CN109870577A - O-连接的n-乙酰氨基葡萄糖合成酶ogt在制备肝癌预后分子标志物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤分子生物学技术及生物医学领域，涉及O‑连接的N‑乙酰氨基葡萄糖合成酶OGT的医用用途，尤其涉及高表达水平的OGT作为肝癌预后的分子标志物以及OGT表达抑制剂在抑制肝癌增殖中的应用。本发明通过Western杂交证实了在临床肝癌标本中，O‑乙酰氨基葡糖转移酶(OGT)及O‑连接的N‑乙酰氨基葡萄糖修饰(O‑GlcNAc)的表达水平显著高于癌旁组织；通过肝癌病人的组织标本证实，相对于癌旁组织而言，部分肝癌组织中含有高水平的O‑GlcNAc修饰，用慢病毒介导法在肝癌细胞Huh7和PLC/PRF/5中下调OGT表达，发现肝癌细胞的增殖和成球能力明显降低，高浓度的葡萄糖有利于肝癌细胞的增殖和成球形成，该调控作用依赖于OGT。本发明将为肝癌的诊断和治疗提供一种新的干预方案的选择。

Description

O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖合成酶OGT在制备肝癌预后分子 标志物中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学技术及生物医学领域，涉及O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖合成酶OGT的医用用途，具体涉及O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖合成酶OGT在制备肝癌预后分子标志物中的应用，尤其涉及高表达水平的OGT作为肝癌预后的分子标志物以及OGT表达抑制剂在抑制肝癌增殖中的应用。

背景技术

现有技术公开了肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界范围内最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，尤其是在发展中国家肝癌的发病率较高，每年超过60,000肝癌病人死亡。越来越多的研究证据表明糖尿病与肝癌的发病率密切相关并且远远超出HBV、HCV、酒精肝等因素对肝癌造成的影响。台湾的一项研究数据表明糖尿病患者中肝癌的发病率是非糖尿病组的两倍之多。同样地，HBEl-Sera研究发现43％肝癌患者均患有糖尿病，然而，糖尿病与肝癌之间的发病机制尚不是很清楚。

目前临床实践中，肝癌最有效的手段有手术切除和肝脏移植肝，但是高复发率和肿瘤转仍然是肝癌治疗的两大难点。由于这些问题的存在，肝癌病人术后5年的生存率只有30％-40％。因此肝癌的早期筛查和诊断对于肝癌的防治非常重要；同时发展能够监控肝癌的试剂，试剂盒以及研究新的肝癌靶向治疗靶点是国民健康的重大问题。

研究公开了O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)修饰是一种可逆转的翻译后修饰，主要在细胞浆和细胞核内蛋白质的丝氨酸和苏氨酸上进行修饰。O-GlcNAc修饰过程通过O-乙酰氨基葡糖转移酶(OGT)和O-乙酰氨基葡糖苷酶(OGA)催化GlcNAc的加入和去除，这种动态的修饰随着体内环境中葡萄糖浓度变化而改变。O-GlcNAc修饰正成为肿瘤细胞的一种特征，使得肿瘤细胞中的关键蛋白处于超高糖基化下；超高糖基化状态的细胞有助于肿瘤细胞的过度增殖，促进肿瘤细胞存活，抵抗多种压力应激，肿瘤血管生存，肿瘤细胞迁移和转移及干细胞自我更新等多种生物过程。众多研究报道，O-GlcNAcylation可以通过不同的病理机制参与肿瘤的形成，在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等肿瘤都发现O-GlcNAcylation和OGT的表达水平显著上升。越来越多的证据指出OGT，O-GlcNAcylation参与肿瘤的发生发展过程，将可以作为治疗肿瘤潜在的新方法；然而，O-GlcNAcylation参与肝癌发生发展的作用机制研究还处在初期，其中的一些具体调控机制尚不是很清楚。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖合成酶OGT的新的医用用途，具体涉及O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖合成酶OGT在制备肝癌预后分子标志物中的应用，尤其涉及高表达水平的OGT作为肝癌预后的分子标志物以及OGT表达抑制剂在抑制肝癌增殖中的应用。

