CN106334188A - 一种治疗皮肤黑色素相关疾病及皮肤美白的药物作用靶点 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗皮肤黑色素相关疾病及皮肤美白的药物作用靶点。本发明优点在于：本发明涉及的药物相对于酪氨酸酶抑制剂，规避了易降解、可溶性差、易引起过敏反应、有致癌可能及可引起外源性褐黄病等诸多弊端；相对于植物中提取的抗氧化剂而言，药物作用靶点确切，药物成分明确，且不会引起接触性皮炎等副作用；相对于乳酸、乙醇酸等加速焕肤的药物，弥补了焕肤只能减少表皮层黑色素而无法减少真皮层黑色素的缺陷；相对于激光及手术切除而言，涂抹或注射的给药方式温和、无创或微创，且治疗后患处无需特殊护理；用药安全；稳定性好；相对于目前现行药物具有成本上的显著优势，合成成本较低。

Description

一种治疗皮肤黑色素相关疾病及皮肤美白的药物作用靶点

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种治疗皮肤黑色素相关疾病及皮肤美白的药物作用靶点。

背景技术

皮肤内黑色素的产量增加及聚集会引起许多皮肤相关疾病，例如获得性皮肤色素沉着、黄褐斑、炎症后黑皮病、太阳斑，等。这些皮肤黑色素相关疾病与接触紫外线照射有关，所以多位于体表裸露部位，常对患者的外观造成影响，甚至会产生严重的心理负担。而随着现今东西方主流审美多以皮肤白为美，怎样淡化皮肤黑色素使皮肤变得更为白皙，也是许多化妆品研发人员所追求的目标。然而，目前尚未有公认安全而有效的产品来减少皮肤黑色素沉着，故该问题的解决具有较高的学术和商业价值。

表皮和真皮的黑色素沉着量与黑色素细胞的数量以及产生黑色素相关的酶活性有关。黑色素细胞在接受外界刺激(如紫外线照射、慢性炎症等)后，经其表面受体c-kit、MC1R、肾上腺素受体等激活一系列信号通路，上调转录因子MITF的表达，增加与黑色素合成密切相关的酶——酪氨酸酶——的表达；酪氨酸酶合成后被转运至黑色素小体，在其中作用于其底物酪氨酸，再经一系列的生化修饰，最终合成黑色素，然后转运至其他细胞中，导致黑色素沉着。

现有的治疗皮肤黑色素沉着的方法：酪氨酸酶抑制剂，如左旋维C、曲酸、鞣花酸、氨甲环酸、对苯二酚等，有易降解、可溶性差、易引起过敏反应、有致癌可能及可引起外源性褐黄病等诸多弊端；植物中提取的抗氧化剂，有效成分不明确，且容易引起接触性皮炎等副作用；乳酸、乙醇酸等加速焕肤的药物，只能减少表皮层黑色素含量而无法减少真皮层黑色素，效果有限；而激光及手术切除，治疗过程中会对皮肤本身造成损伤，且治疗后患处需特殊护理。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供以LAMC2基因和/或其编码的蛋白Laminin-5作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤黑色素相关疾病药物或皮肤美白药物中的应用。

本发明的第二个目的是，提供一种治疗皮肤黑色素相关疾病及皮肤美白的组合物。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：以LAMC2基因和/或其编码的蛋白Laminin-5作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤黑色素相关疾病药物或皮肤美白药物中的应用。

所述的以LAMC2基因和/或蛋白Laminin-5作为药物作用靶点的药物是LAMC2基因和/或蛋白Laminin-5表达的抑制剂。

所述的以LAMC2基因和/或蛋白Laminin-5作为药物作用靶点的药物是干预LAMC2基因或蛋白Laminin-5的表达与功能的中和性抗体、小分子药物、小核苷酸，微小核糖核酸，反义分子或多肽。

所述的治疗皮肤黑色素相关疾病药物的给药方式是局部注射、涂抹或全身给药。

所述的皮肤黑色素相关疾病包括黑色素细胞痣、皮肤良性黑色素细胞增生疾病、恶性黑色素瘤以及各种原因导致的体表黑色素沉着。

所述的治疗皮肤黑色素相关疾病药物或皮肤美白药物中还包括药学上可接受的载体。

所述的药学上可接受的载体包括组氨酸多肽、赖氨酸多肽、分支状的组氨酸-赖氨酸共聚多肽、阳离子聚合物、硅纳米颗粒、脂质载体或病毒载体。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种治疗皮肤黑色素相关疾病药物或皮肤美白的组合物，所述的组合物包括药学上可接受的载体和以LAMC2基因和/或其编码的蛋白Laminin-5作为药物作用靶点的药物。

