する完全長タンパク質の少なくとも１種類の活性を有するドメインまたはモチーフを含む。マーカータンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００、またはより長いアミノ酸長であるポリペプチドであることができる。さらに、そのマーカータンパク質の他の領域が削除されている他の生物学的に活性な部分を組み替え技法により調製し、そのマーカータンパク質の未変性形態の機能活性の１種類以上に関して評価することができる。特定の態様において、有用なタンパク質はこれらの配列の１つと実質的に（例えば少なくとも約４０％、特定の態様において５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％）同一であり、その対応する天然存在マーカータンパク質の機能活性を保持しているが、天然の対立遺伝子変異または突然変異誘発によりアミノ酸配列が異なる。
[00337] 加えて、マーカータンパク質の部分のライブラリーを用いて、変異体マーカータンパク質またはその部分のスクリーニングおよびその後の選択のためのポリペプチドの多様な集団を生成することができる。
[00338] 予測医学
[00339] 本明細書において、予測医学の分野における動物モデルおよびマーカーの使用も提供し、ここで診断アッセイ、予後予測アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験の監視が予後予測（予測）目的のために用いられ、それにより個体を予防的に処置する。従って、本明細書において、個体ががん関連疾患を発現する危険にさらされているかどうかを決定するために１種類以上のマーカータンパク質または核酸の発現のレベルを決定するための診断アッセイも提供する。そのようなアッセイを予後予測または予測目的のために用いて、それにより個体をそのがん関連疾患の発症の前に予防的に処置することができる。
[00340] 別の観点において、その方法は、その個体が彼の／彼女の発現パターンを変化させる化学物質または毒素に晒されたことがあるかどうかを理解するための同じ個体の少なくとも定期的なスクリーニングのために有用である。
[00341] さらに別の観点は、臨床試験においてがん関連疾患を抑制するためまたはいずれかの他の障害を処置もしくは予防するためのどちらかで投与される薬剤（例えば薬物または他の化合物）の、（例えばそのような処置が有し得るあらゆるシステム作用（ｓｙｓｔｅｍ ｅｆｆｅｃｔｓ）を理解するための）マーカーの発現または活性への影響を監視することに関する。
[00342] 薬理ゲノミクス
[00343] そのマーカーは、薬理ゲノミクスマーカーとしても有用である。本明細書で用いられる際、“薬理ゲノミクスマーカー”は、その発現レベルが患者における特定の臨床薬物応答または感受性と相関する客観的な生化学的マーカーである。その薬理ゲノミクスマーカーの発現の存在または量は、その患者の、より詳細にはその患者の腫瘍の特定の薬物または特定のクラスの薬物を用いた療法への予測される応答に関連している。患者における１種類以上の薬理ゲノミクスマーカーの発現の存在または量を評価することにより
、その患者に関して最も適切である、またはより大きな成功の程度を有すると予測される薬物療法を選択することができる。
[00344] 臨床試験の監視
[00345] 薬剤（例えば薬物化合物）のマーカーの発現のレベルへの影響の監視は、基本的な薬物スクリーニングにおいてだけでなく臨床試験においても適用することができる。例えば、薬剤のマーカー発現に影響を及ぼす有効性を、がん関連疾患に関する処置を受けている対象の臨床試験において監視することができる。
[00346] １つの限定的でない態様において、本発明は、以下の工程を含む、薬剤（例えば作動薬、拮抗薬、ペプチド模倣体、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬物候補）を用いた対象の処置の有効性を監視するための方法を提供する：（ｉ）その薬剤の投与の前に、対象から投与前の試料を得て；（ｉｉ）その投与前の試料中の１種類以上の選択されたマーカーの発現のレベルを検出し；（ｉｉｉ）その対象から１個以上の投与後の試料を得て；（ｉｖ）その投与後の試料中のそのマーカー（単数または複数）の発現のレベルを検出し；（ｖ）その投与前の試料中のそのマーカー（単数または複数）の発現のレベルをその投与後の試料（単数または複数）中のそのマーカー（単数または複数）の発現のレベルと比較し；そして（ｖｉ）その対象へのその薬剤の投与をそれに応じて変更する。
[00347] 例えば、処置の過程の間のそのマーカー遺伝子（単数または複数）の増大した発現は、無効な投与量およびその投与量の増大が望ましいことを示している可能性がある。逆に、そのマーカー遺伝子（単数または複数）の減少した発現は、有効な処置および投与量を変更する必要がないことを示している可能性がある。
[00348] 電子装置で読み取り可能な媒体、システム、アレイおよび同じものを用いる方法
[00349] 本明細書で用いられる際、“電子装置で読み取り可能な媒体”は、電子装置により直接読まれ得る、およびアクセスされ得るデータまたは情報を記憶、保持または含有するためのあらゆる適切な媒体を指す。そのような媒体には以下の媒体が含まれ得るが、それらに限定されない：磁気記録媒体、例えばフロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ；光学記憶媒体、例えばコンパクトディスク；電子記憶媒体、例えばＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ等；ならびに一般的なハードディスクおよびこれらのカテゴリーのハイブリッド、例えば磁気／光学記憶媒体。その媒体は、本明細書において記述されるようなマーカーをその上に記録するために適合または設計されている。
[00350] 本明細書で用いられる際、用語“電子装置”には、データまたは情報を記憶するために設計または適合されたあらゆる適切な演算もしくは処理装置または他のデバイスが含まれることを意図している。本発明の態様による使用に適した電子装置の例には、スタンドアローンの演算装置；ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）インターネット、イントラネット、およびエクストラネットが含まれるネットワーク；電子機器、例えば携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯電話、ポケットベル等；ならびに局所的および分散型処理システムが含まれる。
[00351] 本明細書で用いられる際、“記録された”は、その電子装置で読み取り可能な媒体上の情報を記憶またはコード化するためのプロセスを指す。当業者は、本明細書で記述されるマーカーを含む物質を生成するために、媒体上に情報を記録するためのあらゆる方法をすぐに採用することができる。
[00352] 様々なソフトウェアプログラムおよびフォーマットを用いて、本発明の態様のマーカー情報を電子装置で読み取り可能な媒体上に記憶させることができる。あらゆる数のデータ処理装置構造化フォーマット（例えばテキストファイルまたはデータベース）を、そのマーカーをその上に記録する媒体を得る、または作製するために用いることができる。そのマーカーを読み取り可能な形態で提供することにより、様々な目的のためにそのマーカー配列情報にルーチン的にアクセスすることができる。例えば、当業者はその読み取り可能な形態のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を用いて標的配列または標的構造モチーフをそのデータ記憶手段内に記憶された配列情報と比較することができる。特定の標的配列または標的モチーフにマッチする配列の断片または領域を同定するために、検索手段が用いられる。
[00353] 従って、本明細書において、対象ががん関連疾患またはがん関連疾患に対する素因を有するかどうかを決定するための方法を実施するための指示を保持するための媒体も提供し、ここでその方法は、マーカーの存在または非存在を決定し、そしてマーカーの存在または非存在に基づいてその対象ががん関連疾患もしくはがん関連疾患に対する素因を有するかどうかを決定する、および／またはがん関連疾患もしくは前がん関連疾患状態に関する特定の処置を推奨する工程を含む。異なる実体（ｅｎｔｉｔｉｅｓ）がその意図される方法の工程を実施することができること、ならびに電子通信のための１つ以上の手段を用いてそのデータを記憶および送信することができることが意図されている。生データ、処理されたデータ、診断、および／または予後は、以下：プライマリケア医師、患者、専門医、保険業者、財団法人、病院、データベース、カウンセラー、療法士、薬剤師、および政府の１つ以上が含まれ得る実体間で通信されるであろうことが意図されている。
[00354] 対象がマーカーと関係するがん関連疾患またはがん関連疾患に対する素因を有するかどうかを決定するための電子システムおよび／またはネットワーク中のシステム、方法も提供し、ここでその方法は、そのマーカーの存在または非存在を決定し、そしてそのマーカーの存在または非存在に基づいてその対象ががん関連疾患もしくはがん関連疾患に対する素因を有するかどうかを決定する、および／またはそのがん関連疾患もしくは前がん関連疾患状態に関する特定の処置を推奨する工程を含む。その方法はさらに、その対象と関係する表現型の情報を受け取る、および／またはネットワークからその対象と関係する表現型の情報を得る工程を含むことができる。
[00355] 本明細書において、対象がマーカーと関係するがん関連疾患またはがん関連疾患に対する素因を有するかどうかを決定するためのネットワーク、方法も提供し、その方法は、そのマーカーと関係する情報を受け取り、その対象と関係する表現型の情報を受け取り、そのマーカーおよび／またはがん関連疾患に対応するネットワークから情報を得て、そしてその表現型の情報、そのマーカー、およびその得た情報の１つ以上に基づいてその対象ががん関連疾患またはがん関連疾患に対する素因を有するかどうかを決定する工程を含む。その方法はさらに、そのがん関連疾患もしくは前がん関連疾患状態に関する特定の処置を推奨する工程を含むことができる。
