KR102081217B1

KR102081217B1 - 네프린 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 투과 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102081217B1
Application number: KR1020170117006A
Authority: KR
Inventors: 오상호; 김지영; 임범진
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2017-09-13
Filing date: 2017-09-13
Publication date: 2020-02-25
Also published as: KR20190029922A

Abstract

본 발명은 상기의 네프린 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 투과 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 네프린 억제제는 피부 각질세포에서 밀착연접을 완화시키는 효과가 있으므로, 다양한 약학조성물 또는 화장료조성물의 경피 흡수 촉진을 위한 보조 조성물로 의학 및 미용 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

네프린 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 투과 촉진용 조성물{A composition for accelerating skin permeation comprising a nephrin inhibitor}

본 발명은 네프린 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 투과 촉진용 조성물에 관한 것이다.

통상 약물의 체내 투입을 위해 사용되는 전달방법으로는 경구 투여제, 주사제 또는 흡입제 형태로 제제화되고 있는데 약물전달에 있어서 가장 많은 비중을 차지하는 경구 투여제의 경우, 약물이 간에서 초회 통과 효과(first pass metabolism)에 의해 상당량이 분해되므로 제제화 과정에서 해당 약물의 생체이용률(bioavailability)를 고려하여 실제 필요로 하는 양보다 과량의 약물을 복용해야 하는 문제가 있다. 흡입제의 경우 약물이 용기의 기벽에 흡착되므로 실제 처방량 보다 적은 양의 약물이 흡입될 수 있으며 사용 및 휴대가 불편한 단점이 있다. 따라서 이를 해결하고자 기존의 경구투여제, 주사제, 흡입제 등에 비해 많은 이점을 지니는 경피 투여 시스템이 활발히 개발되고 있다.

경피 투여의 경우, 경구 투여제와 달리 간에서 대사되지 않으므로 약물이 간에 의해 비활성 대사체로 전환되는 것을 방지할 수 있고 소화기관을 통하지 않으므로 약물에 의한 소화기관 장애를 최소화 함과 동시에 소화관 내 조건에 의해 약물 흡수도가 영향을 받지 않는다. 또한, 경피투여의 경우 약물의 혈중 농도를 일정하게 장기간 유지할 수 있으며 경구제나 주사제와 달리 높은 일시적으로 높아지는 혈중 농도로 인한 부작용을 예방할 수 있고, 투여 회수가 빈번한 약물의 투여회수 감소와 부작용 발생 시 제제의 적용을 용이하게 중단할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 경피 투여의 장점에도 불구하고 피부는 선천적으로 외부물질의 체내 유입에 대한 장벽으로 작용하도록 설계되어 있다는 점 때문에 약물의 피부투과과정에 있어서 피부장벽 자체가 속도제한과정으로 작용하여 약물의 투과성이 제한될 수 있다는 문제가 있다. 따라서 피부를 통해 약물을 체내로 전달시키는 것이 가능한 약물들은 극히 제한되어 있다. 특히 친수성 약물이나 염의 형태로 된 약물은 자체의 극성이 커서 일반적인 약물에 비해 피부를 통해 흡수되기에는 큰 어려운 점이 있다.

이를 극복하기 위해 경피 흡수 촉진용 리포좀 조성물을 이용하는 방법(KR1595530), 지질 용해성 조성물을 이용하는 방법(KR0654841), 나노입자를 이용하는 방법(KR0422763), 초음파 융합 장치를 이용하는 방법(KR1022201)등이 고안되고 있으나, 생체를 구성하는 본연의 물질이 아니므로 피내에서 면역반응을 야기하는 등의 문제가 발생하는 실정이다.

한편, 네프린(nephrin)은 신장의 족세포(podocyte)의 틈새막(slit membrane) 단백들 중 하나로서, 신장 여과 기능을 원활히 구현하기 위해 중요한 단백질이다. 신장 기능에 장애가 발생하면 소변으로 네프린이 대량 방출되는 것으로 알려져 있으므로, 신장 기능 검사의 지표로 이용된다.

