CN101301475A - Peg化因子vii糖型 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含多种因子VII多肽或因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺连接的和/或丝氨酸连接的寡糖链，而且其中至少一个寡糖基团共价附着了至少一个聚合基团。该聚合基团可以是聚环氧烷(PAO)，例如聚乙二醇(PEG)。

Description

PEG化因子VII糖型
本案是申请日2003年06月20日，申请号为03817417.0，发明名称“EEG化因子VII糖型”的分案申请。
发明领域
本发明涉及包含因子VII缀合物的组合物，所述缀合物具有预定的糖基化样式。
发明背景
因子VII是作为分子量大约50kDa的单链糖蛋白在肝中合成并分泌到血液中的维生素K依赖性血浆蛋白。FVII酶原通过蛋白水解切割转变成激活形式(FVIIa)。与组织因子(TF)复合的FVIIa能够将因子IX和因子X二者转变成它们的激活形式，继而发生导致迅速凝血酶生成和纤维蛋白形成的反应。
参与凝血级联反应的蛋白质，包括例如VII、因子VIII、因子IX、因子X、和蛋白C，被证明是治疗多种病理学状况的有用治疗剂。因此，对于制药学上可接受的且展示均一和预定临床功效的包含这些蛋白质的制剂的需求日益增长。
由于使用人血浆作为制药学产品来源有许多缺点，因此优选在重组系统中生产这些蛋白质。然而，凝结蛋白需要进行多种共翻译修饰和翻译后修饰，包括例如天冬酰胺连接(N连接)糖基化、O连接糖基化、和谷氨酸残基的γ-羧化。在使用异源细胞作为宿主用于大规模生产蛋白质时，这些修饰在质量上或数量上是不同的。具体而言，异源细胞中的生成常常导致不同排列的糖型，即具有不同的共价连接寡糖结构的相同多肽。
在不同的系统中，治疗性蛋白质寡糖结构中的变异尤其与免疫原性和体内清除有关。
除了体内清除以外，功能性体内半衰期对于化合物在体内具有“治疗性利用度”的时段而言同样是重要的。
rFVIIa的循环半衰期是大约2.3个小时(《Summary Basis forApproval for
Figure A20081000946800091
》即批准
Figure A20081000946800092
的简要根据，FDA证明号96-0597)。
人重组FVIIa的商品化制剂以出售。
Figure A20081000946800094
是市场上能够获得的有效且可靠的治疗出血发作的唯一rFVIIa。相对较高的施用剂量和频率是达到并维持期望的治疗或预防效果所必需的。因而，难以获得适当的剂量调节，而且因需要频繁的静脉内施用而限制了患者的生活方式。
具有较长循环半衰期的分子将减少必需施用的次数。考虑到当前FVIIA产品与频繁注射的联系，显然需要改进的FVII分子。
改进循环的一种方法是确保由体内清除的速率得到降低。如上所述，治疗性蛋白质寡糖结构中的变异尤其与体内清除有关。另外，将化学模块附着于多肽上也可能赋予多肽以降低的肾清除。
无活性形式的FVII已有报道。灭活形式能够与野生型FVII或FVIIa竞争与组织因子的结合并抑制凝结活性。灭活形式的FVIIa被建议用于治疗超凝结状况的患者，诸如患有败血症、有心肌梗塞风险、或有血栓性中风风险的患者。
WO 98/32466建议可以将FVII以及许多其它蛋白质进行PEG化，但是不含这个方面的任何其它信息。
WO 01/58935要求保护非多肽模块(如PEG)与多肽的缀合物，所述多肽的氨基酸序列因导入或消除了至少一个包含非肽模块的附着基团的氨基酸残基而与野生型FVII不同。
US 4847325建议可以通过使PEG衍生物与经过氧化的集落刺激因子-1(CSF-1)反应而将CSF-1附着于PEG上。
因此，本领域需要提供凝结蛋白制剂的组合物和方法，特别是包含改进的重组人因子VII、修饰的因子VII、或因子VII相关多肽的制剂。
发明概述
本发明的研究人员发现，具有包含至少一个寡糖基共价连接至至少一个聚合基团上的糖型样式的因子VII多肽的制剂展示改进的功能特性。因此，本发明涉及提供这些缀合蛋白制剂的方法和组合物。
因此，在第一个方面中，本发明涉及包含多种因子VII多肽或因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺和/或丝氨酸连接的寡糖链，而且其中至少一个寡糖基团共价附着了至少一个聚合基团。
在它的一个实施方案中，聚合基团共价附着于唾液酸模块上。在它的另一个实施方案中，聚合基团共价附着于半乳糖模块上。
在它的一个实施方案中，大约94-100％的寡糖链包含至少一个唾液酸模块。
在它的一个实施方案中，大约94-100％的寡糖链包含至少一个唾液酸模块，而且其中少于大约25％的寡糖链包含至少一个未加帽的触角(antenna)。
在一个实施方案中，少于大约10％的寡糖链包含至少一个未加帽的触角。
在一个实施方案中，少于大约5％、优选少于大约2％的寡糖链包含至少一个未加帽的触角。
在一个实施方案中，大约96-100％的寡糖链包含至少一个唾液酸模块。
在一个实施方案中，大约98-100％的寡糖链包含至少一个唾液酸模块。
在一个实施方案中，天冬酰胺连接的寡糖链位于与野生型人FVIIa(图1)中氨基酸残基Asn-145和Asn-322对应的位置。
在一个实施方案中，丝氨酸连接的寡糖链位于与野生型人FVIIa(图1)中氨基酸残基Ser-52和Ser-60对应的位置。
在一个实施方案中，聚合物选自：聚环氧烷(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，诸如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、和葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖、聚氨基甲酸酯、聚酯、和聚酰胺。
