CN109998994A - 包含药物的柔性脂质体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种包含药物的柔性脂质体及其制备方法。由于皮肤的屏障作用，很多药物透皮效率低，吸收不好。本发明针对上述问题提高了一种包含药物的柔性脂质体，是由包括有由疏水化修饰的多肽修饰的柔性脂质体包含药物制成，所述的有特殊修饰的脂质体由以下主要成分的原料制成：按重量比计，卵磷脂:脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或其衍生物＝7:2‑4，含有重量百分比为0.1‑1％的抗氧化剂，含有重量百分比为1‑10％的疏水化修饰多肽DP7‑C或PAL‑DP7或其衍生物，还含有重量百分比为1～10％的具有药物。本发明设计并筛选了一种用疏水化多肽修饰的柔性脂质体，能有效携带药物进入皮肤深层，并能协助药物进入细胞内发挥作用，具有很好的应用前景。

Description

包含药物的柔性脂质体及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种包含药物的柔性脂质体及其制备方法。
背景技术
透皮给药(Transdermal Drug Delivery)是药物经由皮肤吸收进入人体血液循环并达到有效血药浓度、实现疾病治疗或预防一种给药新途径。透皮给药是药物研发的一个重要领域，是无创伤性给药的新途径，其优点表现为：1)药物吸收不受消化道内pH值、食物和药物在肠道移动时间等复杂因素影响；2)可有效避免药物在肝脏的首过效应；3)可持续控制给药速度；4)用药部位在体表，患者可自行给药，顺应性较好。
皮肤的屏障作用是决定药物渗透速度的关键因素。因此克服皮肤屏障作用，促进药物在一定时间内透皮渗透达到治疗量，是许多药物透皮给药系统研究的关键问题之一。根据不同药物，促进其透皮渗透的方法有很多，主要有：①透皮吸收促进剂；②超声波法；③离子导入法；④电穿孔法；⑤微针法。但超声法、离子导入法、电穿孔法、微针法等方法均为物理方法，需要特殊的仪器，对皮肤也有一定损伤。透皮吸收促进剂为化学方法，不同性质的药物分子需要筛选不同种类的透皮吸收促进剂，急需一种广谱的透皮给药系统针对小分子药物、多肽或蛋白药物，实现其有效地透皮吸收。
脂质体是由磷脂等类脂形成的双分子层的闭合囊泡，其结构类似生物膜，具有亲水性和亲脂性，可以包裹水溶性和脂溶性药物。柔性脂质体(也称传递体)是在普通脂质体的基础上，加入表面活性剂，如胆酸钠、脱氧胆酸钠、吐温等，使其类脂质膜具有了高度的形变能力，能高效穿过比其自身小数倍的孔道，传递体的这种高度形变能力使其可作为一种重要的透皮给药系统，传递各种形式的药物，包括亲水性、疏水性，小分子、大分子。但一般配方的柔性脂质体虽然能携带药物进入表皮，但透皮效率有限。
本发明设计并筛选了一种用疏水化多肽修饰的柔性脂质体，它能有效携带药物进入皮肤深层，并能协助药物进入细胞内发挥作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种广谱的、可携带不同性质药物的柔性脂质体，实现药物有效的透皮递送。
本发明提供了一种柔性脂质体，是由疏水化修饰的多肽修饰得到的。
进一步的，上述柔性脂质体中，所述的疏水化修饰的多肽为氮端疏水化修饰的多肽。
上述柔性脂质体中，所述疏水化修饰的多肽修饰的柔性脂质体由以下主要成分的原料制成：按重量比计，卵磷脂:脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或疏水化修饰的多其衍生物＝7:2-4，含有重量百分比为1-10％的疏水化修饰的多肽，还含有药物成分。
其中，上述柔性脂质体中，还含有抗氧化剂。所述的抗氧化剂包括维生素C或其衍生物、维生素E或其衍生物或辅酶Q中的至少一种。所述抗氧化剂的重量百分比含量为0.1-1％。
其中，上述柔性脂质体中，由下述配比的成分制备而成：按重量比计，卵磷脂:脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物＝7:3，含有重量百分比为0.5％的抗氧化剂，还含有重量百分比为2-10％的疏水化修饰的多肽。
其中，上述柔性脂质体中，所述疏水化修饰的多肽中多肽的序列为在SEQ ID NO:1基础上在C端连接NH2，并在多肽的氮末端偶联甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。
SEQ ID NO:1疏水化修饰多肽的氨基酸序列
VQWRIRVAVIRK。
其中，上述柔性脂质体中，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物。
其中，上述柔性脂质体中，所述的甾醇类化合物为胆固醇、丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种。
其中，上述柔性脂质体中，所述饱和直链脂肪酸为C6～C20中的至少一种。
其中，上述柔性脂质体中，所述饱和直链脂肪酸为C8～C18中的至少一种。
其中，上述柔性脂质体中，所述的长链脂肪酸为硬脂酸、软脂酸、月桂酸或正辛酸中的至少一种。
其中，上述柔性脂质体中，所述疏水化修饰的多肽结构为：
其中，所述的R为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。
其中，上述柔性脂质体中，所述的R为
本发明还提供了一种包含药物的柔性脂质体，是由疏水化修饰的多肽修饰的柔性脂质体包含药物制备而成。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述的疏水化修饰的多肽修饰的柔性脂质体由以下主要成分的原料制成：按重量比计，卵磷脂:脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物＝7:2-4，含有重量百分比为1-10％的疏水化修饰的多肽。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，还含有抗氧化剂。所述的抗氧化剂包括维生素C或其衍生物、维生素E或其衍生物或辅酶Q中的至少一种。所述抗氧化剂的重量百分比含量为0.1-1％。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述的药物包括小分子药物、多肽类药物或蛋白类药物中的至少一种。进一步的，所述的小分子药物为利多卡因、酚洛酮、佐米曲坦或雌激素中的至少一种。所述多肽类药物为甲状旁腺激素PTH、胰岛素或GLP-1或其类似物中的至少一种。所述蛋白类药物为生长激素、EPO或白细胞介素类。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述药物包括多肽或蛋白类免疫原。具体包括病原菌抗原、病毒抗原、肿瘤抗原等。所述的多肽免疫原包括肿瘤多肽抗原MAGE-3、gp100、MUC1、PEP3等。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述柔性脂质体由下述配比的成分制备而成：按重量比计，卵磷脂:脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物＝7:3，含有重量百分比为0.5％的抗氧化剂，还含有重量百分比为2-10％的疏水化修饰多肽。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述疏水化修饰多肽中多肽的序列为在SEQID NO:1基础上在C端连接NH2，并在多肽的氮末端偶联甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述的甾醇类化合物为胆固醇、丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述饱和直链脂肪酸为C6～C20中的至少一种。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述饱和直链脂肪酸为C8～C18中的至少一种。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述的长链脂肪酸为硬脂酸、软脂酸、月桂酸或正辛酸中的至少一种。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述疏水化修饰多肽结构为：