[00356] 本明細書において、対象ががん関連疾患またはがん関連疾患に対する素因を有するかどうかを決定するための商法も提供し、その方法は、そのマーカーと関係する情報を受け取り、その対象と関係する表現型の情報を受け取り、そのマーカーおよび／またはがん関連疾患に対応するネットワークから情報を得て、そしてその表現型の情報、そのマーカー、およびその得た情報の１つ以上に基づいてその対象ががん関連疾患またはがん関連疾患に対する素因を有するかどうかを決定する工程を含む。その方法はさらに、そのがん関連疾患もしくは前がん関連疾患状態に関する特定の処置を推奨する工程を含むことができる。
[00357] アレイ
[00358] 本明細書において、アレイ中の１種類以上の遺伝子の発現をアッセイするために用いることができるアレイも提供する。１態様において、そのアレイを用いて組織における遺伝子発現をアッセイしてそのアレイ中の遺伝子の組織特異性を確かめることができる。この方法において、約７０００以上に至るまでの遺伝子を発現に関して同時にアッセイすることができる。これは、１種類以上の組織において特異的に発現している一連の遺伝子を示すプロファイルを開発することを可能にする。
[00359] そのような定性的決定に加えて、本明細書において遺伝子発現の定量化を提供する。従って、組織特異性だけでなく、その組織における一連の遺伝子の発現のレベルも確かめることができる。従って、遺伝子をそれらの組織発現それ自体およびその組織における発現のレベルに基づいてグループ分けすることができる。これは、例えば２つの組織間の、または３つ以上の組織間の遺伝子発現の関係の確認において有用である。従って、ある組織を撹乱させることができ、第２の組織における遺伝子発現への作用を決定することができる。この状況において、生物学的刺激に応答したある細胞型の別の細胞型への作用を決定することができる。
[00360] そのような決定は、例えば細胞間相互作用を遺伝子発現のレベルで知るために有用である。ある薬剤がある細胞型を処置するために療法的に投与されるが別の細胞型への望ましくない作用を有する場合、その方法はその望ましくない作用の分子的基礎を決定するためのアッセイを提供し、そうして中和する薬剤を同時投与する、または他の方法でその望ましくない作用を処置するための機会を提供する。同様に、単一の細胞型内でさえ、望ましくない生物学的作用を分子レベルで決定することができる。従って、ある薬剤のその標的遺伝子以外の発現への作用を確かめ、そして中和することができる。
[00361] 別の態様において、そのアレイを用いてそのアレイ中の１種類以上の遺伝子の発現の時間経過を監視することができる。これは、本明細書で開示されるような様々な生物学的状況、例えばがん関連疾患の発現、がん関連疾患の進行、およびがん関連疾患と関係する細胞の形質転換のようなプロセスにおいて起こる可能性がある。
[00362] そのアレイは、同じ細胞における、または異なる細胞におけるある遺伝子の発現または他の遺伝子の発現の作用を確かめるためにも有用である。これは、例えば、最終的な標的または下流の標的を制御することができない場合の療法介入のための代わりの分子標的の選択を提供する。
[00363] そのアレイは、正常および異常な細胞における１種類以上の遺伝子の差次的発現パターンを確かめるためにも有用である。これは、診断または療法介入のための分子標的として役立ち得る一連の遺伝子を提供する。
[00364] 代用マーカー
[00365] そのマーカーは、１種類以上の障害もしくは疾患状態に関する、またはがん関連疾患状態に至る病気に関する代用マーカーとして役立ち得る。本明細書で用いられる際、“代用マーカー”は、疾患もしくは障害の非存在もしくは存在と、または疾患もしくは障害の進行と相関する客観的な生化学的マーカーである。そのようなマーカーの存在または量は、その疾患に依存していない。従って、これらのマーカーは、特定の処置の過程が疾患状態または障害の低減において有効であるかどうかを示す役目を果たし得る。代用マーカーは、疾患状態もしくは障害の存在もしくは程度が標準的な方法論では評価するのが難しい場合、または危険である可能性のある臨床エンドポイントに到達する前に疾患進行の評価が望まれる場合に、特に有用である。
[00366] 薬力学的マーカー
[00367] そのマーカーは薬力学的マーカーとしても有用である。本明細書で用いられる際、“薬力学的マーカー”は、薬物の作用と特異的に相関する客観的な生化学的マーカーである。薬力学的マーカーの存在または量は、それに関してその薬物が投与されている疾患状態または障害とは無関係であり；従って、そのマーカーの存在または量は対象におけるその薬物の存在または活性を示している。例えば、薬力学的マーカーは生物学的組織中のその薬物の濃度を示している可能性があり、ここでそのマーカーはその組織においてその薬物のレベルと関連して発現もしくは転写されているか、または発現もしくは転写されていないかのどちらかである。この様式で、その薬物の分布または取り込みをその薬力学的マーカーにより監視することができる。同様に、その薬力学的マーカーの存在または量は、そのマーカーの存在または量がインビボでのその薬物の相対的な分解速度を示しているように、薬物の代謝産物の存在または量と関連している可能性がある。
[00368] 薬力学的マーカーは、薬物作用の検出の感度の増大において、特にその薬物が低用量で投与される場合に特に有用である。少量の薬物さえも多数ラウンドのマーカーの転写または発現を活性化するのに十分である可能性があるため、その増幅されたマーカーはその薬物自体よりも容易に検出可能な量である可能性がある。また、そのマーカーは、そのマーカー自体の性質により、より容易に検出することができ；例えば本明細書で記述される方法を用いて、タンパク質マーカーに関して抗体を免疫に基づく検出系において用いることができ、またはマーカー特異的な放射標識されたプローブを用いてｍＲＮＡマーカーを検出することができる。さらに、薬力学的マーカーの使用は、可能な直接観察の範囲を超える薬物処置による危険性の機序に基づく予測を与えることができる。
[00369] 試験のためのプロトコル
[00370] がん関連疾患に関する試験の方法は、例えば対象からの生物学的試料におけるそれぞれのマーカー遺伝子の発現レベルを時間の経過にわたって測定し、そしてそのレベルを対照生物学的試料におけるそのマーカー遺伝子の発現のレベルと比較することを含む。
[00371] そのマーカー遺伝子が本明細書で記述された遺伝子の１つであり、その発現レベルが差次的に発現されている（例えば、対照における発現レベルよりも高い、または低い）場合、その対象はがん関連疾患に冒されていると判定される。そのマーカー遺伝子の発現レベルが許容できる範囲内に入る場合、その対象はがん関連疾患に冒されていそうにない。
[00372] その対照に関する標準値は、その発現レベルを比較するためにその対照におけるそのマーカー遺伝子の発現レベルを測定することにより予め決定することができる。例えば、その標準値は、その対照における上記で言及したマーカー遺伝子の発現レベルに基づいて決定することができる。例えば、特定の態様において、その許容できる範囲は、その標準値に基づいて±２標準誤差として選ばれる。一度その標準値を決定したら、その試験法を、対象からの生物学的試料中の発現レベルのみを測定し、その値をその対照に関する決定された標準値と比較することにより実施することができる。
[00373] マーカー遺伝子の発現レベルには、そのマーカー遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびタンパク質への翻訳が含まれる。従って、がん関連疾患に関する試験の１つの方法は、そのマーカー遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現の強度またはそのマーカー遺伝子によりコードされるタンパク質の発現レベルの比較に基づいて実施される。
[00374] プローブ
[00375] そのがん関連疾患に関する試験におけるマーカー遺伝子の発現レベルの測定は、様々な遺伝子分析法に従って実施することができる。具体的には、例えばこれらの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとして用いるハイブリダイゼーション技法、またはそのマーカー遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとして用いる遺伝子増幅技法を用いることができる。
[00376] その試験のために用いられるプローブまたはプライマーは、そのマーカー遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。それぞれのマーカー遺伝子のヌクレオチド配列に関する識別番号は本明細書で記述されている。
[00377] さらに、より高度な動物の遺伝子は一般に高頻度で多型を伴うことは理解されるべきである。スプライシングプロセスの間に互いに異なるアミノ酸配列を含むイソ型を生成する多くの分子も存在する。マーカー遺伝子の活性に類似した活性を有するがん関連疾患と関係するあらゆる遺伝子は、たとえそれが多型またはイソ型であることによるヌクレオチド配列の違いを有していても、そのマーカー遺伝子に含まれる。
[00378] そのマーカー遺伝子にはヒトに加えて他の種のホモログが含まれることができることも理解されるべきである。従って、別途明記しない限り、表現“マーカー遺伝子”は、その種に特有のマーカー遺伝子または個体に導入された外来のマーカー遺伝子のホモログを指す。
[00379] また、“マーカー遺伝子のホモログ”は、ストリンジェントな条件下でそのヒトのマーカー遺伝子にプローブとしてハイブリダイズすることができるヒト以外の種に由来する遺伝子を指すことは理解されるべきである。そのようなストリンジェントな条件は当業者には既知であり、当業者は等しいストリンジェンシーを生成するための適切な条件を実験的または経験的に選択することができる。
[00380] マーカー遺伝子のヌクレオチド配列またはマーカー遺伝子のヌクレオチド配列の相補鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含み、少なくとも１５ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを、プライマーまたはプローブとして用いることができる。従って、“相補鎖”は二本鎖ＤＮＡの他方の鎖に関する一方の鎖を意味し、それはＡ：Ｔ（ＲＮＡに関してはＵ）およびＧ：Ｃ塩基対からなる。
[00381] 加えて、“相補的”は、少なくとも１５個の連続したヌクレオチドの領域に完全に相補的であるそれらだけでなく、特定の場合において少なくとも４０％、特定の場合において５０％、特定の場合において６０％、特定の場合において７０％、少なくとも８０％、９０％、および９５％以上のヌクレオチド配列相同性を有するそれらも意味する。ヌクレオチド配列間の相同性の程度は、アルゴリズム、ＢＬＡＳＴ等により決定することができる。
