CN114949227B

CN114949227B - 一种提高icd诱导剂的方法及其应用

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Publication number: CN114949227B
Application number: CN202210516787.1A
Authority: CN
Inventors: 刘洪卓; 李金菠; 周双
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2022-05-12
Filing date: 2022-05-12
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2042-05-12
Also published as: CN114949227A

Abstract

本发明属于联合用药领域，具体涉及一种提高ICD诱导剂(基于自噬抑制剂与ICD诱导剂联合给药)的方法及其应用。将自噬抑制剂与ICD诱导剂联合使用。本发明基于自噬抑制剂与ICD诱导剂联合给药增加ICD诱导剂的抗肿瘤效果，并且为实现效果将碱性自噬抑制剂包封于脂质体内，利用磷酸化核苷类似物制备pH梯度的空白脂质体，加入自噬抑制剂进行孵育载药，进一步增加了自噬抑制剂与ICD诱导剂联合后的抗肿瘤效果。

Description

一种提高ICD诱导剂的方法及其应用

技术领域

本发明属于联合用药领域，具体涉及一种提高ICD诱导剂(基于自噬抑制剂与ICD诱导剂联合给药)的方法及其应用。

背景技术

近来，癌症已成为导致人类死亡的主要原因之一。目前癌症的主要治疗方法有手术治疗，药物化疗，放疗，免疫治疗等等。随着PD-1/PD-L1的成功上市，免疫疗法成为癌症治疗的新星，越来越多地得到了人们的关注。单一免疫疗法存在响应率低，个体差异大等缺点，因此经常与化疗药联用增加其治疗效果。其中，免疫原性细胞死亡(ICD)诱导剂具备化疗-免疫疗法双重作用机制，药物分子，如阿霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫草素等不仅能够诱导肿瘤细胞凋亡，还能诱导肿瘤释放肿瘤相关抗原，激活机体抗肿瘤免疫反应，具有明显优势。虽具有化疗-免疫疗法双重作用效果，单一ICD诱导剂仍存在诱导免疫原性低，激活促进肿瘤生长的免疫抑制微环境，抗肿瘤作用差等缺点。为改善这些缺陷，常将ICD诱导剂与免疫检查点抑制剂、免疫激动剂等其他免疫疗法联合使用，重塑肿瘤免疫抑制微环境，增强抗肿瘤免疫活性。但常存在联用的免疫疗法经价格昂贵，全身给药造成严重毒副作用等问题，因此迫切寻找新的作用机制，增强单一ICD诱导剂诱导的抗肿瘤化疗-免疫疗法。

随着免疫检查点抑制剂的上市，免疫治疗越来越受到人们的关注。除了直接的免疫疗法以外，有些化疗药物也被发现能够诱导凋亡肿瘤细胞释放抗原，招募免疫细胞进一步杀伤肿瘤，该现象称为ICD现象。但是单个ICD诱导剂诱导的ICD效应通常会很弱，很难激发强烈的免疫反应，因此通常采用联用的方法增强ICD效应。自噬是ICD效应发生时伴随的一个重要现象，能够促进ATP的释放，诱导APC抗原提呈，进一步诱导细胞毒性T细胞增殖从而杀死肿瘤细胞。但是自噬同时也会吞噬部分相关抗原，从而减弱激活的免疫系统。

因此能够增强ICD效应的抗肿瘤作用是目前主要关注点。

发明内容

鉴于此，本发明旨在提供一种提高ICD诱导剂(基于自噬抑制剂与ICD诱导剂联合给药)的方法及其应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种提高ICD诱导剂的方法，将自噬抑制剂与ICD诱导剂联合使用。

所述将自噬抑制剂和ICD诱导剂共载于纳米制剂中共递送(药物理化性质相似可以同时用一种跨膜梯度包在一个脂质体中)或分别单载于纳米制剂中单载分别给药(若两种药性质相差较大时分别形成脂质体)。

