KR101765417B1 - Tenc1의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 TENC1(Tensin like C1 domain containing phosphatase)의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 TENC1의 발현이 당뇨병의 신장조직이나 고혈당상황을 준 사구체 발세포주에서 증가함을 확인하였고, TENC1의 티로신 인산가수분해효소(PTPase) 활성이 네프린(nephrin)의 인산화를 억제하여 발세포의 여과도에 영향을 주고 결과적으로 발세포 비대증을 유도한다는 것을 실험적으로 증명함으로써 당뇨병성 신증 치료의 새로운 표적을 제시하였다. 이에, 본 발명에 따른 TENC1 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 TENC1에 의한 네프린의 탈인산화를 억제함으로써 당뇨병성 신증의 초기단계에서부터 손상이 유도되는 발세포를 보호하고 이의 구조 및 여과기능을 유지시킬 수 있으므로 당뇨병성 신증의 초기단계에서부터 예방 또는 치료에 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에서는 TENC1의 발현이 당뇨병의 신장조직이나 고혈당상황을 준 사구체 발세포주에서 증가함을 확인하였고, TENC1의 티로신 인산가수분해효소(PTPase) 활성이 네프린(nephrin)의 인산화를 억제하여 발세포의 여과도에 영향을 주고 결과적으로 발세포 비대증을 유도한다는 것을 실험적으로 증명함으로써 당뇨병성 신증 치료의 새로운 표적을 제시하였다. 이에, 본 발명에 따른 TENC1 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 TENC1에 의한 네프린의 탈인산화를 억제함으로써 당뇨병성 신증의 초기단계에서부터 손상이 유도되는 발세포를 보호하고 이의 구조 및 여과기능을 유지시킬 수 있으므로 당뇨병성 신증의 초기단계에서부터 예방 또는 치료에 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 TENC1(Tensin like C1 domain containing phosphatase)의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
고령화 사회가 지속됨에 따라 당뇨를 포함한 대사성 질환은 점점 증가하고 있는 추세이다. 당뇨는 대표적인 대사성 질환으로 췌장에서 인슐린 분비가 정상적으로 이루어지지 않거나 인슐린 신호전달의 문제로 인해 말초에서 인슐린 반응성이 감소하여 혈당 농도가 높게 유지되는 현상을 의미한다. 우리나라도 최근 들어 사회 경제적인 발전으로 인해 당뇨병 인구가 늘고 있다. 2012년 대한당뇨병학회의 보고에 따르면 국내에 당뇨병을 진단받은 성인 인구는 약 320만 명으로 성인 10명 중 1명에 해당하며 성인 10명 중 2명이 당뇨병 전단계인 것으로 보고되었다. 이러한 추세가 지속된다면 2050년도 우리나라 당뇨병 환자 수는 600만 명에 이를 것으로 추정되고 있다. 또한, 당뇨병 환자 중 본인이 당뇨임을 인지하는 경우는 73.4%에 불과하며 특히 30~44세의 젊은 연령층에서는 약 절반(45.6%)이 본인이 당뇨병임을 인지하지 못하고 있어 당뇨병 치료 지연으로 인해 당뇨 합병증 노출 위험성이 큰 상황이다.
망막병증, 신경병증과 더불어 당뇨의 주요 합병증 중의 하나인 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy; DN)은 당뇨환자의 20~40%에서 발생하며, 최근 당뇨병 환자의 증가로 인해 우리나라를 포함한 전 세계적으로 말기신부전(end-stage renal disease; ESRD)의 가장 주된 원인으로 보고되고 있다. 당뇨병성 신증 환자가 말기신부전에 이르게 되면 비가역적인 신장손상이 초래되어 뚜렷한 예방 및 치료방법이 없어 이식을 받을 때까지는 만성적으로 혈액투석이나 복막투석을 통한 신대체요법을 실시할 수밖에 없다. 이는 환자의 삶의 질을 급격히 저하시킬 뿐 아니라 지속적인 치료로 인해 천문학적인 의료비 증가를 초래하고 있다. 따라서 신장 섬유화가 진행되기 이전, 당뇨병성 신증의 초기단계에서 이를 인지하고 치료하여 말기신부전이 초래되는 것을 예방하는 것이 매우 중요하다.
기존의 당뇨병성 신증과 관련한 연구들은 대부분 사구체 메산지움(mesangium)의 증식 및 비대로 인한 사구체 경화증이나 신세뇨관 간질의 세포외 기질 축적에 의한 섬유화에 초점이 맞추어져 진행되어 왔다.
한편, 사구체 발세포(podocyte)는 신장의 정상 구조 및 소변 여과장치의 유지에 중요한 역할을 하며, 사구체 모세혈관 내의 혈액이 소변 여과장치를 통과하면서 소변을 형성하는데, 이중 가장 비깥층을 구성하는 여과장치이다. 발세포는 당뇨병성 신증의 초기단계에서부터 손상이 일어난다고 알려져 있으며, 발세포 수의 감소, 구조적 변화, 및 기능적 손상으로 인해 유발될 수 있다. 당뇨병성 신증의 초기에 사구체 내 다른 세포의 수는 변화가 없는 반면 발세포 수의 감소가 관찰되며, 발세포 발돌기의 소멸, 발돌기의 너비 증가 및 세극막(slit diaphragm; SD) 밀도 감소 등의 구조적 변화가 관찰된다. 당뇨병에서 고포도당, 후기당화산물, 안지오텐신 Ⅱ, 고혈압 또는 신장 내압의 증가와 관련된 물리적인 세포 신장, 활성산소종, 전환성장인자 등이 사구체 발세포의 손상 기전이 될 수 있다고 알려져 있다. 그러므로 당뇨병성 신증에서 발세포의 변화를 관찰/이해하는 것은 초기 당뇨병성 신증의 진단, 예방, 및 치료에 매우 중요하다고 할 수 있다. 그러나 아직까지 이러한 손상 기전에 대한 연구동향은 다른 사구체 세포인 메산지움으로 기존에 진행되었던 틀에서 크게 벗어나지 않고 있어 새로운 시각에서 발세포 손상 기전을 연구하는 것이 필요한 상황이다.
