CN103393597A

CN103393597A - 疏水性肽修饰的注射用长循环脂质体给药系统

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Publication number: CN103393597A
Application number: CN2013102750351A
Authority: CN
Inventors: 张强; 代文兵; 高薇; 蔡德富
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2013-07-02
Filing date: 2013-07-02
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2033-07-02
Also published as: CN103393597B

Abstract

本发明属于药物剂型和制剂技术领域，涉及一种供注射用载抗癌药物的靶向长循环脂质体给药系统，其特征在于：长循环脂质体用疏水性肽修饰。其中，疏水性肽与细胞膜具有很强的亲和性，可以通过疏水作用插入到细胞膜中，本发明用疏水性肽修饰长循环脂质体可以增加在肿瘤组织内的脂质体透过肿瘤细胞膜的能力，使其运载的药物可以到达细胞内的靶点，从而提高抗癌药物的疗效。本发明的特点在于，利用了疏水性肽的插膜作用，将其修饰在长循环脂质体表面，增加抗癌药物的肿瘤细胞内转运。

Description

疏水性肽修饰的注射用长循环脂质体给药系统

技术领域

本发明属于药物剂型和制剂技术领域，涉及一种供注射用的疏水性肽修饰的载抗癌药物的长脂质体给药系统，用于增加抗癌药物的肿瘤细胞内转运。

背景技术

恶性肿瘤是导致人类死亡的主要原因之一。随着世界人口老龄化程度增加，预计全世界癌症死亡人数将继续上升。目前，恶性肿瘤的治疗仍然是医学面临的重大难题。药物化疗是临床上治疗恶性肿瘤最常用的方法。然而，大部分的化疗药物没有选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常的细胞产生杀伤作用，导致严重的毒副作用，如阿霉素的心脏毒性作用等。采用纳米载体（如脂质体，纳米粒，胶束等）包载药物可以明显延长其在体内循环的时间，有利于抗肿瘤药物向肿瘤区蓄积，从而增加了抗癌药物的治疗指数，减少了毒副作用。目前已有阿霉素脂质体、柔红霉素脂质体、紫杉醇白蛋白纳米粒等产品上市。

脂质体是最早进入临床的纳米制剂，具有制备简单，无毒性，无免疫原性等特点。普通脂质体虽然能够改善抗癌药物的疗效，但易被肝脏、脾脏内的巨噬细胞摄取而迅速消除，在体内滞留时间短。将普通脂质体的表面进一步用亲水性的聚乙二醇（PEG）进行修饰，可制成长循环脂质体。长循环脂质体能够逃避血浆中的调理素的调理作用从而避免了被网状内皮系统的巨噬细胞摄取（故也称为隐性脂质体），显著延长了其在循环系统中的滞留时间，血药浓度也明显提高。同时，长循环脂质体经增强渗透和滞留作用（EPR）可增加被包载药物向肿瘤组织内的蓄积，从而提高了抗癌药物传递的靶向性。目前已有阿霉素隐性脂质体上市

)。

尽管长循环脂质体可以增加药物在肿瘤组织内的蓄积，但并不意味着一定能够提高抗肿瘤药物的疗效。其原因之一在于大部分抗肿瘤药物的作用靶点位于细胞内，脂质体必须将药物运送到细胞内才能发挥药效，而普通的长循环脂质体进入细胞的能力较差。主动靶向脂质体是解决这一问题的重要方法，其原理是在长循环脂质体表面修饰抗体，配体，穿膜肽等分子，通过抗体与肿瘤细胞表面特异性抗原结合，配体与肿瘤细胞表面特异性受体结合或穿膜肽与细胞膜的相互作用，增加脂质体与细胞膜的粘附和摄取。尽管目前尚无此类产品上市，但是已有少数进入临床试验，例如靶向转铁蛋白的奥沙利铂脂质体已进入II期临床。

