CN111388493B - 治疗癌症的药物组合物、药物制剂及其应用和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗癌症的药物组合物、药物制剂及其应用和制备方法,所述药物组合物包括:伊立替康和小檗碱。所述药物组合的纳米脂质体制剂中,伊利替康和小檗碱的质量比为1‑10:1–10;伊利替康与磷脂的质量比为1:5–15;磷脂与胆固醇的质量比为1‑10:1。本发明所提供的药物制剂为共载脂质体,其包封率高,载药量高,能够同步递送两种药物,确保药物到达肿瘤部位时仍能保持协同比例。本发明在癌症的治疗方面具有良好的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及一种治疗癌症的药物组合物、药物制剂及其应用和制备方法。
背景技术
脂质体作为药物载体已经被用于多种疾病的治疗,尤其是在癌症的治疗中展现出明显的优越性。将抗癌药物包封在脂质体中,能够显著改善药物在体内的代谢动力学行为,提高药物在肿瘤组织的蓄积量,降低药物的毒副作用,提高治疗效果。
伊利替康(IRI)是一种拓扑异构酶I抑制剂,可用于肺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌和胰腺癌等多种实体瘤的治疗。但IRI具有严重的毒副作用(如骨髓抑制和胃肠道毒性等),限制了其在临床上的应用。将伊利替康高度封装在纳米脂质体中可以保护其向癌症部位的递送,减少系统性泄漏降低毒性。Onivyde(伊立替康脂质体)已于2015年获准与5-FU/LV联合应用用于吉西他滨单药治疗失败的转移性PDAC患者,总体生存期约为2个月。但美国食品药品监督管理局(FDA)对Onivyde发出了“黑匣子”安全警告,因为其会引发威胁生命的中性粒细胞减少(3-4%,27%)和腹泻(-3-4、13%)等症状。
为了进一步提高IRI的治疗效果,联合给药的策略得到了广泛的关注。联合给药是指采用两种或多种具有不同作用部位或作用机制的药物同时或先后应用的给药策略,其结果可实现增加药物疗效并减轻毒副作用的目的。
研究发现某些中药提取物可以改善各种化疗药物的抗肿瘤效果。小檗碱(BER)是从传统植物黄连中提取的异喹啉类生物碱,具有多种药理作用,例如抑菌、降血糖、抗炎和抗腹泻等。有报道称,BER可以通过氧化应激途径抑制β-葡萄糖醛酸酶的活性来改善IRI治疗引起的肠道毒性(包括延迟性腹泻和肠道粘膜炎)。此外,BER还是一种拓扑异构酶II的抑制剂,可干扰拓扑异构酶介导的DNA剪接复合物的形成,影响DNA的自主复制过程,从而诱导肿瘤细胞凋亡。BER对多种肿瘤细胞如肝癌细胞、胰腺癌细胞、白血病细胞和乳腺癌细胞均展现出了明显的活性抑制作用。
多项研究已证实,拓扑异构酶I抑制剂和拓扑异构酶II抑制剂联合应用可以产生协同作用,对多种肿瘤细胞的活性抑制效果比单独使用一种抑制剂时得到了显着改善。因此,选择BER与IRI联合给药,能在提高疗效的同时,降低IRI引发的肠道毒性。
然而静脉注射或滴注小檗碱溶液剂会引起血管扩张、血压下降、心脏抑制等反应,动物实验也表明静脉给药小檗碱溶液剂会导致动物迅速死亡。而且,许多文献报道如果两种药物的体内药动学行为不一致,体内给药后,两种药物并不会以最优协同比例在体内循环,从而不会达到最佳治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗癌症的药物组合物,以及其制成的纳米脂质体制剂,并在癌症治疗中进行应用,药物能够向肿瘤组织同步递送,提高抗肿瘤效果,降低毒副作用。
本发明是通过如下技术方案实现的:
一种治疗癌症的药物组合物,包括伊立替康和中药提取物,所述中药提取物为葛根素、甘草素、小檗碱、黄芩苷中的一种或多种,所述伊立替康与所述中药提取物的质量比为1-10:1-10。
优选的,所述中药提取物为小檗碱,所述伊利替康与所述小檗碱的质量比为1-10:1-5。
本发明还提供一种药物制剂,包括磷脂、胆固醇和如上述的药物组合物,所述磷脂与所述胆固醇的质量比为1-10:1,优选为2-5:1;所述伊利替康与所述磷脂的质量比为1:5-15,优选为1:5-10;所述药物制剂的剂型为固体制剂、液体制剂、半固体制剂中的一种或多种,优选所述药物组合物的剂型为纳米脂质体制剂。
优选的,所述磷脂为天然磷脂或合成磷脂中一种或两种组合;所述天然磷脂为蛋黄卵磷(EPC)或氢化大豆卵磷脂(HSPC);所述合成磷脂为二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油和甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG2000-DSPE)中的一种或多种。
