CN111234022A - 抗n-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体及杂交瘤细胞株和其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体及杂交瘤细胞株和其制备方法与应用，所述杂交瘤细胞株能够分泌抗N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体，其保藏编号为CCTCC NO：C2019117。其具有有效的抑制多种肿瘤细胞生长的活性，且直接杀死或杀伤肿瘤细胞，能够应用于肿瘤的诊断和治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体及杂交瘤细胞株和其制备方法与应用。
背景技术
糖蛋白的寡糖链参与了分子识别以及细胞与细胞间、细胞与间质间的识别、黏附和受体作用等多种生物功能。细胞癌变时癌细胞膜上糖蛋白的寡糖链发生改变，即糖基异常化(aberrantglycosylation)，各种异常的糖蛋白糖基可影响细胞的正常功能，如细胞的识别和黏附功能障碍，是导致细胞恶性转化的分子基础。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(O-GlcNAc，OGT)是一组参与天冬酰胺连接型(N-)聚糖合成加工的酶类，能将共同供体底物UDP-N-乙酰氨基葡萄糖 (UDP-GlcNAc)中的GlcNAc(Gn)糖基转移至N-聚糖五糖核心的两个甘露糖上。
O-GlcNAc糖基化是一种广泛存在于蛋自质丝苏氨酸残基上的动态、可逆的蛋白质翻译后修饰，广泛分布在细胞浆和细胞核中，参与调节多种细胞途径。在体内，O-GlcNAc动态修饰由N-乙酞氨基葡萄糖转移酶(OGT)和N-乙酞氨基葡萄糖普酶(OGA)协同完成。N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅴ(GnTV)为糖蛋白N-糖链加工酶之一，起着决定N-糖链类型及复杂型糖链结构的重要作用。筛选能抑制肿瘤细胞生长或者能应用于肿瘤诊断的单克隆抗体是当前的迫切需要。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
作为本发明其中一个方面，本发明提供一种杂交瘤细胞株。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种杂交瘤细胞株，其中：所述杂交瘤细胞株能够分泌抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体，其保藏编号为CCTCC NO：C2019117。
作为本发明所述的杂交瘤细胞株的一种优选方案：所述杂交瘤细胞株是通过SEQID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所述的三段序列通过蛋白重组表达出的三段N-乙酰氨基葡萄糖转移酶蛋白免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得。
作为本发明的另一个方面，本发明提供一种抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌所得。
作为本发明所述的抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体的一种优选方案：所述抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体能够识别并杀死肿瘤细胞，具有抑制肿瘤细胞的作用。
作为本发明的另一个方面，本发明提供制备所述的抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体的方法，其包括，
三段重组蛋白片段的重组表达：分别对SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：3所述的三段序列进行基因片段扩增，然后对目的基因片段和蛋白表达载体pET 28a进行酶切连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行测序，将测序正确的阳性克隆提取质粒转入大肠杆菌BL21中，IPTG诱导蛋白表达并纯化，重组表达出三段N-乙酰氨基葡萄糖转移酶蛋白；
制备杂交瘤细胞株。
作为本发明所述的制备抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体的方法的一种优选方案：所述制备杂交瘤细胞株，其包括将所述三段N- 乙酰氨基葡萄糖转移酶蛋白混合用脂质体颗粒包封，皮下多点注射加腹腔注射于Balb/c小鼠，注射3次，每次时间间隔为2周，第3次注射4天后，尾静脉注射所述三段N-乙酰氨基葡萄糖转移酶蛋白混合剂；将免疫小鼠的脾细胞与 Sp2/0骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞；筛选分泌抗体能力最强的阳性的杂交瘤细胞株进行克隆化，挑选单克隆细胞株并定株，定株后的杂交瘤细胞株扩大培养，纯化，得到所述抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体。
