CN104411335A

CN104411335A - 优化的皮下治疗药剂

Info

Publication number: CN104411335A
Application number: CN201380027958.3A
Authority: CN
Inventors: W·亨利; R·沃尔夫-加罗韦; J·C·梅奥; M·J·厄尔
Original assignee: Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd
Current assignee: Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd
Priority date: 2012-04-16
Filing date: 2013-04-16
Publication date: 2015-03-11
Also published as: EP2838566A2; KR102137290B1; ZA201407370B; CA2869993A1; CL2014002773A1; PH12014502314B1; AU2018200111B2; JP6550107B2; JP2019131593A; GEP201706716B; US20150086524A1; MX2020014208A; MD20140123A2; SG11201406492YA; AP2014008049A0; BR112014025737A2; NI201400122A; NZ701205A; GB201418864D0; GB201910190D0

Abstract

本发明提供一种用于皮下给药的方法和剂型，将所述治疗药剂改性，相对于所述治疗药剂的原始形态，以增加亲水性以及改变分子尺寸，其中，其C_max:C_average的比例低于静脉递送该药剂的C_max:C_average的比例。

Description

优化的皮下治疗药剂

本发明涉及一种皮下递送的治疗药剂(therapeutic agents)，以及对这些药剂的改性，以使它们适合皮下递送。

许多疏水(亲油)分子被用在治疗感染、疾病和失调(disorders)中。亲油分子通常是直接给药到病人的血液中，以确保快速的递送到感染、疾病等的部位。然而，这类分子的半衰期和/或生物利用度可能不是最优化的。静脉内给药的缺点包括局部和全身反应使得需要递送相对大量的药剂到患者以及静脉内给药并不方便。

本发明的发明人意外的发现，改性治疗药剂来增加该药剂的亲水性和分子尺寸，将得到不能直接进入血管系统的这样的药剂。然而，该改性药剂由于其具有由含水淋巴系统(aqueous lymphatic system)进入患者的循环系统的能力仍然为生物可利用的。选择改性是为了减少所述治疗药剂与结缔组织的表面粘附作用，并增加其在组织液中的溶解度。本发明的改性治疗药剂在被递送到皮下空间时便特别地有效，因为它们太大以至于难以直接从皮下空间进入血管系统，因而通过淋巴系统在周身输送，通过胸导管(thoracic duct)(右淋巴管和锁骨下静脉)进入循环系统。这样便意外地使得所述药剂可预测地、稳定地输注入患者体内的循环系统。因此，本发明涉及的是改性药剂的皮下递送，以使得该改性药剂的效果即寿命、输注速率(infusion rate)和清除速率以及由此而得的持续效果可以更好地被预测。这些的实现是通过使所述药剂更为亲水，并改变分子尺寸使得在皮下递送到患者时，所述改性药剂不能穿过血管壁进入血流，但却可通过组织液输送入淋巴系统。这将获得一种从淋巴系统到血管系统的可控的、可预测的释放。它消除了对递送位点周围的血管形成水平进行考虑的需求，如下所讨论的。

本发明可应用于多肽、生物分子，包括所有的血液因子、激素、抗生素、单克隆抗体和一些小分子。任何合适的改性都可以使用只要不会干扰该分子的治疗效果即可，并且通过增加亲水性以及改变它的分子尺寸(可包括改变药剂的分子量或者物理尺寸)，以此确保它不能在没有首先通过胸导管处的淋巴系统进入锁骨下的静脉下而直接进入血管(vasculature)。所选择的改性可以具有调节该药剂在体内清除(通过排泄、消化、免疫攻击或者其他方法)的伴随效果，从而该药剂的输注速率和清除速率将“平衡”至一个最佳治疗效果。

合适的改性的例子包括将所述药剂与聚合物的缀合，合适的生物相容性聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)、聚磷脂酰胆碱(poly-phosphatidyl choline)(PC)、聚丙二醇(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚环氧乙烷(PEO)、聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylated polyol)、聚烯醇(polyolefinic alcohol)、聚羟烷基甲基丙烯酸酯(polyhydroxyalkylmethacrylate)、多糖、聚α-羟基酸、聚乙烯醇、聚磷腈(polyphosphosphasphazene)、聚N-丙烯酰吗啉、聚烯烃氧化物聚合物(polyalkyene oxide polymers)、聚马来酸、聚DL-丙氨酸、羧甲基纤维素、右旋糖酐、淀粉或淀粉衍生物、透明质酸、甲壳素、聚甲基丙烯酸酯、聚唾液酸(PSA)、聚羟基链烷酸酯(polyhydroxy alkanoates)、聚氨基酸以及它们的组合。所述生物相容性聚合物可以具有线性或分支状结构。

所述生物相容性聚合物的其他例子为蛋白质，所述蛋白质选自但不限于：由白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白包括单克隆抗体、抗体片段如单域抗体(single-domain antibodies)、V_L、V_H、Fab、F(ab′)₂、Fab′、Fab3、scFv、di-scFv、sdAb、Fc以及它们的组合组成的组中。

改性所述治疗药剂的其他方法可以是通过使用融合蛋白(fusionproteins)；进入囊泡递送载体，例如脂质体、传递体(transfersomes)或者微胶粒(micelles)；进入/附着于树枝状大分子；形成所述药剂的低聚体复合物。所选择的改性可以具有调节体内该药剂在体内清除(通过排泄、消化、免疫攻击或者其他方法)的伴随效果，从而该药剂的输注速率和清除速率将“平衡”至一个最佳治疗效果。

所述改性药剂一旦被递送到皮下空间，便能够通过淋巴系统进入锁骨下静脉输注入血管系统中，然后这样的改性也控制了从体内对该药剂的清除通过的方式为可以以一定方式平衡和控制从皮下空间进入循环的输注速率与体内的药物产品的清除速率的比例从而优化所述改性药剂的治疗效率和效力。

可以通过这样的方式改性以用于皮下递送的所述治疗药剂的例子包括凝血因子(blood coagulation factors)。凝血级联涉及多个不同的蛋白质进而从多个方面去作用于彼此激活和促进血块的形成和维持健康的止血。在一些实施方式中，根据本发明的用于改性凝血因子选自因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子(von Willebrand’s Factor)和蛋白C组成的组中。在一些实施方式中，所述凝血因子更适于为因子VII、因子VIII或者因子IX。

本发明涉及的所述治疗药剂的例子包括，凝血因子VII(本文中称为FVII)，FVII为53000道尔顿(Da)，糖基化的(glycosylated)、维生素K依赖性的(Vitamin K dependent)、单链酶原、含有12个天然的二硫键(O’Haraet al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,84:5158-5162(1987))。该蛋白主要在肝中产生。FVII参与了外在的凝血级联(图1)。该蛋白形成有四个离散的结构域：一个N-端的γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域、两个表皮生长因子样(EGF)结构域和一个C-端丝氨酸蛋白酶结构域。在不存在它的辅因子组织因子(TF)(可在血管内皮下膜发现)时循环酶原显示出非常小的蛋白酶活性。随着血管受到损伤，FVII以高亲和力结合TF从而通过特异性裂解精氨酸152和异亮氨酸153之间的肽键以转换为活跃的、双链酶FVIIa。FVIIa的轻链由所述N-端Gla和EGF-样结构域组成并且其重链由丝氨酸蛋白酶结构域组成。所述重链和轻链则通过半胱氨酸135和半胱氨酸262之间的单一的二硫键紧密相连。一旦被激活，FVIIa迅速催化FX转换为FXa以及FIX转换为FIXa。然后FXa与FVa形成复合体的裂解凝血酶原(prothrombin)，以产生少量的凝血酶(Aitken,M.G.EMA,16:446-455(2004))。该凝血酶生成激活了血小板和血小板表面的辅因子V、VIII以及XI。该激活导致凝血酶大量形成，并引起纤维蛋白聚合和止血栓(haemostatic plug)的形成。

人类重组FVIIa已经开发并被Novo Nordisk商业化为(eptacog alfa[激活的],ATC码B02BD08)。获得了治疗已经分别引发有对抗FVIII或者IX的抑制性抗体的血友病A患者或者血友病B患者中的出血事件的许可(Jurlander et al.,Seminars in Thrombosis andHemostasis,27:373-383(2001)；Roberts et al.,Blood,15:3858-3864(2004))。从1996年推出后其治疗就已经证实为安全和有效的。然而，由于该蛋白质的体内半衰期比较短(2.3小时；许可的摘要概述(Summary Basisfor Approval)，FDA编号96-0597)，在单个出血事件的时间内需要多次输注高剂量的该产品(90μg·kg^-1)以实现止血。该产品的短半衰期，以及为了获得所期望的治疗效果所需的高剂量将排除在带有抑制物的血友病患者的预防性治疗的普通应用中。明显地，所以有必要开发具有增长的半衰期的FVIIa分子，并在药代动力学(PK)和药效学(PD)中有所改进。

因子VIII(FVIII)是一种重要的凝血因子也是熟知的抗血友病因子(AHF)。人类中，因子VIII是由F8基因编码。这个基因的缺乏导致血友病A，一种众所周知隐性X-连锁凝血功能障碍，在5000个男性中大约有1个受影响。

X连锁的F8基因通过26个外显子编码着2351个氨基酸的多肽并在信号肽裂解后转换为2332个氨基酸的成熟的FVIII分子(Wang et al.Int.J.Pharmaceutics,259:1-15(2003))。已经发现可通过血管、肾小球和肾小管内皮细胞(tubular endothelium)合成FVIII并释放到血流中，以及肝脏的肝窦细胞(sinusoidal cells)(尽管对此并不十分明确)是人类的主要释放位点。所述FVIII分子形成有六个蛋白质结构域；NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH。其成熟的分子含有一些翻译后修饰(post-translational modification)，包括N-连接和O-连接的糖基化、磺化和二硫键的形式。FVIII含有共计23个半胱氨酸残基，其中有16个在蛋白质结构域A和C中形成8个二硫键(McMullenet al.Protein Science,4:740-746(1995))。由于该蛋白质具有翻译后修饰，基于糖基化的程度和类型，它的循环分子量可高达330KDa。FVIII也要进行蛋白水解处理以使其循环的种类成为由重链(A1-A2-B)和轻链(A3-C1-C2)组成的异源二聚体。当FVIII被分泌到循环系统中时，它便以非共价的方式与冯维勒布兰德因子(vWF)结合。两个分子的结合涉及FVIII的轻链的结构域A3和C2(Lacroix-Desmazes et al.Blood,112:240-249(2008))。与vWF结合将增加FVIII的稳定性和循环的半衰期。虽然结合vWF增加了FVIII的循环的半衰期，但是它的天然半衰期为15-19小时。

因子VIII是一种参与内在的凝血通道(intrinsic blood coagulationpathway)的重要的辅因子。它在凝血级联中的作用是充当“成核模板”(nucleation template)以在激活的血小板表面上组织Fxase复合体的组件形成正确的空间定向(Shen et al.Blood,111:1240-1247(2008))。FVIII最初是被凝血酶(因子IIa)或FXa所激活，然后从vWF以FVIIIa的形式游离。然后FVIIIa在血管损伤的部位结合激活的血小板，并且通过A2和A3介导的相互作用(mediated interaction)结合FIXa。在血小板的表面上在Ca²⁺存在下FIXa与FVIII的结合将增加FIXa的蛋白水解活性至大约200000倍。其复合体再激活FX转换为FXa。而后因子Xa，与它的辅因子Va一起，激活更多的凝血酶。凝血酶依次裂解纤维蛋白原转变成纤维蛋白，然后聚合和交联(使用因子XIII)转化为纤维蛋白血块。

不再受vWF的保护时，被激活的FVIII是在过程中通过蛋白水解而失活(最显著地由活化的蛋白质C和因子IXa)并且迅速从血流清除。

因子IX(又称为克雷司马斯因子(Christmas factor)为凝血系统的丝氨酸蛋白酶，并且该蛋白质的缺陷将导致血友病B。因子IX是作为非活性的酶原前体而产生的，随后经过处理以去除信号肽，接着进一步糖基化而后通过因子XIa或者因子VIIa裂解，以产生由二硫键连接的双链的形式(Scipio etal J Clin Invest.1978；61(6):1528–1538)。一旦被激活为因子IXa并在Ca²⁺、膜磷脂以及因子VIII辅因子的存在下，它将水解因子X中的精氨酸-异亮氨酸键以形成因子Xa。因子IX通过抗凝血酶抑制。

血友病B是一种X-连锁的出血性疾病(X-linked bleeding disorder)，是由凝血因子IX基因过多的突变引起，并致使缺乏有效的促凝蛋白质。血友病B又是熟知的克雷司马斯病(Christmas disease)，是由非功能性的或者缺乏FIX(防止固有级联的正常启动)引起的后果。严重和潜在的威胁生命的出血事件可以通过及时给药足够量的FIX以得到改善。只要循环酶原是在治疗的范围内则止血即可维持。

有史以来，通过静脉递送血浆FIX或者凝血酶原复合体浓缩物，以及最近通过高纯化的血浆和重组FIX来治疗血友病B。来自于中国仓鼠的卵巢细胞(CHO细胞)的重组人类FIX的出现改变了克雷司马斯病的治疗使得预防性治疗成为可能特别是在小孩子中。然而该方式的限制因素为短半衰期和潜在的“超级效力”限制预防性治疗至大约3天的间隔。

医师在寻求治疗患者的血液凝固和其他病症所面临的问题为如何实现治疗药剂的长期治疗剂量，例如给予这类患者凝血因子组合物。另一个问题，尤其是这类药剂的预防性应用是保持可预测的、稳态水平的输注，以及体内治疗药剂的分布和清除，这样就避免了药剂水平及其效果出现锯齿形“爆发”或者“波峰”。

例如，凝血的调节是一个会存在多种主导性的健康问题的过程，包括未能形成血块和血栓，形成不需要的血块。防止不需要的血块的药剂被用在许多情况中并且可以得到多种药剂。遗憾的是，现在大多治疗方法具有不良的副作用。口服的抗凝血剂如华法林(Warfarin)通过抑制肝脏中维生素K的作用，从而防止维生素K依赖性蛋白质中谷氨酸残基的完全羧基化，导致循环系统中的活性蛋白浓度下降并降低了形成血块的能力。华法林治疗较为复杂在于该药物与它的靶标的竞争性。饮食维生素K的波动可能导致过多剂量或过低剂量的华法林。凝结能力的波动是这种治疗的不良效果。

注入的物质如肝素，包括低分子量的肝素，也常用的抗凝血剂。再次，这些化合物需要过量给药并且必须仔细监测。

另一种限制治疗性多肽的使用的现象为一些多肽显示出的相对短的体内半衰期。总的来说，短体内半衰期的问题意味着治疗性糖肽类必须频繁地且高剂量地给药，这最终将转换为更高风险的局部不良反应和更高的医疗费用，与假设存在的又可能必要的维持治疗糖蛋白的治疗有效水平更长的更有效的方法相比。

确保治疗药剂通过淋巴系统递送的能力提供了该药剂的可控输注。增加的亲水性将避免该分子被降解酶、免疫系统等损坏。此外，在水中增加的移动性使得所述治疗药剂生物相容性更好，因此获得更低的剂量需求。这反过来又可以获得更少的副作用、更有效的治疗和在医师的照顾中花费的时间减少。

