CN109528654A - 一种盐酸伊立替康和盐酸阿霉素共载脂质体及其制备方法 - Google Patents

一种盐酸伊立替康和盐酸阿霉素共载脂质体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种盐酸伊立替康和盐酸阿霉素共载脂质体及其制备方法，该脂质体包括以下组分：药物、磷脂、胆固醇、蔗糖八硫酸酯三乙胺盐和缓冲剂；其中，所述药物为盐酸伊立替康和盐酸阿霉素，盐酸伊立替康与盐酸阿霉素重量比为1‑10:1‑10，盐酸伊立替康与磷脂重量比为0.1‑1:1，磷脂与胆固醇重量比为2‑9:1。该脂质体包封率高、载药量高，能够共递送两种药物，确保药物到达肿瘤部位时仍保持协同比例，达到增效、减毒的目的。

Description

一种盐酸伊立替康和盐酸阿霉素共载脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及脂质体药剂技术领域，特别涉及一种盐酸伊立替康和盐酸阿霉素共载脂质体及其制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤发病机制复杂、治疗环节多，对于这种异质性的多基因疾病，单一治疗剂往往不能取得理想的治疗效果。联合治疗已成为多数恶性肿瘤临床治疗规范中的标准治疗。
伊立替康(irinotecan,IRI,CPT-11)，是一种喜树碱类前药，作用于拓扑异构酶I，通过将拓扑异构酶I转变为拓扑异构酶I-药物-DNA复合物，从而抑制DNA复制发挥抗肿瘤作用。伊立替康可用于治疗结直肠癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤等，属广谱抗肿瘤药的典型代表之一。阿霉素(doxorubicin,DOX)，是一种蒽环类抗肿瘤抗生素，能嵌入DNA相邻碱基对之间，使DNA链断裂，阻碍核酸合成；同时也是拓扑异构酶II的抑制剂，通过抑制拓扑异构酶II，干扰DNA的正常复制，而诱导细胞凋亡。阿霉素可用于治疗乳腺癌、卵巢癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性白血病、肝癌、骨及软组织肉瘤、肺癌等，为临床最常用的抗肿瘤药物之一。
因拓扑异构酶I和拓扑异构酶II是参与细胞核中核酸合成调节的两种主要酶类，而伊立替康和阿霉素又分别是作用于拓扑异构酶I和拓扑异构酶II的抑制剂，因此，将两者组合可能产生协同治疗效果。有报道显示，拓扑异构酶I和拓扑异构酶II抑制剂的组合可能表现出协同的抗肿瘤活性。(Kim R,Hirabayashi N,Nishiyama M,Jinushi K,Toge T,Okada K.Experimental studies on biochemical modulation targetingtopoisomerase I and II in human tumor xenografts in nude mice.Int JCancer.1992；50:760-6.)另有报道显示，喜树碱类(拓扑异构酶I抑制剂)和阿霉素(拓扑异构酶II抑制剂)药物的组合可以协同抑制各种肿瘤细胞。(①K.M.Camacho,S.Menegatti,S.Mitragotri,Nanomedicine 2016,11:1139.②Y.Chen,Y.Gao,H.Chen,D.Zeng,Y.Li,Y.Zheng,F.Li,X.Ji,X.Wang,F.Chen,Q.He,L.Zhang,J.Shi,Adv.Funct.Mater.2012,22:1586.③S.Aryal,C.M.J.Hu,L.F.Zhang,Mol.Pharm.2011,8:1401.)近年来，伊立替康和阿霉素的联合处方也被施用于临床试验中。(①Nishimura S,Tsuda H,Hashiguchi Y,KokawaK,Nishimura R,Ishiko O,Kamiura S,Hasegawa K and Umesaki N.Phase II study ofirinotecan plus doxorubicin for early recurrent or platinum refractoryovarian cancer:interim analysis.International Journal of GynecologyCancer.2007；17:159-163.②Negoro S,Uejima H,Takeda T et al.A phase II study ofirinotecan and doxorubicin in patients with refractory or relapsed small-celllung cancer.Annals Oncol.2000；11:109.)