所述自噬抑制剂和ICD诱导剂分别单载于纳米制剂，而后单载于纳米制剂的ICD诱导剂首先给药，再将单载于纳米制剂的自噬抑制剂给药，实现联合使用。

所述纳米制剂为脂质体。

所述脂质体中内水相包含磷酸化核苷、磷酸化核苷类似物及其可溶性盐溶液、普通pH梯度缓冲液、金属离子梯度中的一种或几种。其中，普通pH梯度缓冲液为柠檬酸缓冲液，硫酸铵缓冲液；金属离子梯度为铜离子梯度、锌离子梯度、铁离子梯度、锰离子梯度、镁离子梯度、钙离子梯度等含金属离子盐溶液，其中铜离子梯度可以为葡萄糖酸铜、硫酸铜、氯化铜、醋酸铜、硝酸铜等铜离子溶液。

进一步的说，脂质体中内水相为能够弥补两种药物联用时造成的抗原缺失。

进一步的说，脂质体中内水相结构式为R-(H PO₄)n-H₂PO₄,(n＝0，1，2),R代表核苷基团或者核苷类似物；优选为磷酸化核苷或其可溶性盐，更优选三磷酸化核苷或其可溶性盐，例如腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)、胸腺苷三磷酸(TTP)、尿苷三磷酸(UTP)等及其可溶性钠盐。结构为：

进一步的说，两种药物分别制备脂质体时，两种脂质体任意一个的内水相含磷酸化核苷、磷酸化核苷类似物及其可溶性盐溶液中一种或几种即可。

所述ICD诱导剂为能诱导内质网应激的化疗药，中药，光敏剂，诱导肿瘤细胞凋亡并产生ICD效应化合物；

其中，化疗药为蒽醌类，奥沙利铂，环磷酰胺，硼替左米等；

中药为紫草素、汉黄芩素，槲皮素，土木酸内酯等；

光敏剂为金丝桃素等；

诱导肿瘤细胞凋亡并产生ICD效应化合物为紫草素；

所述自噬抑制剂为氯喹、羟氯喹、硫酸羟氯喹及其可溶性盐溶液。

进一步的说，自噬抑制剂主动载药脂质体成分按质量百分比为磷脂组成：50％-95％磷脂，5％-50％胆固醇，0-5％的PEG化磷脂，内水相浓度为50-300mM的磷酸化核苷，5％-20％自噬抑制剂；外水相缓冲溶液可为PBS、HBS缓冲溶液等；

所述ICD诱导剂主动载药脂质体成分按质量百分比，磷脂组成：50％-95％磷脂，5％-50％胆固醇，0-5％的PEG化磷脂，内水相为金属离子梯度金属离子浓度100-300mM，外水相HBS缓冲溶液，5％-15％ICD诱导剂。

上述制备脂质体时所述脂质体载药温度30-65℃。

所述自噬抑制剂与ICD诱导剂的给入量分别依次为5-15mg/kg、5-15mg/kg。

所述ICD诱导剂与自噬抑制剂之间的给药时间间隔时间为12-24h。

一种所述方法的应用，所述方法在抗肿瘤中的应用。

本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：

本发明基于自噬抑制剂与ICD诱导剂联合给药增加ICD诱导剂的抗肿瘤效果，并且为实现效果将碱性自噬抑制剂包封于脂质体内，利用磷酸化核苷类似物制备pH梯度的空白脂质体，加入自噬抑制剂进行孵育载药，进一步增加了自噬抑制剂与ICD诱导剂联合后的抗肿瘤效果；具体为：

(1)本发明采用联用机制，将自噬抑制剂与ICD诱导剂联用能够增加单独ICD诱导剂的抗肿瘤作用。

(2)本发明将磷酸化核苷或其类似物作为内水相制备空白脂质体，磷酸化核苷结构中具有三个磷酸基团能够提供大量H⁺，使得该脂质体能够维持稳定的跨膜pH梯度，包载碱性药物。

