KR101627409B1 - 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메트포르민(Metformin)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 이의 복막 섬유화 예방 또는 치료용도 및 메트포르민을 포함하는 복막 투석액에 관한 것이다. 본 발명의 메트포르민은 항산화 작용을 통해 복막의 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)를 억제함으로써, 복막의 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있으므로 복막 섬유화를 예방 또는 치료하는 효과가 우수하다.

Description

메트포르민을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도{Pharmaceutical composition comprising metformin as an active ingredient and use thereof}

본 발명은 메트포르민(Metformin)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 이의 복막 섬유화 예방 또는 치료용도 및 메트포르민을 포함하는 복막 투석액에 관한 것이다.

말기 신부전 환자는 국내에서도 매년 10% 이상 증가하고 있으며, 이들 대부분은 혈액 투석과 복막 투석 등의 치료를 받는다. 이 중 복막 투석은 혈액 투석과 비교하여 장점이 있는 것으로 알려져 있으나, 복막 투석을 장기간 시행할 경우 형태학적으로 중피 세포 탈락, 복막 섬유화, 혈관변화 및 혈관신생 등의 변화가 발생될 수 있고, 기능적으로 한외여과부전 및 용질이동의 변화가 일어난다는 문제점이 지속적으로 지적되고 있다. 이러한 변화들은 복막투석의 효율을 감소시켜 말기 신부전 환자에서 복막투석 치료를 중단하게 하는 중요한 원인이 된다(Margetts PJ, Bonniaud P. Basic mechanisms and clinical implications of peritoneal fibrosis. Perit Dial Int. 23(6):530-541,2003.). 결과적으로 복막 투석을 통해 생체가 투석액에 장기간 반복적으로 노출되는 경우 투석막으로서의 복막이 형태적으로나 기능적으로 심각하게 변화되므로 이러한 점은 복막 투석을 저해하게 된다.

이 중 복막 섬유화는 복막의 중피 세포가 탈락하고 섬유아세포가 활성화되어 일어나는 것으로 복막에서의 복막 섬유화의 기전이 정확히 밝혀져 있지는 않으나, 복막에 존재하는 여러 세포들의 상태와 세포 생산 물질들 상호간의 균형이 섬유화를 지속시키느냐 완화시키느냐를 결정하는 것으로 보인다. 특히 transforming grwoth factor-β1(TGF-β1)은 피브로넥틴(fibronectin)이나 콜라겐(collagen) 등 세포외 기질 단백 생산을 자극할 뿐 아니라, 기질 분해를 방해하는 TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinase), PAI-1(plasminogen activatorinhibitortype1) 등을 자극하여 섬유화 과정에서 중요한 역할을 한다. 실험동물에서도 복강 내 유전자 주입에 의하여 TGF-β1을 과발현시킬 경우 복막 섬유화를 유발할 수 있음이 증명된 바 있다 (Margetts PJ, Kolb M, Galt T, Hoff CM, Shockley TR, Gauldie J.Gene transfer of transforming growth factor-beta1 to the rat peritoneum: effects on membrane function. J Am Soc Nephrol. 12(10):2029-2039,200). TGF-β1이 프로모터 활성을 자극함으로써 유발하는 또 다른 섬유화 사이토카인인 CTGF(connective tissue growth factor)가 TGF-β1에 의한 피브로넥틴과 콜라겐 등 세포외 기질 단백 발현에 중요한 매개 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Mason RM,Wahab NA. Extra cellular matrix metabolism in diabetic nephropathy. J Am SocNephrol.14(5):1358-1373,2003). 또한 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)는 E-cadherin 및 ZO-1의 발현의 감소와 de novo α-smooth muscle actin(이하, α-SMA) 발현 축적이 특징으로 알려져 있으며, 섬유증과 관련한 이것의 가역적인 특징에 의하여 치료의 타깃으로 고려될 수 있다.

상기와 같이 복막 섬유화가 일어나게 되면 복막의 용질 수송에 영향을 미치게 되므로 투석을 시행할 수 없으므로 복막 투석의 장기 수행을 위해서는 복막 섬유화를 감소시키거나 예방하는 것이 매우 중요한 과제이다.

복막 섬유화를 예방하기 위해서, 생체에 적합한 투석액의 개발, 투석액 내의 당 분해산물 농도 감소, 포도당 중합체 투석액, 세포내 유리기 제거 물질 및 퍼페니돈(Pirfenidone; PFD)과 같은 항섬유화 제제 등에 관한 연구가 보고되고 있으나, 아직까지 복막 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있는 약물에 대한 보고는 미흡한 실정이다. 따라서 부작용이 없고 치료 효과가 우수한 새로운 복막 섬유화 억제 약품의 개발에 대한 필요성이 있다.