네프린(Nephrin)은 발세포의 막 단백질로 세극막을 구성하고 있다. 네프린의 세포 외 도메인(extracellular domain)은 인접한 돌기에서 뻗어나온 다른 네프린과 결합하여 세극막 형성에 중심적인 역할을 하고, 네프린의 세포 내 도메인(intracellular domain)은 세포 내에서 CD2AP나 Neph1, podocin 등과 같은 단백질과 결합하여 발세포의 구조를 유지하게 된다. 네프린 유전자의 돌연변이는 태아에서부터 심한 단백뇨 및 신증후군을 보이는 핀란드형 선천성 신증후군(congenital nephrotic syndrome of Finnish type)을 초래한다는 것이 확인되면서 사구체 여과 기전에서 네프린의 중요성이 조명받기 시작했다. 최근에는 네프린의 세포 외 도메인이 세극막을 형성할 뿐만 아니라 세포 내 도메인의 티로신(tyrosine) 잔기가 src-kinase family인 Fyn에 의해 인산화되어 발세포 내의 신호전달에 관여할 수 있다는 가능성이 제시되었다. 현재까지 진행된 연구결과에서는 주로 네프린의 인산화 된 부분을 SH2(Src homology 2) domain을 가지는 Nck(non-catalytic region of tyrosine kinase adaptor protein 1)나 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)가 인식하여 이를 경유한 액틴 세포골격 조절을 통해 발세포 구조 유지에 중요한 역할을 하는 것에 대해 초점이 맞추어져 연구가 진행되어 왔다. 그러나 아직까지 네프린 인산화를 경유한 발세포 내 하위 신호전달 및 그 조절자에 대한 연구는 미비한 실정이다. 특히 네프린의 인산화가 신장 손상 상황에서 감소되는 연구가 보고 되었음에도 불구하고 네프린의 탈 인산화를 매개하는 티로신 인산가수분해효소(protein tyrosine phosphatase; PTPase)에 대한 연구는 거의 없어 네프린의 탈 인산화를 매개로 한 발세포 손상 및 신장 손상 진행 기전을 이해하기 위한 연구가 필요하다.
본 발명자들은, 상기와 같은 종래의 문제점 해결을 위하여, 당뇨병성 신증 초기에 발세포 네프린의 탈 인산화에 의한 발세포 손상, 나아가 신장의 손상 기전을 연구하던 중 티로신 인산가수분해효소 활성을 가지는 TENC1(Tensin-like C1 domain-containing phosphatase)이 당뇨 환자의 신장에서 높게 발현하는 것에 착안하여 이를 연구한 결과, 당뇨병성 신증에서 TENC1이 발세포 네프린의 탈인산화를 매개함을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 TENC1의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TENC1(Tensin-like C1 domain-containing phosphatase)의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 TENC1의 활성 억제제는 나프토퀴논(Naphthoquinone)계 화합물일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 나프토퀴논계 화합물은 디하이드로탄시논(Dihydrotanshinone: (1R)-1,6-dimethyl-1,2-dihydronaphtho[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dione), 크립토탄시논(Cryptotanshinone: (1R)-1,6,6-trimethyl-2,7,8,9-tetrahydro-1H-naphtho[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dione), 베타라파촌(β-Lapachone: 2,2-dimethyl-3,4-dihydrobenzo[h]chromene-5,6-dione), 및 스트렙토니그린(Streptonigrin: (4Z)-5-amino-6-(7-amino-6-methoxy-5,8-dioxoquinolin-2-yl)-4-(4,5-dimethoxy-6-oxocyclohexa-2,4-dien-1-ylidene)-3-methyl-1H-pyridine-2-carboxylic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 나프토퀴논계 화합물은 디하이드로탄시논(Dihydrotanshinone)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 TENC1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 TENC1의 활성 억제제는 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성을 저해하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 TENC1에 의한 네프린(nephrin)의 탈인산화를 억제함으로써 사구체 발세포 보호효과를 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 약리학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 보조제(additive)를 더 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물의 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에서는 TENC1의 발현이 당뇨병의 신장조직이나 고혈당 상황을 준 사구체 발세포주에서 증가함을 확인하였고, TENC1의 티로신 인산가수분해효소(PTPase) 활성이 네프린(nephrin)의 인산화를 억제하여 발세포의 여과도에 영향을 주고 결과적으로 발세포 비대증을 유도한다는 것을 실험적으로 증명함으로써 당뇨병성 신증 치료의 새로운 표적을 제시하였다. 이에, 본 발명에 따른 TENC1의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 TENC1에 의한 네프린의 탈인산화를 억제함으로써 당뇨병성 신증의 초기단계에서부터 손상이 유도되는 발세포를 보호하고 이의 구조 및 여과기능을 유지시킬 수 있으므로 당뇨병성 신증의 초기단계에서부터 예방 또는 치료에 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은, 스트렙토조토신(streptozotocin; STZ)을 투여하여 제1형 당뇨병을 유발시킨 흰 쥐의 신장에서 웨스턴 블롯팅을 통해 TENC1 단백질의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 2는, 고농도의 포도당을 처리한 분화된 발세포주에서 웨스턴 블롯팅을 통해 TENC1 단백질의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 3은, 아데노바이러스를 이용해 분화된 발세포주에 TENC1 WT과 티로신 인산가수분해효소 활성이 없는 TENC1 변이체를 과발현시켜 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의한 발세포주 비대 유도를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는, 고농도의 포도당을 처리한 분화된 발세포주에서 S6K의 인산화가 증가됨을 확인함으로써 mTORC1 신호전달의 활성화를 확인한 결과이다.
도 5a는, 분화된 발세포주에서 TENC1의 처리 농도에 의존적으로 S6K의 인산화 증가를 통해 mTORC1 신호전달의 활성화를 확인한 것이며, 도 5b는, TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의해 mTORC1의 활성화가 유도됨을 보여주는 결과이다.
도 6은, 네프린(nephrin)을 과발현시킨 세포주(293NPH)에서 Fyn에 의해 인산화된 네프린과 TENC1의 결합을 면역침강법을 통해 확인한 결과이다.
도 7a는, 분화된 발세포주에 포도당을 고농도로 처리하였을 때 네프린의 인산화 및 PI3K와의 결합이 감소됨을 확인한 결과이며, 도 7b는, 네프린을 과발현시킨 세포주(293NPH)에 Fyn을 과발현시켜 네프린의 인산화를 유도한 후 TENC1 WT 또는 TENC1 변이체를 과발현시킨 경우 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의해 네프린의 탈인산화가 유도됨을 확인한 결과이다.
도 8은, 천연물 라이브러리로부터 TENC1 활성 억제제를 스크리닝하기 위해 Malachite Green assay를 수행하여 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성 저해효과를 측정한 결과이다.
도 9는, 제2형 당뇨병 모델인 db/db 생쥐에 TENC1 활성 억제제의 대표 물질로 선정한 디하이드로탄시논(DHTS)을 투여하였을 때 공복혈당에 영향을 미치지 않음을 나타내는 결과이다.
