CN113181117A - 一种紫草素和蒽环类化疗药共载脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种紫草素和蒽环类化疗药共载脂质体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种包含紫草素和蒽环类化疗药物脂质体的制备方法及其在协同抗肿瘤免疫疗法中的应用，属于药物制剂技术领域。首先，将紫草素和蒽环类药物米托蒽醌或阿霉素同时包封于脂质体内，用共载脂质体以细胞毒实验、摄取实验和ICD诱导能力来筛选协同比例，所制备的双载药脂质体具有pH/GSH双响应释放特性，能够将药物递送到肿瘤组织，协同诱导抗肿瘤效果并降低两药的给药剂量，减少药物毒副作用，实现了增效减毒的目的。

Description

一种紫草素和蒽环类化疗药共载脂质体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种包含紫草素和蒽环类化疗药的脂质体的制备及其在抗肿瘤免疫疗法中的应用。
背景技术
免疫治疗是指人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法，包括肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂等。近来免疫治疗手段在癌症的治疗中表现出良好的优越性，得到了越来越多的关注。由于单一免疫治疗手段响应率低等缺点，免疫疗法常与化疗药联用以增强其作用效果。一些化疗药物如阿霉素、米托蒽醌、环磷酰胺、奥沙利铂等化疗药物自身也可以诱导凋亡肿瘤产生相关抗原，进而激活机体产生免疫反应，激活免疫细胞杀死肿瘤细胞，该作用称为免疫原性死亡(immunogenic cell death，ICD)。然而单一化疗药物诱导的ICD效应很弱，无法达到化疗联合免疫治疗的效果。
理想的ICD诱导剂具备如下特点：(1)有效诱导细胞凋亡和介导抗肿瘤免疫反应的肿瘤抗原释放，(2)可以逆转多药耐药和降低肿瘤相关抗原释放的细胞突变，(3)选择性杀死免疫抑制的免疫细胞，而对免疫原性免疫细胞无影响，(4)下调和直接杀死转移的肿瘤细胞。在众多的ICD诱导剂中，蒽环类化疗药具备大部分上述特点。然而在诱导有效ICD效应的同时也能产生严重的毒副作用。
传统中药紫草素也是一种有效的ICD诱导剂，其具备的ICD诱导剂的特点，但是由于水溶性差，生物利用度低，毒性大等缺点，还未作为抗癌药物应用于临床。将ICD诱导剂蒽环类化疗药和紫草素制备成共载复合体用于抗肿瘤的相关研究还未见报道。
发明内容
鉴于此，本发明旨在提供一种包含紫草素和蒽环类化疗药物的共载脂质体的制备方法及其在协同抗肿瘤免疫疗法中的应用，首先，利用有机溶剂辅助载药的方法将脂溶性药物紫草素和蒽环类药物米托蒽醌或阿霉素同时以主动载药的方式包封于脂质体内，所制备的双载制剂能够将药物递送到肿瘤组织并具有pH/GSH双响应释放特性，协同诱导抗肿瘤效果，同时降低两药的给药剂量，减少药物毒副作用，从而达到增效减毒的效果。
本发明目的是通过以下方式实现：
一种具有协同效应的药物组合物，其包括紫草素和蒽环类化疗药，所述蒽环类化疗药为阿霉素，表阿霉素，吡柔比星，柔红霉素，阿柔比星，伊达比星，安柔比星，米托蒽醌中的一种或二种以上。
进一步地，所述紫草素与蒽环类化疗药的摩尔比为1-100：100-1。
进一步地，所述蒽环类化疗药为米托蒽醌或阿霉素。
进一步地，所述紫草素与米托蒽醌的摩尔比为1-20：20-1，紫草素与阿霉素的摩尔比为10：1-1：10。
本发明进一步提供一种包含有紫草素和盐酸米托蒽醌的共载脂质体，所述共载脂质体采用主动载药方式包封紫草素和盐酸米托蒽醌于脂质体内，两药包封率均高于95％，紫草素和盐酸米托蒽醌与共载脂质体的质量比为1:50-1:5，粒径50-130nm，制剂稳定性良好，具有pH/GSH双响应释放特性。
进一步地，所述共载脂质体能够实现协同抗肿瘤和协同诱导免疫原性死亡(ICD)效应。
