CN110302161A - 一种复合纳米脂质体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种复合纳米脂质体及其应用。所述的复合纳米脂质体中包括：大豆卵磷脂、叶酸修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000、胆固醇、光敏剂、化疗药和过氧化氢酶。该系统利用脂质体作为纳米载药系统，改善了药物的溶解度，降低了毒副作用，增加了对肿瘤部位的靶向性。本发明将光敏剂与抗癌药包裹在一起，通过细胞和活体抗肿瘤实验发现两种药物有很好的协同治疗效果；此外，负载过氧化氢酶，缓解了因光动力治疗而导致的肿瘤缺氧，增强了对肿瘤的抑制作用；并且，使用叶酸修饰的磷脂，实现对肿瘤的主动靶向，大大增强了抑瘤效果。

Description

一种复合纳米脂质体及其应用
技术领域
本发明涉及脂质体的制备方法、化疗与光动力协同治疗，特别涉及一种具有多机制协同抗肿瘤活性的纳米脂质体的制备及应用。
技术背景
癌症仍是世界上难以攻克的难题，目前癌症的主要临床治疗手段之一的化疗和放疗。化疗作为一种传统的治疗方法在临床癌症治疗中仍得到广泛的应用，而阿霉素是临床常用的化疗药物，但由于阿霉素在肿瘤部位的富集能力差、对心脏严重的毒副作用和易产生耐药性等缺点限制了治疗的效果。
光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)作为新兴的癌症治疗的手段之一，能够有效的实现对肿瘤的抑制作用。BODIPY类和菁染料类光敏剂具有许多特殊的理化性质，如：较大的摩尔消光系数和荧光量子产率，良好的热稳定性和光稳定性，并且通常还具有较好的光毒性和暗毒性。但此类化合物常常存在水溶性差，吸收率低，在病灶部位的富集量少，肿瘤内部缺氧等缺点，限制了其应用效果。因此，借助于纳米药物传递系统实现药物的病灶部位靶向递送、实现时间可控的药物释放是增加药物治疗功效，降低毒副作用的有效手段。因此，构建一种多功能的载药系统，探索多机制抗肿瘤物质的协同传递与应用，对肿瘤新型疗法的探索具有重要意义。
脂质体是由两亲性物质磷脂和其他两性化合物如胆固醇等分散到水相时形成的多层囊泡，自组装成脂质双分子层，疏水的尾部处于膜的中间，亲水的头部在内外表面层，形成亲水核心。囊泡内部为水相，通常作为包裹水溶性药物的场所；磷脂双分子层为疏水层，通常用于包裹脂溶性物质。脂质体具有很多优良的性质，如降低药物对非病灶部位的毒副作用、有效的提高药物的稳定性、增加药物在血液中的循环时间、实现药物的有效控制释放、具有很好的靶向性和生物相容性。基于此，以脂质体为主体，将不同类型的抗肿瘤分子进行协同传递与应用，是极有潜力的协同治疗新思路。
发明内容
本发明的目的即在于构建一种以脂质体作为纳米药物传递系统，将光动力治疗与传统的化疗联合在一起，并结合其它多种有效因素，达到增强协同抑制肿瘤的目的。
基于上述目的，本发明首先提供一种复合纳米脂质体，所述复合纳米脂质体中包括：大豆卵磷脂(SPC)、叶酸修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(FA- DSPE-mPEG2k)、胆固醇、光敏剂、化疗药和过氧化氢酶(Catalase)。
另一方面，本发明还提供上述复合纳米脂质体的制备方法，该方法包括如下步骤：
①将原料混合物溶于溶剂中，配制成质量浓度为3～10mg/ml的溶液；
所述的原料混合物使大豆卵磷脂(SPC)、叶酸修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(FA-DSPE-mPEG2k)、胆固醇、光敏剂和化疗药按照质量比80:10- 20:10-20:0.5-5:1-10的混合物；
所述的溶剂选自氯仿、乙醇或甲醇；
②将步骤①所得溶液中的溶剂蒸出，并干燥；然后加入磷酸缓冲溶液，反复冻融 3次；
③将步骤②的溶液匀质后过聚碳酸酯膜；
④向步骤③所得产物中加入过氧化氢酶，超声，过滤膜，得复合纳米脂质体。
本发明的设计基于利用脂质体作为纳米载药系统，负载上光敏剂和化疗药，实现化疗与光动力治疗的协同抗肿瘤治疗。此外，辅以叶酸修饰的连接聚乙二醇的磷脂(FA-DSPE-mPEG2k)，大大增强了对肿瘤的靶向性以及长循环作用，实现了药物的控制释放。进一步地，用脂质体包裹了过氧化氢酶，有效的缓解了肿瘤缺氧，提高了光动力治疗的效果。