优选的,所述磷脂为氢化大豆卵磷(HSPC)和甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG2000-DSPE)的组合,所述氢化大豆卵磷脂(HSPC)和所述甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG2000-DSPE)的质量比为50-150:1,优选为100-150:1。
本发明制备上述所述药物制剂的方法,包括以下步骤:
步骤(1)将磷脂和胆固醇溶解在有机溶剂溶剂中,除去有机溶剂,得到膜材;所述磷脂包括氢化大豆卵磷脂和甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;
步骤(2)将梯度物质加入到步骤(1)所得的膜材中,水化,挤出制备单室脂质体;
步骤(3)通过透析、柱层析或超滤等手段,采用缓冲液除去上述单室脂质体外水相中的梯度物质,得到梯度空白脂质体;
步骤(4)将伊利替康和小檗碱分别配置成一定浓度的溶液,采用次序载药的方式,先将伊利替康溶液加入到空白脂质体中,在50-70℃的水浴中孵育30-60min,然后使用pH调节剂调节pH为7.0-9.0,最后加入小檗碱溶液,在50-70℃的水浴中孵育30-60min,冰水浴冷却,得到伊利替康和小檗碱共载脂质体。
优选的,所述步骤(2)中所述的梯度物质为硫酸铵溶液、蔗糖八硫酸酯三乙胺盐溶液、枸橼酸盐溶液、磺丁基醚环糊精盐溶液中的一种或多种,所述梯度物质的浓度为100mM-650mM;
所述步骤(3)中所述的缓冲液为生理盐水、等渗蔗糖、组氨酸、羟乙基哌嗪-乙基磺酸盐(HEPES)、柠檬酸盐、酒石酸盐、磷酸盐及其他药学上可接受的缓冲物质,所述缓冲液pH为5.0-7.0。
本发明还提供了一种上述药物组合物在治疗结直肠癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌或胰腺癌中应用。
本发明还提供了一种上述药物制剂在治疗结直肠癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌或胰腺癌中应用。
本发明的有益效果如下:本发明的用于癌症治疗的药物组合物共载脂质体制剂,不仅解决了现有技术中小檗碱静脉给药的安全性问题;而且又能使得体内给药后,血液中两种药物的比例较长时间维持在产生协同作用的比例范围内,从而发挥小檗碱和伊利替康的协同抗肿瘤作用,其抗肿瘤效果明显由于市售伊利替康脂质体Onivyde,而且能进一步降低伊利替康给药引起的胃肠毒性。另外本发明制备的纳米脂质体伊利替康和小檗碱的包封率高,均达到95%以上,且粒径均一,稳定性好,制备方法工艺简单,适宜工业化大生产。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举较佳实施例,并配合所附图式,作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例13中给药48h后伊利替康和小檗碱在体内的比例变化图。
图2为本发明实施例14中药物组合物共载脂质体制剂的组织分布图。
图3为本发明实施例15中药物组合物共载脂质体制剂的药效实验中肿瘤体积变化图。
图4为本发明实施例15中药物组合物共载脂质体制剂的药效实验中裸鼠的体重变化图。
图5为本发明实施例15中药物组合物共载脂质体制剂的药效实验结束后小鼠结肠组织的HE染色病理切片结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
体外细胞毒性实验
采用MTT法(噻唑蓝)考察伊利替康和小檗碱对人源胰腺癌细胞(BxPC-3)的细胞毒性,并筛选伊利替康和小檗碱的协同比例。
实验步骤如下:用胰酶将状态良好的细胞消化下来,用新鲜培养基将细胞悬液稀释至浓度为30×104cells/mL,然后向96孔板加入100μL的细胞悬液(30×103cells/孔),于培养箱中过夜贴壁,弃去旧培养基,向各孔中加入200μL不同浓度的含药培养液,对照组加入不含药的新鲜培养液,培养24小时或48小时后,每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液继续培养4小时。取出后弃去孔内溶液并用滤纸吸干,每孔加入200μL DMSO溶解生成的蓝紫色结晶,于振荡器上振摇10min使之完全溶解,用酶标仪测定490nm波长下的吸光度值。