메트포르민(Metformin)은 NIDDM을 앓는 환자의 혈당을 낮추기 위해 널리 처방되고 있는 당뇨병 치료제로 숙주의 말초 조직에서 인슐린에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 최근 메트포르민에 대한 많은 연구가 진행되고 있으며, 메트포르민을 포함하는 복합제제, 메트포르민의 다양한 염의 항당뇨 활성(한국공개특허 제2009-0005513호 등) 등의 연구결과가 새롭게 보고되고 있다. 또한 메트포르민의 루프스 예방 또는 치료용도(한국공개특허 제2014-0036598호), 메트포르민의 항암 용도 등 새로운 의약 용도에 관한 연구 역시 활발하게 이루어지고 있으나, 아직까지 메트포르민과 복막 섬유화의 관계에 대해서는 보고된 바 없다.

본 발명자들은 복막 섬유화를 효과적으로 예방, 치료 및 개선할 수 있는 물질을 예의 연구하던 중, 당뇨병 치료제로 알려진 메트포르민이 항산화 작용을 통해 복막의 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)를 억제함으로써, 복막의 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 메트포르민(Metformin)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 이의 복막 섬유화 예방 또는 치료용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 메트포르민을 포함하는 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 메트포르민이 복막의 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)를 억제하는, 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 메트포르민이 산화 스트레스를 개선하는 것인, 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 약학적 조성물에 항산화제를 추가로 포함하는, 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 항산화제가 미토큐(MitoQ), NAC(N-acetylcysteine) 및 DPI(diphenyleneiodonium)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 메트포르민을 포함하는 복막 투석액에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 복막 투석액에 항산화제를 추가로 포함하는 복막 투석액에 관한 것이다.

본 발명의 메트포르민은 항산화 작용을 통해 복막의 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)를 억제함으로써, 복막의 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있으므로 복막 섬유화를 예방 또는 치료하는 효과가 우수하다.

도 1은 메트포르민이 HPMC에서 세포 성장 및 세포 독성에 미치는 영향을 나타낸 도이다(n=5, * p<0.05 versus 대조군).
도 2는 HPMC에서 세포 형태, ZO-1 및 α-SMA의 발현에 대한 형광 면역염색 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 웨스턴 블랏을 이용하여 메트포르민이 HPMC에서 E-cadherin 및 α-SMA의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05 versus 대조군).
도 4는 실시간 PCR을 이용하여 HPMC에서 E-cadherin 및 α-SMA의 발현에 미치는 메트포르민의 영향을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05 versus others).
도 5는 TGF-β1 처리에 따른 Smad2/3, Erk MAPK 및 p38 MAPK 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다(p<0.05 versus 대조군).
도 6은 메트포르민 처리가 TGF-β1 노출된 HPMC에서 Smad2/3, p38 및 Erk MAPK 의 활성화를 차단한다는 것을 확인한 도이다(p<0.05 versus 대조군.)
도 7은 TGF-β1에 의한 GSK-3β 인산화 유도, β-catenin, Snail의 발현 증가 및 β-catenin의 핵 내 이동이 메트포르민 처리에 의하여 효과적으로 억제될 수 있음을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 메트포르민이 TGF-β1 유도된 ROS 생산, NOX 활성, 그리고 NOX mRNA 발현을 차단하는 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다(C: 대조군, T: TGF-β1 단독 처리군, M: 메트포르민 단독 처리군, T+M: TGF-β1+메트포르민 처리군)(*p<0.05 versus 대조군).
도 9는 메트포르민이 TGF-β1 유도된 미토콘드리아 ROS 생산 및 미토콘드리아 NOX-4 발현을 차단함을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 메트포르민이 TGF-β1 노출된 HPMC에서 감소된 항산화 활성을 증가시킴을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05 versus 대조군).
도 11은 항산화제가 TGF-β1 유도된 EMT를 개선할 수 있음을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05 versus 대조군).

본 발명은 메트포르민(Metformin)을 포함하는 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 '메트포르민'은 항산화 작용을 통해 복막의 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)를 억제함으로써, 복막의 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있으므로 복막 섬유화를 예방 또는 치료하는 효과가 우수하다. 보다 구체적으로 상기 메트포르민은 TGF-β1에 의해 유도된 복막의 EMT에 있어서, Smad2/3, Erk MAPK 및 p38 MAPK 활성화를 차단하여 EMT를 효과적으로 억제하고, β-catenin의 핵 내 이동을 억제하고, GSK-3β의 인산화, Snail의 과발현을 억제함으로써 EMT를 억제할 수 있으며, 특히 복막 중피 세포에서 NADPH 산화효소 (NOX) 활성 조절 및 NOX mRNA 발현의 조절을 통해 ROS를 억제하고 이와 같은 산화적 스트레스를 억제함으로써 EMT를 억제할 수 있다. 이러한 메트포르민의 복막 섬유화 억제 효과는 메트포르민이 산화적 스트레스를 개선하는 항산화 효과에 기인한다.