其中，所述的R为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。
其中，上述包含药物的柔性脂质体中，所述的R为
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述小分子药物占脂质体体重量百分比为1～10％。
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述小分子药物占脂质体重量百分比为1～8％。
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述小分子药物占脂质体的重量百分比为2～5％。
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述多肽类药物占脂质体重量百分比为1～10％。
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述多肽类药物占脂质体重量百分比为2～6％。
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述多肽类药物占脂质体的重量百分比为3％。
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述蛋白类药物占脂质体体重量百分比为1～5％。
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述蛋白类药物占脂质体重量百分比为1～3％。
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述蛋白类药物占脂质体的重量百分比为2％。
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述多肽或蛋白类免疫原占脂质体体重量百分比为1～5％。
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述多肽或蛋白类免疫原占脂质体重量百分比为1～3％。
进一步的，上述包含药物的柔性脂质体中，所述多肽或蛋白类免疫原占脂质体的重量百分比为2％。
本发明还提供了一种上述包含药物的柔性脂质体的制备方法，包括以下步骤：
a、称取卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物、维生素E置于反应容器中，加入溶剂溶解，所述溶剂为氯仿与乙醇按1∶1-3组成的混合物或全部为乙醇；
b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；
c、在脂质体膜中加入DP7-C或PAL-DP7和蒸馏水，进行超声水化得空白脂质体溶液；
d、将药物加入空白脂质体溶液，轻微震荡，室温孵育30-60分钟，即得包含药物的柔性脂质体。
其中，上述包含药物的柔性脂质体的制备方法中，还包括步骤e：将脂质体挤压通过0.1-0.45μm聚碳酸酯膜4～8次。
其中，上述包含药物的柔性脂质体的制备方法中，还包括步骤f：按剂型要求，将柔性脂质体再添加药学上常规辅料制成乳剂、油剂、搽剂、膏剂或贴剂剂型。
本发明还提供了一种药物制剂，所述药物制剂是由上述柔性脂质体装载药物活性成分作为主要活性成分制成的外用药物制剂。或由上述含有药物的柔性脂质体作为主要活性成分制成的药物制剂。进一步的，所述药物制剂为透皮制剂。本发明的药物制剂剂型为酊剂、洗剂、冲洗剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、凝胶剂、膏剂、软膏剂、凝霜剂、乳剂、霜剂、泥敷剂、油剂、气雾剂、喷雾剂或贴剂等剂型。
具体的，所述的辅助性成分可以为制备外用药时的常规添加制剂，如透皮促进剂、骨架材料、成膜材料、压敏胶或防粘材料等。具体可包括表面活性剂类、亚砜类、吡咯烷酮类、氮酮或其类似物、挥发油、氨基酸或其衍生物、磷脂、油酸、醇醚类、多元醇类或萜类等。
本发明还提供了具有上述序列或结构的疏水化修饰多肽DP7-C或PAL-DP7或其衍生物在制备药物制剂上的用途。也提供了上述疏水化修饰多肽DP7-C或PAL-DP7或其衍生物修饰的柔性脂质体在制备药物制剂上的用途。所述用途中，药物制剂都是指透皮制剂。
柔性脂质体是在脂质体基础上经处方改进的一种自聚集泡囊，在脂质体的磷脂成分中加入表面活性物质如胆酸钠等，使其类脂膜具有高度变形能力，亦称为传递体。由于传递体粒径比脂质体小，能穿过孔径为其本身1/10～1/5的小孔，透过速率和量几乎与纯水相当。
本发明的柔性脂质体(传递体)的作用机理为：1、传递体粒径较脂质体更小，能快速穿透皮肤角质层，进入表皮和真皮，形成“储库”；2、包封在传递体内的药物能缓慢释放出来，极大提高了药物的作用效果。3、该传递体携带药物具备自己特有的生物学功能，可进入血液循环系统发挥作用，或多肽、蛋白类抗原诱导机体的免疫反应。
本发明的有益效果为：
本发明在传统的脂质体基础上经处方改进提供了一种新型柔性脂质体，通过在脂质体的磷脂成分中加入表面活性物质如脱氧胆酸钠、聚山梨醇酯80或其衍生物等，使其类脂膜具有高度变形能力，同时加入能加强透皮效果的穿膜肽，提高其透皮渗透能力。发明人将上述传递体用于包裹药物，利用其优良的透皮能力，制备成新型药物透皮制剂。本发明新型药物透皮剂所用材料安全无毒，具有生物膜的功能与特性，与人体细胞有很强的亲和性，透皮率高，在透皮给药技术中有很好的应用前景，具有巨大的经济效益。
初步的药物试验显示：本发明通过采用上述柔性脂质体包含利多卡因等小分子药物时，能够快速穿透皮肤角质层，进入表皮和真皮，形成“储库”；上述柔性脂质体包含胰岛素、GLP-1、EPO、白细胞介素类蛋白药物时，也能够快速的穿透皮肤，透皮效果更好；在包含病毒抗原、肿瘤抗原等蛋白或多肽抗原类时，制备的含抗原的柔性脂质体能更快的诱导机体发生免疫反应。
在技术水平上，本发明优势在于：本发明产品除具有药物特有的功能外，该药物透皮制剂还具有更好的透皮效果，能协助药物进入细胞内发挥作用。
附图说明
图1为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含利多卡因的DP7-C修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；
图2为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含利多卡因的PAL-DP7修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；
图3为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含GLP-1类似物Exendin-4(Ex-4)的DP7-C修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；