使用Chou-Talalay法(联合指数法或者中位药效法)计算伊利替康与小檗碱的联合指数(Combination Index,CI),考察其联合作用的特征。两药的联合指数公式为:
CIx=(D1)/(Dx)1+(D2)/(Dx)2
其中,(Dx)1和(Dx)2分别为两药单独作用于细胞产生x%抑制率时的浓度,(D1)和(D2)分别为两药联合作用于细胞产生x%抑制率时的浓度。CI=1为相加作用,CI<1为协同作用,CI>1为拮抗作用。
实验结果见表1
表1:伊利替康和小檗碱抗人缘胰腺癌BxPC-3细胞的协同增效作用
表1结果显示:伊利替康和小檗碱对BxPC-3细胞联合给药,当伊利替康与小檗碱的剂量比为1-10:1-5时,表现出良好的协同作用,当剂量比为1:8和1:10时表现出拮抗作用。
药物组合物共载脂质体制剂的制备:
实施例1:称取HSPC(150mg)、胆固醇(60mg)、DSPE-MPEG2000(1.2mg)溶解于15mL氯仿中,39℃减压蒸发成膜,真空放置12小时以去除残留溶剂。在65℃下,加入10mL600mM蔗糖八硫酸酯三乙胺盐溶液水化30min,形成多层囊泡脂质体(MLV)。然后将MLV通过0.4μm、0.2μm和0.1μm的聚碳酸酯膜逐步挤出,得到单室空白脂质体。将挤出后的脂质体样品通过用外水相(20mMHEPES+150mMNaCl)预平衡过的Sepharose CL-4B凝胶柱,即得空白脂质体混悬液;将10.6mg的伊利替康与空白脂质体在60℃孵育60min,再加入5.3mg小檗碱,孵育30min后冰水浴终止载药。得到伊利替康和小檗碱共载脂质体,所得到的脂质体伊利替康包封率为98%,小檗碱为25%。
实施例2:本实施例与实施例1相同,所不同的是:用30mM蔗糖+20mM组氨酸替换20mMHEPES+150mMNaCl,所得所得到的脂质体伊利替康包封率为90%,小檗碱为43%。
实施例3:本实施例与实施例1相同,所不同的是:用pH7.0的磷酸盐缓冲液替换20mMHEPES+150mMNaCl,所得到的脂质体伊利替康包封率为85%,小檗碱为76.4%。
实施例4:本实施例与实施例1相同。所不同的是:将10.6mg的伊利替康与空白脂质体在60℃孵育60min,使用NaOH将外水相pH调至8.0,再加入5.3mg小檗碱,孵育30min后冰水浴终止载药。得到伊利替康和小檗碱共载脂质体,所得到的脂质体伊利替康包封率为97.9%,小檗碱为85%。
实施例5:本实施例与实施例1相同,所不同的是:将10.6mg的伊利替康与空白脂质体在60℃孵育60min,使用500mM磷酸氢二钠将外水相pH调至8.5,再加入5.3mg小檗碱,孵育30min后冰水浴终止载药。得到伊利替康和小檗碱共载脂质体,所得到的脂质体伊利替康包封率为98.2%,小檗碱为95.4%。
实施例6:本实施例与实施例5相同,所不同的是:将10.6mg的伊利替康与空白脂质体在60℃孵育60min,使用600mM磷酸氢二钠将外水相pH调至8.5,再加入5.3mg小檗碱,孵育30min后冰水浴终止载药。得到伊利替康和小檗碱共载脂质体,所得到的脂质体伊利替康包封率为97.8%,小檗碱为96%。
实施例7:本实施例与实施例6相同,所不同的是:将10.6mg的伊利替康与空白脂质体在60℃孵育60min,使用800mM磷酸氢二钠将外水相pH调至8.5,再加入5.3mg小檗碱,孵育30min后冰水浴终止载药。得到伊利替康和小檗碱共载脂质体,所得到的脂质体伊利替康和小檗碱包封率无明显变化。
实施例8:本实施例与实施例7相同,所不同的是提高伊利替康和小檗碱的载药量,使得伊利替康与磷脂的药脂比为1:10.6(m/m),小檗碱与磷脂的药脂比为1:21.3(m/m)。将14.1mg的伊利替康与空白脂质体在60℃孵育60min,使用800mM磷酸氢二钠将外水相pH调至8.5,再加入7.05mg小檗碱,孵育30min后冰水浴终止载药。得到伊利替康和小檗碱共载脂质体,所得到的脂质体伊利替康包封率为99.5%,小檗碱为97.2%。
实施例9:本实施例与实施例8相同,所不同的是提高伊利替康和小檗碱的载药量,使得伊利替康与磷脂的药脂比为1:7.1(m/m),小檗碱与磷脂的药脂比为1:14.2(m/m)。将21.2mg的伊利替康与空白脂质体在60℃孵育60min,使用800mM磷酸氢二钠将外水相pH调至8.5,再加入10.6mg小檗碱,孵育30min后冰水浴终止载药。得到伊利替康和小檗碱共载脂质体,所得到的脂质体伊利替康包封率为98%,小檗碱为96.8%。