(3)本发明采用经磷酸化核苷或其类似物修饰的脂质体包载药物包封率高，减少了膜材的使用，便于工业放大生产。

(4)本发明的脂质体具有pH响应释放特性，减少了药物在血液循环中的泄露，保证了药物在肿瘤微环境中释放，从而发挥更好的抗肿瘤效果。

(5)本发明的内水相同样具备药理活性，能够增加自噬抑制剂与ICD诱导剂联用的抗肿瘤作用，减少了附加药物带来的潜在毒副作用。

附图说明

图1为本发明实施例提的药脂比与药物包封率的关系图；

图2为本发明实施例提的羟氯喹脂质体4℃稳定性；

图3为本发明实施例提的羟氯喹脂质体体外释放特性；

图4为本发明实施例提的磷酸化核苷空白脂质体在不同肿瘤模型中的肿瘤生长及体重变化曲线；

图5为本发明实施例提的羟氯喹脂质体在结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长曲线；

图6为实施例中提到的紫草素脂质体在结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长曲线；

图7为本发明实施例提的自噬抑制剂脂质体与ICD诱导剂联用不同给药顺序在肿瘤模型中的肿瘤生长曲线；

图8为本发明实施例提的给药顺序对肿瘤自噬相关指标的调节作用效果图；

图9为本发明实施例提的给药顺序对ICD效应相关指标的调节作用效果图；

图10为本发明实施例提的给药顺序对肿瘤免疫微环境中肿瘤细胞的调节作用效果图；

图11为本发明实施例提的羟氯喹脂质体与紫草素脂质体联用后在结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长；

图12为本发明实施例提的羟氯喹脂质体与紫草素脂质体联用后在结肠癌肿瘤模型中肿瘤生长曲线；

图13为本发明实施例提的羟氯喹脂质体与紫草素脂质体联用后在结肠癌肿瘤模型中诱导树突细胞DC，及IL-1β释放情况；

图14为本发明实施例提的羟氯喹脂质体与紫草素脂质体联用后在结肠癌肿瘤模型中招募CD8⁺T细胞的情况。

图15为本发明实施例提的紫草素脂质体与羟氯喹脂质体给药剂量联用后在结肠癌肿瘤模型中的肿瘤生长及体重变化及肿瘤体重对比。

其中，free HCQ：羟氯喹的氯化钠溶液，LipSHK：紫草素单载脂质体，LipHCQ、LipHCQa：羟氯喹单载脂质体(内水相为ATP)，LipHCQc：羟氯喹单载脂质体(内水相为柠檬酸缓冲溶液pH3.5)。

图16为本发明实施例提供的反应原理图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。

本发明首先探索自噬抑制剂能否增加ICD诱导剂的抗肿瘤效果，并针对联用用药方案的缺陷合理设计制剂，将碱性自噬抑制剂包封于脂质体内，该脂质体内水相为磷酸化核苷或其类似物，所制备的脂质体具有pH响应释放特性，同时内水相也具备一定的药理作用(参见图16)。该脂质体与ICD诱导剂紫草素脂质体联用后能够增加紫草素脂质体的抗肿瘤作用。

实施例1

包含羟氯喹主动载药脂质体的制备方法：

将氢化大豆卵磷脂(HSPC)、胆固醇(Chol)、PEG化磷脂(DSPE-mPEG2000)(质量比35.5：15.2：2.5)溶解于氯仿中，减压蒸发除去有机溶剂，形成干燥的脂膜；而后向脂膜中加入终浓度200mM的ATP·2Na(内水相)，于55℃条件下水化20min后，通过聚碳酯滤膜进行整粒，形成脂质体膜内外均为ATP·2Na(三磷酸腺苷二钠)的纳米尺寸脂质体，利用琼脂糖凝胶色谱柱交换脂质体外水相为PBS缓冲盐；向制备的空白脂质体中加入硫酸羟氯喹粉末，其中，药脂质比1：5(质量比)，于37℃下孵育20min，即得羟氯喹主动载药脂质体；同时以未添加药物的作为空白脂质体(即ATP空白脂质体)。