进一步地，所述共载脂质体在pH为中性的释放介质中，药物释放较慢，随着pH的降低及GSH的增加，药物释放速度加快。
本发明进一步提供包含紫草素和蒽环类化疗药的共载脂质体的制备方法，其主要包括以下步骤：
(1)将氢化大豆卵磷脂、胆固醇、PEG化磷脂溶解于易挥发的有机溶剂中，减压蒸发除去有机溶剂，形成干燥的脂膜；
(2)加入铜离子盐溶液，水化处理，通过滤膜进行整粒，形成纳米尺寸的脂质体，使用琼脂糖凝胶色谱柱交换外水相；
(3)向步骤(2)制备的脂质体中加入紫草素的DMSO溶液，孵育处理后，加入盐酸米托蒽醌水溶液，继续孵育处理，冷却后即得双载药脂质体。
进一步地，步骤(1)中，所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷或正己烷。
进一步地，步骤(2)中，所述铜离子盐溶液为葡萄糖酸铜水溶液，浓度为50-300mM，优选为100-200mM。
进一步地，所述葡萄糖酸铜水溶液的pH为3.5-8.0，优选为6.8-7.4。
进一步地，步骤(2)中，所述水化处理的条件为：于55-65℃条件下孵育10-200min。
进一步地，步骤(2)中，所述滤膜为聚碳酯滤膜，膜孔径为0.1-0.45μm。
进一步地，步骤(3)中，所述孵育处理具体过程为：于55-65℃下孵育30-200min。
本发明进一步提供所述包含紫草素和蒽环类化疗药的共载脂质体的应用，其应用于肿瘤治疗，不仅可以直接杀死肿瘤细胞，还可以诱导机体产生免疫反应，进一步杀死肿瘤细胞，实现协同增效减毒的效果。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
(1)本发明将亲脂性药物紫草素与蒽环类药物一起以主动载药的方式包封于脂质体内，药物包封率高，减少了膜材的使用，便于工业放大生产。
(2)本发明的共载脂质体具有pH、还原敏感双响应特性，减少了药物在血液循环中的泄露，保证了药物在肿瘤微环境中释放药物，从而发挥更好的抗肿瘤效果。
(3)本发明的共载脂质体能够维持两药以协同比例在血液中循环，并且能够以特定协同比例在肿瘤内蓄积。
(4)本发明的共载脂质体能够实现协同增效减毒的效果，以较低的给药剂量实现较好的治疗效果，降低了蒽环类药物的系统性毒性，实现抗肿瘤协同作用的同时，能够有效诱导强烈的ICD效应，激活机体抗肿瘤免疫反应，调节肿瘤抑制微环境，增强化疗药本身抗肿瘤的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为盐酸米托蒽醌与紫草素以物理混合物和共载脂质体对黑色素瘤细胞B16F10的联合指数(CI)-抑制率(Fa)关系图；
图2为盐酸米托蒽醌与紫草素以不同摩尔比(1：1，2：1，5：1，1：5)通过物理混合物和共载脂质体形式被细胞摄取比例对比图；
图3为紫草素和米托蒽醌共载脂质体体外诱导ATP释放情况对比图；
图4为紫草素和米托蒽醌共载脂质体体外释放特性；
图5为紫草素和米托蒽醌共载脂质体体液循环过程中米托蒽醌与紫草素摩尔比例变化曲线；
图6为紫草素和米托蒽醌共载脂质体在肿瘤中米托蒽醌与紫草素摩尔比例变化曲线；
图7为紫草素和米托蒽醌共载脂质体在黑色素瘤模型中的肿瘤生长曲线及体重变化；
图8为紫草素和米托蒽醌共载脂质体在黑色素瘤模型中的诱导ICD效应及免疫细胞表达；
图9为紫草素和米托蒽醌共载脂质体在黑色素瘤模型中的细胞因子变化；
其中，LipSHK：紫草素单载脂质体，LipMIT：米托蒽醌单载脂质体，LipMS：米托蒽醌、紫草素共载脂质体，LipM+LipS：米托蒽醌、紫草素单载脂质体混合物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1
一种包含紫草素和盐酸米托蒽醌共载脂质体的制备方法，其主要包括如下步骤：
(1)将氢化大豆卵磷脂(HSPC)、胆固醇(Chol)、PEG化磷脂(DSPE-mPEG2000)(质量比95.5：5.2：0.5)溶解于氯仿中，减压蒸发除去有机溶剂，形成干燥的脂膜；
