CN101199837A

CN101199837A - 一种人源性细胞因子生发制剂及其制备方法

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Publication number: CN101199837A
Application number: CNA2007100930744A
Authority: CN
Inventors: 邓国宏; 伍津津; 何荫良; 谭文婷; 岳世韬; 高小燕
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-11-30
Filing date: 2007-11-30
Publication date: 2008-06-18

Abstract

本发明名称为一种人源性细胞因子生发制剂及其制备方法，涉及保健治疗产品技术领域。其成分包括脂质成膜材料卵磷脂、胆固醇及活性成分生发细胞因子，它们之间的重量份数比为：2～6∶1～4∶1～5；所述卵磷脂选自卵黄卵磷脂或大豆卵磷脂；所述生发细胞因子选自人成纤维细胞、胎盘细胞、角质细胞或毛乳头细胞的培养上清液的蛋白冻干粉末，细胞培养上清液中富含与毛发生长有关的细胞因子；所述生发细胞因子被包封在脂质膜中。工艺中采用旋转蒸发法使产品成为易于透过皮肤屏障的脂质体剂型，并冰冻干燥为更加稳定的粉末，使用时以含2％促渗剂氮酮的蒸馏水溶解即可。本发明产品易于渗透、皮肤贮留量高、疗效好、无毒副作用。

Description

一种人源性细胞因子生发制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生发制剂及其制备方法，具体涉及一种人源性细胞因子生发制剂及其制备方法，还涉及该人源性细胞因子生发制剂的脂质体剂型。

背景技术

据流行病学调查表明，世界头发疾病的发病情况非常严重，总发病率达到60％，其中男性发病率74.6％，女性24.4％，脱发患者占77.3％。毛囊在毛发的生长发育中起关键性作用。目前关于毛囊生长发育和毛发疾病的基础研究有了令人瞩目的进展，但是针对毛发疾病的临床用药仍较为匮乏，FDA仅仅认证了治疗脱发的内服药非那雄胺和外用药米诺蒂尔2类药。市场上有很多生发的中药制剂，但大多存在生发疗效不一、机制不明、成分不稳定等诸多缺点。因此，开发新的有效的生发药物有巨大的临床意义。

研究发现毛囊及其周围组织能通过自分泌和旁分泌产生一些生物活性因子，经各种途径影响毛发的生长发育和生长周期。其中，对毛囊有重要意义的细胞因子主要有：肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor basic，FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、胰岛素样生长因子(insulin-likegrowth factor，IGF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，这些细胞因子的深入研究为脱发的治疗提供了依据。但是，这类药物多难以直接通过皮肤屏障到达毛囊组织，在毛囊局部难以达到有效浓度；同时这些药物又因容易降解、生物活性下降而不能通过静脉或口服给药完成治疗。

表皮的角质层是药物透皮吸收的主要屏障，药物局部治疗成功的关键是药物必须透过角质层到达病变部位达到有效浓度并维持一定时间。脂质体是将药物包封于类脂质双分子层所形成的超微球状载体制剂。脂质体类似细胞结构，有生物膜的特性和功能，能促进透皮吸收和保持药物在皮肤高浓度。脂质体用作皮肤给药的载体具有以下优点：(1)脂质体与皮肤角质层脂质有高度的相似性，能增强药物进入角质层或表皮的类脂内，增加药物在皮肤的滞留量和滞留时间。(2)脂质体的皮肤靶向作用使得进入血液循环的药物量少，减少了药物由于全身吸收引起的不良反应。(3)脂质体包封药物后，可提高药物的稳定性。(4)脂质体无毒、可生物降解，应用安全无刺激。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有效的人源性细胞因子生发制剂，本发明的另一目的还在于提供这种人源性细胞因子生发制剂的制备方法。

本发明的上述目的是通过以下的技术方案实现的：

即一种人源性细胞因子生发制剂，其特征是：其成分包括脂质成膜材料卵磷脂、胆固醇及活性成分生发细胞因子，它们之间的重量份数比为：2～6∶1～4∶1～5；所述卵磷脂选自卵黄卵磷脂或大豆卵磷脂；所述生发细胞因子选自人的成纤维细胞、胎盘细胞、角质细胞或毛乳头细胞的培养上清液的蛋白冻干粉末；所述生发细胞因子被包封在脂质膜中。

上述人源性细胞因子生发制剂为脂质体冻干粉末剂型。

本发明的制备工艺包括以下步骤：

(1)采用饱和硫酸铵分级沉淀法至硫酸铵饱和度达70％来浓缩培养上清液，透析除盐，-70℃冰冻干燥浓缩液，获得富含与毛发生长有关的细胞因子的蛋白冻干粉末。其主要活性成分为：肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)。细胞可以是成纤维细胞、胎盘细胞、角质细胞或毛乳头细胞；

(2)将卵磷脂和胆固醇用氯仿和甲醇按2∶1体积配比溶解，在旋转蒸发仪上于48℃、120r/min条件下旋转蒸除溶剂，得黄绿色乳状脂膜；

(3)称取步骤(1)的蛋白冻干粉末，用PBS PH7.4溶解，加入步骤(2)所得脂膜中，并加入乙醚混匀，在超声波清洗器上于20℃、160W条件下超生振荡乳化10min，在旋转蒸发仪上于38℃、120r/min条件下旋转蒸除溶剂，至凝乳/豆腐样凝胶形成；