상기 메트포르민은, 메트포르민 또는 그 약학적으로 수용가능한 염, 예를 들어 염산염(hydrochloride salt), 메트포르민 푸마르산염(fumarate salt), 메트포르민 숙신산염 (succinate salt)(1999년 3월 4일자 미국출원 제 09/262,526호에 개시), 브롬화수소산염(hydrobromide salt), p-클로로페녹시 아세테이트(p-chlorophenoxy acetate) 또는 엠보네이트(embonate), 그리고 그 외에 알려진 1 염기성 및 2 염기성의 카복시산의 메트포르민염(미국특허 제 3,174,901호에 개시된 것을 포함)을 총체적으로 지칭한다.

메트포르민, 또는 구체적으로 메트포르민 히드로클로라이드는 1,1-디메틸비구아니드 모노히드로클로라이드이며, 화학식은 다음과 같다.

본 발명의 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이드, 탈크 같은 윤활제도 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필레글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통하여 투여될 수 있다.

원하는 결과를 달성하기 위해 일반적으로 본 발명의 메트포르민은 24시간 동안 체중 1 kg 당 약 0.001 내지 100 mg, 바람직하게는 약 0.01 내지 100 mg, 특히 약 0.1 내지 10 mg으로, 적절하다면 복수개의 단일 투여량 형태로 투여할 수 있다.

또한 더욱 바람직하게는 체중, 투여 경로의 특성, 장애의 유형 및 중증도, 의약에 대한 개인의 행동, 제형의 특성 및 투여 시간 또는 간격에 따라 양을 조절할 수 있다.

또한 본 발명은 메트포르민의 항산화 효과를 강화하기 위하여 항산화제를 추가로 포함하는 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

메트포르민은 산화적 스트레스를 개선하는 항산화 효과를 통하여 복막 섬유화를 예방 또는 치료할 수 있으므로, 복막 세포에서 항산화 효과를 나타내는 항산화제를 추가로 함유하는 경우 복막 섬유화 예방 또는 치료 효과가 더욱 증진될 수 있다.

따라서 본 발명의 항산화제는 복막 세포의 섬유화를 억제할 수 있도록 산화 스트레스 억제 효과를 나타내는 것이면 제한없이 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 미토큐(MitoQ), NAC(N-acetylcysteine) 및 DPI(diphenyleneiodonium)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 항산화제들은 미토콘드리아에서 TGF-β1 유도된 NOX-4 발현의 상향조절 및 활성을 차단시킬 수 있으며, TGF-β1 유도된 E-cadherin 하향 조절 및 TGF-β1 유도된 α-SMA 발현의 상향 조절을 뚜렷하게 개선할 수 있다.

본 발명의 메트포르민과 항산화제들을 포함하는 복합제가 당업계에 공지된 통상의 방법으로 제조될 수 있으며, 상기 복합제는 유핵정, 캅셀제, 이중정, 다층정, 단일정 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 5 내지 90 중량%로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 50 내지 90 중량%로 포함될 수 있다. 상기 첨가제의 예로는 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제(disintegrator), 윤활제, 방부제, 항산화제, 등장제 (isotonic agent), 완충제, 피막제, 감미제, 용해제, 기제 (base), 분산제, 습윤제, 현탁제, 안정제, 착색제, 방향제, 수용성 첨가제, 부형제 등 각 제형에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 보다 상세하게는 미결정 셀룰로오스, 락토스, 만니톨, 나트륨 시트레이트, 칼슘 포스페이트, 글리신 및 전분; 글리콜산 전분나트륨, 크로스포비돈, 크로스카르멜로즈 나트륨 및 특정 복합 실리게이트 등을 포함하는 붕해제; 포비돈, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필메틸셀룰로스 (HPMC), 히드록시프로필셀룰로스 (HPC), 수크로오스, 젤라틴, 아카시아 검, 마크로골, 경질 무수 규산, 합성 규산 알루미늄, 규산 칼슘 또는 마그네슘 메타실리케이트 알루미네이트와 같은 규산염 유도체, 인산수소칼슘과 같은 인산염, 탄산칼슘과 같은 탄산염, 및 이들의 혼합물을 포함하는 결합제 및 스테아르산, 스테아르산 칼슘 또는 스테아르산 마그네슘과 같은 스테아르산 금속염류, 탈크, 콜로이드 실리카, 자당지방산에스테르, 수소첨가된 식물성 오일, 고융점의 왁스, 글리세릴지방산에스테르류, 글리세롤디베헤네이트, 활석 및 이들의 혼합물을 포함하는 활택제가 포함될 수 있다.

또한 본 발명은 메트포르민을 포함하는 복막 투석액을 제공한다.