图4为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含GLP-1类似物Exendin-4(Ex-4)的PAL-DP7修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；
图5为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含EPO的DP7-C修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；
图6为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含EPO的PAL-DP7修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；
图7为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含NY-ESO-1的DP7-C修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；
图8为制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含NY-ESO-1的PAL-DP7修饰柔性脂质体纳米粒径检测图；
图9为制备的含利多卡因的DP7-C和PAL-DP7修饰柔性脂质体的体外透皮效果图；
图10为制备的含Ex-4的DP7-C和PAL-DP7修饰柔性脂质体的体外透皮效果图；
图11为制备的含EPO的DP7-C和PAL-DP7修饰柔性脂质体的体外透皮效果图；
图12为制备的含NY-ESO-1的DP7-C和PAL-DP7修饰柔性脂质体的体外透皮效果图；
图13为含Ex-4的柔性脂质体在饮食诱导肥胖(DIO)小鼠模型中的效果，A.给药后各组小鼠体重的变化趋势图；B.胰岛素耐量(ITT)的检测；C.小鼠葡萄糖耐量检测；
图14为含EPO的柔性脂质体在小鼠中促网织红细胞的活性；
图15为含NY-ESO-1的柔性脂质体免疫小鼠后的抗体产生情况。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
本发明中所述的疏水化修饰多肽DP7-C为抗菌肽DP7与胆固醇的偶联物，疏水化修饰多肽PAL-DP7为抗菌肽DP7与软脂酸的偶联物，其合成方法参见专利CN107441501A中的合成方法，也可采用本领域的其它方法进行合成，实施例中所用的DP7-C和PAL-DP7由成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成。
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明含药物的柔性脂质体的制备
按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素E，分别用氯仿/乙醇或乙醇溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽DP7-C或PAL-DP7，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入适量利多卡因或GLP-1类似物(Ex-4)或EPO或NY-ESO-1等，室温孵化40分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即得本发明含药物的柔性脂质体。
试验例1-1包含利多卡因的DP7-C修饰柔性脂质体的制备
实验材料：
大豆卵磷脂：购自Lipoid GmbH公司；
脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；
聚山梨醇酯80：购自美国Merck公司；
疏水化修饰多肽DP7-C：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；
利多卡因：购自上海蓓朗生物科技有限公司；
仪器：马尔文激光粒度检测仪ZEN 3600。
本试验例研究柔性脂质体采用DP7-C修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含利多卡因的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8.5:1.5，疏水化修饰多肽DP7-C比例为5％，利多卡因终浓度为50mg/ml，水化介质为水，水化时间30分钟。
具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素E，分别用氯仿/乙醇(1:2)溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽DP7-C，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入利多卡因至终浓度为5mg/ml，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含利多卡因的柔性脂质体1-1和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含利多卡因的柔性脂质体1-2，其粒径分别为79.49nm和73.91nm左右，见表1，采用超速离心法测得产品的包封率分别为48.9％和50.8％。其中，以聚山梨醇酯80为表面活性剂、DP7-C修饰的柔性脂质体，其粒径图见图1。
试验例1-2包含利多卡因的PAL-DP7修饰柔性脂质体的制备
实验材料：
大豆卵磷脂：购自Lipoid GmbH公司；
脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；
聚山梨醇酯80：购自美国Merck公司；
疏水化修饰多肽(PAL-DP7)：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；
利多卡因：购自上海蓓朗生物科技有限公司；
仪器：马尔文激光粒度检测仪ZEN 3600。
本试验例研究柔性脂质体采用PAL-DP7修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含利多卡因的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8:2，疏水化修饰多肽PAL-DP7比例为6％，利多卡因终浓度为50mg/ml，水化介质为水，水化时间30分钟。
具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素E，分别用氯仿/乙醇(1:2)溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽PAL-DP7，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入利多卡因至终浓度为5mg/ml，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含利多卡因的柔性脂质体1-3和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含利多卡因的柔性脂质体1-4，其粒径分别为71.36nm和70.34nm左右，见表1，采用超速离心法测得产品的包封率分别为53.2％和55.1％。其中纳米粒径最小、包封率最好的为以聚山梨醇酯80为表面活性剂、PAL-DP7修饰的柔性脂质体，其粒径图见图2。
表1制备含利多卡因的不同组成柔性脂质体的纳米表征情况
试验例2-1包含GLP-1类似物(Ex-4)的DP7-C修饰柔性脂质体的制备
实验材料：
大豆卵磷脂：购自Lipoid GmbH公司；
脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；
聚山梨醇酯80：购自美国Merck公司；
疏水化修饰多肽DP7-C：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；
GLP-1类似物(Exendin-4)：购自美国Sigma公司；
仪器：马尔文激光粒度检测仪ZEN 3600。
本试验例研究柔性脂质体采用DP7-C修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含Exendin-4(Ex-4)的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8.5:1.5，疏水化修饰多肽DP7-C比例为5％，Ex-4终浓度为1mg/ml，水化介质为水，水化时间30分钟。
具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素E，分别用氯仿/乙醇(1:1)溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽DP7-C，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入Ex-4至终浓度为1mg/ml，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含Ex-4的柔性脂质体2-1和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含Ex-4的柔性脂质体2-2，其粒径分别为122.3nm和120.4nm左右，见表2，采用超速离心法测得产品的包封率分别为52.7％和52.81％。其中，以聚山梨醇酯80为表面活性剂、DP7-C修饰的柔性脂质体，其粒径图见图3。
试验例2-2包含Ex-4的PAL-DP7修饰柔性脂质体的制备
实验材料：
大豆卵磷脂：购自Lipoid GmbH公司；
脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；
聚山梨醇酯80：购自美国Merck公司；
疏水化修饰多肽PAL-DP7：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；
GLP-1类似物(Exendin-4)：购自美国Sigma公司；
仪器：马尔文激光粒度检测仪ZEN 3600。
本试验例研究柔性脂质体采用PAL-DP7修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含Ex-4的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8:2，疏水化修饰多肽PAL-DP7比例为6％，Ex-4终浓度为1mg/ml，水化介质为水，水化时间30分钟。
具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素E，分别用氯仿/乙醇(1:1)溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽PAL-DP7，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入Ex-4至终浓度为1mg/ml，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含Ex-4的柔性脂质体2-3和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含Ex-4的柔性脂质体2-4，其粒径分别为114.1nm和102.5nm左右，见表2，采用超速离心法测得产品的包封率分别为54.17％和55.69％。其中纳米粒径最小、包封率最好的为以聚山梨醇酯80为表面活性剂、PAL-DP7修饰的柔性脂质体，其粒径图见图4。
表2制备含Ex-4的不同组成柔性脂质体的纳米表征情况
试验例3-1包含EPO的DP7-C修饰柔性脂质体的制备
实验材料：
大豆卵磷脂：购自Lipoid GmbH公司；
脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；
聚山梨醇酯80：购自美国Merck公司；
疏水化修饰多肽(DP7-C或PAL-DP7)：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；
EPO：购自美国Sigma公司；
仪器：马尔文激光粒度检测仪ZEN 3600。
本试验例研究柔性脂质体采用DP7-C修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含EPO的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8.5:1.5，疏水化修饰多肽DP7-C比例为5％，EPO终浓度为0.2mg/ml，水化介质为水，水化时间30分钟。
具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素E，分别用氯仿/乙醇(1:3)溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽DP7-C，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入EPO至终浓度为0.2mg/ml，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含EPO的柔性脂质体3-1和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含EPO的柔性脂质体3-2，其粒径分别为131.4nm和125.7nm左右，见表3，采用超速离心法测得产品的包封率分别为55.78％和56.12％。其中，以聚山梨醇酯80为表面活性剂、DP7-C修饰的柔性脂质体，其粒径图见图5。
试验例3-2包含EPO的PAL-DP7修饰柔性脂质体的制备
实验材料：
大豆卵磷脂：购自Lipoid GmbH公司；
脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；
聚山梨醇酯80：购自美国Merck公司；
疏水化修饰多肽(PAL-DP7)：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；
EPO：购自美国Sigma公司；
仪器：马尔文激光粒度检测仪ZEN 3600。
本试验例研究柔性脂质体采用PAL-DP7修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含EPO的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8:2，疏水化修饰多肽PAL-DP7比例为6％，EPO终浓度为0.2mg/ml，水化介质为水，水化时间30分钟。
具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素E，分别用氯仿/乙醇(1:3)溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽PAL-DP7，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入EPO至终浓度为0.2mg/ml，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含EPO的柔性脂质体3-3和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含EPO的柔性脂质体3-4，其粒径分别为119.6nm和114.7nm左右，见表3，采用超速离心法测得产品的包封率分别为56.93％和58.21％。其中纳米粒径最小、包封率最好的为以聚山梨醇酯80为表面活性剂、PAL-DP7修饰的柔性脂质体，其粒径图见图6。
