CN112957329B - 一种共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种共载盐酸阿霉素‑佛司可林的纳米脂质体及其制备方法和应用。所述共载盐酸阿霉素‑佛司可林的纳米脂质体，包括活性药物成分和脂质材料，所述活性药物成分为盐酸阿霉素和佛司可林。所述的纳米脂质体通过共载化疗药物—盐酸阿霉素和佛司可林，降低了盐酸阿霉素与佛司可林毒副作用的同时杀伤肿瘤细胞和肿瘤干细胞。所述的纳米脂质体与单载盐酸阿霉素的脂质体相比，抗肿瘤效果和抗肿瘤干细胞效果均显著提高，具有很好的临床应用前景。

Description

一种共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride，DOX·HCl)是一种抗肿瘤抗生素，抗瘤效果显著，临床上主要用于治疗乳腺癌、卵巢癌等肿瘤，但由于其作用的非选择性导致临床毒副作用较大，骨髓抑制、心脏毒性、消化道反应等常见的毒副作用，其中心脏毒性为限制性毒性。为了解决化疗药物的毒副作用，科学家们展开大量的研究，其中纳米药物由于其特殊的纳米尺度，能够通过enhanced permeability and retention effect(EPR效应)，富集于肿瘤组织减少在正常组织的分布，从而减少化疗药物的毒副作用。到目前为止，盐酸阿霉素纳米脂质体
Figure BDA0002958912910000011
成功地应用于临床乳腺癌等肿瘤的化疗。
虽然临床的纳米药物(如
Figure BDA0002958912910000012
)与游离药物相比能够显著降低毒副作用，但是它们和游离药物一样随着时间发展会出现肿瘤复发、转移和耐药等。乳腺癌干细胞是乳腺癌化疗后复发、转移和耐药的主要原因，目前临床上使用的大多数化疗药物如紫杉醇、盐酸阿霉素、顺铂等都是针对已经分化的肿瘤细胞，其可在短时间内杀死这类细胞，使肿瘤体积减少，然而这类药物对肿瘤组织中的肿瘤干细胞效果很差，甚至基本无效。已有文献记载，将传统的抗肝癌干细胞药物盐霉素钠和抗肝癌药物阿霉素制备成共载纳米脂质体可以同时杀伤肝癌细胞和肝癌干细胞(巩志荣.靶向肝癌细胞和肝癌干细胞的共载盐霉素钠和阿霉素纳米脂质体的体内外研究[D].第二军医大学，2015)。
目前尚未见盐酸阿霉素与其它非肿瘤干细胞药物共载脂质体以提高盐酸阿霉素的抗肿瘤细胞、抗肿瘤干细胞效果的相关报道。
发明内容
针对临床上盐酸阿霉素及其制剂的不足，本发明的目的是提供一种共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体，提高盐酸阿霉素的抗肿瘤效果。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供一种共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体，包括活性药物成分和脂质材料；其中，活性药物成分为盐酸阿霉素和佛司可林。
所述盐酸阿霉素的结构式如式I所示：
Figure BDA0002958912910000021
所述佛司可林的结构式如式II所示：
Figure BDA0002958912910000022
优选地，所述盐酸阿霉素和佛司可林摩尔比为20:1～1:20。
进一步优选地，所述盐酸阿霉素和佛司可林摩尔比为3:1～1:3。
优选地，所述盐酸阿霉素与脂质材料的摩尔比为1:1～1:110。
进一步优选地，所述盐酸阿霉素与脂质材料的摩尔比为1:1～1:40。
进一步优选地，所述盐酸阿霉素与脂质材料的摩尔比为1:1～1:5。
优选地，所述脂质材料为磷脂、聚乙二醇磷脂中的一种或两种。
优选地，所述脂质材料为磷脂和聚乙二醇磷脂。
进一步优选地，所述脂质材料中磷脂、聚乙二醇磷脂的摩尔比为100:3～5:1。
优选地于，所述聚乙二醇磷脂为靶头修饰的聚乙二醇磷脂或靶头修饰的聚乙二醇磷脂与聚乙二醇磷脂的共混物。
进一步优选地，所述共混物中靶头修饰的聚乙二醇磷脂与聚乙二醇磷脂的摩尔比为1:1。
优选地，所述磷脂、聚乙二醇磷脂中的磷脂选自卵磷脂、大豆磷脂、鞘磷脂、氢化大豆磷脂(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、琥珀酸胆固醇酯(CHEMS)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)中的一种或多种。
优选地，所述靶头修饰的聚乙二醇磷脂中的靶头选自叶酸、生物素、多肽、透明质酸、寡糖、单抗、核酸适配体。
优选地，所述纳米脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、非小细胞肺癌。
本发明还提供一种共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的制备方法，包括如下步骤：
S1.将磷脂、聚乙二醇磷脂和/或靶头修饰的聚乙二醇磷脂与佛司可林加入反应容器，加入溶剂溶解；
S2.将步骤S1的溶液减压蒸干溶剂，形成薄膜，再加入缓冲液，水化薄膜；然后反复挤出；
S3.将步骤S2反复挤出后的脂质体溶液置于PBS溶液中透析，加入盐酸阿霉素溶液，孵育，透析除去未包裹的盐酸阿霉素，即得共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体或靶头修饰的共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体。