[00382] そのようなポリヌクレオチドは、マーカー遺伝子を検出するためのプローブとして、またはマーカー遺伝子を増幅するためのプライマーとして有用である。プライマーとして用いられる場合、そのポリヌクレオチドは通常１５ｂｐ〜１００ｂｐ、特定の態様において１５ｂｐ〜３５ｂｐのヌクレオチドを含む。プローブとして用いられる場合、ＤＮＡはそのマーカー遺伝子（またはその相補鎖）のヌクレオチド配列全体または少なくとも１５ｐｂのヌクレオチドを有するその部分配列を含む。プライマーとして用いられる場合、その３’領域はそのマーカー遺伝子に相補的でなければならず、一方でその５’領域は制限酵素認識配列またはタグに連結されていることができる。
[00383] “ポリヌクレオチド”は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかであることができ
る。これらのポリヌクレオチドは、合成によるものまたは天然存在のもののどちらであってもよい。また、ハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いられるＤＮＡは、通常は標識されている。当業者はそのような標識法をすぐに理解する。本明細書において、用語“オリゴヌクレオチド”は、比較的低い重合度を有するポリヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドはポリヌクレオチドに含まれる。
[00384] がん関連疾患に関する試験
[00385] ハイブリダイゼーション技法を用いたがん関連疾患に関する試験は、例えばノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、またはＤＮＡマイクロアレイ技法を用いて実施することができる。さらに、遺伝子増幅技法、例えばＲＴ−ＰＣＲ法を用いることができる。ＲＴ−ＰＣＲにおける遺伝子増幅工程の間にＰＣＲ増幅監視法を用いることにより、マーカー遺伝子の発現のより定量的な分析を達成することができる。
[00386] ＰＣＲ遺伝子増幅監視法において、検出標的（ＤＮＡまたはＲＮＡの逆転写産物）を、蛍光色素およびその蛍光を吸収する消光物質で標識されたプローブにハイブリダイズさせる。そのＰＣＲが進行し、Ｔａｑポリメラーゼがそのプローブをその５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により分解すると、その蛍光色素および消光物質は互いから引き離され、蛍光が検出される。その蛍光はリアルタイムで検出される。標的のコピー数が既知である標準試料を同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅が線形であるサイクル数を用いてその対象試料中のその標的のコピー数を決定することが可能である。また、当業者は、そのＰＣＲ増幅監視法はあらゆる適切な方法を用いて実施することができることを認識している。
[00387] がん関連疾患に関する試験の方法は、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質を検出することにより実施することもできる。以下、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質を“マーカータンパク質”と記述する。そのような試験法に関して、例えば、それぞれのマーカータンパク質に結合する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、およびＥＬＩＳＡ法を用いることができる。
[00388] その検出において用いられるそのマーカータンパク質に結合する抗体は、あらゆる適切な技法により生成することができる。また、マーカータンパク質を検出するため、そのような抗体を適切に標識することができる。あるいは、その抗体を標識する代わりに、その抗体に特異的に結合する物質、例えばプロテインＡまたはプロテインＧを標識してそのマーカータンパク質を間接的に検出することができる。より具体的には、そのような検出法にはＥＬＩＳＡ法が含まれ得る。
[00389] 抗原として用いられるタンパク質またはその部分的なペプチドは、例えばマーカー遺伝子またはその一部を発現ベクター中に挿入し、そのコンストラクトを適切な宿主細胞中に導入して形質転換体を生成し、その形質転換体を培養してその組み換えタンパク質を発現させ、そしてその発現された組み換えタンパク質をその培養物または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、遺伝子によりコードされるアミノ酸配列または完全長ｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列の一部を含むオリゴペプチドを化学的に合成して免疫原として用いる。
[00390] さらに、がん関連疾患に関する試験は、生物学的試料中のマーカー遺伝子の発現レベルだけでなくマーカータンパク質の活性も指標として用いて実施することができる。マーカータンパク質の活性は、そのタンパク質に本来備わっている生物学的活性を意味する。様々な方法をそれぞれのタンパク質の活性を測定するために用いることができる。
[00391] たとえ患者がこれらの疾患を示唆する症状にも関わらずルーチン的な試験においてがん関連疾患に冒されていると診断されなくても、そのような患者ががん関連疾患を患っているか否かは本明細書で記述される方法に従う試験を実施することにより容易に決定することができる。
[00392] より具体的には、特定の態様において、そのマーカー遺伝子が本明細書で記述される遺伝子の１つである場合、その症状が少なくともがん関連疾患への易罹患性を示唆している患者におけるそのマーカー遺伝子の発現レベルにおける増大または減少は、その症状が主にがん関連疾患により引き起こされていることを示す。
[00393] 加えて、その試験は患者においてがん関連疾患が改善しているかどうかを決定するために有用である。言い換えれば、本明細書で記述される方法を用いてがん関連疾患に関する処置の療法的作用を判定することができる。さらに、そのマーカー遺伝子が本明細書で記述される遺伝子の１つである場合、がん関連疾患に冒されていると診断されている患者におけるそのマーカー遺伝子の発現レベルにおける増大または減少は、その疾患がより進行していることを暗示している。
[00394] がん関連疾患への重症度および／または易罹患性は、発現レベルにおける差に基づいて決定することもできる。例えば、そのマーカー遺伝子が本明細書で記述される遺伝子の１つである場合、そのマーカー遺伝子の発現レベルにおける増大の程度はがん関連疾患の存在および／または重症度と相関している。
[00395] マーカーの発現の制御
[00396] 加えて、マーカー遺伝子の発現自体を、その遺伝子の転写制御領域中に変異（単数または複数）を導入することにより制御することができる。当業者はそのようなアミノ酸置換を理解している。また、変異させるアミノ酸の数は、その活性が維持される限り特に制限されない。通常、それは５０アミノ酸以内、特定の限定的でない態様において３０アミノ酸以内、１０アミノ酸以内、または３アミノ酸以内である。変異の部位は、その活性が維持される限りあらゆる部位であってよい。
[00397] スクリーニング法
[00398] さらに別の観点において、本明細書において、がん関連疾患を処置するための療法剤に関する候補化合物に関するスクリーニング法を提供する。１種類以上のマーカー遺伝子を、本明細書で記述される遺伝子の群から選択する。がん関連疾患に関する療法剤は、そのマーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルを増大または減少させることができる化合物を選択することにより得ることができる。
[00399] “遺伝子の発現レベルを増大させる化合物”という表現は、遺伝子の転写、遺伝子の翻訳、またはタンパク質活性の発現の段階のいずれか１つを促進する化合物を指すことは理解されるべきである。一方で、“遺伝子の発現レベルを減少させる化合物”という表現は、本明細書で用いられる際、これらの段階のいずれか１つを阻害する化合物を指す。
[00400] 特定の観点において、がん関連疾患に関する療法剤に関するスクリーニングの方法は、インビボまたはインビトロのどちらで実施することもできる。このスクリーニング法は、例えば、（１）候補化合物を動物の対象に投与し；（２）その動物の対象からの生物学的試料中のマーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルを測定し；または（３）マーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルを、その候補化合物を接触させていない対照における発現レベルと比較した場合に増大または減少させる化合物を選択するこ
とにより実施することができる。
[00401] さらに別の観点において、本明細書において、以下の工程による、医薬品のための候補化合物のマーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルへの有効性を評価するための方法を提供する：動物の対象をその候補化合物と接触させ、その化合物のその動物の対象に由来する生物学的試料中のそのマーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルへの作用を監視する。その動物の対象に由来する生物学的試料中のそのマーカー遺伝子（単数または複数）の発現レベルにおける変動は、上記で記述した試験法において用いられる技法と同じ技法を用いて監視することができる。さらに、その評価に基づいて、医薬品のための候補化合物をスクリーニングにより選択することができる。
[00402] キット
[00403] 本明細書で記述された組成物のいずれもキット中に含まれてよい。限定的でない例において、ｍｉＲＮＡを単離する、ｍｉＲＮＡを標識する、および／またはｍｉＲＮＡ集団をアレイを用いて評価するための試薬がキット中に含まれる。そのキットにはさらに、ｍｉＲＮＡプローブを作製または合成するための試薬が含まれていてよい。従って、そのキットは、適切な容器手段（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ ｍｅａｎｓ）中に、標識されたヌクレオチドまたは後で標識される未標識のヌクレオチドを組み込むことによりｍｉＲＮＡを標識するための酵素を含むであろう。それには１種類以上の緩衝液、例えば反応緩衝液、標識緩衝液、洗浄緩衝液、またはハイブリダイゼーション緩衝液、ｍｉＲＮＡプローブを調製するための化合物、およびｍｉＲＮＡを単離するための構成要素も含まれてよい。他のキットには、ｍｉＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む核酸アレイを作製するための構成要素も含まれてよく、従って例えば固体支持体が含まれてよい。
