CN105408480A - 用于靶向o-连接的n-乙酰氨基葡萄糖转移酶和促进伤口愈合的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

目前公开的主题提供了用于靶向UDP-N-乙酰氨基葡萄糖多肽β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)的化合物、组合物和方法。而且，目前公开的主题提供了用于促进伤口愈合的化合物、组合物和方法。

Description

用于靶向O-连接的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和促进伤口愈合的组合物和方法

相关申请

本申请要求2013年3月11日提交的序列号为61/775,937的美国临时专利申请的优先权，其全部公开内容通过引用的方式并入本文。

政府利益

目前公开的主题是根据国立卫生研究院给予的RO1AI49427号基金在美国政府的支持下进行的。美国政府具有下述发明的一定权利。

技术领域

目前公开的主题涉及用于靶向UDP-N-乙酰氨基葡萄糖多肽β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)的化合物、组合物和方法。目前公开的主题还涉及用于促进伤口愈合的化合物、组合物和方法。

背景技术

慢性伤口是影响美国650万患者以及每年花费约250亿美元来治疗的重大患病根源(1)。患有糖尿病的患者发展慢性不愈伤口的风险增加。各种因素可能导致糖尿病患者易于发展慢性伤口，包括神经病变、血管病变以及引起血糖水平升高的潜在内分泌功能障碍。

如同磷酸化作用，胞内蛋白O-糖基化是调节胞内蛋白包括酶、转录因子、结构蛋白和细胞粘着蛋白的常见动态翻译后修饰。丝氨酸和苏氨酸的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)修饰由酶UDP-N-乙酰氨基葡萄糖多肽β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(O-GlcNAc转移酶，OGT)催化；而GlcNAc由O-GlcNAc-选择性N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶(GlcNAc酶，OGA)除去(在(2)有评论)。

高血糖，过量葡萄糖进入氨基葡萄糖途径，为OGT提供过量UDP-GlcNAc来修饰胞内蛋白(3)。过量葡萄糖被转化为氨基葡萄糖，其最终被转化为UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)，即用于胞内蛋白的OGT修饰的供体底物。因此，高血糖症与各种蛋白的O-糖基化增加有关(3-7)。高血糖状态包括糖尿病中观察到的胞内蛋白的GlcNAc修饰增加被认为有助于与糖尿病有关的一些病理。例如，(i)胰腺细胞具有高水平的OGT，且对细胞内O-GlcNAc修饰中的改变有敏感性，以及(ii)肌肉和脂肪组织中OGT的超表达引起转基因小鼠模型的糖尿病(8)。糖尿病组织包括人类糖尿病组织(9)和高血糖动物模型(4)中观察到胞内蛋白的GlcNAc修饰增加。用于细胞内O-糖基化在糖尿病中的病理作用的其它支持来自证明引起胞内蛋白O-糖基化增加的糖尿病和突变的遗传相关性的研究；导致编码OGA的基因提前终止的突变与对墨西哥裔美国人口成年发病II型糖尿病的遗传易感性相关(10)。OGA从胞内蛋白除去GlcNAc，且鉴别的OGA突变导致蛋白O-糖基化水平升高。

伤口愈合期间，伤口周边处的角质细胞必须降低对后边缘处的相邻细胞的粘附，以允许离开边缘并移动到伤口中(11)。来自组的之前数据证明增加的O-糖基化部分通过提高包括斑珠蛋白的细胞桥粒组分的翻译后稳定性来使细胞与细胞的粘附稳定(12)。

发明概述

简言之，本发明涉及用于靶向OGT和/或促进伤口愈合的化合物、组合物和方法。

在本发明的某些实施方案中，提供了分离的反义OGT多核苷酸，其中多核苷酸的长度为18-30个核苷酸，且进一步地，其中分离的反义OGT多核苷酸包含与OGTmRNA杂交的序列。在一些实施方案中，分离的多核苷酸可具有如SEQIDNO:3所示的序列或与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173所示的18-30核苷酸序列互补的序列。在一些实施方案中，分离的多核苷酸在中等至高严格性条件下与OGTmRNA杂交。

在一些实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含(i)反义OGT多核苷酸和(ii)药学上可接受的载体，其中所述多核苷酸的长度为18-30个核苷酸且具有与OGTmRNA杂交的序列。在一些实施方案中，反义OGT多核苷酸是第一伤口愈合剂和/或第一抗OGT剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含第二伤口愈合剂和/或第二抗OGT剂。

在一些实施方案中，药物组合物的多核苷酸在中等至高严格性条件下与OGTmRNA杂交。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是凝胶、藻酸盐、水凝胶或基于纤维素的载体，基于纤维素的载体选自羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素及其混合物。而且在某些实施方案中，药学上可接受的载体包含醇、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物、F-127和/或其混合物。

在一些实施方案中，分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173的编码区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。在一些实施方案中，分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸具有与SEQIDNO:173的调控区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。而且在某些实施方案中，分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸具有与SEQIDNO:173的内含子区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。

在一些实施方案中，分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸包含选自SEQIDNO:4-168中任一个的序列。

在一些实施方案中，分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸包含与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的18-30核苷酸序列互补的序列或与SEQIDNO:3的18-30连续核苷酸片段对应的序列，其中该序列包含选自SEQIDNO:4-168中任一个的序列。而且在一些实施方案中，分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸包含SEQIDNO:4-168中任一个的片段，还包含1-10个核苷酸残基，从而所述多核苷酸的序列对应于SEQIDNO:3的18-30连续核苷酸片段或对应于与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的18-30核苷酸序列互补的18-30核苷酸分子。

在一些实施方案中，药物组合物被配制成用于局部施用和/或局部注射。在某些实施方案中，在伤口敷料中配制该药物组合物。而且在一些实施方案中，在胶态凝胶敷料中配制该药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物被配制成用于缓释(sustainedrelease)，用于缓慢释放(slowrelease)，用于延长释放(extendedrelease)和/或用于控释(controlledrelease)。而且在一些实施方案中，该药物组合物是液体、霜剂、软膏、乳剂、洗剂、喷剂、药膏(salve)、泡沫剂和/或涂料(paint)。

在一些实施方案中，对有伤口的个体施用分离的多核苷酸和/或药物组合物的多核苷酸。在一些实施方案中，所述伤口未以期望的速度愈合。在某些实施方案中，个体的伤口延迟，难以愈合，和/或是慢性的，而且仍然在其它实施方案中，伤口的特征至少部分是OGT的表达增加。

在一些实施方案中，个体是糖尿病患者。在某些实施方案中，个体有(i)1型糖尿病，(ii)2型糖尿病，(iii)高于正常血糖水平和/或(iv)胰岛素抗性受体。在一些实施方案中，个体不是糖尿病患者。

在目前公开的主题的一些实施方案中，提供了抑制细胞中OGT的方法，其包括对细胞施用抗OGT剂，其中抗OGT剂选自(i)反义OGT多核苷酸，其中所述多核苷酸的长度为18-30个核苷酸且具有与OGTmRNA杂交的序列；(ii)抑制OGT表达的双链RNA分子；以及(iii)抑制OGT表达的短发夹RNA分子。在一些实施方案中，所述细胞包括胰岛素抗性受体，在某些实施方案中，细胞在个体中。

在目前公开的主题的某些实施方案中，提供了治疗有伤口的个体的方法，其包括对个体施用抗OGT剂，其中该抗OGT剂选自(i)反义OGT多核苷酸，其中所述多核苷酸的长度为18-30个核苷酸且具有与OGTmRNA杂交的序列；(ii)抑制OGT表达的双链RNA分子；以及(iii)抑制OGT表达的短发夹RNA分子。

在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸在中等至高严格性条件下与OGTmRNA杂交。在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸具有如SEQIDNO:3所示的序列，在某些实施方案中，所述18-30个核苷酸的序列对应于SEQIDNO:3的18-30连续核苷酸片段，以及在某些实施方案中，反义OGT多核苷酸包含选自SEQIDNO:4-168中任一个的序列。

在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。

在所公开方法的一些实施方案中，所述多核苷酸是反义OGT多核苷酸，且在某些实施方案中，所述多核苷酸是寡脱氧核苷酸。

在本发明方法的一些实施方案中，所述多核苷酸包含：(i)与SEQIDNO:173的调控区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列，(ii)与SEQIDNO:173的内含子区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列；和/或(iii)与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的18-30核苷酸序列互补的序列或对应于SEQIDNO:3的18-30连续核苷酸片段的序列，其中所述序列包含选自SEQIDNO:4-168中任一个的序列。

在所公开方法的一些实施方案中，所述多核苷酸的序列包含SEQIDNO:4-168中任一个的片段，还包含1-10个核苷酸残基，从而所述多核苷酸的序列对应于SEQIDNO:3的18-30连续核苷酸片段，或对应于与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的18-30核苷酸序列互补的18-30核苷酸分子。

在所公开方法的一些实施方案中，分离的双链RNA分子包括包含选自SEQIDNO:169-171中的序列且包括约11-27个核苷酸的第一链。在该方法的某些实施方案中,小发夹RNA包含SEQIDNO:172的序列。

在目前公开的主题的一些实施方案中，在药物组合物中提供抗OGT剂。而且在一些实施方案中，药物组合物还包含药学上可接受的载体，其中药学上可接受的载体包含例如凝胶、醇、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物、F-127、藻酸盐、水凝胶和/或基于纤维素的载体，基于纤维素的载体选自羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素及其混合物。

在本发明方法的一些实施方案中，药物组合物被配制成用于和/或通过局部施用、局部注射、伤口敷料和/或胶态凝胶敷料来给药。在所公开方法的某些实施方案中，药物组合物被配制用于缓释、缓慢释放、延长释放和/或控释，以及进一步地，该组合物的形式为液体、霜剂、软膏、乳剂、洗剂、喷剂、药膏、泡沫剂和/或涂料。

在所公开方法的一些实施方案中，药物组合物是局部地和/或通过局部注射给药。在某些实施方案中，施用所述药物组合物或药剂以治疗有伤口的个体，且在一些实施方案中，个体的伤口延迟，难以愈合，未以期望的速度愈合和/或是慢性的。在某些实施方案中，伤口的特征至少部分是OGT的表达增加。

在本发明方法的一些实施方案中，(i)个体是糖尿病患者，(ii)个体患有1型糖尿病，(iii)个体患有2型糖尿病，(iv)个体的血糖水平高于正常血糖水平，(v)个体有胰岛素抗性受体，和/或(vi)个体不是糖尿病患者。

在一些实施方案中，所公开方法还包括对细胞或对个体施用第二伤口愈合剂和/或第二抗OGT剂的步骤。

要理解的是，前面的概述和下面的详述都说明了本发明的实施方案中，且意在提供用于理解如所声明的发明的性质和特征的概述或构架。本说明书用来解释所声明主题的原理和操作，并阐述使用本发明原理的示例性实施方案。一旦阅读下面的公开内容并考虑附图，本发明的其它和进一步的特征和优点对于本领域技术人员会是十分显而易见的。