发明内容

本发明目的在于基于现有技术的现状，提供O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖合成酶OGT的新的医用用途，具体涉及O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖合成酶OGT在制备肝癌预后分子标志物中的应用，尤其涉及高表达水平的OGT作为肝癌预后的分子标志物以及OGT表达抑制剂在抑制肝癌增殖中的应用。

本发明通过Western杂交证实了在临床肝癌标本中，O-乙酰氨基葡糖转移酶(OGT)及O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖修饰(O-GlcNAc)的表达水平显著高于癌旁组织；同时通过232例肝癌病人的组织标本证实，相对于癌旁组织而言，大部分肝癌组织中含有高水平的O-GlcNAc修饰；本发明用慢病毒介导法在肝癌细胞Huh7和PLC/PRF/5中下调OGT表达，发现肝癌细胞的增殖和成球能力明显降低，同时发现高浓度的葡萄糖有利于肝癌细胞的增殖和成球形成，而这一调控作用依赖于OGT；因此，本发明可根据OGT蛋白的表达水平及总O-GlcNAcylation的修饰水平蛋白在肝癌组织中的表达来判断病人的预后，即OGT蛋白的表达水平及总O-GlcNAcylation的修饰水平高预示着肝癌病人恶性程度更高、预后更差，从而为肝癌病人提供了预后判断的指标；另一方面，可以通过OGT表达抑制剂调控肝癌细胞的增殖和成球能力，从而调控肝癌的发生和发展。本发明提供的OGT在用于制备肝癌的早期诊断制剂及OGT干扰核酸在用于制备肝癌治疗制剂中的应用将为肝癌的诊断和治疗提供一种新的选择方案。

本发明体外实验，结果显示，

在临床肝癌标本中，OGT及O-GlcNAcylation的表达水平在肿瘤组织中显著高于癌旁组织；

通过对232例肝癌病人的组织芯片进行免疫组化分析，大部分肝癌病人组织中具有较高水平的OGlcNAc修饰蛋白；

用慢病毒介导法在肝癌细胞Huh7和PLC/PRF/5中将OGT表达下调，经过一段时间的培养和筛选，其OGT蛋白水平和总O-GlcNAcylation修饰明显下调；

利用已建立的肝癌OGT干扰细胞株，通过CCK-8法检测OGT对肝癌细胞Huh7和PLC/PRF/5增殖能力的影响，发现下调OGT蛋白的表达能够抑制肝癌细胞的增殖能力；

本发明进一步研究OGT在肝癌细胞中的生物学功能，通过细胞成球实验分析OGT对肝癌细胞Huh7干性潜能的影响，利用已建立的肝癌OGT干扰细胞株放在条件性培养基中培养，培养12天后，细胞聚集生长形成细胞球状，OGT干扰的细胞株中，细胞球体的直径和数目明显少于对照组，因此下调OGT蛋白的表达能够抑制肝癌细胞的成球能力；

本发明进行了糖尿病群体与非糖尿病人比较，发生肝癌的风险明显上升，表明糖尿病正成为肝癌发展过程中重要风险因素，高浓度葡萄糖有利于肝癌细胞的增殖和成球形成，而这一调控作用依赖于OGT；

采用葡萄糖的替代物2-DG，验证2-DG能否代替葡萄糖降低肝癌细胞的增殖和成球能力，实验结果显示，随着不同浓度的2-DG处理，对细胞的增殖和成球功能有一定的抑制作用；

干扰OGT蛋白的表达能够降低eIF4E蛋白水平的表达水平，在高浓度的葡萄糖生理条件，更有利于促进OGT调控eIF4E影响肝癌的发展过程。

基于OGT蛋白及总O-GlcNAcylation的修饰水平在肝癌病人中高表达，并与肝癌患者的预后息息相关这一特点，本发明提供了一种肝癌的检测试剂，即检测GlcNAcylation和OGT的试剂。所述的试剂或试剂盒，可以是酶联免疫检测OGT的ELISA试剂盒、化学发光试剂盒、固态或液态芯片试剂盒或OGT的单克隆抗体和多克隆抗体。上述的检测OGT单克隆抗体可为CST公司的货号为5368的单克隆抗体。