[00404] アレイが含まれるあらゆるキットの態様に関して、本明細書における配列のいずれかの全部または一部と同一または相補的である配列を含有する核酸分子が存在することができる。
[00405] そのキットの構成要素は、水性媒体中または凍結乾燥された形態のどちらかで包装されてよい。そのキットの容器手段には一般に、その中に構成要素を入れる、そして好ましくは適切に分取する（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）ことができる少なくとも１個のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器または他の容器手段が含まれるであろう。そのキット中に１種類より多くの構成要素が存在する場合（標識試薬および標識は一緒に包装されてよい）、そのキットは一般に、その中に追加の構成要素を別々に入れることができる第２、第３または他の追加の容器も含有するであろう。しかし、構成要素の様々な組み合わせが１個のバイアル中に含まれてよい。本発明のキットには典型的には、核酸を収容するための手段、および商業販売のために厳重に密閉されたあらゆる他の試薬容器も含まれるであろう。そのような容器には、その中に所望のバイアルが保持される射出成形または吹込成形されたプラスチック容器が含まれ得る。
[00406] そのキットの構成要素が１種類以上の液体溶液中で提供される場合、その液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が１つの好ましい溶液である。キット中に含まれてよい他の溶液は、ｍｉＲＮＡの混合された試料からの単離および／または濃縮（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）に関わる溶液である。
[00407] しかし、そのキットの構成要素は乾燥粉末（単数または複数）として提供されてよい。試薬および／または構成要素が乾燥粉末として提供される場合、その粉末は適切な溶媒の添加により再構成され得る。その溶媒は別の容器手段中で提供されてもよいと予想される。そのキットには標識されたｍｉＲＮＡの単離を容易にする構成要素も含まれてよい。それにはそのｍｉＲＮＡを保存もしくは維持する、またはその分解に対して保護
する構成要素も含まれてよい。その構成要素はＲＮＡ分解酵素無含有であることができ、またはＲＮＡ分解酵素に対して保護することができる。
[00408] また、そのキットは一般に、適切な手段中で、それぞれの個々の試薬または溶液のための別個の容器を含むことができる。そのキットには、そのキットの構成要素の使用ならびにそのキット中に含まれていないあらゆる他の試薬の使用のための説明書も含まれ得る。説明書には実施することができる変更が含まれていてよい。そのような試薬は本発明のキットの態様であることが意図されている。また、そのキットは上記で確認された特定の品目に限定されず、ｍｉＲＮＡの操作または特性付けのために用いられるあらゆる試薬が含まれてよい。
[00409] ｍｉＲＮＡアレイの文脈で論じられたあらゆる態様は、本発明のスクリーニングまたはプロファイリングの方法またはキットにおいてより一般的に用いられてよいことも意図されている。言い換えれば、特定のアレイ中に何が含まれていてよいかを記述しているあらゆる態様は、ｍｉＲＮＡプロファイリングの状況においてより一般的に実施することができ、アレイ自体を含む必要はない。
[00410] あらゆるキット、アレイまたは他の検出技法もしくは道具、またはあらゆる方法は、これらのｍｉＲＮＡのいずれかに関するプロファイリングを含み得ることも意図されている。また、ｍｉＲＮＡアレイの文脈で論じられたあらゆる態様は本発明の方法におけるアレイ形式を用いて、または用いずに実施することができ；言い換えれば、ｍｉＲＮＡアレイ中のあらゆるｍｉＲＮＡは本発明のあらゆる方法において当業者に既知のあらゆる技法に従ってスクリーニングまたは評価することができることが意図されている。そのアレイ形式は、実施されるスクリーニングおよび診断法に必要ではない。
[00411] 療法的、予後的、または診断的適用のためにｍｉＲＮＡアレイを用いるためのキットおよびそのような使用が意図されている。そのキットには、ｍｉＲＮＡアレイ、ならびにそのアレイ上のｍｉＲＮＡに関する標準的な、または正規化されたｍｉＲＮＡプロファイルに関する情報が含まれ得る。また、特定の態様において、対照ＲＮＡまたはＤＮＡがそのキット中に含まれ得る。その対照ＲＮＡは、標識および／またはアレイ分析に関する陽性対照として用いることができるｍｉＲＮＡであることができる。
[00412] 別の観点において、様々な診断および試験キットを提供する。１態様において、キットは患者ががん関連疾患に冒されているかどうかを評価するために有用である。そのキットは、マーカーの発現を評価するための試薬を含む。別の態様において、キットは化学的または生物学的薬剤の患者におけるがん関連疾患の阻害に関する適切性を評価するために有用である。そのようなキットはマーカーの発現を評価するための試薬を含み、１種類以上のそのような薬剤も含んでいてよい。
[00413] さらなる態様において、そのキットはがん関連疾患細胞の存在を評価する、またはがん関連疾患を処置するために有用である。そのようなキットは、マーカータンパク質またはそのタンパク質の断片と特異的に結合する抗体、抗体誘導体または抗体断片を含む。そのようなキットは複数の抗体、抗体誘導体または抗体断片を含んでいてもよく、ここで複数のそのような抗体薬剤はマーカータンパク質またはそのタンパク質の断片と特異的に結合する。
[00414] 追加の態様において、そのキットはがん関連疾患細胞の存在を評価するために有用であり、ここでそのキットはマーカー核酸またはその核酸の断片と特異的に結合する核酸プローブを含む。そのキットは複数のプローブを含んでいてもよく、ここでそのプローブのそれぞれがマーカー核酸またはその核酸の断片と特異的に結合する。
[00415] 本明細書で記述される組成物、キットおよび方法は、数ある中でも以下の使用を有し得る：１）患者ががん関連疾患に冒されているかどうかを評価する；２）ヒトの患者におけるがん関連疾患の病期を評価する；３）患者におけるがん関連疾患の悪性度を評価する；４）患者におけるがん関連疾患の性質を評価する；５）患者におけるがん関連疾患を発現する可能性を評価する；６）患者におけるがん関連疾患と関係する細胞の組織学的タイプを評価する；７）がん関連疾患を処置する、および／または患者ががん関連疾患に冒されているかどうかを評価するために有用である抗体、抗体断片または抗体誘導体を作製する；８）がん関連疾患細胞の存在を評価する；９）１種類以上の試験化合物の患者におけるがん関連疾患の抑制に関する有効性を評価する；１０）療法の患者におけるがん関連疾患の抑制に関する有効性を評価する；１１）患者におけるがん関連疾患の進行を監視する；１２）患者におけるがん関連疾患の抑制のための組成物または療法を選択する；１３）がん関連疾患に冒された患者を処置する；１４）患者においてがん関連疾患を抑制する；１５）試験化合物の有害な可能性を評価する；ならびに１６）がん関連疾患を発現する危険にさらされている患者において、がん関連疾患の発症を予防する。
[00416] そのキットは、（例えば患者試料のような試料中の）がん関連疾患細胞の存在を評価するために有用である。そのキットは複数の試薬を含み、そのそれぞれがマーカー核酸またはタンパク質と特異的に結合することができる。マーカータンパク質との結合に関する適切な試薬には、抗体、抗体誘導体、抗体断片等が含まれる。マーカー核酸（例えばゲノムＤＮＡ、ＭＲＮＡ、スプライシングされたＭＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）との結合に関する適切な試薬には、相補的核酸が含まれる。例えば、その核酸試薬には、支持体に固定された（標識または未標識）オリゴヌクレオチド、支持体と結合していない標識オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマーの対、分子ビーコンプローブ等が含まれ得る。
[00417] そのキットは場合により本明細書で記述される方法を実施するために有用な追加の構成要素を含んでいてよい。例として、そのキットは、相補的核酸をアニーリングさせるために、または抗体をそれが特異的に結合するタンパク質と結合させるために適切な流体（例えばＳＳＣ緩衝液）、１個以上の試料区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ）、その方法の実施を記述している説明書、正常細胞の試料、がん関連疾患細胞の試料等を含んでいてよい。
[00418] 本教示の方法およびキットは、本明細書において広く、かつ包括的に記述されてきた。その包括的な開示の範囲内に入るより狭い種および包括性の低い（ｓｕｂ−ｇｅｎｅｒｉｃ）グループ分けのそれぞれも、本教示の一部を形成する。これには、条件付きの本教示の包括的な記述またはその属からいずれかの主題を除去する消極的な限定が、その切り取られた物質が本明細書において明確に列挙されているか否かに関わらず含まれる。
[00419] 動物モデル
[00420] 非ヒト動物モデルを少なくとも１種類のがん関連疾患の評価のために生成することができる。その方法には、その動物を対象の（ｉｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）がんを引き起こすと信じられている少なくとも１種類の化学物質の繰り返し投与に曝露することが含まれる。特定の観点において、その方法にはさらに、その動物から１個以上の選択された試料を収集し；そしてその収集された試料を可能性のあるがんの開始または発達の１種類以上の徴候（ｉｎｄｉｃｉａ）と比較することが含まれる。
[00421] その動物モデルを生成する方法には、以下の工程が含まれる：その動物を特定の化学物質を含まない環境において維持し、そしてその動物をそのがんを引き起こすと信じられている少なくとも１種類の化学物質を用いて感作する。特定の態様において、そ