본 발명은 상기의 네프린 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 투과 촉진용 조성물에 관한 것으로, 피부 조직에서의 네프린 억제제의 효과에 대한 것이다. 본 발명의 조성물은 피부의 밀착연접을 완화하여 외부 물질의 피내 흡수 촉진 효과가 현저하므로, 의학 및 미용 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 네프린 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 투과 촉진용 조성물에 관한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 일 구체예에서 “상피 조직”이란, 동물에서 몸의 외표면이나 체강 및 위, 장과 같은 내장성 기관의 내면을 싸고 있는 세포조직으로서, 크게 덮개상피(covering epithelium)와 샘상피(glandular epithelium)로 구분된다. 바깥쪽의 덮개상피는 신체의 외부 표면이나 다른 세포, 내강(lumen) 또는 외계에 닿아 있으며, 아래쪽의 덮개상피는 기저막이 있어 결합조직과 연결된다. 덮개상피에서 기원한 샘상피는 여러 물질을 분비하는 세포로 구성되어 있어 분비상피라고도 하며, 다른 조직과 함께 샘(gland)을 이룬다. 각 조직을 구성하고 있는 상피는 밀집하고 있어 세포 사이를 채우는 물질은 매우 적은 편이다. 본 발명에 있어서, 상피 조직은 바람직하게는 덮개상피이고, 더욱 바람직하게는 피부이며, 더욱 바람직하게는 표피이나, 이에 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서 “네프린(nephrin)”이란, 신장의 족세포(podocyte)의 틈새막(slit membrane) 단백들 중 하나로서, 신장 여과 기능을 원활히 구현하기 위해 중요한 단백질이다. 신장 기능에 장애가 발생하면 소변으로 네프린이 대량 방출되는 것으로 알려져 있으므로, 신장 기능 검사의 지표로 이용된다. 사람의 네프린 유전자는 서열번호 1로 표시된다.

본 발명의 일 구체예에서 “네프린 억제제”란, 네프린 유전자 또는 단백질의 발현을 억제 가능한 제제를 통칭한다. 상기 유전자의 발현 억제제는 네프린 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성된 군으로부터 선택된 것인 조성물이며, 상기 단백질의 활성 억제제는 네프린 단백질에 특이적인 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 것인 조성물을 제공한다.

상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)으로서, 생체 내 뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다. 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

상기 siRNA(small interfering RNA)는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 사용된다. 본 발명에서 siRNA 분자가 이용되는 경우, 센스 가닥(네프린 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(네프린 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조 또는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 불일치(mismatch)(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 팽창/돌출(bulge)(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. siRNA 말단 구조는 네프린 유전자의 발현을 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다. 상기 siRNA분자는 이에 제한되지는 않으나, 전체 길이가 15 내지 30 염기, 바람직하게는 19 내지 21 염기일 수 있다.

상기 shRNA(short hairpin RNA)은 45 내지 70 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서, 타겟유전자 siRNA 염기서열의 센스가닥과 상보적인 안티센스가닥 사이에 3-10개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후, 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노 바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 루프(loop)가 있는 헤어핀 구조의 shRNA가 만들어지고 세포내의 다이서(dicer)에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다.

상기 마이크로 RNA(microRNA)는 발생, 분화, 증식, 보존 및 아폽토시스 등 다양한 생물학적 과정을 조절한다. 마이크로 RNA는 일반적으로 타겟 mRNA를 불안정하게 하거나, 번역을 방해함으로써 타겟 mRNA를 코딩하는 유전자의 발현을 조절한다.

상기 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예를 들어, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 그의 결합) 역시 당분야에서 공지된 내용으로부터 적절히 선택할 수 있으며, 상기 유전자의 발현 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 또는 마이크로RNA 외에도 상기 유전자의 발현을 억제하는 물질이면 어떤 것이든 가능하다.

상기 항체란, 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 유효성분인 네프린 유전자로부터 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 보다 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(Light chain) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(Heavy chain)를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 발명자들은 네프린 억제제가 피부 각질세포에서 밀착연접(tight junction)을 완화시키는 효과가 있음을 확인하였다. 상기 피부의 밀착연접은 세포연접의 한 종류로서, 연결되어 있는 세포 사이의 물질 이동을 제한한다. 따라서 네프린 억제제의 밀착연접 완화효과는 피부를 통한 물질 흡수를 용이하게 하므로, 다양한 약학조성물 또는 화장료조성물의 경피 흡수 촉진을 위한 보조 조성물로 이용 가능하다.

본 발명의 일 구체예에서 “경피 흡수”란, 경구 또는 주사 투여 대신에 피부를 통하여 약물을 삼투 흡수시켜 투여하는 약물전달방법을 의미한다. 약물을 피부에 도포하여 일정 시간당 일정 농도를 흡수시키므로, 혈중의 약물 농도를 일정하게 유지 가능한 이점이 있다. 일예로, 협심증 치료제인 니트로글리세린을 첨부한 테이프 등이 임상에서 이용되고 있다. 그러나 경피 흡수를 이용한 약물전달에서의 흡수율을 효율적으로 높이기 위해서, 피부 장벽을 해결하는 것이 중요한 과제이다.