基于下调OGT蛋白的表达水平能够抑制肝癌细胞的增殖和成球能力的特点，本发明还提供一种治疗肝癌的药物，主要活性成分为OGT的表达抑制剂，所述的抑制剂为抑制OGT表达的shRNA干扰质粒或shRNA干扰分子；上述的ShRNA可选自合成的ShRNA1和ShRNA2干扰分子。

本发明中，用于构建N-乙酰氨基葡糖转移酶(OGT)shRNA1的引物：

OGT-shRNA1-F(5-3):

CCGGTGGATGCTTATATCAATTTAGGCTCGAGCCTAAATTGATATAAGCATCCTTTTTG

OGT-shRNA1-R(5-3):

AATTCAAAAAGGATGCTTATATCAATTTAGGCTCGAGCCTAAATTGATATAAGCATCCA

本发明中，用于构建N-乙酰氨基葡糖转移酶(OGT)shRNA2的引物：

OGT-shRNA2-F(5-3):

CCGGTGCACAATCCTGATAAATTTGACTCGAGTCAAATTTATCAGGATTGTGCTTTTTG

OGT-shRNA2-R(5-3):

AATTCAAAAAGCACAATCCTGATAAATTTGACTCGAGTCAAATTTATCAGGATTGTGCA

基于OGT在肝癌病人患者中高表达以及下调OGT蛋白的表达水平能够抑制eIF4E的表达，调节OCT4，Sox2，Nanog，KLF4的表达，从而调节肝癌细胞的增殖和成球能力的特点，本发明提供了一种对OGT，eIF4E，OCT4，Sox2，Nanog，KLF4联合检测试剂。所述的试剂或试剂盒，可以是酶联免疫检测OGT，eIF4E，OCT4，Sox2，Nanog的ELISA试剂盒、化学发光试剂盒、固态或液态芯片试剂盒或OGT，eIF4E，OCT4，Sox2，Nanog的单克隆抗体和多克隆抗体。

本发明的肝癌检测试剂可以为肝癌的早期诊断及肝癌病人的生存预后提供一种监测手段，明显提高肝癌病人的复发的检出率；本发明的肝癌检测试剂只需要少量的患者组织，即可对患者进行诊断，避免了对患者造成的伤害，有利于医生选择合适的药物和方法对患者进行针对性干预治疗；本发明中所述的肝癌治疗药物，可以为肝癌的治疗提供一种新的选择，具有广阔的应用前景。

同时本发明在一定程度上解释了糖尿病与肝癌的发病之间的关系，为肝癌的防治提供了一定的理论依据。

附图说明

图1，在临床肝癌标本中，OGT及O-GlcNAcylation的表达水平在肿瘤组织中显著高于癌旁组织，其中，(a)利用Western技术检测8位肝癌病人癌组织及癌旁组织中整体的O-GlcNAcylation的表达水平；(b)Western技术检测14例肝癌病人的癌组织及癌旁组织中OGT的表达水平。

图2，通过对232例肝癌病人的组织芯片进行免疫组化分析，大部分肝癌病人组织中具有较高水平的OGlcNAc修饰蛋白，其中，(a)为OGlcNAc在不同肝癌病人中表达水平；(b)232例肝癌病人的癌组织中O-GlcNAcylation修饰表达水平的强弱分布；(c)为肝癌组织芯片中肝癌病人癌和癌旁组织中O-GlcNAcylation免疫组织化学染色的代表图，左边为低倍镜下的组织图，右边为左边图中方框中组织放大后的高倍镜下的图；(d)232例肝癌病人的癌和癌旁组织中O-GlcNAcylation修饰表达水平的强弱分布。