使用马尔文粒径测定仪对载药脂质体进行表征，载药脂质体粒径为120nm左右，PDI小于0.1，Zeta电位为-14mV左右；使用葡聚糖凝胶G-50柱层析检测脂质体的包封率，药物的包封率均在98％以上，载药量达16.7％。用Hitachi HT7700透射电子显微镜表征脂质体形态，粒径均一，表面圆整。

实施例2处方筛选

1.筛选制剂中内水相种类

固定实施例1记载的制备脂质体成分用量不变，以及制备过程不变，仅采用不同内水相，选取内水相，向脂膜中加入终浓度70mM CMP·2Na(5’-胞苷一磷酸(钠盐)，最大溶解度)，终浓度200mM CTP·2Na(5’-胞苷三磷酸(钠盐))制备脂质体。按照药脂质量比1：5进行载药，同时，以未添加药物的作为空白脂质体(即CTP空白脂质体、CMP空白脂质体)实验结果如表1。

	包封率(％)
		200mM CTP·2Na	>95
70mM CMP·2Na	<30

结果表明，随着内水相核苷磷酸化程度得增加，溶解度增高，脂质体的包封率也随之增加。

2.载药时间的考察

固定其余处方不变，选取内水相最大溶解度70mM CMP制备脂质体。按照药脂质量比1：5进行载药，考察载药时间对包封率的影响，实验结果

表2。

	包封率(％)
		30min	<30
4h	～60
		8h	>95

实验结果表明，当内水相浓度较低时，随着载药时间的延长，包封率逐渐升高。

3.药脂比的考察

固定其余处方条件不变，选取不同药脂比进行载药，1：10，1：8，1：5，1：4，1：3，实验结果如图1。

实验结果表明，随着药脂比的增高，包封率先不变后降低，因此，优选药脂比为1：5。

实施例3羟氯喹主动载药脂质体的稳定性实验

将按实施例1制备的羟氯喹主动载药脂质体放置于4℃中存放，每7天测一次包封率、粒径、PDI。实验结果如图2。

结果表明，羟氯喹主动载药脂质体两周4℃稳定性良好。

实施例4羟氯喹脂质体的体外释放实验

按实施例1制备羟氯喹脂质体，脂质体中药物总浓度为1mg/ml，取500μl脂质体装入分子量8000-13000的透析袋中，放入30ml不同的分散介质中(pH分别为7.4、6.5、5.0的PBS缓冲液)，于37℃以100rpm转速震荡，在特定时间点取1ml分散介质，并补等体积的分散介质。用HPLC测定药物浓度，计算两种药物的累计释放量。实验结果如图3。

结果表明，在pH7.4的PBS缓冲液中，脂质体中药物的释放量较少，小于20％，随着pH的降低，药物的累积释放量随之增多，表明羟氯喹主动载药脂质体具备pH响应释放特性。

实施例5以磷酸化核苷为内水相的空白脂质体药效及安全性的考察

以磷酸化核苷为内水相的空白脂质体为将氢化大豆卵磷脂(HSPC)、胆固醇(Chol)、PEG化磷脂(DSPE-mPEG2000)(质量比35.5：15.2：2.5)溶解于氯仿中，减压蒸发除去有机溶剂，形成干燥的脂膜；而后向脂膜中加入终浓度200mM的ATP·2Na或CTP·2Na(内水相)，于55℃条件下水化20min后，通过聚碳酯滤膜进行整粒，形成脂质体膜内外均为ATP·2Na、CTP·2Na的纳米尺寸脂质体，利用琼脂糖凝胶色谱柱交换脂质体外水相为PBS缓冲盐，使用三倍柱体积的PBS饱和琼脂糖凝胶色谱柱，将制备好的粒径均一的内水相内外均为ATP·2Na、CTP·2Na的纳米尺寸脂质体分别至于压干的琼脂糖凝胶色谱柱上，压干脂质体后加入PBS，根据分子排阻的原理，纳米尺寸的脂质体会先流出色谱柱，未包封的内水相会与脂质体分开，从而实现置换外水相为PBS的过程。