作为本发明所述的制备抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体的方法的一种优选方案：所述进行基因片段扩增，其三段基因片段引物分别为：5’-GCCGACAGCACAGAACCAAC-3’、5’ -GGTGGGACACAGACGGAGAG-3’；5’-GCAGGAAGCTCTGATGCATTATAA-3’、5’-ATGAAAAGCGCACCACTCGT -3’；5’-CACTTTTTTTATTGGTGATCATGCT-3’、5’- GTTCCATTGTGTATTGTTTGGTGTT-3’。
作为本发明的另一个方面，本发明提供抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体在制备诊断或治疗肿瘤制剂中的应用。
本发明的有益效果：通过对所筛选的抗体进行细胞毒性试验，进一步选择具有抑制肿瘤细胞生长活性或能力的单克隆抗体，最终选择一株能有效抑制肿瘤细胞生长的单克隆抗体，并命名为OGTmAb。保藏编号为CCTCC NO： C2019117，其具有有效的抑制多种肿瘤细胞生长的活性，且直接杀死或杀伤肿瘤细胞，能够应用于肿瘤的诊断和治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为OGTmAb抑制肿瘤细胞生长图。
图2为OGT抑制剂处理肿瘤细胞裂解液与OGTmAb的反应性图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明的杂交瘤细胞株OGTmAb于2019年6月4日保藏在中国典型培养物保藏中心。地址：中国.武汉.武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：C2019117。
抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
3种OGT重组蛋白片段的重组表达：将OGT基因CDS区分成三段，分别设计3对引物进行基因片段扩增，然后对目的基因片段和蛋白表达载体pET 28a进行酶切连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行测序，将测序正确的阳性克隆提取质粒转入大肠杆菌BL21中，IPTG诱导蛋白表达并纯化，重组表达出 3种OGT重组蛋白片段；
制备杂交瘤细胞株：
1)、将步骤一的3种OGT重组蛋白片段混合剂用脂质体颗粒包封，皮下多点注射加腹腔注射于Balb/c小鼠，注射3次，每次时间间隔为2周，第3次注射4天后，尾静脉注射3种OGT重组蛋白片段混合剂；
2)、取经步骤1)的免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞；筛选分泌抗体能力最强的阳性的杂交瘤细胞株进行克隆化，选择生长速度快、分泌抗体能力强、长势优秀的单克隆细胞株，并定株；定株后的杂交瘤细胞株扩大培养，上清用protein-G柱亲和纯化，得到抗OGT单克隆抗体。
材料和来源：
实验动物：Balb/c小鼠和ICR小鼠购自南京青龙山实验动物场。
试剂：protein-G购于invitrigen公司。
3种OGT重组蛋白片段的表达与纯化：
分别设计3对引物进行基因片段扩增，构建质粒载体，用大肠杆菌重组表达出3种OGT重组蛋白片段。
(一)蛋白表达
试剂、耗材、仪器：
LB培养基，卡那霉素(Kan)，试管，10cm培养皿，摇床，引物，PCR试剂， PCR仪，琼脂糖，marker，移液枪，电泳槽，gel拍照仪，胶回收试剂盒，DNA 浓度测定仪，限制性内切酶，清洁回收试剂盒，pet28a载体，T4连接酶，DH5α感受态，质粒提取试剂盒，BL21感受态
操作步骤：
1、LB(液体，固体)配制：称取8g LB固体培养基(干粉)，加200mL ddH2O，混匀，121℃高压2h。高压好的固体培养基冷却至50℃(不烫手)后，加入卡那霉素浇板子(10cm培养皿)，通风厨中放置一夜后，放入4℃冰箱保存。
2、片段扩增
表1引物序列：
基因序列1(OGT-1，SEQ ID NO：1)：
基因序列2(OGT-2，SEQ ID NO：2)：
基因序列3(OGT-3，SEQ ID NO：3)：
PCR体系(高保真酶扩增)：
程序：95℃预变性4min；95℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸50s，设30个循环；72℃延伸10min。
取5μL PCR产物电泳，gel拍照仪拍照，根据marker判断结果是否正确，正确后将胶割下回收片段
3、胶回收：按照AXYGEN胶回收试剂盒(货号：AP-GX-50G)进行回收。
4、酶切
5、清洁回收
按照AXYGEN清洁回收试剂盒(货号：AP-PCR-50G)进行回收。