本发明的发明人出人意料的展示了当根据本发明的改性和递送至皮下空间时可以系统地获得一种更持续‘稳态’(steady state)水平的治疗药剂。该‘稳态’的增加持续性可以归因于通过淋巴系统进入血管系统速率(即输注)(平衡了代谢速率和/或免疫系统的降解速率)与通过肾脏或胃肠道(GItract)清除速率的结合。

根据本发明的改性药剂的皮下递送，因此，可以在减轻了反复团注(bolusinjection)递送时使得“锯齿”波峰和波谷常见。然而，皮下递送可以给药大剂量使得C_max为与静脉注射所达到的相同，在这种情况下，由于通过淋巴系统进入血管系统中输注速率减慢，将会获得改性药剂的持续更长的治疗效果。因此，本发明可以得到低频率给药的结果。或者，当根据本发明采用皮下递送时，可以采用相同的给药频率但更低的剂量，以替代静脉递送。

换句话说，在给定的持续时间内(如4天)改性药剂的皮下给药剂量的C_max:C_average比例低于静脉注射同样剂量时的。这明显是一个优势，因为改性药剂在血液中水平更为一致的。

如本领域技术人员所理解得，低C_max可能有利于患者，即C_max:C_average或者C_max:C_min的比例更低(即相比于静脉注射药物的典型的“锯齿”图时波峰和波谷的曲线变平)。

因子VIIa，例如，说明了这个问题并且其改性也显示出本发明的技术方案。人类中的因子VII和VIIa具有的循环的半衰期大约为2-4小时。也就是说，在2-4小时之内，血清中的肽浓度被减少一半。当使用因子VIIa作为促凝血剂(procoagulant)去治疗某种血友病时，标准的规程为每两个小时注射VIIa并以高剂量注入(45-90μg/kg体重，参见，Hedner et al.,Transfus.Med.Rev.7:78-83(1993))。因此，使用这些蛋白质作为促凝血剂或者抗凝血剂(如因子VII的这种情况)要求所述蛋白质在频繁的间隔内给药并且以高剂量给药。

生化药物与生物相容性聚合物缀合目前已经成功地用于提高这样的治疗产品的物理化学特性。通过缀合进行改良的蛋白质的特性包括PK、PD和免疫原性。将化学基团附着于蛋白质可以显著地提高其循环半衰期(Jevsevaret al.,Biotechnol.J.,5:113-128(2010))。对于分子量低于肾小球滤过限制的分子种类大分子量部分的缀合可以防止产品的肾清除率。并且，化学基团添加到药物产品上可以通过空间位阻防止受体介入移除该分子。

使用分子改性，例如生物相容性聚合物可以使所述治疗药剂更具亲水性从而可以有助于减少或防止对引入的治疗药剂的免疫反应。改性提供了一个‘水屏障’(shield of water)包围着所述药剂，其可以‘隐藏’任何可能引起免疫系统响应的表位(epitopes)。在水溶液中所述改性药剂周围存在的水分子可以形成笼形结构(clathrate structure)。

此外，使用所述改性可以使得皮下递送所述药剂通过淋巴系统逐步治疗药剂引入体内，避免与团注或者静脉大剂量输注相关的反应，例如与静脉注射给定抗生素相关的“红色人综合征”(red-man syndrome)。

因此，可以预料的是通过改性这样的治疗药剂以用于皮下递送并随后通过淋巴系统后续输注到血管系统中将获得许多优势。

因此，本发明提供，作为第一方面，一种对患者给药治疗药剂的方法，该方法包含对患者皮下给药所述治疗药剂，使其C_max:C_average的比例小于静脉递送该药剂时C_max:C_average的比例，其中，将所述治疗药剂改性，相对于所述治疗药剂的原始形态，以增加亲水性以及改变分子尺寸。相比于静脉给药，皮下给药可以使得在治疗期间这样的药剂在患者的血流中更为一致的浓度，这致使C_max:C_average的比例得到降低。

本发明还提供一种对患者的淋巴系统给药治疗药剂的方法，该方法包括下皮下给药所述治疗药剂的步骤，使得该治疗药剂不在注射部位直接进入患者的循环系统，并且其中，将所述治疗药剂改性，相对于所述治疗药剂的原始形态，以增加亲水性以及改变分子尺寸，使得该改性药剂无法直接从给药部位进入循环。

本发明还提供了一种在对患者皮下给药治疗药剂时防止所述治疗药剂直接进入患者的局部循环系统的方法，该方法包括对患者皮下给药该改性药剂的步骤，其中，将所述治疗药剂改性，相对于所述治疗药剂的原始形态，以增加亲水性以及改变分子尺寸。

皮下给药所述改性治疗药剂使得患者被给药到比通过静脉团注更高剂量的该药剂；使得所述患者能够比静脉给药该改性药剂更早再次给药(re-dosed)；使得产生的免疫反应要少于或者等于静脉给药该改性药剂所产生的免疫反应；为患者提供的治疗效果所持续的时间要比静脉注射给药该改性药剂的治疗效果所持续的时间长至少12小时；以及所述药剂可以以比安全地静脉递送该改性药剂的浓度更高的浓度进行递送。

至少通过所述改性药剂与未改性的药剂的分子尺寸比率增加亲水性。亲水性是指亲水亲油平衡(HLB)，其可以被定义为水的亲和力，在本发明的内容中意味着较低的表面粘附力和水中更高的分散性。

本发明提供一种调整患者(subject)的皮下贮库(subcutaneous depot)中的治疗药剂递送速度的方法，该方法包括改性所述治疗药剂以改变该药剂的亲水性，其中，亲水程度与生物利用度成比例。

意外地发现，越是要获得从皮下贮库释放最长的持续时间，越是需要更小程度的改性。不被理论所束缚，这可能被合理的说明的是更小程度的改性使得治疗药剂暴露于通过淋巴扩散慢的皮下组织。与之相对，较高程度的改性完全地覆盖所述治疗药剂并使得其产品自由快速地进入血液循环。

本发明还表明更高改性治疗药剂(即二-(di-)或者三-(tri-)改性的种类与单-(mono-)改性的种类相比)则生物利用度更高。因此，本发明的发明人已经证实，较高程度的改性和水合水平促进了更高的改性以及由此而得的生物利用度。

因此，对于任何给予治疗药剂，从皮下贮库的释放现在可以通过增加或者减少所述治疗药剂的改性水平进行调整。

根据本发明，皮下递送可以是通过皮下注射、局部施覆(topicalapplication)、经皮贴剂(transdermal patch)、微皮肤磨削(microdermalabrasion)、高压干粉递送或者任何其他将治疗剂引入皮下空间的方法。

本发明的再一个方面提供了改性药剂在根据所述第一和其他方面的方法中的应用，该改性药剂包括治疗药剂和改性，其中，相对于该治疗药剂的原始形态，所述改性增加了该药剂的亲水性并改变了该药剂的分子尺寸。相比于所述治疗药剂的原始形态，所述改性使该药剂亲水性增加了至少50％和分子尺寸增加了至少50％。

已经在几种市售的生化药物产品中使用的生物相容性聚合物的例子是聚乙二醇(以下简称PEG)。共价连接PEG分子到另一个分子的过程被称为聚乙二醇化。迄今为止，九种聚乙二醇化产品已经获得了FDA的上市批准，其中四种畅销药：(Schering-Plough)、(Hoffman-La Roche)、(Amgen)和(Hoffman-La Roche)。已存在许多不同的化学成分用于结合蛋白质治疗剂以活化PEG分子。已经成功地采用随机聚乙二醇化通过蛋白质上的氨基基团共价连接PEG基团到蛋白质。附着位点最常见的是，但是不唯一的，为赖氨酸残基侧链上的ε-氨基。这种随机的反应可能产生非常复杂的缀合物的混合物并在PEG残基的附着数量和位点上有所不同。甚至随后对随机缀合反应进行纯化，仍可能存在具有非常不同的物理化学性质和药学特性的位置异构体(positional isomers)。许多位点特异性聚乙二醇化(site-specific PEGylation)技术已经开发出来，现在被利用于生产更好界定的生化药物。使位点特异性聚乙二醇化的方法包括N-端、半胱氨酸、聚糖、二硫化物和聚组氨酸定向的聚乙二醇化。

在使用PEG衍生化的肽治疗剂已被证实降低了多肽类的免疫原性，例如US4179337公开了非免疫原性的多肽，例如酶和肽类激素与聚乙二醇(PEG)或者聚丙二醇结合。除了降低免疫原性外，由于所讨论的多肽的PEG缀合物的尺寸增加，使得在循环中的清除时间有所延迟。

PEG及其衍生物附着多肽的主要方式是通过肽的氨基酸残基的非特异性键合(见US 4088538、US 4496689、US 4414147、US 4055635以及WO87/00056)。另一个PEG附着肽方式是通过糖肽上的糖基残基的非特异性氧化(见WO 94/05332)。

在这些非特异性的方法中，将聚乙二醇以随机的、非特异性方式加到在肽主链上的反应性残基上。当然，PEG分子的随机加入也有它的缺点，包括最终产品缺乏均匀性，以及存在肽的生物学活性或者肽的酶活性的减少的可能性。因此，对于治疗药剂的生产，可获得特异性标记的、容易表征的、本质上均匀的产品的衍生策略更为有利。

本领域中治疗药剂的聚乙二醇化的状况，如重组凝血因子(如FVIIa、FVIII和FIX)可以总结如下。WO98/32466表明FVII可以聚乙二醇化，但关于这方面并不包括任何进一步的信息。US2008/0200651表明具有野生型的(wild-type)，或者增强的，活性的FVII多肽并且通过人工引入半胱氨酸残基而缀合有聚乙二醇分子，显示出增加的体内半衰期。US2008/0221032描述了FVIIa-聚唾液酸缀合物的生产，得到的分子显示出显著的体内半衰期的增加。US2009/0176967教导了酶可以用于在FVII多肽的C-端引入特定的官能团由此可以结合如PEG的生物相容性聚合物。US2009/0227504描述了FVIIa(或者FVIIa-样分子)的制备，即将一个或多个天冬酰胺-和/或丝氨酸-连接的低聚糖链与至少一个聚合物基团共价地改性，并由此证实有所改善的血清半衰期。US2010/0028939描述了怎样采用半乳糖氧化酶这样的酶对天然的糖蛋白进行改性以在多糖末端产生反应性的醛官能度(aldehydefunctionalities)。该反应性的醛然后可以用来缀合聚合物基团和蛋白质以生成具有改进药理学特性的产品。US2010/0056428表明在FVIIa中在糖基基团处通过聚合物基团如PEG的肟来衍生糖蛋白可以获得改进的药代动力学特性。关于FVIII和FIX的也有公开的相关报道，分别见US2008/0255026和US7683158。

另一个类似蛋白质聚乙二醇化已经被Polytherics开发并且被称为TheraPEG^TM，其中PEG聚合物通过该蛋白质中的一对半胱氨酸残基的还原的二硫键附属于感兴趣的蛋白质(WO2005/007197)。该技术已经被用于准备无因子FIXa污染的聚乙二醇化的因子IX(WO2009/130602)、聚乙二醇化的因子VII(WO2011/135308)和聚乙二醇化的因子VIII(WO2011/135307)。

现在由本发明的发明人所发现的，与静脉注射给药的相同形式的相比，皮下给药改性治疗药剂，如凝血因子的聚乙二醇化形式，可以改善半衰期并延长在血浆中的活性，尤其是当“剂量调整”(dose adjusted)时。给受皮下注射的具体位置可以增加或者减少所述改性药剂出现在血液系统中的有效时间。无论如何，获得了较低的C_max:C_average比例；相似的药代动力学分布(pharmacokinetic profiles)通常与相关的缓释剂型同等视之。皮下给药未改性的治疗药剂的缺陷是治疗药剂可以直接进入心血管系统，从而C_max和持续时间结果主要取决于皮下注射部位的血管状况。当皮下注射至高度血管化的区域时将明显地比在注射于低血管化的区域中时更为快速地吸收大量的药剂。这种矛盾可以用本发明的用于皮下递送的改性药剂来克服。

根据本发明提供的改性治疗药剂得到了通过淋巴系统递送到心血管系统的分子，并因此在不依赖注射部位的血管下，得到了通过淋巴系统进入循环的更可预测的、一致的递送速率。

本领域中现有的治疗药剂的配方考虑，包括凝血因子，没有重视配制这样的用于皮下给药的因子所衍生而得的优势。特别地，也没有暗示或者启示这样的配方在皮下给药时可以递送并维持正常止血至有所延长的时间或者它们可以提供更稳定的药物生物利用度(更低C_max:C_average比例)，这是由于获得了稳定输注效果。所述淋巴系统提供了含水液体，在其中血管壁为含有胶原蛋白。任何太大而不能通过血管壁的分子必须依靠淋巴引流(lymphaticdrainage)去到血流中。然而，如果分子中存在一定程度的疏水性，它很有可能在进入淋巴系统前粘附于组织上以及粘附于淋巴管壁，并因此其将被固定在上述液体中。相比之下当提供的亲水基团(hydrophilic moiety)时，所述改性药剂将更容易分散在淋巴中的水相中从而很容易地引流入系统中并进入到胸导管的血流中。

任何方面的所述治疗药剂可以为小分子、大分子、聚合物和多肽，其中，小分子包括催眠药和镇静药、抗心律失常药、抗氧化剂、抗哮喘剂(anti-asthmaagents)，激素类药剂包括避孕药、拟交感神经药(sympathomimetics)、利尿药、调脂药(lipid regulating agents)、抗雄激素药物、抗寄生虫药、抗凝血剂、肿瘤药(neoplastics)、抗肿瘤药、降糖药(hypoglycemics)、精神兴奋剂(psychic energizers)、镇静剂、呼吸药物(respiratory drugs)、抗惊厥药(anticonvulsants)、肌肉松弛剂、抗帕金森药(多巴胺对抗物)、细胞激素、生长因子、抗癌剂、抗血栓剂、抗高血压药、心血管药、止痛药、消炎药、抗焦虑药(镇定剂)、食欲抑制剂(appetite suppressants)、抗偏头痛药、肌肉收缩剂、抗感染药(抗生素、抗病毒药、抗真菌剂、疫苗)抗关节炎药、抗疟疾药、止吐药、抗癫痫药(anepileptics)、支气管扩张剂、营养剂和补充剂、生长补充剂、抗肠炎剂、疫苗、抗体、诊断剂以及造影剂。