(4)用PBS PH7.4混悬步骤(3)所述凝胶，静置1h，然后在超声破碎仪上于冰浴、150W条件下，间歇超声乳化，得乳白色乳液，过滤除残渣，收集滤液；

(5)将步骤(4)所得滤液于-70℃冰冻干燥24h，即得富含细胞因子活性成分的脂质体冻干粉末。

上述脂质体冻干粉末在使用时以含2％促渗剂氮酮的蒸馏水溶解即可。

实验证明，本发明公开的人源性细胞因子生发制剂的优点是非常明显的：(1)将与毛发生长有关的细胞因子成分包裹于脂质双分子层中形成脂质体，由于脂质体与皮肤角质层脂质有高度的相似性，能增强药物进入角质层或表皮的类脂内，增加药物在皮肤的滞留量和滞留时间。(2)脂质体的皮肤靶向作用使得进入血液循环的药物量少，减少了药物由于全身吸收引起的不良反应。(3)脂质体包封药物后，可提高药物的稳定性。(4)脂质体无毒、可生物降解，应用安全无刺激。(5)产品核心成分为细胞培养上清所提取的与毛发生长有关的细胞因子，与毛囊及其周围组织分泌的生物活性因子一致，更有效的促进毛发生长。

附图说明

附图1 本发明所制备的人源性细胞因子生发制剂脂质体剂型的透射电镜下形态；

附图2本发明所制备的人源性细胞因子生发制剂用药15天时促毛发生长情况：图中从左至右三只BalB/C小鼠分别为脱毛时(0d)、阳性对照组(15d)、本发明人源性细胞因子生发制剂受试组(15d)的毛发生长情况。

实施方案

实施例1 细胞培养上清液中活性细胞因子的提取

采用硫酸铵分级沉淀法浓缩提取活性细胞因子：收集细胞培养上清，加入硫酸铵至硫酸铵饱和度达30％，待溶解完毕，静置30min，然后20℃、3000r/min离心30min，分离上清及沉淀。沉淀用PBS混悬，上清中加入硫酸铵至硫酸铵饱和度达50％，再次离心。重复一次至硫酸铵饱和度达70％，收集三次沉淀，以PBS为透析液、W3500透析袋透析3h除盐，每1h更换一次透析液，并用磁力搅拌器加速除盐，收集透析袋内液体，-70℃冰冻干燥24h，得富含HGF、FGF、IGF等细胞因子的蛋白冻干粉末。经R&D公司ELISA试剂盒定量检测，HGF、FGF、IGF的回收率分别为62％、73％、100％。所培养细胞可以是成纤维细胞、胎盘细胞、角质细胞或毛乳头细胞，其中以成纤维细胞和胎盘细胞为最佳。这些细胞的培养及上清液的收集均采用现有的常规方法。

实施例2人源性细胞因子生发制剂脂质体剂型的制备

称取卵黄卵磷脂1g、胆固醇0.5g，用67ml氯仿和33ml甲醇溶解。在RE-52旋转蒸发仪上于48℃水浴、120r/min条件下蒸除溶剂至黄绿色乳状脂膜形成。称取实施例1中所述蛋白干粉0.75g，用12.5ml PBS溶解后加入脂膜中，加入乙醚100ml，混匀。在KQ-400KDE型高功率超声波清洗器上于20℃、160W条件下，振荡乳化10min后，用RE-52旋转蒸发仪于38℃水浴、120r/min蒸除溶剂，至凝乳/豆腐样凝胶形成，用17.5ml PBS混悬。静置1h。在CP-750超声破碎仪上，冰浴、150W，间歇超声乳化100次(超声2s，间歇9s)，得乳白色乳液，过滤除残渣，收集滤液。-70℃冰冻干燥24h，得富含HGF、FGF、IGF等与毛发生长有关的细胞因子的脂质体冻干粉末，即为脂质冻干粉末成品。

实施例3人源性细胞因子生发制剂脂质体剂型的形态鉴定

根据需要调整超声频率及时间，可控制脂质体粒径大小及形态，并用透射电镜鉴定：2％磷钨酸染色，铜网干燥，15min后于透射电镜下观察脂质体形态、照相并测其直径。所制备脂质体平均直径为140.8nm(59.3-296.3nm)，形态见图1，结果显示本工艺所制备的脂质体大小比较均匀，膜边缘光滑无皱折。

实施例4人源性细胞因子生发制剂脂质体剂型的成分鉴定和评价

经R&D公司ELISA试剂盒定量检测，本产品富含HGF、FGF、EGF、IGF TGF-β1、VEGF，是正常血清的5-15倍，包封后与包封前(实施例1获得的冻干粉)比较，各细胞因子含量有2-7倍的提高。