附图说明

图1.高血糖增加O-GlcNAc糖基化并阻碍人类角质细胞的伤口愈合。在用补充葡萄糖到指示的最终浓度的培养基中培养HaCaT细胞。通过SDS-PAGE和免疫印迹法，使用识别O-GlcNAc修饰的RL2抗体并使用GAPDH作为负载对照分析细胞裂解物(图1)。相对于GAPDH负载对照将RL2信号定量(图1B)。在有指示的葡萄糖浓度的DMEM中孵育人角质细胞单层。用移液管吸头对细胞进行划痕，并于0h(小时)和16h时拍摄显微照片(图1C)。然后使用图像分析软件测量伤口大小。所有条件的N＝11(图1D)。误差线反映均值标准误差。*表示与正常葡萄糖水平(5.5mM)相比P值<0.07，**表示与正常葡萄糖水平(5.5mM)相比P值<0.0005。25mM和100mM之间的P值<0.01。

图2.O-GlcNAc途径中的RNA干扰(RNAi)影响人角质细胞中的伤口愈合速度。此外，使用shRNA进行的OCT抑制(knockdown)使伤口愈合加速。用靶向OGT、OGA和GFP(对照)的shRNA稳定转导HaCaT细胞，并使之生长至融合。然后通过探测O-GlcNAc修饰(RL2)、OGT蛋白和肌动蛋白(负载对照)的免疫印迹法分析细胞裂解物(图2A)。相较于肌动蛋白信号，将RL2反应性量化(图2B)。转导细胞在有25mM葡萄糖的生长培养基中生长至融合，并划痕以引入伤口。图2C中示出在0h和12h处获得的代表性显微照片，而图2D中示出对裸露伤口区域的定量。在划痕伤口分析中，对于未处理细胞，N＝18；对于shGFP，N＝10；对于shOGT，N＝8；以及对于shOGA，N＝14。误差线反映均值的标准误差(SEM)。星号(*)表示p值<0.05的结果。

图3.特定OGT抑制使人角质细胞伤口愈合加速。用100nM抗OGT的siRNA或乱序对照siRNA(scrambledcontrolsiRNA)转染HaCaT细胞。对融合培养物的细胞裂解物进行探测RL2、抗OGT和抗GAPDH反应性的免疫印迹(图3A)和定量(图3B)。用siRNA转染60小时后，将融合细胞划痕，并获得在0h、16h和26h处的显微照片(图3C)。使用图像分析软件对裸露伤口区域进行定量(图3D)。对于未转染细胞，N＝7；对于对照siRNA，N＝7；以及对于OGTsiRNA，N＝6。误差线反映标准误差。星号表示相较于对照，p值<0.05。

图4.OGT转染的角质细胞中细胞与细胞的粘附提高。图4A显示分散酶分析的结果，其中用分散酶处理后,对照(Con)和OGT(OGT)转染的角质细胞的融合单层培养物飘离板,并通过来回摇晃培养物10次受到剪切力作用。由OGT细胞生成较少片段,这表示相较于对照显示出较大的细胞与细胞粘附。图4B和图4C显示对照和超表达OGT的角质细胞的电子显微照片,其中图4B提供俯视图且图4C提供正交视图,各图都示出与对照角质细胞相比，超表达OGT的角质细胞的细胞膜更紧密地关联。

图5.与对照小鼠相比，在糖尿病小鼠的皮肤中观察到胞内蛋白的O-糖基化增加。图5显示使用GlcNAc特异性单克隆抗体RL2的免疫印迹分析，其表明与野生型对照相比，在糖尿病小鼠的表皮提取物中GlcNAc修饰增加。星号表示对照中未观察到而糖尿病皮肤中检测到的蛋白质的额外GlcNAc修饰。箭头绘出相对于对照在糖尿病皮肤中未改变的蛋白的GlcNAc修饰并用作负载对照(+，阳极；-，阴极)。

图6.胞内O-糖基化增加使伤口愈合延迟。通过划痕使对照(Con)和OGT(OGT)转染的角质细胞的融合单层培养物受到损伤，并确定伤口闭合的时间。如图6中所示，对照角质细胞用16小时愈合伤口；而OGT超表达的角质细胞在16小时时未能闭合伤口。

图7.使用OGT特异性shRNA抑制OGT活性促进角质细胞伤口愈合和在单层划痕试验中逆转葡萄糖对伤口愈合的剂量依赖型抑制。用浓度递增的葡萄糖处理人HaCat对照(较暗色柱)和使用OGT特异性shRNA(hOGT，浅色条)抑制OGT的HaCat角质细胞的融合培养物，通过划痕使之受到损伤，以及在受损伤19小时后测量愈合伤口的大小(每组n＝12)，如图7A中所示。如图7A中的划痕试验，对于非转导对照HaCat角质细胞和GFP特异性shRNA(shGFP)转导对照，与shOGT转导的HaCat角质细胞相比(每组n＝12)，在图7B中示出数据。

图8.OGT的shRNA抑制减少角质细胞胞内蛋白O-糖基化；而OGA抑制增加蛋白O-糖基化。使用靶向GFP(对照)、OGT和OGA的shRNA稳定转染的HaCaT细胞生长至融合。然后用抗(i)O-GlcNAc修饰(RL2)、(ii)OGT蛋白和(iii)GAPDH(负载对照)的抗体通过免疫印迹分析细胞裂解物，如图8A和图8B中所示。如所示的，OGT的基因抑制减少O-GlcNAc蛋白修饰；而OGA的基因抑制增加O-GlcNAc蛋白修饰。

图9.当局部施用于伤口时，OGT反义寡脱氧核苷酸使测试小鼠皮肤中的OGT蛋白水平和O-GlcNAC修饰下调。在受损伤后t＝0和t＝24小时时,将50μlF-127凝胶中的10nMOGT反义寡脱氧核苷酸局部施用于WT小鼠的全层皮肤伤口。在受损伤后48小时时,收集用OGT反义ODN或溶媒对照(vehiclecontrol)处理的小鼠的损伤周围皮肤。通过SDSPAGE分离皮肤提取物,并用抗O-GlcNAc修饰(RL2)、OGT蛋白或GAPDH(用作负载对照)的抗体,通过免疫印迹来探测，如图9中所示。

发明详述

本文中列出了目前公开的主题的一个或多个实施方案的详细信息。研究本文中提供的信息后，本文中描述的实施方案的修改和其它实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提供的信息，特别是所描述的示例性实施方案的具体详细信息主要提供用于清楚理解，而不会由其理解为是限制性的。如有冲突，以本申请的说明书包括定义为准。

通过解释本发明的方式提供各实施例，且对其没有限制性。事实上，对本领域技术人员来说在不偏离本发明的范围的情况下，对本发明的教导可以进行各种修改和变化是显而易见的。例如，作为一个实施方案的一部分而说明或描述的特征可以与另一个实施方案一起使用以得到又一实施方案。

除非所涉及上下文中另有说明或明确相反的暗示，所有涉及的本发明单数特征或限制应包括相应的复数特征或限制，反之亦然。

除非所涉及组合的上下文中另有说明或明确相反的暗示，本文中所用的方法或过程步骤的所有组合可以以任何顺序进行。

本发明的方法和组合，包括其组件，可以包含，由或主要由基本元素和本文描述的实施方案限制以及本文描述的任何其它或可选的组件或限制或其它有用的限制组成。

目前公开的主题包括有利于抑制细胞中的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖多肽β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和/或有利于伤口愈合的化合物、组合物和方法。

在一些实施方案中，目前公开的主题包括具有与OGTmRNA杂交的序列的分离的反义OGT多核苷酸。

术语“分离的”，当用在分离的多核苷酸的上下文中时，是除了其天然环境外通过人工存在的多核苷酸，因此不是天然产物。

术语“核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸”和“核酸序列”指的是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物。

反义多核苷酸和其它抗OGT多核苷酸如siRNA和shRNA的合成，对本领域技术人员来说是己知的。参见例如SteinC.A.andKriegA.M.(eds),AppliedAntisenseOligonucleotideTechnology(应用的寡核苷酸技术),1998(Wiley-Liss)。反义多核苷酸可抑制OGT的转录和/或翻译。在一些实施方案中，多核苷酸是由OGT基因或mRNA进行转录和/或翻译的特异性抑制剂，且不会抑制由其它基因或mRNA进行的转录和/或翻译。产物可与OGT基因或mRNA结合，(i)5'与编码序列结合和/或(ii)与编码序列结合，和/或(iii)3'与编码序列结合。

反义多核苷酸一般与OGTmRNA反义(例如，与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的序列互补)。这种多核苷酸能与OGTmRNA杂交，并因此通过干扰包括转录、mRNA加工、mRNA从细胞核的运输、翻译或mRNA降解在内的OGTmRNA新陈代谢的一个或多个方面抑制OGT的表达。通常，反义多核苷酸与OGTmRNA杂交，形成可引起对mRNA的翻译和/或不稳定的直接抑制的双链体(duplex)。这种双链体可能易于被核酸酶降解。

术语“互补”指的是两条包含反平行核苷酸序列的核苷酸序列，一旦所述反平行核苷酸序列中的互补碱基残基之间形成氢键，则所述反平行核苷酸序列能互相配对。如本领域中所己知的，两条互补链的核酸序列，当从5’至3’方向看各链时，是互相反向互补。如本领域中所己知的，在给定的一组条件下互相杂交的两条序列不一定会100％完全互补。

所述反义多核苷酸可与所有或部分OGTmRNA杂交。通常，所述反义多核苷酸与OGTmRNA的核糖体结合区或编码区杂交。所述多核苷酸可与OGTmRNA的全部或一个区域互补。例如，所述多核苷酸可以是OGTmRNA的全部或一部分的准确互补物。然而，不需要绝对互补，且有足够的互补性以在生理状况下形成解链温度大于约20℃、30℃或40℃的双链体的多核苷酸特别适用于本发明。

因此，所述多核苷酸通常是与mRNA互补的序列的同源物。所述多核苷酸可以是在中等至高严格性条件下如约50℃至约60℃时0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠的条件下与OGTmRNA杂交的多核苷酸。在一些实施方案中，短语“中等至高严格性”指约0.0165和约0.033M氯化钠之间；在一些实施方案中，“中等至高严格性”指约0.0165和约0.033M柠檬酸钠之间；在一些实施方案中“中等至高严格性”指低于解链温度(Tm)约5℃至约30℃的温度，其中50％杂交在Tm下发生。

在一些实施方案中，适合的多核苷酸的长度为约6-40个核苷酸。在一些实施方案中，适合的多核苷酸的长度为约18-30个核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸的长度可以为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸是寡脱氧核苷酸。

在一些实施方案中，所述多核苷酸可以具有SEQIDNO:3中示出的序列或与SEQIDNO:1中示出的序列互补的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸在中等至高严格性条件下与OGTmRNA杂交。

在一些实施方案中，所述多核苷酸可以具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173的编码区中示出的核苷酸序列互补的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸可以具有与SEQIDNO:173的调控区中示出的核苷酸序列互补的序列。在一些实施方案中，多核苷酸可以具有与SEQIDNO:173的内含子区中示出的核苷酸序列互补的序列。

在一些实施方案中，所述多核苷酸可以包括选自SEQIDNO:4-168中任一个的序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸具有选自SEQIDNO:4-168中任一个的序列。