在一个实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一个实施方案中，聚乙二醇是分子量300-100,000Da的PEG，诸如大约500-20,000Da、或大约500-15,000Da、或2-15kDa、或3-15kDa、或3-12kDa、或大约10kDa。
在一个实施方案中，多肽具有野生型因子VII的氨基酸序列(图1)。在一个实施方案中，多肽是野生型因子VIIa。
在一个实施方案中，因子VII多肽选自：S52A-因子VII、S60A-因子VII、第290位与第291位残基之间受到蛋白水解切割的因子VII、第315位与第316位残基之间受到蛋白水解切割的因子VII、发生氧化的因子VII、L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、S336G-FVII、第290位和/第291位(优选第290位)的氨基酸残基已被取代的因子VII序列变体、以及第315位和/或第316位(优选第315位)的氨基酸残基已被取代的因子VII序列变体。在另一个实施方案中，因子VII多肽选自：WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/77218、WO 03/27147、和WO 03/37932中公开的与野生型FVIIa相比生物学活性升高的因子VII变体；            L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，S314E/V158D-FVII，S314E/E296V-FVII，S314E/M298Q-FVII，S314E/V158T-FVII，K316H/L305V-FVII，K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII，K316H/E296V-FVII，K316H/M298Q-FVII，K316H/V158T-FVII，K316Q/L305V-FVII，K316Q/K337A-FVII，K316Q/V158D-FVII，K316Q/E296V-FVII，K316Q/M298Q-FVII，K316Q/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314F/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/K337A/E296V-FVII，S314E/L305V/K337A/V158D-FVII，S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII，S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V-FVII，S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D-FVII，K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII，K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/K337A-FVII，F374Y/V158D-FVII，F374Y/E296V-FVII，F374Y/M298Q-FVII，F374Y/V158T-FVII，F374Y/S314E-FVII，F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374Y/V158D/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，F374Y/V158T/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314F-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-Factor VII，S60A-Factor VII；andP11Q/K33F-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；由233Thr至240Asn的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII、由304Arg至329Cys的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII、以及由153Ile至223Arg的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII。
在一个实施方案中，因子VII相关多肽选自：R152E-FVII、S344A-FVII、FFR-FVII、和缺乏Gla结构域的FVIIa。
在一个实施方案中，在本说明书所述凝结测定法、蛋白水解测定法、或TF结合测定法中一种或多种方法中进行测试时，因子VII相关多肽展示在相同细胞类型中生成的野生型因子VIIa的比活的至少大约25％、优选至少大约50％、更优选至少大约75％、且最优选至少大约90％。
在一个实施方案中，在本说明书所述凝结测定法、蛋白水解测定法、或TF结合测定法中一种或多种方法中进行测试时，因子VII相关多肽展示在相同细胞类型中生成的野生型因子VIIa的比活的大约25％以下、优选大约10％以下、更优选大约5％以下、且最优选大约1％以下。