膜蛋白是指能够结合或整合到细胞或细胞器表面上的蛋白质的总称。跨膜蛋白属于膜蛋白中的一种，可以跨越膜的二端。其中，膜蛋白露出膜外的部分含较多的极性氨基酸，属亲水性，与细胞膜磷脂分子的亲水头部邻近，嵌入脂双层内部的膜蛋白由一些非极性的氨基酸组成，与脂质分子的疏水尾部相互结合，因此与膜结合非常紧密。基于跨膜蛋白中疏水性肽片断与细胞膜的结合能力，本发明将疏水性肽修饰在长循环脂质体的表面，经注射给药后，长循环脂质体能通过增强渗透和滞留作用向肿瘤组织内蓄积，继而，利用疏水性肽的插膜作用，肿瘤组织内的脂质体转运到细胞内，进而增加抗癌药物的细胞内转运，增加抗肿瘤药效，并可降低化疗药物的毒副作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种是利用疏水性肽的插膜作用，用其修饰长循环脂质体，增加细胞对脂质体的摄取，提高脂质体递送抗癌药物的靶向性。具体是将长循环脂质体表面用疏水性肽修饰，制备成疏水性肽修饰的靶向脂质体。疏水性肽修饰的长循环脂质体先通过增强渗透和滞留作用（EPR效应）将运载的药物蓄积到肿瘤组织，再通过疏水性肽的插膜作用，将药物最终运载到肿瘤细胞内，实现抗肿瘤药物的靶向递送，从而发挥更好的抗肿瘤药效。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明提供一种供注射用的载抗癌药物的长循环脂质体，其中，脂质体表面用疏水性肽修饰。

本发明提供的疏水性肽修饰的长循环脂质体，其中所述疏水性肽可以是疏水性的线性肽或环肽，其中，线性肽可经端基修饰，优选为肽N端乙酰化和（或）C端酰胺化修饰。

本发明提供的疏水性肽修饰的长循环脂质体，其中所述疏水性肽的序列中包括至少一种疏水性氨基酸残基，其中，疏水性氨基酸选自：酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)或丙氨酸(A)。

本发明提供的疏水性肽修饰的长循环脂质体，其中所述疏水性肽的序列中至少包含2个疏水性氨基酸残基，这2个疏水性氨基酸残基既可以源于同一种疏水性氨基酸的2个残基，也可以源于2种疏水性氨基酸的残基。

本发明提供的疏水性肽修饰的长循环脂质体，其中疏水性肽选自环孢素、PFVYLI、VPTLQ、VPMLK、PMLKE、VPTLK、VPALR、VPALK、QLPVM、PIEVCMYREP、SDLWEMMMVSLACQY、VTWTPQAWFQWV、GSPWGLQHHPPRT、GPFHFYQFLFPPV、TSPLNIHNGQKL、PLILLRLLRGQ、KLWMRWYSPTTRRYG、RLSGMNEVLSFRWL、LALLAK、LWLWLWLWLQ、FFFLSRIF、VTVLALGALAGVGVG、AAVALLPAVLLALLAP或LSTIFGIPMALIWGIYFAIL。

其中，环孢素为由11个氨基酸组成的疏水环状多肽；PFVYLI肽由六个氨基酸组成，是α1-抗胰蛋白酶上的一小段序列，具有很强的疏水性，能够增强蛋白和荧光探针对细胞膜的穿透性；VPTLQ、VPMLK、PMLKE、VPTLK、VPALR、VPALK、QLPVM肽为疏水性五肽；VTVLALGALAGVGVG为整合素β3链中的一段疏水性片断，LSTIFGIPMALIWGIYFAIL是来源于小凹蛋白中的一段疏水性片断；PIEVCMYREP和AAVALLPAVLLALLAP是来源细胞相关生长因子的疏水性肽片断；SDLWEMMMVSLACQY、VTWTPQAWFQWV、GSPWGLQHHPPRT、GPFHFYQFLFPPV、TSPLNIHNGQKL、PLILLRLLRGQ、KLWMRWYSPTTRRYG和RLSGMNEVLSFRWL是通过噬菌体展示肽技术筛选得到的疏水性肽。以上疏水环肽修饰到脂质体表面后，脂质体与细胞膜具有很强的亲和性，通过疏水性肽的疏水作用，介导脂质体插入到细胞膜中，增加药物的细胞内输送。