도 10은, 디하이드로탄시논 투여가 당뇨병성 신증에서 나타나는 신장 비대증에 미치는 영향을 확인하기 위해, 생쥐의 신장무게와 체중간의 비율을 측정한 결과 디하이드로탄시논을 투여한 db/db 생쥐의 신장에서는 db/db에서 관찰되는 신장비대증이 관찰되지 않음을 확인한 결과이다.
도 11a는, db/db 생쥐에서 당뇨병성 신증의 진행으로 인해 증가된 단백뇨가 디하이드로탄시논 투여에 의해 감소됨을 알부민 ELISA를 통해 확인한 결과이며, 도 11b는, 분화된 발세포주에 포도당을 고농도로 처리하여 발세포의 여과기능을 손상시킨 경우 디하이드로탄시논 처리에 의해 손상정도가 개선됨을 단백질 정량을 통해 확인한 결과이다.
도 12는, db/db 생쥐의 신장에서 감소된 네프린의 인산화가 디하이드로탄시논 투여에 의해 복구되는 것을 면역침강법을 통해 확인한 결과이다.
도 13은, db/db 생쥐에서 증가된 mTORC1 신호전달의 활성화가 디하이드로탄시논 투여에 의해 효과적으로 개선되는 것을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다.
도 2는, 고농도의 포도당을 처리한 분화된 발세포주에서 웨스턴 블롯팅을 통해 TENC1 단백질의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 3은, 아데노바이러스를 이용해 분화된 발세포주에 TENC1 WT과 티로신 인산가수분해효소 활성이 없는 TENC1 변이체를 과발현시켜 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의한 발세포주 비대 유도를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는, 고농도의 포도당을 처리한 분화된 발세포주에서 S6K의 인산화가 증가됨을 확인함으로써 mTORC1 신호전달의 활성화를 확인한 결과이다.
도 5a는, 분화된 발세포주에서 TENC1의 처리 농도에 의존적으로 S6K의 인산화 증가를 통해 mTORC1 신호전달의 활성화를 확인한 것이며, 도 5b는, TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의해 mTORC1의 활성화가 유도됨을 보여주는 결과이다.
도 6은, 네프린(nephrin)을 과발현시킨 세포주(293NPH)에서 Fyn에 의해 인산화된 네프린과 TENC1의 결합을 면역침강법을 통해 확인한 결과이다.
도 7a는, 분화된 발세포주에 포도당을 고농도로 처리하였을 때 네프린의 인산화 및 PI3K와의 결합이 감소됨을 확인한 결과이며, 도 7b는, 네프린을 과발현시킨 세포주(293NPH)에 Fyn을 과발현시켜 네프린의 인산화를 유도한 후 TENC1 WT 또는 TENC1 변이체를 과발현시킨 경우 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의해 네프린의 탈인산화가 유도됨을 확인한 결과이다.
도 8은, 천연물 라이브러리로부터 TENC1 활성 억제제를 스크리닝하기 위해 Malachite Green assay를 수행하여 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성 저해효과를 측정한 결과이다.
도 9는, 제2형 당뇨병 모델인 db/db 생쥐에 TENC1 활성 억제제의 대표 물질로 선정한 디하이드로탄시논(DHTS)을 투여하였을 때 공복혈당에 영향을 미치지 않음을 나타내는 결과이다.
도 10은, 디하이드로탄시논 투여가 당뇨병성 신증에서 나타나는 신장 비대증에 미치는 영향을 확인하기 위해, 생쥐의 신장무게와 체중간의 비율을 측정한 결과 디하이드로탄시논을 투여한 db/db 생쥐의 신장에서는 db/db에서 관찰되는 신장비대증이 관찰되지 않음을 확인한 결과이다.
도 11a는, db/db 생쥐에서 당뇨병성 신증의 진행으로 인해 증가된 단백뇨가 디하이드로탄시논 투여에 의해 감소됨을 알부민 ELISA를 통해 확인한 결과이며, 도 11b는, 분화된 발세포주에 포도당을 고농도로 처리하여 발세포의 여과기능을 손상시킨 경우 디하이드로탄시논 처리에 의해 손상정도가 개선됨을 단백질 정량을 통해 확인한 결과이다.
도 12는, db/db 생쥐의 신장에서 감소된 네프린의 인산화가 디하이드로탄시논 투여에 의해 복구되는 것을 면역침강법을 통해 확인한 결과이다.
도 13은, db/db 생쥐에서 증가된 mTORC1 신호전달의 활성화가 디하이드로탄시논 투여에 의해 효과적으로 개선되는 것을 웨스턴 블롯팅을 통해 확인한 결과이다.
본 발명자들은 티로신 인산가수분해효소 활성을 가지는 TENC1이 당뇨 환자의 신장에서 높게 발현하는 것에 착안하여 이를 연구한 결과 당뇨병성 신증에서 TENC1이 사구체 발세포 단백질인 네프린의 탈인산화를 매개함을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 TENC1(Tensin-like C1 domain-containing phosphatase)의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 TENC1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “당뇨병성 신증”이란 당뇨병에 의해 신장을 구성하는 기관 중 혈액 여과를 담당하고 있는 사구체가 손상되는 질환을 의미하며, 이로 인한 신장기능 저하에 의해 나타날 수 있는 모든 질환을 총칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병성 신증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병성 신증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일실시예에서는, TENC1이 당뇨 환자의 신장에서 높게 발현한다는 결과를 바탕으로 하여, 제1형 당뇨병을 유발시킨 흰 쥐의 신장조직에서 TENC1의 발현이 정상 신장조직에서보다 증가되어 있음을 확인하였으며, 당뇨병성 신증의 초기 단계에서부터 손상된다고 알려진 사구체 발세포에 당뇨병성 신증의 주요 원인인 고혈당 환경을 주기 위해 고농도의 포도당을 처리하였을 때 TENC1의 발현이 증가되는 것을 확인하였다(실시예 1 참조). 상기 고포도당 조건에서 과발현된 TENC1은 실제로 발세포의 현저한 비대를 유도하였으며, 이는 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의한 것임을 실험적으로 증명하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 사구체 발세포 비대증의 병리기전에 있어서 활성화된다고 알려진 mTORC1 신호전달 기전과 고포도당 환경에서 과발현되는 TENC1의 관련성을 검증하였다. mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)은 인슐린, 성장인자, 아미노산, 또는 산화적 스트레스에 반응하여 단백질의 합성을 조절하며, mTORC1 하위의 S6K 또는 4E-BP1(eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) binding protein 1)을 통해 신호전달이 활성화된다. mTORC1이 활성화되면 적어도 S6K1의 두 개의 잔기를 인산화시키며 단백질 합성을 개시한다. 따라서 발세포주에 고농도의 포도당을 처리하였을 때 S6K 인산화의 증가를 통해 mTORC1이 활성화됨을 확인하였으며, 이는 곧 과발현된 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의한 것임을 알 수 있었다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 당뇨병성 신증과 같은 신장손상 환경에서 발세포 특이적인 단백질인 네프린의 탈인산화에 대한 TENC1의 영향을 검증한 결과, Fyn에 의해 인산화된 네프린에 TENC1이 결합하는 것을 확인하였고, TENC1의 과발현을 야기하는 고포도당 환경에서 네프린의 티로신 잔기 인산화가 감소하였으며, 실제로 TENC1의 과발현에 의해 네프린 티로신 잔기의 탈인산화가 유도됨을 확인하였다(실시예 4 참조).