本发明的复合纳米脂质体具有以下显著的特征：①粒径均匀、分布均一、稳定性好，光敏剂的吸收和发射波长在近红外区域(600-900纳米)。②可用于细胞荧光成像。③可见光及近红外波长的光照射时，可产生单线态氧并可用于肿瘤细胞的杀伤，是用于光动力治疗的理想光敏剂。④复合纳米脂质体包裹了过氧化氢酶，有效的避免了因肿瘤缺氧而导致的光动力治疗效果降低，提高治疗效果。⑤复合纳米脂质体由叶酸修饰，大大增加了药物在肿瘤部位的累积，减弱了对正常部位的毒副作用，实现了对肿瘤部位的主动和被动靶向(EPR效应)的双靶向的治疗效果。⑥将光动力治疗与传统的化疗联合并加强，实现优异的协同治疗肿瘤的作用。
因此，本发明另一方面的目的在于提供上述本发明复合纳米脂质体在制备肿瘤标记和治疗药物中的应用。尤其是用于光动力治疗和化疗治疗的复合治疗制剂。并尤其适用于恶性乳腺肿瘤。
附图说明
图1是FA-L@MD@CAT的基本表征和细胞毒性结果图；其中，(a)图是FA- L@MD@CAT的透射电镜成像，比例尺，200nm；(b)图是经动态光散射测定的FA- L@MD@CAT的粒径分布图；(c)图是L@D、L@M及L@MD对MCF7细胞暗毒性测试结果；(d)图是L@D、L@M及L@MD对MCF7细胞光毒性测试结果；(e) 图FA-L@MD@CAT与L@MD@CAT分别在正常细胞(COS7)和癌细胞(MCF7) 的细胞毒性实验；(f)图FA-L@MD@CAT和FA-L@MD@BSA在低氧下(2％氧气含量)的对MCF7细胞毒性实验。上述所涉及的细胞毒性实验，均为6个重复组取平均值，误差为其方差，光照条件为，波长：660nm,光照强度：40mW,光照时间： 20min。
图2是老鼠体内光动力-化疗联合抗肿瘤实验结果图；其中，(a)老鼠肿瘤治疗实验设计的时间轴；(b)是治疗结束后，不同治疗组老鼠肿瘤图。其中，A为PBS， B为PBS(L+)，C为L@CAT(L+)，D为L@D，E为L@M，F为L@M(L+)，G 为L@MD(L+)，M为FA-L@MD@BSA(L+)，N为FA-L@MD@CAT(L+)；(c) 是不同治疗组荷4T1肿瘤小鼠肿瘤生长曲线图；(d)是18天内不同治疗组荷瘤老鼠体重变化图。
图3是L@BP的基本表征和细胞毒性结果图；其中，(a)图是L@BP的透射电镜成像，比例尺，200nm；(b)图是经动态光散射测定的L@BP的粒径分布图；(c) 图是L@B、L@P及L@BP在甲醇中吸收图；(d)图是Liposome、L@B、L@P及 L@BP对MCF7细胞光毒性测试结果；(e)图是Liposome、L@B、L@P及L@BP 对COS7细胞光毒性测试结果；(f)图是Liposome、L@B、L@P及L@BP对4T1细胞光毒性测试结果。上述所涉及的细胞毒性实验，均为6个重复组取平均值，误差为其方差，光照条件为，波长：660nm,光照强度：10mW,光照时间：10min。
图4是老鼠体内光动力-化疗联合抗肿瘤实验结果图；其中，(a)是不同治疗组荷4T1肿瘤小鼠肿瘤生长曲线图；(b)是18天内不同治疗组荷瘤老鼠体重变化图； (c)是治疗结束后，不同治疗组老鼠肿瘤图。其中，A为PBS，B为PBS+NIR，C 为Liposome+NIR，D为L@P，E为L@B，F为L@B+NIR，G为L@BP，H为 L@BP+NIR，I为Free Br；J为Free Br+NIR。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的内容作进一步的说明：
本发明提供一种复合纳米脂质体，其包括：大豆卵磷脂(SPC)、叶酸修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(FA-DSPE-mPEG2k)、胆固醇、光敏剂、化疗药和过氧化氢酶(Catalase)。
具体的实施方式之一，所述的光敏剂为式I的化合物(MBDP)：
该光敏剂，即化合物MBDP与文献Dyes Pigm.2017,147,99-105 (DOI:10.1016/j.dyepig.2017.07.048)中记载一致。
另一具体的实施方式中，所述的光敏剂为式II的化合物(Cy5-Br)：
该光敏剂，即化合物Cy5-Br与文献Dyes Pigm.2017,149,633-638 (DOI:10.1016/j.dyepig.2017.11.010)中记载一致。