본 발명의 메트포르민을 포함하는 복막 투석액은 삼투제, 완충액, 전해질 및 그들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 투석성분을 포함할 수 있으며, 예컨대, 삼투제는 포도당, 포도당 중합체(예컨대 말토덱스트린, 아이코덱스트린), 포도당 중합체 유도체, 시클로덱스트린, 변성전분, 히드록시에틸 전분, 폴리올, 과당, 아미노산, 펩티드, 단백질, 아미노당, 글리세롤, N-아세틸 글루코사민(NAG) 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 완충액은 중탄산염, 락테이트, 피루베이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스(즉, 트리스히드록시메틸아미노메탄), 아미노산, 펩티드, 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 전해질은 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 및 염화물을 포함할 수 있다.

상기 투석액은 1이상의 투석 성분(예컨대 투석용액의 요소 또는 구성 성분) 및 치료적 유효량의 유효물질을 포함할 수 있으며, 복막 섬유화를 억제하기 위한 성분으로 메트포르민을 포함하는 투석액이다. 상기 투석액은 투석 농축물일 수 있으며, 투석액에는 약 0.1μM 내지 약 1000 μM의 메트포르민이 포함될 수 있다.

상기 투석액은 단일 용기 내의 단일 투석 용액 또는 별도로 수용된 또는 다중-챔버를 가진 용기의 투석부로 사용될 수 있으며, 복막 투석 시 기존에 사용되는 투석액과 동시에 또는 시간차를 두고 환자에게 투여될 수 있다.

이상 본 명세서에 기재된 수치값은 달리 명시되어 있지 않은 한 균등범위까지 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 또는 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실험 시약 및 통계처리

모든 화합물 및 조직 배양 플레이트는 다른 언급이 없는 한, Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 및 Nunc Labware (Waltham, MA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.

모든 실험데이터는 평균 ± SD로 나타내었다. 각 군 사이의 다양한 파라미터들의 차이는 ANOVA에 의해 평가하였으며, 다중 비교를 위하여 수집되었다. 결과물의 유의도가 p≤ 0.05 인 경우, 유의한 것으로 평가하였다.

실험예 1. 세포 성장 및 세포독성 검정

인간 복막중피세포(HPMC)의 분리

인간 복막 중피 세포(Human peritoneal mesothelial cells; 이하 HPMC)를 분리하여 사용하였다. 선택 복부 수술을 시행한 환자 중 동의한 환자로부터 인간 장막 일부를 얻었으며, 이를 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척하고 0.05% 트립신-0.02% EDTA 용액에서 37℃를 유지하여 지속적인 교반과 함께 배양하였다. 배양 후, 상청액을 4℃에서 5분 동안 500xg 으로 원심분리하였으며, 이 후 10% FBS, 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신 및 26mmol/L NaHCO₃ 함유하는 M199 에서 배양하였다. 분주 48시간 후에 배지의 절반을 교체한 후, 전체 배지를 4일에 한번씩 교체하였다. 모든 실험은 2 및 4번째 계대 사이의 세포들을 이용하여 수행하였다. 조직 수확물들은 기관 윤리위원회(ECT 164-7)에 의하여 승인되었으며, 각 환자로부터 사전 동의를 얻었다.

메트포르민의 HPMC 세포성장 및 세포독성에 대한 영향

HPMC의 세포 성장 정도 및 세포독성을 측정하여 in vitro HPMC(human peritoneal mesothelial cell) 실험에 바람직한 메트포르민의 농도를 결정하기 위하여, 메트포르민을 0 내지 10mM 로 처리하고 메트포르민이 세포독성 및 세포 성장에 미치는 영향을 관찰하였다. 먼저 MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 흡수 검정을 수행하였다. 96웰 플레이트 내에서 성장된 세포에 메트포르민(0mM 내지 10mM)을 48시간 동안 처리하였다. 20μl MTS 시약을 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 5% CO₂ 분위기에서 배양하였다. HPMC의 분화는 96웰 플레이트 리더(Dynex Revelation, Dynex Ltd., Billingshurst,UK)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 읽어 측정하였다.

또한 HPMC 내 메트포르민의 세포독성은 처리 48시간 이후 배지에 나온 젖산탈수소 효소(lactate dehydrogenase; 이하, LDH) 양에 의해서 결정하였다. LDH 세포독성 검정을 위하여, HPMC를 96웰-플레이트에 2x10⁵cell/ml 로 분주하였으며, 이를 메트포르민으로 처리하고 제조사의 지시에 따라 LDH 세포독성 검출 키트(Roche, Mannheim, 독일)로 측정하였다.

결과를 도 1 에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 메트포르민 자극 48 시간 이후에도 1mM 메트포르민 농도까지는 LDH 방출 및 세포 성장에서 뚜렷한 변화가 관찰되지 않았다. 따라서 메트포르민의 1mM 농도까지는 세포 독성 없이 사용할 수 있는 물질임을 확인하였다.

