CN107543926A - 一种新的诊断乳腺浸润性导管癌的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及COL5A1的一种新用途，属于肿瘤诊断技术领域，即COL5A1在诊断/治疗乳腺浸润性导管癌中的应用。其优点表现在：本发明首次发现COL5A1在乳腺浸润性导管癌中特异性表达升高，针对COL5A1进行靶向敲低后可抑制乳腺癌细胞株MCF‑7增殖，显示出COL5A1是潜在的乳腺癌诊断、治疗靶点标志物，研发相关的试剂或药物能够提高乳腺癌(主要是浸润性导管癌)的诊断、治疗效果，或作为目前主流治疗药物的辅助用药。

Description

一种新的诊断乳腺浸润性导管癌的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断技术领域，具体地说，是COL5A1在诊断乳腺浸润性导管癌中的应用。

背景技术

乳腺癌最常见的组织学类型是浸润性导管癌，占乳腺癌的90％以上，目前尚不具备能够完全治愈乳腺癌的方法。在乳腺浸润性导管癌患者肿瘤组织中V型胶原α1链(Type Vcollagenα1chain，COL5A1)的表达对乳腺癌及乳腺癌细胞株的影响目前尚未见报道。

中国专利文献CN104685065A公开了一种从正常乳腺至原位导管癌的转化和至浸润性导管癌转化的microRNA，中国专利文献CN105648043A公开了COL5A1作为矮小基因，未见COL5A1在诊断乳腺浸润性导管癌中的应用的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供COL5A1的新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：COL5A1作为诊断标志物在制备诊断乳腺癌的诊断产品中的应用。

进一步地，用于诊断乳腺浸润性导管癌。

进一步地，所述的诊断产品为诊断试剂或诊断试剂盒。

检测COL5A1的试剂作为诊断乳腺癌的诊断试剂盒的应用。

进一步地，用于诊断乳腺浸润性导管癌。

一种治疗乳腺浸润性导管癌的药物，所述的药物可降低COL5A1的表达。

一种治疗乳腺浸润性导管癌的药物，所述的药物以COL5A1为靶点。

本发明优点在于：

本发明首次发现COL5A1在乳腺浸润性导管癌中特异性表达升高，针对COL5A1进行靶向敲低后可抑制乳腺癌细胞株MCF-7增殖，显示出COL5A1是潜在的乳腺癌诊断、治疗靶点标志物，研发相关的试剂或药物能够提高乳腺癌(主要是浸润性导管癌)的诊断、治疗效果，或作为目前主流治疗药物的辅助用药。

附图说明

附图1：乳腺组织的COL5A1免疫组织化学染色及mRNA表达水平。

附图2：COL5A1敲低后对MCF-7和MCF-12A增殖的影响。B部分的三条线自上而下分别为：空白，C-siR，COL5A1-siR。

附图3：COL5A1敲低后对MCF-7和MCF-12A侵袭和迁移的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：COL5A1在乳腺组织标本中的表达比较

(1)COL5A1是乳腺癌发生发展的进展性标志物(χ²检验)，在乳腺浸润性导管癌中表达增高。

(2)COL5A1和浸润性导管癌临床病理特征的关联性

通过实验，我们发现COL5A1在浸润性导管癌中的表达不受年龄、肿瘤大小、临床分期、组织学分级等情况制约，但与ER、PR表达差别正相关。

实验材料和方法：

1、组织样本

在外科手术后30分钟之内，将组织放入4％多聚甲醛溶液中固定24小时，部分新鲜组织直接进行后续实验。所有经固定好的乳腺组织进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。

2、免疫组织化学

1)将石蜡切片60℃烤片30min，梯度酒精常规脱蜡水化(100％乙醇两次，5min/次；95％乙醇一次，3min；85％乙醇一次，3min；75％乙醇一次，3min)，PBS缓冲液清洗；

2)切片放入柠檬酸缓冲液(浓度为0.01M，pH 6.0)中，微波炉高温2min修复抗原，冷却至室温，PBS缓冲液清洗；

3)3％H₂O₂-甲醇封闭内源性过氧化物酶，室温10min；

4)孵育COL5A1一抗，4℃冰箱过夜；

5)PBS缓冲液清洗后孵育二抗1h；

6)滴加新鲜配置的DAB显色液，室温下染色5min，蒸馏水洗终止显色；

7)苏木素复染1min、水洗、1％盐酸酒精分化后充分水洗返蓝，中性树胶封片；

8)两位病理科医生独立拍片并评分。

3、Western blotting免疫印迹

1)新鲜组织加入RIPA裂解液提取组织蛋白；

2)BCA法检测蛋白浓度；

3)样本加入loading buffer并热变性10min；

4)配制SDS-PAGE胶，按照每孔50ug蛋白上样并电泳；

5)样本蛋白转膜至PVDF膜；

6)5％脱脂牛奶封闭1h；

7)一抗孵育，4℃过夜，TBST缓冲液清洗3×10min；

8)二抗孵育1h，TBST缓冲液清洗3×10min；

9)ECL发光液显色

4、荧光半定量PCR

1)TRIzol提取新鲜组织总RNA；

2)NANOdrop测定浓度；

3)逆转录cDNA；

4)运行荧光半定量PCR程序。

5、统计学分析

计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料采用卡方检验或Fisher检验；采用Stata11.0统计软件进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