又一具体的实施方式中，所述的化疗药为盐酸阿霉素(Dox)。
再一具体的实施方式中，所述的化疗药为紫杉醇(PTX)。
当然上述对于光敏剂和化疗药物的选自可以自由组合，例如但不限于：使用 MBDP与Dox的组合，Cy5-Br与PTX的组合、MBDP与PTX的组合，或者Cy5- Br与Dox的组合。
更为具体的实施方式中，本发明所述的复合纳米脂质体通过薄膜分散-冻融-挤压相结合的方法制备，所述方法包括如下步骤：
①将原料混合物溶于溶剂中，配制成质量浓度为3～10mg/ml的溶液；
所述的原料混合物使大豆卵磷脂(SPC)、叶酸修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(FA-DSPE-mPEG2k)、胆固醇、光敏剂和化疗药按照质量比80:10- 20:10-20:0.5-5:1-10的混合物；更优选为80:10-20:0.5-2:1-5。
所述的溶剂选择的基本原则是至少能够基本溶解磷脂、胆固醇、MBDP和Dox 的有机溶剂，并且此有机溶剂能够易被去除。为了便于其余选定组分能够在更为适宜的溶剂气氛中获得更好的结合，以获得稳定性更高、粒径更为合适的脂质体，优选地，选用甲醇、乙醇、正丙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷中的一种或几种，更优选地选择甲醇、氯仿、二氯甲烷中的一种或几种。最优选自氯仿、乙醇或甲醇；
所述有机溶剂的用量可以在较宽范围内变动，优选地，根据所使用的固形物的总量，优选地，使混合物在溶剂中的浓度为1.6-30mg/ml，更优选为3-10mg/ml。
②将步骤①所得溶液中的溶剂蒸出，并干燥；然后加入磷酸缓冲溶液，反复冻融 3次；冻融温度为-20℃或-80℃，优选于-80℃；
所加入的磷酸缓冲溶液与步骤①中原料混合物的比例为0.03～0.6ml:1mg。
除去溶剂可以选择使用旋转蒸发仪，步骤①所得的混合溶液中的有机溶剂除去后可获得薄膜状的剩余物。优选地，除去有机溶剂的温度为40-60℃。
③将步骤②的溶液匀质后过聚碳酸酯膜；
具体地，将步骤②的溶液在40-65℃的水浴中过均质机，电压为30-45mV，压力为800-1000bar，循环10-50次；然后在40-65℃的水浴中过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次。过膜可使用经挤压器。
④向步骤③所得产物中加入过氧化氢酶，超声，过滤膜，得复合纳米脂质体。
具体地，选用浓度为1mg/ml的过氧化氢酶，并且使过氧化氢酶的体积与步骤③所得滤液体积比为1：9～99。超声后依次过0.45μm和0.2μm的微孔滤膜，各重复3 次，得到复合纳米脂质体。
本发明提供由上述方法得到的脂质体，作为药物载体应用。本发明所得的脂质体，尤其本发明的方法所得的脂质体，具有很好的稳定性，粒径均一，分布均匀。
实施例1
制备脂质体产品Ⅰ
(1)精密称取大豆卵磷脂80mg，FA-DSPE-mPEG2k 10mg和胆固醇10mg于 100ml圆底烧瓶中，在氮气保护的状态下，用20ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，放入真空干燥箱中于37℃下干燥，过夜。加入20ml的 PBS，用磁力搅拌器(660转/分)搅拌至完全溶解。将其放入-80℃冰箱中，反复冻融3次，得到溶液A。
(2)用高压均质机将溶液A匀质，电压为40mV，压力为800bar，水浴温度为 65℃，循环30次。将所得的溶液在65℃水浴下经挤压器依次通过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次，得到溶液B。
(3)取9.9ml(2)中所得的溶液B，加入0.1ml浓度为1mg/ml过氧化氢酶溶液(CAT)。超声，依次过0.45μm和0.2μm的滤膜，各重复3次，得到脂质体产品Ⅰ:空白脂质体包裹的过氧化氢酶(FA-L@CAT)。
制备脂质体产品Ⅱ
(1)精密称取大豆卵磷脂80mg，DSPE-mPEG2k 10mg，胆固醇10mg和光敏剂 MBDP1mg于100ml圆底烧瓶中，在氮气保护的状态下，用20ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，放入真空干燥箱中于37℃下干燥，过夜。加入20ml的PBS，用磁力搅拌器(660转/分)搅拌至完全溶解。将其放入- 80℃冰箱中，反复冻融3次，得到溶液A。
