WO2016070817A1 - 依达拉奉在制备用于预防和治疗脑淀粉样血管病的药物中的应用 - Google Patents

依达拉奉在制备用于预防和治疗脑淀粉样血管病的药物中的应用 Download PDF

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  • Figure 5 shows that edaravone inhibits the activity of BACE and Gsk-3 ⁇ .
  • 1-5 edaravone significantly reduced the expression of CTF ⁇ and A ⁇ in the brain of AD mice
  • 6-7 edaravone inhibited the expression and activity of BACE in the brain of AD mice, and enhanced the brain ⁇ of AD mice - the activity of secretase
  • 8 Edaravone inhibits the activity of Gsk-3 ⁇ in the brain of AD mice
  • 9-10 In vitro experiments further confirmed that edaravone inhibits the expression of BACE
  • 11 In vitro experiments further confirmed that edaravone inhibits Gsk-3 ⁇ active.

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Abstract

本发明属于制药领域，具体涉及依达拉奉在制备用于预防和治疗脑淀粉样血管病(CAA)的药物中的应用。通过给药依达拉奉，本发明可以清除脑内已经沉积的淀粉样蛋白(Aβ)，和预防脑内Aβ沉积。

Description

依达拉奉在制备用于预防和治疗脑淀粉样血管病的药物中的应用 技术领域
本发明属于制药领域。具体而言，本发明涉及依达拉奉(Edaravone)用于预防和清除脑内Aβ沉积，尤其是用于预防和治疗脑淀粉样血管病(CAA)。
背景技术
脑淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy，CAA)是指β-淀粉样蛋白(Amyloid-beta peptide，Aβ)在大脑皮质和髓质的中小动脉(较少累积静脉)中层和外膜上的沉积。淀粉样蛋白在脑内的沉积可以是任何疾病的组成部分。CAA是阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的一种形态学标志，但也经常见于那些神经功能正常的老年患者中。CAA通常无症状，但也可表现为颅内出血(ICH)、痴呆或短暂性神经功能异常，其中以ICH最为常见。目前尚无有效的CAA治疗药物。
依达拉奉(Edaravone，化学结构为3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，分子式为C10H10N2O，含有3个抗氧化基团(参见，例如，Edaravone(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)，a novel free radical scavenger，for treatment of cardiovascular diseases，Higashi Y1，Jitsuiki D，Chayama K，Yoshizumi M.，Recent Pat Cardiovasc Drug Discov.，Jan.2006；1(1)：85-93，以及The reaction rate of edaravone(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one(MCI-186))with hydroxyl radical，Abe S，Kirima K，Tsuchiya K，Okamoto M，Hasegawa T，Houchi H，Yoshizumi M，Tamaki T.