然而，伊立替康的胃肠道反应、骨髓抑制等毒性和阿霉素的心脏毒性等其他不良反应限制了临床使用，因此有必要选择合适的药物递送系统。脂质体作为抗肿瘤药物的良好载体，优势在于，脂质体在体内无毒、无免疫原型，可降解、缓释；能够增强所载药物在体内的稳定性，使药物稳定抵达靶部位后释放；改变被包封药物的体内分布，使其在肿瘤部位高蓄积，减少对正常组织的损害，进而减少所需药物剂量，达到减毒、增效的目的。
目前，水溶性弱碱性药物制备成脂质体通常选择主动载药技术，包括：pH梯度法、硫酸铵梯度法和金属离子络合梯度法。上市的伊立替康脂质体注射剂和阿霉素脂质体注射剂分别利用蔗糖八硫酸酯三乙胺梯度和硫酸铵梯度法完成药物的装载。有研究者Ishaque M.等采用金属离子络合梯度法将伊立替康和阿霉素共包封于脂质体中，利用硫酸锰或氯化锰溶液作为内水相制备空白脂质体，然后利用离子载体A23187建立pH梯度，完成药物的装载。(Ishaque M.Shaikh,Kuan-Boone Tan,Anumita Chaudhury,Yuanjie Liu,Bee-Jen Tan,Bernice M.J.Tan,Gigi N.C.Chiu.Liposome co-encapsulation of synergistic combination of irinotecan and doxorubicin forthe treatment of intraperitoneally grown ovarian tumor xenograft.Journal ofControlled Release 172 2013:852–861.)但是，该方法的问题在于重金属离子在体内的不断蓄积，可能产生毒性，离子载体A23187的安全性也有待进一步研究。
发明内容：
针对上述背景技术，本发明旨在提供一种盐酸伊立替康和盐酸阿霉素共载脂质体及其制备方法，利用两种药物的协同作用，提高抗肿瘤效果，降低毒副作用。
本发明的技术方案如下：
一种盐酸伊立替康和盐酸阿霉素共载脂质体，包括以下组分：药物、磷脂、胆固醇、蔗糖八硫酸酯三乙胺盐和缓冲剂。
其中，盐酸伊立替康与盐酸阿霉素重量比为1-10:1-10，盐酸伊立替康与磷脂重量比为0.1-1:1，磷脂与胆固醇重量比为2-9:1。
上述盐酸伊立替康和盐酸阿霉素共载脂质体，其优选方案中，盐酸伊立替康与盐酸阿霉素重量比为1-5:1-5，盐酸伊立替康与磷脂重量比为0.1-0.4:1，磷脂与胆固醇重量比为2-5:1。
上述磷脂可选自天然磷脂如：蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)；也可选自合成磷脂如：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油酯(DPPG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG2000-DSPE)中的一种或几种。
进一步地，所述的磷脂优选为：氢化大豆卵磷脂(HSPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG2000-DSPE)中的一种或几种；
更进一步地，所述的磷脂优选为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)与甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG2000-DSPE)的组合；
当所述磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)与甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG2000-DSPE)的组合时，其重量比为：3:0.01-1，优选为3:0.05-0.1。
盐酸伊立替康、盐酸阿霉素、磷脂的比例为：0.1-0.4:0.1-0.4:1时，包封率可达99％。
本发明所述的共载脂质体的制备方法包括以下步骤：
1)制备空白脂质体初品：
通过薄膜分散、乙醇注入或微混合等方法制备空白脂质体初品：
2)制备梯度空白脂质体：
将空白脂质体初品通过挤出设备或均质机降低并均匀粒度，得到平均粒度为50-150nm的脂质体；然后利用透析、柱层析或者超滤等手段，将脂质体外水相中的蔗糖八硫酸酯三乙胺盐置换成pH为5.0-7.0的缓冲剂，建立跨膜动力梯度，形成空白脂质体；