本发明适用的药剂的例子包括，但并不限制于此，降钙素、红细胞生成素(EPO)、阿糖苷酶(ceredase)、伊米苷酶(cerezyme)、环孢菌素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促血小板生成素(TPO)、α-1蛋白酶抑制剂、依降钙素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、生长激素、人类生长激素(HGH)、生长激素释放激素(GHRH)、肝素、低分子量肝素(LMWH)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素-1受体、白细胞介素-2、白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-6、促黄体激素释放激素(LHRH)、因子IX胰岛素、胰岛素原、胰岛素类似物(例如，美国专利号NO.5922675中描述的单酰化胰岛素)、胰淀素、C-肽、生长激素抑制素、生长激素抑制素类似物包括奥曲肽、抗利尿激素、促卵泡激素(FSH)、胰岛素样生长因子(IGF)、促胰岛素激素(insulintropin)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、组织生长因子、角质细胞生长因子(KGF)、神经胶质生长因子(GGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、内皮生长因子、甲状旁腺素(PTH)、胰高血糖素样肽胸腺素α1、IIb/IIIa抑制剂、α1抗胰蛋白酶、磷酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4抑制剂、二磷酸盐、呼吸道合胞病毒的抗体、囊性纤维化跨膜调控子(CFTR)基因、脱氧核糖核苷酸酶(Dnase)、抗假单胞菌青霉素类如羧苄青霉素、替卡西林、阿洛西林、美洛西林以及哌拉西林；头孢菌素类如头孢泊肟、头孢丙烯、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢噻吩、头孢匹林、头孢氨苄、头孢拉啶、头孢西丁、头孢羟唑、头孢唑啉、头孢噻啶、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢来星(cephaloglycin)、头孢呋辛、头孢雷特(ceforanide)、头孢噻肟、头孢曲秦(cefatrizine)、头孢乙腈、头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢美唑、头孢他啶、氯碳头孢和拉氧头孢，单环β-内酰胺类如氨曲南；杀菌/渗透性增强蛋白质(BPI)、抗-CMV抗体、13-顺式维甲磺酸，大环内酯类如红霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素、罗红霉素、克拉霉素、环酯红霉素、阿奇霉素、氟红霉素(flurithromycin)、地红霉素、交沙霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、白霉素、美地霉素、罗他霉素、andazithromycin和swinolideA；喹诺酮类如环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲沙星、莫西沙星、诺氟沙星、依诺沙星、格雷沙星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替马沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、妥舒沙星、普卢利沙星、依尔沙星、帕珠沙星、克林沙星和西他沙星，氨基糖苷类如庆大霉素、乙基西梭霉素、草履虫素、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素、以及链霉素、万古霉素、替考拉宁、雷冒拉宁(rampolanin)、麦地拉宁、粘菌素、达托霉素、短杆菌肽、粘杆菌素，多粘菌素类如多粘菌素B、卷曲霉素、杆菌肽、青霉烯类；青霉素类包括青霉素酶敏感剂(penicllinase-sensitive agents)如青霉素G、青霉素V、青霉素酶耐受剂(penicllinase-resistant agents)如甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯唑西林、氟氯西林(floxacillin)、萘夫西林、革兰阴性微生物活性剂如氨苄西林、阿莫西林以及海他西林、西林(cillin)、以及革兰西林(galampicillin)；碳青霉烯类如亚胺培南、美罗培南、依西酸喷他脒(pentamidine isethiouate)、硫酸沙丁胺醇、利多卡因、硫酸奥西那林、二丙酸倍氯米松(beclomethasone diprepionate)、去炎松乙酰胺(triamcinolone acetamide)、布地奈德缩丙酮(budesonide acetonide)、氟替卡松、异丙托溴铵、氟尼缩松、色甘酸钠、酒石酸麦角胺，以及上述抗生素，血因子、激素、生长因子、另一种治疗肽或者蛋白质、或者单克隆抗体或者小分子的可适用的、类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂以及其药学可接受的盐的形式。适当地，用于改性药剂可以选自由因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子和蛋白C组成的组中。在一些实施方式中所述凝血因子适于为因子VII、因子VIII或者因子IX。

根据本发明的药剂可以通过任何生物相容性聚合物被改性，例如，聚乙二醇(PEG)、聚磷脂酰胆碱(PC)、聚丙二醇(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚环氧乙烷(PEO)、聚氧乙烯多元醇、聚烯醇、聚羟烷基甲基丙烯酸酯、多糖、聚α-羟基酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚N-丙烯酰吗啉、聚烯烃氧化物聚合物、聚马来酸、聚DL-丙氨酸、羧甲基纤维素、右旋糖酐、淀粉或淀粉衍生物、透明质酸、甲壳素、聚甲基丙烯酸酯、聚唾液酸(PSA)、聚羟基链烷酸酯、聚氨基酸以及它们的组合。所述生物相容性聚合物可以具有线性或分支状结构。

在另一种实施方式中，所述生物相容性聚合物为选自但并不限于由白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白包括单克隆抗体、抗体片段如单域抗体、V_L、V_H、Fab、F(ab′)₂、Fab′、Fab3、scFv、di-scFv、sdAb、Fc以及它们的组合组成的组中的蛋白质。

在一些实施方式中，增加改性治疗药剂的亲水性/溶解性并被递送到皮下能够使得该药剂比通过静脉递送以更高的浓度存在在递送介质中。在药物通过注射给药的这种情况下，可以确保使用较小的注射量，其更适合皮下给药。另外，在较高的浓度下，未改性的药剂可能预计为自动催化(auto-catalyze)，所述改性可以防止该药剂自动消化(auto-digestion)，从而未改性的形式可能导致有不良的、危险的副产品。例如，未改性的血因子IX将以高浓度自动催化并产生因子IXa，具有形成血栓的危险。

于是，本发明的另一方面，所述改性治疗药剂的皮下递送体积为不多于2ml。适当地，所述递送体积可以为5μl、10μl、25μl、50μl、100μl、250μl、500μl、750μl或者1ml。在另一种实施方式中，所述药剂的递送体积可以为不超过1.5ml、2ml、2.5ml、3.0ml或者3.5ml。值得注意的是本发明可以以较高浓度的活性的药剂通过单次皮下注射进行递送且比静脉内注射更安全，因为没有直接递送至患者的血流里。这对于凝血因子来说是特别重要的，因为静脉注射高浓度的凝血因子可能在患者中导致不良的和危险血块。皮下递送使得活性的药剂可以通过淋巴系统稳定输注入血流中，从而避免了活性的药剂直接递送到血流中产生的危险水平。因此，由于药剂递送进入血流的浓度被患者淋巴系统所调控，可以以较高浓度皮下给药的剂量进行递送，这将使得可以以相比静脉递送传统使用的更小的体积使用。

在本发明范围内包括的治疗药剂能够通过亲水改性进行改性去增加亲水性和改变分子尺寸以防止其穿过血管壁直接进入血管系统，从而可通过皮下递送对患者进行给药，以此通过淋巴系统到达循环系统。改性这种药剂的方法也包括在本发明中。

本发明的剂型可以给药每天至少一次、每天至少两次、每周约一次、每周约两次、每两周约一次或者每月约一次。调控所述改性治疗药剂自皮下贮库的释放速率的能力意味着给药可以更便于控制。

对某些的治疗药物，每天一次的剂量方案将是足够的，但是对于其他的更频繁的剂量方案可能更适合或者更期望，其中，相对于标准静脉剂量每一皮下给药剂量的量可以被减少。所以，本发明的剂型可以为每天一次给药、每天两次(或者更多次如果需要)进行给药。

本发明可以阻止血液中药剂浓度快速升高和随后下降(即“锯齿”)。相比未改性的药剂传统上可见的或者当反复的静脉注射同样的改性的产品时的，本发明提供了一种更长时间地在患者血液中更一致的、更可预期的药剂浓度。

本发明的另一个好处是它使皮下给药的试剂的剂量比安全地静脉给药的剂量高。这将可以提供更长的治疗效果持续时间相比于以更高剂量或者更频繁剂量的通常的和安全的静脉递送所持续时间来说。例如，至于血液因子，因为该产品通过胸导管被递送进入锁骨下静脉，所述方法能够使更大量的产品单时间点单剂量进行皮下给药相比于单时间点静脉注射入静脉来说。高剂量团注入血管可以引起不良的血栓事件。

本发明的另一个好处能够使所述药剂间隔地再次给药以使该药剂的血药浓度维持一致的水平，从而提供一个持久不变的和可预期的治疗效果而不需要等待直到该药剂的血药浓度下降到与治疗不相关的水平时再次给药。在传统的做法中，静脉再次给药，伴随着即刻的C_max和起始作用，被推迟直到估计治疗剂水平已经下降到由新注射而加入的C_max不会达到可能形成血栓水平(即减少不良事件的风险)，但是这意味着患者在他或者她的血液系统中已经达到了一种“不健康的”药剂水平范围。换句话说，当血流中仍存在“健康水平”或治疗有效水平的药剂，该药剂随后剂量便不能正常的给予患者。然而，本发明能够在药剂的血药水平仍处于治疗有效范围内时进行该药剂的再次给药，从而本发明使得在血液系统中蛋白质的治疗剂水平更一致，那是很理想的适合于预防治疗。由于通过胸导管进入入血流的药剂的一致性递送，避免了该药剂在血流中增加到不期望的高水平的问题。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于皮下给药的改性凝血因子的药物组合物的剂型，当配置用于皮下给药到患者时，提供了一种足够维持所述患者全血凝固时间(whole blood clotting time)不多于20分钟的每月不多于一次的剂型。也提供了用于皮下给药每月不多于一次的聚乙二醇化凝血因子的液体剂型在治疗凝血失调中的应用，该剂型具有的C_max为静脉注射给药的同等参考剂型(equivalent reference dosage form)的至少10％且不多于90％。适当地，所述C_max为20％-80％，或者30％-70％，或者40％-60％。适当地，所述凝血因子可以为FVII、FVIII或者FIX。

“不多于”的意思是所述剂型可以以比指定的时间周期更频繁地进行给药，但并不必然这样做；这种剂型的皮下给药效果是指检测在该时间周期里的持续时间。然而，由于较低的和一致的C_max，可以更频繁地给药且对患者没有不良效果。

适当地，所述凝血因子的剂型可以足够维持所述患者全血凝固时间为少于15分钟，或者适当地，少于12分钟。在一种具体实施方式，所述凝血因子的剂型为每周至少一次的剂型，或者每月至少一次、每两周至少一次、每半周至少一次的剂型。

根据本发明的剂型可以包括选自由因子VIIa、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子XIII、因子V、冯维勒布兰德因子和蛋白C组成的组中的凝血因子。适当地，所述凝血因子为FVII、FVIII或者FIX。

本发明的剂型可以通过任何生物相容性聚合物进行改性，如本文所定义的。适当地，所述改性为聚乙二醇化。

所述剂型具有的C_max可以为静脉注射给药的同等参考剂型的至少10％且不多于90％。在一种具体实施方式中，所述剂型具有的C_max可以为静脉注射给药的同等参考剂型的10％-25％。在一种具体实施方式中，所述剂型具有的C_max可以为静脉注射给药的同等参考剂型的40％-60％。在一种具体实施方式中，所述剂型具有的C_max可以为静脉注射给药的同等参考剂型的75％-80％。在一种具体实施方式中，所述剂型具有的C_max可以为静脉注射给药的同等参考剂型的75％或78.8％。在一种实施方式中，C_max为75％-80％并且所述血因子可以为FVII。在另一种实施方式中，C_max为10％-25％并且所述血因子可以为FVIII。在另一个实施方式中，C_max为40％-60％并且所述血因子可以为FIX。

还提供了一种根据本发明的剂型，剂量为1-1000IU/kg，或者5-500IU/kg，或者100-250IU/kg或者25-50IU/kg。

本发明的剂型可以使得所述剂型的少频率给药，却足够维持患者的全血凝固时间不多于20分钟、或者不多于15分钟、或者不多于10分钟。在一种具体实施方式中，所述剂型足以维持全血凝固时间少于12分钟。所述剂型可以提供两周不多于一次、每周不多于一次、每周不多于两次、每三天不多于一次、每两天不多于一次、每天不多于一次或者更多或者更少频率的剂型。

值得注意是本发明的一个好处为当药剂为凝血因子时的剂型，不需要更频繁地对患者给药来至通过这样的时间间隔来继续维持全血凝固时间在健康范围内，而是可以更频繁地给药以助于提供一种与那些控释剂(controlledrelease formulation)相似的“稳定状态”。通常本领域技术人员认为“正常”全血凝固时间为10-12分钟，并且任何15分钟以下的都认为是健康的非血友病的人群。一旦全血凝固时间超过20分钟，则被认为是在不健康的范围中。在15-20分钟之间则被认为是表明了尽管出血可控，但却不正常。

在另一种实施方式中，所述剂型以比静脉团注的血浆半衰期更低的频率进行给药。例如，团注改性的因子IX需要每周一次，然而，根据本发明的皮下递送相同的药剂，可能仅需要每十天一次，或者更少。

根据本发明的另一个方面，提供了一种具有25-50IU/kg的改性凝血因子的药物组合物以用于比静脉给药该凝血因子更低频率或相同频率的皮下给药。

本发明的剂型因此能维持止血在标准值至高到七天，所述标准值被定义为少于15分钟的全血凝固时间(WBCT)，适当地，大约为12分钟或者更少。

本发明的剂型具有的C_max为静脉注射给药的同等参考剂型的至少10％到不多于90％。在本发明的一些实施方式中，该值可以为至少75％、78％或者80％，并且所述凝血因子可以为FVII。在本发明的一些实施方式中，该值可以为至少15％、18％或者20％，并且所述凝血因子可以为FVIII。在本发明的一些实施方式中，该值可以为40％、45％或者50％，并且所述凝血因子可以为FIX。

本发明的具体实施方式的剂型，其中，所述改性药剂为聚乙二醇化血因子，当配置用于不多于每月一次皮下给药时，包括25-50IU/kg的剂量。在一些实施方式中，所述剂量可以为25、30、35、40、45或者50IU/kg。所述剂量可以25IU/kg-30IU/kg、35IU/kg-40IU/kg或者40IU/kg-50IU/kg。

在一种实施方式中，当所述剂型被准备为150IU/kg的剂量时，所述剂型可以适合于在需要的患者中每两周给药一次。适当地，所述剂型可以每两周给药不多于一次。

根据本发明的一种具体实施方式，当皮下给药改性凝血因子的剂型时能导致正常止血维持至少一个半星期。

根据本发明的剂型，当皮下给药时可以少量的所述改性的血凝(凝结)因子达到相同的治疗终点，从而为需要治疗的患者提供更安全的产品。在一种实施方式中，静脉给药的所述改性凝血因子调整剂量(adjusted dose)的一半就足以实现在患者体内维持正常止血至少一周，特别地其中所述凝血因子为因子VIIa或者因子VIII。对于正常止血的适合的值为约12分钟的全血凝固时间(WBCT)，如上所述的。

本发明的剂型可以适当地包括少于用于静脉给药的参考剂型(包括有相同改性凝血因子)的调整治疗有效量一半的剂量以达到相同治疗效果。例如，在一种具体实施方式中，所述凝血因子为因子IX。

本发明因此也提供了一种用于皮下给药的改性凝血因子的剂型，该剂型包括静脉给药所需的剂量调整量的50％以实现相同的有效作用的持续。

一种适用于皮下给药的剂型可以适当地被准备为含水的或者基本上含水的剂型。所述剂型可以包括所需的添加盐、防腐剂和稳定剂和/或赋形剂或者助剂。本发明的剂型可以被提供作无水粉末以备用于在适当的含水介质中的临时剂型(extemporaneous formulation)。

通常可以优选将剂型配制为缓冲含水剂型(buffered aqueousformulation)。适合的缓冲溶液可以包括，但不限制于氨基酸(例如组氨酸)、无机酸的和碱金属或者碱土金属的盐(例如钠盐、镁盐、钾盐、锂盐或者钙盐-例如氯化钠、磷酸钠)。可以存在其它的成分如洗涤剂或者乳化剂(例如，Tween或者任何其它形式的)以及稳定剂(例如苯甲脒或者苯甲脒的衍生物)。还可以存在赋形剂如糖类(例如蔗糖)。合适的pH值为生理学的pH，例如，pH 6.8-7.4。液体剂型可以被制备为在给药载体中随时可用。