目前公开的主题还包括药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包括抗OGT剂和药学上可接受的载体。如本文中使用的，抗OGT剂指的是OGT抑制剂和多核苷酸如siRNA、shRNA、反义多核苷酸如寡脱氧核苷酸和本文公开的所有这类特异性多核苷酸，包括具有SEQIDNO:4-172中任一个的序列的多核苷酸。

在一些实施方案中，所述药物组合物包括具有SEQIDNO:4-172中任一个的序列的多核苷酸和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述药物组合物包括具有与OGTmRNA杂交的序列的多核苷酸和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物包括具有SEQIDNO:3中示出的序列或与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的序列互补的序列的多核苷酸和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物包括本文描述的多核苷酸和药学上可接受的载体。

本文所用术语“药学上可接受的载体”指无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液以及用于在使用前重配为无菌注射液或分散液的无菌粉末。适合的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或溶媒(vehicle)的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其适合的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯如油酸乙酯。通过以下方式可以维持适当的流动性，例如通过使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散液的情况下保持所需粒径，以及通过使用表面活性剂。这些组合物也可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗菌和抗真菌剂如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来保证对微生物作用的预防。可能还希望包括等渗剂如糖、氯化钠等。可以通过包含延迟吸收的药剂如单硬脂酸铝和明胶来实现可注射药物形式的延长吸收。通过在生物可降解聚合物如聚交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中形成药物微胶囊基质制得注射长效形式。根据药物与聚合物的比例和所使用特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。长效注射制剂也可以通过将药物包封在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。可以通过用细菌截留过滤器过滤或通过加入仅在使用前可以溶解或分散在无菌水或其它无菌注射介质中的无菌固体组合物形式的灭菌剂，将注射制剂灭菌。适合的惰性载体可以包括糖如乳糖。理想的是，至少95wt％的活性成分颗粒的有效粒径范围为0.01-10微米。

在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括凝胶、藻酸盐、水凝胶、醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括F-127。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包括基于纤维素的载体例如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和其混合物。在一些实施方案中，所述组合物是液体、霜剂、软膏、乳剂、洗剂、喷剂、药膏、泡沫剂或涂料。

目前公开的主题的组合物可以被配制用于各种所需的给药形式。在一些实施方案中，所述组合物被配制成用于局部施用。在一些实施方案中，所述组合物被配制成用于局部注射。在一些实施方案中，所述组合物被配制在伤口敷料中。在一些实施方案中，所述组合物被配制在胶态凝胶敷料中。在一些实施方案中，所述组合物被配制成用于缓释。在一些实施方案中，所述组合物被配制成用于缓慢释放、延长释放或控释。

术语“伤口敷料”指的是局部施用于伤口的敷料，且排除了适用于全身给药的组合物。例如，一种或多种抗OGT多核苷酸(如OGT反义多核苷酸)可以分散在伤口接触材料如纺织或非纺织物材料的实心片中或之上，或可以分散在泡沫如聚氨酯泡沫层中或水凝胶如聚氨酯水凝胶、聚丙烯酸酯水凝胶、明胶、羧甲基纤维素、果胶、藻酸盐和/或透明质酸水凝胶中，例如在凝胶或软膏中。在某些实施方案中，一种或多种抗OGT多核苷酸分散在使活性成分缓释入伤口中的生物可降解片材中或之上，例如冻干胶原片材、冻干胶原/藻酸盐混合物(可从Johnson&JohnsonMedicalLimited获得，注册商标为FIBRACOL)或冻干胶原/氧化再生纤维素(可从Johnson&JohnsonMedicalLimited获得，注册商标为PROMOGRAN)。

本文中使用的“伤口促进基质”包括例如合成的或天然存在的基质如胶原、非细胞基质、交联生物支架分子、基于组织的生物工程结构框架、生物制造的生物假体，和其它植入结构例如适合有利于促进伤口愈合的细胞浸润和增殖的血管移植物。其它适合的生物基质材料可包括化学修饰的胶原组织以降低抗原性和免疫原性。其它适合的实例包括用于伤口敷料的胶原片材、无抗原或抗原减少的非细胞基质(WilsonGJetal.(1990)TransAmSocArtifIntern36:340-343)或己被改造为降低对异种移植物材料的抗原应答的其它生物基质。有利于促进伤口愈合的其它基质可包括例如包含不溶胶原和弹性蛋白的己处理牛心包蛋白(CourtmanDWetal.(1994)JBiomedMaterRes28:655-666)和可用于为宿主细胞迁移提供天然微环境以加速组织再生的其它非细胞组织(MaloneJMetal.(1984)JVaseSurg1:181-91)。本发明预期包含本文描述的一种或多种抗OGT多肽的合成或天然基质，包括抗OGT多肽。优选OGT反义寡脱氧核苷酸。

目前公开主题的分离的多核苷酸有利于抑制细胞中的OGT和/或治疗个体中的伤口。在一些实施方案中，伤口未以期望的速率愈合。在一些实施方案中，伤口被延迟、难以愈合或是慢性的。在一些实施方案中，伤口的特征至少部分是OGT表达增加或OGT活性增加。

本文中使用的术语“伤口”包括对任何组织的损伤，包括例如延迟的或难以愈合的伤口或慢性伤口。伤口实例可包括开放性或闭合性伤口。术语“伤口”也可包括例如以不同方式对皮肤和皮下组织造成的(例如长期卧床造成的压疮和创伤引起的伤口)具有不同特征的损伤。根据伤口深度，伤口可被分类为四种级别中的一种：i)I级伤口，局限在上皮中；ii)II级伤口，延伸至真皮；iii)III级伤口，延伸至皮下组织；和iv)IV级(或全皮层伤口)伤口，暴露骨头(例如，骨压点如大转子或骶骨)。

术语“部分层伤口”指的是包含I-III级的伤口。部分层伤口的实例包括压褥疮、静脉瘀滞性溃疡和糖尿病溃疡。本发明预期治疗未以期望的速率愈合的所有类型伤口，包括延迟的愈合伤口、不完全愈合伤口和慢性伤口。

“未以所述/一个预期速率愈合的伤口”指的是对任何组织的损伤，包括延迟的或难以愈合的伤口(包括延迟的或不完全愈合的伤口)和慢性伤口。未以预期速率愈合的伤口的实例包括溃疡，如糖尿病溃疡、糖尿病足部溃疡、血管炎溃疡、动脉性溃疡、静脉性溃疡、静脉瘀滞性溃疡、压迫溃疡、褥疮性溃疡、感染性溃疡、创伤引起的溃疡、烧伤性溃疡、与坏疽性脓皮相关的溃疡和混合性溃疡。未以预期速率愈合的其它伤口包括裂开伤口。

如本文中使用的，延迟的或难以愈合的伤口可包括例如特征至少部分为以下的伤口：1)长期炎性阶段，2)缓慢形成细胞外基质和/或3)上皮形成或闭合速率降低。

术语“慢性伤口”一般指的是还未愈合的伤口。例如，在三个月内未愈合的伤口被认为是慢性的。慢性伤口包括静脉性溃疡、静脉瘀滞性溃疡、动脉性溃疡、压力溃疡、糖尿病溃疡，糖尿病足部溃疡、血管炎溃疡、褥疮性溃疡、烧伤性溃疡，创伤引起的溃疡、感染性溃疡、混合性溃疡，以及坏疽性脓皮病。慢性伤口可以是包含由完全或部分动脉阻断引起的溃疡形成的动脉性溃疡。慢性伤口可以是包含由静脉瓣功能不全和相关的血管疾病引起的溃疡形成的静脉性或静脉瘀滞性溃疡。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于下述压力溃疡形成的AHCPR阶段中的一种或多种：第1阶段、第2阶段、第3阶段和/或第4阶段。

如本文中使用的，慢性伤口可指的是，例如特征至少部分在于以下中的一种或多种：(i)伤口炎症的慢性自保持状态，(ii)不良的或有缺陷的伤口细胞外基质，(iii)不良应答(衰老的)伤口细胞，特别是成纤维细胞，从而限制细胞外基质产生，和/或(iv)部分由于缺少必要的细胞外基质排列(orchestration)和缺少用于迁移的支架导致的表皮再生失败。慢性伤口的特征还可以在于1)引起溃疡性病变包括例如糖尿病、压力(褥疮)、静脉和动脉性溃疡的长期炎症和蛋白水解活性；2)受影响区域中基质的进行性沉积；3)修复时间较长；4)伤口收缩较小；5)表皮再生较慢；和6)肉芽组织厚度增加。

示例性慢性伤口可包括“压力溃疡”。基于AHCPR(AgencyforHealthCarePolicyandResearch(卫生保健政策和研究机构),U.S.DepartmentofHealthandHumanServices(美国卫生和人类服务部))指南，示例性压力溃疡可被分为4个阶段。第1阶段压力溃疡是完好皮肤上可观察到的与压力有关的改变，与身体上相邻或相对区域相比，其指标可包括以下中一种或多种的变化：皮肤温度(温暖或凉爽)、组织一致性(坚硬或松软感)和/或感觉(疼痛、瘙痒)。溃疡在浅肤色皮肤中表现为持续发红的限定区，而在深色皮肤肤色中，溃疡可能出现，伴随持续红色、蓝色或紫色。第1阶段溃疡可包括完好皮肤非苍白性红斑和皮肤溃疡的前驱病变。在皮肤较深色的个体中，皮肤变色、温暖、水肿，硬结或硬度也可能是第1阶段溃疡的指标。第2阶段溃疡的特征在于涉及表皮、真皮或两者的部分层皮肤损失。溃疡是表层的且在临床上表现为擦伤、水泡或浅坑。第3阶段溃疡的特征在于全层皮肤损失，包括可向下延伸至但未穿过基本筋膜的皮下组织的损伤或坏死。溃疡在临床上表现为存在或不存在相邻组织被破坏的深坑。第4阶段溃疡的特征可在于具有广泛破坏、组织坏死或对肌肉、骨或支撑结构(例如，肌腱、关节囊)损害的全层皮肤损失。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于压力溃疡的以下AHCPR阶段中的一种或多种：第1阶段、第2阶段、第3阶段和/或第4阶段。

示例性慢性伤口也可包括“褥疮性溃疡”。示例性褥疮性溃疡可由对引起局部缺血的骨性隆起的长期和未缓解压力引起。该伤口倾向于发生在自己不能变换位置以卸下重量的患者，如瘫痪的、无意识的或严重虚弱的人。如美国卫生和人类服务部(U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)所定义的，主要预防措施包括识别高危患者、经常评估和防范措施如定期改变位置、适合的减压寝具、防潮层和适当的营养状况。治疗选择可包括例如，减压、手术和酶促清创、潮湿伤口护理和细菌负荷控制。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于由对引起局部缺血的骨性隆起长期和未缓解压力引起的褥疮性溃疡或溃疡形成。