在不同的实施方案中，缀合多肽展示的生物利用度是参考制剂的生物利用度的至少大约110％，诸如参考制剂的生物利用度的至少大约120％、至少大约130％、或至少大约140％。
在一个实施方案中，缀合多肽展示的血清半衰期是参考制剂的半衰期的至少大约125％，诸如参考制剂的半衰期的至少大约150％、至少大约200％、或至少大约250％。
在一个实施方案中，缀合多肽是通过酶促修饰多肽中的唾液酸或半乳糖模块而生成的。
在另一个方面中，本发明涉及用于制备权利要求1的制剂的方法，所述方法包括：在至少一个聚合分子共价附着于多肽上至少一个寡糖链的条件下使含寡糖的多肽接触聚合物分子。
在还有一个方面中，本发明涉及包含权利要求1-22任一项中定义的制剂和制药学可接受载体或佐剂的药物组合物。
在还有一个方面中，本发明涉及包含多种因子VII多肽或因子VII相关多肽的制剂用于制备治疗因子VII反应综合症的药物的用途，其中所述多肽包含天冬酰胺和/或丝氨酸连接的寡糖链，而且其中至少一个寡糖基团共价附着了至少一个聚合基团。
在还有一个方面中，本发明涉及用于治疗因子VII反应综合症的方法，包括：对需要这种治疗的患者施用包含权利要求1-22中描述的制剂的制药学配方，施用的条件是会导致出血减少和/或凝血增加。
在它的一个实施方案中，所述综合症选自：血友病A、血友病B、因子XI缺乏、因子VII缺乏、血小板减少、von Willebrand氏病、凝血因子抑制剂的存在、手术、创伤、抗凝剂疗法，包括稀释凝血病、颅间出血(intercranial haemorrhage)、干细胞移植、上胃肠道出血、和肝病。
在还有一个方面中，本发明涉及用于预防有害出血的方法，包括：对需要这种治疗的患者施用包含权利要求1-22中描述的制剂的制药学配方，施用的条件是会导致出血减少和/或凝血增加。
在还有一个方面中，本发明涉及用于预防有害凝血的方法，包括：对需要这种治疗的患者施用包含权利要求1-22中描述的制剂的制药学配方，施用的条件是会有效抑制凝血。
在它的一个实施方案中，有害凝血与选自下组的状况有关：血管成形术、深静脉血栓形成、肺栓塞、中风、弥漫性血管内凝血(DIC)、与革兰氏阴性内毒素血症有关的肺和肾中的纤维蛋白沉积、以及心肌梗塞。
在还有一个方面中，本发明涉及用于防止由组织因子介导的反应的方法，包括：有效抑制凝结的条件下对需要这种治疗的患者施用包含权利要求1-22中描述的制剂的制药学配方。
在它的一个实施方案中，由组织因子介导的反应与选自下组的状况有关：炎症、癌症、肿瘤生长、转移、血管发生、SIRS、ALI、ARDS、MOF、HUS、和TTP。
发明描述
本发明的发明人发现，具有其中至少一个寡糖基团共价连接了至少一个聚合基团(诸如例如PEG)的糖型样式的凝结蛋白的制剂展示改进的功能特性。因此，本发明涉及提供这些缀合蛋白制剂的方法和组合物。具体而言，本发明涉及包含因子VII多肽或因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽具有天冬酰胺连接(N连接)和丝氨酸连接(O连接)的寡糖共价附着了至少一个聚合基团的样式。本发明的制剂展示改变的特性，包括但不限于改进的药代动力学特性和改进的临床功效。本发明还涵盖包含这些制剂的制药学配方，以及利用这些配方的治疗性方法。
在用于本文时，术语“共价附着”意欲涵盖寡糖模块与聚合模块彼此直接共价相连，或者彼此通过间插模块(诸如桥接、间隔子或连接模块)而间接共价相连。
术语“缀合物”或可互换的“缀合多肽”意指通过将一种或多种多肽共价附着一种或多种聚合物分子而形成的异源(在合成或嵌合的意义上)分子。
术语“聚合分子”或可互换的“聚合基团”或“聚合模块”或“聚合物分子”涵盖能够缀合至多肽的附着基团的分子。在用于本发明缀合物的内容时，将理解为通过糖蛋白寡糖链上的附着基团将聚合物分子(或模块)连接至缀合物的多肽部分上；优选的是，将聚合物分子附着于对寡糖加帽的唾液酸模块(“唾液酸加帽基团”)或半乳糖模块。
聚合物分子指通过共价连接两个或多个单体而形成的分子，其中没有一个单体是氨基酸残基。优选的聚合物是选自下组的聚合物分子：聚环氧烷(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，诸如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐和葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖，特别优选PEG。
术语“附着基团”意指寡糖模块中能够附着聚合物分子的官能团。有用的附着基团是例如胺、羟基、羧基、醛、酮、巯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺、乙烯砜、或卤代醋酸酯。
可以在与聚合物反应之前活化寡糖模块上的附着基团。或者，可以在与寡糖模块反应之前活化聚合物上存在的基团。无论是存在于寡糖模块上或者是聚合物模块上，激活基团可以是活化离去基团的形式。
术语“活化离去基团”包括那些易于在有机或酶促调控的取代反应中被取代的模块。活化离去基团在本领域是知道的，参阅例如Vocadlo等人，《Carbohydrate Chemistry and Biology》即碳水化合物化学和生物学，第2卷，Wiley-VCH Verlag，德国，2000；Kodama等人，Tetrahedron Letters，34：6419，1993；Lougheed等人，J.Biol.Chem.，274：37717，1999。
