JP6548738B2

JP6548738B2 - 脳アミロイド血管症の予防及び治療用医薬品を製造するためのエダラボンの使用

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Publication number: JP6548738B2
Application number: JP2017542258A
Authority: JP
Inventors: 延江王; 樹生矯; 秀卿姚; 新富周
Original assignee: 中国人民解放軍第三軍医大学第三附属医院
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2019-07-24
Anticipated expiration: 2035-11-05
Also published as: CN105616405B; EP3216447A1; CN105616405A; US20170312253A1; JP2017533267A; WO2016070817A1; EP3216447B1; EP3216447A4

Description

本発明は製薬分野に属す。具体的には、本発明は脳内Aβ沈着の予防と除去、特に脳アミロイド血管症(CAA)の予防と治療のためのエダラボン(Edaravone)の使用に係る。

脳アミロイド血管症(cerebral amyloid angiopathy, CAA)とはβアミロイドタンパク質(Amyloid-beta peptide、Aβ)が大脳皮質と髄質の小中サイズの動脈(少数例で静脈)の中層と外膜に沈着することを指す。アミロイドタンパク質の脳内沈着は如何なる疾患の構成部分にもなり得る。CAAはアルツハイマー病(Alzheimer disease、AD)の一種の形態学的ホールマークであり、神経機能が正常な高齢患者によく見られる。CAAは通常、無症状であるが、頭蓋内出血(ICH)、痴呆又は一過性神経機能異常として現れることもあり、ICHが最もよく見られる。有效なCAA治療薬は今のところまだ無い。

エダラボン(Edaravone)は、化学構造が3-メチル-1-フェニル-2-ピラゾリン-5-オンであり、分子式がC₁₀H₁₀N₂Oであり、3つの抗酸化官能基を含み(例えば、Edaravone(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one), a novel free radical scavenger, for treatment of cardiovascular diseases, Higashi Y1, Jitsuiki D, Chayama K, Yoshizumi M., Recent Pat Cardiovasc Drug Discov., Jan. 2006; 1(1):85-93、及びThe reaction rate of edaravone (3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one (MCI-186)) with hydroxyl radical, Abe S, Kirima K, Tsuchiya K, Okamoto M, Hasegawa T, Houchi H, Yoshizumi M, Tamaki T., Chem Pharm Bull (Tokyo), Feb. 2004; 52(2):186-91参照)、非常に強い抗酸化作用とラジカル除去作用を有する。これは現在、急性虚血発作の臨床治療用薬として認められており、虚血再灌流中に発生する酸素フリーラジカルを除去することによって神経保護作用を奏する。過去の研究では、エダラボンは脳虚血再灌流障害の面積を減少させ、Fas/FasLシグナル経路の遺伝子発現を抑制し、ニューロンアポトーシスを阻害できることが発見されている(例えば、Edaravone neuroprotection effected by suppressing the gene expression of the Fas signal pathway following transient focal ischemia in rats, Xiao B, Bi FF, Hu YQ, Tian FF, Wu ZG, Mujlli HM, Ding L, Zhou XF, Neurotox Res., Oct. 2007; 12(3):155-62参照)。最近の研究では、エダラボンはN2a/Swe.Δ9細胞のミトコンドリア依存性アポトーシス経路を抑制できることが発見されている。虚血再灌流の高齢ラットにおいて、エダラボンはグルタチオンペルオキシダーゼの活性を低減し、JNK-c-Jun経路を抑制し、ニューロンアポトーシスを減少させることができる。エダラボンは他の神経系の変性疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症(ALS)やパーキンソン病に対しても治療作用を有する。

本発明者は初めてエダラボンが直接にAβに作用し、Aβ凝集を抑制し、Aβ線維の凝集分解を促進し、Aβ代謝に影響することによって脳アミロイド血管症(CAA)の進行をブロック又は遅らせることができることを発見した。

本発明はCAAを患っている又は患っている疑いがある患者に有效量のエダラボン又はその類似物又は誘導体を投与することを含むCAA治療方法を提供する。

本発明によれば、エダラボンは静脈内、皮下又は経口投与され、好ましくは経口投与される。

エダラボンは注射剤、錠剤、カプセル剤等に調製できる。

必要な場合、エダラボンは他のCAA治療薬、例えばAβ抗体と組み合わせて投与できる。

本発明によれば、当該方法は、さらに、投与ステップの前に患者がCAAを患っていることを確定する確定ステップを含む。前記確定ステップは患者がCAAの臨床症状を有することを確定することである。

本発明によれば、患者の脳内にはアルツハイマー病の特徴的な斑がある又は無い。

本発明によれば、患者にはアルツハイマー病の症状がある又は無い。

本発明によれば、患者には心臓発作又は脳卒中があった又は無い。

本発明によれば、エダラボンの一日量は約0.1 mg/kg〜約25 mg/kg の間である。そのうち、予防のためには、一日量0.5-5.0 mg/kgが好ましく、治療のためには、一日量5.0-25 mg/kgが好ましい。例えば、一日量約0.5 mg/kg、3.5 mg/kg又は15 mg/kgであり、毎日2回〜毎週2回投与する。