상기 결과들을 바탕으로 하여, 본 발명의 또 다른 실시예에서는, 네프린의 티로신 잔기의 탈인산화를 억제함으로써 발세포를 보호할 수 있는 TENC1의 활성을 저해하는 TENC1의 억제제를 발굴하기 위해 천연물 화합물 라이브러리를 이용한 스크리닝을 수행하였다. 상기 라이브러리 화합물들의 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성 저해 효과를 측정한 결과, 4개의 화합물에서 효과를 보였으며, 공통적으로 나프토퀴논(Naphthoquinone) 구조를 가지는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 스크리닝을 통해 도출된 화합물 중 대표물질로써 디하이드로탄시논을 선정하고 당뇨병성 신증 동물모델에서 그 효과를 검증하였다. 그 결과, 디하이드로탄시논 경구 투여는 제2형 당뇨모델에서 공복혈당에 변화를 주지 않음을 관찰하였으며, 이에 반하여 디하이드로탄시논의 경구 투여는 당뇨병성 신증에서 나타나는 신장 비대 및 단백뇨를 개선시키는 효과가 있음을 확인하였고, 나아가 이러한 개선 효과가 TENC1에 의한 네프린의 탈인산화 및 mTORC1의 신호 활성화 억제를 통해 이루어짐을 확인하였다(실시예 6 참고).
따라서 본 발명의 상기 TENC1 활성 억제제는 나프토퀴논계 화합물일 수 있고, 바람직하게는 디하이드로탄시논(Dihydrotanshinone: (1R)-1,6-dimethyl-1,2-dihydronaphtho[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dione), 크립토탄시논(Cryptotanshinone: (1R)-1,6,6-trimethyl-2,7,8,9-tetrahydro-1H-naphtho[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dione), 베타라파촌(β-Lapachone: 2,2-dimethyl-3,4-dihydrobenzo[h]chromene-5,6-dione), 및 스트렙토니그린(Streptonigrin: (4Z)-5-amino-6-(7-amino-6-methoxy-5,8-dioxoquinolin-2-yl)-4-(4,5-dimethoxy-6-oxocyclohexa-2,4-dien-1-ylidene)-3-methyl-1H-pyridine-2-carboxylic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 디하이드로탄시논일 수 있다.
상기 천연물로부터 유래된 화합물은 천연물로부터 직접 추출할 수 있으며, 화학적으로 합성된 것도 추출된 것과 동일한 TENC1 활성 억제 효과를 나타낸다는 것은 당업자에게 자명하다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 TENC1 활성 억제제를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물의 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 당뇨병성 신증 환경에서 TENC1의 발현 증가 확인
1-1. 당뇨병 유발 마우스 모델의 신장조직에서 TENC1 발현 증가 확인
본 발명자들은 선행 연구를 통해 TENC1(Tensin-like C1 domain-containing phosphatase)이 당뇨환경에서 근위축증에 관여하는 것을 확인한 것에 더불어, 데이터베이스를 통해 TENC1이 다른 장기들에 비하여 신장에서 높게 발현하는 것을 확인하였다. 따라서 상기 결과를 바탕으로, TENC1이 당뇨병에 의한 합병증 중 큰 부분을 차지하고 있는 당뇨병성 신증과 관련이 있는지 알아보고자 하였다.
TENC1과 당뇨병성 신증과의 관련성을 검증하기 위하여, 인슐린을 생성하는 췌장의 베타세포에 세포독성을 유발시켜 제1형 당뇨병 유발 동물모델 제작에 많이 이용되고 있는 화합물인 스트렙토조토신(streptozotocin; 이하, STZ)을 흰 쥐에 고용량으로 투여하여 제1형 당뇨병을 유발시켰다. 상기 당뇨병이 유발된 흰 쥐에서 신장을 적출한 후 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 수행하여 TENC1 단백질의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 당뇨병을 유도하지 않은 흰 쥐의 신장세포와 비교할 때 STZ으로 당뇨병을 유도한 흰 쥐의 신장세포에서 TENC1(C1-Ten)의 발현이 통계적으로 유의하게 증가되어있는 것을 알 수 있었다.
1-2. 고포도당을 처리한 사구체 발세포주에서 TENC1의 발현 증가 확인
실시예 1-1의 결과를 통해 당뇨병이 유발된 흰 쥐의 신장조직에서 TENC1의 발현이 증가되는 것을 확인하였으므로, 더 나아가 당뇨 초기 병변에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 사구체 발세포와 TENC1의 관련성을 알아보고자 하였다. 당뇨환경에서 증가하는 고혈당은 당뇨병성 신증에 작용하는 여러 가지 기전의 중심적인 역할을 하므로, 분화가 완료된 사구체 발세포주에 30 mmol/L 고농도의 포도당(glucose)을 처리한 후 웨스턴 블롯팅을 수행하여 TENC1 단백질의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 사구체 발세포주에 고농도의 포도당을 각각 12시간, 24시간, 48시간 동안 처리하였을 때 정상농도인 5 mmol/L의 포도당을 처리한 경우와 비교하여 TENC1의 발현이 증가되는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통하여 TENC1이 당뇨병성 신증과 연관되어 나타나는 사구체 발세포의 병리학적 증상과 관련이 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2. TENC1 과발현에 의한 사구체 발세포주의 비대 유도 확인
실시예 1의 결과를 바탕으로, 고포도당을 처리한 사구체 발세포주에서 발현이 증가된 TENC1이 실제로 신장에 어떠한 병리학적 증상을 유발하는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
GFP(green fluorescent protein)와 TENC1 발현벡터가 삽입된 아데노바이러스를 분화된 발세포주에 감염시켜 GFP와 TENC1 단백질을 발현하는 발세포주를 제작하였다. TENC1은 TENC1 wild type(WT) 또는 선행연구를 통해 밝힌 바와 같이 TENC1의 효과가 TENC1의 티로신 인산가수분해효소(protein tyrosine phophatase, PTPase) 활성 때문인지 검증하기 위하여 TENC1 단백질의 아미노산 231번 위치의 시스테인(cysteine)을 세린(serine)으로 치환하여 제조한 TENC1 변이체(TEN1 CS)를 이용하여 사구체 발세포주에 과발현시켰다. 상기 TENC1 변이체는 기질과는 안정적으로 결합하지만 촉매작용은 하지 못하도록 제작된 돌연변이체이다. 이후 분화된 발세포주의 크기를 GFP 발현에 의한 초록 형광을 이용하여 공초점 현미경(confocal microscope)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, GFP만을 발현시킨 세포(Ad-GFP)에 비하여 TENC1 WT을 과발현시킨 세포(Ad-C1 Ten WT)의 경우 그 크기가 현저히 커진 것을 관찰하였다. 또한, TENC1 변이체를 과발현시킨 세포(Ad-C1 Ten CS)의 경우 GFP만을 발현시킨 세포와 비슷한 크기임을 확인하였다. 따라서 상기 결과를 통해 TENC1은 사구체 발세포의 비대를 유도할 수 있으며, 이는 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의한 것임을 알 수 있었다.