실시예 1. 메트포르민의 TGF -β1에 의해 유도된 EMT 개선 효과

1.1 세포 형태 및 마커 발현의 변화

메트포르민의 EMT 개선 효과를 확인하기 위하여, 우선 TGF-β1를 이용하여 HPMC에서 EMT를 유도하였으며, 메트포르민을 처리한 HPMC에서 EMT 개선효과를 세포의 형태 변화와 상피(epithelial cell) 및 중간엽 세포(mesenchymal cell) 마커의 발현 변화를 통해 확인하였다. HPMC에서 EMT가 진행되어 복막 섬유화가 진행되는 경우 HPMC의 상피 세포 마커, 예컨대 ZO-1은 감소할 것이며, 중간엽 세포 마커, 예컨대 α-SMA은 증가한다.

세포 형태를 역위상차 현미경(Axiovert 200; Carl Zeiss, Oberkochen, 독일)을 이용하여 분석하였으며, 디지털 카메라(AxioCam HRC; Carl Zeiss)를 이용하여 이미지를 얻었다. 면역형광염색을 위하여, 세포들을 세척하고 4% 인산염 완충 파라포름알데하이드(20℃에서 25분) 내에서 고정시켰으며, PBS 내 1% Triton X-100로 투과되도록 하였다(4℃에서 15분). PBS로 세척 후, ZO-1(Invitrogen, CA), α-SMA (Abcam, Cambridge, MA) 또는 β-catenin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에 대한 1차 특이적 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하기 전, 세포들을 PBS 내 5% BSA로 1시간 동안 처리하였다. 세포들을 PBS 내 0.2% 트윈 20로 세척하였으며, 염소 항-마우스 IgG-FITC-접합 이차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로 1시간 동안 실온, 암 조건에서 배양하였다. DAPI를 이용하여 핵을 대비염색하였으며, 세포들을 AxioCam HRC 디지털 카메라와 함께 10x10 및 20x10 NA 대물렌즈 장치를 갖는 Axiovert 200 형광 현미경 하에서 시각적으로 관찰하였다. 디지털 사진은 Axiovision 4.3 (Carl Zeiss) 로 얻었으며, 결합 이미지는 포토샵 7.0 (Adobe Systems, Toronto, Ontario, 캐나다)를 이용하여 얻었다.

결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, TGF-β1 (1ng/ml)은 장방형의 세포형태를 가진 HPMC를 신장된 방추형태의 세포로 변화시키는 세포 형태변화를 유도하였으며, TGF-β1 축적 48시간까지 중간엽 세포 마커인 α-SMA의 축적과 함께 상피세포 마커인 ZO-1의 감소를 보여주었다. 반면 메트포르민을 처리한 실험군에서는 TGF-β1 유도된 세포 형태 변화와 상피 및 중간엽 세포 마커의 발현 변화를 TGF-β1 미처리 군과 같은 수준으로 다시 되돌아가는 현상을 보였다. 보다 구체적으로 위상차 현미경으로 관찰한 결과, TGF-β1를 처리한 실험군에서는 대조 HPMC에서 나타나는 장방형 및 조약돌 형태와 달리 가늘고 긴, 섬유형의 세포가 관찰된 반면, 미처리 또는 메트포르민 (1mM) 처리된 HPMC는 무시할만한 α-SMA 축적과 함께 뚜렷한 ZO-1 발현을 보이는 것이 확인되었고, 이를 통해 TGF-β1 처리에 의한 EMT 유도가 메트포르민(1mM) 처리에 의해 완화될 수 있음을 확인하였다.

1.2 웨스턴 블랏 분석을 통한 EMT 마커 변화 확인

추가적으로 웨스턴 블랏 분석을 통해 TGF-β1 유도된 EMT에서 메트포르민의 개선효과를 확인하였다. 먼저 세포 용해물(30 μg)로부터 단백질 시료를 분리하고, 이를 환원 완충액과 함께 혼합, 가열하고 10% SDS-PAGE 겔상에 옮긴 후, 일렉트로블랏팅(electroblotting) 방법을 사용하여 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. 막을 TBS 내 5% wt/vol 무지방 분유로 실온에서 30분동안 차단시키고 블랏은 하기 항원에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다: E-cadherin (BD Bioscience, Bedford, MA), α-SMA, β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). PBS, 트윈 20 으로 블랏을 세척한 후, 블랏들을 각 1차 항체에 상응하는 호스래디쉬 페록시다아제-접합된 2차 항체들과 함께 배양하였으며 이후 강화된 화학발광검출(Santa Cruz Biotechnology)을 수행하였다. 양성 면역반응성 밴드들이 농도계에 의해서 정량화되었으며, 인간 β-actin의 발현과 비교분석하였다.