表3制备含EPO的不同组成柔性脂质体的纳米表征情况
试验例4-1包含肿瘤抗原NY-ESO-1的DP7-C修饰柔性脂质体的制备
实验材料：
大豆卵磷脂：购自Lipoid GmbH公司；
脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；
聚山梨醇酯80：购自美国Merck公司；
疏水化修饰多肽DP7-C：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；
NY-ESO-1：购自美国Sigma公司；
仪器：马尔文激光粒度检测仪ZEN 3600。
本试验例研究柔性脂质体采用DP7-C修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含NY-ESO-1的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8.5:1.5，疏水化修饰多肽DP7-C比例为5％，NY-ESO-1终浓度为0.15mg/ml，水化介质为水，水化时间30分钟。
具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素E，分别用乙醇溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽DP7-C，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入NY-ESO-1至终浓度为0.15mg/ml，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含NY-ESO-1的柔性脂质体4-1和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含NY-ESO-1的柔性脂质体4-2，其粒径分别为88.37nm和78.9nm左右，见表4，采用超速离心法测得产品的包封率分别为45.2％和45.7％。其中，以聚山梨醇酯80为表面活性剂、DP7-C修饰的柔性脂质体，其粒径图见图7。
试验例4-2包含NY-ESO-1的PAL-DP7修饰柔性脂质体的制备
实验材料：
大豆卵磷脂：购自Lipoid GmbH公司；
脱氧胆酸钠：购自北京奥博星生物技术责任有限公司；
聚山梨醇酯80：购自美国Merck公司；
疏水化修饰多肽PAL-DP7：成都凯捷生物医药科技发展有限公司合成；
NY-ESO-1：购自美国Sigma公司；
仪器：马尔文激光粒度检测仪ZEN 3600。
本试验例研究柔性脂质体采用PAL-DP7修饰，表面活性物质分别采用脱氧胆酸钠和聚山梨醇酯80进行制备，包含NY-ESO-1的柔性脂质体的制备工艺选择的参数为：大豆卵磷脂与脱氧胆酸钠或大豆卵磷脂与聚山梨醇酯80的比例均为8:2，疏水化修饰多肽PAL-DP7比例为6％，NY-ESO-1终浓度为0.15mg/ml，水化介质为水，水化时间30分钟。
具体的制备工艺如下：按配方精确称量大豆卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80、维生素E，分别用乙醇溶解，于250ml梨型瓶中溶解混合，室温下旋转蒸发2小时，将所得薄膜置于真空干燥箱中过夜。第二天加入蒸馏水、适量疏水化修饰多肽PAL-DP7，400w探头超声30min，得空白传递体溶液。再缓慢加入NY-ESO-1至终浓度为0.15mg/ml，室温孵化30分钟后，将所得母液用0.2μm的聚碳酸酯膜多次过滤，加入赋形剂5％甘露醇，分装于西林瓶中，经冻干后即分别得到以脱氧胆酸钠为表面活性剂的含NY-ESO-1的柔性脂质体4-3和以聚山梨醇酯80为表面活性剂的含NY-ESO-1的柔性脂质体4-4，其粒径分别为77.48nm和73.4nm左右，见表4，采用超速离心法测得产品的包封率分别为47.7％和49.3％。其中纳米粒径最小、包封率最好的为以聚山梨醇酯80为表面活性剂、PAL-DP7修饰的柔性脂质体，其粒径图见图8。
表4制备含NY-ESO-1的不同组成柔性脂质体的纳米表征情况
实施例2本发明含药物的柔性脂质体的透皮效果验证
体外透皮实验采用改良的单室Franz扩散池，以小鼠皮肤作为体外透皮实验皮肤，对不同的含药物柔性脂质体的透皮吸收结果进行对比，分别在不同时间点取样，小分子通过HPLC方法，大分子通过ELISA方法测定透皮接收液中药物的浓度，计算累积透皮量。
试验例2-1包含利多卡因的柔性脂质体的透皮效果验证
1、材料
样品：试验例1制备的含利多卡因的柔性脂质体的冻干粉(1-1，1-2，1-3，1-4)以及未经DP7-C或PAL-DP7修饰的含利多卡因的柔性脂质体作为普通柔性脂质体对照；
仪器：药物透皮试验扩散仪(上海黄海药检，型号RYJ-6B)；HPLC(Agilent，型号1260)；色谱柱：ZORBAX 300SB-C18；
材料：剥离后的小鼠皮肤。
2、方法
2.1按透皮试验扩散仪的使用说明进行待试样品的透皮实验，同时设置一个上方只加缓冲液的空白对照，分别于试验的0hr、1hr、2hr、4hr、8hr收获接收池里的样品。
2.2HPLC检测：紫外检测波长：220nm；流动相：A液：100％ACN+0.1％TFA；
B液：100％H2O+0.1％TFA；试验条件见下表5：
表5HPLC检测条件
时间(min) A液 B液
0 25％ 75％
20 70％ 30％
20.5 25％ 75％
27 25％ 75％
3、结果
分别将利多卡因作为标准品和样品进行HPLC测定，根据利多卡因标准品峰面积建立标准曲线，将待测样品的峰面积代入公式，计算出样品的累计透皮量，见图4。结果表明，随着时间的延长，透过小鼠皮肤的利多卡因逐步增加，与未经修饰的柔性脂质体相比，DP7-C和PAL-DP7修饰的柔性脂质体均具有更好的透皮性能。
试验例2-2包含Ex-4的柔性脂质体的透皮效果验证
1、材料
样品：试验例2制备的以聚山梨醇酯80为表面活性剂、PAL-DP7修饰的含EX-4的柔性脂质体冻干粉(2-1，2-2，2-3，2-4)以及未经DP7-C或PAL-DP7修饰的包含EX-4的柔性脂质体作为普通柔性脂质体对照；
仪器：药物透皮试验扩散仪(上海黄海药检，型号RYJ-6B)；HPLC(Agilent，型号1260)；色谱柱：ZORBAX 300SB-C18；
材料：剥离后的小鼠皮肤。
2、方法
2.1按透皮试验扩散仪的使用说明进行待试样品的透皮实验，同时设置一个上方只加缓冲液的空白对照，分别于试验的0hr、1hr、2hr、4hr、8hr收获接收池里的样品。
2.2HPLC检测：紫外检测波长：220nm；流动相：A液：100％ACN+0.1％TFA；
B液：100％H2O+0.1％TFA；试验条件见下表6：
表6HPLC检测条件
时间(min) A液 B液
0 50％ 50％
25 75％ 25％
25.01 100％ 0
30 100％ 0
30.01 50％ 50％
35 50％ 50％
3、结果
分别将EX-4的多肽作为标准品和样品进行HPLC测定，根据Ex-4标准品峰面积建立标准曲线，将待测样品的峰面积代入公式，计算出样品的累计透皮量，见图10。结果表明，随着时间的延长，透过小鼠皮肤的Ex-4量逐步增加，与未经修饰的柔性脂质体相比，DP7-C和PAL-DP7修饰的柔性脂质体均具有更好的透皮性能。
试验例2-3包含EPO的柔性脂质体的透皮效果的ELISA定量验证