文献中描述了用于活化聚合物的方法和化学原理。常用于活化聚合物的方法包括用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物、表氯醇、二乙烯砜、碳二亚胺、磺酰卤化物、三氯三嗪等物质来活化官能团(参阅例如Taylor，1991，《Protein Immobilization，Fundamentals andApplications》即蛋白质固定的原理和应用，Marcel Dekker，纽约；Wong，1992，《Chemistry of protein Conjugation and Crosslinking》即蛋白质缀合和交联的化学，CRC出版社，伯克莱屯；Hermanson等人，1993，《Immobilized Affinity Ligand Techniques》即固定化亲和配体技术，Academic出版社，纽约；Dunn等人编，《Polymeric Drugs andDrug Delivery Systems》即聚合药物和药物投递系统，ACS系列讨论会，第469卷，美国化学学会，1991)。
可用于实践本发明的反应基团和反应类型通常是那些在相对温和的条件下进行的类型，包括但不限于亲核取代(如胺和醇与酰基卤、活泼酯的反应)、亲电子取代(如烯胺反应)、和向碳-碳和碳-杂原子键中加成(如Michael反应、Diels-Alder加成)。这些和其它有用的反应描述于例如March，《Advanced Organic Chemistry》即高级有机化学，第3版，John Wiley & Sons，纽约，1985；Hermanson，《Biocon jugateTechniques》即生物缀合技术，Academic出版社，圣迭戈，1996；Feeney等人，《Modifications of Proteins》蛋白质修饰，化学进展丛书，第198卷，美国化学学会，1982。
可以选择反应性官能团，使得它们不参与或干扰装配寡糖和聚合物模块所必需的反应。或者，可以通过保护性基团的存在来保护反应性官能团免于参与反应。有用的保护性基团的范例参阅例如Greene等人，《Protective groups in Organic Synthesis》即有机合成中的保护性基团，John Wiley & Sons，纽约，1991。
文献中描述了用于将碳水化合物连接至其它分子的一般方法(参阅例如Lee等人，Biochemistry，28：1856，1989；Bhatia等人，Anal.Biochem.，178：408，1989；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.，112：8886，1990；和Bednarski等人，WO 92/18135)。
术语“天然存在的糖基化位点”意指位于位置Asn-145(N145)、Asn-322(N322)、Ser-52(S 52)、和Ser-60(S60)的糖基化位点。相似的，术语“天然存在的体内O-糖基化位点”包括位置S52和S60，而术语“天然存在的体内N-糖基化位点”包括位置N145和N322。
术语“功能性体内半衰期”使用其常规含义，即身体/靶器官中仍然存在多肽或缀合物50％的生物学活性时的时间，或者多肽或缀合物的活性为其初始值的50％时的时间。作为测定功能性体内半衰期的变通方法，可以测定“血清半衰期”，即50％的多肽或缀合物分子在清除之前在血浆或血流中循环时的时间。血清半衰期的测定常常比功能性半衰期的测定更加简单，而且血清半衰期的量级常常较好的指示了功能性体内半衰期的量级。血清半衰期的其它术语包括血浆半衰期、循环半衰期、血清清除、血浆清除、和清除半衰期。多肽或缀合物是通过网状内皮系统(RES)、肾、脾、或肝中的一种或多种的作用，通过由组织因子、SEC受体、或其它受体介导的消除，或者通过特异性或非特异性蛋白水解而清除的。通常，清除取决于蛋白质的大小(相对于肾小球滤过作用的临界值)、电荷、附着的碳水化合物链、和细胞受体的存在。需要保持的功能性常常选自促进凝血、蛋白水解、辅因子结合、或受体结合的活性。可以通过本领域知道的任何合适方法来测定功能性体内半衰期和血清半衰期，下文将进一步描述(参阅“因子VII制剂的功能特性”部分)。
术语“增加”在用于功能性体内半衰期或血浆半衰期时用于指在可比条件下测定的多肽或缀合物的相关半衰期相对于参考分子诸如未缀合的因子VIIa(如野生型FVIIa)在统计学上显著增加。例如，相关半衰期可以增加至少大约25％，诸如至少大约50％，例如至少大约100％、150％、200％、250％、或500％。
制剂的“免疫原性”指制剂在施用于人后引发有害免疫应答的能力，无论是体液应答、细胞应答、或二者。已知因子VIIa多肽和因子VIIa相关多肽不会在人体中引发可检测的免疫应答。但是，在任何人类亚群中，可能存在对特定施用蛋白质展示敏感性的个体。可以通过使用本领域知道的常规方法对敏感个体中存在的抗因子VII抗体和/或因子VII反应性T细胞定量来测量免疫原性。在有些实施方案中，本发明制剂展示在敏感个体中的免疫原性相对于参考制剂在该个体中的免疫原性降低了至少大约10％、优选至少大约25％、更优选至少大约40％、且最优选至少大约50％。
术语“与图1(野生型FVII)的氨基酸残基S52、S60、N145、N322对应的氨基酸残基”意指将序列比对时与野生型因子VII的序列(图1)对应的氨基酸残基Asn和Ser。可以使用适于序列比对的电脑程序方便的测定比对序列的氨基酸序列同源性/同一性，诸如例如ClustalW程序1.8版1999年(Thompson等人，1994，Nucleic Acid Research，22：4673-4680)。
因子VII多肽和因子VII相关多肽
本发明涵盖人因子VII多肽，诸如例如那些具有美国专利号4,784,950中公开的氨基酸序列(野生型因子VII)的多肽。在用于本文时，“因子VII”或“因子VII多肽”涵盖野生型因子VII，以及与野生型因子VII相比展示基本上相同或改进的生物学活性的因子VII变体。术语“因子VII”意欲涵盖处于其未切割(酶原)形式的因子VII多肽，以及那些经过蛋白水解加工而生成其各自的生物活性形式的多肽(可以称为因子VIIa)。通常，因子VII在第152位与第153位残基之间受到切割而生成因子VIIa。