，Chem Pharm Bull(Tokyo)，Feb.2004；52(2)：186-91)，具有很强的抗氧化作用和清除自由基作用。它是当前批准用于临床治疗急性缺血性卒中的药物，通过清除缺血再灌注中产生的氧自由基，而发挥神经保护作用。过去研究发现，依达 拉奉能减少脑缺血再灌注损伤面积，并抑制Fas/FasL信号通路基因表达而阻止神经元凋亡(参见，例如，Edaravone neuroprotection effected by suppressing the gene expression of the Fas signal pathway following transient focal ischemia in rats，Xiao B，Bi FF，Hu YQ，Tian FF，Wu ZG，Mujlli HM，Ding L，Zhou XF，Neurotox Res.，Oct.2007；12(3)：155-62)。新近一项研究发现，依达拉奉能抑制N2a/Swe.Δ9细胞的线粒体依赖的凋亡途径。在缺血再灌注老龄大鼠中，依达拉奉能降低谷胱甘肽过氧化物酶活性，抑制JNK-c-Jun通路，减少神经元凋亡。依达拉奉对其他神经系统变性疾病如肌萎缩侧索硬化(ALS)和帕金森氏病均有治疗作用。
发明概述
本发明人首次发现，依达拉奉直接作用于Aβ，抑制Aβ聚集，促进Aβ纤维解聚，影响Aβ代谢，从而阻断或者延缓脑淀粉样血管病(CAA)的进展。
本发明提供一种治疗CAA的方法，包括向患有或怀疑患有CAA的患者给药有效量的依达拉奉或其类似物或衍生物。
根据本发明，依达拉奉通过静脉内、皮下或口服给药，优选口服给药。
依达拉奉可制成针剂、片剂、胶囊剂等。
如果需要，依达拉奉可与其他治疗CAA的药物，例如Aβ抗体，组合给药。
根据本发明，该方法还包括确定患者患有CAA，其中确定步骤发生在给药步骤之前。所述确定步骤是确定患者罹患CAA的临床症状。
根据本发明，患者脑中有或者没有阿尔茨海默氏症的特征性斑块。
根据本发明，患者有或者没有阿尔茨海默氏症的症状。
根据本发明，患者有过或者没有心脏病发作或中风。
根据本发明，依达拉奉的日剂量在约0.1mg/kg至约25mg/kg之间。其中对预防而言，日剂量优选为0.5-5.0mg/kg，而对治疗而言，日剂量优选为5.0-25mg/kg。例如，日剂量为约0.5mg/kg，3.5mg/kg或15mg/kg，每日两次至每周两次给药。
根据本发明，该方法还包括给药期间监测CAA相应的体征或症状的变化。
本发明还提供一种预防CAA的方法，包括向易患CAA的患者给药有效量的依达拉奉或其类似物或衍生物。
本发明还提供一种减少患者血管淀粉样蛋白的方法，包括按照与有效去除血管淀粉样蛋白相关和减少脑微出血发生率的治疗方案给药依达拉奉。在一实施方式中，该方法还包括通过MRI监测患者的脑微出血。在另一实施方式中，该方法还包括通过PET扫描监测患者的血管淀粉样蛋白的去除。所述治疗方案可以是长期治疗方案。
依达拉奉及其类似物或衍生物
依达拉奉的化学名是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)，分子式是C10H10N2O，分子量是174.19，化学结构式是
Figure PCTCN2015093837-appb-000001
依达拉奉的类似物包括位于吡唑啉环的3位甲基可以是乙基、丙基等低级(C1-6)烷基，或低级烷氧基，例如甲氧基、乙氧基等；或者3位的甲基可以是H，而4位被低级烷基或烷氧基取代。依达拉奉的衍生物包括酯，即吡唑啉环的5位酮转化为烯醇，与羧酸反应生成酯，例如，甲酯、乙酯等。所述酯(前体)在体内水解后，再转化成酮。另外，苯基也任选被一个或多个取代基取代，所述取代基选自低级烷基、低级烷氧基、硝基、卤素等。
本发明预期上述这些类似物和衍生物具有与依达拉奉等同的功能。
据报道，遗传因素在某些类型的CAA和CAA相关疾病中起作用。因此，任选在开始治疗之前确定疾病的症状、体征或风险因子的存在与否。