本试验例采用ELISA试剂盒定量测定包含EPO的柔性脂质体的透皮效果。
1、材料
样品：试验例3制备的EPO的柔性脂质体的冻干粉(3-1，3-2，3-3，3-4)以及未经DP7-C或PAL-DP7修饰的含EPO的柔性脂质体作为普通柔性脂质体对照；
仪器：药物透皮试验扩散仪(上海黄海药检，型号RYJ-6B)；
材料：剥离后的小鼠皮肤。
EPO蛋白ELISA检测试剂盒：购自美国R&D公司。
2、方法
2.1按透皮试验扩散仪的使用说明进行待试样品的透皮实验，同时设置一个上方只加缓冲液的空白对照，分别于试验的0hr、1hr、2hr、4hr、8hr收获接收池里的样品。
2.2ELISA测定：按照ELISA检测试剂盒说明书检测各个时间点的样品，根据标准曲线计算样品中EPO的含量。
3、结果
采用EPO的ELISA检测试剂盒定量检测各时间点的接收池样品中EPO的含量，结果见图11。结果表明，随着时间的延长，透过小鼠皮肤的EPO量逐步增加，与未经修饰的普通柔性脂质体相比，DP7-C和PAL-DP7修饰的柔性脂质体均具有更好的透皮性能。
试验例2-4包含NY-ESO-1的柔性脂质体的透皮效果验证
本试验例采用ELISA试剂盒定量测定包含NY-ESO-1的柔性脂质体的透皮效果。
1、材料
样品：试验例4制备的NY-ESO-1的柔性脂质体的冻干粉(4-1，4-2，4-3，4-4)以及未经DP7-C或PAL-DP7修饰的含NY-ESO-1的柔性脂质体作为普通柔性脂质体对照；
仪器：药物透皮试验扩散仪(上海黄海药检，型号RYJ-6B)；
材料：剥离后的小鼠皮肤。
NY-ESO-1蛋白ELISA检测试剂盒：购自上海达科为生物科技有限公司。
2、方法
2.1按透皮试验扩散仪的使用说明进行待试样品的透皮实验，同时设置一个上方只加缓冲液的空白对照，分别于试验的0hr、1hr、2hr、4hr、8hr收获接收池里的样品。
2.2ELISA测定：按照ELISA检测试剂盒说明书检测各个时间点的样品，根据标准曲线计算样品中NY-ESO-1的含量。
3、结果
采用NY-ESO-1的ELISA检测试剂盒定量检测各时间点的接收池样品中NY-ESO-1的含量，结果见图12。结果表明，随着时间的延长，透过小鼠皮肤的NY-ESO-1量逐步增加，与未经修饰的普通柔性脂质体相比，DP7-C和PAL-DP7修饰的柔性脂质体均具有更好的透皮性能。
实施例3本发明含药物的柔性脂质体的体内活性验证
本发明含药物的柔性脂质体均采用相关动物模型检测透皮后的药物活性，均采用本专业范围内公认的动物模型及方法进行验证。
试验例3-1包含Ex-4的柔性脂质体在饮食诱导肥胖小鼠(DIO)模型中的作用
Exendin-4(Ex-4)是一种胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物，是从希腊毒蜥蜴唾液中分离的一种多肽激素，含39个氨基酸的多肽分子，其氨基酸序列与GLP-1有53％同源性。在哺乳动物内Ex-4具有与GLP-1相同的生理功能，它们作用于同一受体。Ex-4能以葡萄糖浓度依赖方式分泌胰岛素降低血糖水平，刺激胰岛β细胞再生，诱导前胰岛基因的转录，促进胰岛素的成熟和分泌；还可以抑制餐后胰高血糖素的产生，延迟胃排空，抑制食欲等。
建立小鼠饮食诱导的肥胖模型(DIO)研究包含Ex-4的柔性脂质体通过皮肤给药对小鼠糖尿病模型的治疗效果。
实验方法：选择体重为40～45g的C57/B6雄性小鼠(购自北京维通利华公司)，随机分成3组：生理盐水组(NS组)、Ex-4皮下给药组(Ex-4皮下组)和Ex-4柔性脂质体透皮给药组(Ex-4透皮组)用高脂饲料喂养8周形成肥胖，胰岛素抵抗和血糖升高的症状，再开始对小鼠进行治疗。
治疗方式为生理盐水组(NS组)和Ex-4皮下组(Ex-4皮下组)均为皮下给药，每天给药一次30μg/kg；Ex-4柔性脂质体透皮给药组，皮肤贴片每周一次，每次1mg/kg。然后每天称三组的体重和摄食量。
治疗后14天，对小鼠进行胰岛素耐量和葡萄糖耐量的检测，然后处死小鼠后，眼眶静脉取血，分离血清，负80度冰箱保存。
胰岛素耐量(ITT)的检测，检测前将小鼠禁食4小时(自由饮水)，然后对小鼠腹腔注射0.5U/kg的胰岛素，分别在注射胰岛素后0、30、60、120min四个时间点进行尾尖采血，测定血糖含量。
葡萄糖耐量(IPGTT)检测，检测前将小鼠禁食16小时(自由饮水)，然后对小鼠腹腔注射2g/kg的葡萄糖溶液，分别在注射葡萄糖0、30、60、120min四个时间点进行尾尖采血，测定血糖含量。
实验结果：各组小鼠体重及摄食量的变化见图13A，结果显示，Ex-4皮下组和Ex-4透皮组均明显抑制小鼠体重的增长。
小鼠胰岛素耐量检测如图13B所示，小鼠治疗周期结束时，将小鼠禁食4小时，对小鼠腹腔注射0.5U/kg的胰岛素，分别在0、30、60、120min四个时间点对血糖进行检测。实验结果显示，与NS组相比，Ex-4皮下组和Ex-4透皮组能够明显改善胰岛素耐量情况。
小鼠葡萄糖耐量检测如图13C所示，小鼠治疗周期结束时，将小鼠禁食16小时，对小鼠腹腔注射2g/kg的葡萄糖，分别在0、30、60、120min四个时间点对血糖进行检测；实验结果显示，在30min时，Ex-4皮下组和Ex-4透皮组分泌的胰岛素能够明显控制葡萄糖的含量，提高DIO小鼠的葡萄糖耐量。
这些结果说明，含Ex-4的柔性脂质体能有效透过小鼠皮肤，并能在体内发挥正常的生理活性，达到减重、降低胰岛素耐受、提高胰岛素敏感性的作用。
试验例3-2包含EPO的柔性脂质体的透皮效果的促网织红细胞活性的测定
EPO，全称红细胞生成素，主要由成年人的肾脏产生，刺激骨髓造血干细胞的分裂、分化，生成红细胞。EPO活性的检测方法按照中国药典2015年版四部通则3522开展。依据EPO可刺激网织红细胞生成的作用，给小鼠皮下注射EPO后，其网织红细胞数量随EPO注射剂量而增加。
6～8周龄的BALB/C雌性小鼠分成7组：NS组，EPO皮下注射组(EPO皮下组)低、中、高三个剂量组和EPO柔性脂质体透皮给药组(EPO透皮组)低、中、高三个剂量组。NS组和EPO皮下组进行一次性皮下注射，EPO剂量分别为0.1、0.2、0.4μg，EPO透皮组采用皮肤贴片，剂量分别为25、50、100μg，在第4天每组从小鼠眼眶采血3～4滴，置于预先加入乙二胺四乙酸二钾抗凝剂的采血管中。取抗凝血，用全自动王志宏细胞分析仪计数每只小鼠血液中的网织红细胞对红细胞总数的比值(RET％)，结果见图14，说明EPO透皮组与皮下组随着剂量增加呈现相同促网织红细胞生成的趋势，具有相似的促网织红细胞的功能。
试验例3-3包含NY-ESO-1的柔性脂质体的诱导小鼠免疫反应的验证
疫苗的透皮给药一般采用特定微针或贴片技术，采用非侵入方式进行免疫，同时蛋白或多肽疫苗保存于微针或贴片，稳定性较好，可常温保存。透皮免疫可以解决目前免疫接种存在的疫苗低温保存、生物活性不稳定、接种人群的依从性等问题，也是目前免疫的一个重要的研究方向。本试验例开展实施例1中试验例4制备的含NY-ESO-1的柔性脂质体的透皮免疫效果研究，以NY-ESO-1蛋白作为肿瘤模式抗原研究透皮免疫激活免疫的效果。
选用5～7周龄，18g左右的雌性小鼠，分组3组：NS组、NY-ESO-1皮下免疫组和NY-ESO-1透皮免疫组。NS组和NY-ESO-1皮下免疫组(5μg NY-ESO-1+150μg Al(OH)3)采用皮下注射方式，NY-ESO-1透皮组(包含NY-ESO-1的柔性脂质体(50μg))采用皮肤贴片，0、2、4周三次免疫。第6周采血收集血清，通过ELISA法检测NY-ESO-1特异性抗体及抗体亚型。