(1)向酶切产物中加入3倍体积的Buffer PCR-A，混匀后转移到制备管中，将制备管置于2mL离心管中，12000rpm离心1min，弃废液；
(2)将制备管置回2mL离心管中，加入700μL Buffer W2，12000rpm离心1min，弃废液，再加入400μL Buffer W2，12000rpm离心1min；
(3)12000rpm空离1min；
(4)将制备管置于清洁的1.5mL离心管中，在制备膜中央加入20μL Eluent，室温静置3min，12000rpm离心1min洗脱DNA；
(5)测浓度。
6、连接
16℃金属浴连接过夜
7、转化连接产物
将连接产物加入到感受态DH5α中，冰上孵育30min，42℃水浴锅热应激90s，再放置冰上3-5min，加入1mL液体LB，37℃，100rpm振揺1h，5000rpm离心5min，弃上清，菌液悬浮后涂布于含Kan抗性的LB平板上，37度培养过夜。
8、鉴定
挑取单菌落于3mL左右含Kan抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm振揺培养过夜PCR鉴定并提取质粒送测序。
9、转化质粒
测序正确的质粒转入感受态BL21中，方法同7，挑板鉴定后保种。
(二)原核表达蛋白的纯化
试剂、耗材、仪器：
200mL培养基、咪唑母液(1M)、Lysis buffer、Washing buffer、Elution buffer，Ni填料、IPTG、1.5mL离心管、50mL离心管(黄管)、超声仪、离心机、旋转摇床、0.22μm或0.45μm一次性过滤器、试管，摇床，500mL锥形瓶
溶液配制：
1、Lysis buffer(500mL)
Nacl(300mM) 8.77g
NaH2PO4·H2O(50mM) 3.45g
2、配备50mL咪唑母液(1M)
m＝cvM＝1*50*10-3*68.08＝3.404g
Lysis buffer(150mL)咪唑浓度10mM
1000*V＝10*150 V＝1.5mL
3、Washing buffer(50mL)咪唑浓度20Mm
1000*V＝20*50 V＝1mL
4、Elution buffer(50mL)咪唑浓度(200mM)
1000*V＝200*50 V＝10mL
操作步骤：
下午接菌(3mL培养基)；
第二天早上重新接菌(1：100)，200mL培养基中加2mL菌液，一小时后观察，之后每隔20min观察一次，菌体OD 600达到0.6左右时即可加入IPTG；
加入IPTG使其浓度达到1mM/mL(IPTG母液浓度1M/mL)，200mL培养基中加入200μLIPTG，37℃150rpm诱导5h，(加IPTG前取出1mL做对照)；
离心机收集菌体，PBS洗两遍，来不及纯化可以放于-80℃保存；
加入25-30mL lysis buffer，超声20min(超声2s停3s)，超声过程中可用ddH2O 洗涤Ni填料(3000rpm离心5min，洗涤3遍)；
超声完，4℃12000rpm离心20min，取上清，用0.22μm或0.45μm一次性过滤器过滤；
将Ni填料与过滤液混合，4℃摇摆结合1h；
先润洗垫片，将处理后的混合液转移至柱子中，静置5min，让其液自然流下，再用10-15mL lysis buffer洗涤杂蛋白，收集1-2管洗脱液；
用20mL左右的wahing buffer洗涤杂蛋白，收集1-2管洗脱液；
先加2mL左右elution buffer洗脱蛋白，之后每次加1mL，直至蛋白洗脱干净，洗脱的蛋白标记上E-1，E-2….E-10；
洗脱的蛋白测浓度，做上标记后-80℃保存。
(三)蛋白表达情况：
OGT 1浓度：4.846mg/mL
OGT 2浓度：4.479mg/mL
OGT 3浓度：4.985mg/mL
抗OGT单克隆抗体的制备与杂交瘤的定株：
(一)单克隆抗体的制备
将OGT1、OGT2、OGT3表达蛋白按1：2：1的质量比，用脂质体进行包装，形成复合物，作为免疫原按3种表达蛋白的总质量为80μg/只鼠的量皮下免疫8周龄左右的Balb/c小鼠；2周后，同样的蛋白量进行二免；2周后，同样的蛋白量进行三免；三免14天后处死小鼠，取出小鼠脾脏，用聚乙二醇(PEG)将研磨成单个细胞的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行细胞融合。融合前一周复苏Sp2/0 细胞，37℃，5％CO2培养箱中传代培养。将处于对数生长期的细胞收集至离心管中，细胞计数，把细胞稀释为106个/mL备用。饲养细胞可于融合前一天准备，取6-8周龄ICR小鼠1只，颈椎脱位致死，放于75％酒精中消毒5-10min，固定于盘上，在超净台中无菌剪开腹部皮肤。用无菌注射器吸取HAT选择培养液20mL注入小鼠腹腔，用酒精棉球轻揉腹部，抽回培养基。加入10mL HAT 培养液中，铺入到3块96孔细胞培养板中，100μL/孔，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。
表2三种不同OGT质量比免疫小鼠的免疫效果
| OGT1：OGT2：OGT3(质量比) | 免疫小鼠抗体滴度 | 评价 |
| 1：1：1 | 1：25600 | |