CAA患者的诊断和监测
同大多数神经疾病一样，常常从患者的病史与仔细询问家族史和患者的发病情况及症状的模式、以及神经学检查而得出诊断。脑部计算机断层扫描(CT)或核磁共振成像(MRI)可以鉴定脑叶出血、中风或点状出血，在排除动静脉畸形、脑肿瘤或其它出血原因中很重要。血管造影术(血管和心脏内部的X线检查)对CAA的诊断没有帮助，但可能是排除动脉瘤所需要的。脑活检(手术切除小块脑组织)可以显示特征性 淀粉样沉积物。当诊断不确定时，可能需要活检来排除潜在要治疗的病症。检查脑脊液蛋白的腰椎穿刺可以显示特征性的异常。
伴有出血CAA必须与其它类型的脑出血区分开来。在CAA中，出血通常发生在叶区，常破裂进入脑及其被膜间的蛛网膜下腔中，并在夜晚发生。在高血压相关的出血中，出血通常发生在脑内更深处，破裂进入脑内深处的室或腔中，并在日间活动时发生。脑出血的其它原因有动静脉畸形，创伤，动脉瘤，脑肿瘤中出血，血管炎(血管的炎症)或出血性病症。患者可以通过MRI监测脑微出血和/或通过正电子发射断层(PET)扫描监测血管淀粉样蛋白的去除。
适于治疗的患者包括处于CAA风险但未表现出症状的个体，以及目前正表现出症状的患者。
治疗方案
在预防性应用中，向易患CAA或处于CAA风险中的患者给药药物组合物或药剂，方案包括所述组合物或药剂的给药量和频率足以消除或降低风险、减轻严重度或延迟疾病发作，包括疾病的生理学、生物化学、组织学和/或行为症状，疾病发展过程中呈现出的并发症和中间病理表型。在治疗性应用中，向怀疑患有或已患有这样的疾病的患者给药组合物或药剂，方案包括所述组合物的给药量和频率足以治愈或至少部分遏制疾病的症状，包括疾病发展中呈现出的并发症和中间病理表型。完成治疗性或预防性治疗的适当量被定义为有效的治疗或预防剂量。完成治疗性或预防性治疗的适当的量和给药频率的组合被定义为有效治疗或预防方案。
本发明药剂给药的剂量和频率可以根据治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，向尚未处于疾病状态中的患者给药含有依达拉奉的药物组合物，以增强患者的抵抗力。这样的量被定义为 “有效预防剂量”。在这种应用中，精确的量还是依赖于患者的健康状况，但通常在每剂0.1-25mg，特别是每剂0.5-5.0mg的范围内。相对低的剂量以相对不频繁的间隔长时间给药。一些患者在其余生中持续接受治疗。
在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔的相对高剂量(例如，每剂约3.5-25mg的剂量，或者5.0-25mg的剂量)，直至减轻或终止疾病的进展，优选直至患者表现出疾病症状的部分或完全改善。之后，可以向患者施用预防性方案。
本发明的药物可任选与其它在CAA或AD治疗中至少部分有效的药剂组合给药。在淀粉样沉积物出现在脑血管系统中的CAA情况下，本发明的药剂还可以与增加本发明药物通过血脑屏障的其它药物联用。
本发明的药物可以通过胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内或肌内方式给药，用于预防性和/或治疗性治疗。尽管其它途径同样有效，但典型的给药途径是口服，其次是肌内注射。这种类型的注射最通常在臂或腿部肌肉中实行。在一些方法中，药剂直接注射到沉积物累积的特定组织中，例如，颅内注射。肌内注射或静脉输注也是优选的。在一些方法中，特定的治疗性抗体直接注射到颅内。
本发明的有益效果主要体现在，依达拉奉或其类似物或衍生物具有抑制Aβ聚集作用，从而可以消除已经沉积在脑内血管壁上或者脑实质内的Aβ，或者预防Aβ在脑内血管壁和脑实质中继续沉积。
附图说明
为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介 绍。显然，这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式。本发明的技术方案包括但不限于这些附图。
图1显示依达拉奉对Aβ具有显著的抑聚和解聚作用。其中，1：依达拉奉的分子结构；2和3：硫磺素T实验证明依达拉奉对Aβ具有显著的抑聚和解聚作用；4-6：Western blot进一步证实依达拉奉对Aβ具有显著的抑聚作用；7-10：透射电镜进一步明确依达拉奉对Aβ具有显著的抑聚和解聚作用。