一种“改性凝血因子”为连接有一个或多个如上所述的改性用试剂的凝血因子(blood coagulation factors)(凝血因子，blood clotting factors)。在一些实施方式中，所述改性为PEG。所述PEG分子可以直接连接或者间接连接到所述凝血因子。所述聚乙二醇化的凝血因子还可以被定义为“缀合有PEG分子的凝血因子”或者一种“凝血因子-PEG缀合物”。

改性凝血因子(blood coagulation factors)(凝血因子，blood clottingfactors)适于包括因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子和蛋白C中的至少一种。在一些具体实施方式中，所述凝血因子适于为因子VII、因子VIII或者因子IX。

如本文所使用的术语“血因子缀合物”指的是具有改性凝血因子蛋白，如PEG部分、如上文所述的其它缀合部分。

除非文中特别指定，术语因子VIIa(FVIIa)和因子VII(FVII)也可以交换使用。FVIII用为因子VIII的缩写以及FIX用为因子IX的缩写，并适用于本发明中描述的其他血因子。

所述凝(凝结)血因子可以来自于任何合适的来源和可以是通过DNA重组技术利用分子生物技术或者化学合成或者在哺乳动物的转基因牛奶生产的重组蛋白，或者所述因子可以从自然来源分离而得(即纯化血浆)。适当地所述因子是哺乳类的凝血因子，如人类的凝血因子。引用的凝血因子(blood clotting factor)包括凝血因子(blood coagulation factor)。

正如本文中所指出的本发明涉及改性凝血因子的剂型，该改性凝血因子通过缀合一个或者更多改性用的试剂进行改性，如聚乙二醇聚合物(“聚乙二醇化”)。所述凝血因子的改性可以通过任何方便的方法进行。

现在广泛应用于血液产品的剂型中。80为一种聚乙二醇化的脂肪酸并每个分子携带有分子当量大约0.8kDa的PEG。

如上文所述，血因子为特异性化的尤其是表面粘附的性质。这是所述凝血级联的必要特征，即需要酶和辅因子粘附其它在级联中参与者，粘附血小板的表面以及损伤部位组织。的确特别重要的是血块保持在损伤部位而不漂移以引起血栓风险。此属性给药物产品的剂型提出了挑战，因为血因子如VIIa、VIII和IX将过度地粘附在任何玻璃和塑料表面。实际上，通过使用大量聚山梨酯(即80)对此有所减轻。

在本发明的一种具体实施方式中，FVIII具有20kDa的直链聚乙二醇部分与之缀合。缀合PEG减轻了这种因子的表面粘附性质至不必要进一步使用的程度。

当在凝固过程中被激活，PEG-FVIII一直粘附于血小板的表面，并且在整个凝血过程作为一个小部分。在这个方面中，血块将以正常的方式形成于损伤部位的血小板上。

通过具有一个单-聚乙二醇化因子(mono-PEGylated factor)并因此避免了在剂型中加入的需求，从而可以实现聚乙二醇的量的减少。使用Fs(拜耳FVIII)进行计算以确定在所述剂型中的每摩尔FVIII具有的PEG的总量，并且与单一缀合20kDa部分(在它的剂型中不需要任何进一步)进行比较。因此，在剂量对剂量的基础(dose-for-dose basis)上，本发明的一种具体实施方式提供了聚乙二醇的25.8倍减少量，当给药的减少频率也考虑到，那么这可以获得总体上减少大约80倍PEG的给药量。

本发明的发明人已经发现增加所述目标治疗剂的水-承载能力(water-carrying capability)(例如，通过双-聚乙二醇化产品相对于单-聚乙二醇化该产品)，该产品经皮下给药后进入血流的过程，可以被加速。相反地，减少所述水-承载能力(例如，单-聚乙二醇化产品相对于双-聚乙二醇化该产品)，该产品经皮下给药后进入血液系统的过程，可能被减速，给出了贮库作用(depot effect)。不希望受理论的束缚，显示出同样的产品具有较小的水-承载能力(例如，通过单-聚乙二醇化或者具有较小的聚乙二醇分子)抵抗穿过皮下空间进行分散的时间长于被改性为具有较大的水-承载能力的同样的产品(例如，多-聚乙二醇化或者结合有较大的PEG分子)，因此提供了增强的贮库作用。

不希望受理论的束缚，设计一种具有更大水-承载能力特性的产品(例如，通过双-或者多-聚乙二醇化增加它的PEG覆盖范围，增加PEG的尺寸或者相对于直链的使用支链的PEG分子)似乎可使得在皮下空间内分散水性更好，使得通过淋巴管进入血浆的速率更快；将减少了亲水性的产品设计为具有较小的水-承载能力特性(例如，通过单-聚乙二醇化或者通过使用较小的PEG分子)，似乎将留下更多的疏水性治疗药剂被暴露、减少其分散性和减慢了它通过含水的淋巴系统进入血浆。

这种改性用于皮下给药的分子的分散特性的能力，通过选择性地调整亲水性和疏水性之间的平衡，提供产品通过淋巴从皮下空间到血浆中的控制释放的控制精准度，其可以根据治疗药剂的特性、患者的需要和生理机能或者这些的结合或者其它影响因素进行调整。

在一些具体实施方式中，当所述改性为PEG，所述聚乙二醇(PEG)可以具有线性或分支状结构并且可以通过任何方便的路线连接所述治疗药剂。在所述治疗药剂为蛋白质时，例如，凝血因子或者其它治疗蛋白如本文所描述的，缀合PEG可以通过天然蛋白中丝氨酸或者苏氨酸残基，通过与天然蛋白连接的糖残基上的羟基残基，或者通过一个或者多个半胱氨酸残基。所述PEG部分可以通过这样的残基连接天然的或者重组形式的蛋白。由重组表达制得的蛋白质可以通过位点特异性工程(site specific engineering)向蛋白质序列插入想要的氨基酸残基和/或控制特定的糖基化酶的糖基化模式。其它聚乙二醇化路线包括酰胺或者N-端氨基聚乙二醇化，或者羧基聚乙二醇化。

所述PEG部分也可以通过一个或者多个被还原的半胱氨酸二硫键以缀合凝血因子，也就是因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C。游离的半胱氨酸残基是还原在蛋白质中的胱氨酸二硫键的结果。例如，所述缀合可以通过连接基团桥接两个半胱氨酸残基的硫残基从而在因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C中形成二硫键。因此，所述二硫键可以为天然二硫键或者重组引入的二硫键。

在本发明的一种具体实施方式中，所述亲水基团，例如聚乙二醇链通过横跨半胱氨酸残基的二价连接基团(通常在天然形式的凝血因子中形成二硫桥键(disulphide bridge))进行连接。

所述PEG分子可以为任何合适的分子量，例如，从1kDa-100kDa，10-500kDa，适当地5-30kDa或者20-30kDa。一些适当的分子量包括5、10、20或者30kDa。适当地，所述PEG分子可以具有5kDa-40kDa。

这有几种不同类型的聚乙二醇聚合物可以与因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C形成缀合物。既可以是含有单一聚乙二醇链的线性的PEG聚合物，还可以是支链或者多臂PEG聚合物(multi-arm PEG polymers)。支链聚乙二醇含有2条或者2条以上的单独的线性的PEG链并通过共同的基团键合。例如，两个PEG聚合物可以通过赖氨酸残基键合在一起。其中一条线性的PEG链键合其α-氨基，而另一条PEG链则键合其ε-氨基。赖氨酸核心的剩余羧基则留下用于共价连接蛋白质。分支状和线性的聚乙二醇聚合物都可市售得到其一系列的分子量的产品。

本发明的一种具体实施方式中，所述因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C-缀合物含有一个或者多个与因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C键合的线性的聚乙二醇聚合物。在一些具体实施方式中，所述凝血因子为因子III、因子VIII或者因子IX，其中，PEG具有的分子量大约为2-100kDa。在本发明的另一方面中，因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C-缀合物含有一个或者多个与因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C键合的线性的聚乙二醇聚合物，其中，线性的PEG具有的分子量为约1-约40kDa。在某些具体实施方式中，线性的PEG具有的分子量大约为10-30kDa。在某些具体实施方式中，线性的PEG具有的分子量大约为20kDa。在某些具体实施方式中，线性的PEG具有的分子量大约为10kDa。在确定的具体实施方式中，线性的PEG具有的分子量大约为少于10kDa。在具体的实施方式中，所述血液因子缀合物含有多于一个与凝血因子键合的线性的PEG聚合物，例如将两个、三个或多达八个线性的PEG聚合物键合到因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C。在一些实施方式中，所述血液因子缀合物含有多个线性的PEG聚合物，其中，每个线性的PEG具有的分子量大约为5-30kDa。

本发明的血因子缀合物可以含有一个或多个缀合因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的分支状的PEG聚合物，其中，每个分支状的PEG具有的分子量为约2-约100kDa。本发明的另一个方面，血因子缀合物可以含有一个或多个缀合因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的分支状的聚乙二醇聚合物，其中，每个分支状的PEG具有的分子量为约1-约100kDa。在某些具体实施方式中，每个分支状的PEG具有的分子量为约5-约40kDa。在某些具体实施方式中，每个分支状的PEG具有的分子量为约10kDa、20kDa或者30kDa。在某些具体实施方式中，每个分支状的PEG具有的分子量少于约10kDa。在具体的实施方式中，所述血因子缀合物可以含有多于一个缀合因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的分支状的PEG聚合物，例如将两个、三个或多达八个直链PEG聚合物键合到因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C。在一些实施方式中，所述因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C-缀合物含有多达八个分支状的PEG聚合物，其中，每个分支状的PEG具有的分子量为约5-40kDa，适合地10-30kDa。

所述血因子-PEG缀合物可以通过本领域技术人员公知的层析方法进行纯化，包括但不限制于离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、沉淀以及基于膜的分离。

适合地，所述因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C-PEG缀合物的PEG部分键合两个半胱氨酸残基，以在凝血因子中形成二硫键。因此，所述PEG含有连接子来桥接二硫键。这样的缀合方法的例子如在WO2005/007197、WO 2009/047500和WO 2010/010324中所描述的。

如上所述，聚乙二醇化的其他路线可以包括标准的糖基聚乙二醇化(glycoPEGylation)方法如Stennicke et al(Thromb.Haemost.2008,100(5),920-8)中描述的，或者N-端酰胺聚乙二醇化如US5644029中描述的。

本发明的一种实施方式中，PEG部分可以根据图2中给出的路线缀合因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C。在图2中，R1基团表示在所述PEG部分和连接基团之间，所述连接基团跨越(spanning)了在血因子分子上的二硫键的硫原子。

R1表示的取代基为直接的键(direct bond)、亚烷基(优选C_1-10亚烷基)、或任选取代的芳基或杂芳基；其中所述芳基包括苯基、苯甲酰基和萘基；其中合适的杂芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶和嘌呤；其中与聚合物的连接可以为通过水解作用不稳定的键的方式或通过稳定的键的方式。

在任选取代的芳基或者杂芳基上存在的具体取代基包括例如选自-CN、-NO₂、-CO₂R、-COH、-CH₂OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO₂R、-SR、-SOR、-SO₂R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO₂R、-NR’CO₂R、-NO、-NHOH、-NR’OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR’COR、-N⁺R₃、-N⁺H₃、-N⁺HR₂、-N⁺H₂R、卤素例如氟或氯、-C≡CR、-C＝CR₂和¹³C＝CHR中的一种或多种相同或不同的取代基，其中每个R或R’独立地代表氢原子或者烷基(优选C_1-6)或者芳基(优选苯基)。特别优选地存在吸电子取代基(electron withdrawing substituents)。在一种实施方式中，R1中所述任选取代的芳基或杂芳基包括被酰胺基(NHCO)取代的芳基或杂芳基，所述酰胺基将R1单元与PEG部分连接。

在因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原子之间的连接基团可以含有3-碳桥(3-carbon bridge)。在一种实施方式中，在因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、血管性血友病因子或者蛋白C的半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原子之间的连接基团是(CH₂)₂CHC(O)-。

在本发明的一种实施方式中，PEG部分可以如上所述的进行缀合，其中包括有与PEG部分缀合的因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的成分具有以下结构：

其中，R1如上述定义所述，且“因子”表示凝血因子。

在实施方式中，如上定义的R1中任选取代的芳基或杂芳基包括由酰胺(NHCO)基团取代的芳基或杂芳基，缀合蛋白的结构如下所示，其中，R3如下定义：

R3代表的取代基可以为：直接的键、亚烷基(优选C_1-10亚烷基)或者任选取代的芳基或杂芳基；其中所述芳基包括苯基、苯甲酰基和萘基；其中合适的杂芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶和嘌呤；其中与所述聚合物的连接可以通过水解作用不稳定的键的方式或通过稳定的键的方式，且“因子”表示凝血因子。

在任选取代的芳基或者杂芳基上存在的具体取代基包括例如选自-CN、-NO₂、-CO₂R、-COH、-CH₂OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO₂R、-SR、-SOR、-SO₂R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO₂R、-NR’CO₂R、-NO、-NHOH、-NR’OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR’COR、-N⁺R₃、-N⁺H₃、-N⁺HR₂、-N⁺H₂R、卤素例如氟或氯、-C≡CR、-C＝CR₂和¹³C＝CHR中的一种或多种相同或不同的取代基，其中每个R或R’独立地代表氢原子或者烷基(优选C_1-6)或者芳基(优选苯基)。特别优选地存在吸电子取代基。

在一些实施方式中，本发明的剂型可以由如上文定义的聚乙二醇化形式的凝血因子组成，其中所述聚乙二醇分子为直链(适合单分散)形式。所述PEG可以通过三个碳桥部分缀合到凝血因子。例如，所述PEG可以为1-100kDa；在一些实施方式中，为5-30kDa；在一些实施方式中为10kDa，在另一些实施方式中为20kDa。

用于皮下给药的所述剂型可通过合适的水性载体中的配制。在大部分的实施方式中，合适的水溶液为缓冲至生理学的pH(例如至pH6.8)并且其含有的组合物含有一种或多种氨基酸和/或盐(例如组氨酸和NaCl)以及存在非离子表面活性剂(例如80)且任选的稳定剂(例如苯甲脒或者苯甲脒衍生物，例如参见US7612066)。

根据本发明可以使用的非离子表面活性剂/乳化剂包括聚山梨醇酯如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯(聚山梨醇酯80，80)、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯61、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯21、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯81、聚山梨醇酯85和聚山梨醇酯120，以及聚氧乙烯硬脂酸如聚乙二醇8硬脂酸(PEG 400单硬脂酸)、聚乙二醇2硬脂酸、聚乙二醇4硬脂酸、聚乙二醇6硬脂酸、聚乙二醇12硬脂酸、聚乙二醇20硬脂酸、聚乙二醇30硬脂酸、聚乙二醇40硬脂酸、聚乙二醇50硬脂酸、聚乙二醇100硬脂酸、聚乙二醇150硬脂酸以及聚乙二醇4二硬脂酸酯、聚乙二醇8二硬脂酸酯、聚乙二醇12二硬脂酸酯、聚乙二醇32二硬脂酸酯、聚乙二醇150二硬脂酸酯。