(2)加入200mM葡萄糖酸铜溶液(三乙醇胺调pH至7.4)，于55-65℃条件下水化30min后，通过聚碳酯滤膜进行整粒，形成脂质体膜内外均为葡萄糖酸铜溶液的纳米尺寸脂质体，利用琼脂糖凝胶色谱柱交换脂质体外水相为HEPES缓冲盐；
(3)向步骤(2)制备的脂质体中加入紫草素的DMSO溶液，于55-65℃下孵育30min，然后再加入盐酸米托蒽醌水溶液，继续孵育30min，冷却5min即得双载药脂质体。
使用马尔文粒径测定仪对载药脂质体进行表征，载药脂质体粒径为120nm左右，PDI小于0.1，Zeta电位为-14mV左右；使用葡聚糖凝胶G-50柱层析检测脂质体的包封率，两种药物的包封率均在95％以上，药脂比均为0.1。用Hitachi HT7700透射电子显微镜表征脂质体形态，粒径均一，表面圆整。
实施例2
筛选共载制剂中盐酸米托蒽醌与紫草素的协同比例
1、通过细胞毒性试验筛选协同比例
取对数生长期细胞B16F10(黑色素瘤细胞)以每孔3000个细胞铺于96孔板中，贴壁12h，按实施例1的方法制备不同摩尔比(米托蒽醌：紫草素＝10:1,5:1,2:1,1:1,1:2,1:5,1:10,1:20)的紫草素和米托蒽醌共载脂质体，制备不同摩尔比(米托蒽醌：紫草素＝10:1,5:1,2:1,1:1,1:2,1:5,1:10,1:20)的脂质体、紫草素和盐酸米托蒽醌水溶液物理混合物，分别用培养液稀释成所需浓度(共载脂质体浓度梯度：10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.312μg/ml、0.156μg/ml、0.078μg/ml、0.039μg/ml；物理混合物浓度梯度:2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.312μg/ml、0.156μg/ml、0.078μg/ml、0.039μg/ml、0.020μg/ml、0.005μg/ml)每孔加入0.2ml药溶液，每个浓度6个平行孔。培养箱中孵育48h后，加入20μl 5mg/ml的噻唑蓝，于培养箱中继续孵育4h，倒出溶液，加入200μl DMSO，振摇均匀后用酶标仪在波长490nm下测定吸光度，计算细胞的存活率。分别计算米托蒽醌和紫草素共载脂质体和物理混合物的联合指数(CI)，计算公式如下，实验结果如图1。
Figure BDA0002987508820000051
(Dx)1和(Dx)2分别为药物A、药物B单独作用于细胞产生x％的抑制率时的剂量，(D)1和(D)2分别为药物A和药物B联用时作用于细胞产生x％的抑制率时的剂量。CI＝1为相加作用,CI<1为协同作用，CI>1为拮抗作用；
实验结果表明，物理混合物实验组，不同比例米托蒽醌与紫草素均表现为细胞毒拮抗或相加作用；米托蒽醌与紫草素共载脂质体实验组，两药在不同比例配比下大部分表现为协同作用。
2、摄取实验验证共载脂质体筛选协同比例的合理性
取对数生长期细胞B16F10(黑色素瘤细胞)以每孔250000个细胞铺于6孔板中，贴壁12h，按实施例1的方法制备不同摩尔比(米托蒽醌：紫草素＝5:1,2:1,1:1,1:5)的紫草素和米托蒽醌共载脂质体，制备不同摩尔比(米托蒽醌：紫草素＝5:1,2:1,1:1,1:5)的脂质体、紫草素和盐酸米托蒽醌水溶液物理混合物，分别用培养液稀释至药物总浓度为5μg/ml，培养箱中培养4h或8h，刮取细胞，超声破碎细胞，酶标仪测定两种药物含量，计算两种药物的摄取比例，实验结果如图2。
实验结果表明，细胞摄取后，紫草素和米托蒽醌共载脂质体仍能够保持其特定比例，但物理混合物实验组的摄取比例与设定比例存在明显差异，因此，相比于物理混合物，共载脂质体筛选协同比例更合理。
实施例3
盐酸米托蒽醌和紫草素共载脂质体协同诱导ICD效应比例的筛选