实施例5 人源性细胞因子生发制剂脂质体剂型的包封率检测

采用超滤法测定本工艺所制备脂质体的包封率：其原理为分子筛，包封在脂质体内的细胞因子因脂质体直径较大，不能通过滤膜，而游离的细胞因子直径远小于脂质体，能透过滤膜，从而达到分离检测目的。具体做法是：取实施例2中超声乳液过滤除残渣后所得滤液，用Millipore MWCO 100K超滤离心管4000r/min离心20min，R&D公司ELISA试剂盒定量检测超滤前及超滤后滤液中各细胞因子含量，计算W总、W游及包封率。本工艺所制备的人源性细胞因子生发脂质体包封率以HGF计为63％(61％-65％)。

实施例6人源性细胞因子生发制剂的促毛发生长试验

方法：将24只BalB/C雄性小鼠随机分为6组，每组4只，给药前1d将小鼠背部用8％硫化钠(含3％淀粉)脱毛，去毛面积4cm²，脊柱左右区各2cm²。所有试验组动物均右侧区域外涂相应受试样品，每只小鼠用药0.5ml/d，各组左侧区不做任何处理。连续用药20d，每日观察小鼠背部皮肤变化及毛发生长情况，每只小白鼠于11d、12d、14d、17d、20d左右各随机拔取5根毛发，游标卡尺测鼠毛长度，取其均值。阳性对照组涂目前市场上常见的生发药物，阳性对照组涂蒸馏水。

结果：毛发生长状况见图2和表1。生长时间：成纤维细胞、胎盘细胞、角质细胞培养液来源的产品于用药9-10天可见毛发生长，阳性对照组于12-14天可见；生长密度：在第9-14天，成纤维细胞、胎盘细胞、角质细胞培养液来源的本发明人源性细胞因子生发制剂受试组毛发明显比阳性对照组密集；生长长度：受试组、阳性对照组显著快于涂蒸馏水组。

附表1本发明所制备的人源性细胞因子生发制剂不同时段的促毛发生长情况(单位：mm)

	KC培养液	lip-KC	FB培养液	lip-FB	阳性对照组	蒸馏水
	KC培养液	lip-KC	FB培养液	lip-FB	阳性对照组	蒸馏水	11d12d14d17d	1.631±0.4051.736±0.5612.269±0.5943.711±0.654	2.140±0.4691.991±0.5352.643±0.8424.839±1.224	1.614±0.4921.492±0.2882.121±0.5083.575±0.679	1.792±0.2581.872±0.5002.111±0.4113.941±1.333	1.440±0.2701.630±0.2971.966±0.2563.532±0.797	1.210±0.4101.157±0.3901.948±0.5033.650±0.727

表注释：KC即Keratinocyte，角质细胞；FB即Fibroblast，成纤维细胞；lip-KC为角质细胞培养上清液来源的人源性细胞因子生发制剂脂质体剂型；lip-FB为成纤维细胞培养上清液来源的人源性细胞因子生发制剂脂质体剂型。

实施例7人源性细胞因子生发制剂脂质体剂型离体透皮率实验

方法：改良二室扩散池法进行药物皮肤透过率实验，对接受池中细胞因子含量进行第2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h实时监测，比较人源性细胞因子生发制剂脂质体剂型与细胞培养液(水剂)的离体皮肤通透差异。结果：包封后比不包封透过率提高4倍左右；高浓度脂质体比低浓度脂质体透过率提高2倍左右。

实施例8人源性细胞因子生发制剂脂质体剂型皮内渗透实验

方法：I¹²⁵标记的本发明产品和I¹²⁵标记的未包封蛋白质擦拭大白兔皮肤，监测不同时相点(0h、0.5h、2h、6h)药物入血量及第6h药物皮肤贮量，比较脂质体剂型与非脂质体剂型的在体皮肤渗透差异，同时考察促渗剂毛果芸香碱、氮酮的促渗作用。结果：脂质体剂型的皮肤贮量约是非脂质体剂型蛋白质的2倍；产品无显著血药浓度，本产品为皮肤外用药物，需要较高的皮肤贮量而不是血药浓度；促渗剂有明显增加皮肤贮量的作用，毛果芸香碱约为2-3倍，氮酮约为4倍。

实施例9 细胞生物活性测定

采用MTT法测定本产品(即人源性细胞因子生发制剂)对HepG₂细胞的生物活性。本产品对HepG₂细胞的生物活性约是小牛血清培养基的1.5倍，是阳性对照及无血清培养基的2倍余。

Claims

1.一种人源性细胞因子生发制剂，其特征是其成分包括脂质成膜材料卵磷脂、胆固醇及活性成分生发细胞因子，它们之间的重量份数比为：2～6∶1～4∶1～5；所述卵磷脂选自卵黄卵磷脂或大豆卵磷脂；所述生发细胞因子选自人的成纤维细胞、胎盘细胞、角质细胞或毛乳头细胞的培养上清液的蛋白冻干粉末；所述生发细胞因子被包封在脂质膜中。

2.根据权利要求1所述的人源性细胞因子生发制剂，其特征是所述人源性细胞因子生发制剂为脂质体冻干粉末剂型。

3.一种制备如权利要求1所述人源性细胞因子生发制剂的制备方法，其特征是：工艺包括以下步骤：