本発明によれば、当該方法は、さらに、投与期間CAAに伴う兆候又は症状の変化をモニタリングすることを含む。

本発明はさらに、CAAを患い易い患者に有效量のエダラボン又はその類似物又は誘導体を投与することを含むCAA予防方法を提供する。

本発明はさらに、血管アミロイドタンパク質の有効除去に関し、かつ、脳微小出血の発生率を減少させる治療方案に基づいてエダラボンを投与することを含む、患者の血管アミロイドタンパク質を減少する方法を提供する。一つの実施の形態において、当該方法はさらに、MRIにより患者の脳微小出血をモニタリングすることを含む。別の実施の形態において、当該方法はさらに、PETスキャンにより患者の血管アミロイドタンパク質の除去をモニタリングすることを含む。前記治療方案は長期治療方案とすることができる。

エダラボン及びその類似物又は誘導体
エダラボンの化学名は3-メチル-1-フェニル-2-ピラゾリン-5-オン(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)であり、分子式はC₁₀H₁₀N₂Oであり、分子量は174.19であり、化学構造式は下記である：

エダラボンの類似物は、ピラゾリン環の3位のメチルをエチル、プロピル等の低級(C_1-6)アルキル、又はメトキシ、エトキシ等の低級アルコキシで置き換えてもよいもの、又は3位のメチルをHで置き換えてもよく、4位が低級アルキル又はアルコキシに置換されるものを含む。エダラボンの誘導体は、ピラゾリン環の5位のケトンがエノールに変換され、カルボン酸と反応して生成されるメチルエステル、エチルエステル等のエステルを含む。前記エステル(前駆体)は体内で加水分解した後、再びケトンに変換される。また、フェニルも一つ又は複数の置換基で任意に置換され、前記置換基は低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ、ハロゲン等から選択される。

本発明では上記これら類似物と誘導体がエダラボンと等同の機能を有することが予測される。

あるタイプのCAAとCAA関連の疾患において遺伝要因が作用するとの報告がある。したがって、治療の開始前に疾患の症状、兆候又は危険因子の有無を任意に確定する。

CAA患者の診断とモニタリング
大多数の神経疾患と同様、通常、患者の病歴、家族の詳細な病歴、患者の発病状況や症状のパターン、及び神経学検査に基づき診断が行われる。頭部コンピュータ断層撮影(CT)又は核磁気共鳴画像法(MRI)は脳葉出血、脳卒中又は点状出血を確認でき、動静脈奇形、脳腫瘍又は他の出血原因を排除する場合に非常に重要である。血管造影法(血管と心臓内部のX線検査)はCAAの診断には役に立たないが、動脈瘤の排除には必要と思われる。脳生検(手術で脳組織を少し切除する)は特徴的なアミロイド沈着物を表示できる。診断が不確定の場合、生検により治療すべき潜在的な病症を排除しなければならない可能性がある。脳脊髄液タンパク質が確認される腰椎穿刺は特徴的な異常を表示できる。

出血を伴うCAAは必ず他の種類の脳出血と区別しなければならない。CAAにおける出血は通常、脳葉領域に発生し、通常、破裂して脳とその被膜の間のクモ膜下腔に進入し、夜中に発生する。高血圧に関する出血において、出血は通常、脳内のより深いところで発生し、破裂して脳内の深いところの室や腔に進入し、日中の活動中に発生する。脳出血のその他の原因としては、動静脈奇形、負傷、動脈瘤、脳腫瘍における出血、血管炎(血管の炎症)や出血性病症がある。患者はMRIにより脳の微小出血がモニタリングされ、及び/又はポジトロン断層法(PET)スキャンにより血管アミロイドタンパク質の除去がモニタリングされる。

治療に適する患者は、CAAの危険を有する症状がまだ現れていない個体、及び現在症状が現れている患者を含む。

［治療方案］
予防性使用において、CAAを患い易い又はCAAの危険を有する患者に医薬組成物又は薬剤を投与する場合、方案には、危険を無くす又は低減でき、重症度合を軽減し、または、疾患の生理学、生物化学、組織学及び/又は行動症状、疾患進行中に現れる合併症及び中間病理表現型を含んだ疾患の発症を遅らせられるだけの前記組成物又は薬剤の投与量と頻度が含まれる。治療性使用において、このような疾患を患っている疑いがある又は既に患っている患者に組成物又は薬剤を投与する場合、方案には、疾患進行中に現れる合併症及び中間病理表現型を含んだ疾患の症状を治愈又は少なくとも一部を阻止できるだけの前記組成物の投与量と頻度が含まれる。治療性又は予防性治療を完成させるために適切な量が治療又は予防の有効量と定義される。治療性又は予防性治療を完成させるために適切な量と投与頻度の組み合わせが治療又は予防の有効方案と定義される。

本発明の薬剤の投与量と頻度は治療が予防性であるか又は治療性であるかによりに変えることができる。予防性使用において、まだ疾患状態にない患者にエダラボン含有医薬組成物を投与して患者の抵抗力を高めることができる。このような量は“有效予防量”と定義される。このような使用において、正確な量はやはり患者の健康状况に依存するが、通常1回0.1-25 mgであり、特に1回0.5-5.0 mgの範囲内である。相対的に低い量で相対的に高くない頻度で長期間投与する。一部の患者は余命中に継続的に治療を受ける。

治療性使用において、時には相対的に短期間で相対的に高い量(例えば、1回約3.5-25 mg、又は5.0-25 mg)を、疾患の進展が軽減又は終了するまで、好ましくは患者に現れる疾患症状の一部又は全部が改善されるまで投与する。その後、患者に予防性方案を適用できる。