慢性伤口也可包括“动脉性溃疡”。慢性动脉性溃疡一般被理解为是伴随动脉硬化和高血压心血管疾病的溃疡。其疼痛，边缘尖锐(sharplymarginated)，且常常在侧下肢和脚趾上发现。动脉性溃疡的特征可以是可能引起组织坏死和/或溃疡的完全或部分动脉阻塞。动脉性溃疡的病征可包括例如肢体无脉、痛性溃疡、常常很局限的小点状溃疡、凉性或冰冷皮肤、毛细血管返回时间延迟(暂时推进脚趾末端和释放，正常颜色应在约3秒或更短时间内返回到脚趾)、萎缩外观皮肤(例如发亮、薄的、干的)以及手指和脚毛发的损失。在某些实施方案中，提供了一种治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于由完全或部分动脉阻塞引起的动脉性溃疡或溃疡形成。

示例性慢性伤口可包括“静脉性溃疡”。示例性静脉性溃疡是影响下肢的最常见溃疡类型，其特征可以是静脉瓣功能障碍。正常静脉具有防止血液回流的瓣膜。当这些瓣膜变得不完整时，静脉血回流引起静脉充血。来自红细胞的血红蛋白逃逸并渗漏进血管外空间中，引起通常注意到的棕色变色(brownishdiscoloration)。己经证明静脉性溃疡周围的皮肤经皮氧分压降低，表明有阻碍区域正常血管分布的力。淋巴引流和回流也在这些溃疡中起作用。静脉性溃疡可出现在内踝附近，并常与水肿和硬化性下肢一起发生；其可能是浅的，不太痛且可能会出现由受影响部位排出的渗液。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于由于静脉瓣功能障碍和相关的血管疾病而引起的静脉性溃疡或溃疡形成。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于由于完全或部分动脉阻塞引起的动脉性溃疡或溃疡形成。

示例性慢性伤口可包括“静脉瘀滞性溃疡”。瘀滞性溃疡是与静脉功能不全有关的病变，且更常出现在内踝上，常常具有压痕性水肿、静脉曲张、斑状色素沉着、红斑和无法触诊的瘀点及紫癜。瘀滞性皮炎和溃疡一般是瘙痒的而不是疼痛的。示例性静脉瘀滞性溃疡的特征可在于下肢慢性被动性静脉充血导致局部缺氧。这些伤口的一种可能发病机理包括阻碍氧穿过厚血管周围纤维蛋白袖扩散进组织。另一种机理是渗漏进血管周围组织的大分子捕获维持皮肤完整性所需的生长因子。另外，由于静脉充血大白细胞的流动减慢，阻塞毛细血管，变为激活的并损害血管内皮，从而易于形成溃疡。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于由于静脉瓣功能障碍和相关的血管疾病引起的静脉性溃疡或溃疡形成。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于由下肢慢性被动静脉充血和/或所引起的局部充血而引起的静脉瘀滞性溃疡或溃疡形成。

示例性慢性伤口可以包括“糖尿病溃疡”。糖尿病患者易患溃疡，包括由神经和血管并发症引起的足部溃疡。周围神经病变可引起足部和/或腿部的感觉改变或完全丧失。患有晚期神经病变的糖尿病患者减弱所有敏捷-迟钝辨别的能力。患有神经病变的患者对足部的任何创口或创伤可能会完全忽视数天或数周。并不少见的是，当事实上溃疡已存在相当长的一段时间时，患有神经病变的患者才注意到溃疡“刚刚出现”。对于神经病变患者，已表明严格的血糖控制可以减慢该疾病的进展。由于感觉降低，夏尔科(Charcot)足部畸形也可能会发生。在其足部中具有“正常”感觉的人具有自动感觉何时太大的压力正施加于足部区域的能力。一旦确定，我们的身体本能地移动位置以释放该应力。患有晚期神经病变的患者会减弱感觉持续的压力损害的这种能力，因而,可以发生组织缺血和坏死,导致例如足底溃疡。另外，在足骨中的微小骨折，如果未注意且未治疗,可能导致外形损伤、慢性肿胀以及另外的骨隆起。微血管疾病是糖尿病患者的重大并发症之一，其还可以导致溃疡形成。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于由糖尿病的神经和血管并发症引起的糖尿病性足溃疡和/或溃疡形成。

示例性慢性伤口可以包括“创伤性溃疡”。创伤性溃疡的形成可以由于对身体的创伤性损伤而导致发生。这些损伤包括例如，对动脉、静脉或淋巴系统的损害；对骨骼骨结构的改变；组织层—表皮、真皮、皮下软组织、肌肉或骨的损失；对身体部位或器官的损害以及身体部位或器官的损失。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于与身体的创伤性损伤有关的溃疡形成。

示例性的慢性伤口可以包括“烧伤性溃疡”，其包括I度烧伤(即皮肤的表面变红区域)；II度烧伤(除去水泡液以后可以自发治愈的起泡损伤部位)；III度烧伤(贯穿整个皮肤的烧伤并且通常需要外科干预用于伤口愈合)；烫伤(可因滚烫的热水、油脂或散热器液发生)；热烧伤(可因火焰发生，通常是深度烧伤)；化学烧伤(可由酸和碱引起，通常是深度烧伤)；电烧伤(房屋周围的低电压或工作中的高压)；爆炸焰烧伤(通常是表面损伤)；以及接触烧伤(通常是深度烧伤并且可由于消声器尾管、热熨斗和炉灶发生)。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于与身体的烧伤性损伤有关的溃疡形成。

示例性慢性伤口可以包括“血管炎溃疡”。血管炎溃疡还发生在下肢上并且是疼痛的边缘尖锐的病变，其可以具有有关的可触诊紫癜和出血性水泡。胶原疾病、败血症以及各种造血系统疾病(例如，血小板减少症、异常蛋白血症)可能是这种严重急性病症的原因。

示例性慢性伤口可以包括坏疽性脓皮病。坏疽性脓皮病以小腿的单个或多个非常痛的溃疡的形式存在。深红色至紫色的破坏边界包围化脓性中央缺损。活检不能揭示血管炎。在一半患者中，它与全身性疾病如溃疡性结肠炎、局限性回肠炎或白血病相关。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于与坏疽性脓皮病有关的溃疡形成。

示例性慢性伤口可以包括感染性溃疡。感染性溃疡在直接接种各种生物体后发生并且可能与明显区域性腺病相关。实例是分枝杆菌感染、炭疽病、白喉症、皮炎芽生菌病(blastomyosis)、孢子丝菌病、兔热病以及猫抓热。初期梅毒的生殖器溃疡通常无触痛，并具有干净坚实的基础。软下疳和腹股沟肉芽肿的那些生殖器溃疡倾向于是粗糙、肮脏和更加过度(extravagant)的病变。在某些实施方案中，提供了治疗慢性伤口的方法，其中慢性伤口的特征在于与感染有关的溃疡形成。

本文中使用的术语“裂开伤口”是指具有破裂或裂开的伤口，通常是手术伤口。在某些实施方案中，提供了治疗未以预期速率愈合的伤口的方法，其中伤口的特征在于裂开。

在一些实施方案中，目前公开的主题的组合物还可以包括一种或多种其它伤口愈合剂，例如美国专利号8,063,023和8,247,384以及美国专利申请号US1012/0289479中描述的那些药剂(各通过引用的方式并入本文中)，包括例如抗连接蛋白剂。

在一些实施方案中，目前公开的主题的组合物还可以包括一种或多种其它抗OGT剂。

本文所用的术语“个体”包括人类个体和动物个体。因此，目前公开的主题提供了兽医治疗用途。这样，目前公开的主题提供了对哺乳动物如人以及由于正濒临灭绝而重要的那些哺乳动物如东北虎、具有经济重要性的动物如农场饲养的用于人类消耗的动物和/或对人类有社会重要性的动物如作为宠物或在动物园饲养的动物的治疗。这类动物的实例包括但不限于：肉食动物如猫和狗；猪，包括家猪(pig)、生猪(hog)和野猪；反刍动物和/或有蹄类动物如牛(cattle)、公牛(oxen)、绵羊(sheep)、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼以及马。

在一些实施方案中，个体不是糖尿病人。在一些实施方案中，个体是糖尿病人。在一些实施方案中，个体患有I型糖尿病、2型糖尿病，具有比正常血糖水平高的血糖水平，和/或具有胰岛素抗性受体。

如本文中所指出的，目前公开的个体还包括抑制细胞中OGT的方法和治疗有伤口的个体的方法。

在一些实施方案中，抑制细胞中OGT的方法包括对细胞施用抗OGT剂。在一些实施方案中，细胞在个体中。在一些实施方案中，治疗有伤口的个体的方法包括对个体施用抗OGT剂。

在目前公开主题的方法的一些实施方案中，抗OGT剂选自：本文中描述的具有与OGTmRNA杂交的序列的反义OGT多核苷酸，本文中描述的抑制OGT表达的双链RNA分子，例如siRNA，以及本文中描述的抑制OGT表达的短发夹RNA分子。

在一些实施方案中，所述方法包括施用第二伤口愈合剂和/或第二抗OGT剂。在一些实施方案中，如本文中描述的，将抗OGT剂提供于组合物中，用于根据目前公开的主题的方法给药。

在某些情况下，本文中公开的核苷酸和多肽包含在公众可用的数据库如和SWISSPROT中。通过引用明确并入包括序列在内的信息以及与包括在这种公众可用的数据库中的这类核苷酸和多肽有关的其它信息。除非另有说明或显而易见，引用这种公众可用的数据库就是引用截至本申请申请日时数据库的最新版本。

虽然本文中使用的术语被认为是本领域技术人员所熟知的，但为了便于说明目前公开的主题，本文列出了定义。

除非另有定义，本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与目前公开的主题所属领域的技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文中描述的类似或等同的任何方法、装置和材料可用在目前公开主题的实践或测试中，现描述了代表的方法、装置和材料。

根据长期存在的专利法公约，在本申请包括权利要求书中使用的术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述/该(the)”指的是“一个/种或多个/种”。因此,例如提及“一个细胞”包括多个这类细胞等。

除非另有说明，本说明书和权利要求书中使用的表达成分的量的所有数字、性质如反应条件等应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。相应地，除非另有相反说明，本说明书和权利要求书中列出的数字参数是可以随通过目前公开主题获得的要保护的期望性质而变化的近似值。

当涉及值或涉及质量、重量、体积、浓度或百分数的量时，本文所用的术语“约”指的是包括与特定量有以下的变化，在一些实施方案中±20％、在一些实施方案中±10％、在一些实施方案中±5％、在一些实施方案中±1％、在一些实施方案中±0.5％，以及在一些实施方案中±0.1％，因为这种变化适于进行所公开的方法。

如本文中使用的，范围可以表达成从“约”一个具体值和/或至“约”另一具体值。还应理解的是，本文公开了大量值，且各值除其本身外，本文还公开了“约”该具体值。例如，如果公开了值“10”，那么也公开了“约10”。还应理解的是，也公开了两个具体单位之间的各单位。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。

通过以下具体但非限制性的实施例进一步说明目前公开的主题。以下实施例包括某些显而易见的预言例。以下实施例可包括代表在与本发明相关的研发和实验过程中的不同时间收集的数据的数据汇编。