实验结果：

1、免疫组化结果显示，COL5A1在浸润性导管癌中高表达率为51.11％。表达高于纤维腺瘤及癌旁正常组织，后两者高表达率分别为11.1％和5.6％(P＜0.05)。Westernblotting和qPCR显示结果与免疫组化一致(P＜0.05)。

2、临床病理参数分析显示，COL5A1在浸润性导管癌中的表达与年龄、肿瘤大小、临床分期、组织学分级等无显著相关性(P＞0.05)，但与ER、PR表达差别正相关(P＜0.05)。

实施例2：COL5A1对乳腺癌细胞株MCF-7及乳腺导管上皮细胞株MCF-12A增殖、侵袭的影响

(1)COL5A1敲低后对MCF-7和MCF-12A增殖的影响

运用小干扰RNA技术敲低COL5A1后，MCF7细胞增殖降低，MCF-12A细胞株未受到明显影响。

(2)运用小干扰RNA技术敲低COL5A1后，MCF7细胞株和MCF-12A细胞株均出现侵袭和迁移能力降低。

实验材料和方法：

1、细胞培养及siRNA干扰

MCF7和MCF12A细胞株购于ATCC，按照相关培养方案进行培养。细胞分为siRNA组、NC组和空白对照组。细胞生长至80％左右时，去除原培养基，PBS清洗，按照50nM终浓度加入siRNA及相应转染试剂，无血清培养6h，更换常规完全培养基继续培养24h。0.25％胰蛋白酶消化细胞，接种至96孔板或6孔板进行后续功能实验。

2、WST1实验

细胞铺于96孔板，每组3复孔，按每100ul加10ulWST1避光混匀试剂，加入各孔，2h后酶标仪上读取OD值，连续检测3d，绘制生长曲线。

3、划痕实验

1)先用marker笔在6孔板背后均匀划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。

2)每孔加入约5×10⁵个细胞，生长至70-80％时进行实验。

3)无菌枪头比着直尺垂至于背后的横线划痕，PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。

4)放入37℃、5％CO₂培养箱培养，按0，24，48小时取样拍照。

4、Transwell实验

1)-20℃保存的Matrigel在4℃8夜融化，以无血清培养基稀释至终浓度为250μg/ml，80μl加入transwell板上室,覆盖整个聚碳酯膜，37℃2h使Matrigel聚合成胶。

2)5×10⁵个细胞制成200ul细胞悬液，加入上室中；

3)48h后，弃Transwell上室内培养液，棉签擦去上层未穿过的细胞及Matrigel，用PBS洗涤2次，操作过程中动作轻柔；

4)小室细胞用4％多聚甲醛固定15min；

5)0.1％结晶紫染液染色30min，PBS清洗；

6)倒置显微镜下随机选取6个高倍镜视野进行细胞计数，染成蓝色的细胞被认为是穿过基质胶的侵袭细胞。取平均值并分析。

实验结果：

1、siRNA敲低COL5A1，经Western blotting验证目标蛋白表达显著降低(P＜0.05)，证实siRNA干预有效。

2、WST1实验显示MCF7细胞增殖活性经siRNA干扰后活性下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，对MCF12A活性的影响无显著统计学差异(P＞0.05)。

3、划痕实验及Transwell实验显示经siRNA干扰后，MCF7细胞迁徙、运动能力较对照组明显降低(P＜0.05)，MCF12A未显示显著统计学差异(P＞0.05)。

综上所述，COL5A1在乳腺浸润性导管癌组织中特异性表达增高，敲低COL5A1抑制肿瘤细胞MCF-7增殖和侵袭，COL5A1可以作为检测乳腺癌的标志物或潜在治疗靶点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.COL5A1作为诊断标志物在制备诊断乳腺癌的诊断产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于诊断乳腺浸润性导管癌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断产品为诊断试剂或诊断试剂盒。

4.检测COL5A1的试剂作为诊断乳腺癌的诊断试剂盒的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用于诊断乳腺浸润性导管癌。

6.一种治疗乳腺浸润性导管癌的药物，其特征在于，所述的药物可降低COL5A1的表达。

7.一种治疗乳腺浸润性导管癌的药物，其特征在于，所述的药物以COL5A1为靶点。