3)载药：将盐酸伊立替康和盐酸阿霉素分别配制成一定浓度的溶液，采用次序载药的方式，先将盐酸伊立替康溶液加入到空白脂质体中，50-70℃水浴孵育30-60min，然后加入盐酸阿霉素溶液，50-70℃水浴孵育30-60min，冰水浴冷却，得到伊立替康和阿霉素共载脂质体。
步骤(2)中所述的蔗糖八硫酸酯三乙胺盐，浓度为0.2-0.7M，其中摩尔浓度按取代的铵计算。
步骤(2)中缓冲剂可选自生理盐水、等渗蔗糖、组氨酸、羟乙基哌嗪-乙基磺酸盐(HEPES)、吗啉-乙基磺酸盐(MES)、酒石酸盐、柠檬酸盐及其他药学上可接受的缓冲物质，其pH为5.0-7.0，优选为羟乙基哌嗪-乙基磺酸盐(HEPES)与氯化钠(NaCl)的组合。
步骤(2)中羟乙基哌嗪-乙基磺酸盐(HEPES)的浓度为：15-30mM，氯化钠(NaCl)的浓度为：100-250mM。
步骤(3)中伊立替康药物溶液的浓度为：10-20mg/mL，阿霉素溶液的浓度为：10-20mg/mL。
本发明的有益效果是：
①本发明的共载脂质体系，盐酸伊立替康和盐酸阿霉素的包封率高，均达到95％以上，并且，盐酸伊立替康和盐酸阿霉素的装载量高。高载药量就意味着更少载体材料的使用，这有利于提高药物传递效率并减少毒副作用，满足临床需求。
②采用多阴离子盐作为内水相，蔗糖八硫酸盐每一个分子携带8个酸根，可以与药物形成致密的结合，有效防止药物泄漏，保证制剂的稳定性。同时，提高药物的滞留时间，明显延缓药物在体内的释放，并且两种药物释放具有一定的规律，确保两种药物到达肿瘤部位时仍保持协同的剂量比。
③本发明的共载脂质体，体内药效试验证明，其抗肿瘤效果更佳，有效地发挥了药物的治疗作用。
④本发明中药物组合的筛选有着临床证据支持和充分的文献支持，可以协同抑制多种肿瘤细胞，因此更具有临床意义。
⑤脂质体粒度在50-150nm之间，工艺稳定，可控性和重现性好，易于工业化生产。
附图说明：
图1为本发明实施例18的细胞毒性图。其中，A图药物为阿霉素溶液和对比实施例4制备的阿霉素脂质体，B图药物为伊立替康溶液和对比实施例4制备的伊立替康脂质体。
图2为本发明实施例18的抑制率-联合指数图。其中，A图为乳腺癌细胞(4T-1)，B图为非小细胞肺癌细胞(A549)、C图为结肠癌细胞(HT-29)。
图3为本发明实施例19的伊立替康和阿霉素共载脂质体的药动试验阿霉素/伊立替康比例变化图。其中，A图为2h，B图为24h。
图4为本发明实施例19的伊立替康和阿霉素共载脂质体的药动试验药时曲线图。
图5为本发明实施例20的伊立替康和阿霉素共载脂质体的药效试验肿瘤体积变化图。
图6为本发明实施例20的伊立替康和阿霉素共载脂质体的药效试验荷瘤小鼠体重变化图。
图7为本发明实施例21的伊立替康和阿霉素共载脂质体的组织分布图。
图8为本发明实施例22的伊立替康和阿霉素共载脂质体的溶血率图。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明权利范围的限制。
本发明所述“包封率”是指脂质体中包载药物与投药量的比例，“载药量”是指包载药物占脂质体的质量比。“药脂比”指药物与磷脂的重量比。
包封率及载药量的计算公式如下：
包封率＝脂质体内包载的药物含量/加入的药物总量×100％；
载药量＝脂质体内包载的药物含量/脂质体各成分总量×100％。
空白脂质体的制备：
实施例1：薄膜分散法
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h，得到不均匀的多室脂质体。使用高压挤出设备降低脂质体的粒度，然后使用Sephadex G-50通过柱层析除去空白脂质体外相的阴离子，将其置换成含20mM HEPES和150mM NaCl的溶液，形成跨膜动力梯度。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先将伊立替康溶液加入到空白脂质体中，65℃孵育30min，然后加入阿霉素溶液孵育30min，即得伊立替康和阿霉素共载脂质体。
实施例2：乙醇注入法
