CN102475885A - 肝细胞生长因子制剂在生发中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肝细胞生长因子制剂在生发中的应用，是以肝细胞生长因子为有效成分的制剂，其中该制剂使有效量的上述因子分布、作用于给药的局部组织及其附近组织，并且能够避免在给药部位以外的主要代谢脏器组织中的转运、分布、作用；该制剂用于治疗或预防各种原因所致的急性及慢性脱发；该肝细胞生长因子通过局部用药直接刺激毛囊生长，可以避免HGF可能带来的不必要的副作用。

Description

肝细胞生长因子制剂在生发中的应用

技术领域

本发明涉及治疗脱发的药用制剂，尤其涉及一种有效成分是肝细胞生长因子(HGF)，用于治疗或预防脱发、在患者欲增毛部位皮肤局部外用给药的肝细胞生长因子(HGF)制剂在生发中的应用。

背景技术

肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种能够促进有丝分裂、促细胞运动和形态发生的活性多效性因子。1983年首先由Michalopoulors等在血浆和血小板中发现和证实。HGF是由间充质来源细胞分泌的一种旁分泌因子，最初分泌出来的HGF是一种无活性的单链形式。在丝氨酸蛋白酶HGF激活物的作用下HGF单链转变为有活性的异二聚体(一条重链和一条轻链由二硫键连接而成)。研究证实，在体内HGF不仅作为肝再生因子在肝脏修复中起作用，它还具有血管新生作用，近年来发现该生长因子和它的c-Met受体在几种不同体系的间充质上皮相互作用中起着主要调节作用，并且发现它可能对毛囊生长有调控作用。

已有研究表明HGF和它的受体c-Met构成的信号系统能够刺激角质形成细胞的生长和移动、促进人类黑素细胞的黑素形成、在活体内调节血管生成，并且能够调节如钙黏素等细胞黏附子的表达而游离上皮细胞。近年来的研究集中于以下两个方面：(1)调节真皮乳头细胞和上皮角质形成细胞之间的相互作用；(2)诱导毛囊周围血管的形成。我们通过体内、体外一系列的研究探讨了HGF对毛囊生长的影响。目的在于探讨其在脱发方面应用的可能性及其作用机制，因此考虑将HGF做为一种治疗毛发紊乱性疾病的新颖物质而应用于临床。

发明内容

本发明的主要目的在于克服现有产品存在的上述缺点，而提供一种肝细胞生长因子(HGF)制剂在生发中的应用，其有效成分是肝细胞生长因子(HGF)，该制剂是一种外用制剂，用于治疗或预防脱发、在患者欲增毛部位皮肤局部外用给药；该肝细胞生长因子(HGF)通过局部用药直接刺激毛囊生长，可以避免HGF可能带来的不必要的副作用。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明以肝细胞生长因子(HGF)为有效成分的制剂，其中该制剂使有效量的上述因子分布、作用于给药的局部组织及其附近组织，并且能够避免在给药部位以外的主要代谢脏器组织中的转运、分布、作用。

前述的肝细胞生长因子(HGF)为有效成分的制剂，其特征在于，所述制剂用于治疗或预防各种原因所致的急性及慢性脱发。

前述的肝细胞生长因子(HGF)为有效成分的制剂，其特征在于，所述制剂的给药部位是局部外用。

前述的肝细胞生长因子(HGF)为有效成分的制剂，其特征在于，所述制剂可以作为其它外用生发制剂的添加成分使用。

前述的肝细胞生长因子(HGF)为有效成分的制剂，其特征在于，所述制剂一次给药量是含有权力要求1所述有效成分的最终浓度为10-1000ng/ml。

附图说明：

图1为本发明所述有效成分HGF对毛囊生长的影响，显示不同浓度的HGF对不去毛乳头毛囊生长的作用，其中*P＜0.01。

图2为本发明所述有效成分HGF对除去毛乳头后的毛囊生长的影响，显示不同浓度的HGF对去毛乳头毛囊生长的作用，其中*P＜0.01。

图3为本发明所述有效成分HGF对除去毛乳头后的毛囊和普通毛囊生长的影响的对比，显示不同浓度的HGF对去毛乳头和不去毛乳头毛囊生长的作用的综合比较。

图中主要标号说明：去：除去毛乳头的毛囊；不去：未除去毛乳头毛囊。

具体实施方式

本发明涉及一种治疗脱发的药用制剂，其有效成分是HGF，并且在给药剂量、给药方法进行了详细研究。

首先，本发明通过体外试验，探讨了HGF对体外培养毛囊器官生长的影响，并且更深一步探讨了HGF直接诱导毛囊生长的源泉细胞——毛囊干细胞分化的可能性，并通过各种免疫组织化学、生化学检测手法，检测了HGF受体c-Met、诱导毛囊干细胞分化的信号传导通路中的关键因子β-catenin的表达变化，以弄清其作用机制；最后，通过制作小鼠动物模型，探讨HGF的用法及用药浓度。