(2)用高压均质机将溶液A匀质，电压为40mV，压力为800bar，水浴温度为 65℃，循环30次。将所得的溶液在65℃水浴下经挤压器依次通过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次，得到脂质体产品Ⅱ:脂质体包裹的光敏剂(L@M)。
制备脂质体产品Ⅲ
(1)精密称取大豆卵磷脂80mg，FA-DSPE-mPEG2k 10mg，胆固醇10mg和光敏剂MBDP1mg于100ml圆底烧瓶中，在氮气保护的状态下，用20ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，放入真空干燥箱中于37℃下干燥，过夜。加入20ml的PBS，用磁力搅拌器(660转/分)搅拌至完全溶解。将其放入-80℃冰箱中，反复冻融3次，得到溶液A。
(2)用高压均质机将溶液A匀质，电压为40mV，压力为800bar，水浴温度为 65℃，循环30次。将所得的溶液在65℃水浴下经挤压器依次通过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次，得到脂质体制品Ⅲ：叶酸修饰的脂质体包裹的光敏剂 (FA-L@M)。
制备脂质体产品Ⅳ
(1)精密称取大豆卵磷脂80mg，DSPE-mPEG2k 10mg，胆固醇10mg和阿霉素 1mg于100ml圆底烧瓶中，在氮气保护的状态下，用20ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，放入真空干燥箱中于37℃下干燥，过夜。加入20ml的PBS，用磁力搅拌器(660转/分)搅拌至完全溶解。将其放入-80℃冰箱中，反复冻融3次，得到溶液A。
(2)用高压均质机将溶液A匀质，电压为40mV，压力为800bar，水浴温度为 65℃，循环30次。将所得的溶液在65℃水浴下经挤压器依次通过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次，得到，得到脂质体产品Ⅳ:脂质体包裹的阿霉素 (L@D)。
制备脂质体产品Ⅴ
(1)精密称取大豆卵磷脂80mg，DSPE-mPEG2k 10mg，胆固醇10mg，光敏剂 MBDP 1mg和阿霉素1mg于100ml圆底烧瓶中，在氮气保护的状态下，用20ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，放入真空干燥箱中于 37℃下干燥，过夜。加入20ml的PBS，用磁力搅拌器(660转/分)搅拌至完全溶解。将其放入-80℃冰箱中，反复冻融3次，得到溶液A。
(2)用高压均质机将溶液A匀质，电压为40mV，压力为800bar，水浴温度为 65℃，循环30次。将所得的溶液在65℃水浴下经挤压器依次通过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次，得到脂质体产品Ⅴ:脂质体包裹的光敏剂和阿霉素 (L@MD)。
制备脂质体产品Ⅵ
(1)精密称取大豆卵磷脂80mg，FA-DSPE-mPEG2k 10mg，胆固醇10mg，光敏剂MBDP1mg和阿霉素2mg于100ml圆底烧瓶中，在氮气保护的状态下，用20 ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，放入真空干燥箱中于37℃下干燥，过夜。加入20ml的PBS，用磁力搅拌器(660转/分)搅拌至完全溶解。将其放入-80℃冰箱中，反复冻融3次，得到溶液A。
(2)用高压均质机将溶液A匀质，电压为40mV，压力为800bar，水浴温度为 65℃，循环30次。将所得的溶液在65℃水浴下经挤压器依次通过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次，得到溶液B。
(3)取9.9ml(2)中所得的溶液B，加入0.1ml浓度为1mg/ml牛血清白蛋白溶液(BSA)。超声，依次过0.45μm和0.2μm的滤膜，各重复3次，得到Ⅵ：叶酸修饰的脂质体包裹的光敏剂和阿霉素以及牛血清白蛋白(FA-L@MD@BSA)。
制备脂质体产品Ⅶ