在上述步骤S1中，当采用磷脂、聚乙二醇磷脂与佛司可林反应时可制备得到共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体；当采用磷脂、聚乙二醇磷脂与靶头修饰的聚乙二醇磷脂共混物与佛司可林反应时可制备得到靶头修饰的共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体；进一步地，当采用磷脂、靶头修饰的聚乙二醇磷脂与佛司可林反应时也可制备得到靶头修饰的共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体。
优选地，步骤S1中所述溶剂为氯仿、乙醇混合溶液，V氯仿：V乙醇为7:3。
优选地，步骤S2中所述减压蒸干是利用旋转蒸发仪，37℃下进行。
优选地，步骤S2中所述缓冲液为pH为5.4的250mM(NH4)2SO4缓冲液。
优选地，步骤S2中所述水化是在65℃下进行。
优选地，步骤S2中所述反复挤出是利用微型脂质体挤出仪，反复挤出10次。
优选地，步骤S3中所述PBS溶液pH为7.4。
优选地，步骤S3中所述透析为透析过夜。
优选地，步骤S3中所述盐酸阿霉素溶液浓度为1mg/mL。
优选地，步骤S3中所述孵育条件为温度37℃，时间4h。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体，所述纳米脂质体具有抗肿瘤干细胞的效果，其对于4T乳腺癌细胞干细胞的抑制率可达80.20％，对SKOV3卵巢癌干细胞抑制率可达78.82％；而经过靶头修饰的共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体抗肿瘤干细胞的效果更高，其对于4T乳腺癌细胞干细胞的抑制率可达91.46％，对SKOV3卵巢癌干细胞抑制率可达87.78％；而盐酸阿霉素脂质体对4T乳腺癌细胞干细胞的抑制率为50.23％，对SKOV3卵巢癌干细胞抑制率为33.78％；与盐酸阿霉素脂质体相比，共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体及靶头修饰的共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体抗肿瘤效果，明显增加。
附图说明
图1为纳米脂质体体外抗4T1乳腺癌细胞的效果。
图2为纳米脂质体体外抗4T1乳腺癌干细胞株效果。
图3为纳米脂质体体外抗SKOV3卵巢癌细胞的效果。
图4为纳米脂质体体外抗SKOV3卵巢癌干细胞的效果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
原料来源：
二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，货号：D130424；公司：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，货号：R-1028-2K；公司：西安凯新生物科技有限公司；
盐酸阿霉素，货号：HF190916；公司：北京华奉联博科技有限公司；
佛司可林，货号：F127328；公司：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
DSPE-PEG2000-Mal，货号：R-0039-2k；公司：西安凯新生物科技有限公司；
神经肽类似物(PNBL-NPY)，货号：INBRN-2020年9月；公司：苏州强耀生物科技有限公司。
实施例1共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建和表征
1.共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建
将20mg DPPC加入100ml的圆底烧瓶中，然后按DPPC、DSPE-PEG2000和佛司可林按摩尔比为10:0.3:0.1加入DSPE-PEG2000和佛司可林，然后加入50ml的氯仿、乙醇混合溶液(V氯仿：V乙醇＝7:3)，使完全溶解。采用旋转蒸发仪在37℃下减压蒸干溶剂，形成薄膜，然后加入50ml的250mM(NH4)2SO4缓冲液(pH 5.4)在65℃水化薄膜，采用微型脂质体挤出仪使脂质体溶液反复挤出10次。于PBS(pH7.4)溶液中透析过夜，加入与佛司可林摩尔比为1:1的盐酸阿霉素溶液(1mg/mL)，37℃孵育4h，透析过夜除去未包裹的盐酸阿霉素，即得共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体：(DOX·HCl+FSK)LP-1。按照上述方法，不添加佛司可林，可制备得盐酸阿霉素脂质体DOX·HCl LP。
2.共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体的表征
共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体水合直径和直径分布采用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering，DLS)进行测定。测定结果表明：(DOX·HCl+FSK)LP纳米脂质体的粒径为320nm，PDI为0.250；DOX·HClLP-1脂质体的粒径为300nm，PDI为0.221。