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，65℃水浴中搅拌，减压挥除乙醇，再加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h，得到不均匀的多室脂质体。使用高压挤出设备降低脂质体的粒度，然后用Sephadex G-50除去空白脂质体外相的阴离子，将其置换成含20mM HEPES和150mM NaCl的溶液。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先将伊立替康溶液加入到空白脂质体中，65℃孵育30min，然后加入阿霉素溶液孵育30min，即得伊立替康和阿霉素共载脂质体。
实施例3
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.1的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后使用Sephadex G-50除去脂质体外相的阴离子，将其置换成含20mM HEPES和150mM NaCl的溶液。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得伊立替康和阿霉素共载脂质体。
实施例4
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:2:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后使用Sephadex G-50将脂质体外相的阴离子置换成含20mM HEPES和150mM NaCl的溶液。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得。
实施例5
将EPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后用Sephadex G-50将脂质体外相的阴离子置换成含20mM HEPES和150mM NaCl的溶液。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得。
实施例6
将HSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后用Sephadex G-50将脂质体外相的阴离子置换成含20mM HEPES和150mM NaCl的溶液。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得。
表1
采用凝胶排阻色谱法测定包封率。实施例1和2结果显示，以薄膜分散法和乙醇注入法制备的空白脂质体进行载药，包封率相当，均可用于后续研究。实施例3-6结果显示，当磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)与甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(MPEG2000-DSPE)的组合时，其重量比为3:0.05-0.1，包封率可达95％；当磷脂DSPC改变为EPC或HSPC时，包封率在95％以下。
缓冲剂：
实施例7
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后用Sephadex G-50将脂质体外相的阴离子置换成HEPES/NaCl(20mM/150mM，pH 5)。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得。
实施例8
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后用Sephadex G-50将脂质体外相的阴离子置换成HEPES/NaCl(20mM/150mM，用NaOH调至pH 7)。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得。
实施例9
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后用Sephadex G-50将脂质体外相的阴离子置换成HEPES/NaCl(20mM/150mM，用NaOH调至pH7.5)。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得。
实施例10