图2显示依达拉奉能够拮抗Aβ对细胞的毒性作用。其中，1-3：依达拉奉能够拮抗Aβ对SH-SY5Y细胞的毒性作用，无论是细胞存活率及细胞轴突长度均明显高于单纯Aβ处理组；4-5：依达拉奉能够拮抗Aβ对原代培养的皮层神经元的毒性作用，依达拉奉处理组的皮层神经元的轴突长度明显高于单纯Aβ处理组；6-7：依达拉奉显著减少Aβ引起的细胞凋亡；8：ROS实验证实依达拉奉显著减少细胞内的氧化水平。
图3显示依达拉奉显著改善AD小鼠的智能水平。其中，1-2：Morris水迷宫检测发现依达拉奉预防组的小鼠逃逸时间及平台穿越次数明显少于对照；3和4：依达拉奉预防组小鼠在Y迷宫检测中表现明显好于对照组；5-7：依达拉奉预防组小鼠在旷场实验中表现明显好于对照组；8-10：依达拉奉治疗组小鼠在Morris水迷宫检测中表现仍明显好于对照组。
图4显示依达拉奉显著减少脑内及脑血管内的Aβ沉积。其中1-2：依达拉奉预防实验中，依达拉奉明显减少脑内Aβ沉积；4-5：依达拉奉治疗实验中，依达拉奉明显减少脑内Aβ沉积；3和6：无论是预防实验或治疗试验，依达拉奉能够显著减少脑内Aβ水平；7-8：无论是预防实验或治疗试验，依达拉奉能够显著减少脑血管内Aβ沉积。
图5显示依达拉奉抑制BACE及Gsk-3β的活性。其中，1-5：依达拉奉显著减少AD小鼠脑内CTFβ及Aβ的表达；6-7：依达拉奉抑制AD小鼠脑内BACE的表达及活性，增强AD小鼠脑内α-分泌酶的活性； 8：依达拉奉抑制AD小鼠脑内Gsk-3β的活性；9-10：体外实验进一步证实依达拉奉抑制BACE的表达；11：体外实验进一步证实依达拉奉抑制Gsk-3β的活性。
图6显示依达拉奉显著改善Aβ引起的继发性病理改变。其中，1-3：依达拉奉能够显著减少AD小鼠脑内神经元结构的破坏及神经元的丢失；4：依达拉奉能够显著减少AD小鼠脑内神经元的凋亡；5：依达拉奉能够显著减少AD小鼠脑内星形胶质细胞及小胶质细胞反应；6-7：依达拉奉能够显著减少AD小鼠脑内Tau蛋白的磷酸化程度；8-9：依达拉奉能够保护AD小鼠脑内突触结构的完整性；10：依达拉奉能够显著减少AD小鼠脑内神经炎症反应。
图7显示依达拉奉显著减少AD小鼠脑内氧化水平。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的优选方案进行描述。这些描述只是举例说明本发明的技术方案的特征和优点，而非限制本发明的保护范围。
1.硫磺素T荧光试验
依达拉奉对Aβ聚集的抑制作用：10μM Aβ42与不同浓度的依达拉奉溶液(0μM，1.56μM，3.13μM，6.25μM，11.25μM，25.0μM，50.0μM及100μM)在37℃孵箱内孵育两天，加入5μM硫磺素T工作液继续孵育20分钟，酶标仪下读取OD值(激发波长为450nm，发射波长为482nm)。
依达拉奉对Aβ纤维的解聚作用：Aβ42溶于DMEM培养基中，37℃孵育两天形成Aβ纤维。已形成的Aβ纤维与不同浓度的依达拉奉溶液(具体浓度同前)在相同的条件下再孵育3天后，加入5μM硫磺素T工作液孵育20分钟，酶标仪下读取OD值(激发波长与发射波长同前)。
2.透射电子显微镜负染色
为进一步证实依达拉奉对Aβ纤维形成的抑制作用及对已形成的Aβ纤维的解聚作用，透射电子显微镜(TEM)负染色应用于本研究。将聚醋酸甲基乙烯脂包被的铜网预先置于24孔板底，不同浓度依达拉奉工作液与Aβ共同孵育于24孔板内。Aβ的处理及后续孵育过程同硫磺素T实验。作用完毕后，吸去多余液体，磷钨酸染色30秒。样本自然风干，Joel 1200EX透射电镜观察、拍照。
3.Western blot方法检测依达拉奉对Aβ的抑聚作用
1μM Aβ42与不同浓度的依达拉奉溶液(0μM，0.3μM，1μM及3μM)在37℃孵箱内孵育两天，混合液与非还原性上样缓冲液轻轻混合，进行Western blot检测，检测抗体为小鼠来源的Aβ抗体(6E10)。
4.SH-SY5Y细胞株培养、细胞存活能力检测和轴突生长能力检测