实施例2共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建和表征
1.共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建
将20mg DPPC加入100ml的圆底烧瓶中，然后按DPPC、DSPE-PEG2000和佛司可林按摩尔比为10:1:2加入DSPE-PEG2000和佛司可林，然后加入50ml的氯仿、乙醇混合溶液(V氯仿：V乙醇＝7:3)，使完全溶解。采用旋转蒸发仪在37℃下减压蒸干溶剂，形成薄膜，然后加入50ml的250mM(NH4)2SO4缓冲液(pH 5.4)在65℃水化薄膜，采用微型脂质体挤出仪使脂质体溶液反复挤出10次。于PBS(pH7.4)溶液中透析过夜，加入与佛司可林摩尔比为1:1的盐酸阿霉素溶液(1mg/mL)，37℃孵育4h，透析过夜除去未包裹的盐酸阿霉素，即得共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体：(DOX·HCl+FSK)LP-2。
2.共盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体的表征
共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体水合直径和直径分布采用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering，DLS)进行测定。测定结果表明：(DOX·HCl+FSK)LP-2纳米脂质体的粒径为350nm，PDI为0.220。
实施例3共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建和表征
1.共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建
将20mg DPPC加入100ml的圆底烧瓶中，然后按DPPC、DSPE-PEG2000和佛司可林按摩尔比为10:0.3:1加入DSPE-PEG2000和佛司可林，然后加入50ml的氯仿、乙醇混合溶液(V氯仿：V乙醇＝7:3)，使完全溶解。采用旋转蒸发仪在37℃下减压蒸干溶剂，形成薄膜，然后加入50ml的250mM(NH4)2SO4缓冲液(pH 5.4)在65℃水化薄膜，采用微型脂质体挤出仪使脂质体溶液反复挤出10次。于PBS(pH7.4)溶液中透析过夜，加入与佛司可林摩尔比为1:3的盐酸阿霉素溶液(1mg/mL)，37℃孵育4h，透析过夜除去未包裹的盐酸阿霉素，即得共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体：(DOX·HCl+FSK)LP-3。
2.共盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体的表征
共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体水合直径和直径分布采用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering，DLS)进行测定。测定结果表明：(DOX·HCl+FSK)LP-3纳米脂质体的粒径为330nm，PDI为0.140。
实施例4共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建和表征
1.共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建
将20mg DPPC加入100ml的圆底烧瓶中，然后按DPPC、DSPE-PEG2000和佛司可林按摩尔比为10:2:1加入DSPE-PEG2000和佛司可林，然后加入50ml的氯仿、乙醇混合溶液(V氯仿：V乙醇＝7:3)，使完全溶解。采用旋转蒸发仪在37℃下减压蒸干溶剂，形成薄膜，然后加入50ml的250mM(NH4)2SO4缓冲液(pH 5.4)在65℃水化薄膜，采用微型脂质体挤出仪使脂质体溶液反复挤出10次。于PBS(pH7.4)溶液中透析过夜，加入与佛司可林摩尔比为3:1的盐酸阿霉素溶液(1mg/mL)，37℃孵育4h，透析过夜除去未包裹的盐酸阿霉素，即得共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体：(DOX·HCl+FSK)LP-4。
2.共盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体的表征
共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体水合直径和直径分布采用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering，DLS)进行测定。测定结果表明：(DOX·HCl+FSK)LP-4纳米脂质体的粒径为280nm，PDI为0.221。
实施例5共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建和表征
1.共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建