将处于对数生长期的4T1(乳腺癌)和CT26(结肠癌)细胞分别接于体重为18-20g雌性BALB/c小鼠的右后侧，建立两种肿瘤模型，当肿瘤体积达到100mm³时，将两种荷瘤小鼠分别随机分成三组：生理盐水组、内水相分别为浓度200mM CTP和ATP的两种空白脂质体组，给药体积200μl静脉给药，每三天给药一次，共给药4次。每两天量一次肿瘤长、宽，计算肿瘤体积，记录一次小鼠体重。(肿瘤体积＝长径×短径²/2)实验结果如图4。

实验结果表明，以磷酸化核苷作为内水相制备的空白脂质体在不同肿瘤模型中均没有抗肿瘤的作用，且对小鼠体重没有影响，表明使用磷酸化核苷作为内水相制备的空白脂质体安全，且所用剂量不会促进肿瘤生长。

实施例6以实施例1获得ATP为内水相羟氯喹主动载药脂质体药效学研究

将处于对数生长期的CT26(小鼠结肠癌)细胞接于体重为18-20g雌性BALB/c小鼠的右后侧，当肿瘤体积达到100mm³时，将荷瘤小鼠分别随机分成五组：生理盐水组，45mg/kg硫酸羟氯喹水溶液，5mg/kg，15mg/kg，45mg/kg不同浓度的羟氯喹脂质体，静脉给药，每三天给药一次，共给药4次。每两天量一次肿瘤长、宽，计算肿瘤体积。(肿瘤体积＝长径×短径²/2)实验结果如图5。

实验结果表明，自噬抑制剂羟氯喹游离药抗肿瘤作用很弱，包载于脂质体中后抑瘤效果略微增加，不存在剂量依赖性。

实施例7ICD诱导剂紫草素脂质(LipSHK)的制备及单药药效学研究

ICD诱导剂紫草素脂质(LipSHK)的制备过程为首先利用薄膜分散法制备空白脂质体，氢化大豆磷脂(HSPC)、胆固醇(Chol)、PEG化磷脂(DSPE-mPEG2000)质量比为95.5：5.2：0.5，内水相为200mM葡萄糖酸铜(三乙醇胺调pH7.4)溶液，外水相20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)+92mM氯化钠。将空白脂质体与紫草素的DMSO溶液于55-65℃下孵育30分钟，冷却5分钟即得载药脂质体。按照实施例5的方法建立CT26肿瘤模型，荷瘤小鼠分组：生理盐水组、5mg/kg紫草素单药脂质体、15mg/kg紫草素单药脂质体，静脉给药，每三天给一次药。记录小鼠的肿瘤体积。实验结果如图6。

实验结果表明，单独ICD诱导剂紫草素脂质体的抗肿瘤作用较弱，不存在剂量依赖性。

实施例8羟氯喹脂质体与ICD诱导剂紫草素脂质体联用给药顺序对药效影响的考察

将处于对数生长期的CT26(结肠癌)细胞分别接于体重为18-20g雌性BALB/c小鼠的右后侧，当肿瘤体积达到100mm³时，将荷瘤小鼠分别随机分成六组：生理盐水组，15mg/kg羟氯喹主动载药脂质体(按照实施例1制备方法，仅将内水相替换为柠檬酸缓冲液，添加量为300mM)，15mg/kg紫草素主动载药脂质体(按照实施例7的制备方法制备内水相为200mM葡萄糖酸铜pH7.4)，15mg/kg羟氯喹主动载药脂质体与15mg/kg紫草素主动载药脂质体联用3组(同时给药LipHCQc+LipSHK,先后给药，给药间隔24小时，LipHCQc→LipSHK,LipSHK→LipHCQc)静脉给药，每三天给药一次，共给药4次。每两天量一次肿瘤长、宽，计算肿瘤体积。(肿瘤体积＝长径×短径²/2)实验结果如图7。