SH-SY5Y细胞株购于北京协和医院细胞库，于5％CO2，37℃的湿化孵育箱内培养。MTT细胞存活度检测根据试剂盒(Sigma)说明书进行操作。用Aβ和不同浓度依达拉奉的混合工作液对SH-SY5Y细胞处理24小时，然后用MTT工作液(0.5mg/ml)在37℃温度孵育4小时，10％SDS孵育15分钟。563nm波长处(Synergy H4，Bio Tek)测定其OD值。轴突生长实验根据既往文献(参见，例如，Wang，Y.J.，et al.，Effects of proNGF on neuronal viability，neurite growth and amyloid-beta metabolism.Neurotox Res，2010，17(3)：p.257-67)中描述的方法进行。用含1％FBS及10μM全反式维甲酸(RA)(Sigma，US)的培养基培养SH-SY5Y细胞7天后，用1μM Aβ和不同浓度的依达拉奉对细胞处理24小时。倒置显微镜下观察，采图，应用ImageJ软件对每组50个神经元的轴突的长度进行测量。
5.皮层神经元原代培养，ROS检测及碘化丙啶(PI)标记凋亡细胞
皮层神经元从刚出生的129sv小鼠脑中分离，在多聚赖氨酸包被的盖玻片上培养。72小时后，用1μM Aβ42寡聚体和不同浓度的依达 拉奉工作液对细胞处理24小时，然后用4％多聚甲醛固定10分钟，再用MAP-2抗体染色。轴突长度的测量方法如上述。
ROS检测根据制造商(Cell Biolabs Inc)提供的方案进行。
碘化丙啶(PI)标记凋亡的神经元的方法具体如下：PBS液洗涤活性神经元3次，PI工作液(2μg/ml)在室温下孵育洗涤后的活性神经元15分钟，然后用HEPES缓冲液(100mM HEPES，140mM NaCl，25mM CaCl2，pH 7.4)洗涤3次×5分钟。最后细胞在PBS中用2％多聚甲醛固定20分钟，然后用缓冲液洗涤3次×5分钟。DAPI(1∶1000)孵育20分钟复染。细胞在B50荧光显微镜观察，采图。
6.动物和依达拉奉给药
APPswe/PS1DE9(AD)转基因小鼠购于美国Jackson实验室(编号：005864)，饲养于第三军医大学第三附属医院SPF级动物房。所有应用于小鼠的处理及相关实验都得到第三军医大学动物伦理委员会批准，备案。在预防实验中，3月龄AD小鼠给予依达拉奉治疗6个月，空白对照(AD小鼠)和正常野生型对照(野生型同窝小鼠)给予等量生理盐水。在治疗实验中，9月龄AD小鼠给予依达拉奉治疗3个月，同样设立年龄相匹配的空白对照(AD小鼠)及正常野生型对照。根据成人依达拉奉治疗剂量推算出小鼠等量治疗剂量：依达拉奉注射液12.6mg/kg，腹腔注射，每周2次。同时另外2组小鼠给予依达拉奉口服用药，日剂量为0.1-25mg/kg，例如，3.5mg/kg(既适用于预防也适用于治疗)，或者预防组的日剂量也可为6.4mg/kg，治疗组的日剂量也可为12.8mg/kg。从3月龄给药至9月龄为预防实验，从9月龄用药至12月龄为治疗实验。达到既定时间后，每个组的小鼠按照后续方法进行行为学测验。每组取3只小鼠用于Golgi染色。剩余的小鼠过度麻醉后解剖大脑。一侧大脑半球冰冻后用于生化分析，另一侧大脑半球用4％多聚甲醛固定用于组织分析。
7.行为学检测
每组的所有小鼠都进行行为学测试，包括水迷宫、Y迷宫和旷场实验。水迷宫检测主要包括4天的平台实验及随后的探索实验。整个过程通过录像记录，用图像分析软件进行分析(ANY-maze，Stoelting)。在平台实验中，测算逃逸路径长度和逃逸潜伏期；在探索实验中，测量各个象限时间和穿越平台时间。自发性交替实验和新臂探索实验在Y迷宫内进行。在自发交替实验中，小鼠在迷宫内自由活动5分钟。交替(Alternation)定义为连续进入相互连接的三个臂。交替百分比为实际的交替次数与最大可能的交替次数(定义为入臂次数减2)的比值，乘以100。新臂探索实验，一个臂(新臂)被阻挡，小鼠允许在其他两臂内探索5分钟。在2小时的间歇期后，小鼠可以自由探索三个臂。旷场实验，小鼠置于旷场中央3分钟，其路径被跟踪系统(Limelight，ActiMetrics)记录。同时，小鼠的直立、修饰、排便及排尿次数均被记录。
8.Aβ脑内沉积定量分析