在用于本文时，“因子VII相关多肽”涵盖与野生型因子VIIa的活性相比因子VIIa生物学活性实质上得到修饰或降低的多肽，包括变体。这些多肽包括但不限于经过化学修饰的因子VII或因子VIIa，以及导入了特定氨基酸序列改变而修饰或破坏多肽生物活性的因子VII变体。
因子VIIa在血液凝结方面的生物学活性衍生自它的下列能力：(1)结合组织因子(TF)和(2)催化因子IX或因子X的蛋白水解切割而生成激活的因子IX或X(分别为因子IXa或Xa)。出于本发明的目的，例如美国专利号5,997,864中所述，使用缺乏因子VII的血浆和促凝血酶原激酶来测量制剂促进血液凝结的能力，由此可以对因子VIIa生物学活性定量。在这种测定法中，生物学活性表述成凝结时间相对于对照样品的减少，并可通过与含1个单位/ml因子VII活性的合并人血清标准相比较而转变成“因子VII单位”。或者，可以通过(1)测量因子VIIa在包含包埋在脂膜中的TF和因子X的系统中生成因子Xa的能力(Persson等人，J.Biol.Chem.，272：19919-19924，1997)；(2)测量水性系统中因子X的水解(见下文实施例5)；(3)使用基于表面激元共振(surface plasmonresonance)的仪器测量它与TF的物理结合(Persson，FEBS Letts.，413：359-363，1997)；(4)测量合成底物的水解(见下文实施例4)；和(5)测量不依赖TF的体外系统中的凝血酶的生成，从而对因子VIIa生物学活性定量。
与野生型因子VIIa相比具有实质上相同或改进的生物学活性的因子VII变体涵盖那些在上文所述凝结测定法、蛋白水解测定法、或TF结合测定法中的一种或多种方法中进行测试时展示在相同细胞类型中生成的野生型因子VIIa的比活的至少大约25％、优选至少大约50％、更优选至少大约75％、且最优选至少大约90％的变体。与野生型因子VIIa相比具有实质上降低的生物学活性的因子VII变体是那些在上文所述凝结测定法、蛋白水解测定法、或TF结合测定法中的一种或多种方法中进行测试时，展示在相同细胞类型中生成的野生型因子VIIa的比活的不到大约25％、优选不到大约10％、更优选不到大约5％、且最优选不到大约1％的变体。与野生型因子VII相比具有实质上修饰的生物学活性的因子VII变体包括但不限于展示不依赖TF的因子X蛋白水解活性的因子VII变体和那些可结合TF但不切割因子X的变体。
无论是与野生型因子VII相比展示实质上相同或更好的生物活性，或者是与野生型因子VII相比展示实质上得到修饰或降低的生物活性，因子VII变体包括但不限于因一个或多个氨基酸的插入、缺失、或取代而具有与野生型因子VII序列不同的氨基酸序列的多肽。
与野生型因子VII相比具有实质上相同或改进的生物学活性的因子VII相关多肽的非限制性范例包括：S52A-FVII、S60A-FVII(Iino等人，Arch.Biochem.Biophys.，352：182-192，1998)；L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、和S336G-FVII；美国专利号5,580,560中公开的展示蛋白水解稳定性增加的FVIIa变体；在第290位与第291位残基之间或第315位与第316位残基之间受到蛋白水解切割的因子VIIa(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.，48：501-505，1995)；因子VIIa的氧化形式(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.，363：43-54，1999)、(图1的)第290位和/第291位(优选第290位)的氨基酸残基得到取代的因子VII序列变体、以及(图1的)第315位和/或第316位(优选第315位)的氨基酸残基得到取代的因子VII序列变体。
与野生型因子VII相比具有实质上相同或改进的生物学活性的因子VII相关多肽的非限制性范例还包括WO 01/83725、WO 02/22776、WO02/77218、WO 03/27147、和WO 03/37932中公开的与野生型FVIIa相比生物学活性增加的FVII变体，包括但不限于：L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，and S336G-FVII，L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，5314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，S314E/V158D-FVII，S314E/E296V-FVII，S314E/M298Q-FVII，S314E/V158T-FVII，K316H/L305V-FVII，K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII，K316H/E296V-FVII，K316H/M298Q-FVII，K316H/V158T-FVII，K316Q/L305V-FVII，K316Q/K337A-FVII，K316Q/V158D-FVII，K316Q/E296V-FVII，K316Q/M298Q-FVII，K316Q/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/K337A/E296V-FVII，S314E/L305V/