(1)精密称取大豆卵磷脂80mg，FA-DSPE-mPEG2k 10mg，胆固醇10mg，光敏剂MBDP1mg和阿霉素2mg于100ml圆底烧瓶中，在氮气保护的状态下，用20 ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，放入真空干燥箱中于37℃下干燥，过夜。加入20ml的PBS，用磁力搅拌器(660转/分)搅拌至完全溶解。将其放入-80℃冰箱中，反复冻融3次，得到溶液A。
(2)用高压均质机将溶液A匀质，电压为40mV，压力为800bar，水浴温度为 65℃，循环30次。将所得的溶液在65℃水浴下经挤压器依次通过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次，得到溶液B。
(3)取9.9ml(2)中所得的溶液B，加入0.1ml浓度为1mg/ml过氧化氢酶溶液(CAT)。超声，依次过0.45μm和0.2μm的滤膜，各重复3次，得到Ⅶ：叶酸修饰的脂质体包裹的光敏剂和阿霉素以及过氧化氢酶(FA-L@MD@CAT)。
实施例2
制备脂质体产品Ⅰ
(1)精密称取大豆卵磷脂80mg，FA-DSPE-mPEG2k 10mg，胆固醇10mg，光敏剂Cy5-Br1mg于100ml圆底烧瓶中，在氮气保护的状态下，用20ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，放入真空干燥箱中于37℃下干燥，过夜。加入20ml的PBS，用磁力搅拌器(660转/分)搅拌至完全溶解。将其放入-80℃冰箱中，反复冻融3次，得到溶液A。
(2)用高压均质机将溶液A匀质，电压为40mV，压力为800bar，水浴温度为 65℃，循环30次。将所得的溶液在65℃水浴下经挤压器依次通过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次，得到Ⅰ：脂质体包裹的光敏剂(L@B)。
制备脂质体产品Ⅱ
(1)精密称取大豆卵磷脂80mg，FA-DSPE-mPEG2k 10mg，胆固醇10mg，紫杉醇2mg于100ml圆底烧瓶中，在氮气保护的状态下，用20ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，放入真空干燥箱中于37℃下干燥，过夜。加入20ml的PBS，用磁力搅拌器(660转/分)搅拌至完全溶解。将其放入- 80℃冰箱中，反复冻融3次，得到溶液A。
(2)用高压均质机将溶液A匀质，电压为40mV，压力为800bar，水浴温度为 65℃，循环30次。将所得的溶液在65℃水浴下经挤压器依次通过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次，得到Ⅱ：脂质体包裹的光敏剂(L@P)。
制备脂质体产品Ⅲ
(1)精密称取大豆卵磷脂80mg，FA-DSPE-mPEG2k 10mg，胆固醇10mg，光敏剂Cy5-Br1mg和紫杉醇2mg于100ml圆底烧瓶中，在氮气保护的状态下，用20 ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，放入真空干燥箱中于37℃下干燥，过夜。加入20ml的PBS，用磁力搅拌器(660转/分)搅拌至完全溶解。将其放入-80℃冰箱中，反复冻融3次，得到溶液A。
(2)用高压均质机将溶液A匀质，电压为40mV，压力为800bar，水浴温度为 65℃，循环30次。将所得的溶液在65℃水浴下经挤压器依次通过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次，得到Ⅲ：脂质体包裹的光敏剂(L@BP)。
实施例3
对实施例1所制得的脂质体进行对比性能测试。
(1)性能测试实验1：制备脂质体产品FA-L@MD@CAT的形貌分析
取脂质体溶液FA-L@MD@CAT，通过Zeta电位与粒径分析仪(Malvern Zetasizer，Nanozs90)测得水合平均粒径为122.4nm，多分散系数(Poly Diversity Index，“PDI”)为0.129，ZETA电位值为-28mV。粒径分布图如图1中(b)所示。通过透射电镜(TEM，HT7700EXALENS)获得脂质体溶液FA-L@MD@CAT的 TEM图像，如图1中(a)所示。
(2)性能测试实验2：使用酶标仪测体外细胞毒性