피부는 전신을 둘러싸며 크게 표피, 진피, 피하지방의 3층 구조로 이루어져 있다. 이 중 최외각에 위치한 표피에는 각질층(stratum corneum)이 존재함으로써 외부의 여러 자극원으로부터 인체를 보호하는 피부장벽의 역할을 한다. 각질층(stratum corneum)은 편평한 모양의 각화세포가 여러층으로 이루어져 있으며 케라틴이라고 불리는 소수성의 불용성 섬유상 단백질이 각질세포를 채우고 있고, 각질세포 사이사이를 세라마이드, 자유지방산, 콜레스테롤 등으로 구성된 세포간지질이 채우고 있는 ‘라멜라 구조’를 이루고 있다. 이러한 구조적 특징으로 인해 피부의 수분 증발은 억제되고, 외부의 스트레스나 해로운 자극으로부터 인체를 효과적으로 보호할 수 있게 되었지만 약학조성물 또는 화장품의 유효성분 또한 쉽게 흡수되지 못하게 되었다(Drug Discovery Today. Technologies., 2: 67-74, 2005). 각질층의 지질은 다른 일반적인 생체막들과는 다르게, 인지질이 아닌 세라마이드(ceramid), 콜레스테롤(cholesterol), 자유지방산(free fatty acid)으로 이루어져있다. 인지질(phospholipid), 스핑고미엘린(sphingomyelin), 콜레스테롤을 함유하는 보통의 생체막은 수분이나 물에 잘 녹는 분자량이 낮은 물질에 대한 투과성이 강해 장벽으로서의 역할을 잘 수행하지 못한다. 그러나 각질층의 세라마이드, 콜레스테롤, 자유지방산 등의 지질은 직선적으로 잘 연결되어 있어 수분과 친수성 물질의 투과를 억제하는 훌륭한 장벽기능을 수행한다. 각질층을 통한 물질의 흡수는 세포간 경로와 직접 세포투과(transcellular)경로를 통하여 이루어진다.

따라서, 경피 흡수를 통한 약물전달방법에 있어서, 어떻게 하면 유효성분을 피부에 자극을 주지 않으면서 흡수를 촉진시키고 효과를 최대화 할 수 있는가 하는 것이 기술적 과제로 남아있는 실정이다.

본 발명의 일 구체예에서 “개질”이란, 대상의 물리적 또는 화학적 성질을 변화시킨다는 것으로, 대상의 구조를 변화시키거나, 전기전도도를 변화시키거나, 친수/친유 성질을 변화시키거나, 대상에 포함된 특정 성분의 함량을 변화시키는 것 등의 개념을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서 “마이크로 구조체”란, 마이크로니들, 마이크로블레이드, 마이크로나이프, 마이크로파이버, 마이크로스파이크, 마이크로프로브, 마이크로발브(microbarb), 마이크로어레이 또는 마이크로전극 등을 포함하는 것으로, 상기에 제한되는 것은 아니나, 특히 본 발명에 있어서는 마이크로니들인 것이 바람직하다. 의학적 용도로 사용되는 마이크로니들을 제조하는 경우, 구성물질은 "생체적합성 또는 생분해성 물질"인 것이 바람직하다. 상기의 "생체적합성 물질"이란 인체에 독성이 없고 화학적으로 불활성인 물질을 의미하고, "생분해성 물질"은 생체 내에서 체액, 효소 또는 미생물 등에 의해서 분해될 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서 “마이크로니들(microneedle)”이란, “미세침”으로도 명명되며, 미세한 침으로 피부에 구멍을 내 약물 침투를 증가시키는 기술을 의미한다. 주로 생체 내 약물 전달, 채혈, 체내 분석물질 검출 등에 사용된다. 피부는 표피로부터 각질층 (< 20 ㎛), 외피(epidermis) (< 100 ㎛) 및 진피 (dermis) (300 ~ 2,500 ㎛)로 구성되어 있으므로, 특정 피부층에 통증 없이 약물 및 생리활성물질을 전달하기 위해서는 마이크로니들 상단 부 직경을 30 ㎛ 이내, 유효길이는 200 ~ 2,000 ㎛, 피부관통을 위한 충분한 경도를 갖도록 제작하는 것이 약물과 피부미용성분의 전달에 효과적이다. 또한, 생분해성 솔리드 마이크로니들을 통해 약물 및 생리활성물질 등을 전달하기 위해서는 마이크로니들 제조공정 가운데 고열처리, 유기용매 처리 등 약물 및 생리활성물질의 활성을 파괴할 수 있는 공정을 배제할 수 있어야 한다.