本发明提供的疏水性肽修饰的长循环脂质体，构成长循环脂质体的组成材料主要包括磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的磷脂，其中，疏水性多肽可以连接在聚乙二醇末端或直接连接在磷脂上来修饰脂质体，优选为连接到聚乙二醇末端。

本发明用于制备长循环脂质体的聚乙二醇修饰的磷脂优选为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）。

本发明提供的疏水性肽修饰的长循环脂质体，组成脂质体的磷脂选自大豆磷脂（SPC），二月桂酰卵磷脂（DLPC）、二肉豆蔻酰卵磷脂（DMPC）、二棕榈酰卵磷脂（DPPC）、二硬脂酰卵磷脂（DPPC）、二硬脂酰卵磷脂（DSPC）、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂（MPPC）、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂（PMPC）、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂（PSPC）、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂（SPPC）、蛋黄卵磷脂（EPC）、氢化豆磷脂（HSPC）、二油酰基卵磷脂（DOPC）、二月桂酰磷脂酰甘油（DLPG）、二棕榈脂酰甘油（DPPG）、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）、二肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）、二棕榈酰磷脂酸（DPPA）、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸（DPPS）、脑磷脂酰丝氨酸（PS）、脑神经鞘磷脂（BSP）、二棕榈酰神经鞘磷脂（DPSP）、二硬脂酰神经鞘磷脂（DSSP）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）之一种或多种。

本发明用于制备长循环脂质体的聚乙二醇修饰的磷脂包括以上磷脂的聚乙二醇修饰物，优选为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇（DSPE-PEG）。

本发明提供的疏水性肽修饰的长循环脂质体，其包载的抗癌药物选自阿霉素、表阿霉素、顺铂、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱或羟基喜树碱。

本发明提出了一种供注射用的疏水性肽修饰修饰的载抗癌药物的长循环脂质体给药系统，其特征在于其依据的理论是药物进入细胞分为两个步骤，即从血管扩散到肿瘤组织间隙和从肿瘤间隙向细胞内转运，用疏水性肽修饰可以实现药物的细胞内转运。

本发明相对于现有产品，其有益效果主要体现在以下方面：

本发明用疏水性肽修饰长循环脂质体作为抗肿瘤药物的载体，在脂质体的被动靶向的基础上，进一步实现主动靶向，将药物递送至肿瘤细胞内，提高了抗肿瘤药物的治疗指数。

本发明与目前广泛研究的配体修饰的脂质体不同，配体修饰的脂质体是利用某些肿瘤细胞表面高表达某些受体，从而寻找其相应的配体来修饰脂质体，从而导致配体修饰的脂质体适用的肿瘤类型有限，而本发明利用疏水性肽与肿瘤细胞细胞膜的疏水相互作用，介导载体进入肿瘤细胞，几乎适用于所有的肿瘤类型。另外，本发明的疏水性多肽来源广泛，设计多元化、简单可行，可根据体内外靶向输送结果进行疏水性多肽序列的高通量筛选。

附图说明

图1导向化合物（DSPE-PEG-CsA）的质谱图

图2环孢素A修饰的长循环阿霉素脂质体的粒径图

图3同时孵育阿霉素长循环脂质体（DOX/SSL）,环孢素A修饰的阿霉素长循环脂质体（DOX/CsA-SSL）,阿霉素长循环脂质体加游离的环孢素A（DOX/SSL+CsA）后，MCF-7细胞内阿霉素的含量的流式结果图和定量图

图4同时孵育香豆素长循环脂质体（Cou/SSL）,环孢素A修饰的香豆素长循环脂质体（Cou/CsA-SSL）后，MCF-7，MCF-7Adr,Hela细胞内香豆素的含量的流式结果图（A）和定量图（B）

图5尾静脉注射包载荧光染料DiR的环孢素A修饰的长循环脂质体（DiR/CsA-SSL），长循环脂质体（DiR/SSL）后，MCF-7的荷瘤裸鼠的活体成像

图6尾静脉注射生理盐水（Control）、阿霉素溶液(Free DOX)、阿霉素长循环脂质体(SSL)、环孢素A修饰阿霉素长循环脂质体(CsA-SSL)后小鼠的肿瘤体积变化图