本発明の薬剤は、CAA又はAD治療において少なくとも一部有効である他の薬剤と組み合わせて投与できる。アミロイド沈着物が脳血管系に現れるCAAの場合、本発明の薬剤は、本発明の医薬品の血液脳関門の通過を増強できる他の医薬品と併用できる。

本発明の医薬品は非経口、局部、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、鼻腔内又は筋肉内で投与され、予防性及び/又は治療性の治療に用いることができる。他の投与方式でも同様に有効であるが、代表的な投与方式は経口であり、次は筋肉内注射である。この種の注射は腕と足の筋肉にされるのが最も多い。一部の方法では、薬剤を直接沈着物が蓄積している特定組織に注射する。例えば、頭蓋内に注射する。筋肉内注射又は静脈内注射も好ましい。一部の方法では、特定の治療性抗体を直接頭蓋内に注射する。

本発明の有益な效果は主に、エダラボン又はその類似物又は誘導体がAβ凝集抑制作用を有し、これにより脳内血管壁上又は脳実質内に沈着したAβを除去できる、又はAβが脳内血管壁及び脳実質内に引き続き沈着するのを予防できることにある。

本発明の技術方案をより明確に説明できるよう、以下に図面と合わせて簡潔に説明する。勿論、これら図面は本出願に記載の一部の具体的な実施の形態のものである。本発明の技術方案はこれら図面を含むがこれらに限定されない。

図1はエダラボンがAβに対して顕著な凝集抑制及び凝集分解作用を有することを示す。1はエダラボンの分子構造を示す。2及び3はチオフラビンT実験によりエダラボンがAβに対して顕著な凝集抑制及び凝集分解作用を有することを証明していることを示す。4-6はウエスタンプロット（Western blot）によりエダラボンがAβに対して顕著な凝集抑制作用を有することを更に証明していることを示す。7-10は透過型電子顕微鏡によりエダラボンがAβに対して顕著な凝集抑制及び凝集分解作用を有することを更に明確にしていることを示す。

図2はエダラボンがAβの細胞に対する毒性作用を拮抗できることを示す。1-3はエダラボンがAβのSH-SY5Y細胞に対する毒性作用を拮抗でき、細胞生存率も細胞の神経突起の長さも明らかに単純なAβ処理組よりも高いことを示す。4-5：エダラボンがAβの初代培養した皮質ニューロンに対する毒性作用を拮抗でき、エダラボン処理組の皮質ニューロンの神経突起の長さは明らかに単純なAβ処理組よりも高いことを示す。6-7：エダラボンがAβによる細胞アポトーシスを顕著に減少させていることを示す。8：ROS実験によりエダラボンが細胞内の酸化レベルを顕著に減少させていることを証明していることを示す。

図3はエダラボンがADマウスの知能レベルを顕著に改善することを示す。1-2はモリス水迷路試験によりエダラボン予防組のマウス逃避潜時とプラットフォーム越えの回数が明らかに対照より少ないことを発見したことを示す。3及び4はエダラボン予防組マウスのY迷宮試験におけるパフォーマンスが明らかに対照組より優れていることを示す。5-7はエダラボン予防組マウスのオープンフィールドテストにおけるパフォーマンスが明らかに対照組より優れていることを示す。8-10はエダラボン治療組マウスのモリス水迷路試験のおけるパフォーマンスが依然として明らかに対照組より優れていることを示す。

図4はエダラボンが脳内及び脳血管内のAβ沈着を顕著に減少させていることを示す。1-2：エダラボン予防実験において、エダラボンが脳内Aβ沈着を顕著に減少させていることを示す。4-5はエダラボン治療実験において、エダラボンが脳内Aβ沈着を顕著に減少させていることを示す。3及び6は予防実験でも治療実験でも、エダラボンが脳内Aβレベルを顕著に減少できることを示す。7-8は予防実験でも治療実験でも、エダラボンが脳血管内Aβ沈着を顕著に減少できることを示す。

図5はエダラボンがBACE及びGsk-3βの活性を抑制することを示す。1-5はエダラボンがADマウス脳内CTFβ及びAβの発現を顕著に減少させることを示す。6-7はエダラボンがADマウス脳内BACEの発現及び活性を抑制し、ADマウス脳内α-分泌酵素の活性を増強することを示す。8はエダラボンがADマウス脳内Gsk-3βの活性を抑制することを示す。9-10はインビトロ実験によりエダラボンがBACEの発現を抑制することを更に証明していることを示す。11：インビトロ実験によりエダラボンがGsk-3βの活性を抑制することを更に証明していることを示す。

図6はエダラボンがAβによる二次的病理学的変化を顕著に改善していることを示す。1-3はエダラボンがADマウス脳内ニューロン構造の破壊及びニューロンの喪失を顕著に減少できることを示す。4はエダラボンがADマウス脳内ニューロンのアポトーシスを顕著に減少させることができることを示す。5はエダラボンがADマウス脳内の星状膠細胞と小膠細胞の反応を顕著に減少させることができることを示す。6-7はエダラボンがADマウス脳内Tauタンパク質のリン酸化程度を顕著に減少させることができることを示す。8-9はエダラボンがADマウス脳内シナプス構造の完全性を保護できることを示す。10はエダラボンがADマウス脳内神経炎症反応を減少させることができることを示す。