在所述组合物中组分的合适的浓度范围可以为例如5-25mM组氨酸(适合地10-15mM组氨酸)、10-50mM的NaCl(适合地30-40mM的NaCl)和0.001-0.01％的80(适合地0.005％-0.008％的80)以及任选的0.5-5mM的苯甲脒(适合地1-2mM的苯甲脒)。

本文中使用的术语“突变蛋白质”指的是因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的类似物，其中，因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的天然存在的组成中的一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代或缺失，或者将一个或多个氨基酸残基加入到血因子的原始序列上，而所得的产物与原始的血因子相比活性并未发生显著变化。因此这些突变蛋白质由已知的合成技术和/或定点诱变技术(site-directed mutagenesistechniques)或任何其它已知的适当的技术制备而得。

根据本发明的突变蛋白质包括由核酸如DNA或者RNA编码而得的蛋白质，该核酸在严格条件(stringent conditions)下杂交了编码本发明中的因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的DNA或者RNA。术语“严格条件”是指杂交条件和随后的洗涤条件，也就是本领域普通技术人员通常所指的“严格”(Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Interscience,N.Y.,sections 63and 6.4(1987,1992)；Sambrook et al.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1989))。

严格条件的例子包括但不限于洗涤条件为比计算出的所研究的杂合体的Tm低12-20℃，在例如2×SSC和0.5％SDS中洗涤5分钟，在2×SSC和0.1％SDS中洗涤15分钟；在0.1倍的SSC和0.5％SDS中在37℃下洗涤30-60分钟，然后0.1×SSC和0.5％SDS中在68℃下洗涤30-60分钟。本领域普通技术人员能够理解的是：严格条件也取决于DNA序列、寡核苷酸探针(如10-40个碱基)或者混合的寡核苷酸探针的长度。如果使用混合探针，优选使用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC。

优选地，任何这种突变蛋白质都具有充分复制的因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的氨基酸序列，或者甚至更好的是，具有充分复制的因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的活性。

因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的一个特征活性为它的参与凝血级联的能力以及检测因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的分析试验中。只要突变蛋白质具有基本的血因子活性，就可以认为它具有与血液子大体上相似的活性。因此，可以通过常规的实验手段，包括用本文所述的分析试验来测定任何给定的突变蛋白质是否与因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C具有至少大体相同的活性。

在优选的实施方式中，任何这种突变蛋白质与因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的氨基酸序列相比具有至少40％的同一性或同源性。更优选地，具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或者最优选地具有至少90％、95％、98％或者99％的同一性或同源性。

同一性反映了两种或多种多肽序列或者两种或多种多核苷酸序列之间的关系，通过比较序列来测定。通常，同一性涉及在被比较的序列的长度上，分别准确地比较两种多核苷酸序列的核苷酸与核苷酸之间的对应或者多肽序列的氨基酸与氨基酸之间的对应。

对于没有准确对应的序列，则可以用“百分比同一性”(percent identity)测定。通常，将待比较的两个序列对齐以给出序列间的相关性最大值。这可以包括在一个序列或者两个序列间插入“空位(gap)”来提高对齐的程度。百分比同一性可以在所比较的每个序列的全长上进行测定(所谓的总体比对)，这种比对尤其适合具有相同或非常相似长度的序列；或者也可以在限定的较短长度上进行测定(所谓的局部比对)，这种比对更适合于不等长的序列。

比较两个或多个序列的同一性和同源性的方法在本领域是公知的。例如，可以使用Wisconsin序列分析包9.1版的软件(Devereux,et al.,Nucleicacids Research,12:387(1984))，例如可以使用BESTFIT和GAP软件来测定两个多核苷酸之间的百分比同一性，以及测定两个多肽序列之间的百分比同一性和百分比同源性。BESTFIT使用Smith和Waterman的“局部同源性”算法(Advances in Applied Mathematics,2:482-489(1981))，并找出两个序列之间的最佳相似性单一区域。其它用来测定序列之间的同一性和/或相似性的软件在本领域是已知的，如BLAST家族的软件(Atschul et al.,J.Molec.Biol.215:403(1990)，通过进入NCBI的主页www.ncbi.nlm.nih.gov就能使用)和FASTA软件(Pearson W R,Methods in Enzymology,183:63-98(1990))。

根据本发明，可以使用的因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的突变蛋白质包括置换多肽的有限的一组基本相对应的序列，基于本发明的教导和指导，本领域普通技术人员无需经过过多的试验就能够得到这些突变蛋白质。

优选地，根据本发明的突变蛋白质中的改变是指公知的“保守”(conservative)置换。因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的保守氨基酸置换可以包括在具有足够相似的物理化学性能的组内的同义氨基酸(synonymous amino acids)，组内成员间的置换能够保留分子的生物功能。很明显，也可以在上述限定的序列中进行氨基酸的插入和缺失且不改变它们的功能，尤其是当插入或缺失仅仅涉及少许的氨基酸，如30个以内，优选10个以内，并且没有移除或取代对功能构象很重要的氨基酸，如半胱氨酸残基时。由这种缺失和/或插入制得的蛋白质和突变蛋白质都属于本发明的保护范围。

因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸经常能够互相置换(具有脂肪族侧链的氨基酸)。这些可能的置换中，优选使用甘氨酸和丙氨酸互相置换(因为它们具有相对短的侧链)，使用缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸互相置换(因为它们具有较大的疏水脂肪族侧链)。其它通常能够互相置换的氨基酸包括：苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；半胱氨酸和蛋氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。这种性质的置换通常被称为是“保守的”或“半保守的”氨基酸置换。

可以利用任何适当的技术例如使用定点诱变技术来实现相对于本发明的融合蛋白序列的氨基酸改变。

能够理解的是，可以通过使用天然存在或非天然存在的氨基酸，来实现本发明范围内的氨基酸置换或插入。无论使用的是天然的还是合成的氨基酸，优选仅存在L-氨基酸。

另外，也可以使用包括因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C，与其他肽或蛋白片段相互融合的融合蛋白，只要所述融合蛋白保留了因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的活性。一般而言，本文中的术语“融合蛋白”是指通过包括氢键或盐桥的化学方式，或通过由蛋白质合成的肽键，或是通过上述两种方式连接在一起的一种或多种蛋白质。

本文所使用的术语“功能衍生物”涵盖了因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的衍生物和它们的突变蛋白质，可以通过本领域已知的手段，由在残基上以侧链的形式存在的功能基团或附加于N-或C-端基团的功能基团制得，只要它们保持药学上可接受的性质，也就是它们没有破坏蛋白质的活性并大体上与血因子的活性相似，也没有将毒性赋予含有它的组合物，就都属于本发明的内容。

例如，这些衍生物可以包括羧基的脂肪族酯、羧基通过与氨或伯胺或仲胺反应生成的酰胺、氨基酸残基中的游离氨基与酰基部分(例如烷酰基或羧基芳酰基(carboxylic aroyl groups))形成的N-酰基衍生物、或由游离羟基(例如丝氨酰残基或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物，包括例如可利用羟基残基的糖基化。

根据本发明的“血因子的活性片段”可以是因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C或本文定义的突变蛋白质的片段。术语片段是指分子的任何子集(subset)，也就是保持所需生物活性的较短的肽。可以很容易地通过从血因子分子的任何一端消除氨基酸而得到片段并如本文中所描述的测定所得片段的性质。用于从多肽的N-端或C-端移除一个氨基酸的蛋白酶是已知的，并且测定保持所需生物活性的片段仅涉及常规实验。

如因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的活性片段、突变蛋白质和它的活性片段，本发明进一步涵盖了单独的或与相关分子或残基连接(例如，糖或磷酸盐残基)的蛋白质分子的多肽链的任何片段或前体，或蛋白质分子或它们的糖残基的聚集物，只要所述片段与因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C具有大体相似的活性。

本文中的术语“盐”指的是因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C分子或其类似物的氨基的酸加成盐(acid addition salts)和羧基盐。羧基盐可用本领域已知的方法制备，包括无机盐，例如，钠盐、钙盐、铵盐、三价铁盐或锌盐等，以及与有机碱形成的盐，例如胺类，如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等。酸加成盐包括例如与矿物酸，例如盐酸或硫酸形成的盐，以及与有机酸例如醋酸或草酸形成的盐。当然，这些盐必须保留如上所述的血因子的生物活性。

在本文中对患者给药治疗药剂的内容中所使用的，术语“曲线下面积”或“AUV”的定义为把患者体循环内的药物浓度作从零到无限大的时间的函数，所得到的曲线下方的总面积。本文中使用的术语“清除率”或“肾清除率”的定义为每分钟排出血浆体积中含有的药物的含量。

在对患者给药肽药物的内容中，本文使用的术语“半衰期”或“t1/2”的定义为患者体内的药物血浆浓度减少至一半所需要的时间。根据多种清除机理、重新分配和其它本领域已知的机理，与肽药物相关的半衰期可以多于一种。通常，定义为α和β半衰期其中α相和重新分配有关，而β相与清除率有关。然而，对大部分情况而言，蛋白质药物局限于血流中，就可能有至少两种清除率半衰期。如本领域所熟知的，聚乙二醇化对α相和β相半衰期的精确影响会随着分子尺寸和其它参数而变化。对“半衰期”的更多解释可参见《Pharmaceutical Biotechnology》(1997,DFA Crommelin and RD Sindelar,eds.,Harwood Publishers,Amsterdam,pp 101-120)。

在对患者给药肽药物的内容中，本文使用的术语“停留时间”的定义为给药后药物在患者体内停留的平均时间。

在对患者给药肽药物的内容中，本文使用的术语“免疫原性”的定义为在给药后或重复给药后在患者体内药物引发免疫反应的倾向。

本文使用的术语“分子尺寸”意思是药剂的重量、尺寸和/或形状。因此，“通过改性增加分子尺寸”意思是增加所述药剂的分子尺寸使得其物理大到不能通过血管壁进入血流。所述分子尺寸，并不意味着增加分子量，如果，例如，在改性之前截断药剂。分子尺寸可以包括分子/重量、大小和/或构象并假定改性药剂保持了活性且在没有通过淋巴系统递送下不能直接穿入血管。

本文使用的术语“皮下递送”或“皮下给药”意思是由任何适合的方法使所述治疗药剂被递送通过皮肤直接到皮下空间。

在所述改性药剂的皮下剂量的内容中，本文使用的术语“剂量调整”意思是静脉的改性药剂的剂量乘以函数静脉C_max/皮下的C_max。如本文所解释的，本发明的方法使得可以以较少频率的剂量和/或较高剂量施于患者当与未改性的药剂或者静脉给药的改性药剂相比时。在皮下剂量的内容中“剂量未调整”是指递送与将进行静脉递送的改性药剂的静脉剂量相同的剂量。

本文使用的术语“皮下空间”是指皮肤下的结缔组织。它包括血管、血流和内脏。

“原始形态”是指改性之前的药剂存在的状态以及该状态通常以药学可接受的形式对患者进行静脉给药。

本发明的皮下剂型(subcutaneous dosage form)可以进一步包括药学可接受的稀释剂、佐剂或者载体。适合于皮下给药的皮下剂型可以包括含水的和/或无水的无菌注射液(S)(其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使得所得剂型与打算接受者的血液等渗的溶质)；含水的和无水无菌的悬浮液(可以包括悬浮剂和增稠剂)。可以用于注射溶液中的赋形剂例如包括水、醇类、多元醇、丙三醇和植物油。所述组合物例如可以保存于单剂量的或多剂量的容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，以及可以保存于冷冻干燥(冻干)的条件下只要在使用下即刻添加无菌液体，例如注射用水。临时注射液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制得。

通常，所述皮下剂型可以含有防腐剂、溶解剂(solubilising agents)、稳定剂、湿润剂、乳化剂、着色剂、盐(本发明的活性物质本身就可以以可药上课接受的盐的形式提供)、缓冲剂或抗氧化剂。它们还可以含有除本发明物质之外的有治疗活性的药剂。本发明的皮下剂型还可以和药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体一起使用。这类赋形剂可以包括但不限于生理盐水、缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲生理盐水)、葡萄糖、脂质体、水、丙三醇、乙醇以及它们的组合。

本文描述的皮下剂型的皮下给药可以以对治疗患者的疾病有效的任何有效、便捷的方式进行。该剂型可以为液体形式或者固体形式。液体形式可以为随时可使用的或者制备成浓缩液然后在皮下给药前进行稀释。固体形式可以适于在合适的给药载体中重建以用于皮下给药。在治疗或作为预防药中，作为可注射组合物对患者进行给药的活性的药剂可以为，例如以无菌水分散液，优选等渗的。

根据本发明的另一个方面，这提供了用于皮下给药每月不多于一次的聚乙二醇化凝血因子的液体剂型在治疗凝血失调中的应用，所述剂型的C_max为静脉给药该改性的血液因子所得的C_max的至少10％且不多于90％。

本发明的这个方面还包括一种患者的凝血疾病或者创伤的治疗方法，该方法包括对所需患者皮下给药如本文定义的改性凝血因子的剂型。

本发明因此还提供了一种将改性凝血因子制备成药物的应用，该药物含有如本文定义的用于治疗患者凝血失调的剂型，其中，所述药物可用于皮下给药且具有C_max为静脉给药该改性的血液因子所得的C_max的至少10％和且不多于90％。适当地，所述C_max为20％-80％，或者30％-70％，或者40％-60％。在一种实施方式中，C_max为75-80％并且所述血因子可以为FVII。在另一种实施方式中，C_max为10％-25％并且所述血因子可以为FVIII。在另一种实施方式中，C_max为40％-60％并且所述血因子可以为FIX。

凝血疾病或者失调可以通过凝血因子的功能缺失进行区分，或者自身抗体的产生进行区分。凝血疾病的例子包括血友病A和血友病B。

因子VIIa可以用于在治疗血友病A或B的出血事件，或用于具有分别对抗FVIII或IX的抑制抗体的患者的治疗中。因子VIII可以用于在治疗血友病A的出血事件以及因子IX可以用于在治疗血友病B的患者。

本文中使用的术语“治疗”包括任何有益于人类或非人类哺乳动物的方式。“非人类哺乳动物”的治疗可以延伸至家养动物的治疗，包括马和宠物(例如猫和犬)以及农场/农用动物包括绵羊、山羊、猪、牛和马科的成员。所述治疗可以是针对任何已存在病情或失调，或可以是预防性的(预防治疗)。所述治疗可以是关于遗传性的或获得性的疾病。所述治疗可以是关于急性的或慢性的疾病。

本发明所述的皮下剂型可以单独使用或与其他化合物结合使用，如治疗化合物或者分子，如抗炎药、止痛剂或抗生素、或其他药学上活性的药剂(可以促进或提高因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的活性)，例如另一种凝血因子。与其他化合物一起的给药可以是同时地、分别地或连续地给药。这些组分可以可以制备成为试剂盒(kit)的形式适当地可包括有使用说明。

在所述凝血级联中的活性水平可以由任何合适的分析试验进行测量，例如全血凝固时间(WBCT)测试或者活化部分凝血活酶时间(Activated PartialThromboplastin Time，APTT)。

