CN107988163A - 一种利用人食管鳞癌细胞球培养富集癌干细胞的方法 - Google Patents

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李秋实
刘洋
王玉婷
李秋霞
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Abstract

本发明公开了一种利用人食管鳞癌细胞球培养富集癌干细胞的方法，运用无血清成球培养法,富集到第1代的肿瘤干细胞球样细胞,对其进行离心、接种,得到第2代直至第9代细胞球细胞。检测第1代、3代、5代、7代、9代细胞球细胞中肿瘤干细胞特异性标志物Ki67和p75NTR的表达情况,并对细胞增殖、侵袭能力进行对比。结果:第1代、3代、5代细胞球细胞中p75NTR核阳性表达的细胞数量随球细胞代数的增长依次递增,增殖、侵袭能力都随之相应增强；第5代、7代、9代细胞球细胞核均p75NTR表达阳性,同时其相应的增殖、侵袭能力均未见显著差异。结论:无血清细胞球培养传代至第5代，细胞球完全由癌干细胞组成。

Description

一种利用人食管鳞癌细胞球培养富集癌干细胞的方法
技术领域
本发明属于医学技术领域，涉及一种利用人食管鳞癌细胞球培养富集癌干细胞的方法。
背景技术
食管癌是目前世界范围内最常见的六大恶性肿瘤之一,其发病率在中国最高。目前认为耐受化-放疗的残存的癌细胞是癌症干细胞(cancer stem cells，CSCs)。肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSC s)的研究,对肿瘤的临床诊断和治疗预后有着重要意义,食管肿瘤干细胞的分离和鉴定是研究食管癌靶向治疗的重要途径。尽管目前在ESCC个体癌组织中已发现多种干细胞相关蛋白高表达的癌细胞具有高度的自我更新能力，与病人的预后、病理分期、复发和治疗耐受相关。但是并没有发现明确的识别、分选食管癌CSCs的特异性标签蛋白和技术。肿瘤细胞球培养是目前获取没有特异性标签蛋白的肿瘤干细胞的唯一方法，但是肿瘤细胞球仍然是一个由处于不同分化程度的异质性肿瘤干细胞组成的细胞群，至于细胞球内细胞成分，特别是多次传代培养后细胞球干细胞成分的变化如何？没有明确的结果。
本课题组黄燕燕通过无血清成球培养法获得食管癌Eca109细胞球并观察了其干细胞特性及p75NTR表达情况,推测细胞球中p75NTR核表达阳性的球细胞有可能是食管癌干细胞。但是细胞球细胞都是干细胞,还是仍然是异质性细胞群,没有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用人食管鳞癌细胞球培养富集癌干细胞的方法，该方法从人食管癌细胞株Eca109细胞中分离培养出不同代次的细胞球细胞,观察p75NTR和ki67的表达,并对其增殖和侵袭能力进行分析,结果：传第五代及以后的细胞球完全由其中由p75NTR核表达阳性的细胞组成，是即由食管癌干细胞组成。
其具体技术方案为：
一种利用人食管鳞癌细胞球培养富集癌干细胞的方法，包括以下步骤：
步骤1、细胞球细胞的获得
选用对数生长期的食管癌鳞癌Eca109细胞,消化、离心,稀释成1×105/mL的单细胞悬液，接种到添加有B27的无血清培养基DMEM/F12,37℃,5％CO2培养箱中培养。待食管癌Eca109细胞形成连接紧密、体积较大的悬浮的细胞球时,收集细胞球，离心、再稀释成稀释成1×105/mL的单细胞悬液，再次进行传代，反复此过程一直传代至第九代。观察实验所需代次细胞球细胞的成球数量并计算成球率。
步骤2、荧光免疫细胞化学检测细胞球细胞p75NTR、Ki67的表达
取各代细胞球细胞，消化、离心,用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基重悬,制成8×103/mL单细胞悬液,种入预先准备好的盖玻片上,置于37℃,5％CO2培养箱中培养24h。取出盖玻片,4％的多聚甲醛固定20min。1×PBS冲洗后滴加山羊封闭液37℃封闭30min,加入一抗后4℃孵育过夜。次日,37℃复温30min,滴加荧光二抗室温孵育2h,最后抗荧光淬灭封片剂封片。采用激光共聚焦显微镜来观察着色部位及荧光强度。
步骤3、CCK8法测细胞球细胞增殖情况