刚果红染色标记致密Aβ斑块。取等间距(～1.3mm)冰冻切片，室温下氯化钠工作液处理20分钟，刚果红工作液处理45分钟，用无水酒精快速脱水。6E10免疫组化法标记总Aβ斑块。6E10染色采用漂片法进行。用ImageJ分析软件对新皮层和海马区的Aβ斑块进行定量分析，得到Aβ斑块所占的的面积百分比及单位面积内数量。
9.脑血管淀粉样变检测
为评估脑血管淀粉样变严重程度，一种新的评估方法应用于本研究中。用α-平滑肌肌动蛋白抗体(1a4)和Aβ抗体(6E10)双重免疫荧光染色标记大脑血管，激光共聚焦下(Radiance 2000MP，Bio-Rad)观察，记录血管图像。根据如下四级量表对每根血管的CAA严重程度进行评分：0级：没有Aβ沉积；1级：少量Aβ沉积，Aβ沉积少于血管周长的三分之一；2级：中度Aβ沉积，Aβ沉淀大于血管周长的三分之一，但 少于三分之二；3级：重度沉积，Aβ沉积超过血管周长的75％。
10.微出血染色和定量分析
首先用2％亚铁氰化钾染色含铁血黄素，然后用1％的核速红复染细胞核。在显微镜下，对每张脑组织切片中的微出血定量，计算每张切片含铁血黄素沉淀的平均数。
11.ELISA分析
冰冻脑组织匀浆后，依次用TBS、SDS和甲酸进行萃取。TBS、SDS和甲酸提取物分别代表可溶性Aβ，疏松的老年斑和致密的老年斑。脑内和血清中Aβ40、Aβ42(Covance)、IL-6、IL-1β、INF-γ、TNF-β(eBioscience，BMS603，BMS6002，BMS606，BMS607)浓度使用ELISA试剂盒(Covance或eBioscience)测定。测定步骤参照试剂盒说明书进行。脑组织中alpha与beta分泌酶的活性的测定也参照试剂盒(R&D Systems)说明书进行。
12.神经元NeuN，ChAT和MAP-2免疫染色
为明确依达拉奉对神经元的保护作用，对脑组织切片进行NeuN，ChAT和MAP-2漂片法免疫组化染色检测。一抗分别为兔抗鼠NeuN，ChAT和MAP-2抗体，稀释比例均为1∶200，4℃孵育过夜，生物素化的Ig二抗37℃孵育2h，DAB显色，系列脱水，透明，封片。
13.星形胶质细胞反应、小胶质细胞反应和Tau过度磷酸化免疫染色
按照前述步骤进行漂片法免疫组化染色。初始抗体分别是兔抗鼠CD45抗体(标记小胶质细胞)，兔抗鼠GFAP(标记星形胶质细胞)，兔抗鼠pSer396-Tau抗体。稀释比例为1∶200，后续步骤同前。
14.Golgi染色
动物过度麻醉后，先后进行含0.5％亚硝酸钠的生理盐水，4％多聚甲醛，Golgi染液心脏灌注。灌注完毕后，将脑组织切割成0.1cm×0.1cm的小块，并转移至含有Golgi染液的棕色容器内，室温下避光放置3天。然后浸入1％硝酸银溶液中继续孵育，避光反应3天。脑组织用振荡切片机切割(Leica，VT1000S，Germany)，切片厚度35um。统计海马CA1区锥体细胞中段树突10μm内的树突棘数量。
15.二硝基苯肼(DNPH)蛋白印迹法测定脑组织内氧化水平
组织内蛋白质羰基水平反映组织内氧化水平。DNPH与蛋白质羰基反应形成蛋白-DNP腙复合物，可以通过DNPH抗体检测该复合物的水平，从而评估组织内氧化水平。5μl新鲜脑组织样品在室温下与12％SDS和10μl DNPH工作液共同孵育20分钟。7.5μl中和液中和样品。含15μg总蛋白的样品加样，进行Western blot检测。过度氧化或氧化失衡是AD病理机制的一个重要方面，促使Aβ沉积和神经元纤维缠结形成(参见，例如，Oxidative Stress and its Implications for Future Treatments and Management of Alzheimer Disease，Int J Biomed Sci，Clark，T.A.，et al.，2010，6(3)：p.225-227)。
16.蛋白质印迹(Western blot)