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后用Sephadex G-50将脂质体外相的阴离子置换成HEPES/蔗糖(20mM/30mM，用NaOH调至pH7.0)。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得。
实施例11
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后用Sephadex G-50将脂质体外相的阴离子置换成蔗糖/组氨酸(30mM/20mM，用NaOH调至pH7.0)。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得。
实施例12
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后用Sephadex G-50将脂质体外相的阴离子置换成pH 7.4的PBS缓冲溶液。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得。
实施例13
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后用Sephadex G-50将脂质体外相的阴离子置换成pH 6.5的PBS缓冲溶液。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得。
表2
实施例7-9结果显示，当缓冲剂为HEPES/NaCl，pH为5-7时，包封率达到99％；实施例10-11结果显示，当缓冲剂由HEPES/NaCl的组合改变为HEPES/蔗糖或蔗糖/组氨酸时，包封率由99％下降至90％左右；当使用PBS缓冲溶液时，包封率严重降低。结果表明，缓冲剂的组合为HEPES/氯化钠(15-30mM/100-250mM，pH 5-7)时，共载脂质体的包封率最优。
载药：
实施例14
按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.6:0.6:1，先将伊立替康溶液加入到实施例1的空白脂质体中，65℃孵育30min，然后加入阿霉素溶液孵育30min。
实施例15
按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.8:0.8:1，先将伊立替康溶液加入到实施例1的空白脂质体中，65℃孵育30min，然后加入阿霉素溶液孵育30min。
表3
实施例14、15结果显示，随着药脂比(盐酸伊立替康：盐酸阿霉素：磷脂)增加，超出0.4:0.4:1时，包封率由99％逐渐降低。
对比实施例1：载药次序(同时载伊立替康和阿霉素溶液)
按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，同时将伊立替康和阿霉素溶液加入到实施例1的空白脂质体中，65℃孵育1h，即得伊立替康和阿霉素共载脂质体。测得伊立替康的包封率为94％，阿霉素的包封率为90％。对比实施例2：载药次序(先载阿霉素溶液，后载伊立替康溶液)
按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:0.4:1，先将阿霉素溶液加入到实施例1的空白脂质体中，65℃孵育30min，然后加入伊立替康溶液孵育30min，即得伊立替康和阿霉素共载脂质体。测得伊立替康的包封率为93％，阿霉素的包封率为93％。
对比实施例1和对比实施例2实验结果显示，改变载药次序，“同时载伊立替康和阿霉素溶液”与“先载阿霉素溶液，后载伊立替康溶液”两种方式无显著性差异，包封率均较低，达不到95％；而实施例1中的载药次序：“先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液”测得的包封率更高，可达到99％。
对比实施例3：硫酸铵梯度法制备伊立替康和阿霉素共载脂质体
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.25M(NH4)2SO4溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后用Sephadex G-50将空白脂质体外相的阴离子置换成含20mM HEPES和150mM NaCl的溶液。按照伊立替康：阿霉素：磷脂(重量比)为0.05:0.05:1，先载伊立替康溶液，后载阿霉素溶液，65℃孵育即得。测得伊立替康的包封率为97％，阿霉素的包封率为96％。