の動物の少なくとも一部を多数回の連続曝露により感作する。
[00422] 薬剤に関して少なくとも１種類のがん関連疾患に対する有効性に関してスクリーニングする方法には、一般に以下の工程が含まれる：少なくとも１種類の薬剤を試験動物に投与し、その薬剤がそのがん関連疾患の１種類以上の症状を低減するか悪化させるかを決定し；１種類以上の症状における低減を、そのがん関連疾患に対するその薬剤の有効性と関連付け；または１種類以上の症状における低減の欠如をその薬剤の無効性と関連付ける。その動物モデルは、少なくとも１種類のがん関連疾患の開始、進行、重症度、病理、侵攻性、悪性度、活性、能力低下（ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）、死亡率、罹患率、疾患の細分類、または他の基礎をなす病原性もしくは病理学的特徴の少なくとも１つに寄与する１種類以上の代謝経路を評価するために有用である。その分析は、階層クラスタリング、シグネチャーネットーワーク構築、質量分析プロテオミクス解析、表面プラズモン共鳴、線形統計モデリング、部分的最小二乗判別分析、および多重線形回帰分析の１種類以上によることができる。
[00423] その動物モデルは、１種類以上のマーカーまたはそれに対する機能的均等物の発現レベルを調べることにより、少なくとも１種類のがん関連疾患に関して評価することができる。
[00424] その動物モデルは、がん関連疾患を処置または予防するために有用な療法剤のスクリーニングのために用いることができる。従って、その方法は、がん関連疾患を処置または予防するための療法剤を同定するために有用である。その方法は、本明細書で記述される方法により候補薬剤を動物モデルに投与し、その動物モデルにおける少なくとも１種類のがん関連疾患応答をその候補薬剤が投与されていない対照動物モデルと比較して評価することを含む。少なくとも１種類のがん関連疾患応答が症状において低減する、または発病において遅延する場合、その候補薬剤はそのがん関連疾患を処置または予防するための薬剤である。
[00425] そのがん関連疾患に関する動物モデルには、１種類以上のマーカー遺伝子またはそのマーカー遺伝子に機能的に均等な遺伝子の発現レベルがその動物モデルにおいて高められている動物が含まれることができる。“機能的に均等な遺伝子”は、本明細書で一般的に用いられる際、そのマーカー遺伝子によりコードされるタンパク質の既知の活性に類似した活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。機能的に均等な遺伝子の代表的な例には、対象動物のその動物に本来備わっているマーカー遺伝子のカウンターパートが含まれる。
[00426] がん関連疾患に関する動物モデルは、がん関連疾患による生理学的変化を検出するために有用である。特定の態様において、その動物モデルは、マーカー遺伝子の追加の機能を明らかにするため、およびその標的がそのマーカー遺伝子である薬物を評価するために有用である。
[00427] １態様において、がん関連疾患に関する動物モデルは、カウンターパート遺伝子の発現レベルを制御する、またはカウンターパート遺伝子を投与することにより作製することができる。その方法には、本明細書で記述される遺伝子の群から選択された遺伝子の発現レベルを制御することによりがん関連疾患に関する動物モデルを作製することが含まれることができる。別の態様において、その方法には、本明細書で記述される遺伝子によりコードされるタンパク質を投与すること、またはそのタンパク質に対する抗体を投与することによりがん関連疾患に関する動物モデルを作製することが含まれることができる。特定の他の態様において、そのマーカーをその後適切な方法を用いて測定することができるようにそのマーカーを過剰発現させることができることも理解されるべきである。
[00428] 別の態様において、がん関連疾患に関する動物モデルは、そのような遺伝子の群から選択された遺伝子を導入することにより、またはそのような遺伝子によりコードされるタンパク質を投与することにより作製することができる。
[00429] 別の態様において、がん関連疾患は、そのような遺伝子の群から選択された遺伝子の発現またはそのような遺伝子によりコードされるタンパク質の活性を抑制することにより誘導することができる。アンチセンス核酸、リボザイム、またはＲＮＡｉを用いてその発現を抑制することができる。タンパク質の活性は、その活性を阻害する物質、例えば抗体を投与することにより有効に制御することができる。
[00430] その動物モデルは、がん関連疾患の基礎をなす機序を解明するために、そしてスクリーニングにより得られた化合物の安全性を試験するためにも有用である。例えば、動物モデルががん関連疾患の症状を発現する場合、または特定のがん関連疾患に関わる測定値がその動物において変化する場合、その疾患を緩和する活性を有する化合物を探究するためのスクリーニング系を構築することができる。
[00431] 本明細書で用いられる際、“発現レベルにおける増大”という表現は、以下のいずれか１つを指す：外来遺伝子として導入されたマーカー遺伝子が人為的に発現されている場合；その対象動物に本来備わっているマーカー遺伝子の転写およびそのタンパク質への翻訳が増進されている場合；または翻訳産物であるタンパク質の加水分解が抑制されている場合。本明細書で用いられる際、“発現レベルにおける減少”という表現は、その対象動物のマーカー遺伝子の転写およびそのタンパク質への翻訳が阻害されている状態、または翻訳産物であるタンパク質の加水分解が増進されている状態のどちらかを指す。遺伝子の発現レベルは、例えばＤＮＡチップ上のシグナル強度における差異により決定することができる。さらに、その翻訳産物（タンパク質）の活性は、正常な状態における活性と比較することにより決定することができる。
[00432] その動物モデルには、例えばマーカー遺伝子が人為的に導入されて発現している動物；マーカー遺伝子ノックアウト動物；および別の遺伝子でマーカー遺伝子が置換されているノックイン動物が含まれるトランスジェニック動物が含まれ得ることも、意図される範囲内である。マーカー遺伝子のアンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ作用を有するポリヌクレオチド、またはデコイ核酸もしくはそのようなものとして機能するＤＮＡが導入されているトランスジェニック動物を、そのトランスジェニック動物として用いることができる。そのようなトランスジェニック動物には、例えば、マーカータンパク質の活性がその遺伝子のコード領域中に変異（単数または複数）を導入することにより増進もしくは抑制されている、またはそのアミノ酸配列が加水分解に耐性もしくは感受性になるように修飾されている動物も含まれる。アミノ酸配列中の変異には、置換、欠失、挿入、および付加が含まれる。
[00433] 本発明者の発明の原理を適用することができる多くの可能な態様を考慮して、説明された態様は本発明の好ましい例でしかなく、本発明の範囲に対する限定として受け取られるべきでないことは認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲により定義される。従って、本発明者らは、これらの特許請求の範囲および精神の範囲内に入る全てを本発明者らの発明として特許請求する。
[00434] 本発明を明らかにする、または本発明の実施に関して追加の詳細を提供するために本明細書で用いられる刊行物および他の資料は、参照により本明細書に援用され、便宜のため以下の参考文献一覧において提供される。
[00435] 本明細書で列挙された文書のいずれの引用も、前記のいずれかが関係する先行技術であるという自認として意図されていない。日付に関する全ての記載またはこれらの文書の内容に関する表現は出願者に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関する自認は一切構成しない。

Claims (79)

  1. ヒトの対象が乳がん（ＢＣ）に関する生存予後不良を有するかどうかを決定する方法であって、以下の工程：
    該ヒトの対象からの組織の試験試料中のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーのレベルを測定し、該ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーがｉ）ｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｉｉ）ｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなり；そして、
    該対象の生存予後を決定し；ここで該試験試料中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ遺伝子産物のレベルにおける、がんを含まない組織の対照試料中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ遺伝子産物の対応するレベルのレベルと比較した変化は、該ヒトの対象がＢＣに関する生存予後不良を有することを示している；
    を含む、前記方法。
  2. ヒトの対象が予後不良と関係するＢＣを有する、またはそれを発現する危険にさらされているかどうかを診断する方法であって、以下の工程：
    （１）該ヒトの対象から得られた組織の試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し；
    （２）該標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて該試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、
    ここで該マイクロアレイはｉ）ｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｉｉ）ｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなるｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーに関するｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含み；