脑组织内Aβ产生和降解相关酶及分子的水平、过度磷酸化的Tau蛋白水平和突触可塑性相关蛋白的水平均通过蛋白印迹方法检测。脑组织匀浆里的蛋白用RIPA缓冲液提取。样品转移到SDS-PAGE(4-10％丙烯酰胺)凝胶。分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜。印迹用以下抗体探索：APP C末端抗体(171610，Millipore)，BACE1抗体(Millipore)，Aβ抗体(6E10，Abcam)，Neprilysin抗体(Millipore)，RAGE抗体(Millipore)，LRP抗体(5A6，Calbiochem)，IDE抗体(epitomics)，磷酸化Tau蛋白抗体，包括pS396(Signalway)、pT231(Signalway)、pS199(epitomics)、pS262(Abcam)，SNAP25抗体(Millipore)，Synaptophysin抗体(Millipore)，Synapsin I抗体(Millipore)，VAMP1抗体(Millipore)，PSD95抗体 (Millipore)，纤维肌动蛋白抗体(Actin)(Sigma-Aldrich)。IRDye 800CW二抗孵育后，Odyssey荧光扫描仪扫描。
本申请的研究结果表明，对Aβ病理过程的多个关键环节具有明显的干预作用：
(1)依达拉奉抑制Aβ聚合成纤维，并促进Aβ纤维解聚
硫磺素T实验证实依达拉奉能够有效抑制Aβ聚集，呈剂量依赖性，依达拉奉浓度越高，效应越明显；同时解聚实验证实依达拉奉亦能有效地解离已形成的Aβ纤维或较大的聚集体，依达拉奉浓度越高，此效应越明显(参见图1：2和3)。Western blot实验进一步验证了上述结论，实验发现3.0μM依达拉奉能够抑制50％的Aβ形成多聚体(参见图1：4-6)。投射电镜实验发现3.0μM依达拉奉显著抑制Aβ的聚集，部分铜网内甚至无法观测到Aβ。同时TEM发现3.0μM依达拉奉能够解离近80％的Aβ纤维(参见图1：7-10)。
(2)依达拉奉拮抗Aβ的细胞毒性作用
为了探讨依达拉奉是否具有拮抗Aβ细胞毒性的作用，本研究应用SH-SY5Y细胞株及原代培养的皮层神经元作为研究对象，给予1μM Aβ寡聚体及不同浓度梯度的依达拉奉处理，观察其细胞存活率及轴突生长情况。首先，SH-SY5Y实验中，研究发现1μM Aβ寡聚体能引起大量的细胞死亡(存活细胞约为正常对照组的40％)，广泛的神经轴突塌陷(轴突长度约为正常对照组的50％)。而加入依达拉奉后，细胞生存率明显提高，且随着依达拉奉浓度的升高，细胞生存率不断上升，呈显著的剂量依赖性。同时，加入依达拉奉后，反式维A酸诱导的轴突长度也明显增加(参见图2：1-3)。在原代培养的皮层神经元实验中，也观察到上述效应(参见图2：4和5)。其次，ROS实验发现依达拉奉能够扭转Aβ引起的氧化应激反应(参见图2：8)。PI实验中，依达拉奉处理组的凋亡细胞比例明显少于单纯Aβ对照组(参见图2：6和7)。
(3)依达拉奉的应用明显改善AD小鼠的行为学表现
通过Morris水迷宫检测，本发明人发现，无论是预防实验(参见图3：1-2)，还是治疗实验(参见图3：8-10)，依达拉奉处理组的AD小鼠行为学表现明显好于对照组，表现为逃逸时间减少，穿越平台次数增多。Morris水迷宫检测证实依达拉奉能够改善AD小鼠的学习及空间记忆能力。为了全面评价依达拉奉对于AD小鼠的智能改善情况，本研究先后又进行Y迷宫，旷场实验等检测。研究发现依达拉奉处理组的AD小鼠在自发性交替实验及新臂探索实验中，进臂次数显著高于对照组，进入新臂次数比例显著增高，交替(Alternation)比例亦明显增高，表明依达拉奉能够改善AD小鼠的探索及工作记忆能力(参见图3：3和4)。旷场实验中，本发明人发现依达拉奉处理的小鼠直立探索次数及探索的路程均显著高于对照组(参见图3：5-7)。无论是腹腔注射，还是口服给药，均得到上述类似结果。证明不同给药途径的依达拉奉处理，均能改善AD小鼠的智能水平。
(4)依达拉奉明显减少Aβ在脑血管中的沉积
通过刚果红染色及6E10免疫染色，本发明人发现，依达拉奉能够显著减少Aβ在脑内的沉积，约为对照组的50％(参见图4：1-2和4-5)。难能可贵的是，通过血管壁及Aβ双重免疫荧光染色，本发明人发现依达拉奉处理组Aβ在脑血管内的沉积明显减少，CAA 0级及1级血管比例明显增加，2级及3级血管比例明显减少(参见图4：7和8)。同时，AD小鼠的脑组织用TBS，2％SDS及FA进行萃取，分别得到不同Aβ聚集状态的提取物，应用Covance ELISA试剂盒检测其Aβ40，Aβ42的水平。本发明人发现，依达拉奉能够显著减少不同聚集状态的Aβ水平(参见图4：3和6)，这与体外实验结果相一致。口服给药，均得到上述类似结果。