实验结果显示，当伊立替康和阿霉素的包封率均达到95％以上时，并且，处方其他参数合适的条件下，TEA-SOS溶液作为内水相时的药脂比更高，而(NH4)2SO4溶液作为内水相时的药脂相对较低，当提高硫酸铵梯度法的药脂比时，发现两药包封率不足90％。从化合物结构来看，蔗糖八硫酸盐每一个分子携带8个酸根，相比于硫酸铵，蔗糖八硫酸盐与药物的结合能力较强，药物通过与内水相阴离子结合形成阴离子复合物，而稳定滞留于内水相中，因此可实现高包封率，高药脂比。另一方面，满足有效包封率的前提下，内水相溶液浓度是影响药物装载效率的主要因素之一，在一定范围内，内水相溶液浓度越大，形成的跨膜动力越强，药物稳定滞留于内水相的效果越好。
对比实施例4
将DSPC、胆固醇和MPEG2000-DSPE以3:1:0.05的重量比混合，溶解于无水乙醇中，减压蒸发成膜，加入0.6M TEA-SOS溶液，65℃水化1h。使用高压挤出设备降低粒度，然后用Sephadex G-50将脂质体外相的阴离子置换成含20mM HEPES和150mM NaCl的溶液，得到空白脂质体。按照伊立替康：磷脂(重量比)为0.4:1，将伊立替康溶液加入到空白脂质体中65℃下孵育，得到伊立替康脂质体。同样，按照阿霉素：磷脂(重量比)为0.4:1，将阿霉素溶液加入到另一份相同空白脂质体中65℃下孵育，得到阿霉素脂质体。将两者按1:1(重量比)混匀，得到伊立替康脂质体和阿霉素脂质体的物理混合物。测得伊立替康和阿霉素的包封率分别为99％、98％。
实施例16：体外释放试验
采用取样分离法，参照盐酸多柔比星脂质体注射液(楷莱)体外释放试验方法。释放介质含有20mM的氯化铵，等渗，pH为6.5。取实施例1的伊立替康和阿霉素共载脂质体3mL，加入释放介质1mL，混匀，分别取1ml至两个西林瓶中，于55±1℃水浴中放置0.5和3h，分别取出置冰水浴中冷却。另取对比实施例4的伊立替康脂质体和阿霉素脂质体的物理混合物同法操作，分别测定释放前后的包封率。结果见表4。
计算公式：累积释放百分率(％)＝初始包封率(％)-释放试验后的包封率(％)
表4
结果显示，伊立替康和阿霉素共载脂质体在3h时，伊立替康累积释放率大于阿霉素，伊立替康释放更快；相比之下，伊立替康脂质体和阿霉素脂质体的物理混合物在3h时，伊立替康释放率为61.0％，略小于共载脂质体3h时伊立替康的释放率。释放率的差异主要是由于内水相药物存在状态不同所致，进入内水相的弱碱性药物质子化并与阴离子形成复合物，药物的释放需要先与阴离子解离，然后跨膜扩散出来。因此，药物与阴离子复合物的结合状态与溶解能力是影响释放速率的关键，进而决定了处方的安全性和有效性。
实施例17：伊立替康和阿霉素共载脂质体的稳定性试验
将伊立替康和阿霉素共载脂质体在4℃条件下储存两个月，考察其物理化学稳定性，用马尔文粒度仪测定其粒径、多分散指数(PDI)、Zeta电位变化，用高效液相色谱法检测包封率及药物含量变化。结果见表5。
表5
结果显示，4℃放置期间，共载脂质体的粒径、PDI、Zeta电位和包封率没有发生明显；并且，药物含量没有减小，未发生降解，表明该共载脂质体的物理化学稳定性良好。
实施例18：体外细胞毒试验
采用MTT法(噻唑蓝)考察伊立替康和阿霉素对乳腺癌细胞(4T-1)、非小细胞肺癌细胞(A549)和结肠癌细胞(HT-29)的细胞毒性，并筛选伊立替康和阿霉素的协同比例。
实验结果表示：当伊立替康与阿霉素的比例为10:1-1:10时，产生协同作用。
实验步骤如下：将对数生长期细胞消化，用培养液稀释至5×104cells/mL的细胞密度，吹匀后移至96孔板中，每孔100μL，置培养箱中孵育24h。待细胞贴壁后加入用新鲜培养液稀释的不同浓度的伊立替康和阿霉素药物溶液，每孔100μL，每个浓度设置3个平行孔，只加空白新鲜培养液的细胞孔作为对照组，不含有细胞的孔为调零孔。置于培养箱中孵育48h后取出，每孔加20μL MTT溶液(5mg/mL)，再置于培养箱中继续孵育4h后取出，弃去培养液，每孔加200μL DMSO于振荡器上振荡10min溶解蓝紫色甲瓒，用酶标仪于570nm测定96孔板中每孔的吸光度值。通过Graghpad软件计算药物的半数致死浓度(IC50)。使用Chou-Talalay法(又称中位药效法，Median-drug effect analysis；联合指数法，Combinationindex method)计算伊立替康与阿霉素的联合指数(Combination Index,CI)，考察其联合作用的特征，CI＝1为相加作用，CI<1为协同作用，CI>1为拮抗作用。使用CompuSyn软件绘制抑制率-联合指数图(FA-CI，FA：Fraction Affected)。结果见表6-9、图1-2。