실시예 3. TENC1이 mTORC1 신호전달 기작에 미치는 영향 확인
사구체 발세포의 비대증은 당뇨병성 신증 초기에 발세포의 사멸, 탈락 등과 함께 나타나는 병변의 주요 특징 중의 하나이다. 또한, 사구체 발세포 비대증의 병리기전에 있어서 mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1)이 활성화되며 가장 중요한 조절자로 작용한다고 보고되어 있다. 따라서 고농도의 포도당 처리가 분화된 발세포주에서 mTORC1 활성화를 유도하는지 검증해보고자 하였다.
이를 위해, 분화된 발세포주에 포도당을 각각 5, 11.1, 30 mmol/L 농도로 48시간 동안 처리한 후 mTORC1의 활성화를 확인하기 위하여 mTORC1 신호전달 활성화시 발현이 촉진되는 S6K(P70-S6 Kinase 1)의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation)의 증가 여부를 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 분화된 발세포주에서 포도당 농도에 의존적으로 S6K 인산화(pS6K)가 촉진되는 것을 알 수 있었다.
또한, 실시예 1-2의 결과를 통해 확인한 바와 같이, 분화된 발세포주에 고농도의 포도당을 처리하였을 때 TENC1의 발현이 증가됨을 확인하였으므로 상기 TENC1의 발현 증가가 mTORC1 신호전달의 활성화에 관여하는지 알아보고자 하였다. 따라서 실시예 2의 방법과 동일하게 아데노바이러스 벡터를 이용하여 분화된 발세포에 GFP와 TENC1 WT을 과발현시킨 후 S6K 인산화를 확인하였다. 이에 더하여, TENC1에 의한 mTORC1 신호전달의 변화가 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의한 것인지를 검증하기 위해 역시 아데노바이러스 벡터를 이용하여 GFP와 함께 TENC1 변이체(TENC1 CS)를 과발현 시킨 후 S6K 인산화 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, GFP만을 발현시킨 대조군 발세포주에 비하여 TENC1 WT을 과발현시킨 발세포주에서 S6K의 인산화(pS6K)가 증가된 것을 확인하였다. 반면, 도 5b에 나타낸 바와 같이, TENC1 변이체(TENC1 CS)를 과발현시킨 발세포주의 경우에는 S6K의 인산화가 관찰되지 않았다.
따라서 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의해 mTORC1 신호전달이 활성화되며 이를 통해 발세포 비대증이 야기될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. TENC1의 발세포 nephrin 인산화 억제 기전 확인
4-1. 면역침강법을 통한 TENC1과 nephrin의 결합 확인
네프린(Nephrin)은 발세포 특이적인 단백질로 최근 연구결과를 통해 Fyn에 의해 인산화될 수 있으며, 당뇨병성 신증과 같은 신장 손상 환경에서 탈 인산화 되는 것이 확인되었다. 그러나 그 중요성에도 불구하고 nephrin 인산화를 경유한 발세포 내 하위 신호전달 및 그 조절자에 대한 연구는 미비한 실정이다. 한편, 상기 실시예 결과들을 통해 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성이 사구체 발세포의 병리기전에 주요하게 작용할 수 있음을 확인하였으므로, 본 실시예에서는 TENC1이 nephrin의 인산화를 억제하는데 관여하는지 검증하였다.
이를 위해, 먼저 인간 배아 신장세포주인 HEK293을 이용하여 nephrin을 과발현하는 세포주(293NPH)를 제작하고 상기 제작한 세포주에 nephrin을 인산화시키는 것으로 알려진 Fyn을 과발현시켜 nephrin을 인산화시킨 후 TENC1 WT 또는 TENC1 변이체(TENC1 CS)를 과발현시켜 TENC1이 nephrin과 결합하는지 면역침강법(immunoprecipitation; IP)을 수행하여 검증하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Fyn이 과발현된 상태에서 TENC1 WT 또는 TENC1 CS을 과발현시킨 경우 모두 TENC1이 인산화된 nephrin과 결합하는 것을 알 수 있었다.
4-2. TENC1의 발세포 nephrin 인산화 억제 확인
실시예 4-1에서 TENC1이 Fyn에 의해 인산화된 nephrin과 결합하는 것을 확인하였으므로, 나아가 TENC1이 nephrin의 인산화를 억제하는지 알아보고자 하였다.
이를 위해, 먼저 분화된 발세포주에 TENC1의 과발현을 야기할 수 있는 고포도당 환경에서 nephrin의 인산화가 억제되는지 알아보기 위해 포도당을 5 mmol/L 또는 30 mmol/L로 각각 12시간 또는 24시간 동안 처리한 후 면역침강법(IP)과 immunoblot을 수행하였다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 포도당을 30 mmol/L의 고농도로 처리한 경우 5 mmol/L로 처리한 경우에 비하여 nephrin의 티로신 잔기 인산화(pY)가 감소되었다. 또한 nephrin이 인산화되었을 때 결합하는 것으로 알려진 PI3K와의 결합량을 알아보기 위해 PI3K의 조절 소단위체(regulatory subunit)인 p85를 확인한 결과, 포도당을 고농도로 처리하였을 때 PI3K와의 결합 역시 감소하는 것을 알 수 있었다.
다음으로, 직접적으로 TENC1에 의한 nephrin의 인산화 억제 여부를 검증하기 위하여, 실시예 4-1에서 제작한 nephrin을 과발현하는 발세포주(293NPH)에 Fyn을 과발현시켜 nephrin의 인산화를 유도한 다음 TENC1을 발현시키지 않거나 TENC1 WT 또는 TENC1 변이체(TENC1 CS)를 과발현 시킨 후 면역침강법(IP)을 수행하였다.