    （３）該試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルをがんではない細胞の対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較し、そして、
    （４）該ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーにおける変化に基づいて、該ヒトの対象が予後不良と関係するＢＣを有する、またはそれを発現する危険にさらされているかどうかを診断する；
    を含む、前記方法。
  3. 乳がん（ＢＣ）を有するヒトの対象が生存転帰不良を有するかどうかを決定するための方法であって、以下の工程：
    該ヒトの対象の乳房細胞から得られた核酸試料をアッセイして該核酸試料中のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーの発現レベルを決定し、
    該ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーはｉ）ｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｉｉ）ｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、
    Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなり；そして、
    対照試料と比較した場合に該核酸試料においてｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーの発現レベルにおける変化が存在する場合、該ヒトの対象は生存転帰不良を有すると決定する；
    を含む、前記方法。
  4. 結腸がん関連疾患に関する試験のためのＤＮＡチップであって、その上にｉ）ｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｉｉ）ｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなるｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーをアッセイするための少なくとも１種類のプローブが固定されている、前記ＤＮＡチップ。
  5. ｉ）ｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｉｉ）ｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなるｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーに関する少なくとも１種類のマーカーに結合する少なくとも１種類の捕捉試薬を含む製品。
  6. 乳がんに関するスクリーニングのためのキットであって、ｉ）ｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｉｉ）ｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１に関する少なくとも１種類のマーカーの１種類又はこれより多い種類の試薬を含む、前記キット。
  7. マーカーの存在が少なくとも１種類のマーカーに特異的に結合する抗体または抗体断片を含む試薬を用いて検出される、請求項６に記載のキット。
  8. 試薬が標識、放射標識、もしくはビオチン標識されており、および／または抗体もしくは抗体断片が放射標識、発色団標識、蛍光体標識、もしくは酵素標識されている、請求項７に記載のキット。
  9. 試薬が抗体、該試薬が結合している、または該試薬が結合することができるプローブ、および固定された金属キレートの１種類又はこれより多い種類を含む、請求項６に記載のキット。
  10. ｉ）ｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、
    ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｉｉ）ｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなるｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーに向けられた抗体を含む、対象における乳がん関連疾患の存在を予測するためのマイクロアレイ。
  11. ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャー中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡが、それぞれ対照試料と比較してそのようなｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡに特異的である少なくとも１種類のプローブにハイブリダイズする、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  12. ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの発現のレベルが転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の存在を検出することにより評価され、該転写されたポリヌクレオチドが該ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡのコード領域を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  13. 少なくともｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーにそれぞれのｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの単離された変異体もしくは生物学的に活性な断片もしくは機能的均等物、またはそれらに結合する抗体が含まれる、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  14. 試料が乳がんと関連する体液、細胞または組織である、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  15. 試料が患者から得られた細胞を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  16. 試料が時間の経過にわたって採取された患者から得られた細胞を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  17. 乳がん疾患が浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）乳がんである、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  18. 対象の生存予後を決定する工程が全生存（ＯＳ）を予測する、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  19. さらに診断に基づいて処置計画を設計することを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  20. さらに診断に基づいて処置を施すことを含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  21. 試験発現レベルがマイクロアレイにより決定される、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  22. 試験発現レベルがＲＴ−ＰＣＲにより決定される、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  23. ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーが非がん性乳房細胞対乳がん細胞におけるｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの発現における統計的に有意な変化を含む、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  24. 対照ｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ発現レベルが代表的な個体のプールからのものであり、対照試料中のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡレベルに関する平均、中央値または他の統計学的に操作された、または他の方法で要約もしくは統合された代表的なｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ発現レベルである、本特許請求の範囲における請求項のいずれか１項に記載の方法。
  25. 複数のデジタル的にコード化された参照プロファイルを有するデータベースを含むコンピューターで読み取り可能な媒体であって、少なくとも１つの第１の参照プロファイルが乳がん関連疾患応答の徴候を示す１又はこれより多い対象からの１個又はこれより多い試料における少なくとも１種類のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーのレベルを表し、該ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーがｉ）ｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ
    −ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｉｉ）ｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなる、前記コンピューターで読み取り可能な媒体。
  26. 乳がん関連疾患応答の徴候を示す１又はこれより多い対象または乳がん関連疾患を有する対象からの１個又はこれより多い試料における少なくとも１種類の追加のｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡのレベルを表す少なくとも１つの第２の参照プロファイルが含まれる、請求項２５に記載のコンピューターで読み取り可能な媒体。