实施例

实施例1

为了探讨糖尿病皮肤中细胞蛋白O-GlcNAc修饰增加是否有助于患有慢性糖尿病皮肤溃疡的患者中观察到的伤口愈合延迟，进行了本研究。本发明人通过在提高的葡萄糖中培养人角质细胞对高血糖症建模。在高血糖条件下，本发明人观察到(i)角质细胞蛋白的O-GlcNAc修饰水平提高，且重要的是(ii)伤口闭合延迟。通过负责将GlcNAc部分增加到蛋白的基因OGT的shRNA和siRNA抑制，逆转高血糖症诱导的伤口闭合延迟。这些观察结果表明靶向OGT有利于治疗非愈合性糖尿病伤口。

非愈合性伤口是发病的重要源由。对于倾向于发展慢性皮肤伤口的糖尿病患者尤其如此。丝氨酸和苏氨酸残基的O-糖基化是与蛋白磷酸化类似的常见的翻译后调控修饰；在糖尿病和高血糖状态中已观察到胞内蛋白O-糖基化增加。两种胞内酶即UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-多肽β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和O-GlcNAc-选择性N-乙酰基-β-D-葡糖胺糖苷酶(OGA)分别介导来自胞内蛋白底物的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的添加和除去。胞内蛋白O-GlcNAc修饰的改变与糖尿病有关联，且糖尿病组织中观察到的蛋白O-糖基化水平的提高可部分解释有助于伤口愈合延迟的一些所观察到的潜在病理机理。本发明人之前己证明，通过在鼠角质细胞中超表达OGT增加蛋白O-糖基化，导致蛋白O-糖基化和高粘性表型增加。为了探讨糖尿病皮肤中细胞蛋白O-GlcNAc修饰的增加是否有助于患有慢性糖尿病皮肤溃疡的患者中观察到的伤口愈合延迟，进行了本研究。在本研究中，本发明人证明，在升高的高血糖条件下培养的人角质细胞显示出O-GlcNAc修饰水平提高以及体外伤口闭合速率延迟。本发明人还证明，通过RNA干扰(RNAi)进行的OGT特异性抑制显著逆转了该作用，从而为糖尿病患者的伤口愈合延迟的OGT靶向治疗干预提供了机会。

实验程序

材料.细胞培养基从加洲(CA)卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen)获得。shRNA质粒从OpenBiosystems(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific),沃尔瑟姆(Waltham),MA)购买，并在北卡罗来纳州大学教堂山分校慢-shRNA核心设施处被包装为失活慢病毒粒子。发夹中成熟有义链的序列是：shOGT(TRCN0000035064；SEQIDNO.72):5’-GCCCTAAGTTTGAGTCCAAAT-3’和shOGA(TRCN0000134040):5’-CCAGAAACTTTCCTTGCTAAT-3’。TRC慢病毒eGFPshRNA用作用于转导的阳性对照(OpenBiosystems公司目录号RHS4459)。小鼠单克隆O-GlcNAc特异性抗体(克隆RL2)来自ThermoScientific公司(Waltham,MA)。抗GAPDH的兔单克隆抗体来自CellSignaling(Danvers,MA)。抗β-肌动蛋白的小鼠单克隆抗体来自。OGT特异性抗体来自Sigma(St.Louis,MO)。兔多克隆OGT抗体来自Abcam(Cambridge,MA)。小鼠和兔抗羊辣根过氧化物酶缀合的第二抗体来自GEHealthcare(Pittsburgh,PA)。对照siRNA(有义链：GCAGUUAUAAUGACUAGAU)和具有3’UU突出端(overhangs)的OGTsiRNA(有义链：GCACAAUCCUGAUAAAUUU)从Sigma-Aldrich购买。

细胞培养和划痕伤害.在正常或高葡萄糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium，(DMEM)(分别5.5mM或25mM葡萄糖)(13)、1％胎牛血清(FBS)、1000单位盘尼西林/mL、100μg链霉素/mL中培养未转染的和shRNA转染的HaCaT细胞。培养基补充有附图说明中指定的各种量的葡萄糖或抑制剂。使用每mL培养基1μg嘌呤霉素选择shRNA转染的细胞。划痕前6小时更换含嘌呤霉素的培养基。进行划痕试验前使细胞生长60小时(直至融合)。通过在24孔板中融合细胞的单层上实施线性划痕而实施划痕伤口，接着用1×PBS洗涤一次并加入新培养基。划痕后立即使用10×放大倍数在NikonTE2000-U转盘式显微镜上拍摄照片，并在拍摄另一组照片之前于37℃下培养附图说明中说明的时间量。接着使用Tscratch软件包分析伤口(14)。仅评价和比较相同初始伤口大小的伤口。

统计分析.误差线反映均值标准误差(SEM)。按具有如Tscratch软件手册中描述的不等方差的双侧检验进行斯氏T检验。

用shRNA稳定转导角质细胞.在DMEM，10％FBS中培养HaCaT细胞至50-60％融合，并利用两个感染复数(MOI)，用10μg/mL聚凝胺和shRNA(shGFP、shOGT或shOGA)孵育5小时，之后将培养基换成新鲜DMEM。次日，将含1μg/mL嘌呤霉素的培养基加入细胞中，以选择成功转导的细胞。在细胞培养物用于实验之前，使其在嘌呤霉素选择下传代6-8次。

免疫印迹信号的定量。等同负载样品，并通过之前描述的SDS-PAGE分离。根据所建实验方案进行免疫印迹，并通过增强的化学发光(ECL)反应(AmershamBiosciences公司)显色。使用GeneSnap软件(SynGENE,Frederick,MD)对来自免疫印迹的蛋白质带定量。对于RL2染色，使用GeneSnap软件分析三个最突出的带。

角质细胞的siRNA转染.用3’-UU突出端合成对抗OGT的siRNA(3’-GCACAAUCCUGAUAAAUUU-5’)和乱序对照siRNA(3’-GCAGUUAUAAUGACUAGAU-5’)，并在水(工作原液，workingstock)中稀释为20mM，以及根据实验方案使用脂质体(Oligofectamine)(Invitrogen公司)转染有40％融合的角质细胞的24孔板中的各孔。简言之，在12μLOpti-MEMI(Invitrogen公司)中稀释3μL脂质体(Invitrogen公司)，并培养8min(分钟)。同时，将3μLsiRNA与50μLOpti-MEMI混合，并加入到脂质体稀释液中，静置20min以形成复合物。然后将32μLOpti-MEM加入到混合物中，并加入(在500μL高葡萄糖DMEM中的)细胞中。48小时后，将培养基换为高葡萄糖DMEM，并在60小时时，将细胞用于划痕试验。在附图说明中描述的时间点拍摄照片。

结果

高血糖条件导致人角质细胞中的O-GlcNAc水平提高。为了研究糖尿病皮肤中O-GlcNAc修饰水平提高是否与组织中的高葡萄糖水平有关，通过在生长培养基中补充不同量的葡萄糖，并使人角质细胞(HaCaT)生长48小时，在细胞培养物中模拟这些条件(图1)。细胞裂解物的免疫印迹表明，葡萄糖水平提高确实引起角质细胞裂解物中更多的O-GlcNAc修饰，如由O-GlcNAc特异性抗体RL2所检测的(图1A和1B)。O-GlcNAc糖基化中的这种剂量依赖性提高强调葡萄糖浓度增加与角质细胞中O-GlcNAc修饰之间的关联。

在高血糖条件下人角质细胞表现出伤口愈合延迟.然后本发明人想测试高血糖条件是否影响人角质细胞的伤口闭合速率。对此，本发明人使用“划痕试验”作为伤口愈合的体外模型(图1C)。通过用不同量的葡萄糖预孵育HaCaT细胞48小时来进行分析，之后在细胞融合层中引入“伤口”。让“伤口愈合”进行16小时表明培养基中葡萄糖水平的提高以剂量依赖性方式降低伤口闭合速率(图1D)。

通过RNA干涉对O-GlcNAc途径的关键酶进行的基因抑制影响人角质细胞培养物中的伤口闭合速率。伤口闭合延迟与HaCaT细胞中O-GlcNAc修饰水平提高之间的明显关联引导我们更详细地进一步研究负责O-GlcNAc蛋白修饰(分别为OGT和OGA)的添加或除去的酶的作用。为了做到这一点，本发明人用对抗任一酶的shRNA稳定转导HaCaT细胞，并通过免疫印迹分析来分析细胞裂解物(图2A和2B)。细胞裂解物的免疫印迹分析证实了RNAi对O-GlcNAc水平的影响，同时shOGT显示O-GlcNAc修饰水平显著降低。shOGA转导的细胞显示出与未转导的和shGPF对照相似的O-GlcNAc修饰水平(图2B)。shRNA转导的划痕伤害表明，抑制OGT显著提高了伤口闭合速率，而对于OGA则恰恰相反(图2C和2D)。shGFP转导的对照与未转导的细胞无显著不同。总的来说，这些数据有力表明，降低O-GlcNAc(shOGT)的量加速伤口愈合，而抑制O-GlcNAc(shOGA)的除去则抑制人角质细胞的伤口愈合，因此强调了O-GlcNAc水平和伤口愈合速率之间的关联。

OGT的siRNA抑制减少角质细胞O-GlcNAc糖基化，并在高血糖条件下加速伤口闭合。为了研究使用治疗上更相关的方法靶向OGT基因表达的潜力，本发明人测试了作为抑制OGT的手段的小干扰RNA(siRNA)(图3)。合成针对OGTmRNA序列的19mer(单元单体)siRNA，并使用具有乱序序列的siRNA转染HaCaT细胞，作为对照。转染2天后，探测细胞裂解物的RL2和OGT免疫反应性(图3A和3B)。结果表明对抗OGT的siRNA引起OGT水平和RL2免疫反应性的明显抑制，这可由免疫印迹定量。

接着，在划痕伤害分析中测试siRNA转染的细胞，以检查这种形式的OGTRNAi对体外伤口闭合的影响。图3C示出26小时时间点时，与对照siRNA和未处理细胞相比，用OGTsiRNA的伤口愈合进展显著更多(图3D)。这些结果进一步支持人角质细胞中的胞内O-GlcNAc修饰水平与伤口闭合速率有关，并且这可使用OGT抑制来进行操作。

OGT的shRNA抑制减少了角质细胞胞内蛋白O-糖基化；而OGA抑制增加了蛋白O-糖基化.使靶向GFP(对照)、OGT和OGA的shRNA稳定转染的HaCaT细胞生长至融合。然后用抗(i)O-GlcNAc修饰(RL2)、(ii)OGT蛋白和(iii)GAPDH(负载对照)的抗体通过免疫印迹来分析细胞裂解物，如图8A和图8B中所示。如所示，OGT的基因抑制减少了O-GlcNAc蛋白修饰；而OGA的基因抑制则增加了O-GlcNAc蛋白修饰。

当通常施用于伤口时，OGT反义寡脱氧核苷酸下调了试验小鼠皮肤中的OGT蛋白水平和O-GlcNAC修饰。在伤害后t＝0和t＝24小时时，对WT小鼠全层皮肤伤口局部施用50ulF-127凝胶中的10nMOGT反义寡脱氧核苷酸。在伤害后48小时时采集用OGT反义ODN或溶媒对照处理的小鼠损害周围的皮肤。通过SDSPAGE分离皮肤提取物，并用抗O-GlcNAc修饰(RL2)、OGT蛋白或GAPDH(作为负载对照)的抗体通过免疫印迹检测，如图9所示。