所述全血凝固时间(WBCT)测试测量的是全部血液在外部环境中(通常为玻璃管或盘)形成血块的实际时间。

所述活化部分凝血活酶时间(APTT)测试测量的是部分凝血途径(bloodclotting pathway)的参数。它在血友病中和静脉注射肝素治疗中异常升高。所述APTT需要几毫升静脉血。所述APTT时间为测量凝血系统的一个部分称为“内源性途径(intrinsic pathway)”。所述APTT值为在实验室测试中对于特定的凝血过程的以秒计的时间。这个结果常与正常的血液的“控制”样品进行比较。如果所述测试的样品比控制的样品时间长，表示在内源性凝血途径中的凝血功能减少。一般药物治疗目的是使得APTT的范围大约为45-70秒，但是该值也可以被表示为测试对正常值得比例，例如1.5倍正常值。在不存在肝素治疗下的高APTT可能是由于血友病，其可以要求进一步的测试。

本发明还提供了包括本发明的皮下剂型和给药载体(包括用于皮下给药的可注射液)的试剂盒(kit of parts)，所述试剂盒适合地包括有它的使用说明书。

在本发明的一种实施方式中，提供了一种用于皮下给药的改性凝血因子(适于因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C)的药物组合物的剂型，当配置用于皮下给药到患者时，提供了一种足够维持所述患者全血凝固时间少于15分钟的每月不多于一次的剂型。该剂型具有的C_max为静脉注射给药的同等参考剂型的至少10％且不多于90％。

因此，本发明提供了用于皮下给药的一种改性凝血因子(选自因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子VIIa、因子V、因子XIII、冯维勒布兰德因子或者蛋白C的组成的组)的药物组合物的剂型，当配置用于皮下给药到患者时，提供了一种每月不多于一次的却足够维持所述患者全血凝固时间少于12分钟的剂型。

因此，本发明的一种实施方式中提供了用于每周不多于一次的皮下给药的25-50IU/kg的聚乙二醇化凝血因子(选自由因子VIIa、因子VIII和因子IX组成的组)的药物组合物的剂型。

本发明的液体剂型可以包括本文中定义的用于皮下给药的每月不多于一次的聚乙二醇化凝血因子，其中，在用于治疗凝血失调时，该剂型具有的C_max为至少10％和不多于90％。

发现这样的组合物可以在患者的凝血疾病或者创伤的治疗方法中特别实用，该方法包括对所需患者皮下给药根据本发明的凝血因子的剂型。

皮下给药的本发明的剂型具有生物利用度和功效比得上通过循环滴定度(circulating titre)和凝血活性的静脉给药各自的改性凝血因子类似物时的水平。

本发明的另一种实施方式中，提供了皮下给药的剂型，该剂型包括如本文定义的被改性凝血因子，即将直链的、单分散的聚乙二醇分子通过三碳桥部分连接到在蛋白质中单一的二硫键。

本发明的液体剂型可以由在水溶液中配制PEG缀合的凝血因子制得，并缓冲到生理学的以及存在非离子表面活性剂以及任选的稳定剂。

本发明第二方面和随后的几方面的优选特征可对照用于第一方面中。

根据本发明的改性药剂的产品影响已经显示出优于静脉递送相同的改性药剂的情况。产品影响可以定义为例如，在所述WBCT中的改进。此定义为将具体的时间点得到的WBCT除以初始的WBCT。使用此方法，皮下递送改性凝血因子持续地显示出比静脉递送同种产品在相同的时间点时的更高的产品影响。

根据本发明，皮下给药改性治疗药剂(例如通过添加生物相容性聚合物)将引起较低的免疫反应。此效果与在本发明之前在药物制剂给药领域中的普通技术人员所预期的效果完全相反。例如，在血因子配制的领域中，普遍认为皮下给药未改性的血因子药预期会去激发免疫性反应(产生FVIII抑制剂)或者通过已存的FVIII抑制物引发免疫反应。

凝血因子的相关免疫反应可以在Bethesda units中被测量。Bethesda unit(BU)为凝血抑制能力的计量单位。根据《Practical Haemostasis》，“1Bethesdaunit(BU)被定义为正常血浆中在2小时后、37℃下在血浆样品中的抑制物中和50％的1单位的因子VIII：C的量。”(Schumacher,Harold Robert(2000).Handbook of Hematologic Pathology.Informa Health Care,p.583)。

本发明中，发现了非常意外的结果。为了降低免疫(抑制物)反应的发生率，提出了采用皮下给药使得免疫反应的水平直接与全身性暴露(systemicexposure)水平有关。通过皮下递送，所述C_max可以从根本上降低，且这样做可以降低免疫反应。

例如，本发明描述了当血因子与聚合物如PEG缀合时发生的令人意外的贮库作用。而且，该结果表示调控速率是可能的，即控制PEG的尺寸(或数量)来调节加到蛋白质上的水合作用水平使得血因子便于从皮下空间获得。

从本申请的结果可以看出，对于由一个聚合物链改性的治疗药剂，这样的药剂具有比相应的双缀合形式(即加入有两个聚合物链)的更慢的血浆进入速率。

换句话说，所述单一缀合产品相对于双缀合产品来说将具有更多的蛋白质被暴露。此情况意味着较高阶的缀合形式(higher-order conjugated forms)的水分散性更好也因此通过通过淋巴管快速进入血浆。

因此出人意外地，越是要获得更长的贮库释放的持续时间，就越是需要更小的改性程度。不被理论所束缚，这可以合理地解释为由更小的改性程度将暴露一些治疗药剂到皮下组织，便赋予较慢的扩散进入淋巴的速率。与之相对，更高的改性程度完全覆盖了治疗药剂并使得该产品自由快速地进入血液循环。

总的说来，本发明存在非常意外的整体效果，通过随改性后皮下递送，使得皮下(SQ)给药后在表观半衰期内观测到35倍的增加。

最后，综上所述，生物利用度偏好较高阶的缀合形式，并证实越高的改性水平和水合作用水平促使更高的移动性水平并因而更高的生物利用度。

每一个方面的所有特可比照用于本发明的所有其他方面。

本文还参照以下附图，其中：

图1显示了凝血级联。缩写词：HMWK-高分子量激肽原；PK-前激肽释放酶；PL-磷脂。

图2显示了二硫化物-特异性生物高分子缀合化学所涉及的步骤并使用聚乙二醇化反应物为缀合反应物的例子(取自Shaunak et al.in Nat Chem Biol.2006；2(6):312-313)。

图3显示了在对受试犬1皮下(SQ)给药PEGhrFIX以及对受试犬2皮下(SQ)给药hrFIX的全血凝固时间(WBCT)。

图4显示了SQ给药后随时间的APTT(活化部分凝血活酶时间)值。

图5显示了SQ给药后的保留血浆的APTT。

图6显示了SQ给药后相对基线的APTT的相对值。

图7显示了SQ给药25IU/Kg后的受试犬9的WBCT。

图8显示了200ug/kg rFVIIa后FVIIa的PK剖面图以及参数。

图9显示了800ug/kg TheraPEG-rFVIIa后FVIIa的PK剖面图以及参数。

图10显示了1600ug/kg TheraPEG-rFVIIa后FVIIa的PK剖面图以及参数。

图11显示了血浆中(所有犬)FVIII的浓度。

图12显示了血浆中(仅对犬SQ给药)FVIII的浓度。

图13显示了对于PEGFVIII的皮下给药(SQ)相比于静脉(IV)给药的免疫者数据(Bethesda值)，受试者的数量由“n”给出。

下面将参照下述实施例对本发明进行进一步的描述，本发明所包括的实施例目的仅在于说明，而不应被理解为是对要保护的发明的限制。本发明的剂型的皮下给药参照给出的SQ(s.c.)和静脉给药为IV(i.v.)。

实施例1：准备剂型和皮下给药

该研究包括皮下给药后对hrFIX的生物利用度和功效的评估。通过循环滴定度和凝血活性，将裸的hrFIX(未聚乙二醇化)与它的聚乙二醇化类似物进行对比。

10kDa聚乙二醇化hrFIX是按照以下标准技术制得，其中将10kDa、直链的、单分散的聚乙二醇通过三碳桥接至一个二硫键进行缀合。

准备用于给药的测试组(test article)，即制备合适的水溶液，缓冲到pH6.8并含有10mM的组氨酸、40mM的NaCl和0.005％的80。并加入1mM的苯甲脒作为稳定剂。

在hrFIX的稀释研究显示PEGrFIX的25％稀释具有差不多的凝血时间的基础上，此研究的分配效力(allocated potency)为4×蛋白质当量。控制组被提供为冻干粉并准备用于给药且附上了重建的说明。该运载载体与上述描述的PEG的相同。

作为此研究的附属，决定了探索rFIX皮下给药的可能性。从上述观察显示出rFIX的聚乙二醇化形式具有适合于皮下给药的前景，源于PEG为蛋白质提供了屏蔽作用。历史上认为SQ路线对FIX不可用，因为考虑到这将会加剧抗体产生的发生率和不会在血液中进入有意义的量。

在本研究的该部分中将PEGhrFIX 50IU/Kg皮下给药到附加的受试动物(犬1)以及相比于裸的hrFIX的2组SQ给药(至2个其他受试者，分别命名为犬6和犬2)。

在这个具体的表现中，每个动物有一个稍微不同的基线，因此未来便于比较，预给药的APTT水平进行标准化为1。犬1和犬2为2010年1月在前面PEGrFIX试验中的受试者，其中记录的静脉给药后的血浆滴定度可以用于比较。

在规律的时间期间并遵循滴定度和凝血作用的衰减取出血样。表1为在静脉给药后随着FIX循环22小时测量的滴定度。

表1

表2表示了在皮下(SQ)给药后FIX循环22小时测量的滴定度的比较。

表2

可以看出的是通过SQ路线的25IU/Kg的在循环中检测不到，且50IU/Kg的PEGhrFIX在血浆中几乎检测不到。与之鲜明对比的是PEGhrFIX的SQ给药的水平(7.8)接近于的IV给药产品的水平(9.9)。

随后研究了滴定度在凝固时间的校正上的作用。首先记录了全血凝固。皮下给药后的WBCT如表3和图3中所示。另外，在皮下给药后APTT在Junior上也进行了记录并且该值如下表4(全血柠檬酸化的，Whole blood citrated)和图4中所示。在保留血浆样品上的该APTT值如表5和图5中表示的同样是皮下给药后。

表3

*注释-45分钟为检测停止的时间，由于已经没有血块形成，根据标准方法。

**两只犬都是无经验的犬，这意味着它们以前没有接触过FIX。

表4

表5

图6-此收集的数据清晰的表示裸的rFIX经皮下注射(几乎)没有生物相容性。这完全是从公开发表的文献和本领域普通技术知识中可预期的。令人更惊讶的是在PEGhrFIX皮下注射后能够检测到如此高的rFIX循环滴定度。的确，在表10中可以看出约80％的皮下注入的PEGrFIX可以参与止血控制。

在凝血时间测量中对比最为明显，对于rFIX的WBCT和APTT都几乎没有进行修正，然而，来自于皮下注射的PEGhrFIX立刻修正了凝血时间。通过一次50IU/kg的皮下注射后，这些测量的止血持续时间可以延长至大约1周。

实施例2：对犬9皮下给药(SQ)hrFIX

给定上述SQ研究为成功的，则确定实施进一步的PEGhrFIX的一次SQ给药并同样伴随着在较长时间内的止血控制。选择的是无经验的受试犬9来探索给药SQ路线对中和抗体的影响。

人血因子在犬中的研究会被犬类免疫系统对人类蛋白的反应所混淆。因此在犬的研究中人类的rFIX是异种蛋白(xenoprotein)从而和抗体应在给药了测试组后的某一时刻进行预期。的确，当受试者再次引入人类血因子时，抗体的产生更显著和更迅速。皮下给药后的受试犬1和犬7结果是具有一个缩短的止血时间。

受试者犬9是无经验的动物并给予小的皮下剂量，因此显露了本发明能够提供的聚乙二醇化血因子真实的持续保护。因为因为犬9先前没有接触人类血因子，从而观察到了真实潜在的(令人惊讶的高度)的结果。

图7表示的是对犬9皮下给药(SQ)25IU/Kg的剂量为1ml(体积1ml)聚乙二醇化IB1001的WBCT结果并且记录在下表6中。

表6

实施例3：对比例

比较FIX和PEG-FIX的静脉给药和皮下给药。

表7*

*-来自于McCarthy et al Thromb.Haemost.87(5)824-830,(2002)。

表8

PEGFIX＝PEG-hrFIX

结果表示皮下剂量C_max是静脉剂量的78.8％。该IV和SQ的百分比值与正常的相比好像是低了，但实际上是试验中的人为影响。假设在每种情况下，FIX与细胞一起被离心下来以作为制得的样品。可以看出静脉剂量的9.9％的值实际上代表了好结果。所以，与皮下剂量的7.8％的对比是有利的，如由给出的C_max计算值所指明的。

总结：

通过皮下注射25和50IU/kg的hrFIX给药，结果是在受试犬类中几乎不能检测到循环滴定度且没有修正血友病。

与上述形成鲜明对比的是，50IU/kg的PEGhrFIX的皮下剂量带来上升至大约80％的生物利用度和修正的凝血时间至在正常的范围内持续1周。

实施例4：具有20kDa PEG的因子VIIa

该实施例记录了对经皮下注射的PEGFVIIa的血因子生物利用度的研究。将两只血友病犬(HB)在0时刻采用等量的PEGFVIIa进行处理；一只为静脉注射(IV)，一只为皮下注射(SQ)。取出血样和回收血浆以测量FVIIa蛋白。表中的结果显示皮下给药的生物利用度为89.5％。

表9

PEG的存在赋予水溶性有助于在淋巴管中的移动性。该数据表示比团注峰以及比相应的IV注射更稳定的FVIIa的控制输注。

该曲线下面积表明聚乙二醇化FVIIa的生物利用度为89.5％，当皮下递送时FVIIa的水平更稳定。

实施例5：PEGFVIII药物产品

为了对比，将FS(市售的重组FVIII)作为参照。作为聚乙二醇化赋形剂，使用了大量的80。

聚山梨醇酯，80，具有1310g/mol的分子量(其中880g来自于聚乙二醇化)(全部的单体单元为20，其中每个携带44g/mol，(CH2-CH2-O))。

该计算是这样：

摩尔PEG等效长度：

表10

的比例 5.86E+02

PEG当量摩尔质量(equivalent Mol Wt.) 5.16E+05

因此，在FS中，每一个FVIII分子中具有相应的516kDa当量的PEG。相比之下，根据本发明制备的PEGFVIII剂型具有单一的20kDaPEG。

总结：在剂量对剂量的基础上，聚乙二醇减少了25.8倍；给出本发明的PEG-FVIII剂型可以每周给药一次，相对于的预防性应用在一周三次的基础上，在PEG给药中存在着下降约80倍的潜在的整体下降；从而通过本发明的FVIII剂型给药的PEG的量在给药期间为给药下的1.25％。

实施例6：皮下给药FVIIa

本研究目标是在血友病B犬中静脉给药和皮下给药后调查TheraPEG化和非

-TheraPEG化的重组人类FVIIa(分别地TheraPEGylated和FVIIa)的药代动力学。

转基因的FVIIa(rFVIIa)的TheraPEG化是根据WO 2011/135308得以实现。TheraPEGrFVIIa作为亲液物(lyophile)在多个批次中被提供到测试位点，在与高纯度水重建基础上，得到在生理学可接受的缓冲中的1mg/ml的TheraPEGrFVIIa且保持了FVIIa的活性。