그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, TENC1 WT을 과발현시킨 경우 대조군과 비교하여 nephrin의 탈인산화가 유도되었고, p85의 발현을 통해 nephrin과 PI3K와의 결합이 감소하는 것을 확인하였다. 반면에 TENC1 변이체(CS)를 과발현시킨 경우에는 nephrin의 탈인산화가 관찰되지 않았으며, PI3K와의 결합 역시 감소하지 않음을 알 수 있었다.
상기 결과들을 통하여, nephrin이 TENC1의 기질로 작용하여 TENC1 특히, TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성에 의해 nephrin의 인산화가 조절되며, 고포도당 환경에서 nephrin의 인산화 억제에 역시 고포도당 환경에 의해 발현이 증가한 TENC1이 작용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 스크리닝을 통한 TENC1 활성 억제제 발굴
상기 결과들을 통하여 당뇨병성 신증의 주요한 원인으로 알려진 고포도당 환경에서 과발현되는 TENC1에 의해 nephrin의 탈인산화가 유도되어 인산화가 억제되고, 사구체 발세포주의 비대가 유도됨을 확인하였으므로, 이를 억제하기 위해 Malachite Green assay를 통해 TENC1 저해제 발굴을 위한 스크리닝(screening)을 진행하였다.
세포에서 정제한 TENC1 단백질과 천연물 라이브러리(natural product library) 후보 화합물 각각을 일정시간 동안 함께 두고, TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성을 측정하였다. 대조군과 비교하여 상기 티로신 인산가수분해효소 활성이 감소한다면 함께 첨가된 상기 후보 화합물이 TENC1의 활성을 저해한 것이라고 생각할 수 있다. 이때, 양성대조군으로는 티로신 인산가수분해효소 억제제인 바나듐산나트륨(sodium vanadate, Na3VO4; NAV)을 사용하였다. 상기 방법은 시험관 내에 다른 분자가 거의 포함되어 있지 않기 때문에 세포 수준에서의 스크리닝 방법에 비해 직접적인 조절자를 발굴할 수 있는 가능성이 크다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 디하이드로탄시논(dihydrotanshinone)을 포함한 나프토퀴논(Naphthoquinone) 구조를 가지는 4종류의 천연물이 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성 억제능을 가지는 것이 확인되었다. TENC1이 당뇨병성 신증에 타겟이 될 수 있으므로 TENC1 활성 억제제는 당뇨병성 신증의 치료제로 사용될 수 있을 것이다.
실시예 6. 당뇨병성 신증 동물모델에서의 TENC1 활성 억제제 효과 분석
상기 실시예 5의 스크리닝을 통해 발굴된 TENC1 활성 억제제 가운데 대표 물질로써 디하이드로탄시논(dihydrotanshinone: DHTS)의 효과를 당뇨병성 신증 동물모델을 이용해 확인하고자 하였다. 이를 위한 당뇨병성 신증 동물모델로는 제2형 당뇨모델인 db/db 생쥐를 사용하였으며, 대조군으로는 db/m 생쥐를 사용하였다. 10주령의 수컷 db/m과 db/db 생쥐를 각각 db/m에 vehicle을 투여한 군, db/db에 vehicle을 투여한 군, db/db에 300 mg/kg의 디하이드로탄시논(DHTS)을 투여한 군으로 총 3그룹으로 나누어 실험을 진행하였으며, 각각 조건에 맞게 모두 2주간 매일 경구투여 하였다. Vehicle로는 1% 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)를 사용하였다.
먼저, 상기 실험을 진행한 후 마우스로부터 혈액을 채취하여 공복 혈당을 측정하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 2주간의 디하이드로탄시논(DHTS) 투여에 의해서는 공복혈당 감소효과가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
다음으로, 혈당 감소와 무관하게 TENC1의 PTPase 활성 억제에 의해 디하이드로탄시논(DHTS)이 신장보호효과를 나타낼 수 있는지 확인하기 위해, 생쥐를 희생시킨 후 신장을 적출하여 무게를 측정함으로써 당뇨병성 신증에서 나타나는 신장 비대를 개선시킬 수 있는지 확인하였으며, 또한 생쥐의 소변 샘플을 확보하여 당뇨병성 신증 시 나타나는 단백뇨를 개선할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 vehicle을 투여한 당뇨모델 db/db 생쥐의 신장무게가 db/m 생쥐에 비해 증가하였으며, 이러한 증가가 디하이드로탄시논(DHTS)을 투여한 db/db 생쥐의 신장에서는 관찰되지 않았다. 따라서 디하이드로탄시논(DHTS)이 신장비대를 개선할 수 있음을 확인하였다.
또한, 도 11a에 나타낸 바와 같이, 디하이드로탄시논(DHTS)을 투여한 db/db의 생쥐에서 단백뇨가 vehicle을 투여한 db/db 생쥐에 비해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 이와 더불어 도 11b에서 확인되는 바와 같이, 분화된 발세포에 30 mmol/L의 고포도당 조건을 처리하여 발세포의 여과기능을 손상시켰을 때에도 디하이드로탄시논(DHTS)을 처리하면 5 mmol/L의 정상 포도당 조건과 유사한 정도로 여과기능 손상을 개선할 수 있음을 확인하였다.