取对数生长期细胞B16F10(黑色素瘤细胞)以每孔100000个细胞铺于24孔板中，贴壁12h，按实施例1的方法制备不同摩尔比(米托蒽醌：紫草素＝10:1,1:1,1:10)的紫草素和米托蒽醌共载脂质体，制备紫草素单载脂质体，制备米托蒽醌单载脂质体，用培养基稀释单载及共载脂质体溶液至脂质体包含总药量为5μg/ml，培养箱中孵育24小时，使用ATP试剂盒测定细胞在培养基中释放的ATP浓度。实验结果如图3。
结果表明，不同摩尔比的紫草素和米托蒽醌共载脂质体能够在体外协同诱导ICD效应标志物ATP的释放。
实施例4
米托蒽醌和紫草素共载脂质体的体外释放实验
按实施例1制备紫草素和米托蒽醌共载脂质体(盐酸米拖蒽醌与紫草素的摩尔比为1：1和2：1)，脂质体中药物总浓度为1mg/ml，取500μl共载脂质体装入分子量8000-13000的透析袋中，放入30ml不同的分散介质中(含5％无水乙醇pH分别为7.4、6.5、5.0的PBS缓冲液、含5mM谷胱甘肽和5％无水乙醇的pH为6.5的PBS缓冲液)，于37℃以100rpm转速震荡，在特定时间点取1ml分散介质，并补等体积的分散介质。用酶标仪测定药物荧光强度，计算两种药物的累计释放量(紫草素：激发波长510nm，发射波长620nm；米托蒽醌：激发波长590nm，发射波长680nm)。实验结果如图4。
结果表明，在pH7.4的PBS缓冲液中，不同药物比例的共载脂质体中药物的释放量都非常少，小于20％，随着pH的降低，两种药物的累积释放量随之增多；加入5mM谷胱甘肽后，药物累积释放量明显增加，证明紫草素和米托蒽醌共载脂质体具有pH、还原双响应释放特性。
实施例5
紫草素、米托蒽醌共载脂质体的药物动力学实验
将40只体重为180-200g的SD大鼠随机分为4组，给药前禁食12h，给药前1h称重。分别为单载混合脂质体组(米托蒽醌与紫草素摩尔比为1：1)、单载混合脂质体组(米托蒽醌与紫草素摩尔比为2：1)、共载脂质体组(米托蒽醌与紫草素摩尔比为1：1)和共载脂质体组(米托蒽醌与紫草素摩尔比为2：1)，给药剂量采用两种药物的总药量为5mg/kg。于特定时间点0.083，0.4，0.2，1，2，4，8，12，24，48h眼眶取血0.3ml于涂肝素钠的EP管中，12000rpm离心3min，取上清贮存于-80℃。酶标仪测定血浆中药物浓度，计算药动学参数。实验结果如图5，药动学参数如表2。
表2紫草素和米托蒽醌共载药脂质体的药动学参数
Figure BDA0002987508820000071
结果表明，相对于单载药混合脂质体来说，共载脂质体能够基本维持设定的药物比例不变，有助于药物以协同比例在肿瘤部位蓄积，发挥协同抗肿瘤效果。
实施例6
紫草素和米托蒽醌共载脂质体瘤内蓄积实验
将处于对数生长期的B16F10(黑色素瘤)细胞接于体重为18-20g雌性C57BL/6小鼠的右后侧，共18只，当肿瘤体积达到200mm3时，将荷瘤小鼠随机分成3组：共载脂质体组(紫草素、米托蒽醌摩尔比1：1)、单载混合脂质体组(紫草素、米托蒽醌摩尔比1：1)、物理混合物组(紫草素、米托蒽醌摩尔比1：1)，给药剂量两药总剂量为5mg/kg，于6h、24h将鼠处死，取其肿瘤，用酶标仪测定肿瘤中的药物含量。实验结果如图6。
结果表明，相较于单载脂质体和溶液剂物理混合物，共载脂质体能够维持药物以协同比例在肿瘤内蓄积。
实施例7
紫草素和米托蒽醌共载脂质体药效实验
将处于对数生长期的B16F10(黑色素瘤)细胞接于体重为18-20g雌性C57BL/6小鼠的右后侧，共24只，当肿瘤体积达到80mm3时，将荷瘤小鼠随机分成八组：生理盐水组、Doxil组(2mg/kg)、紫草素单载脂质体组(6mg/kg)、米托蒽醌单载脂质体组(6mg/kg)、紫草素和米托蒽醌共载脂质体组(米托蒽醌、紫草素摩尔比为10：1，1：1，1：10，两药总剂量4mg/kg)、单载混合脂质体(比例1：1，两药总剂量4mg/kg)。尾静脉给药，每三天给药一次，共给药4次。每两天量一次肿瘤长、宽，计算肿瘤体积，记录一次小鼠体重。(肿瘤体积＝长径×短径2/2)，实验结果如图7。