(5)依达拉奉通过抑制BACE1的表达减少Aβ的产生
通过蛋白质印迹(Western blot)本发明人发现依达拉奉能够降低Aβ 的脑内产生，减少CTFβ的生成(参见图5：1-5)。探索机制，本发明人发现依达拉奉对NEP，IDE，RAGE，LRP等Aβ代谢酶无影响，但对APP的剪切酶α-分泌酶及β-分泌酶(BACE1)有显著影响，表现为依达拉奉处理组的α-分泌酶活性增加，而β-分泌酶的表达及活性明显降低(参见图5：6-7和9-10)。同时，本发明人还发现依达拉奉能够抑制Gsk-3β的活性(参见图5：8和11)。
(6)依达拉奉可减少小胶质细胞、星形胶质细胞及神经炎性反应
无论是预防实验，还是治疗实验，依达拉奉处理组的AD小鼠脑内小胶质细胞、星形胶质细胞及神经炎性反应均显著下降。口服给药的依达拉奉处理组也能明显降低AD小鼠脑内小胶质细胞、星形胶质细胞及神经炎性反应水平(参见图6：5和10)。
(7)依达拉奉减少神经元的死亡、突触变性
神经元的丢失，突触的变性为AD的典型临床表现。为探索依达拉奉是否具有神经元保护作用，本发明人进行MAP-2，NeuN，ChaT等免疫组化染色。研究发现与对照组相比，依达拉奉处理组，NeuN，ChaT阳性面积比例显著增高。Golgi染色发现树突棘的数量亦显著增高。Western blot发现依达拉奉处理组突触相关蛋白的表达明显高于对照组(参见图6：1-3，4和8-9)。
(8)依达拉奉减少Tau蛋白磷酸化水平
通过Western blot本发明人发现依达拉奉能够在多个病理位点减少Tau蛋白磷酸化水平(参见图6：6和7)。同时p396-Tau免疫组化本发明人发现依达拉奉处理组p396-Tau阳性面积比例明显降低。
以上具体实施方式的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明的技术方案进行若干改进和修饰，但这些改进和修饰也落入本发明权利要求请求保护的范围内。

Claims (17)

  1. 依达拉奉或其类似物或衍生物在制备药物中的应用，其中通过向需要的患者给药，所述药物用于治疗脑淀粉样血管病(CAA)。
  2. 权利要求1的应用，其中所述药物通过静脉内、皮下或口服给药。
  3. 权利要求1的应用，其中所述药物制成针剂、片剂或胶囊剂。
  4. 权利要求1的应用，其中依达拉奉与其他治疗CAA的药物组合给药。
  5. 权利要求4的应用，其中所述其他药物为Aβ抗体。
  6. 权利要求1的应用，其中在药物给药前，还包括确定患者患有CAA。
  7. 权利要求6的应用，其中所述确定是确定患者罹患CAA的临床症状。
  8. 权利要求1的应用，其中所述患者的脑中有或者没有阿尔茨海默氏症的特征性斑块。
  9. 权利要求1的应用，其中所述患者有或者没有阿尔茨海默氏症的症状。
  10. 权利要求1的应用，其中所述患者有或者没有心脏病发作或中风。
  11. 权利要求1的应用，其中依达拉奉的日剂量在0.1mg/kg至25mg/kg之间。
  12. 依达拉奉或其类似物或衍生物在制备药物中的应用，其中通过向易患CAA的患者给药，所述药物用于预防CAA。
  13. 依达拉奉或其类似物或衍生物在制备药物中的应用，其中通过向需要的患者给药，所述药物用于减少该患者的血管淀粉样蛋白。
  14. 权利要求13的应用，其中所述给药按照与去除血管淀粉样蛋白相关或减少脑微出血发生率的治疗方案进行。
  15. 权利要求14的应用，其中所述治疗方案包括通过MRI监测患者的脑微出血。
  16. 权利要求14的应用，其中所述治疗方案包括通过PET扫描监测患者的血管淀粉样蛋白的去除或沉积。
  17. 权利要求14-16任一项的应用，其中所述治疗方案是长期治疗方案。
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