图3，用慢病毒介导法在肝癌细胞Huh7和PLC/PRF/5中将OGT表达下调，经过一段时间的培养和筛选，其OGT蛋白水平和总O-GlcNAcylation修饰明显下调，Western杂交检测对照组和OGT敲低组(OGTshRNA1和OGTshRNA2)Huh7及PLC/PRF/5细胞中OGT蛋白水平和总O-GlcNAcylation的表达水平，检测β-actin蛋白量作为内参。

图4，利用已建立的肝癌OGT干扰细胞株，通过CCK-8法检测OGT对肝癌细胞Huh7和PLC/PRF/5增殖能力的影响，发现下调OGT蛋白的表达能够抑制肝癌细胞的增殖能力。

图5.为了进一步研究OGT在肝癌细胞中的生物学功能，本发明通过细胞成球实验分析OGT对肝癌细胞Huh7干性潜能的影响，利用已建立的肝癌OGT干扰细胞株放在条件性培养基中培养，培养12天后，细胞聚集生长形成细胞球状，发现OGT干扰的细胞株中，细胞球体的直径(b)和数目(c)明显少于对照组，因此下调OGT蛋白的表达能够抑制肝癌细胞的成球能力。

图6，糖尿病群体与非糖尿病人比较，发生肝癌的风险明显上升，表明糖尿病正成为肝癌发展过程中重要风险因素，因此，本发明在实验设计增加高浓度葡萄糖条件，分析高糖条件能否影响OGT调控肝癌细胞的增殖和细胞球形成能力，结果表明高浓度葡萄糖有利于肝癌细胞的增殖和成球形成，而这一调控作用依赖于OGT，其中，(a)25mM高浓度葡萄糖条件下，利用已建立肝癌OGT干扰细胞株，通过CCK-8法检测细胞的增殖情况，同时检测肝癌细胞球株体的直径(b)和数目(c)。

图7，采用葡萄糖的替代物2-DG，其作用是替代葡萄糖，不能使葡萄糖进入代谢途径，其中，验证2-DG能否代替葡萄糖降低肝癌细胞的增殖和成球能力，实验结果显示，随着不同浓度的2-DG处理，对细胞的增殖和成球功能有一定的抑制作用。

图8，干扰OGT蛋白的表达能够降低eIF4E蛋白水平的表达水平，其中，(a)，在抑制葡萄糖进入HBP途径后，回补eIF4E蛋白的表达，肝癌细胞的增殖和细胞球形成明显提高(b)-(f)，实验结果表明在在高浓度的葡萄糖生理条件，更有利于促进OGT调控eIF4E影响肝癌的发展过程。

具体实施方式

本发明提供的具体实施方式作详细说明，但本发明的实施并不仅限于此。

本实施例中未注明的具体条件和实验方法，通常按照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或者参照试剂生产商提供的条件实施。

实施例1.OGT及O-GlcNAcylation的表达水平用western杂交检测

为了研究N-乙酰氨基葡糖转移酶(OGT)在肝癌中表达情况，本实施例中选用新鲜的肝癌标本(成对的肿瘤组织及癌旁组织)。将病人组织裂解，提取总蛋白，待SDS-PAGE胶蛋白电泳，

1)根据实验目的制备不同浓度的分离胶SDS-PAGE分离胶，静置1h后分离胶凝固，制备5％的积层胶，插上合适的梳子待凝；

2)向电泳槽中加入1×SDS电泳缓冲液，内槽的缓冲液要没过加样孔，下槽没过电极，加入蛋白样品和蛋白质分子量标准Marker。接通装置电源，电压60V，当蛋白Marker进入分离胶后，把电压调至120V，继续电泳，当溴酚蓝到达分离胶的底部，停止电泳；

3)将胶浸于转移缓冲液中平衡10min，剪取适当大小的PVDF膜，用纯甲醇浸泡1min，再移入转移缓冲液浸泡，装配转移“三明治”：依次为海绵→3层滤纸→凝胶→PVDF膜→3层滤纸→海绵，加转移缓冲液，插上电极，选择恒流350mA；