该实验动物为拉萨阿普索-贝生吉杂交的犬(Lhasa Apso-Basenji crossdogs)患有严重先天性血友病B，这由在F9基因中的5-bp缺失和C→T转变引起的导致早期的终止密码子和不稳定的FIX转录物。在给药之前，所有犬经测试证实为处于正常健康状态，包括完整的血液化学(blood chemistry)、血清化学纤维蛋白原分布图(serum chemistry profile fibrinogen)、纤维蛋白原衍生肽(FDPs)、凝血酶原时间和尿液检查。静脉(IV)给药是通过团注进入头静脉。皮下(SQ)剂量是在肩胛骨之间给药的作为单次剂量。

TheraPEGrFVIIa个别的批次被重建和然后合并以生产用于这些动物的单次剂量溶液如表11中所述。

表11

拟定在以下时间点从每只犬取走5ml血样：

给药前以及给药后10、30分钟，1、2、4、8、12、18、24、36、48、72、96、120、144、168、192、216和240小时。

将4ml血样转移到在冰上的含有0.109M柠檬酸三钠抗凝血剂的管中(9:1v/v)。将剩余的柠檬酸化血液离心分离以准备血浆，将所得的血浆样品按照等分试样保存于-80℃。将血浆的一个等分试样通过ELISA测定FVIIa的浓度。

该Stago Asserachrom VII:Ag ELISA分析法是对血浆样品中的因子VII/VIIa浓度进行定量测定的酶联免疫分析方法。该分析法为夹心ELISA(sandwich ELISA)，包括预先涂有兔子抗人类FVII抗体微滴定孔(microtitrewells)。因为该抗体对于FVIIa具有的亲和力与对PEG-FVIIa的不同，通过稀释蛋白质以适于存在于受检血浆中的FVIIa来获得标准曲线，即，rFVIIa(0.78-50ng/ml)用于分析给药了rFVIIa的犬的血浆，或者PEG-rFVIIa(0.78-50ng/ml)用于分析给药了PEG-rFVIIa的犬的血浆。

血浆样品稀释至适当的浓度落到标准曲线范围内。在洗涤前将稀释的血浆样品和标准品装载并在室温下培养然后在洗涤后与兔子抗人类FVII HPP缀合物和OPD(一种比色HRP基质)进行培养。在492nm下读板并从标准曲线上读出测试样品的浓度(ng/ml)。

表12

表13

表14

药物代谢动力学

对于200ug/kg的FVIIa、800ug/kg的TheraPEG-rFVIIa和1600ug/kg的TheraPEG-rFVIIa的IV和SQ数据图(profiles)以及PK参数如图8、9以及10(表12、表13和表14)中所示。发现TheraPEG-rFVIIa的半衰期为14和27小时之间，这相比非聚乙二醇化的rFVIIa的2.3小时半衰期来说具有明显的延长。TheraPEG-rFVIIa的1600ug/kg IV剂量的AUC比800ug/kg IV的剂量高1.8x。然而，1600ug/kg SQ的剂量只比800ug/kg的剂量高1.2x。这反映了对于800ug/kg和1600ug/kg剂量的生物利用度计算值分别为67％和45％，这代表相比于所得到的非聚乙二醇化rFVIIa的11％SQ生物利用度来说有显著地增加。

TheraPEG-rFVIIa的800ug/kg IV的剂量的AUC是继200ug/kg IV非聚乙二醇化rFVIIa的AUC的84x，以及TheraPEG-rFVIIa的800ug/kg SQ的剂量的AUC是非聚乙二醇化rFVIIa的200ug/kg SQ的300x。

实施例7：皮下给药FVIII

本研究的目标为调查对血友病B犬静脉给药和皮下给药时TheraPEG化血浆衍生的FVIII(TheraPEG-pdFVIII)的药代动力学和药效学。如WO2011/135307中描述的制备TheraPEG-pdFVIII，其具有20kDa线性PEG并且进一步纯化得到纯化的TheraPEG-pdFVIII。

该实验动物为灵缇犬杂交犬(greyhound cross dogs)，其具有严重的先天性血友病A，并且之前给药过犬的血浆以治疗自发性的出血，但是对人类FVIII治疗无经验。给药之前，所有动物经测试证实为处于正常健康状态，包括完整的血液化学、血清化学纤维蛋白原分布图、纤维蛋白原衍生肽、凝血酶原时间和尿液检查。

表15表示了每只犬的重量和FVIII给药剂量。每只犬被接受了任一高剂量(大约：0.14mg/kg)的TheraPEG-pdFVIII或者低剂量(0.07mg/kg)的或者0.03mg/kg的非聚乙二醇化pdFVIII。静脉(IV)给药是通过头静脉团注给药。皮下(SQ)给药是肩胛骨之间单次给药。

表15

拟定在以下时间点从每只犬取走血样：给药前以及给药后10、30分钟，1、2、4、8、12、18、24、36、48、72、96、120、144、168、192、216和240小时。整个血液(非柠檬酸化)用于全血凝血测量和激活凝血时间测量。将剩余的血样转移到在冰上的含有0.109M柠檬酸三钠抗凝血剂的管中(9:1v/v)。所述活化部分凝血活酶时间的测量是在柠檬酸化血液上进行。将柠檬酸化血液离心分离以准备血浆，将所得的血浆样品按照等分试样保存于-80℃以用于FVIII抗原ELISA。

全血凝固时间测量(WBCT)

血液样品分装于2个离心管(vacutubes)中，(2×0.5ml)，并仔细观察且周期的和明断的调平该管直到通过全水平位置上的流动终止确定形成了血块为止。通过保持该管至完全倒置的位置来观察该血块的质量。记录的所述WBCT为从样品提取直至肉眼观察到两个样品有血块的总时间的平均值并且在倒置的位置该血块的质量也被记下。

活化凝血时间(ACT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)

所述ACT和APTT测试是根据制造商的说明书通过使用Haemachron Jr血凝分析仪(International Technidyne Corps)进行测试的。

血浆样品中的FVIII抗原的浓度是通过ELISA并根据制造商的说明书使用来自Affinity Biologicals(Ancaster,Ontario,Canada)的Visulize FVIII抗原试剂盒进行确定的。

结果

全血凝固时间(WBCT)

已经接受了较高剂量的TheraPEG-pdFVIII(HA1-4)的所有犬保持的止血(WBCT<12分钟)为80-100小时。这在IV和SQ给药的WBCT分布上没有什么区别。SQ给药较低剂量的TheraPEG-pdFVIII(HA6)保持的止血为56-75小时。相反，尽管，SQ给药非聚乙二醇化FVIII减少了WBCT，但它并没有获得低于12分钟持续的WBCT。

活化凝血时间(ACT)

已经接受了较高剂量的TheraPEG-pdFVIII(HA1-4)的所有犬其ACT都减少到小于200秒的正常范围并给药后持续大约80小时。这在IV和SQ给药的ACT分布上没有什么区别。

SQ给药较低剂量的TheraPEG-pdFVIII(HA6)保持的ACT为200秒以下并持续至少36小时。相反，尽管，SQ给药非聚乙二醇化FVIII减少了ACT，但它并没有获得低于200秒持续的ACT。

活化部分凝血活酶时间(APTT)

已经接受了较高剂量的TheraPEG-pdFVIII(HA1-4)的所有犬其APTT都减少到少于60秒并给药后持续大约在60小时。这在IV和SQ给药的APTT分布上没有什么区别。

SQ给药较低剂量的TheraPEG-pdFVIII(HA6)保持的APTT为60秒并持续了4小时。相反，尽管，SQ给药非聚乙二醇化FVIII减少了APTT，该最短的APTT时间为80秒。对于给药后的持续时间研究为什么个体的APTT保持在基线值以下的原因是不清楚的，但是可能是由于犬与犬的差异(dog-to-dog variation)。

FVIII血浆浓度和药物代谢动力学

所有犬中的FVIII血浆浓度对时间如图11中所示的。对于仅进行SQ给药的犬的数据在图12中显示。原始数据列于表23-28中。关键的PK参数在表16中所示。

对于HA1和2的TheraPEG-FVIII SQ给药的半衰期分别为18.3小时和16.6小时。当IV给药时，对于HA3和4的半衰期稍短分别为15.2小时和13.9小时。SQ给药后的生物利用度计算为32％。SQ给药非聚乙二醇化FVIII(HA5)后的FVIII浓度大体上低于定量标准，因此不能计算PK参数。

表16

^*近似值是由于数据的可变性

总结

皮下递送单次剂量的较高剂量的TheraPEG-FVIII后通过测量WBCT、APTT和ACT可以获得的止血控制为80-100小时。在这些分析测试中的SQ分布是不能区别开IV给药当量剂量的TheraPEG-FVIII的分布。这清楚地表明SQ递送TheraPEG-FVIII的可行性。

TheraPEG-FVIII半衰期在13.9-18.3小时范围内。这清楚的表明半衰期有延长相比于市售的重组FVIII，其被报道在血友病A犬中为7-11小时(Karpfet al.,Haemophilia 17,5(2011))。所以，所述TheraPEG-FVIII不仅获得了生物可利用的SQ而且证实了延长的半衰期。

SQ给药后TheraPEG-pdFVIII的PK分布相比IV给药具有大大降低C_max和AUC且生物利用度测定为32％。然而，在此剂量的水平下，由于PK曲线的“缓慢释放”性质，SQ给药后曝露保持在高于5％正常水平并与IV给药后持续相同的时间，这可以解释为相等的机能反应(functional responses)。减少C_max和AUC，从而增加了在SQ递送TheraPEG-FVIII的作用持续时间上突出的潜力、本产品的附加安全特征和给药选项(dosing options)。

皮下给药非聚乙二醇化FVIII并不能在血浆中检测到FVIII，尽管减少了凝血时间，但没有保持止血。这证明了非聚乙二醇化FVIII具有非常低的SQ生物利用度，但是非常小量的FVIII可以影响止血。相比于非聚乙二醇化FVIII，低剂量的TheraPEG-pdFVIII使的血浆水平升到9％正常并且止血维持了56-75小时。因此，对pdFVIII加上TheraPEG使得当SQ给药时获得较大量的生物利用度和机能反应。总之，本研究清楚的证实了FVIII的TheraPEG化获得了一个优秀的产品，其可以进行皮下给药并延长作用持续时间。

表17

HA1(SQ PEG-pdFVIII)犬12

表18

HA2(SQ PEG-pdFVIII)犬13

表19

HA3(IV PEG-pdFVIII)犬14

表20

HA4(IV PEG-pdFVIII)犬15

表21

HA5(SQ pdFVIII)犬17

表22

HA6(SQ低剂量PEG-pdFVIII)犬16

实施例8：在犬中皮下给药的免疫反应

在本发明中，已经观察到由皮下给药引起的免疫反应较低。这种效果与在本发明之前的血因子给药领域的普通技术人员所预想的完全相反。人们普遍认为通过皮下给药会加重已有的非常高水平的免疫反应(FVIII抑制物频率)。

本发明中，发现了令人意外的成果。为了降低免疫(抑制剂)反应的发生率，提出采用皮下给药，其免疫反应的水平直接关系全身性暴露水平。通过提供皮下递送，其C_max可以彻底的降低，并且这样做也就降低免疫反应。

在本发明的实施例中，所述聚乙二醇化产品暴露于免疫环境的大部分测试，也就是犬系统。当静脉给药时，可以看出Bethesda值(抑制物数量单元，units of inhibitor quantities)为最高和最早。与之相对所述皮下递送大大降低了系统暴露如C_max以及较低和较晚的Bethesda反应所证实的。的确，所有值中的最低值为SQ给药裸的FVIII，其几乎没有系统暴露并且从来没有看到抑制物值。参见图13/表23作为获得的数据的代表。

表23

图13中的平面图表明通过治疗的刺激，在血浆中发现的随时间抑制活性的大小。在直接的IV治疗的情况下，较高水平的抑制物更快速的发生，相比于SQ治疗，其更慢的溶入到系统并且对免疫系统的刺激少。

实施例9：在鼠中皮下给药的对比研究

该例子描述了当血因子与聚合物如PEG缀合时发生的令人意外的贮库作用。而且，该结果表明调控速率是可能的，即控制PEG的尺寸(或数量)来调节加到蛋白质上的水合作用水平使得血因子便于从皮下空间获得。

因子VIIa聚乙二醇化的相关的药物动力学是在受试鼠中通过3种不同形式聚乙二醇化进行的研究，并比较它们的皮下空间递送相关的行为。

原始的、重组因子VIIa给药到受试鼠，以及3种不同形式的聚乙二醇化的FVIIa，通过皮下(SQ)给药或者通过静脉(IV)给药：

a)TheraPEG化FVIIa：使用Polytherics Ltd的“TheraPEG”技术(如别处和WO 2011/135308中描述的)将FVIIa单-聚乙二醇化到20kDa PEG分子；

b)GlycoPEG化FVIIa：通过标准的glycoPEGylated技术使得FVIIa被缀合到PEG以得到测试产品，并通过二-缀合的20kDa PEG以及相当显著含量的高PEG产品进行控制；

c)HATU催化的聚乙二醇化FVIIa：FVIIa被单-聚乙二醇化到20kDa PEG(使用从US5644029中描述的衍生的缀合方法)。

TheraPEG-FVIIa

将20kDa PEG以10mg/mL分散到5mM的磷酸钠(pH为8.0)、15mMNaCl、2mM EDTA中。然后在20℃下培养3小时。将一小瓶FVIIa(5.3mg)于20mM柠檬酸钠(pH为6.0)、0.1M NaCl、10mM EDTA中重建至0.8mg/mL。并将其在20℃下培养10分钟。然后加入1.5摩尔当量(ME)的24mM TCEP和0.025ME的0.4mM SeCM，并且在20℃下培养1小时。然后将2ME活化的PEG加入到还原的FVIIa。该混合物在20℃下培养1小时，然后在5℃下培养17小时。然后配制缓冲液使用Superdex 200柱进行尺寸排阻色谱法以提纯聚乙二醇化FVIIa。

为了分析该产品，将重建的rFVIIa、活化的PEG、反应混合物以及被选择的Superdex部分(25、30、35、39、45、51、80)在非还原的SDS-PAGE凝胶上跑。含有聚乙二醇化FVIIa的部分合并，并在冻干前浓缩至大约3mL。浓缩的SEC池通过还原和非还原的SDS-PAGE、凝血活性和反相HPLC分析(在冻干前和后)进行测试。

GlycoPEG化FVIIa

一个小瓶(5.3mg)FVIIa在2.5mL的MOPS缓冲盐水中进行重建。然后将该重建的rFVIIa在PD10脱盐柱上进行缓冲液交换(buffer exchange)进入MOPS缓冲盐水中，并且被稀释到1mg/mL。将缓冲液交换后的rFVIIa置于冰上，加入100mM的碘酸钠至最终的浓度为2.5mM。将该混合物在暗处培养30分钟。加入甘油(50％)至最终的浓度为3％。然后使用Zeba旋转柱(Zeba spin column)将混合物进行缓冲液交换进入0.1M乙酸钠缓冲液中。制备50mg/mL氨基氧基PEG(Amino oxy PEG)的储备溶液并将10ME这样的PEG加入到已脱盐的FVIIa中。将该反应混合物在室温下培养1-2小时，然后在4℃下培养过夜。然后通过上述描述的SEC色谱法将该GlycoPEG化FVIIa纯化。