图7同时孵育阿霉素长循环脂质体（DOX/SSL）,PFVYLI修饰的阿霉素长循环脂质体（DOX/PFV-SSL）,游离阿霉素（Free DOX）后，MCF-7细胞内阿霉素的含量的流式结果图。

图8同时孵育阿霉素长循环脂质体（DOX/SSL）,QLPVM修饰的阿霉素长循环脂质体（DOX/QLPVM-SSL）,游离阿霉素（Free DOX）后，MCF-7细胞内阿霉素的含量的流式结果图。

具体的实施方式

以下通过实施例进一步说明和解释本发明，但不作为本发明进行的限制。

实施例1、导向化合物的合成

取一定摩尔比的DSPE-PEG-NHS和疏水性肽（PFVYLI、VPTLQ、QLPVM、VTVLALGALAGVGVG和PIEVCMYREP），以无水DMF作为溶剂，调节pH至8左右，反应，使用TLC跟踪反应，并利用HPLC定量测量未反应的配体。反应结束后，透析，冷冻干燥后，使用MALDI-TOF确证导向化合物结构，得到DSPE-PEG-PFVYLI、DSPE-PEG-VPTLQ、DSPE-PEG-QLPVM、DSPE-PEG-VTVLALGALAGVGVG和DSPE-PEG-PIEVCMYREP。

实施例2、导向化合物的合成

将环孢素A（CsA）中的双键环氧化后，与乙二胺反应得到氨基化的环孢素A。取一定摩尔比的NHS-PEG-DSPE和氨基化的环孢素A，以无水DMF作为溶剂，调节pH至8左右，反应，使用TLC跟踪反应，并利用HPLC定量测量未反应的配体。反应结束后，透析，冷冻干燥后，使用MALDI-TOF确证导向化合物结构，得到DSPE-PEG-CsA。

实施例3、包载阿霉素的环孢素A修饰的长循环脂质体

阿霉素为常用的抗肿瘤药物，作用靶点位于细胞核内，属于P-gp的底物。取卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG、DSPE-PEG-CsA（质量比：10:2.5:1.8:1），置于茄形瓶中加适量氯仿溶解。40℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加入123mM的硫酸氨溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再将所得脂质体反复挤压过0.2μm的聚碳酯膜，将制得的空白脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）缓冲液洗脱，收集脂质体部分。将脂质体在40℃水浴条件下预热片刻，加入阿霉素水溶液（2mg/ml）适量，40℃空气摇床放置20分钟，将载药脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）洗脱，去除游离药物，收集脂质体部分，即得本品。上述制得阿霉素脂质体的粒径应控制在100nm左右。

实施例4、包载阿霉素的环孢素A修饰的长循环脂质体

取卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG、DSPE-PEG-CsA（摩尔比：20:10:2:1），置于茄形瓶中加适量氯仿溶解。40℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加入123mM的硫酸氨溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再将所得脂质体反复挤压过0.2μm的聚碳酯膜，将制得的空白脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）缓冲液洗脱，收集脂质体部分。将脂质体在40℃水浴条件下预热片刻，加入阿霉素水溶液适量（阿霉素：磷脂=1:15，W/W），40℃空气摇床放置20分钟，将载药脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）洗脱，去除游离药物，收集脂质体部分，即得本品。上述制得阿霉素脂质体的粒径应控制在100nm左右，包封率在90%以上。

实施例5、包载阿霉素的环孢素A修饰的长循环脂质体

取卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG、DSPE-PEG-CsA（摩尔比：40:20:1:2），置于茄形瓶中加适量氯仿溶解。40℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加入123mM的硫酸氨溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再将所得脂质体反复挤压过0.2μm的聚碳酯膜，将制得的空白脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）缓冲液洗脱，收集脂质体部分。将脂质体在40℃水浴条件下预热片刻，加入阿霉素水溶液适量（阿霉素：磷脂=1:15，W/W），40℃空气摇床放置20分钟，将载药脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）洗脱，去除游离药物，收集脂质体部分，即得本品。上述制得阿霉素脂质体的粒径应控制在100nm左右，包封率在90%以上。