본 발명에 있어서, 마이크로니들은 본 발명의 네프린 억제제를 유효성분으로 포함하는 것으로서, 마이크로니들의 본연의 목적인 약리 성분의 피내 침투를 용이하게 한다.

본 발명의 일 구체예에서 “화장료조성물”이란, 미용 목적으로 화장료에 포함되는 조성물이다. 본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 화장료조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜워시, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다. 상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다. 지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸알콜, 옥틸도데칸올, 올레일알콜, 판텐올, 라놀린알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다. 그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.

본 발명의 일 구체예에서, 네프린 억제제를 유효 성분으로 포함하는 경피 흡수 촉진용 조성물을 제공하고, 상기 네프린 억제제는 네프린 유전자의 발현 억제제인 경피 흡수 촉진용 조성물을 제공하며, 상기 네프린 유전자의 발현 억제제는 네프린 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로 RNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 경피 흡수 촉진용 조성물을 제공하며, 상기 네프린 억제제는 네프린 단백질의 발현 억제제인 경피 흡수 촉진용 조성물을 제공하며, 상기 네프린 단백질의 발현 억제제는 네프린 특이적인 항체를 포함하는 경피 흡수 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 네프린 억제제를 유효 성분으로 포함하는 화장료조성물을 제공하고, 상기 화장료조성물은 미백, 보습, 주름개선, 피부 표면 개질, 제모 또는 문신용인 화장료조성물을 제공하며, 상기 화장료조성물은 액상, 콜로이드, 겔, 크림, 또는 패치 형태로 제공되는 것인 화장료조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 네프린 억제제를 유효 성분으로 포함하는 마이크로 구조체 조성물을 제공하고, 상기 마이크로 구조체는 마이크로니들, 마이크로블레이드, 마이크로나이프, 마이크로파이버, 마이크로스파이크, 마이크로프로브, 마이크로발브(microbarb), 마이크로어레이 또는 마이크로전극인 마이크로 구조체 조성물을 제공하며, 상기 마이크로 구조체는 마이크로니들인 마이크로 구조체 조성물을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명은 상기의 네프린 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 투과 촉진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 네프린 억제제는 피부 각질세포에서 밀착연접을 완화시키는 효과가 있으므로, 다양한 약학조성물 또는 화장료조성물의 경피 흡수 촉진을 위한 보조 조성물로 의학 및 미용 분야에서 크게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 피부 조직에서 네프린 발현을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 피부 조직에서 네프린 발현을 면역형광염색으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 피부 조직에서 네프린 발현을 면역조직화학염색으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 피부 조직에서 네프린 발현을 면역형광염색 및 위상차 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, 피부 조직에서 네프린 발현을 전자현미경 면역염색으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 각질세포에서 염화칼슘 농도에 따른 네프린의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 각질세포에서 네프린 발현 억제제(siRNA) 처리 시 세포 밀착연접의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, 각질세포에서 네프린 발현 억제제(siRNA) 처리 시 신장 기능 및 세포고사 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, 각질세포에서 네프린의 상처 치유 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 피부 조직에서 네프린 발현의 확인

신장에서 발현된다고 알려진 네프린이 피부 조직에서도 발현된다는 것을 증명하기 위하여, 사람 각질세포 및 멜라닌세포 등으로부터 네프린의 발현 정도를 확인하였다.

먼저, 웨스턴 블랏팅으로 네프린 단백질의 발현을 확인하기 위해 사람의 표피 시료로부터 분리한 각질세포(Keratinocyte, passage 6)와 멜라닌세포(Melanocyte, passage 4), 사람 각질 세포주(HaCaT), 및 사람 멜라닌 형성 세포주(Hermes-1)를 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)로 용해하고, 단백질이 포함된 용액만을 원심분리 분획 추출하여 브래드포드(Bradford) 방법으로 정량화하였다. 각 시료당 20㎍ 농도의 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔에서 단백질 크기별로 분리하고, 니트로셀룰로오즈(nitrocellulose) 막으로 전이한 뒤, 항-네프린 1차 항체(ab 58968, abcam)로 4℃ 조건에서 하룻밤(overnight) 동안 반응시키고, 2차 항체를 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 시각화를 위해서는 화학 발광 시스템(Enhanced chemiluminescence system)을 이용하였다. 상기 웨스턴 블랏팅에서는 쥐의 신장 조직을 양성대조군으로, 정상 성인 신장 기원의 불멸화된 근위 세뇨관 상피 세포주(HK-2)를 음성대조군으로 세팅하였다. 상기 웨스턴 블랏팅 결과를 도 1에 나타내었다.