将各代细胞球细胞，消化、离心,用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基重悬,稀释成1×105/mL的单细胞悬液,在96孔板中每孔接种100μL稀释好的细胞悬液,设空白对照组,在37℃、5％CO2培养箱中培养24h后,每孔加10μL CCK8液,培养2h。在酶联免疫检测仪上450nm波长处检测各孔的吸光度值,记录结果进行统计,并描绘其生长曲线。
步骤4、Transwell检测细胞球细胞侵袭
Matrigel基质胶用无血清高糖DMEM培养基培养基按1∶8稀释包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃过夜风干；37℃预温无血清高糖DMEM培养液30min,用无血清高糖DMEM培养液调整细胞密度为1×105/mL,上室加100μL细胞悬液,下室加入600μL含20％FBS的高糖DMEM培养液,放入37℃、5％CO2培养箱继续培养48h；使用棉签轻轻擦拭,擦去上室内的细胞和基质胶,在4％的多聚甲醛中固定20min,风干,结晶紫染色30min,用光学显微镜观察计数，每个小室随机选取5个200×视野的细胞；
步骤5、统计学方法
采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计分析。以表示,采用ANOVA单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
进一步，步骤1中所述无血清培养基DMEM/F12添加B27的量为1:50，即B27：无血清培养基DMEM/F12的体积比为1:50。
进一步，研究结果显示:每代细胞球形成的时间、大小无明显差异,但第1代、3代、5代细胞球形成的数量随代数的增长依次递增,而第5代、7代、9代的细胞球形成数量差异无统计学意义。另外,第1代、3代、5代细胞球细胞中p75NTR核表达阳性的细胞数量随细胞球代数的增长依次递增,增殖、侵袭能力都随之相应增强；第5代、7代、9代细胞球细胞均是p75NTR核阳性表达,同时第5代、7代、9代细胞球细胞的增殖能力、侵袭能力差异无统计学意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明从人食管癌细胞株Eca109细胞中分离培养出不同代次的细胞球细胞,观察p75NTR和ki67的表达,并对其增殖和侵袭能力进行分析,证实：传至第五代及以上的球细胞是食管癌干细胞。；以及提供依据。
本发明的研究结果表明：第1代、3代、5代细胞球细胞中p75NTR核阳性表达的细胞数量随球细胞代数的增长依次递增,增殖、侵袭能力都随之相应增强；第5代、7代、9代细胞球细胞核均表达p75NTR,同时其相应的增殖、侵袭能力均未见显著差异。得出结论:1.无血清细胞球培养传代至第5代，细胞球完全由癌干细胞组成；
附图说明
图1是食管癌Eca109细胞球的形态，A.食管癌Eca109贴壁细胞；B.第1代细胞球；C.第3代细胞球；D.第5代细胞球；E.第7代细胞球；F.第9代细胞球；
图2是不同代次细胞球细胞成球能力；
图3是Eca109细胞、不同代数Eca109细胞球p75NTR(绿)、Ki67(红)、DAPI(蓝)的表达(×200)；
A-D.食管癌Eca109贴壁细胞；E-H.第1代细胞球；I-L.第3代细胞球；M-P.第5代细胞球；Q-T.第7代细胞球；U-X.第9代细胞球。
图4是Eca109细胞、不同代数Eca109细胞球增殖情况；
图5是不同代数Eca109细胞球Transwell侵袭能力，A.食管癌Eca109贴壁细胞；B.第1代细胞球；C.第3代细胞球；D.第5代细胞球；E.第7代细胞球；F.第9代细胞球；
图6是不同代数Eca109细胞球Transwell侵袭能力统计结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1材料与方法
1.1材料
人食管鳞癌细胞系Eca109细胞(中国科学院上海细胞库)；DMEM/F12无血清培养基、高糖DMEM培养基、胎牛血清和胰酶(GBICO公司)；B27(Invitrogen公司),兔抗人p75NTR、Ki67单克隆抗体(abcom公司)；山羊抗鼠IgG-FITC二抗、山羊抗兔IgG-TRITC二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Cell Counting Kit-8(日本同仁化学研究所CCK-8试剂盒)；1.2μm孔径Matrigel Matrix基质胶(BD公司)；24孔Tanswell小室(Millipore公司)；LSM-510激光共聚焦显微镜(德国CarlZeiss公司)。
1.2方法