实施例6、包载顺铂的环孢素A修饰的长循环脂质体

取氢化豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG、DSPE-PEG-CsA（摩尔比：51:44:2:1），置于茄形瓶中加适量氯仿溶解。40℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加入PBS溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再将所得脂质体反复挤压过0.2μm的聚碳酯膜，制得的空白脂质体。加入适量顺铂的PBS溶液（5mg/mL），60℃，孵育1h。将载药脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）洗脱，去除游离药物，收集脂质体部分，即得本品。述制得顺铂脂质体的粒径应控制在100nm左右，包封率在90%以上。

实施例7、包载柔红霉素的环孢素A修饰的长循环脂质体

取卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG、DSPE-PEG-CsA（摩尔比：52:43:4:2），置于茄形瓶中加适量氯仿和甲醇的混合液（氯仿:甲醇=2:1,体积比）溶解。40℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加入250mM的硫酸氨溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再将所得脂质体反复挤压过0.2μm的聚碳酯膜，将制得的空白脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）缓冲液洗脱，收集脂质体部分。将脂质体在40℃水浴条件下预热片刻，加入柔红霉素水溶液适量（药物：磷脂=1:15，W/W）,40℃空气摇床放置20分钟，将载药脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）洗脱，去除游离药物，收集脂质体部分，即得本品。上述制得多柔比星脂质体的粒径应控制在100nm左右，包封率在90%以上。

实施例8、包载紫杉醇的环孢素A修饰的长循环脂质体

取二棕榈酰卵磷脂（DPPC），二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、DSPE-PEG、DSPE-PEG-CsA（摩尔比：85:9:4:2），并加入紫杉醇（药物：磷脂=1:33，摩尔比），至于茄形瓶中加适量氯仿溶解。40℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加入PBS溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再经脂质体制备仪,0.1μm聚碳酸酯膜反复挤压，得到粒径在100nm左右的环孢素A修饰的紫杉醇长循环脂质体，包封率在90%以上。

实施例9、包载多西他赛的环孢素A修饰的长循环脂质体

取卵磷脂、磷脂酰甘油、胆固醇、DSPE-PEG、DSPE-PEG-CsA（摩尔比：60:5:20:10:5），并加入多西他赛（药物：磷脂=5:95，摩尔比），至于茄形瓶中加适量氯仿溶解。40℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加入PBS溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再经脂质体制备仪,0.1μm聚碳酸酯膜反复挤压，得到粒径在100nm左右的孢素A修饰的多西他赛长循环脂质体，包封率在90%以上。

实施例10、包载香豆素的环孢素A修饰的长循环脂质体

香豆素为脂溶性的荧光探针，包载香豆素，考察疏水性肽介导脂质体进入细胞内的作用。取卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG、DSPE-PEG-CsA（质量比：10:2.5:1.8:1），适量香豆素置于茄形瓶中加适量氯仿溶解。40℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加PBS（pH7.4）缓冲液，水浴超声至出现蓝色乳光。再将所得脂质体反复挤压过0.2μm的聚碳酯膜，将制得的空白脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）缓冲液洗脱，收集脂质体部分，即得本品。上述制得香豆素脂质体的粒径应控制在100nm左右。

实施例11、包载阿霉素的PFVYLI多肽修饰的长循环脂质体

取卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-PFVYLI（20:10:1.8:0.2,摩尔比），置于茄形瓶中加适量氯仿溶解。在37℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜，继续旋蒸1h，除去残留的有机溶剂。加入123mM的硫酸氨溶液，涡旋脱膜后于水浴超声至出现蓝色乳光。再将所得脂质体反复挤压过0.2μm的聚碳酯膜，将制得的空白脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）缓冲液洗脱，收集脂质体部分。将脂质体在37℃水浴条件下预热片刻，加入阿霉素水溶液（2mg/ml）适量，37℃空气摇床放置20分钟，将载药脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）洗脱，去除游离药物，收集脂质体部分，即得本品。上述制得阿霉素脂质体的粒径应控制在100nm左右。