本发明通过观察比较HGF对除去毛乳头的毛囊与未去除毛乳头的毛囊生长的影响，发现对除去毛乳头的毛囊添加不同浓度的HGF后，毛囊生长状态逐渐接近未除去毛乳头的毛囊，结果证明HGF对毛囊生长有直接的促进作用，有可能替代毛乳头对毛囊生长的调节作用。另外，发现HGF对毛囊干细胞有直接诱导分化的作用，直接激发了毛发再生。进而，建立C51BL/6小鼠动物模型，分别将10、50、100和1000ng/ml的HGF单独使用或添加到其它生发药物-米诺地尔后实施皮肤局部外用，结果表明单独使用米诺地尔组比空白对照组小鼠毛发生长快，给HGF组的毛发生长比空白对照组或单独外用米诺地尔组都快，证明了皮肤局部外用10-1000ng/ml的HGF制剂可以直接促进毛发生长，并且，在生发药中添加HGF能增强促进生发效果。即，实施例中，HGF对毛发生长的促进作用得到确认，并且，给药量10-1000ng/ml的HGF浓度范围得到确认。

实验证明了HGF单独或作为添加物与其它药物合用都可以起到促进毛发生长的作用。

本发明使用C51BL/6小鼠，制作了脱发模型，研究了皮肤外用给药的药效，发现无论是单独外用HGF制剂还是添加到其它生发药物制剂中外用，都有促进毛发生长的作用。并通过检测c-Met的磷酸化作为指标，发现在局部外用后局部皮肤c-Met的Tyr残基受到磷酸化，而在给药动物肝脏、肾脏组织，与未给药动物相比，其c-Met完全没有被激活。该结果意味着HGF在给药局部皮肤发挥了作用，在肝脏、肾脏未显示影响。

本发明的含HGF制剂的特征在于：HGF使用量在10-1000ng/ml的最终浓度，使用该因子分布、作用于给药部位局部皮肤组织及其周围皮肤，给药部位以外组织，如：肝脏、肾脏，无该因子作用。

作为具体适用范围，适用于各种原因所引起的脱发性症状，例如可举出全秃、斑秃、外伤性脱发或药物副作用所致脱发等疾病，还可以用于脂溢性脱发及其它脱发的预防。

作为给药方法，能满足以下条件的任何给药方法都可以。即，如上所述的局部皮肤外用，可以单独使用，也可以添加到其它生发外用制剂中使用。作为给药剂型，可例举出外用水性制剂或油性制剂、洗剂、喷雾剂、软膏类、霜剂、湿布剂等。也可以根据需要添加PH调整剂、缓冲剂、透皮制剂、稳定剂、防腐剂或增溶剂等。本发明的含HGF制剂，理想为不含在HGF上吸附、结合的物质，含有促进透皮效果的物质。

本发明的技术方案概述如下：1、探讨HGF促进毛囊生长的最适浓度：观察不同浓度的HGF对不去毛乳头和去毛乳头毛囊生长的作用；2、探讨HGF对毛囊干细胞分化的直接诱导作用：观察HGF对培养的毛囊干细胞中K19、β-catenin表达的影响；3、探讨HGF在体内应用时的最适浓度及对体内其他脏器的影响：动物实验观察不同浓度的HGF对C51BL/6小鼠毛发生长的影响，并检测试验动物皮肤、肝脏、肾脏的c-Met的磷酸化状态。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明丝毫不受这些实施例的限定。