实验结果表明，自噬抑制剂与ICD诱导剂联用以后相对于单一疗法，抗肿瘤作用得到增强；给药顺序不同，抗肿瘤活性不同，先注射ICD诱导剂紫草素脂质体，24小时后再注射自噬抑制剂羟氯喹脂质体药效最好。

实施例9自噬抑制剂与ICD诱导剂联用作用机制的考察

对制备所得各脂质体进行机制考察，按照文献ACS Nano.2019Nov26；13(11):12511-12524方法，对实施例8中药效结束后的肿瘤组织切片进行染色，其中，各实验组分为PBS、15mg/kg羟氯喹主动载药脂质体(按照实施例1制备方法，仅将内水相替换为柠檬酸缓冲液，添加量为300mM)，15mg/kg紫草素主动载药脂质体(内水相为200mM葡萄糖酸铜pH7.4)，15mg/kg羟氯喹主动载药脂质体与15mg/kg紫草素主动载药脂质体联用3组(同时给药LipHCQc+LipSHK,先后给药，给药间隔24小时，LipHCQc→LipSHK,LipSHK→LipHCQc)，实验结果如图8、9、10。

结果表明，相比于紫草素脂质体，与自噬抑制剂联用后，不同给药顺序均会使自噬被抑制，其中先给ICD诱导剂后给自噬抑制剂自噬抑制最严重，LC3B增加、p62增加最多。减少了对CRT，MHC-I等抗原的吞噬作用，其中先诱导ICD效应再抑制自噬使抗原表达量最大。不同给药顺序所诱导的CD8⁺T细胞的浸润无统计学差异。分析联用后对树突细胞的诱导情况，相对于单药紫草素，虽然不同给药顺序均诱导了更多抗原产生，但是树突细胞的数量并没有升高，分泌的能够诱导CD8⁺T细胞发挥作用的细胞因子，IL-1β的量也较少，ATP是促进ATP分泌的关键物质，但由于自噬与ATP释放有关，而ATP释放后，树突细胞才会被激活，诱导细胞毒性T细胞的肿瘤杀伤作用，因此与自噬抑制剂联用后，虽然药效得到增强，但最优给药顺序先给ICD诱导剂再给自噬抑制剂组仍有小鼠肿瘤在观察后期迅速增大，因此需要进一步考察ATP对药效的影响。

实施例10ATP为内水相对自噬抑制剂与ICD诱导剂联用药效学的影响

取实施例8中药效最好的给药顺利，先给ICD诱导脂质体再给自噬抑制剂对药效影响的研究。

具体为：将处于对数生长期的CT26(结肠癌)细胞分别接于体重为18-20g雌性BALB/c小鼠的右后侧，当肿瘤体积达到100mm³时，将荷瘤小鼠分别随机分成六组：生理盐水组，15mg/kg羟氯喹脂质体(内水相为柠檬酸缓冲液pH3.5，LipHCQc)，15mg/kg羟氯喹脂质体(内水相ATP·2Na,LipHCQa)，15mg/kg紫草素脂质体(内水相为200mM葡萄糖酸铜pH7.4)，15mg/kg紫草素脂质体→15mg/kg不同内水相(LipHCQa和LipHCQc)的羟氯喹脂质体两组(两组中ICD诱导剂脂质体和自噬抑制剂脂质体的给药间隔均为24h)，静脉给药，每四天给药一次，共给药4次。每两天量一次肿瘤长、宽，计算肿瘤体积，记录一次小鼠体重。(肿瘤体积＝长径×短径²/2)实验结果如图11、12。

实验结果表明，不同内水相的羟氯喹脂质体(LipHCQa和LipHCQc)抑瘤效果无明显差异，与自噬抑制剂联用后，ICD诱导剂的抗肿瘤作用得到了提高。相比于无药理活性的柠檬酸缓冲液，内水相为ATP·2Na的羟氯喹脂质体与ICD联用时药效更好，表明内水相ATP在联合方案中也发挥了药理作用。各组小鼠体重无明显下降，表明制剂安全性良好。