図7はエダラボンがADマウス脳内酸化レベルを顕著に減少させることを示す。

具体的な実施の形態

本発明に対する理解を更に深めるために、以下に実施例と合わせて本発明の好ましい考案について説明する。これら説明は本発明の保護範囲を限定するものではなく、本発明の技術考案の特徴と長所を例示的に説明するものである。

1. チオフラビンT蛍光実験
エダラボンのAβ凝集に対する抑制作用：10μMのAβ42と異なる濃度のエダラボン溶液(0μM, 1.56μM, 3.13μM, 6.25μM, 11.25μM, 25.0μM, 50.0μM 及び100μM)を37℃でインキュベーター内で2日インキュベートし、加入5μMのチオフラビンT溶液を加えて20分インキュベートし、マイクロプレートリーダーでOD値(励起波長450nm，発光波長482nm)を読み取る。

エダラボンのAβ線維に対する凝集分解作用：Aβ42をDMEM培地に溶解し、37℃で2日インキュベートしてAβ線維を形成する。形成されたAβ線維と異なる濃度のエダラボン溶液(具体的な濃度は前と同じ)を同じ条件で再び3日インキュベートした後、5μMのチオフラビンT溶液を加えて20分インキュベートし、マイクロプレートリーダーでOD値(励起波長と発光波長は前と同じ)を読み取る。

2. 透過型電子顕微鏡ネガティブ染色
エダラボンのAβ線維に対する抑制作用と形成されたAβ線維に対する凝集分解作用を更に証明するために、透過型電子顕微鏡(TEM) ネガティブ染色を本研究に応用する。ホルムバールを被覆した銅グリッドを予め24ウェルプレートの底に置き、異なる濃度のエダラボン溶液とAβを一緒に24ウェルプレート内でインキュベートする。Aβの処理及びその後のインキュベート過程はチオフラビンT実験と同じ。作用完了後、残りの液体を取り除き、リンタングステン酸で30秒染色する。サンプルは自然風乾し、Joel 1200 EX透過型電子顕微鏡で観察、撮影する。

3. ウエスタンプロット方法でエダラボンのAβに対する凝集抑制作用を測定する
1μMのAβ42と異なる濃度のエダラボン溶液(0μM, 0.3μM, 1μM及び3μM)を37℃でインキュベーター内で2日インキュベートし、混合液と非還元性ローディングバッファーを軽く混合し、ウエスタンプロット測定を行い、検出抗体がマウス由来のAβ抗体(6E10)である。

4. SH-SY5Y細胞株培養、細胞生存能力測定及び神経突起成長能力測定
SH-SY5Y細胞株は北京協和医院細胞バンクから購入し、5%のCO2、37℃の加湿インキュベーター内で培養する。MTT細胞生存度測定はキット(Sigma)の説明書に基づき操作する。Aβと異なる濃度のエダラボンの混合溶液を用いてSH-SY5Y細胞を24時間処理し、それからMTT溶液(0.5 mg/ml)を用いて37℃の温度で4時間インキュベートし、10%のSDSで15分インキュベートする。563nm波長において(Synergy H4, Bio Tek)そのOD値を測定する。神経突起成長測定は従来文献(例えば、Wang, Y.J., et al., Effects of proNGF on neuronal viability, neurite growth and amyloid-beta metabolism. Neurotox Res, 2010, 17(3): p.257-67参照)に説明される方法に基づき行う。1%のFBS及び10μM 含有全トランス型レチノイン酸(RA)(Sigma, US)の培地でSH-SY5Y細胞を7日培養した後、1μMのAβと異なる濃度のエダラボンを用いて細胞を24時間処理する。倒立顕微鏡で観察、撮影し、ImageJソフトウエアを用いて各組50個のニューロンの神経突起の長さを測定した。

5. 皮質ニューロン初代培養、ROS測定及びヨウ化プロピジウム(PI)によるアポトーシス細胞標識
皮質ニューロンは生まれたばかりの129svマウス脳から分離し、ポリ-L-リジンで被覆されたカバーガラス上で培養する。72時間後、1μMのAβ42オリゴマーと異なる濃度のエダラボン溶液を用いて細胞を24時間処理し、それから4%のパラホルムで10分固定し、再びMAP-2抗体で染色する。神経突起の長さの測定方法は上記と同じ。

ROS測定はメーカー(Cell Biolabs Inc)から提供される方案に基づき行う。

ヨウ化プロピジウム(PI)でアポトーシスニューロンを標識する方法の詳細は次のとおり：PBS液で活性ニューロンを3回洗浄し、PI溶液(2 μg/ml)で室温で洗浄後の活性ニューロンを15分インキュベートし、それからHEPES緩衝液(100 mM HEPES, 140 mM NaCl, 25 mM CaCl₂, pH 7.4)で3回×5分洗浄する。最后、細胞はPBS中で2%のパラホルムで20分固定し、それから緩衝液を用いて3回×5分洗浄する。DAPI(1:1000)で20分インキュベートし、対比染色する。細胞はB50蛍光顕微鏡で観察、撮影する。