K337A/V158D-FVII，S314F/L305V/V158D/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII，S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V-FVII，S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D-FVII，K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII，K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/K337A-FVII，F374Y/V158D-FVII，F374Y/E296V-FVII，F374Y/M298Q-FVII，F374Y/V158T-FVII，F374Y/S314E-FVII，F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374Y/V158D/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，F374Y/V158T/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-Factor VII，S60A-Factor VII；andP11Q/K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；由233Thr至240Asn的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII、由304Arg至329Cys的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII、以及由153Ile至223Arg的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII。
与野生型因子VII相比具有实质上得到降低或修饰的生物学活性的因子VII相关多肽的非限制性范例包括R152E-FVIIa(Wildgoose等人，Biochem，29：3413-3420，1990)、S344A-FVIIa(Kazama等人，J.Biol.Chem.，270：66-72，1995)、FFR-FVIIa(Holst等人，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.，15：515-520，1998)、缺乏Gla结构域的因子VIIa(Nicolaisen等人，FEBS Letts.，317：245-249，1993)、和其中Lys341被Ala取代的因子VII。化学修饰型因子VII多肽和序列变体的非限制性范例描述于例如美国专利号5,997,864中。
糖基化
在用于本文时，糖基化“样式”或糖型“样式”、“分布”、或“谱”指因子VII多肽或因子VII相关多肽的指定群体中具体寡糖结构的表达式。这些样式的非限制性范例包括具有下述方式的寡糖链的相对比例：(1)具有至少一个唾液酸残基；(2)缺乏任何唾液酸残基(即电荷中性)；(3)具有至少一个末端半乳糖残基；(4)具有至少一个末端N-乙酰半乳糖胺残基；(5)具有至少一个“未加帽”的触角，即具有至少一个末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基；或(6)具有至少一个与触角N-乙酰葡萄糖胺残基经α1-＞3连接的岩藻糖。
在用于本文时，“寡糖链”指与单个氨基酸残基共价相连的整个寡糖结构。因子VII通常在Asn-145和Asn-322(N-连接糖基化)以及Ser-52和Ser-60(O-连接糖基化)处糖基化。在人体中原位生成的因子VII上存在的N-连接寡糖链可以具有两个、三个、或四个触角，每个触角都具有Neu5Ac(α2-＞3或α2-＞6)Gal(β1-＞4)GlcNAc连接(β1-＞2、4、或6)至Man残基的结构，而后者连接(α1-＞3或6)至Man(β1-＞4)GlcNAc(β1-＞4)GlcNAc-Asn。(Neu5Ac表示N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，Gal表示半乳糖，GlcNAc表示N-乙酰葡萄糖胺，而Man表示甘露糖)。寡糖链中还可以包含岩藻糖残基，它可以α1-＞6连接至GlcNAc。
在人体中原位生成的因子VII上存在的O-连接寡糖链具有一个触角，其中Ser-52触角具有Xyl-Xyl-Glc-Ser或Glc-Ser的结构，而Ser-60触角具有Neu5Ac(α2-＞3或α2-＞6)Gal(β1-＞4)GlcNAc-Fuc-Ser或Fuc-Ser的结构。(Fuc表示岩藻糖，Glc表示葡萄糖，而Xyl表示木糖)。
当在人体中原位生成因子VII时，有些N-连接寡糖链缺乏核心岩藻糖残基；所有链缺乏触角性岩藻糖残基；而且两种N-连接链几乎完全被唾液酸化，即每个触角的末端糖是通过α2-＞3或α2-＞6键连接至半乳糖的N-乙酰神经氨酸。
然而，当在其它环境中生成时，因子VII可能包含在它们的一个或多个触角上具有不同末端结构的寡糖链，诸如例如缺乏唾液酸残基；包含N-糖基神经氨酸(Neu5Gc)残基；包含末端N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)残基代替了半乳糖；诸如此类。当在例如存在小牛血清的条件下培养的BHK细胞中生成时，因子VII制剂展示下列寡糖样式：87-93％的寡糖链包含至少一个唾液酸残基；7-13％是中性的(缺乏任何唾液酸)；9-16％包含至少一个末端半乳糖残基；19-29％包含至少一个末端N-乙酰半乳糖胺残基；且30-39％包含至少一个未加帽的触角，即包含至少一个末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基。