实施例11内水相ATP在自噬抑制剂脂质体与ICD诱导剂联用时药理作用的考察

取实施例10中治疗后PBS，15mg/kg紫草素脂质体→15mg/kg不同内水相(LipHCQa和LipHCQc)的羟氯喹脂质体两组(组别中荷瘤鼠的肿瘤，按照实施例9的方法对肿瘤切片中相关指标进行染色，实验结果如图13、14。

结果表明，相比于内水相为柠檬酸缓冲液，ATP作为内水相能够弥补的羟氯喹脂质体与ICD诱导剂联用后由于自噬抑制造成的ATP释放减少，从而成功诱导树突细胞成熟并促进树突细胞分泌IL-1β，最终成功激活CD8⁺T细胞的杀伤作用。

实施例12给药剂量对自噬抑制剂与ICD诱导剂联用药效学的影响

将处于对数生长期的CT26(结肠癌)细胞分别接于体重为18-20g雌性BALB/c小鼠的右后侧，当肿瘤体积达到100mm³时，将荷瘤小鼠分别随机分成：生理盐水组，15mg/kg紫草素脂质体(内水相为200mM葡萄糖酸铜pH7.4)→45mg/kg羟氯喹脂质体(内水相为200mMATP·2Na)，15mg/kg紫草素脂质体→15mg/kg羟氯喹脂质体，15mg/kg紫草素脂质体→5mg/kg羟氯喹脂质体，5mg/kg紫草素脂质体→45mg/kg羟氯喹脂质体，5mg/kg紫草素脂质体→15mg/kg羟氯喹脂质体，5mg/kg紫草素脂质体→5mg/kg羟氯喹脂质体，5mg/kg紫草素脂质体→2mg/kg羟氯喹脂质体(联用组紫草素脂质体的内水相均为200mM葡萄糖酸铜pH7.4，羟氯喹脂质体内水箱均为200mM ATP·2Na，ICD诱导剂脂质体和自噬抑制剂脂质体的给药间隔均为24h)，静脉给药，每四天给药一次，共给药4次。每两天量一次肿瘤长、宽，计算肿瘤体积，记录一次小鼠体重。(肿瘤体积＝长径×短径²/2)实验结果如图15。

实验结果表明，与不同给药剂量的紫草素脂质体，羟氯喹脂质体的最佳给药剂量为5mg/kg。与5mg/kg羟氯喹脂质体联用时，低剂量5mg/kg紫草素脂质体相比于高剂量脂质体，抗肿瘤效果更好。

Claims

1.一种自噬抑制剂与ICD诱导剂联合使用在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：将自噬抑制剂与ICD诱导剂联合使用在制备抗肿瘤药物中的应用；所述肿瘤为结肠癌；

所述ICD诱导剂为紫草素；所述自噬抑制剂为羟氯喹。

2.按权利要求1所述的应用，其特征在于：所述将自噬抑制剂和ICD诱导剂共载于纳米制剂中共递送或分别单载于纳米制剂中单载分别给药。

3.按权利要求2所述的应用，其特征在于：所述自噬抑制剂和ICD诱导剂分别单载于纳米制剂，而后单载于纳米制剂的ICD诱导剂首先给药，再将单载于纳米制剂的自噬抑制剂给药，实现联合使用。

4.按权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述纳米制剂为脂质体。

5.按权利要求4所述的应用，其特征在于：所述两种单载脂质体中至少有一种载药脂质体内水相包含磷酸化核苷、磷酸化核苷类似物及其可溶性盐溶液，另一种载药脂质体的内水相可以是普通pH梯度、金属离子梯度中的一种或几种。

6.按权利要求1所述的应用，其特征在于：所述自噬抑制剂与ICD诱导剂的给入量分别依次为5-15mg/kg、5-15mg/kg。

7.按权利要求3所述的应用，其特征在于：所述ICD诱导剂与自噬抑制剂之间的给药时间间隔时间为12-24h。