6. 動物とエダラボン投与
APPswe/PS1DE9(AD)トランスジェニックマウスは米国Jackson研究室(コード：005864)から購入し、第三軍医大学第三附属医院SPF級動物ハウスで飼育した。マウスに応用される処理と関連の実験は全て第三軍医大学動物倫理委員会の認可を受け、登録されている。予防実験において、3月齢のADマウスにエダラボン治療を6カ月施し、ブランク対照(ADマウス)と正常野生型対照(野生型同腹兄弟マウス)に等量の生理塩水を投与した。治療実験において、9月齢のADマウスにエダラボン治療を3カ月施し、同様に、年齢にマッチするブランク対照(ADマウス)と正常野生型対照を設けた。成人エダラボン治療薬量からマウス等量治療薬量を推定する：エダラボン注射液12.6 mg/kgを毎週2回腹腔注射する。同時に、他の2組のマウスにエダラボン経口薬を投与し、一日量は0.1-25 mg/kg、例えば、3.5 mg/kg（予防にも治療にも適用できる）とする。若しくは予防組の一日量を6.4 mg/kgとし、治療組の一日量を12.8 mg/kgとしてもよい。3月齢から9月齢への投与は予防実験とし、9月齢から12月齢への投与は治療実験とする。所定の時間に達した後、各組のマウスは次の方法で行動試験を行う。各組とも3匹のマウスがGolgi染色される。残りのマウスは過剰麻酔をかけた後に大脳を解剖する。一方の大脳半球を冷凍してから生化学分析に用い、他方の大脳半球を4%のパラホルムで固定して組織分析に用いる。

7. 行動試験
各組のマウスは全て、水迷路、Y迷路及びオープンフィールドテストを含む行動試験を行う。水迷路試験は主に4日のプラットフォームテストとその後のプローブテストを含む。全過程はビデオ記録され、画像分析ソフトで分析される(ANY-maze、Stoelting)。プラットフォームテストにおいて、逃避路径の長さ及び逃避潜伏期を測定する。プローブテストにおいて、各象限時間とプラットフォーム越えの時間を測定する。自発的交替テストと新しいアームプローブテスト（novel arm probe test）をY迷路内で行う。自発的交替テストにおいて、マウスは迷路内で5分自由活動した。交替(Alternation)は互いに接続される三つのアームに連続して進入することと定義される。交替パーセンテージは実際に交替した回数と最大限可能な交替回数(アームに進入した回数から2を引いたものと定義される)の比に100を乗じたものである。新しいアームプローブテストにおいて、一つのアーム(新しいアーム)はブロックされ、マウスは他の2つのアーム内で5分プローブすることを許容された。2時間の間隔を空けた後、マウスは三つのアームに自由にプローブした。オープンフィールドテストにおいて、マウスはオープンフィールドの中央に3分置かれ、そのルートは追跡システム(Limelight、ActiMetrics)により記録される。同時に、マウスの立ち上がり、グルーミング、排便及排尿の回数も記録される。

8. Aβ脳内沈着の定量分析
コンゴーレッドで密なAβ斑が染色標識される。等間隔(〜1.3 mm)で凍結切片を取り、室温で塩化ナトリウム溶液で20分処理し、コンゴーレッド溶液で45分処理し、無水アルコールで素早く脱水する。6E10免疫組織化学法で全Aβ斑を標識する。6E10染色は自由浮遊切片法(Free floating section method)を用いて行う。ImageJ分析ソフトウエアで新皮質と海馬領域のAβ斑を定量分析し、Aβ斑の占める面積パーセンテージと単位面積内の数を得る。

9. 脳血管アミロイドーシスの検出
脳血管アミロイドーシスの重症度を評価するために、一つの新しい評価方法を本研究に応用する。α-平滑筋アクチン抗体(1a4)とAβ抗体(6E10)により大脳血管を二重免疫蛍光染色し、レーザー共焦点(Radiance 2000MP、Bio-Rad)で観察を行い、血管画像を記録する。以下の四級目盛りに従い血管1本毎に対するCAAの重症程度についてスコア化する：0級：Aβ沈着無し。1級：少量のAβ沈着、Aβ沈着は血管周囲の長さの三分の一未満。2級：中度のAβ沈着、Aβ沈着は血管の周囲の長さの三分の一より大きいが、三分の二により小さい。3級：重度の沈着、Aβ沈着は血管の周囲の長さの75%を超える。

10. 微小出血の染色と定量分析
まず、2%のフェロシアン化カリウムでヘモジデリンを染色し、それから1%のヌクレアファストレッドで細胞核を対比染色する。顕微鏡において、脳組織切片毎の微小出血が定量化され、切片毎のヘモジデリン沈着の平均数を計算する。

11. ELISA分析
冷凍脳組織をホモジネートしてから、順にTBS、SDSとギ酸で抽出する。TBS、SDSとギ酸の抽出物はそれぞれ可溶性Aβ、まばらな老人斑、密な老人斑を表す。脳内と血清中のAβ40、Aβ42(Covance)、IL-6、IL-1β、INF-γ、TNF-β(eBioscience, BMS603, BMS6002, BMS606, BMS607)濃度はELISAキット(Covance又はeBioscience)で測定する。測定ステップはキットの説明書に基づき行う。脳組織中のalpha及びbeta分泌酵素の活性測定もキット(R&D Systems)の説明書に基づき行う。