讨论

越来越多来自文献的证据表明，己糖胺途径中的改变在糖尿病病理中起重要作用。例如，小鼠中OGT的超表达引起糖尿病表型(8)，且相对于健康对照(9,15)，来自2型糖尿病患者的细胞和组织中已观察到O-GlcNAc糖基化水平提高。以前，本发明人曾报道，角质细胞中OGT的超表达(i)增加细胞蛋白的GlcNAc修饰，和(ii)显著增强细胞-细胞粘附(12)。与这些观察结果一致，本发明人在浓度增加的葡萄糖中生长的人角质细胞培养物中观察到蛋白O-糖基化的剂量依赖性增加。此外，增加葡萄糖浓度和O-GlcNAc蛋白修饰以剂量依赖性方式与伤口闭合延迟有关。显著的是，用OGT特异性shRNA或siRNA沉默OGT活性减少了角质细胞蛋白的GlcNAc修饰，甚至在增加的葡萄糖浓度的存在下，促进划痕模型试验中的伤口愈合。总的来说，这些观察结果表明，由酶OGT介导的胞内O-糖基化增加可能有助于慢性糖尿病皮肤伤口的伤口愈合延迟。

OGT活性增加对促进细胞粘附和延迟伤口愈合的影响可能部分由于对包括细胞桥粒、粘合连接和本发明人之前已报道的骨架元件在内的角质细胞细胞粘附组分的调控所致。(12)在这种情况下，本发明人之前已证明，斑珠蛋白，其是粘合连接和细胞桥粒细胞-细胞粘附复合物的一种组分，在超表达OGT的角质细胞中被增加的O-糖基化而翻译后稳定化。该增加的斑珠蛋白的蛋白水平促使细胞桥粒和基于斑珠蛋白的粘合连接的形成，并显著增强细胞-细胞粘附。(12)这些观察结果表明，在角质细胞中，O-糖基化的功能部分是调控斑珠蛋白的翻译后稳定性并显著地调控角质细胞的细胞-细胞粘附。伤口愈合期间，角质细胞迁移进伤口以促进表皮新生。伤口周边处的角质细胞必须下调对后边缘处相邻细胞的粘附，以允许移动离开边缘并进入伤口。通过提高细胞-细胞粘附，本发明人认为，胞内蛋白O-糖基化增加阻碍伤口愈合；而对胞内蛋白O-糖基化的下调则促进伤口愈合。

值得注意的是，O-糖基化是普遍存在的细胞内修饰。除了修饰细胞粘附和结构蛋白之外，还通过向丝氨酸和苏氨酸残基OGT催化添加GlcNAc，修饰转录因子和调控酶。因此，OGT活性的影响很可能是多向性的。除了对粘附的影响之外，改变胞内蛋白O-糖基化的水平也可影响细胞增殖和趋化性，且其可能是促成观察到的伤口愈合延迟的这些影响的组合。

糖尿病伤口代表沉重(significant)的卫生保健负担。因为由于肥胖发病率上升和人口老龄化，糖尿病的发病率增加，因而发病率和治疗这些伤口的社会和经济成本可能增加。本发明人已证明，通过使用RNAi抑制OGT降低O-GlcNAc糖基化总体水平加速高血糖角质细胞培养物模型中的伤口愈合。总的来说，这些数据表明局部靶向OGT可证明促进糖尿病溃疡中愈合的有效方法。由于之前己证明，伤口中的受损屏障功能允许用寡核苷酸转染(16)，本发明人认为，局部施用针对OGT的siRNA可能是促进慢性糖尿病皮肤伤口以及一般伤口愈合的有效治疗。

实施例2

OGT反义寡核苷酸局部给药促进糖尿病伤口愈合

本发明人的数据表明，核质酶O-GlcNAc转移酶(OGT)催化的蛋白的细胞内O-糖基化增加有助于慢性糖尿病皮肤伤口的伤口愈合延迟。实施例中描述的该研究将测试通过OGT特异性寡核苷酸的直接给药抑制皮肤中的酶OGT是否加速糖尿病皮肤伤口的愈合。本发明人考虑了通过向皮肤伤口位点局部施用OGT反义寡核苷酸(OGT反义ODN)和/或OGTsiRNA下调OGT活性会加速正常伤口和糖尿病伤口愈合。

该实施例中描述的研究涉及：

I)确定糖尿病小鼠模型中的OGT抑制是否能加速伤口愈合速率，和

II)进一步表征OGT介导的胞内O-糖基化调控伤口愈合的机制。

OGT反义寡核苷酸局部给药以促进糖尿病伤口愈合

慢性伤口是影响美国650万患者和每年花费约250亿美元治疗的发病的重要源由。患有糖尿病的患者患上慢性非愈合伤口的风险增加。各种因素可能促使糖尿病患者易于患上慢性伤口，包括神经病变、血管病变，以及引起血糖水平升高的潜在内分泌功能障碍。

丝氨酸和苏氨酸残基的O-糖基化是与蛋白磷酸化类似的常见翻译后调控修饰；在糖尿病和高血糖状态中已观察到胞内蛋白O-糖基化增加。两种胞内酶即UDP-N-乙酰氨基葡萄糖-多肽β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和O-GlcNAc-选择性N-乙酰基-β-D-葡糖胺糖苷酶(OGA)分别介导来自胞内蛋白底物的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的添加和除去。胞内蛋白的O-GlcNAc修饰的改变与糖尿病有关，且糖尿病组织中观察到的蛋白O-糖基化水平提高可能部分解释有助于伤口愈合延迟的一些潜在病理机理。

角质细胞中OGT活性增加延迟了伤口愈合。伤口愈合期间，角质细胞迁移进伤口以促进表皮新生。伤口周边处的角质细胞必须下调对后边缘处相邻细胞的粘附，以允许移动离开边缘并进入伤口。通过提高细胞-细胞粘附,本发明人考虑到胞内蛋白O-糖基化增加阻碍伤口愈合；而胞内蛋白O-糖基化的下调则促进伤口愈合。在该建议中,本发明人会进一步表征O-糖基化在伤口愈合中的作用。作为初步测试,使用划痕试验将超表达OGT的角质细胞中的伤口闭合时间与对照角质细胞相比(图6)。OGT介导的胞内蛋白O-糖基化增加导致愈合延迟。在伤害后16小时时,对照角质细胞已完全闭合伤口。相反，超表达OGT的角质细胞未能闭合伤口；伤害后16小时时，OGT细胞中观察到小于50％的伤口闭合。

本发明人已证明，(i)通过在鼠角质细胞中超表达OGT增加蛋白O-糖基化导致蛋白O-糖基化增加和高粘性表型(图2和(17))和(ii)升高的高血糖条件下培养的人角质细胞显示出提高的O-GlcNAc修饰水平以及体外伤口闭合速率延迟(图7)。本发明人还证明，通过RNA干扰(RNAi)进行的OGT特异性抑制显著逆转了该作用(图2、3、7)，从而为糖尿病患者伤口愈合延迟的OGT靶向治疗干预提供了机会。考虑了抑制OGT会促进慢性伤口包括糖尿病伤口的愈合。本发明人认为，局部施用抑制性核苷酸(例如OGT反义寡核苷酸或siRNA)会促进体内伤口愈合。

糖尿病人中的细胞内O-糖基化.高血糖即过量葡萄糖进入氨基葡萄糖途径，以为OGT修饰胞内蛋白提供过量UDP-GlcNAc(18)。过量葡萄糖转化为氨基葡萄糖，其最终转化为UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)，即用于胞内蛋白的OGT修饰的供体底物。因此，高血糖症与各种蛋白的O-糖基化增加有关(18-22)。在高血糖状态包括糖尿病中观察到的胞内蛋白GlcNAc修饰的增加，被认为有助于与糖尿病有关的一些病理。例如胰腺β-细胞具有高水平的OGT，且对胞内O-GlcNAc修饰的变化敏感，并且肌肉和脂肪组织中OGT的超表达在转基因鼠模型中引起糖尿病(23)。

糖尿病和引起胞内蛋白O-糖基化增加的突变的遗传相关性.导致编码O-GlcNAc酶(OGA)的基因提前终止的突变与对墨西哥裔美国人口成年发病II型糖尿病的遗传易感性相关(24)。OGA从胞内蛋白除去GlcNAc，且鉴别的OGA突变导致蛋白O-糖基化水平升高。该观察结果为糖尿病中胞内O-糖基化增加的病理作用进一步提供了支持。

前期工作表明，由酶OGT介导的胞内O-糖基化增加促使慢性糖尿病皮肤伤口的伤口愈合延迟，包括：

角质细胞中OGT的超表达(i)增加了细胞蛋白的GlcNAc修饰，(ii)显著增强细胞-细胞粘附(图7)(1)，以及(iii)延迟伤口愈合的角质细胞划痕试验模型中的伤口闭合(图6)；

在来自糖尿病小鼠的皮肤中观察到细胞蛋白的GlcNAc修饰增加(图5)；

人角质细胞培养物中葡萄糖浓度的增加与角质细胞蛋白的GlcNAc修饰增加有关，并以剂量依赖性方式抑制伤口闭合(图7)；和

用OGT特异性shRNA或siRNA沉默OGT活性减少了角质细胞蛋白的GlcNAc修饰，且甚至在增加的葡萄糖浓度的存在下，促进划痕模型试验中的伤口愈合(图2、3、7)。

OGT活性增加对促进细胞粘附和延迟伤口愈合的影响可能部分是由于对包括细胞桥粒、粘合连接和本发明人之前已报道的骨架元件的角质细胞细胞粘附组分的调控所致(17)。

因此，(i)通过增加的葡萄糖浓度、增加的OGT活性或降低的OGA活性来增加胞内蛋白O-糖基化而延迟上皮伤口愈合，和(ii)通过减少蛋白O-糖基化的OGT特异性shRNA或siRNA加速伤口愈合，支持该途径在延迟慢性糖尿病皮肤伤口愈合中的作用。

将OGT鉴别为糖尿病和高血糖状态中角质细胞伤口愈合的调节剂和证明下调OGT活性会促进伤口愈合，是全新的创新性观察结果。发展局部反义OGTODN下调体内OGT活性，会提供OGT抑制将加速慢性糖尿病伤口愈合的概念证据。此外，已证明由于伤口中存在受损屏障，对伤口局部施用反义ODN在人个体中会下调靶基因。因此，OGT反义ODN的局部给药代表全新的、实用可行的促进愈合的方法，且代表慢性非愈合糖尿病伤口护理中的重大突破。通过减少愈合时间，预期局部OGT反义ODN会减少护理这些伤口的直接费用以及由受影响个体中生产力损失导致的间接费用。该建议会测试通过OGT特异性寡核苷酸的直接给药抑制皮肤中的酶OGT是否加速糖尿病皮肤伤口的愈合。这是高风险高影响的研究，通过体内OGT抵制能够促进愈合的概念证据，其具有快速导致在患有慢性糖尿病皮肤伤口的患者中进行OGT反义ODN的翻译临床研究的潜力。