4)封闭:转膜结束后，放入含10％BSA的TBST封闭缓冲液中，室温摇动2h或者4℃过夜；

5)免疫杂交:TBST漂洗膜3次，每次5-10min；用含10％BSA的TBST一抗，4℃过夜孵育；TBST漂洗膜3次，每次10-15min；

用含10％BSA的TBST稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(稀释比1:10000)，室温孵育膜2h；TBST漂洗膜3次，每次20-25min；

6)显色曝光:根据信号的强弱适当调整曝光时间，扫描并保存实验结果，结果表明：在临床肝癌标本中，OGT及O-GlcNAcylation的水平在肿瘤组织中显著高于癌旁组织。

实施例2O-GlcNAcylation蛋白在肝癌组织芯片中的免疫组织化学分析

1)本实验使用的肝癌组织芯片由上海芯超生物科技有限公司制作，共232例肝癌标本。

肝癌组织芯片处理：脱蜡，水化组织切片：二甲苯3min×2次；无水乙醇3min×2次；95％乙醇3min×1次；70％乙醇3min×1次；50％乙醇3min×1次；将组化标本放到自来水中冲洗片刻；在放到ddH₂O静置5min；

2)抗原修复：将装有抗原修复液的耐高温容器放入高压灭菌锅内，浸入组化标本，盖紧高压锅，升温至123℃，切断电源，让其在121℃-123℃维持5min，打开安全阀，取出耐高温容器，冷却至室温再取出切片，ddH2O洗5min×3次：

3)阻断内源性过氧化物酶：在用ddH2O稀释的H2O2溶液中(浓度为3％)孵育10min，ddH2O洗5min×2次，TBST buffer(0.025％Tween-20)洗5min×1次；

4)封闭：擦去组化标本上多余的水分，用阻水笔在切片周围轻轻画个框，滴在封闭液(TBS+0.3％Triton X-100+5％血清)，室温孵育2h；

5)一抗：将标本上的封闭液去净，滴加一抗(用含5％血清的TBS缓冲液稀释)，室温孵育3h或4℃过夜，TBST buffer(0.025％Tween-20)洗5min×2次：

6)二抗：擦去多余水分，滴加二抗(用含5％血清的TBS缓冲液稀释)，室温孵育30min，0.025％Tween-20TBS buffer洗5min×2次：

7)显色：在组化标本上滴加组化专用DAB溶液，同时在显微镜下观察显色程度，待出现阳性反应，则在自来水中冲洗阻断反应：

8)衬染：将苏木精滴在组化标本上，复染1min，流水冲洗，1％盐酸-乙醇分化10s，流水冲洗：

9)脱水：50％乙醇3min，70％乙醇3min，95％乙醇3min，无水乙醇3min，二甲苯3min×2次：

10)将组化标本在通风出橱内充分晾干为止：

11)封片：中性树脂封固。

根据染色的着色强度和阳性率对染色结果进行打分评估，染色强度打分标准为：阴性为0分，弱阳性为1分，中等阳性为2分，强阳性为3分；染色阳性率打分标准为：0％为0分，1-11％为1分，11-50％为2分，多于50％为3分；将染色强度的得分与阳性率的得分相乘，获得组织切片的综合得分，得分小于或等于1的评判为染色阴性，大于1的评判为阳性；根据打分评估，在232例肝癌标本中，211例标本为O-GlcNAcylation阳性表达，大部分肝癌组织中含有高水平的O-GlcNAc修饰，并且相对于癌旁组织而言，肝癌组织中总O-GlcNAcylation很高。

实施例3肝癌细胞系Huh7中敲低OGT的表达后，western杂交检测OGT的敲低效果、细胞成球实验检测细胞的增殖和自我更新能力

1、肝癌细胞系Huh7与PLC/PRF/5中敲低OGT的表达和结果分析

本实验采用人的肝癌细胞系Huh7与PLC/PRF/5，细胞培养采用含10％胎牛血清(Biological Industries)、100μg/ml青霉素及50μg/ml链霉素(Gibco)的DMEM培养液(Gibco)，在5％CO2-95％空气、饱和湿度以及37℃的培养条件下培养，在肝癌细胞系Huh7中，利用包装有针对OGT干扰RNA(shOGT-1和shOGT-2)的慢病毒敲低OGT的表达，以不针对任何人源基因的干扰RNA(的病毒感染Huh7细胞作为对照，经过一段时间的培养和筛选，OGT的敲低效果采用western杂交检测，结果如图3所示，用OGT的干扰RNA敲低OGT的表达后，OGT蛋白的表达水平和总O-GlcNAcylation修饰明显下调；