所述的以LAMC2基因和/或其编码的蛋白Laminin-5作为药物作用靶点的药物是干预LAMC2基因或蛋白Laminin-5的表达与功能的中和性抗体、小分子药物、小核苷酸，微小核糖核酸，反义分子或多肽。

本发明优点在于：

1、本发明系通过干预Laminin-5以抑制黑色素和合成，使皮肤内黑色素含量减少，从而达到治疗皮肤黑色素相关疾病及美白的效果；

2、本发明涉及的药物相对于酪氨酸酶抑制剂，如左旋维C、曲酸、鞣花酸、氨甲环酸、对苯二酚等，规避了易降解、可溶性差、易引起过敏反应、有致癌可能及可引起外源性褐黄病等诸多弊端；

3、相对于植物中提取的抗氧化剂而言，药物作用靶点确切，药物成分明确，且不会引起接触性皮炎等副作用；

4、相对于乳酸、乙醇酸等加速焕肤的药物，弥补了焕肤只能减少表皮层黑色素含量而无法减少真皮层黑色素的缺陷；

5、相对于激光及手术切除而言，给药方式无创或微创，且治疗后患处无需特殊护理；

6、本发明涉及的药物相对于目前现行药物具有成本上的显著优势，合成成本较低。

附图说明

图1.siRNA对人角质形成细胞系HaCaT中LAMC2基因表达的抑制效果。

图2.用siRNA干预HaCaT中LAMC2表达后所得的ECM培养A875和B16细胞系，可显著减少其黑色素含量。

图3.siRNA对小鼠皮肤LAMC2基因表达的抑制效果。

图4.通过小核苷酸针剂注射抑制LAMC2表达，可使C57BL/6小鼠毛囊颜色减淡。

图5.通过小核苷酸针剂注射抑制LAMC2表达，可抑制裸鼠黑色素瘤模型的生长及颜色加深。

图6.通过小核苷酸局部涂抹抑制LAMC2表达，可抑制裸鼠黑色素瘤模型的生长及颜色加深。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明系通过干预Laminin-5以抑制黑色素和合成，使皮肤内黑色素含量减少，从而达到治疗皮肤黑色素相关疾病及美白的效果。干预Laminin-5蛋白的表达与功能的方式较多，如中和性抗体、小分子药物、小核苷酸，微小核糖核酸，多肽等，这些方式与现有治疗方式相比，具有诸多优势，比如：

(1)本发明系通过局部注射或涂抹药膏，实现微创或无创性干预Laminin-5的表达以抑制黑色素和合成，使皮肤内黑色素含量减少，从而达到治疗皮肤黑色素相关疾病及美白的效果；

(2)药物成分明确，，致敏性远低于植物提取物；

(3)可同时减少表皮层与真皮层黑色素含量。

实施例1

1.实验材料

干预Laminin-5蛋白的表达与功能的方式较多，如中和性抗体、小分子药物、小核苷酸，微小核糖核酸，多肽等，现以小核苷酸药物为例，分别以皮肤表皮角质形成细胞和黑色素细胞为靶细胞，证实对Laminin-5蛋白进行干预能够促使皮肤内黑色素含量减少，从而达到治疗皮肤黑色素相关疾病及美白的效果。佐证LAMC2基因或其产物Laminin-5是抑制皮肤黑色素合成的关键靶点。

1.1小核苷酸序列

小核苷酸(Small interfering RNA,siRNA)：是一种小RNA分子(～21-25核苷酸)，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。SiRNA是siRISC的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默。RNA干涉(RNAinterference，RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。

它针对的小鼠LAMC2mRNA的序列为：

正义链：CCAGAUCAACAGUCGACUUTT(SEQ ID NO.1)；

反义链：AAGUCGACUGUUGAUCUGGTT(SEQ ID NO.2)。

它针对的人类LAMC2mRNA的序列为：

正义链：GCAGUACAGAUGGUGAUUATT(SEQ ID NO.3)；

反义链：UAAUCACCAUCUGUACUGCTT(SEQ ID NO.4)。

1.2小核苷酸/组氨酸-赖氨酸聚合物(HKP)纳米颗粒/甲基纤维素溶液配制方法

已用作siRNA转染载体的组氨酸-赖氨酸聚合物(HKP)具有赖氨酸骨架，该赖氨酸骨架包括含有多重组氨酸、赖氨酸或天冬氨酸的支链。将HKP溶于DEPC水制成DEPC水溶液，然后以质量比为4：1体积比为1:1与siRNA(购自上海吉玛制药技术有限公司)水溶液混合，形成平均直径为150-200nm的纳米颗粒。HKP-siRNA水溶液为半透明状，没有明显的沉淀物聚集，可以在4℃下储存至少三个月。