  27. 対象が乳がん関連疾患を有する、有しやすい、または乳がん関連疾患に関する生存予後不良を有するかどうかを決定するためのコンピューターシステムであって、請求項５に記載のデータベース、ならびに該コンピューターに対象のプロファイルを受け取らせ、該データベースから診断的に該対象のプロフィールに関連する適合する参照プロファイルを同定させ、そして該対象が乳がん関連疾患を有する、または有しやすいかどうかの表示を生成させるためのコンピューターが実行可能なコードを含むサーバーを含む、前記コンピューターシステム。
  28. 対象における乳がん関連疾患の存在、非存在、性質または程度を評価するためのコンピューター支援の方法であって、以下の工程：
    （１）該対象から得られた試料からのデータを分類するためのモデルまたはアルゴリズムを含むコンピューターを提供し、
    ここで該分類には該データを少なくとも１種類のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーの存在、非存在または量に関して分析することが含まれ、かつ
    該ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーはｉ）ｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｉｉ）ｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなり；
    （２）該対象から得られた生物学的試料からのデータを入力し；そして、
    （３）該生物学的試料を分類して乳がん関連疾患の存在、非存在、性質または程度を示す；
    を含む、前記方法。
  29. 予後不良の乳がんに関する増大した危険性を示す乳がんシグネチャーであって、該シグネチャーがヒトの対象からの組織の試験試料中のｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーの発現レベルにおける変化を含み、
    該ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーがｉ）ｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｉｉ）ｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなり；
    ここで、該試験試料中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ遺伝子産物の発現レベルにおける、がんを含まない組織の対照試料中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ遺伝子産物の対応するレベルのレベルと比較した変化は、該ヒトの対象が乳がんに関する生存予後不良を有することを示している、前記乳がんシグネチャー。
  30. 乳がん患者において予後を予測するための方法であって、以下の工程：
    乳がんを有する対象からの生物学的試験試料中のシグネチャーの試験発現レベルを検出し；該試験発現レベルに危険性スコアを割り当て；そして
    該試験発現レベルが高い危険性スコアを割り当てられた場合、予後不良を予測し；そして該試験発現レベルが低い危険性スコアを割り当てられた場合、良好な予後を予測する；を含み、該シグネチャーがｉ）ｍｉＲＮＡ遺伝子産物：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３；ならびにｉｉ）ｍＲＮＡ遺伝子産物：ＡＤＡＴ１、ＡＮＫＲＤ５２、ＢＩＲＣ６、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ２ＣＤ２、ＣＨＤ９、ＣＨＭ、ＣＰＴ１Ａ、ＤＡＡＭ１、ＤＩＰ２Ｂ、ＤＰＹ１９Ｌ３、ＦＡＭ９１Ａ１、ＧＭＣＬ１、ＭＥ１、ＮＣＯＡ２、ＯＴＵＤ６Ｂ、ＰＤＳＳ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＧ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＴＣ３、ＵＢＲ５、ＵＢＸＮ７およびＺＦＣ３Ｈ１からなるｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーを含む、前記方法。
  31. ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャー中のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡが、それぞれ対照試料と比較してそのようなｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡに特異的である少なくとも１種類のプローブにハイブリダイズする、請求項３０に記載の方法。
  32. ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの発現のレベルが転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の存在を検出することにより評価され、該転写されたポリヌクレオチドが該ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡのコード領域を含む、請求項３０に記載の方法。
  33. 少なくともｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーにそれぞれのｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの単離された変異体もしくは生物学的に活性な断片もしくは機能的均等物、またはそれらに結合する抗体が含まれる、請求項３０に記載の方法。
  34. 試料が乳がんと関係する体液、細胞または組織である、請求項３０に記載の方法。
  35. 試料が患者から得られた細胞を含む、請求項３０に記載の方法。
  36. 試料が時間の経過にわたって採取された患者から得られた細胞を含む、請求項３０に記載の方法。
  37. 乳がん疾患が浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）乳がんである、請求項３０に記載の方法。
  38. 対象の生存予後を決定する工程が全生存（ＯＳ）を予測する、請求項３０に記載の方法。
  39. さらに診断に基づいて処置計画を設計することを含む、請求項３０に記載の方法。
  40. さらに診断に基づいて処置を施すことを含む、請求項３０に記載の方法。
  41. 試験発現レベルがマイクロアレイにより決定される、請求項３０に記載の方法。
  42. 試験発現レベルがＲＴ−ＰＣＲにより決定される、請求項３０に記載の方法。
  43. ｍｉＲＮＡ／ｍＲＮＡシグネチャーが非がん性乳房細胞対乳がん細胞におけるｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡの発現における統計的に有意な変化を含む、請求項３０に記載の方法。
  44. 対照ｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ発現レベルが代表的な個体のプールからのものであり、対照試料中のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡレベルに関する平均
    、中央値または他の統計学的に操作された、または他の方法で要約もしくは統合された代表的なｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡ発現レベルである、請求項３０に記載の方法。
  45. ｍｉＲ−２１０遺伝子産物を含む、対象における浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）を検出するためのマーカー。
  46. 試験試料と比較した場合の請求項４５に記載のｍｉＲ−２１０遺伝子産物における増大を検出することを含む、対象において浸潤性乳管癌を検出するための方法。
  47. 請求項４５に記載のｍｉＲ−２１０遺伝子産物を含む、乳がんを有する対象においてＤＣＩＳからＩＤＣへの転換を検出するための方法。
  48. ｉ）ＩＤＣにおけるｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２１０およびｍｉＲ−２２１の少なくとも１種類の上方制御；ならびに、ｉｉ）ＩＤＣにおけるｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１８およびｍｉＲ−３３５−５ｐの少なくとも１種類の下方制御を含む、浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）を非浸潤性腺管癌（ＤＣＩＳ）から識別するためのマイクロＲＮＡシグネチャー。
  49. ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ｂ＊、ｍｉＲ−１９７および／またはｌｅｔ−７ｉを含む、乳がんを有する対象における全生存予後に関する、および転移までの時間の予後に関するマイクロＲＮＡシグネチャー。
  50. 非浸潤性転換において下方制御されているｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−２１０およびｍｉＲ−２２１；ならびに浸潤性転換において上方制御されているｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−２１０およびｍｉＲ−２２１の少なくとも１種類を含む、浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）を非浸潤性腺管癌（ＤＣＩＳ）から識別するためのマイクロＲＮＡシグネチャー。
  51. ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１０６ｂ＊、ｍｉＲ−１９７およびｌｅｔ−７ｉを含む、乳がんに関する全生存および転移までの時間に関するマイクロＲＮＡシグネチャー。
  52. ｍｉＲ−２１０に対する逆相関プロファイルを有するタンパク質をコードする遺伝子を含む浸潤性転換に関するマーカーであって、ＢＲＣＡ１、ＦＡＮＣＤ、ＦＡＮＣＦ、ＰＡＲＰ１、Ｅ−カドヘリン、Ｒｂ１の１種類又はこれより多い種類が非浸潤癌において活性化されており、浸潤がんにおいて下方制御されている、前記マーカー。