将20mg DPPC加入100ml的圆底烧瓶中，然后按DPPC、DSPE-PEG2000和佛司可林按摩尔比为10:2:1加入DSPE-PEG2000和佛司可林，然后加入50ml的氯仿、乙醇混合溶液(V氯仿：V乙醇＝7:3)，使完全溶解。采用旋转蒸发仪在37℃下减压蒸干溶剂，形成薄膜，然后加入50ml的250mM(NH4)2SO4缓冲液(pH 5.4)在65℃水化薄膜，采用微型脂质体挤出仪使脂质体溶液反复挤出10次。于PBS(pH7.4)溶液中透析过夜，加入与佛司可林摩尔比为20:1的盐酸阿霉素溶液(1mg/mL)，37℃孵育4h，透析过夜除去未包裹的盐酸阿霉素，即得共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体：(DOX·HCl+FSK)LP-5。
2.共盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体的表征
共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体水合直径和直径分布采用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering，DLS)进行测定。测定结果表明：(DOX·HCl+FSK)LP-5纳米脂质体的粒径为250nm，PDI为0.241。
实施例6共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建和表征
1.共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建
将20mg DPPC加入100ml的圆底烧瓶中，然后按DPPC、DSPE-PEG2000和佛司可林按摩尔比为10:2:1加入DSPE-PEG2000和佛司可林，然后加入50ml的氯仿、乙醇混合溶液(V氯仿：V乙醇＝7:3)，使完全溶解。采用旋转蒸发仪在37℃下减压蒸干溶剂，形成薄膜，然后加入50ml的250mM(NH4)2SO4缓冲液(pH 5.4)在65℃水化薄膜，采用微型脂质体挤出仪使脂质体溶液反复挤出10次。于PBS(pH7.4)溶液中透析过夜，加入与佛司可林摩尔比为1:20的盐酸阿霉素溶液(1mg/mL)，37℃孵育4h，透析过夜除去未包裹的盐酸阿霉素，即得共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体：(DOX·HCl+FSK)LP-6。
2.共盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体的表征
共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体水合直径和直径分布采用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering，DLS)进行测定。测定结果表明：(DOX·HCl+FSK)LP-6纳米脂质体的粒径为230nm，PDI为0.262。
实施例7神经肽Y类似物修饰、共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建和表征
1.神经肽类似物(PNBL-NPY)修饰的DSPE-PEG2000合成
末端为马来酰亚胺的DSPE-PEG2000(即DSPE-PEG2000-Mal)和PNBL-NPY按1:2的摩尔比，溶解于无水DMF中，采用N-甲基吗啉调节pH至7.0，室温下搅拌反应24h，透析48小时，冻干即得产物，神经肽类似物(PNBL-NPY)修饰的DSPE-PEG2000，即DSPE-PEG2000-PBL-NPY。
本例中所采用神经肽类似物(PNBL-NPY)的氨基酸系列为INP-(Nle)-(Bpa)-RLRYC-NH2。
2.神经肽类似物修饰、共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的构建
将20mg DPPC加入100ml的圆底烧瓶中，然后按DPPC、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-PBL-NPY和佛司可林按摩尔比为10:0.15:0.15:0.1加入DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-PBL-NPY和佛司可林，然后加入50ml的氯仿、乙醇混合溶液(V氯仿：V乙醇＝7:3)，使完全溶解。采用旋转蒸发仪在37℃下，减压蒸干溶剂，形成薄膜，然后加入50ml的250mM(NH4)2SO4缓冲液(pH 5.4)在65℃水化薄膜，采用微型脂质体挤出仪使脂质体溶液反复挤出10次。于PBS(pH7.4)溶液中透析过夜，加入与佛司可林摩尔比为1:1的盐酸阿霉素溶液(1mg/mL)，37℃孵育4h，透析过夜除去未包裹的盐酸阿霉素，即得神经肽类似物修饰、共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体：PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP。
3.神经肽类似物修饰、共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体的表征