为了评估体外细胞毒性，用96孔板孵育MCF7细胞，待细胞密度达到每孔1×104个细胞时，加入不同浓度梯度的L@D，L@M，L@MD(L@M：0.0625μM，0.125μM，0.25μM，0.5μM，1μM，2μM；L@D：0.25μM，0.5μM，1μM，2μM，4μM，8μM)，对比光毒性和暗毒性大小，即：空白脂质体，L@D，L@M，L@M(L+)，L@MD， L@MD(L+)。加药后，孵育2h，用660nm光对L@M(L+)组和L@MD(L+)组进行光照，光照强度为40mW，20min。将96孔板放入细胞培养箱中孵育24h后，用移液枪将96孔板的培养液移出，加入100μl 0.5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴盐(噻唑蓝，MTT)溶液，孵育4h后，生成紫色晶体-甲臜，用移液枪将96板中的溶液移出，加入100μl的二甲基亚砜(DMSO)，摇晃至晶体完全溶解，用酶标仪测每孔在490nm、570nm(ONK)和630nm(OD)处的吸光度值，测定结果如图7所示。用以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(OD dye–ODK dye)/(OD blank–ODK blank)
(3)性能测试实验3：动物实验
本实验老鼠购自于大连医科大学SPF实验动物中心，本研究是根据美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理与使用指南》进行的。动物实验方案经地方研究伦理审查委员会即大连理工大学动物伦理委员会(伦理批准号是2018-043)批准。本实验用6-8周的balb/c雌鼠和鼠源的乳腺癌细胞(4T1)构建老鼠肿瘤模型，在每只老鼠背部皮下接种4T1细胞100μl(约2x106个细胞)，待肿瘤体积达到90-100mm3时进行下一步实验。
老鼠肿瘤治疗实验，设立9个实验及对照组，每组3只重复，通过对比不同组老鼠肿瘤的体积大小观测治疗效果。以下为9组为：
a.对照组，PBS；
b.对照组(光照)，PBS(L+)；
c.空白脂质体包裹的过氧化氢酶(光照)，L@CAT(L+)；
d.脂质体包裹的阿霉素，L@D；
e.脂质体包裹的光敏剂MBDP，L@M；
f.脂质体包裹的光敏剂MBDP(光照)，L@M(L+)；
g.脂质体包裹的光敏剂和阿霉素(光照)，L@MD(L+)；
m.叶酸修饰的脂质体包裹的光敏剂、阿霉素和牛血清白蛋白(光照)，FA- L@MD@BSA(L+)；
n.叶酸修饰的脂质体包裹的光敏剂、阿霉素和过氧化氢酶(光照)，FA- L@MD@CAT(L+)。
本发明的老鼠肿瘤治疗实验按照图2中(a)所示的时间轴进行。尾静脉注射0.25mg/kg的光敏剂(0.1mg/kg的CAT/BSA)或0.5mg/kg的阿霉素，24h后治疗 (650nm灯，50mW，20min)一次，48h治疗第二次，72h治疗第三次。自注药后，每两天称老鼠体重和量肿瘤大小。由图2中(d)可知，老鼠体重没有明显的变化，由图2中(b)和(c)可知，L@MD(L+)组、FA-L@MD@BSA(L+)组和FA- L@MD@CAT(L+)组对肿瘤有明显的抑制作用，但L@MD(L+)组肿瘤体积仍有变大的趋势，说明加入叶酸靶向有助于肿瘤的治疗。FA-L@MD@CAT(L+)组比FA- L@MD@BSA(L+)组治疗效果更明显，说明过氧化氢酶能够有效的缓解因光动力治疗而导致的肿瘤缺氧，对肿瘤的抑制作用更好。
实施例4
对实施例2所制得的脂质体进行对比性能测试。
(1)性能测试实验1：制备脂质体产品L@BP的形貌分析
取脂质体溶液L@BP，通过Zeta电位与粒径分析仪(Malvern Zetasizer，Nanozs90)测得水合平均粒径为97.71nm，多分散系数(Poly Diversity Index，“PDI”)为0.155，ZETA电位值为-32mV。粒径分布图如图3中(b)所示。通过透射电镜(TEM，HT7700EXALENS)获得脂质体溶液L@BP的TEM图像，如图3中 (a)所示。
(2)性能测试实验2：对L@B和L@P及L@BP进行吸收光谱测试
在比色皿中加入3ml甲醇，用紫外可见分光光度计测试空白样品，向3ml的甲醇中加入200μl的待测液(Free PTX，L@P，Free Cy5-Br，L@B和L@BP)，测试样品的吸收曲线，如图3中(c)所示。
(3)性能测试实验3：使用酶标仪测体外细胞毒性