实施例12、包载香豆素的PFVYLI修饰的长循环脂质体

香豆素为脂溶性的荧光探针，包载香豆素，考察疏水性肽介导脂质体进入细胞内的作用。取卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG、DSPE-PEG-PFVYLI（质量比10:2:2:1），适量香豆素置于茄形瓶中加适量氯仿溶解。40℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加PBS（pH7.4）缓冲液，水浴超声至出现蓝色乳光。再将所得脂质体反复挤压过0.2μm的聚碳酯膜，将制得的空白脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）缓冲液洗脱，收集脂质体部分，即得本品。上述制得香豆素脂质体的粒径应控制在100nm左右。

实施例13、包载紫杉醇的VPTLQ修饰的长循环脂质体

分别称取处方量的各种材料（豆磷脂：胆固醇：DSPE-PEG、：DSPE-PEG-VPTLQ：紫杉醇＝35：15：2.5：1.5：1），将其溶解在氯仿和甲醇的混合溶剂中，旋转蒸发减压除去有机溶剂，再真空干燥4小时后，加入PBS缓冲盐水化薄膜，探头超声处理10min左右，至溶液充分分散形成稳定体系，即得包载紫杉醇的VPTLQ修饰的长循环脂质体。

实施例14、包载阿霉素的QLPVM多肽修饰的长循环脂质体

取卵磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-QLPVM（20:10:0.75:0.75,摩尔比），置于茄形瓶中加适量氯仿溶解。在37℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜，继续旋蒸1h，除去残留的有机溶剂。加入123mM的硫酸铵溶液，涡旋脱膜后于水浴超声至出现蓝色乳光。再将所得脂质体反复挤压过0.2μm的聚碳酯膜，将制得的空白脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）缓冲液洗脱，收集脂质体部分。将脂质体在37℃水浴条件下预热片刻，加入阿霉素水溶液（2mg/ml）适量，37℃空气摇床放置20分钟，将载药脂质体过Sephadex柱，用PBS（pH7.4）洗脱，去除游离药物，收集脂质体部分，即得本品。上述制得阿霉素脂质体的粒径应控制在100nm左右。

实施例15、包载阿霉素的环孢素A修饰的长循环脂质体体外细胞摄取

本发明利用环孢素A的插膜作用增加细胞对阿霉素长循环脂质体的摄取，同时通过环孢素A对P-gp的抑制作用减少已进入细胞内的阿霉素的外排，从而从整体上增加给药后阿霉素在细胞内的浓度。为此，有必要对其细胞摄取进行考察。以下是使用流式细胞仪对环孢素A修饰的阿霉素长循环脂质体体外细胞摄取的考察。选取人乳腺癌细胞（MCF-7），试验测得其表达P-gp的细胞占总细胞数的25%。将该细胞悬液接种于12孔板中，37℃，培养24h后，细胞均匀贴壁生长至细胞密度达到80%。在无血清培养基中加入预先制备阿霉素长循环脂质体（DOX/SSL）,环孢素A修饰的阿霉素长循环脂质体（DOX/CsA-SSL）,阿霉素长循环脂质体加游离的环孢素A（DOX/SSL+CsA）。置37℃培养箱中孵育3h后，用流式细胞仪测定细胞内DOX荧光强度。

试验结果：流式细胞分析数据见图3。

试验结果表明，加入游离环孢素A可显著增加细胞内DOX的量。证明游离环孢素A可以抑制P-gp对DOX的外排；经环孢素A修饰的长循环脂质体与未经修饰的长循环脂质体，和直接加入游离环孢素A的长循环脂质体相比，细胞内DOX的量均显著增加，证明环孢素A修饰的长循环脂质体可以发挥增加脂质体摄取和减少DOX外排的双重作用。

实施例16、包载香豆素的环孢素A修饰的长循环脂质体体外细胞摄取

本发明利用环孢素A的插膜作用增加所修饰的长循环脂质体的细胞摄取，可以用于非P-gp底物类抗肿瘤药物的递送。香豆素（Cou）为常用的脂溶性荧光探针，为非P-gp底物，用于研究非底物类药物的摄取情况。以下是使用流式细胞仪对环孢素A修饰的香豆素长循环脂质体体外细胞摄取的考察。选取P-gp高，中，低表达的三种细胞：人乳腺癌耐药细胞MCF-7Adr，人乳腺癌细胞（MCF-7），人宫颈癌细胞(Hela)，将细胞悬液接种于12孔板中，37℃培养24h。待细胞均匀贴壁生长至密度达到80%以上时，给予用无血清培养基配置的制剂：包载香豆素的环孢素A修饰的长循环脂质体（Cou/CsA-SSL），包载香豆素的长循环脂质体（Cou/SSL）。置37℃培养箱中孵育3h后，用流式细胞仪测定细胞内Cou荧光强度。