나아가, 상기와 같은 결과가 TENC1에 의한 nephrin의 탈인산화 및 mTORC1 신호증가를 억제하여 나타난 것인지 확인하기 위해, 생쥐로부터 적출한 신장 조직 샘플을 이용하여 면역침강법 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 db/m에 비해 db/db의 신장조직에서 nephrin 탈인산화가 진행된 것을 확인하였으며 디하이드로탄시논(DHTS)을 경구 투여한 db/db의 신장조직의 nephrin 인산화가 회복되는 것을 확인하였다. 또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, db/db의 신장조직에서는 db/m에 비해 S6K의 인산화(pS6K)가 증가된 반면, 디하이드로탄시논(DHTS) 경구투여에 의해 효과적으로 S6K의 인산화(pS6K)의 증가가 억제되는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, TENC1 활성 억제제의 대표물질인 디하이드로탄시논(DHTS)에 의해 db/db에 의한 제2형 당뇨병성 신증 모델의 신장조직에서 나타나는 nephrin 탈인산화와 mTORC1 신호기작 증대가 개선되는 것을 확인하였으며, 결과적으로 당뇨병성 신증에서 나타나는 신장 비대와 단백뇨 역시 개선되는 것을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION
<120> PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR PREVENTING OR TREATING DIABETIC
NEPHROPATHY COMPRISING THE ACTIVITY INHIBITOR OF TENC1
<130> MP16-311
<150> KR 10-2015-0081917
<151> 2015-06-10
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1409
<212> PRT
<213> Homo sapiens TENC1
<400> 1
Met Lys Ser Ser Gly Pro Val Glu Arg Leu Leu Arg Ala Leu Gly Arg
1 5 10 15
Arg Asp Ser Ser Arg Ala Ala Ser Arg Pro Arg Lys Ala Glu Pro His
20 25 30
Ser Phe Arg Glu Lys Val Phe Arg Lys Lys Pro Pro Val Cys Ala Val
35 40 45
Cys Lys Val Thr Ile Asp Gly Thr Gly Val Ser Cys Arg Val Cys Lys
50 55 60
Val Ala Thr His Arg Lys Cys Glu Ala Lys Val Thr Ser Ala Cys Gln
65 70 75 80
Ala Leu Pro Pro Val Glu Leu Arg Arg Asn Thr Ala Pro Val Arg Arg
85 90 95
Ile Glu His Leu Gly Ser Thr Lys Ser Leu Asn His Ser Lys Gln Arg
100 105 110
Ser Thr Leu Pro Arg Ser Phe Ser Leu Asp Pro Leu Met Glu Arg Arg
115 120 125
Trp Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Val Thr Glu Arg Ile Leu Ala Ala Ala
130 135 140
Phe Pro Ala Arg Pro Asp Glu Gln Arg His Arg Gly His Leu Arg Glu
145 150 155 160
Leu Ala His Val Leu Gln Ser Lys His Arg Asp Lys Tyr Leu Leu Phe
165 170 175
Asn Leu Ser Glu Lys Arg His Asp Leu Thr Arg Leu Asn Pro Lys Val
180 185 190
Gln Asp Phe Gly Trp Pro Glu Leu His Ala Pro Pro Leu Asp Lys Leu
195 200 205
Cys Ser Ile Cys Lys Ala Met Glu Thr Trp Leu Ser Ala Asp Pro Gln
210 215 220
His Val Val Val Leu Tyr Cys Lys Gly Asn Lys Gly Lys Leu Gly Val
225 230 235 240
Ile Val Ser Ala Tyr Met His Tyr Ser Lys Ile Ser Ala Gly Ala Asp
245 250 255
Gln Ala Leu Ala Thr Leu Thr Met Arg Lys Phe Cys Glu Asp Lys Val
260 265 270
Ala Thr Glu Leu Gln Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Ile Ser Tyr Phe Ser
275 280 285
Gly Leu Leu Ser Gly Ser Ile Arg Met Asn Ser Ser Pro Leu Phe Leu
290 295 300
His Tyr Val Leu Ile Pro Met Leu Pro Ala Phe Glu Pro Gly Thr Gly
305 310 315 320
Phe Gln Pro Phe Leu Lys Ile Tyr Gln Ser Met Gln Leu Val Tyr Thr
325 330 335
Ser Gly Val Tyr His Ile Ala Gly Pro Gly Pro Gln Gln Leu Cys Ile
340 345 350
Ser Leu Glu Pro Ala Leu Leu Leu Lys Gly Asp Val Met Val Thr Cys
355 360 365
Tyr His Lys Gly Gly Arg Gly Thr Asp Arg Thr Leu Val Phe Arg Val
370 375 380
Gln Phe His Thr Cys Thr Ile His Gly Pro Gln Leu Thr Phe Pro Lys
385 390 395 400
Asp Gln Leu Asp Glu Ala Trp Thr Asp Glu Arg Phe Pro Phe Gln Ala
405 410 415
Ser Val Glu Phe Val Phe Ser Ser Ser Pro Glu Lys Ile Lys Gly Ser
420 425 430
Thr Pro Arg Asn Asp Pro Ser Val Ser Val Asp Tyr Asn Thr Thr Glu
435 440 445
Pro Ala Val Arg Trp Asp Ser Tyr Glu Asn Phe Asn Gln His His Glu
450 455 460
Asp Ser Val Asp Gly Ser Leu Thr His Thr Arg Gly Pro Leu Asp Gly
465 470 475 480
Ser Pro Tyr Ala Gln Val Gln Arg Pro Pro Arg Gln Thr Pro Pro Ala
485 490 495
Pro Ser Pro Glu Pro Pro Pro Pro Pro Met Leu Ser Val Ser Ser Asp
500 505 510
Ser Gly His Ser Ser Thr Leu Thr Thr Glu Pro Ala Ala Glu Ser Pro
515 520 525
Gly Arg Pro Pro Pro Thr Ala Ala Glu Arg Gln Glu Leu Asp Arg Leu
530 535 540
Leu Gly Gly Cys Gly Val Ala Ser Gly Gly Arg Gly Ala Gly Arg Glu
545 550 555 560
Thr Ala Ile Leu Asp Asp Glu Glu Gln Pro Thr Val Gly Gly Gly Pro
565 570 575
His Leu Gly Val Tyr Pro Gly His Arg Pro Gly Leu Ser Arg His Cys
580 585 590
Ser Cys Arg Gln Gly Tyr Arg Glu Pro Cys Gly Val Pro Asn Gly Gly
595 600 605
Tyr Tyr Arg Pro Glu Gly Thr Leu Glu Arg Arg Arg Leu Ala Tyr Gly
610 615 620
Gly Tyr Glu Gly Ser Pro Gln Gly Tyr Ala Glu Ala Ser Met Glu Lys
625 630 635 640
Arg Arg Leu Cys Arg Ser Leu Ser Glu Gly Leu Tyr Pro Tyr Pro Pro
645 650 655
Glu Met Gly Lys Pro Ala Thr Gly Asp Phe Gly Tyr Arg Ala Pro Gly
660 665 670
Tyr Arg Glu Val Val Ile Leu Glu Asp Pro Gly Leu Pro Ala Leu Tyr
675 680 685
Pro Cys Pro Ala Cys Glu Glu Lys Leu Ala Leu Pro Thr Ala Ala Leu
690 695 700
Tyr Gly Leu Arg Leu Glu Arg Glu Ala Gly Glu Gly Trp Ala Ser Glu
705 710 715 720
Ala Gly Lys Pro Leu Leu His Pro Val Arg Pro Gly His Pro Leu Pro
725 730 735
Leu Leu Leu Pro Ala Cys Gly His His His Ala Pro Met Pro Asp Tyr
740 745 750
Ser Cys Leu Lys Pro Pro Lys Ala Gly Glu Glu Gly His Glu Gly Cys
755 760 765
Ser Tyr Thr Met Cys Pro Glu Gly Arg Tyr Gly His Pro Gly Tyr Pro
770 775 780
Ala Leu Val Thr Tyr Ser Tyr Gly Gly Ala Val Pro Ser Tyr Cys Pro