| 1：2：1 | 1：204800 | 最优 |
| 1：2：2 | 1：102400 | |
| 2：1：1 | 1：51200 | |
| 2：1：2 | 1：25600 | |
| 2：2：1 | 1：51200 | |
| 1：1：2 | 1：102400 |
将免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞按细胞数量2-4：1混合，加入50mL的融合管内，1000r/min离心10min，弃上清，在手心轻轻摩擦使两种细胞充分混匀；然后在37℃水浴下，将预热好的1mL PEG在60s内加入融合管内，先慢后快，边加边轻轻搅动。然后立即先慢后快地在90s内加入无抗无血DMEM 30mL，终止反应。37℃水浴10min，后1000r/min离心10min，弃上清，将沉淀以HAT 悬起，混匀到30mL含37℃预热的20％小牛血清的HAT选择培养液中，铺入已加有饲养细胞的96孔细胞板中，100μL/孔，将培养板放入37℃，5％CO2培养箱培养。5d后将用新鲜的HAT培养基对细胞板半换液，10天后用HT培养基全换液。
(二)单克隆抗体杂交瘤的定株
采用ELISA方法检测融合后形成的杂交瘤。分别包被免疫原OGT1、OGT2、 OGT3表达蛋白10ng的量于酶标板孔中，用于杂交瘤上清的检测。OD值高于1/0 以上的，判断为阳性反应。将96孔板中连续检测两次均为阳性的细胞扩大培养，采用有限稀释法进行亚克隆：先按所述方法进行饲养细胞的制备，滴入96孔板中，空出第一列。用HT培养基将阳性杂交瘤细胞吹起，取100μL进行计数，在第一列中进行倍比稀释，使之每10mL培养基中约含100个细胞；轻柔吹匀后加入铺有饲养细胞的培养板中，100μL/孔，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。约7天后数出细胞孔里的克隆数，标记并换新的培养基，待细胞铺满整个孔底的 1/3～1/2时检测。经过2-3次克隆化，待96孔板所有细胞孔均为阳性时，即可进行扩大培养，定株冻存，命名为抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(O-GlcNAc，OGT) 修饰的蛋白质单克隆抗体(单抗简称：OGTmAb)。
表3部分杂交瘤培养上清与免疫原的反应性
OGTmAb对肿瘤细胞的效应：
肿瘤细胞对抗OGT单克隆抗体敏感。选择20μg/mL的抗OGT单克隆抗体的作用浓度，孵育AGS细胞12小时。可见经抗OGT单克隆抗体处理过的AGS细胞大量死亡(图1A)，死亡率高达90％；而未经抗OGT单克隆抗体处理过的AGS细胞存活(图1B)。
OGTmAb对经OGT抑制剂处理肿瘤细胞的效应：
AGS胃癌细胞经2.5μg/mL作用浓度的OGT抑制剂处理，导致肿瘤细胞不能表达与OGT相关的蛋白的糖基化，再选择20μg/mL的抗OGT单克隆抗体的作用浓度，孵育AGS细胞12小时。可见经OGT抑制剂处理过的AGS细胞存活(图2A)；经OGT抑制剂处理过的AGS细胞，在抗OGT抗体的作用，未出现死亡(图2B)。进一步验证了，该抗OGT单克隆抗体与OGT修饰的蛋白的糖基化有关，且抗OGT单克隆抗体可通过作用于OGT修饰的蛋白的糖基化，而导致AGS细胞的死亡。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 南京泰斯德生物科技有限公司
<120> 抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体及杂交瘤细胞株和其制备方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<212> DNA
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cacttttttt attggtgatc atgctaatat gttccctcac ctgaagaaaa aagcagtcat 60
cgattttaag tccaatgggc acatttatga caatcggata gttctgaatg gcatcgacct 120
caaagcattt cttgatagtc taccagatgt gaaaattgtc aagatgaagt gtcctgatgg 180
aggagacaat gcagatagca gtaacacagc tcttaatatg cctgttattc ctatgaatac 240
tattgcagaa gcagttattg aaatgattaa ccgaggacag attcaaataa caattaatgg 300
attcagtatt agcaatggac tggcaactac tcagatcaac aataaggctg caactggaga 360
ggaggttccc cgtaccatta ttgtaaccac ccgttctcag tacgggttac cagaagatgc 420
catcgtatac tgtaacttta atcagttgta taaaattgac ccttctactt tgcagatgtg 480