试验结果：流式细胞分析数据见附图4。

试验结果表明，在三种细胞中，Cou/CsA-SSL的摄取均显著高于Cou/SSL。证明环孢素A修饰可增加SSL在不同P-gp表达的细胞上的摄取量，该载体可用于非P-pg底物类抗肿瘤药物的递送。

实施例17、环孢素A修饰的长循环脂质体在荷瘤裸鼠体内的靶向性分布

由于本发明利用了环孢素A的插膜作用，增强长循环脂质体的靶向性，因此，有必要在动物体内进行靶向性的验证。活体成像试验可以实时观测载有荧光探针的脂质体在荷瘤裸鼠体内的分布。以下是已接种MCF-7的荷瘤裸鼠，尾静脉注射包载荧光染料DiR的环孢素A修饰的长循环脂质体（DiR/CsA-SSL），长循环脂质体（DiR/SSL）的实验结果（见图5）。结果表明，DiR/CsA-SSL组肿瘤靶向性强于DiR/SSL组，在48h时DiR/CsA-SSL在肿瘤组织仍然具有较强的分布。

实施例18、包载阿霉素的环孢素A修饰的长循环脂质体药效学试验

参比制剂：阿霉素长循环脂质体，阿霉素溶液

试验制剂：包载阿霉素的环孢素A修饰的长循环脂质体

试验动物：接种MCF-7的荷瘤裸鼠，体重18-22克，每组小鼠数为6只，尾静脉注射给药，每两天一次，给药单剂量为2mg/kg体重，共给药5次，考察指标为肿瘤体积。

试验结果：试验结果见附图6。

结果表明，环孢素A修饰的阿霉素长循环脂质体能够明显减小肿瘤体积，即抑制肿瘤的生长。

实施例19、包载阿霉素的PFVYLI多肽修饰的长循环脂质体体外细胞摄取

本发明利用PFVYLI多肽的插膜作用增加细胞对阿霉素长循环脂质体的摄取，从而增加给药后阿霉素在细胞内的浓度。为此，对其体外细胞摄取进行考察。以下是使用流式细胞仪对PFVYLI多肽修饰的阿霉素长循环脂质体体外细胞摄取的考察。选取人乳腺癌细胞（MCF-7），将该细胞悬液接种于12孔板中，37℃，培养24h后，细胞均匀贴壁生长至细胞密度达到80%。在无血清培养基中分别加入预先制备阿霉素长循环脂质体（DOX/SSL）,PFVYLI修饰的阿霉素长循环脂质体（DOX/PFV-SSL）,游离阿霉素（DOX）。置37℃培养箱中孵育3h后，用流式细胞仪测定细胞内DOX荧光强度。

试验结果：流式细胞分析数据见图7。

试验结果表明，经PFVYLI修饰的长循环脂质体与未经修饰的长循环脂质体，细胞内DOX的量均显著增加，证明PFVYLI修饰的长循环脂质体可以发挥增加细胞对脂质体摄取。

实施例20、包载阿霉素的QLPVM多肽修饰的长循环脂质体体外细胞摄取

本发明利用QLPVM多肽的插膜作用增加细胞对阿霉素长循环脂质体的摄取，从而增加给药后阿霉素在细胞内的浓度。为此，对其体外细胞摄取进行考察。以下是使用流式细胞仪对QLPVM多肽修饰的阿霉素长循环脂质体体外细胞摄取的考察。选取人乳腺癌细胞（MCF-7），将该细胞悬液接种于12孔板中，37℃，培养24h后，细胞均匀贴壁生长至细胞密度达到80%。在无血清培养基中加入预先制备阿霉素长循环脂质体（DOX/SSL）,QLPVM修饰的阿霉素长循环脂质体（DOX/QLPVM-SSL）,游离阿霉素（DOX）。置37℃培养箱中孵育3h后，用流式细胞仪测定细胞内DOX荧光强度。