当在其它类型的细胞或在其它培养条件下(在无血清、化学成分完全确定的培养基中)生成时，因子VII制剂可能展示下列寡糖样式(如WO 02/29025中所述)：
(1)大约94-100％的寡糖链包含至少一个唾液酸残基，诸如例如大约94-99％、大约95-98％、或大约96-97％。在不同的实施方案中，至少大约94％、95％、96％、或97％的寡糖链包含至少一个唾液酸残基；
(2)6％或更少的寡糖链是中性的，诸如例如大约1.5-6％或大约2-4％；
(3)少于大约16％、优选少于大约10％的寡糖链包含至少一个末端半乳糖，诸如大约6-10％或大约8-9％；
(4)少于大约25％、优选少于大约10％的寡糖链包含至少一个末端GalNAc残基，诸如例如大约6-9％或大约7-8％；
(5)少于大约30％、优选少于大约25％的寡糖链包含至少一个未加帽的触角，诸如例如大约11-23％或大约12-18％；且
(6)至少大约2％、优选至少大约5％、更优选至少大约10％或20％、且最优选至少大约40％的寡糖链包含至少一个α1-＞3连接至触角N-乙酰葡萄糖胺残基(即以β1-＞2，4或6方式连接至Man残基的N-乙酰葡萄糖胺残基)的岩藻糖。
另外，例如如美国专利号6,399,336中所述，可以通过用唾液酸转移酶和唾液酸供体分子对表达的因子VII或因子VII相关多肽制剂进行体外酶促处理来改进唾液酸化程度(即附着于每个寡糖链上的唾液酸残基数目)。通过这种方法，寡糖链上基本上所有触角可能都唾液酸化(即由唾液酸残基“加帽”)。在有些情况中，FVII或FVII相关多肽上的N-葡聚糖也是不完全半乳糖化的，在唾液酸化步骤之前进行包括半乳糖转移酶和UDP-半乳糖供体物质的半乳糖化步骤将改进产物的唾液酸含量。
本发明发明人已经生产了因子VII制剂，其中包含含有至少一个共价附着于至少一个寡糖基团上的聚合基团的寡糖样式。在它的一个实施方案中，制剂包含展示下列一种或多种糖型样式的因子VII多肽或因子VII相关多肽：
(1)大约94-100％的寡糖链包含至少一个唾液酸残基，诸如例如大约94-99％、大约95-98％、或大约96-97％。在不同的实施方案中，至少大约94％、95％、96％、97％、98％、或99％的寡糖链包含至少一个唾液酸残基；
(2)6％或更少的寡糖链是中性的，诸如例如大约0.5-6％或1.5-6％或大约2-4％或0.5-4％或0.5-2％；
(3)少于大约16％、优选少于大约10％的寡糖链包含至少一个末端半乳糖，诸如例如大约6-10％或大约8-9％；
(4)少于大约25％、优选少于大约10％的寡糖链包含至少一个末端GalNAc残基，诸如例如大约6-9％或大约7-8％；
(5)少于大约30％、优选少于大约25％的寡糖链包含至少一个未加帽的触角，诸如例如大约11-23％或大约12-18％；且
(6)至少大约2％、优选至少大约5％、更优选至少大约10％或20％、且最优选至少大约40％的寡糖链包含至少一个经α1-＞3连接至触角性N-乙酰葡萄糖胺残基(即β1-＞2、4、或6连接至Man残基上的N-乙酰葡萄糖胺残基)的岩藻糖。
可以理解，(1)-(6)中的每一项可能代表本发明实施方案所涵盖的不同糖型样式，即可以通过(1)-(6)中的一项来描述依照本发明的制剂的糖型样式，其中至少一个聚合基团共价附着于至少一个寡糖上。或者，可以通过(1)-(6)中的多项来描述本发明所涵盖的制剂的糖型样式。
另外，可以由(1)-(6)中的一项或多项并联合一种或多种其它结构特征来描述本发明所涵盖的制剂。例如，本发明涵盖包含因子VII多肽或因子VII相关多肽的制剂，其中唾液酸残基(Neu5Ac或Neu5Gc)专门以α2-＞3构型连接至半乳糖上。本发明还涵盖包含因子VII多肽或因子VII相关多肽的制剂，其中含有以α1-＞6连接至核心N-乙酰葡萄糖胺上的岩藻糖和/或以α1-＞3连接至触角性N-乙酰葡萄糖胺上的岩藻糖。在一系列实施方案中，本发明的制剂包含因子VII或因子VII相关多肽，其中超过99％的寡糖链包含至少一个唾液酸残基，且(a)所述唾液酸残基专门以α2-＞3的构型连接，和/或(b)存在连接至核心N-乙酰葡萄糖胺上的岩藻糖残基，和/或(c)可检测数目的触角以N-乙酰半乳糖胺为末端。在一个实施方案中，本发明涵盖包含野生型因子VIIa的制剂，其中超过99％的寡糖链包含至少一个唾液酸残基，而且唾液酸残基专门以α2-＞3的构型连接至半乳糖上。在另一个实施方案中，本发明涵盖包含野生型因子VIIa的制剂，其中超过99％的寡糖链包含至少一个唾液酸残基，而且至少一些寡糖链包含N-乙酰半乳糖胺。
可以使用本领域知道的任何方法来测定N-连接和/或O-连接寡糖的样式，包括但不限于：高效液相层析(HPLC)；毛细管电泳(CE)；核磁共振(NMR)；使用诸如快速原子轰击、电喷射、或基质辅助激光解吸(MALDI)等离子化技术的质谱(MS)；气相层析(GC)；以及联合阴离子交换(AIE)-HPLC、大小排阻层析(SEC)、质谱法(MS)、凝胶电泳(SDS-PAGE、CE-PAGE)、等电聚焦凝胶、或等电聚焦毛细管电泳(CE-IEF)的外切糖苷酶处理。参阅例如Weber等人，Anal.Biochem.，225：135，1995；Klausen等人，J.Chromatog.，718：195，1995；Morris等人，《Mass Spectrometry of Biological Materials》即生物学材料的质谱，McEwen等人编，Marcel Dekker，1990，第137-167页；Conboy等人，Biol.Mass Spectrom.，21：397，1992；Hellerqvist，Meth.Enzymol.，193：554，1990；Sutton等人，Anal.Biohcem.，318：34，1994；Harvey等人，Organic Mass Spectrometry，29：752，1994。