12. ニューロンNeuN、ChAT及びMAP-2免疫染色
エダラボンのニューロンに対する保護作用を明確にするために、脳組織切片に対してNeuN、ChAT及びMAP-2自由浮遊切片法免疫組織化学染色検出を行う。一次抗体はそれぞれウサギ抗マウスNeuN、ChAT及びMAP-2抗体であり、希釈の割合は全て1:200であり、4℃で一晩インキュベートし、ビオチン化したIg二次抗体は37℃で2時間インキュベートし、DAB呈色、系列脱水、透明化、封止した。

13. 星状膠細胞反応、小膠細胞反応及びTau過剰リン酸化免疫染色
前記ステップで自由浮遊切片法免疫組織化学染色を行う。一次抗体はそれぞれウサギ抗マウスCD45抗体(小膠細胞標識)、ウサギ抗マウスGFAP(星状膠細胞標識)、ウサギ抗マウスpSer396-Tau抗体である。希釈の割合は1:200であり、後のステップも前記と同様である。

14. Golgi染色
動物に過剰麻酔をかけた後、前後して0.5%の亜硝酸ナトリウムを含有する生理塩水、4%パラホルム、Golgi染色液で心臓灌流する。灌流終了後、脳組織を0.1 cm × 0.1 cmのピースにカットし、Golgi染色液を含有する褐色容器内に移動させ、室温で遮光して3日放置する。その後、1%の硝酸銀液に浸して引き続きインキュベートし、遮光で3日反応させる。脳組織はビブラトーム(Leica、VT1000 S、Germany)でスライスし、切片の厚さは35umである。海馬CA1領域の錐体細胞中段の樹状突起10μm内の樹状突起棘数を統計する。

15. ジニトロフェニルヒドラジン(DNPH)ウェスタンブロット法による脳組織内酸化レベル測定
組織内タンパク質のカルボニルレベルは組織内酸化レベルを反映する。DNPHはタンパク質のカルボニルと反応してタンパク質-DNPヒドラゾン複合体を形成し、DNPH抗体により当該複合体のレベルを測定し、組織内酸化レベルを評価する。5μlの新鮮な脳組織サンプルを室温で12% SDS及び10 μlのDNPH溶液と一緒に20分インキュベートする。7.5のμl中和液でサンプルを中和する。15 μgの総蛋白を含んだサンプルをロードし、ウエスタンプロット測定を行う。過剰な酸化又は酸化不均衡はAD病理メカニズムの一つの重要な側面であり、Aβ沈着と神経原線維変化形成を助長する(例えば、Oxidative Stress and its Implications for Future Treatments and Management of Alzheimer Disease, Int J Biomed Sci, Clark, T.A., et al., 2010, 6(3): p.225-227参照)。

16. ウェスタンブロット(Western blot)
脳組織内Aβの発生及び分解関連酵素及び分子のレベル、過剰リン酸化Tauタンパク質レベル及びシナプス可塑性関連タンパク質のレベルはいずれもウェスタンブロット法により測定する。脳組織ホモジネート中のタンパク質はRIPA緩衝液で抽出する。サンプルをSDS-PAGE(4・10%アクリルアミド)ゲルに移す。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に移す。ブロットは以下の抗体を用いる：APP C末端抗体(171610, Millipore)、BACE1抗体(Millipore)、Aβ抗体(6E10, Abcam)、Neprilysin抗体(Millipore)、RAGE抗体(Millipore)、LRP抗体(5A6, Calbiochem)、IDE抗体(epitomics)、pS396(Signalway)、pT231(Signalway)、pS199(epitomics)、pS262(Abcam)を含むリン酸化Tauタンパク質抗体、SNAP25抗体(Millipore)、Synaptophysin抗体(Millipore)、Synapsin I抗体(Millipore)、VAMP1抗体(Millipore)、PSD95抗体(Millipore)、F−アクチン抗体(Actin) (Sigma-Aldrich)。IRDye 800CW二次抗体をインキュベートした後、Odyssey蛍光スキャナーでスキャンする。

本出願の研究結果により、Aβ病理過程の複数の重要な段階に対して明らかな介入作用があることが分かった：
(1) エダラボンはAβが線維に凝集するのを抑制し、Aβ線維の凝集分解を促進した
チオフラビンT実験はエダラボンがAβ凝集を効果的に抑制でき、用量依存性を呈し、エダラボン濃度が高いほど効果が顕著になることを証明した。同時に凝集分解実験はエダラボンが既に形成されたAβ線維又は比較的大きな凝集体を効果的に分解でき、エダラボン濃度が高いほど効果が顕著になることを証明した(図1：2及び3参照)。ウエスタンプロット実験は更に上記結論を証明し、3.0μMのエダラボンは50%のAβが凝集体を形成することを抑制できることを発見した(図1：4-6参照)。透過型電子顕微鏡実験により3.0μMのエダラボンがAβ凝集を顕著に抑制し、一部銅グリッド内ではAβが観察されなかったことがわかった。同時にTEMにより3.0μMのエダラボンが80%近くのAβ線維を分解できることがわかった(図1：7-10参照)。