试验结果：流式细胞分析数据见图8。

试验结果表明，经QLPVM修饰的长循环脂质体与未经修饰的长循环脂质体相比，细胞内DOX的量显著增加，证明QLPVM修饰的长循环脂质体可以发挥增加细胞对脂质体摄取的作用。

以上实验中，本发明仅仅是事例性的选取部分实施例中制备的脂质体作为实验用药，需要说明的是，本发明的其它疏水性肽修饰的脂质体也具有相同或相近的有益效果。另外，如果用含有本发明所述的疏水性多肽片断的多肽修饰到脂质体表面后，脂质体与细胞之间的相互作用仍然是通过多肽中的疏水性片断介导的，因此，用含有本发明所述的疏水性多肽片断的多肽修饰的脂质体也将在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种供注射用的载抗癌药物的长循环脂质体，其特征在于，脂质体表面用疏水性肽修饰。

2.如权利要求1所述的长循环脂质体，其特征在于，其中所述疏水性肽可以是疏水性的线性肽或疏水性的环肽。

3.如权利要求1所述的长循环脂质体，其特征在于，其中所述疏水性肽的序列中包括一种或多种疏水性氨基酸的残基，其中，疏水性氨基酸选自：酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)或丙氨酸(A)。

4.如权利要求1所述的长循环脂质体，其特征在于，其中所述疏水性肽的序列中至少包含2个疏水性氨基酸残基，其中，疏水性氨基酸选自：酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)、脯氨酸(P)或丙氨酸(A)。

5.如权利要求1-4中任何一项所述的长循环脂质体，其特征在于，其中所述疏水性肽选自环孢素、PFVYLI、VPTLQ、VPMLK、PMLKE、VPTLK、VPALR、VPALK、QLPVM、PIEVCMYREP、SDLWEMMMVSLACQY、VTWTPQAWFQWV、GSPWGLQHHPPRT、GPFHFYQFLFPPV、TSPLNIHNGQKL、PLILLRLLRGQ、KLWMRWYSPTTRRYG、RLSGMNEVLSFRWL、LALLAK、LWLWLWLWLQ、FFFLSRIF、VTVLALGALAGVGVG、AAVALLPAVLLALLAP或LSTIFGIPMALIWGIYFAIL。

6.如权利要求1所述的长循环脂质体，其特征在于，构成长循环脂质体的材料包括磷脂、胆固醇和聚乙二醇修饰的磷脂，其中，疏水性多肽可以连接在聚乙二醇末端或直接连接在磷脂上来修饰脂质体，优选为连接到聚乙二醇末端。

7.如权利要求6所述的长循环脂质体，其特征在于，其中所述磷脂选自大豆磷脂（SPC），二月桂酰卵磷脂（DLPC）、二肉豆蔻酰卵磷脂（DMPC）、二棕榈酰卵磷脂（DPPC）、二硬脂酰卵磷脂（DPPC）、二硬脂酰卵磷脂（DSPC）、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂（MPPC）、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂（PMPC）、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂（PSPC）、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂（SPPC）、蛋黄卵磷脂（EPC）、氢化豆磷脂（HSPC）、二油酰基卵磷脂（DOPC）、二月桂酰磷脂酰甘油（DLPG）、二棕榈脂酰甘油（DPPG）、二硬脂酰磷脂酰甘油（DSPG）、二油酰磷脂酰甘油（DOPG）、二肉豆蔻酰磷脂酸（DMPA）、二棕榈酰磷脂酸（DPPA）、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DMPE）、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（DPPE）、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸（DPPS）、脑磷脂酰丝氨酸（PS）、脑神经鞘磷脂（BSP）、二棕榈酰神经鞘磷脂（DPSP）、二硬脂酰神经鞘磷脂（DSSP）、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）之一种或多种。

8.如权利要求1所述的载抗癌药物的长循环脂质体，其特征在于，所述抗癌药物选自阿霉素、表阿霉素、顺铂、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱或羟基喜树碱。