选取对数生长期的食管癌Eca109细胞用于实验,细胞用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养,在37℃、5％CO2培养箱内培养。显微镜下观察细胞密度达80％以上时,即可传代。
1.2.1细胞球细胞的获得
选用添加有B27(1:50)的无血清培养基DMEM/F12,选用对数生长期的食管癌鳞癌Eca109细胞,消化、离心,加入无血清培养基DMEM/F12稀释成1×105/mL的单细胞悬液种入培养瓶中,37℃,5％CO2培养箱中培养,待食管癌Eca109细胞形成连接紧密、体积较大的悬浮的细胞球时,再次进行传代。将实验所需代次细胞球移入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养,这样有血清和无血清交替培养3次。观察实验所需代次细胞球细胞的成球数量并计算成球率。
1.2.2荧光免疫细胞化学检测p75NTR、Ki67的表达
取对数生长期的细胞,消化、离心,用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基重悬,制成8×103/mL单细胞悬液,种入预先准备好的盖玻片上,置于37℃,5％CO2培养箱中培养24h。取出盖玻片,4％的多聚甲醛固定20min。1×PBS冲洗后滴加山羊封闭液37℃封闭30min,加入一抗后4℃孵育过夜。次日,37℃复温30min,滴加荧光二抗室温孵育2h,最后抗荧光淬灭封片剂封片。采用激光共聚焦显微镜来观察着色部位及荧光强度。
1.2.3CCK8法测细胞增殖情况
将对数生长期的细胞进行消化、离心,稀释成1×105/mL的单细胞悬液,在96孔板中每孔接种100μL稀释好的细胞悬液,设空白对照组,在37℃、5％CO2培养箱中培养24h后,每孔加10μL CCK8液,培养2h。在酶联免疫检测仪上450nm波长处检测各孔的吸光度值(OD值),记录结果进行统计,并描绘其生长曲线。
1.2.4Transwell细胞侵袭实验
Matrigel基质胶用无血清高糖DMEM培养基培养基按1∶8稀释包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃过夜风干；37℃预温无血清高糖DMEM培养液30min,用无血清高糖DMEM培养液调整细胞密度为1×105/mL,上室加100μL细胞悬液,下室加入600μL含20％FBS的高糖DMEM培养液,放入37℃、5％CO2培养箱继续培养48h；使用棉签轻轻擦拭,擦去上室内的细胞和基质胶,在4％的多聚甲醛中固定20min,风干,结晶紫染色30min,用光学显微镜观察计数(每个小室随机选取5个200×视野的细胞)。
1.2.5统计学方法
采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计分析。以表示,采用ANOVA单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1不同代次细胞球的特点
将食管癌Eca109细胞接种于添加B27的无血清DMEM/F12培养基中悬浮培养,至第8～11天获得一定数量又大又圆的细胞球。收集生长良好的细胞球,打散、离心制成单细胞悬液进行传代培养,仍能得到一定数量的细胞球。如此循环得到第2代直至第9代癌干细胞球(图1)。同时,观察并记录每代细胞球形成的时间及细胞球的大小,我们发现不同代次细胞球形成的时间均在8～11天,细胞球的大小也无显著性差异(P>0.05)。但是第1代、3代、5代细胞球形成的数量随代数的增长依次递增(P<0.05),而第5代、7代、9代的细胞球形成数量差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。
2.2不同代次细胞球细胞表达p75NTR和Ki67情况
采用细胞免疫荧光法检测食管癌Eca109贴壁细胞和不同代次食管癌Eca109细胞球细胞中干细胞标记物P75NTR、Ki67的定位表达。两种蛋白在细胞上均有表达,Ki67在食管癌Eca109细胞和不同代次细胞球细胞中都定位于细胞核。其中p75NTR在食管癌Eca109贴壁细胞中荧光大部分定位于细胞浆,小部分定位于细胞核(如图3A-D)。在第1代、3代、5代细胞球细胞中荧光定位于细胞核的数量随代数的增长依次递增(如图3E-H、3I-L、3M-P)。第5代、7代、9代所有细胞均是p75NTR核阳性表达(如图3M-P、3Q-T、3U-X)。
2.3不同代次细胞球细胞增殖能力