实施例1

HGF对毛囊生长的影响作用：

解剖显微镜下分别选取完整无损伤的生长期毛囊(毛乳头大、光滑圆润、真皮组织鞘完整且与外皮根鞘无分离者)和毛乳头去除完全的毛囊进行培养，游离的毛囊小心移入24孔培养板中，每孔2根毛囊，加入0.5ml培养液，37℃，5％CO₂，一定湿度中培养。从成功培养的毛囊中随机取32根毛囊，分成4组，每组8根：空白对照组，分别加入100ng/mL，50ng/mL，10ng/mL HGF的实验组。每天在倒置显微镜下，通过目镜测微器测量毛囊底部到毛发顶部的长度，以第2天减第1天的长度为毛囊的增长长度。同时在倒置显微镜下观察毛乳头、真皮组织鞘、内外根鞘及毛干的变化并照相。将前面实验结束后的毛囊用中性甲醛固定后，石蜡包埋，连续切片，做组织免疫组化实验，检测HGF的受体c-met的表达，还有角蛋白K19的表达情况，以细胞膜和部分胞浆中出现棕黄色颗粒为c-met阳性，反之为阴性。以细胞核中出现棕黄色颗粒为β-catenin阳性，反之为阴性。

免疫组化染色结果的评估方法：

计算每片抗体所染阳性细胞数。每片选择3个视野，每个视野计数50个细胞，阳性染色为1～50个为弱阳性，15～30个为中度阳性，30个以上为强阳性。以细胞膜和部分胞浆中出现棕黄色颗粒为c-met阳性，反之为阴性。β-catenin评价方法同上，以细胞核中出现棕黄色颗粒为β-catenin阳性，反之为阴性。

从图1、2和图3可以看出，在含有毛乳头和不有含毛乳头毛囊实验中，实验组在10～100ng/mL浓度范围内，对毛囊生长的促进呈浓度依赖性变化，不去毛乳头加10ng/mLHGF作用最强，去毛乳头加100ng/mlHGF作用最强。去毛乳头的毛囊加不同浓度的HGF刺激后，总体生长长度都较对照组要好，与对照组相比存在显著性差异，说明一定程度上，HGF可以代替毛乳头而达到促生长的作用同时也可以作为添加剂来促进含有毛乳头的毛囊的生长。

表1结果显示，未去毛乳头组c-met均有表达，而未加HGF刺激的除去毛乳头的对照组，基本无c-met表达；不同浓度HGF刺激后，毛囊隆突部c-met均有表达。从表2结果可以看出，在HGF刺激后，毛囊隆突部β-catenin表达较刺激前在细胞核内的表达增加。说明HGF促进了WNT信号通路中的β-catenin从细胞质进入细胞核，从而促进了细胞分化。

实验数据用SPSS12.0统计软件进行统计学处理，统计变量以x±SD表示，采用双样本t检验比较组间显著性差异。

实施例2

HGF对毛囊干细胞增殖分化中的调节作用：

该试验分别采用皮肤法和毛囊法进行大鼠毛囊干细胞的分离培养，在倒置显微镜下直接观察活细胞的形态学特征和生长状况。将原代培养细胞，并鉴定确认为毛囊干细胞。

待细胞生长状态良好时，去除有血清培养基，以PBS充分漂洗，改为无血清培养基继续培养，一天后，加入50ng/mlHGF，分别刺激0min，15min，30min，Western blot法检测各组β-catenin表达的变化，并进行图像分析。

另外，用HGF刺激毛囊干细胞，24小时后，毛囊干细胞的特异性标志角蛋白k19阳性表达的细胞减少，毛囊干细胞的分化标志Ki67阳性表达的细胞增多，表明HGF能够诱导毛囊干细胞分化。见表3。

β-caternin是毛囊干细胞的关键蛋白，酪氨酸磷酸化的β-caternin是具有活性的β-caternin。从图3可以看出，HGF刺激毛囊隆突区细胞后，酪氨酸磷酸化的β-caternin的表达比刺激前增多，说明HGF激活WNT信号通路，可能是诱导毛囊隆突区细胞发生分化的分子机制。

实验数据用SPSS12.0统计软件进行统计学处理，统计变量以x±SD表示，采用双样本t检验比较组间显著性差异。

实施例3

建立动物模型来研究HGF对毛发生长的直接作用：

将剪掉背部毛发的30只C57BL/6小鼠随机分为5组：分别为10ng/mL，50ng/mL、100ng/mL和1000ng/mL的HGF组和空白对照组。其中HGF的溶剂为生理盐水。每组6只，每天涂药一次，涂抹药物20天，每天观察小鼠的毛发生长情况并拍照记录，运用photoshop图象处理软件对实验照片进行处理，按下式计算第1天、第6天、第15天，第20天小鼠有毛面积与总面积的比值，以此作为对照指标。结果用以下公式计算：