神经肽类似物修饰、共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体水合直径和直径分布采用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering，DLS)进行测定。测定结果表明：纳米递药系统的粒径为380nm，PDI为0.260。
实施例8纳米脂质体抗乳腺癌细胞体外效果评价
将处于对数生长期的4T1细胞株以5×103个/孔的细胞密度植于96孔板中，待细胞24h贴壁后，分别加入终浓度按DOX·HCl为0.015μg/mL，0.075μg/mL，0.15μg/mL，0.75μg/mL，1.5μg/mL，7.5μg/mL的盐酸阿霉素DOX·HCl、实施例1共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体(DOX·HCl+FSK)LP和盐酸阿霉素脂质体DOX·HCl LP、实施例5神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]。空白对照组加入等体积的DMEM培养基。药物处理72h后，每孔200μL培养基加入40μL 5mg/mL的MTT试剂，于培养箱继续培养4h，用注射器轻轻吸取上清液，每孔加入100μL DMSO，震荡溶解甲臢，在酶标仪上波长为490nm处检测各孔吸光值，根据吸光度值计算细胞生长抑制率，结果见图1。由结果可知：当盐酸阿霉素的浓度为7.5μg/mL时盐酸阿霉素DOX·HCl、盐酸阿霉素脂质体DOX·HClLP、共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[(DOX·HCl+FSK)LP]、神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]抑制率分别为：59.81％、61.61％、83.56％、93.56％；共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体(DOX·HCl+FSK)LP抗4T1乳腺癌细胞的效果强于盐酸阿霉素脂质体DOX·HCl LP，神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]抗4T1乳腺癌细胞的效果最强。
实施例9纳米脂质体抗乳腺癌干细胞体外效果评价
首先通过悬浮球培养法，获得4T1乳腺癌干细胞。然后采用CCK-8法评价各纳米脂质体体外抗乳腺癌干细胞的效果。取对数生长期细胞，以5×104/ml细胞数接种于96孔板，每孔100μl，细胞生长24h后，分别加入终浓度按DOX·HCl为0.015μg/mL，0.075μg/mL，0.15μg/mL，0.75μg/mL，1.5μg/mL，7.5μg/mL的盐酸阿霉素DOX·HCl、实施例1共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体(DOX·HCl+FSK)LP和盐酸阿霉素脂质体DOX·HCl LP、实施例5神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]。空白对照组只加培养基，处理72h，小心吸取孔内液体，加入CCK-8:培养基为1:9的液体100μl，置于37℃培养箱中孵育2h。活细胞能够用酶标仪在450nm处测出其光密度值[D(450)值]，根据吸光度值计算细胞生长抑制率，结果见图2。由结果可知：当盐酸阿霉素的浓度为7.5μg/mL时盐酸阿霉素DOX·HCl、盐酸阿霉素脂质体DOX·HClLP、共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[(DOX·HCl+FSK)LP]、神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]抑制率分别为：40.68％、50.23％、80.2％、91.46％；共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体(DOX·HCl+FSK)LP抗4T1乳腺癌干细胞的效果强于盐酸阿霉素脂质体DOX·HCl LP，神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]抗4T1乳腺癌干细胞的效果最强。
实施例10纳米脂质体抗卵巢癌细胞效果评价
将处于对数生长期的SKOV3卵巢癌细胞株以5×103个/孔的细胞密度植于96孔板中，孵育过夜，分别加入终浓度按DOX·HCl为0.015μg/mL，0.075μg/mL，0.15μg/mL，0.75μg/mL，1.5μg/mL，7.5μg/mL的盐酸阿霉素DOX·HCl、实施例1共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体(DOX·HCl+FSK)LP和盐酸阿霉素脂质体DOX·HCl LP、实施例5神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]。空白对照组加入等体积的培养基。药物处理72h后，每孔200μL培养基加入40μL 5mg/mL的MTT试剂，于培养箱继续培养4h，用注射器轻轻吸取上清液，每孔加入100μL DMSO，震荡溶解甲臢，在酶标仪上波长为490nm处检测各孔吸光值，根据吸光度值计算细胞生长抑制率，结果见图3。