또한 사람 표피 조직에서의 네프린 발현을 면역형광염색한 결과를 도 2에 나타내었고, 면역조직화학염색으로 확인한 결과를 도 3에 나타내었으며, 면역형광염색한 조직을 위상차 촬영한 결과를 도 4에 나타내었으며, 전자현미경 면역염색한 결과를 도 5에 나타내었다.

상기 도 1 내지 도 5에서와 확인한 바와 같이, 네프린이 표피를 구성하는 각질세포 및 멜라닌세포에서도 발현된다는 것을 알 수 있었다.

실시예 2: 각질세포에서 염화칼슘 농도에 따른 네프린의 발현 변화 확인

사람의 표피 시료로부터 분리한 각질세포(Keratinocyte, passage 3)에 염화칼슘(CaCl₂)을 첨가 시, 염화칼슘 농도에 따른 네프린의 발현 변화를 확인하였다. 이를 위해, 각질세포 배양액(keratinocyte growth medium, KGM)에 염화칼슘을 0.05, 0.5, 1, 또는 2 mM 농도로 첨가하고, 24시간 추가로 배양한 후, 실시예 1과 동일한 방법으로 세포 단백질 추출 및 웨스턴 블랏팅하였다. 1차 항체로는 항-네프린 1차 항체(Anti-Nephrin antibody, ab 58968, abcam), 또는 항-인볼루크린 1차 항체(Anti-Involucrin antibody, ab 68, abcam)를 이용하였다. 상기 결과를 도 6에 나타내고, 정량화 값을 표 1에 나타내었다.

CaCl₂(mM)	인볼루크린	네프린
0	100.0	100.0
0.05	112.8	146.1
0.5	115.7	126.7
1	129.0	164.8
2	143.7	78.0

실험 결과, 칼슘 이온 농도를 증가시켜 각질형성세포를 분화 유도를 시켰을 때, 네프린 및인볼루크린 세포 분화 단백이 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 시험된 농도 범위에서 인볼루크린이 칼슘 농도에 비례해서 발현이 증가하는 데 비하여, 네프린은 칼슘 농도 비례 증가하다가 고농도(2 mM)에서 발현이 감소되는 것으로 나타났다.

실시예 3: 각질세포에서 네프린 발현 억제제( siRNA ) 처리 시, 세포 변화 확인

사람의 표피 시료로부터 분리한 각질세포(Keratinocyte, passage 3)에 네프린 유전자의 발현 억제제인 siRNA(1104826, Bioneer)를 처리 시, 세포의 변화를 확인하였다. 이를 위해, 각질세포 배양액(keratinocyte growth medium, KGM)에 siRNA 를 10 nM 농도로 첨가하고, 48시간 추가로 배양한 후, 실시예 1과 동일한 방법으로 세포 단백질 추출 및 웨스턴 블랏팅하였다. 1차 항체로는 항-네프린 1차 항체(Anti-Nephrin antibody, ab 58968, abcam), 항-폐쇄소대 1차 항체(Anti-Zonula occludens 1 antibody, 61-7300, Invitrogen), 또는 항-클라우딘 1차 항체(Anti-Claudin 1 antibody, 37-4900, Thermo scientific)를 이용하였다. 폐쇄소대(Zonula occludens 1, ZO-1) 및 클라우딘(Claudin 1)은 세포의 밀착연접을 구성하는 단백질이다. 상기 siRNA 처리 후 세포의 형태 및 웨스턴블랏팅 결과를 도 7에 나타내었다.

실험 결과, siRNA로 네프린의 발현을 억제 시, 세포의 응집에 감소되고, ZO-1 과 같은 밀착연접 단백질의 발현도 함께 감소되는 것을 확인하였다.