途径/方法：

I.确定糖尿病小鼠模型中的OGT抑制是否能够加速伤口愈合速率

糖尿病小鼠模型.初步体内研究将聚焦于从杰克森实验室(JacksonLaboratories,BarHarbor,ME)获得的充分表征且易获得的链脲佐菌素(streptozoticin，STZ)诱导的糖尿病C57BL/6J小鼠；非糖尿病C57BL/6J小鼠将用作WT对照。或者，使用已建立的实验方案，本发明人可通过腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)、50mgSTZ/kg体重，一天一次(qd)，5天，在6-8周大的雄性C57BL/6J小鼠中诱导糖尿病。注射10天后，测定血糖水平以鉴定糖尿病小鼠(即非空腹血糖水平>300-400mg/dl)。可探究的其它糖尿病小鼠模型包括饮食诱导的肥胖模型(每个糖尿病类型2个糖尿病模型(prediabetictype2diabetesmodel))和/或db/db小鼠，都可从杰克森实验室(JacksonLaboratories)获得。

糖尿病小鼠模型中的伤口愈合实验.将小鼠麻醉，剃毛，并通过用6mm钻取活检切开皮肤造成全层中背伤口(直径6mm的圆形，面积113mm²)。受伤小鼠未接受治疗(第1组)，只接受溶媒治疗(第2组)或局部接受溶媒中OGT反义-ODN(OGT反义寡脱氧核苷酸)治疗(第3组)，或局部接受溶媒中对照(OGT有义)ODN的治疗(第4组)。在糖尿病和对照小鼠的背中线各侧剃光的背上制造四个全层切割伤口。对一个伤口施用在冰上冷却的30％PluronicF-127凝胶(SIGMA公司)中的1μMOGT反义-ODN。对一个伤口施用1μM对照OGT有义ODN，对一个伤口只施用溶媒，以及对剩下的伤口不施用任何物质。对于检查OGT抑制程度和对O-GlcNAc修饰的影响的实验，在不同时间点用8mm钻取活检采集伤口和周围的皮肤(每个时间点最少8只小鼠)。

优化体内剂量给药.为了确定最优浓度和给药方案，溶媒中OGT反义ODN的剂量应答曲线将用于C57BL/6J小鼠WT背景中。首先将研究溶媒中0.01μM至10μM的ODN浓度，因为公开的体内研究已证明该浓度对于试验动物的皮肤中的抑制有效。30％F-127凝胶(SIGMA)将是用于ODN给药的初始溶媒，因为其已被证明对体内ODN的局部给药有效；然而，可以研究其它溶媒。将进行时间进程研究以确定最优体内给药方案。例如，施用局部ODN24h(小时)、48h、4天和7天后，通过试验动物皮肤的活检评估单次施用给药后OGT抑制的持久性。将通过(i)皮肤活检切片的免疫荧光和/或免疫过氧化物酶染色和(ii)利用对抗OGT和O-GlcNAc的抗体的皮肤提取物的免疫印迹来评估OGT抑制水平和胞内蛋白O-GlcNAc修饰的影响。局部ODN的给药方案将以抑制作用的半衰期为基础。例如，如果抑制持续48小时，则局部ODN每隔一天的给药方案将用于体内伤口愈合研究。

分析体内伤口愈合.临床上会在不同时间点检查动物，直到实现完全的伤口闭合。每日测量伤口闭合，直至未处理的和溶媒对照和OGT反义ODN处理的小鼠完全愈合。对单个小鼠的伤口进行数码拍照，并将伤口区域定量(Sigma-Scan；Sigma-Aldrich)和标准化，以及表达为初始伤口大小的百分数(100％)(9)。绘制各时间点的平均值(n＝每组8-10只动物)，±SEM。斯氏t检验用于比较对照和OGT反义ODN处理的组。一旦伤口愈合完全，则会根据UNC-CH动物保健委员会(AnimalCareCommittee)批准的实验方案通过断头处死小鼠。会分别使用抗OGT特异性抗体和O-GlcNAc特异性抗体(克隆RL2或CTD110)通过皮肤活检的直接免疫荧光和免疫过氧化物酶染色来分析皮肤组织样品的OGT水平和功能上的蛋白O-GlcNAc修饰。利用抗OGT和RL2抗体和CTD110.1O-GlcNAc特异性抗体进行的组织提取物的免疫印迹，是检查OGT反义ODN给药和OGT功能抑制有效性的另一途径。

II.进一步表征OGT介导的O-糖基化调控体外和体内伤口愈合的机制。

除了粘附之外，细胞增殖和/或趋化性的调控可能也促进高血糖条件或超表达OGT的角质细胞中观察到的的伤口愈合延迟。该研究会进一步表征角质细胞胞内蛋白的GlcNAc修饰增加对(1)细胞-细胞粘附、(2)细胞增殖和(3)趋化性的影响。本发明人考虑了(i)OGT活性的影响可能是多向性的，(ii)胞内O-糖基化水平改变细胞增殖、趋化性和粘附性，以及(iii)这些影响的组合有助于所观察到的伤口愈合延迟。

基本原理：本发明人使用单层划痕分析获得的初始数据表明，角质细胞中胞内O-糖基化的增加阻碍伤口愈合，且OGT抑制加速伤口愈合。O-糖基化是普遍存在的胞内修饰。除了修饰细胞粘附和结构蛋白之外，转录因子和调控酶还被GlcNAc向丝氨酸和苏氨酸残基的OGT催化的添加修饰。除了粘附之外，O-GlcNAc介导的细胞增殖和/或趋化性的调控也可能有助于在高血糖条件或超表达OGT的角质细胞中所观察到的伤口愈合延迟。该研究表征了角质细胞胞内蛋白的GlcNAc修饰增加对(1)细胞-细胞粘附、(2)细胞增殖和(3)趋化性的影响。本发明人考虑了(i)OGT活性的影响可能是多向性的,(ii)胞内O-糖基化水平改变细胞增殖、趋化性和粘附性,以及(iii)这些影响的组合有助于所观察到的伤口愈合延迟。

体外试验.本发明人利用人原代角质细胞以及永久转染的永生化角质细胞系，检查改变的胞内O-糖基化的影响。通过转染细胞系中的人OGT,通过内源OGT和内源OGA的shRNA抑制,通过将细胞暴露给增加浓度的胞外葡萄糖，以及通过使用OGA抑制剂PUGNAc操作O-糖基化。使用这些工具操作胞内O-糖基化水平,本发明人会分析(1)细胞增殖、(2)细胞迁移、(3)细胞-细胞粘附以及(4)伤口闭合的改变，如下文所示。

本发明人会确定胞内O-糖基化水平是否会影响细胞增殖。细胞增殖试验会包括BrDu掺入和3H-胸苷代谢放射标记实验以促进定量分析。基于人OGT瞬时转染进永生化角质细胞A431鳞状细胞癌的初步结果，本发明人预测OGT活性和胞内O-糖基化的增加会减少增殖；而O-糖基化减少会增加增殖。

本发明人会确定胞内O-糖基化水平是否会影响细胞趋化性。使用改良的伯伊登室试验(modifiedBoydenChamberassay)来分析对各种已知刺激角质细胞运动性的试剂的趋化性的改变，该试剂包括胎牛血清、EGF、PDGF和GPCR激动剂。本发明人预测OGT活性和胞内O-糖基化增加会降低趋化性。

本发明人会确定胞内O-糖基化水平是否会影响细胞-细胞粘附。使用分散酶试验直接测量细胞-细胞粘附，且如之前所述，使用抗粘附连接组分和细胞桥粒组分的抗体进行免疫印迹分析和IF分析来确定OGT对连接蛋白水平和细胞定位的影响，分析连接蛋白组分的影响(17)。本发明人预测OGT活性和胞内O-糖基化增加会增强细胞-细胞粘附。

本发明人会在伤口愈合(i.划伤和ii.器官型)模型中同时检查所有三种影响。本发明人利用角质细胞单层划痕试验和与皮肤等效的器官型培养物来研究胞内O-糖基化对伤口愈合的影响。永久转染的OGT角质细胞用于促使这些模型系统中胞内O-糖基化的增加。另外，单层培养物中的角质细胞中或用于构建皮肤等效物的角质细胞中的OGT或O-GlcNAc酶的shRNA抑制，使我们能检查内源OGT和OGA活性的改变。分别用OGTshRNA和OGAshRNA研究伤口愈合过程中胞内O-糖基化的减少和增加。本发明人分析(1)细胞-细胞粘附、(2)细胞迁移、(3)细胞增殖和(4)伤口闭合的改变。本发明人预测OGT活性和胞内O-糖基化增加会降低伤口愈合。

体外试验：

操作OGT活性。用若干方法调控细胞和组织模型系统内的OGT活性。本发明人已制备了分别促使克隆的鼠和人OGT超表达的永久转染的鼠和人角质细胞系。另外，本发明人具有OGT和OGA的shRNA构建体，本发明人已证明，所述构建体有效地显著降低OGT和OGAmRNA、蛋白和活性的内源水平。还证明，对胞外葡萄糖浓度进行调节改变胞内蛋白GlcNAc修饰(2)。最后,OAG抑制剂,特别是PUGNAC,可用于通过抑制催化从丝氨酸和苏氨酸残基除去GlcNAC的酶而增加胞内O-糖基化。

O-糖基化试验.使用许多试验来检测OGT-介导的胞内蛋白GlcNAc修饰的增加。通过(i)用市售的GlcNAc特异性单克隆抗体RL2(26-29)(AffinityBioreagents公司)或CTD110.6(Covance公司)进行免疫印迹，(ii)通过在³H-GlcNAC中培养细胞在将放射性标记特异性并入蛋白底物中，或(iii)通过半乳糖基转移酶放射性标记，来检测GlcNAc修饰的蛋白；β1,4-半乳糖转移酶催化半乳糖从供体UDP-半乳糖添加到N-乙酰氨基葡萄糖OH-4中，并因此可以用于将³H-半乳糖特异性地并入GlcNAc修饰的细胞蛋白中(30)。本发明人已使用这些方法中的每一种来证明斑珠蛋白O-糖基化(17)。

细胞增殖试验.用10μM胸苷类似物5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)(其优先被掺入新复制的DNA)孵育细胞3h，于室温下在含5％蔗糖的4％多聚甲醛(pH7.0)中固定20分钟。用抗BrdU抗体检测掺入BrdU的细胞核，并使用蔡司(Zeiss)荧光显微镜计数。每点包括至少5个不同任意选择的视野(field)，对至少500个细胞进行评分。可替换地，用³H-胸苷标记正增殖的角质细胞；掺入用于各实验条件的限定量的细胞中的³H信号水平为细胞增殖提供了直接定量测量。测定增殖速率的其它方法，包括用结晶紫或MTT染色和对阳性染色的细胞的数量计数。

细胞-细胞粘附试验通过所述的基于分散酶的离解试验进行(17,31,32)。简言之，用PBS将在12或24孔组织培养板上一式三份生长至融合的细胞洗涤两次，于37℃下分别在0.25ml或0.05ml分散酶II(2.4U/ml；RocheDiagnosticsGmbH)中培养1h，在ClayAdams章动器上反复摇晃10次，并对片段数量进行计数。