为了分析该产品，将所选择的SEC部分(23、27、32、35、45和80)在非还原的SDS-PAGE上跑。将含有GlycoPEG化FVIIa的部分合并，并在冻干前浓缩至大约3mL。浓缩的SEC池通过还原和非还原的SDS-PAGE、凝血活性和反相HPLC分析(在冻干前和后)进行测试。

HATU PEG-FVIIa

一个小瓶(5.3mg)rFVIIa在2.5mL的硼酸盐缓冲液中进行重建，在PD10柱上进行缓冲液进入硼酸盐缓冲液，并且被稀释至0.5mg/mL。将甲氧基-PEG的储备溶液在乙腈中制备为16mg/mL。将缓冲液交换的rFVIIa用1.0ME的HATU和2.5ME的DIEA在室温下活化10分钟。在活化后将8ME的甲氧基PEG加入到活化后的rFVIIa至2-5分钟。然后将该反应混合物在室温下培养80-100分钟。然后通过上述描述的SEC色谱法将该HATU PEG化FVIIa纯化。

为了分析该产品，将所选择的SEC部分在非还原的SDS-PAGE上跑。将含有HATU PEG化FVIIa的部分合并，并在冻干前浓缩至大约3mL。浓缩的SEC池通过还原和非还原的SDS-PAGE、凝血活性和反相HPLC分析(在冻干前和后)进行测试。

方法

将0.5mg/kg剂量的剂型对受试鼠进行IV或者SQ给药。对于IV给药将测试组的适合的体积注射进入尾静脉。对于SQ给药将测试组的适合的体积注射进入颈背。随后给药控制测试组(天然的rFVIIa)并在下列时间间隔内取血样：

表24

时间(h)

0.033

0.25

0.5

1

1.5

2

3

4

6

8

12

18

24

36

48

IV控制

√

SQ控制

√

给药测试组后在下列时间间隔内取血样：

表25

每个时间点的血浆是从血液样品中制得而FVIIa浓度是使用StagoAsserachrom VII:Ag ELISA分析法进行确定。该分析法是对血浆样品中的因子VII/VIIa浓度进行定量测定的酶联免疫分析方法。该分析法为夹心ELISA，包括预先涂有兔子抗人类FVII抗体微滴定孔。因为该抗体对于FVIIa具有的亲和力与对PEG-FVIIa的不同，通过稀释蛋白质以适于存在于受检血浆中的FVIIa来获得标准曲线，即，rFVIIa(0.78-50ng/ml)用于分析给药了rFVIIa的鼠的血浆，或者PEG-rFVIIa(0.78-50ng/ml)用于分析给药了PEG-rFVIIa的犬的血浆。

血浆样品稀释至适当的浓度落到标准曲线范围内。在洗涤前将稀释的血浆样品和标准品装载并在室温下培养然后在洗涤后与兔子抗人类FVII HPP缀合物和OPD(一种比色HRP基质)进行培养。在492nm下读板并从标准曲线上读出测试样品的浓度(ng/ml)。表26(a)和(b)中给出了研究结果，这有两种给药路线：静脉给药(IV)和皮下给药(SQ)用于每个聚乙二醇化FVIIa分子和为天然的FVIIa的控制杆。

如表26(a)和(b)中所示，存在2种给药路线，静脉给药(IV)和皮下给药(SQ)用于每个聚乙二醇化FVIIa分子和为天然的FVIIa的控制杆。

本实施例描述了与血因子(与聚合物如PEG缀合)相关的令人意外的贮库作用。而且，该结果表明调控速率是可能的，即控制PEG的尺寸(或数量)来调节加到蛋白质上的水合作用水平使得血因子便于从皮下空间获得。

从表26(a)和(b)表示的结果可以看出：

相比于裸的蛋白质所有的聚乙二醇化蛋白质具有延长的血浆半衰期。

所述单-PEG产品，也就是TheraPEG和HATU聚乙二醇化蛋白质进入血浆的速率比所述的二-PEG缀合物(GlycoPEG)要慢，因而具有更显著的贮库作用。这可以通过比较每个产品的IV和SQ的半衰期中的不同来推导出。

●对于TheraPEG-FVIIa的IV t1/2为8.68小时，相比之下通过SQ给药的同样产品为23.2小时。这代表了2.7倍的增长意味着单-聚乙二醇化产品具有非常大的贮库作用。

●同样地，对于所述单-聚乙二醇化HATU PEG-FVIIa来说其SQ t1/2具有增强的贮库作用代表了超过IV t1/2的1.7倍的增长(24.3/14.07)。

●相反地，对于重聚乙二醇化产品，GlycoPEG-FVIIa，对于该产品的半衰期较靠近而相等(22.3/19.34＝1.15倍)这意味着该产品的SQ给药相比于IV给药具有弱贮库作用。

换句话说，所述单-聚乙二醇化产品(当SQ给药时)显现出比二-聚乙二醇化产品更长的耐受穿过皮下空间分散，因此提供了增强的贮库作用。在所述单-聚乙二醇化产品上的PEG减少量会使得更多的蛋白质暴露；而在GlycoPEG产品上覆盖的较大的PEG会使其在皮下空间内更具水分散性，导致其以更快的速度通过淋巴血管进入血浆。

因此，令人意外地，获得了最长的贮库释放持续时间，却要求较低的聚乙二醇化程度。没有被理论所束缚，这可以合理地解释为通过较低的聚乙二醇化将暴露蛋白质的一些部分于皮下组织，由此穿过淋巴分散的速率会较慢。与此相对，较高程度的聚乙二醇完全覆盖了蛋白质使得该产品游离地快速地进入血液循环。

这支持对目标分子的改性的教导，在这种通过聚乙二醇化的情况下，可以经调整精巧地改变的释放特性，从而所述产品随时间在血液中的浓度以及它的生物利用度。

总的来说，通过聚乙二醇化后再结合皮下递送具有非常令人意外的整体效果，在表面的半衰期中观察到35倍增加(裸的FVIIa的0.66小时相对于皮下给药(SQ)后的23.2小时)。

最后，总体上可以看出，所述生物利用度偏好较高的聚乙二醇化种类，即GlycoPEG，证实更高的PEG和水合水平促进了较高的改性程度以及因此的生物利用度。

表26(a)

表26(b)

Claims

1.一种对患者给药治疗药剂的方法，该方法包括对患者皮下给药所述治疗药剂，使其C_max:C_average的比例小于静脉递送该药剂时C_max:C_average的比例，其中，将所述治疗药剂改性，相对于所述治疗药剂的原始形态，以增加亲水性以及改变分子尺寸。

2.一种对患者的淋巴系统给药治疗药剂的方法，该方法包括皮下给药所述治疗药剂的步骤，使得该治疗药剂不在注射部位直接进入患者的循环系统，并且其中，将所述治疗药剂改性，相对于所述治疗药剂的原始形态，以增加亲水性以及改变分子尺寸。

3.一种在对患者皮下给药治疗药剂时防止所述治疗药剂直接进入患者的局部循环系统的方法，该方法包括对患者皮下给药改性药剂的步骤，其中，将所述治疗药剂改性，相对于所述治疗药剂的原始形态，以增加亲水性以及改变分子尺寸，使所述改性治疗药剂不能从给药的位置直接进入局部血管。

4.一种调整患者的皮下贮库中的治疗药剂递送速度的方法，该方法包括改性所述治疗药剂以改变该药剂的亲水性，其中，亲水程度与生物利用度成比例。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，皮下给药所述改性治疗药剂使得患者能够被给药到比通过单次静脉团注的安全递送量更高剂量的该改性药剂。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，皮下给药所述改性治疗药剂使患者能够比静脉给药该改性药剂更早再次给药。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中，皮下给药所述改性治疗药剂所产生的免疫反应要少于或者等于静脉给药改性或原始形式的该药剂所产生的免疫反应。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述治疗药剂的亲水性相比于原始形态的所述治疗药剂提高了至少50％。

9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中，所述治疗药剂为抗生素、凝血因子、激素、其它治疗肽或者蛋白质、小分子或者单克隆抗体。

10.根据权利要求9中所述的方法，其中，所述凝血因子选自由因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子XIII、因子V、冯维勒布兰德因子和蛋白C组成的组中。

11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中，所述改性为将所述治疗药剂与生物相容性聚合物缀合。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述生物相容性聚合物为聚乙二醇(PEG)、聚磷脂酰胆碱(PC)、聚丙二醇(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚环氧乙烷(PEO)、聚氧乙烯多元醇、聚烯醇、聚羟烷基甲基丙烯酸酯、多糖、聚α-羟基酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚N-丙烯酰吗啉、聚烯烃氧化物聚合物、聚马来酸、聚DL-丙氨酸、羧甲基纤维素、右旋糖酐、淀粉或淀粉衍生物、透明质酸、甲壳素、聚甲基丙烯酸酯、聚唾液酸(PSA)、聚羟基链烷酸酯、聚氨基酸以及它们的组合。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述生物相容性聚合物为PEG。

14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其中，所述改性为融合到多肽以产生融合蛋白质；进入囊泡递送载体，如脂质体、传递体或者微胶粒；进入或者附着于树枝状大分子或者形成治疗药剂的低聚体复合物。

15.根据权利要求1-14中任意一项所述的方法，其中，所述治疗药剂的皮下递送体积为不多于2ml。

16.根据权利要求1-15中任意一项所述的方法，其中，将所述改性治疗药剂以比安全地静脉递送所述改性药剂的浓度更高的浓度进行递送。

17.根据权利要求1-16中任意一项所述的方法，其中，皮下递送所述改性治疗药剂为患者提供的治疗效果所持续的时间要比静脉给药该改性药剂的治疗效果所持续的时间长至少12小时。

18.根据权利要求1-17中任意一项所述的方法，其中，所述皮下递送为皮下注射、局部施覆、经皮贴剂、微皮肤磨削或者高压干粉递送。

19.根据权利要求1-18中任意一项所述的方法，其中，所述皮下递送为每天至少一次、每天至少两次、每周至少一次、每周至少两次、每两周至少一次或者每月至少一次。

20.改性药剂在权利要求1-19中任意一项所述的方法中的应用，该改性药剂包括治疗药剂和改性，其中，相对于该治疗药剂的原始形态，所述改性增加了该药剂的亲水性并改变了该药剂的分子尺寸。

21.改性药剂在权利要求19所述的方法中的应用，其中，相对于该治疗药剂的原始形态，所述改性使该药剂的亲水性增加了至少50％。

22.根据权利要求20或21所述的改性药剂，其中，所述改性为将生物相容性聚合物融合到所述治疗药剂中。

23.根据权利要求20-22中任意一项所述的改性药剂，其中，皮下递送所述改性药剂为患者提供的治疗效果所持续的时间要比静脉给药该改性药剂的治疗效果所持续的时间长至少12小时。

24.一种改性治疗药剂的药物组合物的剂型，其中，皮下递送所述改性治疗药剂为患者提供的治疗效果所持续的时间要比静脉注射给药该改性药剂的治疗效果所持续的时间长至少12小时。

25.一种用于皮下给药的改性凝血因子的药物组合物的剂型，其中，当配置用于皮下给药到患者时，提供了足够维持该患者全血凝固时间不多于20分钟的每月不多于一次的剂型。

26.用于皮下给药每月不多于一次的聚乙二醇化凝血因子的液体剂型在治疗凝血失调中的应用，其中，该剂型具有的C_max为静脉给药的同等参考剂型的至少10％且不多于90％。

27.根据权利要求24-26中任意一项所述的剂型，其中，所述剂型提供每两周不多于一次、每周不多于一次、每半周不多于一次、每两天不多于一次或者每天不多于一次的剂量。

28.根据权利要求24-26中任意一项所述的剂型，其中，所述剂型足够维持所述患者的全血凝固时间为少于15分钟。

29.根据权利要求24-26中任意一项所述的剂型，其中，所述剂型足够维持所述患者的全血凝固时间为少于12分钟。

30.根据权利要求24-29中任意一项所述的剂型，其中，所述凝血因子选自由因子VIIa、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子Xa、因子XI、因子XIII、因子V、冯维勒布兰德因子和蛋白C组成的组中。

31.根据权利要求24-30中任意一项所述的剂型，其中，所述改性为聚乙二醇化。

32.根据权利要求24-31中任意一项所述的剂型，其中，所述剂型具有的C_max为静脉给药的同等参考剂型的至少10％且不多于90％。

33.根据权利要求32中所述的剂型，其中，所述剂型具有的C_max为静脉给药的同等参考剂型的10％-20％。

34.根据权利要求33中所述的剂型，其中，所述药剂为因子VIII。

35.根据权利要求32中所述的剂型，其中，所述剂型具有的C_max为静脉给药的同等参考剂型的40％-60％。

36.根据权利要求35中所述的剂型，其中，所述药剂为因子IX。

37.根据权利要求32中所述的剂型，其中，所述剂型具有的C_max为静脉给药的同等参考剂型的75％-80％。

38.根据权利要求32中所述的剂型，其中，所述剂型具有的C_max为静脉给药的同等参考剂型的75％。

39.根据权利要求37或38中所述的剂型，其中，所述药剂为因子VII。

40.根据权利要求24-39中任意一项所述的剂型，其中，剂量为1-1000IU/kg。

41.根据权利要求24-39中任意一项所述的剂型，其中，剂量为5-500IU/kg。

42.根据权利要求24-39中任意一项所述的剂型，其中，剂量为100-250IU/kg。

43.根据权利要求24-39中任意一项所述的剂型，其中，剂量为50-200IU/kg。

44.根据权利要求24-39中任意一项所述的剂型，其中，剂量为25-50IU/kg。

45.根据权利要求24-39中任意一项所述的剂型，其中，所述剂型给药每天至少一次、每天至少两次、每周约一次、每周约两次、每两周约一次或者每月约一次。

46.一种治疗药剂的剂型，其中，所述剂型用于皮下给药，并且其中改性所述治疗药剂以改变该药剂的亲水性，其中，亲水程度与生物利用度成比例。

47.一种治疗患者的疾病的方法，该方法包括皮下给药根据权利要求24所述的改性治疗药剂的剂型。

48.一种治疗患者的凝血疾病或者创伤的方法，该方法包括对所需患者皮下给药根据权利要求24-46中任意一项所述的凝血因子的剂型。

49.根据权利要求47或48中所述的治疗方法，其中，所述剂型给药每天至少一次、每天至少两次、每周至少约两次、每周至少约一次、每两周至少一次或者每月至少约一次。

50.根据权利要求47或48中所述的治疗方法，其中，所述剂型给药每天至少一次。

51.根据权利要求50所述的治疗方法，其中，所述剂型给药每天两次，其中，所述患者在第一次给药中接收第一剂型和在第二次给药中接收第二剂型。

52.根据权利要求51所述的治疗方法，其中，所述第二剂型与所述第一剂型为分别地、同时地或者连续地给药。

53.一种包括根据权利要求24-46中任意一项所述的皮下剂型和给药载体的试剂盒。