抗体检测方法如下：将NY-ESO-1蛋白用用包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至1μg/ml，在96孔板中每孔加入100μl，4℃过夜。PBST(PBS+0.5％Tween20)洗涤3次。5％的脱脂奶粉37℃封闭1小时。PBST洗涤5次。梯度稀释血清，每孔加入100μl，37℃孵育1小时。PBST洗板5次。其后，每孔加入100μL HRP标记羊抗小鼠IgG(1:3000稀释)，37℃孵育1小时。PBST洗涤5次。各反应孔中加入临时配制的TMB溶液(KPL公司)100μl，室温显色20分钟后，加入0.5M H2SO4 100μl终止反应，450nm波长读数。
抗体检测结果见图15，NS组小鼠的血清中未发现NY-ESO-1特异性抗体，NY-ESO-1皮下免疫组和NY-ESO-1透皮免疫组抗体滴度中位值分别为1024000和512000。结果显示，通过透皮免疫方式的确可以诱导抗体产生，作为免疫接种的一种补充方式。
序列表
<110> 四川大学
<120> 包含药物的柔性脂质体及其制备方法
<130> A190062K
<141> 2019-01-30
<150> 201810150522.8
<151> 2018-02-13
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Gln Trp Arg Ile Arg Val Ala Val Ile Arg Lys
1 5 10

Claims (70)

1.柔性脂质体，其特征在于：是由疏水化修饰的多肽修饰得到的。
2.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：所述疏水化修饰的多肽修饰的柔性脂质体由以下主要成分的原料制成：按重量比计，卵磷脂:脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物＝7:2-4，并含有重量百分比为1-10％的疏水化修饰的多肽，还含有药物成分。
3.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：还含有抗氧化剂。
4.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：所述的抗氧化剂包括维生素C或其衍生物、维生素E或其衍生物或辅酶Q中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：所述抗氧化剂的重量百分比含量为0.1-1％。
6.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：由下述配比的成分制备而成：按重量比计，卵磷脂:脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物＝7:3，含有重量百分比为0.5％的抗氧化剂，还含有重量百分比为2-10％的疏水化修饰的多肽。
7.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：所述疏水化修饰多肽中多肽的序列为在SEQ ID NO:1基础上在C端连接NH2，并在多肽的氮末端偶联甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。
8.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物。
9.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：所述的甾醇类化合物为胆固醇、丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：所述饱和直链脂肪酸为C6～C20中的至少一种。
11.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：所述饱和直链脂肪酸为C8～C18中的至少一种。
12.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：所述的长链脂肪酸为硬脂酸、软脂酸、月桂酸或正辛酸中的至少一种。
13.根据权利要求1所述的柔性脂质体，其特征在于：所述疏水化修饰多肽结构为：
其中，所述的R为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。
14.根据权利要求13所述的柔性脂质体，其特征在于：所述的R为
15.包含药物的柔性脂质体，其特征在于：是由疏水化修饰多肽修饰的柔性脂质体包含药物制备而成。
16.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的疏水化修饰多肽修饰的柔性脂质体由以下主要成分的原料制成：按重量比计，卵磷脂:脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物＝7:2-4，含有重量百分比为1-10％的疏水化修饰的多肽。
17.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：还含有抗氧化剂。
18.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的抗氧化剂包括维生素C或其衍生物、维生素E或其衍生物或辅酶Q中的至少一种。
19.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述抗氧化剂的重量百分比含量为0.1-1％。
20.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的药物包括小分子药物、多肽类药物或蛋白类药物中的至少一种。
21.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的小分子药物为利多卡因、酚洛酮、佐米曲坦或雌激素中的至少一种。
22.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的多肽类药物为PTH、胰岛素或GLP-1或GLP-1类似物中的一种。
23.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的蛋白类药物为生长激素、EPO或白细胞介素中的至少一种。
24.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的药物的重量百分比为1～10％。
25.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述药物为多肽或蛋白类免疫原中的至少一种。
26.根据权利要求25所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的蛋白免疫原包括病原菌抗原、病毒抗原或肿瘤抗原中的至少一种。
27.根据权利要求25所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的多肽免疫原包括肿瘤多肽抗原MAGE-3、gp100、MUC1或PEP3。
28.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于，由下述配比的成分制备而成：按重量比计，卵磷脂:脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物＝7:3，含有重量百分比为0.5％的抗氧化剂，还含有重量百分比为2-10％的疏水化修饰的多肽。
29.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述疏水化修饰多肽中多肽的序列为在SEQ ID NO:1基础上在C端连接NH2，并在多肽的氮末端偶联甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。