  53. 少なくとも１種類の差次的スプライシングイソ型、例えばキナーゼドメインを欠く切り詰められたＥＧＦＲを含む非浸潤性腺管癌に関するマーカーであって、そのようなマーカーが非浸潤性腺管癌においてのみ過剰発現されている、前記マーカー。
  54. 患者をｍｉＲ−２１０発現における増大に基づいて浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）と相関するマーカーを有すると同定するための方法であって、以下の工程：
    ａ）ＩＤＣを有することが疑われる患者からの試験試料におけるｍｉＲ−２１０の発現を分析し；そして、
    ｂ）該患者をｉ）該患者からの試料中のｍｉＲ−２１０発現における非がん性乳房試料と比較した増大が検出された場合、ＩＤＣがんと相関するマーカーを有すると同定し、またはｉｉ）該増大が検出されなかった場合、ＩＤＣがんと相関するマーカーを有しないと同定する；
    を含む、前記方法。
  55. さらに該試験試料を、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−１８１ａの１種類又はこれより多い種類における非がん性乳房試料と比較した増大；および／またはｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１８およびｍｉＲ−３３５−５ｐの１種類又はこれより多い種類における非がん性乳房試料と比較した減少に関して分析することを含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 対象が浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）を有するかどうかを診断する方法であって、該対象からの試験試料中の少なくとも１種類のｍｉＲ−２１０遺伝子産物のレベルを測定することを含み、該試験試料中の少なくとも該ｍｉＲ−２１０遺伝子産物のレベルにおける対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した増大が該対象がＩＤＣを有することを示す、前記方法。
  57. 対象における乳がんの浸潤性を試験する方法であって、以下の工程：
    ａ）浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）を有する対象からの試料中の少なくとも１種類のマーカーの発現レベルを決定し；該少なくとも１種類のマーカーには少なくとも１種類のｍｉＲ−２１０遺伝子産物が含まれ；
    ｂ）工程（ａ）において決定された発現レベルを健康な対象からの試料中の該マーカーの対照発現レベルと比較し；そして
    ｃ）工程（ｂ）における比較の結果が該試験対象における該少なくとも１種類のマーカーの発現レベルが該対照における発現レベルよりも高いことを示している場合、該対象が（ＩＤＣ）の診断を有すると判定する；
    を含む、前記方法。
  58. 試料が乳房組織を含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 全ての方法の工程がインビトロで実施される、請求項５７に記載の方法。
  60. 対象が浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）を有するかどうかを診断する方法であって、以下の工程：
    ａ）該対象から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、ここで該対象は乳房ＩＤＣを有し；
    ｂ）該標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲ−２１０特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて該試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；そして
    ｃ）該試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較し、ここでｍｉＲ−２１０のシグナルにおける増大は該対照がＩＤＣを有することを示している；
    を含む、前記方法。
  61. 工程ｃ）が該試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを非がん性試料と関係するｍｉＲレベルのデータベース、統計、または表と比較することを含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 少なくとも１種類の追加のｍｉＲが該マイクロアレイ中に含まれる、請求項６０に記載の方法。
  63. ｍｉＲ−２１０遺伝子産物の発現のレベルを転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の存在を検出することにより評価し、該転写されたポリヌクレオチドがｍｉＲ−２１０遺伝子産物のコード領域を含む、請求項６０に記載の方法。
  64. 該試料が時間の経過にわたって採取された該患者から得られた細胞を含む、請求項６０に記載の方法。
  65. 少なくとも１種類のｍｉＲ−２１０遺伝子産物に単離された変異体またはその生物学的に活性な断片が含まれる、請求項６０に記載の方法。
  66. 対象において浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）を診断する方法であって、以下の工程：
    ａ）対照と比較した相対的ｍｉＲ−２１０発現を同定し；そして、
    ｂ）ｉ）該対象が該対照と比較して増大したｍｉＲ−２１０発現を有する場合、該対象においてＩＤＣがあると診断し；または、ｉｉ）該対象が該対照と比較して増大したｍｉＲ−２１０発現を有しない場合、該対象においてＩＤＣがないと診断する；
    を含む、前記方法。
  67. さらにｌｅｔ−７ｄおよびｍｉＲ−２２１の少なくとも１種類の対照と比較した相対的発現を同定することを含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 対照と比較して減少したｌｅｔ−７ｄおよび／またはｍｉＲ−２２１発現が浸潤性乳がんの診断を確証する、請求項６７に記載の方法。
  69. さらに診断に基づいて処置計画を設計することを含む、請求項６６に記載の方法。
  70. さらに診断に基づいて処置を施すことを含む、請求項６６に記載の方
    法。
  71. さらに診断に基づいて予後を決定することを含む、請求項６６に記載の方法。
  72. 対象において浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）がんを診断する方法であって、以下の工程：
    ａ）対照ｍｉＲ−２１０レベルと比較した場合の試験ｍｉＲ−２１０発現レベルを同定し、対照ｌｅｔ−７ｄレベルと比較した場合の試験相対的ｌｅｔ−７ｄ発現レベルを同定し、そして対照ｍｉＲ２２１レベルと比較した場合の試験ｍｉＲ−２２１発現レベルを同定し；そして
    ｂ）ｉ）該対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１０発現、対照と比較して増大したｌｅｔ−７ｄ発現、および対照と比較して増大したｍｉＲ−２２１を有する場合、該対象においてＩＤＣがあると診断し、またはｉｉ）該対象が対照と比較して増大したｍｉＲ−２１０発現、対照と比較して増大したｌｅｔ−７ｄ発現、および対照と比較して増大したｍｉＲ−２２１発現を有しない場合、該対象においてＩＤＣがないと診断する；
    を含む、前記方法。
  73. 浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）を有するヒトの対象を処置するための方法であって、ヒトＥＲ＋および／またはＨＥＲ２＋の発現または活性を阻害する薬剤をＩＤＣを有するヒトの対象に投与することを含み、該薬剤がＲＮＡ干渉により機能するオリゴヌクレオチドを含み、かつ該オリゴヌクレオチドに少なくとも１種類のｍｉＲ−２１０遺伝子産物が含まれる、前記方法。
  74. 乳がん進行の可能性を決定するための方法であって、以下の工程：
    ：ａ）乳がんを有する対象からの乳がん細胞を含有する試料におけるｈｓａ−ｍｉＲ−２１０の発現レベルを決定し、そして
    ｂ）工程ａ）からの発現レベルを対照試料における標準的なｍｉＲＮＡ発現レベルと比較し、ここで該乳がんを有する対象におけるｈｓａ−ｍｉＲ−２１０の、該対照試料と比較した場合により高い発現は、より高い進行の危険性と相関している；
    を含む、前記方法。
  75. 対照試料が乳がんが進行していなかった乳がんを有する代表的な個体または個体のプールからの組織を含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 対照試料が工程ａ）の発現レベルを決定する時点と比較した場合により早い時点で採取された対象からの組織を含む、請求項７４に記載の方法。
  77. 標準的なｍｉＲＮＡ発現レベルが代表的な個体のプールからのものであり、対象中の対照組織におけるｍｉＲＮＡレベルに関する、平均、中央値、または他の統計学的に操作された、または他の方法で要約もしくは統合された代表的なｍｉＲＮＡ発現レベルである、請求項７４に記載の方法。
  78. ｌｅｔ−７ｄおよび／またはｍｉＲ−２２１の１種類又はこれより多い種類の発現レベルも対照試料におけるｌｅｔ−７ｄおよび／またはｍｉＲ−２２１の発現レベルと比較して測定し、ｌｅｔ−７ｄおよび／またはｍｉＲ−２２１の１種類又はこれより多い種類の増大した発現レベルがより高い進行の危険性と相関している、請求項７４に記載の方法。
  79. ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１８およびｍｉＲ−３３５−５ｐの１種類又はこれより多い種類の発現レベルも対照試料における発現レベルと比較して測定し、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１８およびｍｉＲ−３３５−５ｐの１種類又はこれより多い種類の減少した発現レベルがより高い進行の危険性と相関している、請求項７４に記載の方法。
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