결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, TGF-β1 축적 48시간까지 중간엽 세포 마커인 α-SMA는 증가되었고 상피세포 마커인 E-cadherin은 유의적으로 감소되었다. 그러나 메트포르민 처리군에서는 TGF-β1 유도된 상피 및 중간엽 세포 마커의 발현 변화가 뚜렷하게 회복되는 것을 확인하였다. 이를 통해 메트포르민이 유도되는 복막 섬유화를 효과적으로 억제하여 치료할 수 있는 물질임이 확인되었다.

1.3 실시간 PCR 을 이용한 mRNA 발현 분석

E-cadherin과 α-SMA 의 mRNA 발현 변화에 대한 메트포르민의 영향은 실시간 PCR을 이용하여 측정하였다. mRNA 발현 분석은 SYBR Green I을 이용하는 ABI PRISM 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 PCR을 이용하여 제조사의 방법에 따라 결정하였다. PCR 반응은 5 μM cDNA, 10 μM SYBR Green PCR master mix, 및 반응당 20 μM 의 최종 부피에 대하여 5 pM의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 수행하였다. 사용된 센스 및 안티센스 프라이머 서열을 다음과 같다.

[표 1]

일차 농도는 각 프라이머의 최적 농도 분석에 대한 예비적 실험에 의해서 결정되었다. 각 시료 내 타겟 유전자의 상대적 mRNA 발현 수준은 comparative CT 법을 이용하여 계산하였다. CT 값은 형광신호가 정의된 실무율보다 높을 때의 사이클 수이다. 최소 3회의 독립적인 PCR 과정을 수행하였다. PCR 산물의 양은 하우스-키핑 유전자인 β-actin을 이용하여 정규화하였으며, 대조군에 대한 각 mRNA의 상대적인 발현을 확인하였다.

결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, TGF-β1은 중간엽 세포 마커인 α-SMA의 mRNA 발현을 유도한 반면 E-cadherin mRNA 발현은 감소시켰고, 이들은 모두 메트포르민(1mM) 처리에 의하여 완화되었다.

실시예 2. 메트포르민의 TGF -β1 유도된 Smad2 /3, Erk MAPK 및 p38 MAPK 활성화 차단효과.

실시예 1.2와 동일한 방법으로 Phospho-Smad2, Phospho-Smad3, Smad2, Smad3, Phospho-ERK1/2, Phospho-p38, ERK1/2, p38, 및 β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에 대한 웨스턴 블랏을 실시하였다. 또한 HPMC에서 TGF β1 유도된 EMT상의 Smad2/3 유전자의 침묵 효과를 결정하기 위하여, HPMC를 인간 Smad2 및 Smad3 siRNA(Thermo Scientific (San Diego, CA))로 처리하였다. siRNA로 Smad2, ON-TARGETplus SMARTpool human Smad2 (4087); Smad3 siRNA, ON-TARGETplus SMARTpool human Smad3 (4088)를 사용하였다. scrambled siRNA 대조군은 비타겟화된(nontargeting) siRNA 풀(pool)을 이용하였다. siRNA의 형질감염을 위하여 HPMC를 약 80%　confluence에서 6웰에 분주하고, siRNA의 형질감염을 제조사의 매뉴얼에 따라 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 수행하였다. 또한 동일한 실험에서 메트포르민을 추가 처리하여, 메트포르민의 Smad2/3, Erk MAPK 및 p38 MAPK 활성화 차단효과를 확인하였다.

결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, HPMC에 TGF-β1를 처리하고 30분 후, Smad2/3의 인산화가 유도되었으며, 자극 3시간 후부터 p38 및 Erk MAPK 기작이 활성화되었다(도 5의 A, B). 또한 흥미롭게도 siRNA에 의한 Smad2/3 유전자 발현의 침묵은 TGF-β1-유도된 EMT를 개선시켰다(도 5의 C). 또한 p38 및 ERK1/2를 억제하기 위하여 SB203589 및 PD98059를 각각 10 μM 처리한 결과, TGF-β1에 노출된 HPMC에서 EMT가 완화되었다(도 5의 D). 이와 같은 결과를 통해, Smad2/3, p38 및 ERK1/2 기작의 억제가 복막 세포에서 EMT 진행을 억제할 수 있는 타깃이 될 수 있음을 확인하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 메트포르민을 함께 처리한 실험군에서는 TGF-β1 노출된 HPMC에서 Smad2/3, p38 및 Erk MAPK 의 활성화가 효과적으로 차단되었으며 이를 통해 메트포르민이 HPMC에서 Smad2/3, p38 및 ERK1/2 기작을 억제함으로써 EMT를 효과적으로 억제할 수 있는 물질임을 확인하였다.