具体操作步骤同实施例3，性能测试实验2。其中，分别测试了在MCF7细胞(图 3中(d))、COS7细胞(图3中(e))和4T1细胞(图3中(f))中加入不同浓度梯度的空白脂质体Liposome,L@B，L@P，L@BP(L@M：0.016μM，0.031μM，0.063μM，0.125μM， 0.25μM，0.5μM，1μM，2μM；L@D：0.017μM，0.034μM，0.068μM，0.138μM， 0.275μM，0.55μM，1.1μM，2.2μM)，进行光毒性和暗毒性的测试。
(4)性能测试实验4：动物实验
老鼠肿瘤治疗实验，设立10个实验及对照组，每组3只重复，通过对比不同组老鼠肿瘤的体积大小观测治疗效果。以下为9组为：
A.对照组，PBS；
B.对照组(光照)，PBS+NIR；
C.空白脂质体(光照)，Liposome+NIR；
D.脂质体包裹的紫杉醇，L@P；
E.脂质体包裹的光敏剂Cy5-Br，L@B；
F.脂质体包裹的光敏剂Cy5-Br(光照)，L@B+NIR；
G.脂质体包裹的光敏剂和紫杉，L@BP；
H.脂质体包裹的光敏剂和紫杉醇(光照)，L@BP+NIR；
I.未被包裹的光敏剂Cy5-Br，Free Br；
J.未被包裹的光敏剂Cy5-Br(光照)，Free Br+NIR。
尾静脉注射0.125mg/kg的光敏剂或0.25mg/kg的阿霉素，24h后治疗(650nm 灯，20mW，10min)。自注药后，每两天称老鼠体重和量肿瘤大小。由图4中(b) 可知，老鼠体重没有明显的变化，由图4中(a)和(c)可知，L@BP+NIR组和 L@B+NIR对肿瘤有明显的抑制作用，其中，L@B+NIR仍然有上升的趋势，而 L@BP+NIR明显的使肿瘤体积减小并有痊愈的趋势。由此说明，通过脂质体将菁染料与紫杉醇包裹以实现光动力与化疗的联合治疗取得了明显的抑瘤效果，有望进一步应用于临床实验。

Claims (9)

1.一种复合纳米脂质体，其特征在于，所述复合纳米脂质体中包括：大豆卵磷脂、叶酸修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇、光敏剂、化疗药和过氧化氢酶。
2.根据权利要求1所述的复合纳米脂质体，其特征在于，所述的光敏剂为式I或式II的化合物：
通式II中，X是氢、氯或溴。
3.根据权利要求1所述的复合纳米脂质体，其特征在于，所述的化疗药为盐酸阿霉素或紫杉醇。
4.根据权利要求1所述的复合纳米脂质体，其特征在于，通过薄膜分散-冻融-挤压相结合的方法制备，所述方法包括如下步骤：
①将原料混合物溶于溶剂中，配制成质量浓度为3～10mg/ml的溶液；
所述的原料混合物使大豆卵磷脂、叶酸修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、胆固醇、光敏剂和化疗药按照质量比80:10-20:10-20:0.5-5:1-10的混合物；
所述的溶剂选自氯仿、乙醇或甲醇；
②将步骤①所得溶液中的溶剂蒸出，并干燥；然后加入磷酸缓冲溶液，反复冻融3次；
③将步骤②的溶液匀质后过聚碳酸酯膜；
④向步骤③所得产物中加入过氧化氢酶，超声，过滤膜，得复合纳米脂质体。
5.根据权利要求4所述的复合纳米脂质体，其特征在于，所述步骤②中所加入的磷酸缓冲溶液与步骤①中原料混合物的比例为0.03～0.6ml:1mg。
6.根据权利要求4所述的复合纳米脂质体，其特征在于，所述步骤③是将步骤②的溶液在40-65℃的水浴中过均质机，电压为30-45mV，压力为800-1000bar，循环10-50次；然后在40-65℃的水浴中过0.4μm和0.2μm的聚碳酸酯膜，各重复10次。
7.根据权利要求4所述的复合纳米脂质体，其特征在于，所述步骤④是向步骤③所得产物中加入1mg/ml过氧化氢酶，过氧化氢酶与步骤③所述的溶液体积比为1:9～1:99，超声后依次过0.45μm和0.2μm的微孔滤膜，各重复3次，得到复合纳米脂质体。
8.根据权利要求4所述的复合纳米脂质体，其特征在于，所述步骤①在氮气保护下进行。
9.权利要求1所述的复合纳米脂质体在制备肿瘤标记和治疗药物中的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110051632A (zh) * 2019-06-05 2019-07-26 燕山大学 一种增强型光动力抗肿瘤纳米载药系统及其制备方法和应用