(2) エダラボンのAβによる細胞毒性に対する拮抗作用
エダラボンがAβによる細胞毒性に対して拮抗作用を有するか否かを考察するために、本研究ではSH-SY5Y細胞株及び初代培養の皮質ニューロンを研究対象として応用し、1μM のAβオリゴマーが与えられ、異なる濃度のエダラボンで処理され、その細胞生存率及び神経突起成長状況を観察する。まず、SH-SY5Y実験において、研究の結果、1μMのAβオリゴマーが大量の細胞死亡を引き起こし(生存細胞は正常対照組の約40%)、広範な神経突起が崩壊した(神経突起の長さは正常対照組の約50%)ことを発見した。しかしエダラボンの添加後、細胞生存率は明らかに高くなり、かつ、エダラボン濃度の上昇に伴い、細胞生存率は上昇し続け、顕著な用量依存性を示した。同時に、エダラボンの添加後、全トランス型レチノイン酸の誘導による神経突起の長さも明らかに増加した(図2：1-3参照)。初代培養の皮質ニューロン実験においても上記効果が観察された(図2：4及び5参照)。次に、ROS実験によりエダラボンがAβによる酸化ストレス反応を反転させることができるのを発見した(図2：8参照)。PI実験では、エダラボン処理組のアポトーシス細胞の割合は単純なAβ対照組よりも明らかに少なかった(図2：6及び7参照)。

(3) エダラボンの使用によりADマウスの行動表現が顕著に改善した
モリス水迷路試験により、本発明者は、予防実験（図3：1-2参照）においても治療実験(図3：8-10参照)においても、エダラボン処理組のADマウスの行動表現は対照組よりも明らかに優れ、逃避潜時が減り、プラットフォームを超える回数が増えたことを発見した。モリス水迷路試験はエダラボンがAD マウスの学習及び空間記憶能力を改善できることを証明した。エダラボンのADマウスの智能に対する改善状況を全面的に評価するために、本研究では前後してY迷路、オープンフィールドテスト等を行い測定した。研究の結果、エダラボン処理組のADマウスは自発的交替テスト及び新しいアームプローブテストにおいて、アームに入る回数が対照組より顕著に多くなり、新しいアームに入る回数の割合は顕著に高くなり、交替(Alternation)の割合も明らに高くなり、これはエダラボンがADマウスのプローブ及びワーキング記憶能力を改善できることを示している(図3：3及び4参照)。オープンフィールドテストにおいて、本発明者はエダラボン処理されたマウスの立ち上がりプローブ回数及びプローブの距離が共に対照組よりも顕著に高くなった(図3：5-7参照)。腹腔注射でも経口投与でも、上記と同様の結果を得た。これは異なる投与経路でエダラボン処理されても、ADマウスの智能レベルを改善できることを証明した。

(4) エダラボンはAβの脳血管中の沈着を明らかに減少させた
コンゴーレッド染色及び6E10免疫染色により、本発明者は、エダラボンがAβの脳内沈着を顕著に減少でき、対照組の約50%に減少できることを発見した(図4：1-2及び4-5参照)。貴重な点として、血管壁及びAβ二重免疫蛍光染色により、本発明者は、エダラボン処理組はAβの脳血管内の沈着が明らかに減少し、CAA 0級及び1級の血管割合は明らかに増加し、2級及び3級の血管割合は明らかに減少したことを発見した(図4：7及び8参照)。同時に、ADマウスの脳組織をTBS、2% SDS及びFAで抽出し、それぞれ異なるAβ凝集状態の抽出物を得て、Covance ELISA キットを応用してそのAβ40，Aβ42のレベルを測定した。本発明者は、エダラボンが異なる凝集状態のAβレベルを顕著に減少できることを発見した(図4：3及び6参照)。これはインビトロ実験結果と一致する。経口投与でも上記と同様の結果を得た。

(5) エダラボンはBACE1の発現を抑制することによりAβの発生を減少させた
ウェスタンブロット(Western blot)により、本発明者はエダラボンがAβの脳内発生を低減でき、CTFβの生成を低減できることを発見した(図5：1-5参照)。メカニズムを調査した結果、本発明者はエダラボンがNEP、IDE、RAGE、LRP等のAβ代謝酵素に対して影響はないが、APPの切断酵素であるα-分泌酵素及びβ-分泌酵素(BACE1)に対して顕著な影響があり、エダラボン処理組のα-分泌酵素活性が増加し、β-分泌酵素の発現及び活性が明らかに低下したことを発見した(図5：6-7及び9-10参照)。同時に、本発明者はエダラボンがGsk-3βの活性を抑制できることも発見した(図5：8及び11参照)。

(6) エダラボンは小膠細胞、星状膠細胞及び神経炎症反応を減少させた
予防実験においても、治療実験においても、エダラボン処理組のADマウス脳内小膠細胞、星状膠細胞及び神経炎症反応は全て顕著に低下した。経口投与したエダラボン処理組もADマウス脳内小膠細胞、星状膠細胞及び神経炎症反応レベルが明らかに低下した(図6：5及び10参照)。

(7) エダラボンはニューロンの死亡、シナプス変性を減少させた
ニューロンの喪失、シナプスの変性はADの典型的な臨床表現である。エダラボンがニューロン保護作用を有するか否かを調べるために、本発明者はMAP-2、NeuN、ChaT等の免疫組織化学染色を行った。研究の結果、対照組に比べ、エダラボン処理組は、NeuN、ChaT陽性面積の割合が顕著に増えた。Golgi染色では、樹状突起棘の数も顕著に増えた。ウエスタンプロットによりエダラボン処理組シナプス関連タンパク質の発現は対照組より顕著に高いことが分かった(図6：1-3，4及び8-9参照)。