785 790 795 800
Ala Tyr Gly Arg Val Pro His Ser Cys Gly Ser Pro Gly Glu Gly Arg
805 810 815
Gly Tyr Pro Ser Pro Gly Ala His Ser Pro Arg Ala Gly Ser Ile Ser
820 825 830
Pro Gly Ser Pro Pro Tyr Pro Gln Ser Arg Lys Leu Ser Tyr Glu Ile
835 840 845
Pro Thr Glu Glu Gly Gly Asp Arg Tyr Pro Leu Pro Gly His Leu Ala
850 855 860
Ser Ala Gly Pro Leu Ala Ser Ala Glu Ser Leu Glu Pro Val Ser Trp
865 870 875 880
Arg Glu Gly Pro Ser Gly His Ser Thr Leu Pro Arg Ser Pro Arg Asp
885 890 895
Ala Pro Cys Ser Ala Ser Ser Glu Leu Ser Gly Pro Ser Thr Pro Leu
900 905 910
His Thr Ser Ser Pro Val Gln Gly Lys Glu Ser Thr Arg Arg Gln Asp
915 920 925
Thr Arg Ser Pro Thr Ser Ala Pro Thr Gln Arg Leu Ser Pro Gly Glu
930 935 940
Ala Leu Pro Pro Val Ser Gln Ala Gly Thr Gly Lys Ala Pro Glu Leu
945 950 955 960
Pro Ser Gly Ser Gly Pro Glu Pro Leu Ala Pro Ser Pro Val Ser Pro
965 970 975
Thr Phe Pro Pro Ser Ser Pro Ser Asp Trp Pro Gln Glu Arg Ser Pro
980 985 990
Gly Gly His Ser Asp Gly Ala Ser Pro Arg Ser Pro Val Pro Thr Thr
995 1000 1005
Leu Pro Gly Leu Arg His Ala Pro Trp Gln Gly Pro Arg Gly Pro Pro
1010 1015 1020
Asp Ser Pro Asp Gly Ser Pro Leu Thr Pro Val Pro Ser Gln Met Pro
1025 1030 1035 1040
Trp Leu Val Ala Ser Pro Glu Pro Pro Gln Ser Ser Pro Thr Pro Ala
1045 1050 1055
Phe Pro Leu Ala Ala Ser Tyr Asp Thr Asn Gly Leu Ser Gln Pro Pro
1060 1065 1070
Leu Pro Glu Lys Arg His Leu Pro Gly Pro Gly Gln Gln Pro Gly Pro
1075 1080 1085
Trp Gly Pro Glu Gln Ala Ser Ser Pro Ala Arg Gly Ile Ser His His
1090 1095 1100
Val Thr Phe Ala Pro Leu Leu Ser Asp Asn Val Pro Gln Thr Pro Glu
1105 1110 1115 1120
Pro Pro Thr Gln Glu Ser Gln Ser Asn Val Lys Phe Val Gln Asp Thr
1125 1130 1135
Ser Lys Phe Trp Tyr Lys Pro His Leu Ser Arg Asp Gln Ala Ile Ala
1140 1145 1150
Leu Leu Lys Asp Lys Asp Pro Gly Ala Phe Leu Ile Arg Asp Ser His
1155 1160 1165
Ser Phe Gln Gly Ala Tyr Gly Leu Ala Leu Lys Val Ala Thr Pro Pro
1170 1175 1180
Pro Ser Ala Gln Pro Trp Lys Gly Asp Pro Val Glu Gln Leu Val Arg
1185 1190 1195 1200
His Phe Leu Ile Glu Thr Gly Pro Lys Gly Val Lys Ile Lys Gly Cys
1205 1210 1215
Pro Ser Glu Pro Tyr Phe Gly Ser Leu Ser Ala Leu Val Ser Gln His
1220 1225 1230
Ser Ile Ser Pro Ile Ser Leu Pro Cys Cys Leu Arg Ile Leu Ser Lys
1235 1240 1245
Asp Pro Leu Glu Glu Thr Pro Glu Ala Pro Val Pro Thr Asn Met Ser
1250 1255 1260
Thr Ala Ala Asp Leu Leu Arg Gln Gly Ala Ala Cys Ser Val Leu Tyr
1265 1270 1275 1280
Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu Ser Leu Thr Gly Pro Gln Ala Val Ala
1285 1290 1295
Arg Ala Ser Ser Ala Ala Leu Ser Cys Ser Pro Arg Pro Thr Pro Ala
1300 1305 1310
Val Val His Phe Lys Val Ser Ala Gln Gly Ile Thr Leu Thr Asp Asn
1315 1320 1325
Gln Arg Lys Leu Phe Phe Arg Arg His Tyr Pro Val Asn Ser Ile Thr
1330 1335 1340
Phe Ser Ser Thr Asp Pro Gln Asp Arg Arg Trp Thr Asn Pro Asp Gly
1345 1350 1355 1360
Thr Thr Ser Lys Ile Phe Gly Phe Val Ala Lys Lys Pro Gly Ser Pro
1365 1370 1375
Trp Glu Asn Val Cys His Leu Phe Ala Glu Leu Asp Pro Asp Gln Pro
1380 1385 1390
Ala Gly Ala Ile Val Thr Phe Ile Thr Lys Val Leu Leu Gly Gln Arg
1395 1400 1405
Lys
Claims (8)
- TENC1(Tensin-like C1 domain-containing phosphatase)의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 TENC1의 활성 억제제는 디하이드로탄시논(Dihydrotanshinone: (1R)-1,6-dimethyl-1,2-dihydronaphtho[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dione)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 TENC1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 TENC1의 활성 억제제는 TENC1의 티로신 인산가수분해효소 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 TENC1에 의한 네프린(nephrin)의 탈인산화를 억제함으로써 사구체 발세포 보호효과를 가지는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 약리학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 보조제(additive)를 더 함유하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
US15/176,064 US20160361288A1 (en) | 2015-06-10 | 2016-06-07 | Pharmaceutical compositions for preventing or treating diabetic nephropathy comprising the activity inhibitor of tenc1 |
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Family Applications (1)
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KR1020160066958A KR101765417B1 (ko) | 2015-06-10 | 2016-05-31 | Tenc1의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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Country | Link |
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KR (1) | KR101765417B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
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KR102081217B1 (ko) * | 2017-09-13 | 2020-02-25 | 연세대학교 산학협력단 | 네프린 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 투과 촉진용 조성물 |
-
2016
- 2016-05-31 KR KR1020160066958A patent/KR101765417B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
Title |
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비특허문헌 1 (BIOL. PHARM. BULL., 2009) |
Also Published As
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