2、检测OGT敲低Huh7细胞的增殖情况

所使用的细胞株为上述为已建立的肝癌OGT干扰细胞株和对照株细胞，利用CCK-8实验进行检测，具体操作如下：

1)先用0.25％胰酶消化单层培养的细胞，再用含10％胎牛血清的DMEM吹打使其形成单个细胞悬液；

2)每孔接种5×103个细胞到96孔细胞培养板中，放入细胞培养箱中1h(目的使悬浮的细胞贴壁)，每个样品做6个平行复孔，并加空白孔做为对照，细胞培养时间设为0h、24h、48h、72h、96h。将10μl CCK-8溶液加入96孔细胞培养板中，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养2小时，终止培养；

3)在酶联免疫检测仪上选择450nm波长，测定吸光值，保存数据。绘制细胞生长曲线，分析实验结果，实验结果表明OGT对肝癌细胞的增殖能力具有显著抑制作用；

3、检测OGT敲低Huh7细胞成球能力实验过程和结果分析

1)将上述DMEM培养液培养的对照组细胞和OGT敲低组细胞用胰酶消化，用DMEM培养液将细胞重悬为单个状态；2000rpm离心5分钟，吸去上清；

2)用含有20ng/mL EGF(Chemicon)、20ng/mL FGF-2(Chemicon)、2μg/mL heparin(Sigma)、1:50的比例加入不含维生素A的B27(Gibco)、100μg/ml青霉素及50μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基(Gibco)洗涤细胞，2000rpm离心5分钟，吸去上清，用DMEM/F12培养基重复洗涤细胞2次，用细胞计数仪计算细胞数量；

3)将对照组和CD133敲低组的细胞等量分到低吸附的96孔板(Corning)，每孔500个细胞悬浮于100μl DMEM/F12培养基中，每组9个重复孔，共10个孔；

4)每3天补充30μl DMEM/F12培养基，培养2周后，统计形成细胞球的数量和直径，以直径大于70μm的细胞球作为有效的结果；

结果如图5所示，OGT敲低后，Huh7细胞形成的细胞球直径明显比对照组小，细胞球数量也显著少于对照组，说明OGT的表达有利于肝癌细胞系Huh7的增殖和自我更新(*P<0.05,**P<0.01)。

Claims (9)

1.O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖合成酶OGT在用于制备肝癌的早期诊断制剂中的应用。

2.OGT表达抑制剂在用于制备抑制肝癌增殖制剂中的应用。

3.一种肝癌的检测试剂，其特征在于，含有检测GlcNAcylation和OGT的试剂。

4.按权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂还包括其检测试剂盒，选自酶联免疫检测OGT的ELISA试剂盒、化学发光试剂盒、固态或液态芯片试剂盒或检测OGT的单克隆抗体和多克隆抗体试剂盒。

5.按权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述的检测OGT单克隆抗体为CST公司的货号为5368的单克隆抗体。

6.一种治疗肝癌的药物，其特征在于，其中主要活性成分为OGT的表达抑制剂。

7.按权利要求6所述的治疗肝癌的药物，其特征在于，所述的抑制剂为抑制OGT表达的shRNA干扰质粒或shRNA干扰分子。

8.按权利要求7所述的治疗肝癌的药物，其特征在于，所述的ShRNA选自合成的ShRNA1和ShRNA2干扰分子。

9.一种对OGT，eIF4E，OCT4，Sox2，Nanog，KLF4联合检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或试剂盒选自酶联免疫检测OGT，eIF4E，OCT4，Sox2，Nanog的ELISA试剂盒、化学发光试剂盒、固态或液态芯片试剂盒或OGT。