CN112823666A (zh) * 2019-11-21 2021-05-21 江苏省农业科学院 一种同时含叶黄素和蛹虫草醇提物的纳米脂质体及其制备方法
CN112957329A (zh) * 2021-03-02 2021-06-15 中山大学 一种共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6314717A (ja) * 1986-07-07 1988-01-21 Shiseido Co Ltd リポソ−ム製剤
CN106798730A (zh) * 2017-03-09 2017-06-06 苏州大学 一种乏氧改善的顺铂前药脂质体制剂及其制备方法与应用
CN107432875A (zh) * 2017-09-05 2017-12-05 石河子大学 一种用于治疗肺肿瘤的功能性脂质体及其制备方法与应用
CN109394696A (zh) * 2018-12-03 2019-03-01 南京邮电大学 一种脂质体的制备方法及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6314717A (ja) * 1986-07-07 1988-01-21 Shiseido Co Ltd リポソ−ム製剤
CN106798730A (zh) * 2017-03-09 2017-06-06 苏州大学 一种乏氧改善的顺铂前药脂质体制剂及其制备方法与应用
CN107432875A (zh) * 2017-09-05 2017-12-05 石河子大学 一种用于治疗肺肿瘤的功能性脂质体及其制备方法与应用
CN109394696A (zh) * 2018-12-03 2019-03-01 南京邮电大学 一种脂质体的制备方法及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIQIAO HUANG，等: "Bromo-pentamethine as mitochondria-targeted photosensitizers for cancer cell apoptosis with high efficiency", 《DYES AND PIGMENTS》 *
HAIRONG WANG，等: "Photosensitizer-crosslinked in-situ polymerization on catalase for tumor hypoxia modulation & enhanced photodynamic therapy", 《BIOMATERIALS》 *
MINGLE LI，等: "A lysosome-targeted BODIPY as potential NIR photosensitizer for photodynamic therapy", 《DYES AND PIGMENTS》 *
QIAN CHEN，等: "Drug-induced co-assembly of albumin/catalase as smart nano-theranostics for deep intra-tumoral penetration, hypoxia relieve,and synergistic combination therapy", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110051632A (zh) * 2019-06-05 2019-07-26 燕山大学 一种增强型光动力抗肿瘤纳米载药系统及其制备方法和应用
CN112823666A (zh) * 2019-11-21 2021-05-21 江苏省农业科学院 一种同时含叶黄素和蛹虫草醇提物的纳米脂质体及其制备方法
CN112957329A (zh) * 2021-03-02 2021-06-15 中山大学 一种共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体及其制备方法和应用
CN112957329B (zh) * 2021-03-02 2022-07-26 中山大学 一种共载盐酸阿霉素-佛司可林的纳米脂质体及其制备方法和应用

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