由结果可知：当盐酸阿霉素的浓度为7.5μg/mL时盐酸阿霉素DOX·HCl、盐酸阿霉素脂质体DOX·HClLP、共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[(DOX·HCl+FSK)LP]、神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]抑制率分别为：50.23％、56.42％、79.12％、89.12％；共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体(DOX·HCl+FSK)LP抗SKOV3卵巢癌细胞的效果强于盐酸阿霉素脂质体DOX·HCl LP，神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]抗SKOV3卵巢癌细胞的效果最强。
实施例11纳米脂质体抗卵巢癌干细胞效果评价
首先通过悬浮球培养法，获得SKOV3卵巢癌干细胞。然后采用CCK-8法评价各纳米脂质体体外抗卵巢癌干细胞的效果。取对数生长期细胞，以5×104/ml细胞数接种于96孔板，每孔100μl，细胞生长24h后，分别加入终浓度按DOX·HCl为0.015μg/mL，0.075μg/mL，0.15μg/mL，0.75μg/mL，1.5μg/mL，7.5μg/mL的盐酸阿霉素DOX·HCl、实施例1共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体(DOX·HCl+FSK)LP和盐酸阿霉素脂质体DOX·HClLP、实施例5神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]。空白对照组只加培养基，处理72h，小心吸取孔内液体，加入CCK-8:培养基为1:9的液体100μl，置于37℃培养箱中孵育2h。活细胞能够用酶标仪在450nm处测出其光密度值[D(450)值]，根据吸光度值计算细胞生长抑制率，结果见图4。由结果可知：当盐酸阿霉素的浓度为7.5μg/mL时盐酸阿霉素DOX·HCl、盐酸阿霉素脂质体DOX·HClLP、共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[(DOX·HCl+FSK)LP]、神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]抑制率分别为：20.24％、33.78％、78.82％、87.78％；共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体(DOX·HCl+FSK)LP抗SKOV3卵巢癌干细胞的效果强于盐酸阿霉素脂质体DOX·HClLP，神经肽类似物修饰共载盐酸阿霉素-佛司可林纳米脂质体[PNBL-NPY-(DOX·HCl+FSK)LP]抗SKOV3卵巢癌干细胞的效果最强。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体包括活性药物成分和脂质材料，所述活性药物成分为盐酸阿霉素和佛司可林；所述抗肿瘤药物为抗肿瘤干细胞药物；所述肿瘤包括乳腺癌或卵巢癌。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述盐酸阿霉素和佛司可林摩尔比为20:1～1:20。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述盐酸阿霉素与脂质材料的摩尔比为1:1～1:110。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述脂质材料为磷脂、聚乙二醇磷脂中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述聚乙二醇磷脂为靶头修饰的聚乙二醇磷脂或靶头修饰的聚乙二醇磷脂与聚乙二醇磷脂的共混物。
6.根据权利要求4或5任一所述应用，其特征在于，所述磷脂、聚乙二醇磷脂中的磷脂选自卵磷脂、大豆磷脂、鞘磷脂、氢化大豆磷脂(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、琥珀酸胆固醇酯(CHEMS)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述靶头修饰的聚乙二醇磷脂中的靶头选自叶酸、生物素、多肽、透明质酸、寡糖、单抗、核酸适配体。
8.权利要求1～5或7任一所述应用中共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将磷脂、聚乙二醇磷脂和/或靶头修饰的聚乙二醇磷脂与佛司可林加入反应容器，加入溶剂溶解；
S2.将步骤S1的溶液减压蒸干溶剂，形成薄膜，再加入缓冲液，水化薄膜；然后反复挤出；
S3.将步骤S2反复挤出后的脂质体溶液置于PBS溶液中透析，加入盐酸阿霉素溶液，孵育，透析除去未包裹的盐酸阿霉素，即得共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体或靶头修饰的共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体。
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