表6
结果如表6和图1显示，对于4T-1细胞，与游离药相比，制剂的IC50大，体外细胞毒性均存在一定程度的降低。对于抗癌药物的递送而言，脂质体药物只有被肿瘤细胞摄取后释放出游离的药物分子才能发挥其抑制肿瘤生长的作用。
表7
表8
表9
实施例19：药动试验
取健康SD(Sprague-Dawley)大鼠，体重200-220g，随机分为两组，每组3只：游离伊立替康+游离阿霉素组，伊立替康和阿霉素共载脂质体组(按实施例1制备)。尾静脉注射给药，给药前禁食12h，伊立替康等效给药剂量5mg/kg，阿霉素等效给药剂量5mg/kg。于规定的时间点眼眶取血，测定药物浓度。
图3结果表示，给药后24h内，共载脂质体组的阿霉素和伊立替康的血药浓度可以维持在预设的比例，而游离药物组的比例波动较大，偏离初始比例1:1。如图4所示，相比游离药物组，共载脂质体组的阿霉素和伊立替康的半衰期分别提高了3.15和5.73倍，生物利用度分别提高了464.20和477.86倍。
实施例20：药效试验
将乳腺癌细胞悬液(4T-1,1×106cells/100μL)接种于雌性Balb/c小鼠右后侧腰背部皮下，待肿瘤体积长至150mm3左右，将其进行随机分组，每组5只：空白对照组(生理盐水)，游离伊立替康+游离阿霉素组，市售伊立替康脂质体(按处方制备)+游离阿霉素组，市售阿霉素脂质体(按处方制备)+游离伊立替康组，伊立替康和阿霉素共载脂质体组(按实施例1制备)和伊立替康脂质体和阿霉素脂质体物理混合物组(按对比实施例4制备)。尾静脉隔两天给1次药，一共给药3次，伊立替康等效给药剂量5mg/kg，阿霉素等效给药剂量5mg/kg。给药后，每天测量和记录小鼠的肿瘤体积和体重。
结果如图5所示，在空白对照组和游离伊立替康+游离阿霉素组中肿瘤体积迅速增长。相比之下，市售伊立替康脂质体+游离阿霉素组，市售阿霉素脂质体+游离伊立替康组及伊立替康脂质体和阿霉素脂质体物理混合物组能延缓肿瘤生长。而伊立替康和阿霉素共载脂质体组则能明显抑制肿瘤生长，给药12天后共载脂质体组的肿瘤体积仅为200mm3左右。如图6所示，伊立替康和阿霉素共载脂质体组小鼠体重没有明显变化，在抗肿瘤效果明显的同时，没有对机体造成显著的非特异性毒性。
实施例21：体内组织分布试验
将乳腺癌细胞悬液接种于雌性Balb/c小鼠，待肿瘤体积达到500mm3时，尾静脉注射给药：游离伊立替康+游离阿霉素组，市售伊立替康脂质体(按处方制备)+游离阿霉素组，市售阿霉素脂质体(按处方制备)+游离伊立替康组，伊立替康和阿霉素共载脂质体组(按实施例1制备)和伊立替康脂质体和阿霉素脂质体物理混合物组(按对比实施例4制备)。伊立替康等效给药剂量5mg/kg，阿霉素等效给药剂量5mg/kg。3h或24h后，处死并分离出肿瘤、心、肝、脾、肺和肾。
结果如图7所示，其中，a为游离伊立替康+游离阿霉素组(Free IRI+Free DOX)；b为市售伊立替康脂质体+游离阿霉素组(Lipo ONY+Free DOX)；c为市售阿霉素脂质体+游离伊立替康组(Lipo DOXIL+Free IRI)；d为伊立替康和阿霉素共载脂质体组(Lipo(IRI/DOX))；e为伊立替康脂质体和阿霉素脂质体物理混合物组(Lipo IRI+LipoDOX)。静脉注射溶液剂后，药物主要分布在心、肝、肺部，在肿瘤组织中几乎不分布。相比之下，静脉注射伊立替康和阿霉素共载脂质体后，药物主要分布在肝脏和肿瘤组织，且肿瘤部位24h的药物含量比3h有明显提升。相比于b组和c组，d组共载脂质体在肿瘤部位高蓄积，除了由脂质体表面PEG修饰产生的长循环以及由EPR效应介导的被动靶向作用之外，主要是其高包封率、高药脂比所致，提高了药物传递效率，相对减少药物在非靶部位的分布，在提高抗肿瘤效果的同时降低药物对机体正常组织的毒副作用。相比之下，e组单载脂质体的物理混合物在肿瘤部位的蓄积量低于d组共载脂质体，主要是由于肿瘤细胞对药物的摄取量不同所致，这也显示出有必要将伊立替康和阿霉素两种药物共同装载于脂质体中，通过共载来提高药物传递效率。