实施例10:本实施例与实施例9相同,所不同的是,提高伊利替康和小檗碱的载药量,使得伊利替康与磷脂的药脂比为1:5.7(m/m),小檗碱与磷脂的药脂比为1:11.4(m/m)。将26.4mg的伊利替康与空白脂质体在60℃孵育60min,使用800mM磷酸氢二钠将外水相pH调至8.5,再加入13.2mg小檗碱,孵育30min后冰水浴终止载药。得到伊利替康和小檗碱共载脂质体,所得到的脂质体伊利替康包封率为95.7%,小檗碱为80%。
实施例11:本实施例与实施例9相同,所不同的是,用DSPC替换HSPC,两种药物的包封率不受影响。
实施例12:本实施例与实施例9相同,所不同的是,使用250mM硫酸铵溶液代替600mM蔗糖八硫酸酯三乙胺盐溶液,所得脂质体伊利替康包封率为97%,小檗碱为95.2。
药物组合物共载脂质体制剂的体内药动学研究:
实施例13:将SD大鼠随机分为三组:(1)伊利替康和小檗碱溶液剂联合组(IRI/BER)、(2)伊利替康脂质体和小檗碱脂质体联合组(lipBER/lipIRI)、(3)药物组合物共载脂质体制剂(lipBI),每组五只。所有给药组伊利替康和小檗碱的剂量分别为4mg/kg和2mg/kg。尾部静脉注射给药后,分别于预设时间点0.08h,0.25h,0.5h,1h,2h,4h,8h,12h,24h和48h从眼眶取出0.4mL血液,将血样转移至涂有肝素的EP管中,15000rpm离心5min,取上清储存于-20℃中待测。
采用沉淀蛋白法对血浆样品中的药物进行测定,以格列齐特作为内标。使用ACQUITYUPLCTM系统和ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(50mm×2.1mm,1.7μm,Waters Corp,Milford,MA,USA)对血浆样品中的伊利替康和小檗碱进行定量分析。流动相由乙腈(A)和含有0.1%甲酸的水溶液(B)组成,流速为0.2mL/min。洗脱梯度为0min 20%A,0.5min80%A,1.8min 92%A,1.9min 70%A,2.0min 20%A;4.6min 20%A。使用DAS2.0软件计算药代动力学参数。
表2
表3
伊利替康和小檗碱的药动学参数如表2、表3所示。图1为给药48h后,体内两种药物的比例变化。给药48h后,共载脂质体制剂中伊利替康和小檗碱的浓度比例始终维持在初始给药比例1.2:1(摩尔比)附近,而游离溶液剂组中两种药物的比例在2h内就已经偏离了初始给药比例。
药物组合物共载脂质体制剂的组织分布研究:
实施例14:收集生长状态良好的BxPC-3细胞,用5ml的胰酶消化4min,再用DMEM细胞培养液终止消化。消化完的细胞以1000rpm的转速离心后,弃去含胰酶的细胞培养液,用PBS缓冲液稀释并计数1.0×106cell/mL。取上述细胞悬液于无菌条件下接种于小鼠右后侧腰背部的皮下组织,每只小鼠接种0.2mL,含瘤细胞约3.5×105个,共接种30只。待肿瘤体积生长到200mm3时,将荷瘤小鼠随机分为五组:小檗碱脂质体组(lipBER)、伊利替康脂质体组(lipIRI)、市售Onivyde组、小檗碱脂质体与伊利替康脂质体联合组(lipB plus lipI)、药物组合物共载脂质体制剂(lipBI),每组六只。通过尾部静脉注射给药,给药剂量为IRI6mg/kg,BER 3mg/kg。在给药后的6h和24h,从每组中随机取三只小鼠,将小鼠颈椎脱臼处死后,迅速解剖,收集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肿瘤,用生理盐水清洗组织表面,并用滤纸吸干表面水分。称取200mg左右的组织样品,小心剪碎,置于10mL EP管中,加入1mL生理盐水,用匀浆机破碎,破碎过程需在冰浴下进行。处理完的组织样品在3,500rpm的转速下离心5min,弃去下层组织碎片,将上清组织匀浆转移至新的EP管中。
采用沉淀蛋白法对组织匀浆中的药物进行测定,以格列齐特作为内标。使用ACQUITYUPLCTM系统和ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(50mm×2.1mm,1.7μm,Waters Corp,Milford,MA,USA)对组织匀浆样品中的伊利替康和小檗碱进行定量分析。流动相由乙腈(A)和含有0.1%甲酸的水溶液(B)组成,流速为0.2mL/min。洗脱梯度为0min 20%A,0.5min80%A,1.8min 92%A,1.9min 70%A,2.0min 20%A;4.6min 20%A。