30.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物。
31.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的甾醇类化合物为胆固醇、丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种。
32.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述饱和直链脂肪酸为C6～C20中的至少一种。
33.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述饱和直链脂肪酸为C8～C18中的至少一种。
34.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的长链脂肪酸为硬脂酸、软脂酸、月桂酸或正辛酸中的至少一种。
35.根据权利要求15所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述疏水化修饰多肽结构为：
其中，所述的R为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。
36.根据权利要求35所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的R为
37.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的小分子药物占脂质体体重量百分比为1～10％。
38.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的小分子药物占脂质体重量百分比为1～8％。
39.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的小分子药物占脂质体的重量百分比为2～5％。
40.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的多肽类药物占脂质体重量百分比为1～10％。
41.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的多肽类药物占脂质体重量百分比为2～6％。
42.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的多肽类药物占脂质体的重量百分比为3％。
43.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的蛋白类药物占脂质体体重量百分比为1～5％。
44.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的蛋白类药物占脂质体重量百分比为1～3％。
45.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的蛋白类药物占脂质体的重量百分比为2％。
46.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的多肽或蛋白类免疫原占脂质体体重量百分比为1～5％。
47.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的多肽或蛋白类免疫原占脂质体重量百分比为1～3％。
48.根据权利要求20所述的包含药物的柔性脂质体，其特征在于：所述的多肽或蛋白类免疫原占脂质体的重量百分比为2％。
49.制备权利要求1-48任一项所述的含药物的柔性脂质体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、称取卵磷脂、脱氧胆酸钠或聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯80衍生物、维生素E置于反应容器中，加入溶剂溶解，所述溶剂为氯仿与乙醇按1∶1-3组成的混合物或全部为乙醇；
b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；
c、在脂质体膜中加入DP7-C或PAL-DP7和蒸馏水，进行超声水化得空白脂质体溶液；
d、将药物加入空白脂质体溶液，轻微震荡，室温孵育30-60分钟，即得包含药物的柔性脂质体。
50.根据权利要求49所述的制备包含药物的柔性脂质体的方法，其特征在于：还包括步骤e：将孵化后的脂质体挤压通过0.1-0.45μm聚碳酸酯膜4～8次。
51.根据权利要求49所述的制备包含药物的柔性脂质体的方法，其特征在于：还包括步骤f：按剂型要求，将柔性脂质体再添加药学上常规辅料制成酊剂、洗剂、冲洗剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、凝胶剂、膏剂、软膏剂、凝霜剂、乳剂、霜剂、泥敷剂、油剂、气雾剂、喷雾剂或贴剂。
52.一种药物制剂，其特征在于，是由权利要求1-14任一项所述的脂质体，装载药物活性成分作为主要活性成分制成的外用药物制剂。
53.根据权利要求52所述的药物制剂，其特征在于：所述的外用药物制剂为透皮制剂。
54.根据权利要求52所述的药物制剂，其特征在于：其剂型为酊剂、洗剂、冲洗剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、凝胶剂、膏剂、软膏剂、凝霜剂、乳剂、霜剂、泥敷剂、油剂、气雾剂、喷雾剂或贴剂。
55.根据权利要求52所述的药物制剂，其特征在于：还含有制备透皮药物制剂必要的辅助性成分。
56.一种透皮药物制剂，是由权利要求15-48任一项所述的含药物的柔性脂质体为主要活性成分制备而成的外用药物制剂。
57.根据权利要求56所述的透皮药物制剂，其特征在于：其剂型为酊剂、洗剂、冲洗剂、搽剂、涂剂、涂膜剂、凝胶剂、膏剂、软膏剂、凝霜剂、乳剂、霜剂、泥敷剂、油剂、气雾剂、喷雾剂或贴剂。
58.根据权利要求56所述的透皮药物制剂，其特征在于：还含有制备透皮药物制剂必要的辅助性成分。
59.疏水化修饰的多肽在制备药物制剂中的用途。
60.根据权利要求59所述的用途，其特征在于：所述疏水化修饰的多肽中多肽的序列为在SEQ ID NO:1基础上在C端连接NH2，并在多肽的氮末端偶联甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。
61.根据权利要求60所述的用途，其特征在于：所述的甾醇类化合物为胆固醇类化合物或胆酸类化合物。
62.根据权利要求60所述的用途，其特征在于：所述的甾醇类化合物为胆固醇、丁二酰化胆固醇、胆酸或去氧胆酸中的至少一种。
63.根据权利要求60所述的用途，其特征在于：所述饱和直链脂肪酸为C6～C20中的至少一种。
64.根据权利要求60所述的用途，其特征在于：所述饱和直链脂肪酸为C8～C18中的至少一种。
65.根据权利要求60所述的用途，其特征在于：所述的长链脂肪酸为硬脂酸、软脂酸、月桂酸或正辛酸中的至少一种。
66.根据权利要求60所述的用途，其特征在于：所述疏水化修饰的多肽结构为：
其中，所述的R为甾醇类化合物或饱和直链脂肪酸。
67.根据权利要求66所述的用途，其特征在于：所述的R为
68.根据权利要求60所述的用途，其特征在于：所述的药物制剂为透皮药物制剂。
69.权利要求1-14任一项所述的疏水化修饰多肽修饰的柔性脂质体在制备药物制剂中的用途。
70.根据权利要求60所述的用途，其特征在于：所述的药物制剂为透皮药物制剂。
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