1.3小核苷酸针剂配制方法

体内实验小核苷酸针剂的配制：用DEPC-5％葡萄糖溶液溶解经过特殊修饰的siRNA(购自锐博生物科技有限公司)和HKP，分别制成siRNA水溶液和HKP水溶液，然后以质量比为4：1体积比为1:1与siRNA水溶液混合，形成平均直径为150-200nm的纳米颗粒。HKP-siRNA水溶液为半透明状，没有明显的沉淀物聚集，可以在4℃下储存至少三个月。

1.4小核苷酸涂抹药膏配制方法

体内实验小核苷酸药膏的配制：使用29mg品牌的修复乳霜作为药膏的油性成分，DEPC水配制20％的丙二醇(购自赛默飞公司)溶液(v/w)，用于溶解300pmol经过特殊修饰的siRNA(购自锐博生物科技有限公司)将siRNA充分溶解于20％的丙二醇溶液后，将混合液搅拌入的愈合膏，直至充分混合，常温下静置30分钟待用。

2.实验方法

2.1细胞培养

2.1.1人类角质形成细胞系HaCaT培养与传代

从液氮罐取出冻存管，立即至于37℃水浴融化，1500rpm离心后去上清，用含20％胎牛血清(FBS，GIBCO)青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml的DMEM培养液(DMEM，GIBCO)10ml重悬，然后接种于10cm培养皿中，置于37℃温箱内培养，每两天换液一次。待细胞密度至90％时，吸除培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗二次后加入0.25％的胰蛋白酶消化约3分钟，镜下见胞质回缩、细胞间隙增大时，加入DMEM培养液终止消化，吸管轻轻吹打瓶壁细胞使呈细胞悬液，按1:3比例分装传代。

2.1.2人类黑色素瘤细胞系A875培养与传代

从液氮罐取出冻存管，立即至于37℃水浴融化，1500rpm离心后去上清，用含20％胎牛血清(FBS，GIBCO)青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml的DMEM培养液(DMEM，GIBCO)10ml重悬，然后接种于10cm培养皿中，置于37℃温箱内培养，每两天换液一次。待细胞密度至90％时，吸除培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗二次后加入0.25％的胰蛋白酶消化约1分钟，镜下见胞质回缩、细胞间隙增大时，加入DMEM培养液终止消化，吸管轻轻吹打瓶壁细胞使呈细胞悬液，按1:3比例分装传代。

2.1.3小鼠黑色素瘤细胞系B16培养与传代

从液氮罐取出冻存管，立即至于37℃水浴融化，1500rpm离心后去上清，用含20％胎牛血清(FBS，GIBCO)青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml的1640培养液(1640，GIBCO)10ml重悬，然后接种于10cm培养皿中，置于37℃温箱内培养，每两天换液一次。待细胞密度至90％时，吸除培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗二次后加入0.25％的胰蛋白酶消化约1分钟，镜下见胞质回缩、细胞间隙增大时，加入1640培养液终止消化，吸管轻轻吹打瓶壁细胞使呈细胞悬液，按1:3比例分装传代。

2.1.4 HaCaT细胞外基质的制备

待细胞密度至90％时，吸除培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗二次后加入0.25％的胰蛋白酶消化约3分钟，镜下见胞质回缩、细胞间隙增大时，加入DMEM培养液终止消化。轻拍培养皿使贴壁细胞全部悬浮，吸除细胞悬液，用PBS漂洗两遍，加入0.2％热灭活的BSA，室温封闭1小时，再用PBS漂洗两遍，待A875或B16细胞系传代时用于接种培养。

2.2裸鼠黑色素瘤模型的建立

待A875和B16细胞密度至90％时，吸除培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗二次后加入0.25％的胰蛋白酶消化约1分钟，镜下见胞质回缩、细胞间隙增大时，加入含FBS的培养液终止消化，吸管轻轻吹打瓶壁细胞使呈细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管，1500rpm离心5分钟后去除上清。将细胞沉淀用PBS重悬，进行细胞计数。将细胞悬液注射到裸鼠背部皮内，每个注射点注射5×10⁶个细胞。