또한 각질세포에 네프린 유전자의 발현 억제제인 siRNA를 20 nM 농도로 첨가 시, 세포고사 정도를 측정하였다. 상기와 동일하게 siRNA 처리 후, 세포를 48시간 추가로 배양하고, 세포의 형태 촬영 및 웨스턴 블랏팅하였다. 신장 마커로서 1차 항체는 항-포도신 1차 항체(Anti-Podocin antibody, sc-21009, Santa Cruz Biotechnology), 또는 항-신세뇨관 단백질 1차 항체(Anti-CD2AP antibody, sc-9137, Santa Cruz Biotechnology)를 이용하였고, 세포고사의 마커로서 1차 항체는 항-카스파제 3 1차 항체(Anti-Caspase 3 antibody, #9662, Cell signaling), 또는 항-분열 카스파제 3 1차 항체(Anti-Cleaved Caspase 3 antibody, #9664, Cell signaling)를 이용하였다. 상기 siRNA 처리 후 세포의 형태 및 웨스턴블랏팅 결과를 도 8에 나타내었다.

실험 결과, siRNA로 네프린의 발현을 억제 시, 신장 기능과 관련된 단백질 중 CD2AP의 감소가 관찰되었으며, 분열 카스파제 3 단백질도 감소되어 세포고사가 증가하는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: 각질세포에서 네프린의 상처 치유 효과 확인

사람의 표피 시료로부터 분리한 각질세포(Keratinocyte, passage 2)를 이용하여, 네프린이 피부 상처 치유에 기여하는 효과를 확인하였다. 이를 위해, 세포를 12-웰 배양접시에 5 x 10⁵/웰의 밀도로 배양하였고, 단층의 시트(sheet)를 형성한 세포의 중심부를 팁으로 긁는 방법으로 도말하였다. 이후, 세척하여 도말에 의한 세포 잔해를 제거하고, 네프린 유전자의 발현 억제제인 siRNA를 20 nM 농도로 첨가한 후, 24시간까지 추가로 배양하여 각질세포의 이동성을 평가하였다. 상기의 세포 이동 결과를 도 9에 나타내었다.

실험 결과, 네프린 발현이 억제된 세포는 이동성이 현저히 저하되어, 상처 치료 효과가 감소되는 것을 확인하였다. 이는 피부 조직에서 네프린 발현이 상처 치유에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> A composition for accelerating skin permeation comprising a nephrin inhibitor <130> DPB173710 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5024 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aggggaagag gaaaacgaga aagggaggag agtaacggaa agagataaaa aagaaaagca 60 ggtggcagag acacacagag agggacccag agaaagccag acagacgcag gtggctggca 120 gcgggcgctg tgggggtcac agtaggggga cctgtgatgg ccctggggac gacgctcagg 180 gcttctctcc tgctcctggg gctgctgact gaaggcctgg cgcagttggc gattcctgcc 240 tccgttcccc ggggcttctg ggccctgcct gaaaacctga cggtggtgga gggggcctca 300 gtggagctgc gttgtggggt cagcacccct ggcagtgcgg tgcaatgggc caaagatggg 360 ctgctcctgg gccccgaccc caggatccca ggcttcccga ggtaccgcct ggaaggggac 420 cctgctagag gtgaattcca cctgcacatc gaggcctgtg acctcagcga tgacgcggag 480 tatgagtgcc aggtcggccg ctctgagatg gggcccgagc tcgtgtctcc cagagtgatc 540 ctctccatcc tggttcctcc caagctgctc ctgctgaccc cagaggcagg caccatggtc 600 acctgggtag ctgggcagga gtacgtggtc aactgtgtgt 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Claims

네프린 유전자의 발현 억제제를 유효 성분으로 포함하는 경피 흡수 촉진용 조성물로서,
상기 네프린 유전자의 발현 억제제는 서열번호 1로 표시되는 유전자에 특이적으로 결합하는 siRNA인 것을 특징으로 하는, 경피 흡수 촉진용 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1항의 경피 흡수 촉진용 조성물을 포함하는 화장료조성물.
제 6항에 있어서,
상기 화장료조성물은 미백, 보습, 주름개선, 피부 표면 개질, 제모 또는 문신인, 화장료조성물.
제 6항에 있어서,
상기 화장료조성물은 액상, 콜로이드, 겔, 크림, 또는 패치 형태로 제공되는 것인, 화장료조성물.
제 1항의 경피 흡수 촉진용 조성물을 포함하는, 마이크로 구조체 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 마이크로 구조체는 마이크로니들, 마이크로블레이드, 마이크로나이프, 마이크로파이버, 마이크로스파이크, 마이크로프로브, 마이크로발브(microbarb), 마이크로어레이 또는 마이크로전극인, 마이크로 구조체 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 마이크로 구조체는 마이크로니들인, 마이크로 구조체 조성물.