ggcaaacatt ctgaagcgtg ttcccaatag tgtactctgg ctgttgcgtt ttccagcagt 540
aggagaacct aatattcaac agtatgcaca aaacatgggc ctgccccaga accgtatcat 600
tttttcacct gttgctccta aagaggaaca cgtcaggaga ggccagctgg ctgatgtctg 660
cttggacact ccactctgta atgggcacac cacagggatg gatgtcctct gggcagggac 720
ccccatggtg actatgccag gagagactct tgcttctcga gttgcagcat cccagctcac 780
ttgcttaggt tgtcttgagc ttattgctaa aaacagacaa gaatatgaag acatagctgt 840
gaagctggga actgatctag aatacctgaa gaaagttcgt ggcaaagtct ggaagcaaag 900
aatatctagc cctctgttca acaccaaaca atacacaatg gaac 944
Claims (8)
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株能够分泌抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体，其保藏编号为CCTCC NO：C2019117。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株是通过SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所述的三段序列通过蛋白重组表达出的三段N-乙酰氨基葡萄糖转移酶蛋白免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得。
3.一种抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌所得。
4.如权利要求3所述的抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体，其特征在于：所述抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体能够识别并杀死肿瘤细胞，具有抑制肿瘤细胞的作用。
5.制备权利要求3所述的抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体的方法，其特征在于：包括，
三段重组蛋白片段的重组表达：分别对SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所述的三段序列进行基因片段扩增，然后对目的基因片段和蛋白表达载体pET 28a进行酶切连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行测序，将测序正确的阳性克隆提取质粒转入大肠杆菌BL21中，IPTG诱导蛋白表达并纯化，重组表达出三段N-乙酰氨基葡萄糖转移酶蛋白；
制备杂交瘤细胞株。
6.如权利要求5所述的制备抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体的方法，其特征在于：所述制备杂交瘤细胞株，其包括将所述三段N-乙酰氨基葡萄糖转移酶蛋白混合用脂质体颗粒包封，皮下多点注射加腹腔注射于Balb/c小鼠，注射3次，每次时间间隔为2周，第3次注射4天后，尾静脉注射所述三段N-乙酰氨基葡萄糖转移酶蛋白混合剂；将免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞；筛选分泌抗体能力最强的阳性的杂交瘤细胞株进行克隆化，挑选单克隆细胞株并定株，定株后的杂交瘤细胞株扩大培养，纯化，得到所述抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体。
7.如权利要求5所述的制备抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体的方法，其特征在于：所述进行基因片段扩增，其三段基因片段引物分别为：5’-GCCGACAGCACAGAACCAAC-3’、5’-GGTGGGACACAGACGGAGAG-3’；5’-GCAGGAAGCTCTGATGCATTATAA-3’、5’-ATGAAAAGCGCACCACTCGT-3’；5’-CACTTTTTTTATTGGTGATCATGCT-3’、5’-GTTCCATTGTGTATTGTTTGGTGTT-3’。
8.抗N-乙酰氨基葡萄糖转移酶修饰的蛋白质单克隆抗体在制备诊断或治疗肿瘤制剂中的应用。
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