실시예 3. 메트포르민의 GSK -3β의 인산화 및 β- catenin 핵내 이동 차단 효과

HPMC에서 TGF-β1-유도된 EMT에 영향을 주는 메커니즘을 추가적으로 이해하기 위하여, E-cadherin 하향 조절 및 EMT의 주요 메커니즘으로 알려진 GSK-3β의 활성화, β-catenin의 핵내 이동 및 Snail 신호전달 경로를 Snail, Phospho-GSK3β, GSK3β (Cell signaling, Danver), β-catenin 항체를 이용하여 실시예 1.2와 같은 웨스턴 블랏을 통해 관찰하였다.

결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, TGF-β1은 GSK-3β의 인산화를 유도하였으며, β-catenin, Snail의 발현을 증가시키고(도 7의 A), β-catenin을 핵 내로 이동하도록 유도하였다(도 7의 B). 그러나 메트포르민을 처리한 실험군에서는 TGF-β1에 의해 유도된 β-catenin의 핵내로의 이동이 억제된 것이 확인되었으며, TGF-β1 유도된 GSK-3β의 인산화, Snail의 과발현이 모두 효과적으로 억제되었다(도 7의 B, C).

실시예 4. 메트포르민의 ROS 억제 효과

메트포르민이 TGF-β1에 의해 유도되는 ROS 생산을 NADPH 산화효소 (NOX) 활성 조절 및 NOX mRNA 발현의 조절에 의해서 차단할 수 있는지 여부를 확인하였다. HPMC를 TGF-β1 (1ng/ml) 노출 전에 2',7'-dichlorofluororesceindiacetate(DCF-DA)(Invitrogen, Carlsbad, CA) 10 μM와 함께 배양하였다. 연속 형광을 형광 플레이트 리더로 여기 485nm 및 방출 535nm 파장에서 판독(Molecular device)하여 ROS 생산을 측정하였으며, NOX 활성은 100μL 세포 분쇄액(homogenate)(100 μg 단백질)이 첨가되고 1mM EGTA를 함유하는 50 mM 인산염 완충액, 150mM 수크로오스, 전자 수여체로서 5μM 루시게닌(lucigenin), 전자 공여체로서 100 μM NADPH을 이용한 발광 검정을 이용하여 측정하였다. 초과산화물 생산이 단백질의 상대적 화학발광 unit/mg 의 속도로 표현되었으며, 단백질 함량은 Bio-Rad 단백질 검정 시약(Bio-Rad Laboratories, CA)을 이용하여 측정하였다. 또한 NOX mRNA 발현 조절 여부는 다음과 같은 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 1.3과 같은 방법으로 수행하여 확인하였다.

[표 2]

결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, TGF-β1에 노출된 HPMC에서의 초기 변화로서 ROS 생산이 증가(도 8의 A)되었으며, 이는 TGF-β1 자극 15분 후에 NOX 활성 증가(도 8의 B) 및, NOX 1, NOX2 및 NOX 4 유전자 발현과 함께 관찰(도 8의 C)되었다. 강화된 NOX 활성은 기질로서 NADPH를 이용한 lucigenin 의 과산화 여기(excitation) 에 의해서 평가되었고 NOX-1, -2 및 -4 mRNA 의 증가 또한 발견되었다. 그러나 메트포르민 처리군에서는 TGF-β1에 노출된 DCF-DA 염색 감소로 확인되는 것과 같이 HPMC에서 ROS 생산 발현이 뚜렷하게 개선되었으며(도8의 D, E) TGF-β1 유도된 NOX mRNA 발현 증가 또한 차단되었다(도 9의 C). 이를 통해 메트포르민이 HPMC에서 NADPH 산화효소 (NOX) 활성 조절 및 NOX mRNA 발현의 조절을 통해 ROS를 억제하고 이와 같은 산화적 스트레스를 억제함으로써 EMT를 억제하여 복막의 섬유화를 완화할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. 메트포르민의 미토콘드리아 ROS 생산 억제 효과

메트포르민이 미토콘드리아 ROS 생산 역시 감소시킬 수 있는지 여부를 면역염색법을 통해 확인하였다. 면역형광염색을 위하여, 세포들을 세척하고 4% 인산염 완충액 파라포름알데하이드에서 고정시켰다(25분, 20ㅀC). PBS 로 세척한 후, 세포들을 PBS 내 1% BSA를 이용하여 1시간 동안 처리하였고, 그 후 1% BSA 내에서 NOX4에 특이적인 1차 항체(Abcam, Cambridge, UK)와 함께 하룻밤동안 4℃에서 배양하였다. 세포들을 그 후 0.2% 트윈 20 으로 세척하였으며, 염소 항-마우스 IgG-FITC-접합된 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)와 함께 1시간 동안 실온, 암조건에서 배양하였다. 미토콘드리아를 1 μM MitoTracker Deep Red (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 30분 동안 염색시켰으며, DAPI를 이용하여 핵을 대비 염색하였다. 세포들을 AxioCam HRC 디지털 카메라와 함께 10 x10 및 20 x 10 NA 대물렌즈 장치를 갖는 Axiovert 200 형광 현미경 하에서 시각적으로 관찰하였다. 디지털 사진은 Axiovision 4.3 (Carl Zeiss) 로 얻었으며, 결합 이미지는 포토샵 7.0 (Adobe Systems, Toronto, Ontario, 캐나다)를 이용하여 얻었다.