2.3体外培养细胞的siRNA转染

待细胞密度至约70％时，对细胞进行换液，并加入HKP-siRNA水溶液(方法参照1.2部分)，使siRNA终浓度为50nM。37℃温箱培养8小时后更换培养基。

2.4小核苷酸局部针剂注射

配制HKP-siRNA水溶液(方法参照1.3部分)，使siRNA终浓度为0.1mg/ml。每个点注射量为50μl，进行皮内注射，每三天注射一次。

2.5小核苷酸局部涂抹用药

体内实验小核苷酸药膏的配制：使用29mg品牌的修复乳霜作为药膏的油性成分，DEPC水配制20％的丙二醇(购自赛默飞公司)溶液(v/w)，用于溶解300pmol经过特殊修饰的siRNA(参见第1.4部分)，经2’ome修饰以及胆固醇修饰，增加其进入细胞的能力(购自锐博生物科技有限公司)。将siRNA充分溶解于20％的丙二醇溶液后，将混合液搅拌入的愈合膏，直至充分混合，常温下静置30分钟待用。

皮肤体内试验中，小核苷酸药膏的涂抹方式为：每天一次，每1cm²涂抹200μg药膏，盖上敷贴保持湿润，抑制水分过快蒸发，大约保持40分钟-1小时左右，可洗去药膏或使其自然吸收。

2.6实时定量PCR

用Trizol(Invitrogen,Grand Island,NY,USA)提取组织或细胞的总RNA，通过紫外分光光度法对RNA浓度和纯度进行测量(ND-1000,Thermo,Rockford,IL,USA)。用RT-PCR试剂盒(TaKaRa,Shiga,Japan)及ABI HT7900PCR仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)对提取的总RNA进行逆转录反应，合成cDNA。以上述cDNA为模板进行实时定量PCR，20μl反应体系：

各反应管配齐，短暂离心混匀后置于PCR反应仪中运行(AppliedBiosystems)。反应条件：95℃10s热启动后进入40个循环的反应：95℃15s，60℃30m，72℃30m。反应结束后用分析软件以ΔΔCT Relative Quantitation法分析结果。每个样本做三个平行副孔，并以GADPH引物作为内参。

引物序列如下：

2.7黑色素含量测定

吸除培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗二次后加入0.25％的胰蛋白酶消化约3分钟，镜下见胞质回缩、细胞间隙增大时，加入含FBS的培养液终止消化，吸管轻轻吹打瓶壁细胞使呈细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管，1500rpm离心5分钟后去除上清。将细胞沉淀用PBS重悬，进行细胞计数。取7×10⁵个细胞，1500rpm离心5分钟后去除上清，向其中加入100μl 1N的NaOH和10％二甲亚砜混合液，混匀，80℃水浴2小时。裂解所得的黑色素溶液置于96孔板内，用酶标仪对其405nm波长处的吸收值进行测量，并以人工合成黑色素(Sigma)制作标准曲线，计算其浓度。结果以相对值统计。

3.实验结果

3.1黑色素含量检测

体外实验中，我们发现在皮肤角质形成细胞系HaCaT中干预Laminin-5的表达，再用所得的ECM以及未干预过的ECM对A875和B16进行培养，随后对这两种黑色素瘤细胞系中黑色素含量进行测定，我们发现干预过Laminin-5的组，不论是A875或B16，其黑色素的含量显著低于未干预组(图2)。

3.2体内实验结果

在后续的体内实验中，本研究发现，通过使用小核苷酸药物对C57BL/6小鼠背部皮肤组织进行局部注射，抑制小鼠皮肤内Laminin-5的表达，对照组采用无效序列的siRNA。注射两次后(第一次注射6天后)，可发现C57BL/6小鼠背部注射处毛囊颜色减淡(图4)。另外，通过使用小核苷酸药物对裸鼠黑色素瘤模型进行局部注射，对照组采用无效序列的siRNA。注射两次后(第一次注射6天后)，可发现黑色素瘤的颜色明显浅于对照组，且体积也更小(图5)。