与食管癌Eca109贴壁细胞相比,不同代次食管癌Eca109细胞球具有更强的增殖能力(P<0.05),随着食管癌Eca109细胞球代数的增长,细胞球第1代,3代,5代细胞的增殖能力依次递增(P<0.05),但是第5代之后的增殖能力并无显著差异(P>0.05)(图4)。
2.4不同代次细胞球细胞的侵袭能力
细胞侵袭能力的大小与穿过Matrigel基质胶到达滤膜的细胞数成正比,结果(图5,6)显示:不同代次细胞球的穿膜细胞数量均显著多于食管癌Eca109贴壁细胞(P<0.05),随着食管癌Eca109细胞球代数的增长,穿膜的细胞数量依次递增,但是食管癌Eca109细胞球第5代之后穿膜的细胞数量并无显著差异(P>0.05)。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种利用人食管鳞癌细胞球培养富集癌干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、细胞球细胞的获得
选用添加有B27无血清培养基DMEM/F12,选用对数生长期的食管癌鳞癌Eca109细胞,消化、离心,加入无血清培养基DMEM/F12稀释成1×105/mL的单细胞悬液种入培养瓶中,37℃,5％CO2培养箱中培养,待食管癌Eca109细胞形成连接紧密、体积较大的悬浮的细胞球时,再次进行传代；将实验所需代次细胞球移入含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养,这样有血清和无血清交替培养3次；取仍能在有血清高糖DMEM培养基中贴壁的细胞用于实验；观察实验所需代次细胞球细胞的成球数量并计算成球率；
步骤2、荧光免疫细胞化学检测p75NTR、Ki67的表达
取对数生长期的细胞,消化、离心,用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基重悬,制成8×103/mL单细胞悬液,种入预先准备好的盖玻片上,置于37℃,5％CO2培养箱中培养24h；取出盖玻片,4％的多聚甲醛固定20min；1×PBS冲洗后滴加山羊封闭液37℃封闭30min,加入一抗后4℃孵育过夜；次日,37℃复温30min,滴加荧光二抗室温孵育2h,最后抗荧光淬灭封片剂封片；采用激光共聚焦显微镜来观察着色部位及荧光强度；
步骤3、CCK8法测细胞增殖情况
将对数生长期的细胞进行消化、离心,稀释成1×105/mL的单细胞悬液,在96孔板中每孔接种100μL稀释好的细胞悬液,设空白对照组,在37℃、5％CO2培养箱中培养24h后,每孔加10μLCCK8液,培养2h；在酶联免疫检测仪上450nm波长处检测各孔的吸光度值,记录结果进行统计,并描绘其生长曲线；
步骤4、Transwell细胞侵袭实验
Matrigel基质胶用无血清高糖DMEM培养基培养基按1∶8稀释包被Transwell小室底部膜的上室面,4℃过夜风干；37℃预温无血清高糖DMEM培养液30min,用无血清高糖DMEM培养液调整细胞密度为1×105/mL,上室加100μL细胞悬液,下室加入600μL含20％FBS的高糖DMEM培养液,放入37℃、5％CO2培养箱继续培养48h；使用棉签轻轻擦拭,擦去上室内的细胞和基质胶,在4％的多聚甲醛中固定20min,风干,结晶紫染色30min,用光学显微镜观察计数，每个小室随机选取5个200×视野的细胞；
步骤5、统计学方法
采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计分析；以表示,采用ANOVA单因素方差分析；P<0.05为差异有统计学意义。
2.根据权利要求1所述的利用人食管鳞癌细胞球培养富集癌干细胞的方法，其特征在于，步骤1中所述无血清培养基DMEM/F12添加B27的量为1:50。
3.根据权利要求1所述的利用人食管鳞癌细胞球培养富集癌干细胞的方法，其特征在于，研究结果显示:每代细胞球形成的时间、大小无明显差异,但第1代、3代、5代细胞球形成的数量随代数的增长依次递增,而第5代、7代、9代的细胞球形成数量差异不明显；另外,第1代、3代、5代细胞球细胞中p75NTR核表达阳性的细胞数量随细胞球代数的增长依次递增,增殖、侵袭能力都随之相应增强；第5代、7代、9代细胞球细胞均是p75NTR核阳性表达,同时第5代、7代、9代细胞球细胞的增殖能力、侵袭能力均未见显著差异。
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