趋化性试验.使用聚碳酸酯过滤器(25*80mm,孔径12μM)在改良的伯伊登室中测量趋化性。将化学引诱剂添加到下室中，并按5×10⁴个细胞/孔将细胞加到上室中。在指定时间点(0-12小时)，用机械方式除去上膜表面上的非迁移细胞，固定穿过并在过滤器的下表面上展开的细胞并用Diff-Quik(FisherScientific,Pittsburgh,PA)染色。用显微镜和10×物镜对迁移的细胞计数。对于各数据点，四个任意视野各计数两次，确定三种单个孔的平均+/-标准偏差(SD)。OGT介导的胞内O-糖基化对趋化性的影响可以是全身的或途径特异性的。为了区分这些可能性，对各种趋化因子(生长因子如EGF和PDGF、血清和GPCR激动剂)进行分析。

体内试验：

除了改变细胞粘附之外，OGT还可影响增殖。将通过Ki67即核增殖抗原的皮肤活检进行免疫组织化学染色，在体内分析角质细胞增殖(33)，以确定伤害后OGT抑制对体内角质细胞增殖的影响。

伤口愈合期间，存在炎性浸润、包括嗜中性粒细胞然后巨噬细胞的早期浸润的进行性变化。炎性变化被认为损害早期伤口愈合，因此本发明人另外分析组织样品的OGT反义ODN对炎性浸润的影响，以确定OGT抑制对体内伤口炎症的影响。

将通过伤害后第1天和第3天伤口的皮肤活检分析嗜中性粒细胞和巨噬细胞浸润。切片用苏木精和伊红染色，并通过对细胞/高倍视野计数对嗜中性粒细胞进行定量。另外，髓过氧物酶染色也用作对浸润进伤口的嗜中性粒细胞定量的其它手段。巨噬细胞通过染色皮肤活检样品进行定量。

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本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用的方式并入本文中，程度如同具体单独地指示要通过引入并入每个单独的出版物、专利或专利申请一样。

应理解的是，在不偏离本文公开的主题的范围的情况下，目前公开的主题的各种详细信息可以变化。此外，前述说明书仅用于说明的目的，而不用于限定的目的。

序列表自由文本

SEQIDNO:1是OGT有义DNA/核苷酸序列-编码(3141nt)。

SEQIDNO:2是OGT多肽序列(1046aa)。

SEQIDNO:3是OGT反平行序列/OGT反义DNA序列。

SEQIDNO:4-11是OGT反义寡脱氧核苷酸，其中SEQ.ID.NO.4、5和6是编码区，SEQ.ID.NO.7和8识别3’UTR区，以及SEQ.ID.NO.9、10和11识别内含子。

SEQIDNO:12-168识别OGT反义寡脱氧核苷酸(编码区)。

SEQIDNO:169-171是OGTsiRNA。

SEQIDNO:172是OGTshRNA。

SEQIDNO:173是OGT有义DNA/核苷酸序列，全长序列，包括调控区、内含子以及编码序列(49836nt)。

Claims (85)

1.分离的反义OGT多核苷酸，其中所述多核苷酸的长度为18-30个核苷酸，且具有与OGTmRNA杂交的序列。

2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，其具有

SEQIDNO:3所示的序列，或

与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173所示的18-30核苷酸序列互补的序列。

3.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸在中等到高严格性条件下与OGTmRNA杂交。

4.药物组合物，其包含：

(i)反义OGT多核苷酸，其中所述多核苷酸的长度为18-30个核苷酸，且具有与OGTmRNA杂交的序列；和

(ii)药学上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的组合物，其中所述多核苷酸具有

SEQIDNO:3所示的序列，或

与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。

6.如权利要求4所述的组合物，其中所述多核苷酸在中等至高严格性条件下与OGTmRNA杂交。

7.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述多核苷酸具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173的编码区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。

8.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述多核苷酸具有与SEQIDNO:173的调控区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。

9.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述多核苷酸具有与SEQIDNO:173的内含子区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。

10.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述多核苷酸包含选自SEQIDNO:4-168中任一种的序列。

11.如权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述多核苷酸包含与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的18-30核苷酸序列互补的序列或对应于SEQIDNO:3的18-30连续核苷酸片段的序列，其中所述序列包含选自SEQIDNO:4-168中任一种的序列。

12.如权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述多核苷酸的序列包含SEQIDNO:4-168中任一个的片段，还包含1-10个核苷酸残基，从而所述多核苷酸的序列对应于SEQIDNO:3的18-30连续核苷酸片段或与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的18-30核苷酸序列互补的18-30核苷酸分子。

13.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述多核苷酸是寡脱氧核苷酸。

14.如权利要求4-13中任一项所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体是凝胶。

15.如权利要求4-13中任一项所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括醇。

16.如权利要求4-13中任一项所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括聚乙二醇-聚丙二醇共聚物。

17.如权利要求4-13中任一项所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括F-127。

18.如权利要求4-13中任一项所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括藻酸盐或水凝胶。

19.如权利要求4-13中任一项所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包括基于纤维素的载体。

20.如权利要求4-13中任一项所述的组合物，其中所述基于纤维素的载体选自羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素及其混合物。

21.如权利要求4-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成用于局部施用。

22.如权利要求4-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成用于局部注射。

23.如权利要求4-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制于伤口敷料中。

24.如权利要求4-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制于胶态凝胶敷料中。

25.如权利要求4-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成用于缓释。

26.如权利要求4-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成用于缓慢释放、延长释放或控释。

27.如权利要求4-20中任一项所述的组合物，其中所述组合物是液体、霜剂、软膏、乳剂、洗剂、喷剂、药膏、泡沫剂和/或涂料。

28.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述多核苷酸或组合物用于治疗有伤口的个体。

29.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述伤口未以预期的速率愈合。

30.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述伤口延迟、难以愈合或是慢性的。

31.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述伤口的特征至少部分是OGT的表达增加。

32.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述个体是糖尿病患者。

33.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述个体患有1型糖尿病。

34.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述个体患有2型糖尿病。

35.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述个体的血糖水平高于正常血糖水平。

36.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述个体具有胰岛素抗性受体。

37.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或组合物，其中所述个体不是糖尿病患者。

38.如权利要求4-37中任一项所述的组合物，其还包含第二伤口愈合剂。

39.如权利要求4-37中任一项所述的组合物，其还包含第二抗OGT剂。

40.抑制细胞中OGT的方法，其包括对细胞施用抗OGT剂，其中所述抗OGT剂选自：

(i)反义OGT多核苷酸，其中所述多核苷酸的长度为18-30个核苷酸，且具有与OGTmRNA杂交的序列；

(ii)抑制OGT表达的双链RNA分子；以及

(iii)抑制OGT表达的短发夹RNA分子。

41.治疗有伤口的个体的方法，其包括对所述个体施用抗OGT剂，其中所述抗OGT剂选自：

(i)反义OGT多核苷酸，其中所述多核苷酸的长度为18-30个核苷酸，且具有与OGTmRNA杂交的序列；

(ii)抑制OGT表达的双链RNA分子；以及

(iii)抑制OGT表达的短发夹RNA分子。

42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述多核苷酸在中等至高严格性条件下与OGTmRNA杂交。

43.如权利要求40或41所述的方法，其中所述多核苷酸具有：

SEQIDNO:3中所示的序列(所述18-30个核苷酸的序列与SEQIDNO:3的18-30连续核苷酸片段对应)，或

与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。

44.如权利要求40或41所述的方法，其中所述多核苷酸是反义OGT多核苷酸。

45.如权利要求40或41所述的方法，其中所述多核苷酸是寡脱氧核苷酸。

46.如权利要求40或41所述的方法，其中所述反义OGT多核苷酸包含选自SEQIDNO:4-168中任一个的序列。

47.如权利要求40或41所述的方法，其中所述多核苷酸具有与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173的编码区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。

48.如权利要求40或41所述的方法，其中所述多核苷酸具有与SEQIDNO:173的调控区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。

49.如权利要求40或41所述的方法，其中所述多核苷酸具有与SEQIDNO:173的内含子区中示出的18-30核苷酸序列互补的序列。

50.如权利要求40或41所述的方法，其中所述多核苷酸包含与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的18-30核苷酸序列互补的序列或与SEQIDNO:3的18-30连续核苷酸片段对应的序列，其中所述序列包含选自SEQIDNO:4-168中任一个的序列。

51.如权利要求40或41所述的方法，其中所述多核苷酸的序列包含SEQIDNO:4-168中任一个的片段，且还包含1-10个核苷酸残基，从而所述多核苷酸的序列对应于SEQIDNO:3的18-30连续核苷酸片段或与SEQIDNO:1或SEQIDNO:173中示出的18-30核苷酸序列互补的18-30核苷酸分子。

52.如权利要求40或41所述的方法，其中所述分离的双链RNA分子包括包含选自SEQIDNO:169-171的序列且包括约11-27个核苷酸的第一链。

53.如权利要求40或41所述的方法，其中小发夹RNA包含SEQIDNO:172的序列。

54.如权利要求38-53中任一项所述的方法，其中将所述抗OGT剂提供于药物组合物中。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述药学上可接受的载体是凝胶。

57.如权利要求55所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括醇。

58.如权利要求55所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括聚乙二醇-聚丙二醇共聚物。

59.如权利要求55所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括F-127。

60.如权利要求55所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括藻酸盐或水凝胶。

61.如权利要求55所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括基于纤维素的载体。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述基于纤维素的载体选自羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素及其混合物。

63.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制成用于局部施用。

64.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制成用于局部注射。

65.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制于伤口敷料中。

66.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制于胶态凝胶敷料中。

67.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制用于缓释。

68.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制用于缓慢释放、延长释放或控释。

69.如权利要求54-62中任一项所述的方法，其中所述组合物是液体、霜剂、软膏、乳剂、洗剂、喷剂、药膏、泡沫剂或涂料。

70.如权利要求44和46-53中任一项所述的方法，其中局部施用所述抗OGT剂。

71.如权利要求44和46-53中任一项所述的方法，其中通过局部注射施用所述抗OGT剂。

72.如权利要求44-71中任一项所述的方法，其中所述组合物或药剂用于治疗有伤口的患者。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述伤口未以预期的速率愈合。

74.如权利要求72所述的方法，其中所述伤口延迟、难以愈合或是慢性的。

75.如权利要求72所述的方法，其中所述伤口的特征至少部分是OGT的表达增加。

76.如权利要求44和46-53中任一项所述的方法，其中所述细胞包括胰岛素抗性受体。

77.如权利要求76所述的方法，其中所述细胞在个体中。

78.如权利要求45-75和77中任一项所述的方法，其中所述个体不是糖尿病患者。

79.如权利要求45-75和77中任一项所述的方法，其中所述个体是糖尿病患者。

80.如权利要求79所述的方法，其中所述个体患有1型糖尿病。

81.如权利要求79所述的方法，其中所述个体患有2型糖尿病。

82.如权利要求45-75和77中任一项所述的方法，其中所述个体的血糖水平高于正常血糖水平。

83.如权利要求45-75和77中任一项所述的方法，其中所述个体有胰岛素抗性受体。

84.如权利要求45-83中任一项所述的方法，其还包括施用第二伤口愈合剂的步骤。

85.如权利要求45-83中任一项所述的方法，其还包括施用第二抗OGT剂的步骤。