结果如图2所示
尾静脉给药6h后,共载脂质体制剂的药物主要分布在肝脏和肿瘤组织中,而其他脂质体组的药物主要分布在肝脏、脾脏或肺部。值得一提的是,给药6h和24h后,共载脂质体制剂中伊利替康和小檗碱均以2:1(m/m)的比例在肿瘤部位蓄积,这与体外细胞实验中最佳协同比例是一致的。实验结果证明,药物组合物共载脂质体制剂可以向肿瘤组织同步递送伊利替康和小檗碱,提高药物在肿瘤部位的蓄积。
药物组合物共载脂质体制剂的体内药效研究
实施例15:收集生长状态良好的BxPC-3细胞,用5ml胰酶消化4min后,以DMEM细胞培养液终止消化。消化完的细胞在1000rpm离心后,弃去含胰酶的细胞培养液,用PBS缓冲液稀释并计数1.75×106cell/mL。取上述细胞悬液于无菌条件下接种于小鼠右后侧腰背部的皮下组织,每只小鼠接种0.2mL,含瘤细胞约3.5×105个,共接种36只。待荷瘤小鼠后背肿瘤体积长至200mm3左右将荷瘤小鼠随机分为六组:生理盐水组(control)、小檗碱脂质体组(lipBER)、伊利替康脂质体组(lipIRI)、市售Onivyde组、小檗碱脂质体与伊利替康脂质体联合组(lipB plus lipI)、药物组合物共载脂质体制剂(lipBI),每组六只。尾静脉注射给药,每隔5天给药一次,共给药4次。BER的给药剂量为3mg/kg,IRI的给药剂量为6mg/kg。在实验期间,定期监测荷瘤小鼠的肿瘤体积和体重的变化。4次给药全部完成后继续停药观察5天,然后处死小鼠,取其主要器官(心、肝、脾、肺、肾、结肠、肿瘤)用福尔马林固定,制备HE染色切片。
实验结果见图3,图4,图5。共载脂体相比于Onivyde展现了更好的抗肿瘤效果,尽管在停药后肿瘤体积略有增加,但仍然优于Onivyde(P<0.05)。共载脂质体组的小鼠体重在治疗期间没有明显变化,说明在提高抗肿瘤效果的同时,没有对机体造成显著的非特异性毒性。HE染色结果表明,共载脂质体组的结肠切片相比于Onivyde组没有显现出严重的组织损伤,这证明了小檗碱可以改善伊利替康引发的肠道毒性。
Claims (1)
1.一种药物制剂,其特征在于,包括磷脂、胆固醇、伊立替康和中药提取物,所述中药提取物为小檗碱,所述伊利替康与所述小檗碱的质量比为2:1;
制备方法包括:称取150mg HSPC、60mg胆固醇、1.2mg DSPE-MPEG2000溶解于15mL氯仿中,39℃减压蒸发成膜,真空放置12小时以去除残留溶剂;在65℃下,加入10mL 600mM蔗糖八硫酸酯三乙胺盐溶液水化30min,形成多层囊泡脂质体;然后将所述多层囊泡脂质体通过0.4μm、0.2μm和0.1μm的聚碳酸酯膜逐步挤出,得到单室空白脂质体;将挤出后的脂质体样品通过用组成为20mM HEPES+150mM NaCl的外水相预平衡过的SepharoseCL-4B凝胶柱,即得空白脂质体混悬液;使得伊利替康与磷脂的药脂比m/m为1:10.6,小檗碱与磷脂的药脂比m/m为1:21.3;将14.1mg的伊利替康与空白脂质体在60℃孵育60min,使用800mM磷酸氢二钠将外水相pH调至8.5,再加入7.05mg小檗碱,孵育30min后冰水浴终止载药,得到伊利替康和小檗碱共载脂质体。
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Berberine enhances chemosensitivity to irinotecan in colon cancer via inhibition of NF κB;MEILING YU等;《MOLECULAR MEDICINE REPORTS》;20141231;第9卷;249-254 * |
Inhibitory effect of berberine on the mediastinal lymph node metastasis produced by orthotopic implantation of Lewis lung carcinoma;Noriyasu Mitani等;《Cancer Letters》;20011231;第165卷;35-42 * |
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