有毛面积％＝(有毛面积/总面积)×100％

外用50ng/ml、1000ng/mL的HGF组和空白对照组C57BL/6小鼠，在给药后10分钟时，脱血，取肝脏、肾脏及局部用药皮肤，迅速提取蛋白质，用免疫沉降法、Western blot法检测磷酸化c-Met。

结果显示，10ng/mL的HGF实验组比对照组略快，差别不太明显，50ng/mL、100ng/mL和1000ng/mL的HGF实验组的小鼠与对照组相比，毛发生长较快。即HGF可以直接促进毛发的生长。

Western Blot结果显示，外用50ng/ml的HGF组在给药10分钟后，皮肤组织显示磷酸化c-Met的条带，表示c-Met有显著磷酸化，而对照的未给药组则无条带出现，表明HGF对给药局部皮肤起了作用。另外，肝脏和肾脏组织则无磷酸化c-Met出现，表明局部外用的HGF没有在全身主要代谢脏器肝脏、肾脏发生作用。

以上结果表明，以HGF为主要成分的制剂可以直接刺激小鼠毛发生长，作用于给药的局部组织及其附近组织，并且能够避免在给药部位以外的主要代谢脏器组织中的转运、分布、作用。

实施例4

建立动物模型来研究HGF对毛发生长的直接作用：

将剪掉背部毛发的18只C57BL/6小鼠随机分为3组：2％米诺地尔组、2％米诺地尔加100ng/mL的HGF组和空白对照组。每组6只，每天涂药一次，涂抹药物20天，每天观察小鼠的毛发生长情况并拍照记录，运用photoshop图象处理软件对实验照片进行处理，按下式计算第1天、第6天、第15天，第20天小鼠有毛面积与总面积的比值，以此作为对照指标。结果用以下公式计算：

有毛面积％＝(有毛面积/总面积)×100％

结果如表4所示，米诺地尔组比未加米诺地尔的对照组小鼠毛发生长快，而米诺地尔加100ng/mL的HGF组比米诺地尔组小鼠毛发生长快。表明HGF能增强米诺地尔的促进生发作用。

制剂例：在无菌操作下，将10μg的HGF，加入10ml生理盐水中，再加入1mg的Tween 80，以1ml/支分装，冷冻干燥后，封口。

外用液配制例：用1ml生理盐水，加入含1μg HGF的冻干瓶中，制成1μg/ml的HGF溶液，可用生理盐水或含有其他生发药的溶液进一步稀释，直接外用。

表1不去毛乳头的毛囊和去毛乳头的毛囊隆突部c-Met阳性率

表1-1去毛乳头的毛囊染色结果，分为不加HGF的DMEM对照组和加了HGF的实验组

表1-2不去毛乳头的毛囊染色结果，分为不加HGF的DMEM对照组和加了HGF的实验组

表2不去毛乳头的毛囊和去毛乳头的毛囊隆突部β-catenin阳性率

表2-1不去毛乳头的毛囊染色结果，分为不加HGF的DMEM对照组和加了HGF的实验组

表2-2去毛乳头的毛囊染色结果，分为不加HGF的DMEM对照组和加了HGF的实验组

表4不同天数各组小鼠毛发生长情况

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.以肝细胞生长因子为有效成分的制剂，其中该制剂使有效量的上述因子分布、作用于给药的局部组织及其附近组织，并且能够避免在给药部位以外的主要代谢脏器组织中的转运、分布、作用。

2.根据权利要求1所述的肝细胞生长因子为有效成分的制剂，其特征在于，所述制剂用于治疗或预防各种原因所致的急性及慢性脱发。

3.根据权利要求1或2所述的肝细胞生长因子为有效成分的制剂，其特征在于，所述制剂的给药部位是局部外用。

4.根据权利要求1、2或3所述的肝细胞生长因子为有效成分的制剂，其特征在于，所述制剂可以作为其它外用生发制剂的添加成分使用。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的肝细胞生长因子为有效成分的制剂，其特征在于，所述制剂一次给药量是含有权力要求1所述有效成分的最终浓度为10-1000ng/ml。

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