实施例22：溶血试验
取兔血20mL，转至预先肝素化的试管中，离心除去血液中的纤维蛋白，使成脱纤血液。加入生理盐水约10倍量，摇匀，离心，除去上清液，沉淀的红细胞再用生理盐水按上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为止，将所得红细胞用生理盐水配成2％的混悬液。按下表8所示依次加入2％红细胞悬液、生理盐水或蒸馏水以及不同体积的伊立替康和阿霉素共载脂质体，1号为阴性对照组，2号为阳性对照组。摇匀后，置37℃水浴中，3小时后取出，2000rpm离心5min除去碎片和完整的红细胞。所得上清液于415nm处测定吸光度。
计算式：溶血率(％)＝(样品组吸光度-阴性对照组吸光度)/阳性对照组吸光度×100％
表10
结果如图8所示，在所有测试的稀释条件下，最大溶血率仅为1.20±0.29％，溶血率远远小于5％的临界极限，可以安全供静脉注射使用。

Claims (10)

1.一种盐酸伊立替康和盐酸阿霉素共载脂质体，其特征在于，包括以下组分：药物、磷脂、胆固醇、蔗糖八硫酸酯三乙胺盐和缓冲剂；盐酸伊立替康与盐酸阿霉素重量比为1-10:1-10，盐酸伊立替康与磷脂重量比为0.1-1:1，磷脂与胆固醇重量比为2-9:1。
2.根据权利要求1所述的共载脂质体，其特征在于，盐酸伊立替康与盐酸阿霉素重量比为1-5:1-5，盐酸伊立替康与磷脂重量比为0.1-0.4:1，磷脂与胆固醇重量比为2-5:1。
3.根据权利要求1所述的共载脂质体，其特征在于，所述的磷脂为天然磷脂和合成磷脂中的一种或多种；所述的天然磷脂为蛋黄卵磷、氢化大豆卵磷脂中的一种或多种；所述的合成磷脂为负电性磷脂、中性磷脂、聚乙二醇修饰磷脂中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的共载脂质体，其特征在于，所述的合成磷脂为二硬脂酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油酯、磷脂酰乙醇胺、甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种，优选为二硬脂酰磷脂酰胆碱与甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的组合。
5.根据权利要求4所述的共载脂质体，其特征在于，二硬脂酰磷脂酰胆碱与甲氧基PEG2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺重量比为：3:0.01-1，优选为3:0.05-0.1。
6.根据权利要求1所述的共载脂质体，其特征在于，所述的蔗糖八硫酸酯三乙胺盐浓度为0.2-0.7M，其中摩尔浓度按取代的铵计算。
7.根据权利要求1所述的共载脂质体，其特征在于，所述的缓冲剂选自生理盐水、等渗蔗糖、组氨酸、羟乙基哌嗪-乙基磺酸盐(HEPES)、吗啉-乙基磺酸盐(MES)、酒石酸盐、柠檬酸盐及其他药学上可接受的缓冲物质。
8.根据权利要求6所述的共载脂质体，其特征在于，所述的缓冲剂pH为5.0-7.0。
9.根据权利要求6所述的共载脂质体，其特征在于，羟乙基哌嗪-乙基磺酸盐的浓度为：15-30mM，氯化钠的浓度为：100-250mM。
10.根据权利要求1所述的共载脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备空白脂质体初品：
通过薄膜分散、乙醇注入或微混合等方法制备空白脂质体初品：
2)制备梯度空白脂质体：将空白脂质体初品通过挤出设备或均质机降低并均匀粒度，得到平均粒度为50-150nm的脂质体；然后利用透析、柱层析或者超滤等手段，将脂质体外水相中的蔗糖八硫酸酯三乙胺盐置换成pH为5.0-7.0的缓冲剂，建立跨膜动力梯度，形成空白脂质体；
3)载药：将盐酸伊立替康和盐酸阿霉素分别配制成一定浓度的溶液，采用次序载药的方式，先将盐酸伊立替康溶液加入到空白脂质体中，50-70℃水浴孵育30-60min，然后加入盐酸阿霉素溶液，50-70℃水浴孵育30-60min，冰水浴冷却，得到伊立替康和阿霉素共载脂质体。
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