本研究还发现，通过使用小核苷酸药物对裸鼠黑色素瘤模型进行局部涂抹10天后，可发现黑色素瘤的颜色明显浅于对照组，且体积也更小(图6)。

4.结论

本发明的创新之处在于：

通过药物干预黑色素生成相关靶点Laminin-5，抑制皮肤中黑色素的合成，替代以往的酪氨酸酶抑制剂、植物提取物、焕肤药物、激光和手术等治疗方式。

大量研究显示，黑色素细胞和角质形成细胞在功能上有着密切而重要的联系。黑色素细胞可以向周围的角质形成细胞输送成熟的黑素小体，导致皮肤色素沉着，从而保护角质形成细胞免受紫外线损伤。而角质形成细胞通过旁分泌作用所分泌的细胞因子，如α-MSH、促肾上腺皮质激素、内皮素-1/2/3、FGF-2以及肝细胞生长因子，对表皮黑色素细胞的增殖和分化都有着重要的调控作用。Laminin-5是角质形成细胞所分泌的一种细胞外基质(ECM)，它能启动细胞间半桥粒的形成并稳固表皮与真皮之间的连接，同时它还与调控黑色素细胞有关。

研究发现，人角质形成细胞系HaCaT所分泌的Laminin-5可增加小鼠黑色素瘤细胞系B16F10对酪氨酸的摄取以及对α-MSH的敏感度，促进B16F10中黑色素的合成。同时，Laminin-5还能促进黑色素细胞及黑色素瘤细胞的增殖和迁移能力。用siRNA对HaCaT中Laminin-5的表达进行敲减后用其ECM对B16F10进行培养，B16F10的黑色素合成量显著降低。用siRNA对HaCaT中Laminin-5的表达进行敲减后用其ECM对人类黑色素瘤细胞系A375进行培养，其粘附和迁移能力显著降低。由此证明，在角质形成细胞中对Laminin-5敲减可抑制其ECM诱导的黑色素合成以及黑色素瘤细胞的粘附和迁移。

本发明优点在于：

(1)本发明系通过干预Laminin-5以抑制黑色素和合成，使皮肤内黑色素含量减少，从而达到治疗皮肤黑色素相关疾病及美白的效果；

(2)本发明涉及的药物相对于酪氨酸酶抑制剂，如左旋维C、曲酸、鞣花酸、氨甲环酸、对苯二酚等，规避了易降解、可溶性差、易引起过敏反应、有致癌可能及可引起外源性褐黄病等诸多弊端；

(3)相对于植物中提取的抗氧化剂而言，药物作用靶点确切，药物成分明确，且不会引起接触性皮炎等副作用；

(4)相对于乳酸、乙醇酸等加速焕肤的药物，弥补了焕肤只能减少表皮层黑色素含量而无法减少真皮层黑色素的缺陷；

(5)相对于激光及手术切除而言，给药方式无创或微创，且治疗后患处无需特殊护理；

(6)本发明涉及的药物相对于目前现行药物具有成本上的显著优势，合成成本较低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.以LAMC2基因和/或其编码的蛋白Laminin-5作为药物作用靶点的药物在制备治疗皮肤黑色素相关疾病药物或皮肤美白药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的以LAMC2基因和/或蛋白Laminin-5作为药物作用靶点的药物是LAMC2基因和/或蛋白Laminin-5表达的抑制剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的以LAMC2基因和/或蛋白Laminin-5作为药物作用靶点的药物是干预LAMC2基因或蛋白Laminin-5的表达与功能的中和性抗体、小分子药物、小核苷酸，微小核糖核酸，反义分子或多肽。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗皮肤黑色素相关疾病药物的给药方式是局部注射、涂抹或全身给药。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的皮肤黑色素相关疾病包括黑色素细胞痣、皮肤良性黑色素细胞增生疾病、恶性黑色素瘤以及各种原因导致的体表黑色素沉着。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗皮肤黑色素相关疾病药物或皮肤美白药物中还包括药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药学上可接受的载体包括组氨酸多肽、赖氨酸多肽、分支状的组氨酸-赖氨酸共聚多肽、阳离子聚合物、硅纳米颗粒、脂质载体或病毒载体。

8.一种治疗皮肤黑色素相关疾病药物或皮肤美白的组合物，其特征在于，所述的组合物包括药学上可接受的载体和以LAMC2基因和/或其编码的蛋白Laminin-5作为药物作用靶点的药物。

9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述的以LAMC2基因和/或其编码的蛋白Laminin-5作为药物作用靶点的药物是干预LAMC2基因或蛋白Laminin-5的表达与功能的中和性抗体、小分子药物、小核苷酸，微小核糖核酸，反义分子或多肽。