결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, TGF-β1 은 증가된 Mito-Sox 염색에서 보여주는 바와 같이 HPMC에서 TGF-β1 자극 6시간 이내에 TGF-β1 염색 미토콘드리아 ROS 생산을 증가시키고(도 9의 A), 이는 메트포르민에 의하여 차단되었다. 또한 TGF-β1 노출된 HPMC 에서의 NOX-4 및 미토콘드리아 마커는 co-localization을 나타내었다(도9의 B). 그러나 이와 같은 TGF-β1 노출된 HPMC 에서의 미토콘드리아 ROS 생산 증가는 메트포르민 처리에 의하여 차단되었다. 구체적으로 TGF-β1 유도된 미토콘드리아에서의 NOX-4 발현의 상향 조절을 메트포르민이 차단한다는 것이 면역 염색에서 확인되었다.

실시예 6. 메트포르민의 항산화 활성 증가효과

HPMC 내 산화적/항산화적 상태를 평가하기 위하여, 환원된 글루타치온(glutathione; GSH) 및 SOD(superoxide dismutase)들을 글루타치온 검정 키트(Cell Biolabs, San Diego, CA) 및 SOD 활성 검정(Cell Biolabs, San Diego, CA)를 각각 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 측정하였다. 세포 용해물에 5% MPA(Metaphosphoric Acid)를 첨가하고 균질화하고, 4℃에서 15분 동안 12,000rpm 으로 원심분리하였다. 상청액들을 이용하여 시료 내 함유된 총 글루타치온 함량(GSH/GSSG)을 측정하였다. SOD 측정을 위하여, 세포들을 균질화하고 10분 동안 4℃에서 12,000rpm으로 원심분리하고 상청액을 수득하였다. XOD(Xanthine/Xanthine Oxidase) 시스템에 의하여 과산화물음이온(O₂ ^-)이 생성되었고, 그 후 Chromagen Solution을 이용하여 검출되었다. 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 흡광도를 읽었다.

결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 세포막성 NOX 및 미토콘드리아의 활성화에 의해서 유도되는 산화적 스트레스의 개선과 함께, 메트포르민은 또한 HPMC에서 환원된 글루타티온(glutathione)(GSH/GSSG)의 방출, SOD 활성 및 SOD 발현을 증가시켰다. 이러한 결과에 따라 메트포르민이 HPMC에서 항산화 활성을 증가시킴으로서 EMT를 효과적으로 억제하여 복막 섬유화를 억제할 수 있음을 확인하였다.

실시예 7. 항산화에 따른 EMT 개선효과

메트포르민은 항산화 효과를 증가시킴으로서 EMT를 억제할 수 있는 것으로 앞서의 실시예의 결과 확인되었다. 이에 더하여 산화적 스트레스를 억제하는 항산화 효과가 EMT를 효과적으로 개선할 수 있는 기작이 맞는지 여부를 확인하기 위하여 항산화제 NAC (5 mM), MitoQ (1 μM), and DPI (10 μM) 처리하고 TGF-β1 유도된 EMT에서의 산화 스트레스의 역할을 확인하였다.

결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 항산화제인 NAC, DPI 및 메트포르민은 미토콘드리아에서 TGF-β1 유도된 NOX-4 발현의 상향조절 및 활성을 차단시켰다. 또한 TGF-β1 유도된 E-cadherin 하향 조절 및 TGF-β1 유도된 α-SMA 발현의 상향 조절은 항산화제 NAC, MitoQ , DPI 및 메트포르민 처리에 의하여 뚜렷하게 개선되었다. 이를 통해 메트포르민이 항산화 기작을 통해 복막섬유세포에서 EMT를 효과적으로 억제하는 물질임을 확인하였다.

제제예 1. 의약품의 제조

1.1 산제의 제조

메트포르민 100mg

유당 100mg

탈 10mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1.2 정제의 제조

메트포르민 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1.3 캡슐제의 제조

메트포르민 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 정제를 제조한다.

1.4 주사제의 제조

메트포르민 100mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

Claims (6)

1. 메트포르민(Metfromin)을 포함하는 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 메트포르민은 복막의 EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)를 억제하는 것인, 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 메트포르민은 산화 스트레스를 개선하는 것인, 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 항산화제를 추가로 포함하는, 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 항산화제는 미토큐(MitoQ), NAC(N-acetylcysteine) 및 DPI(diphenyleneiodonium)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 복막 섬유화 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 복막 투석액인 약학적 조성물.

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