结果表明，相较于单载脂质体，紫草素和米托蒽醌共载脂质体能够起到协同抗肿瘤的效果，可以更好的抑制肿瘤生长，同时小鼠体重没有明显变化。
实施例8
紫草素和米托蒽醌共载脂质体诱导抗肿瘤免疫反应考察
取实施例7中治疗后荷瘤鼠的肿瘤，4％多聚甲醛固定，制作石蜡切片，后进行免疫组化实验。二甲苯，梯度乙醇脱蜡，抗原修复液修复，3％H2O2 37℃孵育12h脱黑色素，5％山羊血清37℃封闭20min，一抗anti-CRT，anti-HMGB1，anti-LC-3B，anti-CD80，anti-CD4，anti-CD8，anti-Foxp3 4℃孵育过夜，PBS洗涤除去多余一抗，二抗孵育，三抗孵育，苏木素染核30s，中性树胶封片，正置显微镜拍照，imageJ软件量化阳性表达，计算阳性率，实验结果如图8。同时，使用Ellisa试剂盒测小鼠血清中肿瘤相关细胞因子的表达。实验结果如图9。
结果表明，紫草素和米托蒽醌共载脂质体相较于单载脂质体可以协同诱导ICD效应，更好的激活抗肿瘤的免疫反应，同时共载脂质体还能够调节肿瘤抑制微环境，下调免疫抑制细胞调节性T细胞，促进免疫原性细胞因子的表达，减少免疫抑制细胞因子的表达。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种具有协同效应的药物组合物，其特征在于，其包括紫草素和蒽环类化疗药，所述蒽环类化疗药为阿霉素，表阿霉素，吡柔比星，柔红霉素，阿柔比星，伊达比星，安柔比星，米托蒽醌中的一种或二种以上。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述紫草素与蒽环类化疗药的摩尔比为1-100：100-1。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述蒽环类化疗药为米托蒽醌或阿霉素；所述紫草素与米托蒽醌的摩尔比为1-20：20-1，紫草素与阿霉素的摩尔比为10：1-1：10。
4.一种包含权利要求1-3任一项所述的药物组合物的共载脂质体，其特征在于，所述共载脂质体采用主动载药方式包封紫草素和蒽环类化疗药于脂质体内，紫草素和蒽环类化疗药总重量与共载脂质体的重量比为1:50-1:5，包封率均高于95％，粒径50-130nm，且具有pH/GSH双响应释放特性。
5.权利要求4所述的共载脂质体的制备方法，其特征在于，其主要包括以下步骤：
(1)将氢化大豆卵磷脂、胆固醇、PEG化磷脂溶解于易挥发的有机溶剂中，减压蒸发除去有机溶剂，形成干燥的脂膜；
(2)加入铜离子盐溶液，水化处理，通过滤膜进行整粒，形成纳米尺寸的脂质体，利用琼脂糖凝胶色谱柱交换脂质体外水相；
(3)向步骤(2)制备的脂质体中加入紫草素的DMSO溶液，孵育处理后，加入蒽环类化疗药水溶液，继续孵育处理，冷却后即得双载药脂质体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷或正己烷。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述铜离子盐溶液为葡萄糖酸铜水溶液，浓度为50-300mM，pH为3.5-8.0；所述水化处理的条件为：于55-65℃条件下孵育10-200min；所述滤膜为聚碳酯滤膜，滤膜孔径为0.1-0.45μm。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述孵育处理具体过程为：于55-65℃下孵育30-200min。
9.权利要求1-3任一项所述的药物组合物和权利要求4所述的共载脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤。
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