(8) エダラボンはTauタンパク質リン酸化レベルを減少させた
ウエスタンプロットにより、本発明者はエダラボンが複数の病理位点でTauタンパク質酸化レベルを減少できることを発見した(図6：6及び7参照)。同時にp396-Tau免疫組織化学により、本発明者はエダラボン処理組p396-Tau陽性面積の割合が明らかに低下したことを発見した。

以上の具体的な実施の形態の説明は本発明の核心思想に対する理解を容易にするためだけのものである。当業者は本発明の原理を逸脱しない範囲において、本発明の技術考案に対して若干の改良や修正を行ってもよく、これら改良や修正も本発明の請求の範囲内には入ると理解されるべきである。

Claims

エダラボン又はその類似物又は誘導体を含有する、脳アミロイド血管症(CAA)治療剤であって、
前記類似物は、（１）ピラゾリン環の３位のメチルが、メチル以外の低級（C _1-6 ）アルキル、低級アルコキシ、若しくはHにより置き換えられたエダラボン類似物、（２）ピラゾリン環の４位のHが低級アルキル若しくは低級アルコキシにより置き換えられたエダラボン類似物、又は（３）フェニルが、低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ及びハロゲンから選ばれる一つ若しくは複数の置換基により任意に置き換えられたエダラボン類似物を含み、
前記誘導体は、ピラゾリン環の５位のケトンがエノールに変換され、カルボン酸と反応して生成され、該エステルは体内で加水分解した後にケトンに変換されるエステル（前駆体）を含む、治療剤。
静脈内、皮下又は経口投与される請求項1に記載の脳アミロイド血管症(CAA)治療剤。
注射剤、錠剤又はカプセル剤である、請求項1又は２に記載の脳アミロイド血管症(CAA)治療剤。
他のCAA治療用医薬品と組み合わせて投与される請求項1〜３の何れか１項に記載の脳アミロイド血管症(CAA)治療剤。
前記他のCAA治療用医薬品はAβ抗体である請求項4に記載の脳アミロイド血管症(CAA)治療剤。
CAAを患っていることが確定した患者に投与される、請求項1に記載の脳アミロイド血管症(CAA)治療剤。
前記確定とは、患者がCAAの臨床症状を有することを確定することである請求項6に記載の脳アミロイド血管症(CAA)治療剤。
脳内にはアルツハイマー病の特徴的な斑がある又は無い患者に使用する、請求項1〜７の何れか１項に記載の脳アミロイド血管症(CAA)治療剤。
アルツハイマー病の症状がある又は無い患者に使用する、請求項1〜７の何れか１項に記載の脳アミロイド血管症(CAA)治療剤。
心臓発作又は脳卒中がある又は無い患者に使用する、請求項1〜７の何れか１項に記載の脳アミロイド血管症(CAA)治療剤。
一日量として0.1 mg/kg〜25 mg/kg のエダラボンを含有する請求項1〜１０の何れか１項に記載の脳アミロイド血管症(CAA)治療剤。
CAAを患い易い患者に投与するための、エダラボン又はその類似物又は誘導体を含有する、脳アミロイド血管症(CAA)予防剤であって、
前記類似物は、（１）ピラゾリン環の３位のメチルが、メチル以外の低級（C _1-6 ）アルキル、低級アルコキシ、若しくはHにより置き換えられたエダラボン類似物、（２）ピラゾリン環の４位のHが低級アルキル若しくは低級アルコキシにより置き換えられたエダラボン類似物、又は（３）フェニルが、低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ及びハロゲンから選ばれる一つ若しくは複数の置換基により任意に置き換えられたエダラボン類似物を含み、
前記誘導体は、ピラゾリン環の５位のケトンがエノールに変換され、カルボン酸と反応して生成され、該エステルは体内で加水分解した後にケトンに変換されるエステル（前駆体）を含む、予防剤。
必要とする患者に投与することによって該患者の血管アミロイドタンパク質を減少させるための、エダラボン又はその類似物又は誘導体を含有する医薬品であって、
前記類似物は、（１）ピラゾリン環の３位のメチルが、メチル以外の低級（C _1-6 ）アルキル、低級アルコキシ、若しくはHにより置き換えられたエダラボン類似物、（２）ピラゾリン環の４位のHが低級アルキル若しくは低級アルコキシにより置き換えられたエダラボン類似物、又は（３）フェニルが、低級アルキル、低級アルコキシ、ニトロ及びハロゲンから選ばれる一つ若しくは複数の置換基により任意に置き換えられたエダラボン類似物を含み、
前記誘導体は、ピラゾリン環の５位のケトンがエノールに変換され、カルボン酸と反応して生成され、該エステルは体内で加水分解した後にケトンに変換されるエステル（前駆体）を含む、医薬品。
血管アミロイドタンパク質の除去に関する又は脳微小出血発生率を減少させる治療方案に基づいて投与される、請求項13に記載の医薬品。
前記治療方案はMRIにより患者の脳微小出血をモニタリングすることを含む請求項14に記載の医薬品。
前記治療方案はPETスキャンにより患者の血管アミロイドタンパク質の除去又は沈着をモニタリングすることを含む請求項14に記載の医薬品。
前記治療方案は長期治療方案である請求項14〜16のいずれかに記載の医薬品。