使用任何上述方法(或分辨具有不同结构的寡糖链的任何其它方法)拆分因子VII衍生寡糖链后，将拆分出的种类归类，例如归入(1)-(6)其中一组。计算(1)-(6)每一种的相对含量，即归入该组的寡糖总数相对于样品中寡糖链总含量的比例。
例如，使用AIE-HPLC，可以由在BHK细胞中生成的重组因子VII制剂拆分13个或更多N-连接寡糖峰(参阅例如Klausen等人，Mol.Biotechnol.，9：195，1998)。其中5个峰(在Klausen等人的论文中命名为1-5)不含唾液酸，8个峰(命名为6、7、和10-15)确实含有唾液酸。
可以理解，在指定分析中，含唾液酸链和缺乏唾液酸链的数目和分布可能取决于(a)所表达的多肽；(b)细胞类型和培养条件；(c)表达后化学和/或酶促处理对糖型样式的任何修饰；和(d)采用的分析方法，因此所得到的样式可能相应变化。
在任何情况中，一旦将含唾液酸的寡糖与不含唾液酸寡糖拆分开来，就使用常规数据分析程序来计算每个峰下面的面积；总的峰面积；和各个峰占总峰面积的百分率。通过这种方式，对于指定制剂，含唾液酸的峰的面积之和/总的峰面积X 100即得到依照本发明的制剂的唾液酸化百分率数值(即具有至少一个唾液酸残基的寡糖链的比率)。通过相似方式，可以计算不含唾液酸或含有至少一个半乳糖或N-乙酰葡萄糖胺的链的百分率。
聚合物
将要偶联到多肽上的聚合物分子可以是任何合适分子，诸如天然或合成的均聚物或杂聚物，分子量范围通常是大约300-100,000Da，诸如大约500-20,000Da、或大约500-15,000Da、或2-15kDa、或3-15kDa、或3-12kDa、或大约10kDa。在本文中与某一分子量一起使用时，术语“大约”指指定聚合物制剂中的近似平均分子量分布。
均聚物的范例包括聚醇(即poly-OH)、聚胺(即poly-NH2)、和聚羧酸(即poly-COOH)。杂聚物指包含不同偶联基团诸如羟基和胺基的聚合物。
合适聚合物分子的范例包括选自下组的聚合物分子：聚环氧烷(PAO)，包括聚亚烷基二醇(PAG)，诸如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐、葡聚糖，包括羧甲基葡聚糖、聚氨基甲酸酯、聚酯、和聚酰胺，或者适于降低免疫原性和/或增加功能性体内半衰期和/或血清半衰期的任何其它聚合物。一般而言，由聚亚烷基二醇衍生的聚合物是生物相容性的、无毒的、无抗原性的、且无免疫原性的，具有多种水溶性特性，而且易于由活生物体分泌。
PEG是优选的聚合物分子，因为与例如多糖诸如葡聚糖相比它只有少数能够交联的反应性基团。具体而言，对单功能性PEG、例如甲氧基聚乙二醇(mPEG)感兴趣，因为它的偶联化学较为简单(只有一个反应性基因能够用于缀合寡糖上的附着基因)。这样消除了交联的风险，由此得到的多肽缀合物更加均一，而且聚合物分子与多肽的反应更加易于控制。
为了实现聚合物分子对多肽的共价附着，必须以活化形式提供聚合物分子的羟基末端基团，即具有反应性官能团(其实例包括例如伯氨基、酰肼(HZ)、硫醇、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基羧甲酸酯(SCM)、苯并三唑碳酸酯(BTC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、醛、硝基苯基碳酸酯(NPC)、和tresylate(RES))的形式。合适的活化聚合物分子可以通过商业途径获得，例如ShearwaterPolymers公司(亨茨维尔，阿拉巴马州，美国)或PolyMASCPharmaceuticals公司(英国)。或者，可以通过本领域知道的常规方法来活化聚合物分子，例如如WO 90/13540中所述的方法。用于本发明的活化的线性或分支聚合物分子的具体范例描述于ShearwaterPolymers公司1997年和2000年的产品目录(用于研究和制药的官能化生物相容聚合物，聚乙二醇及衍生物，收入本文作为参考)。
活化的PEG聚合物的具体范例包括下列线性PEG：NHS-PEG(例如SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG、和SCM-PEG)、和NOR-PEG、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEG、和MAL-PEG，以及分支PEG，诸如PEG2-NHS，和US 5,932,462和US 5,643,575(将二者收入本文作为参考)中公开的那些。另外，下列发表物(收入本文作为参考)公开了有用的聚合物分子和/或PEG化化学法：US 5,824,778、US5,476,653、WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、US 4,902,502、US 5,281,698、US 5,122,614、US 5,219,564、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO 95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439,508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921,131、US 5,736,625、WO 98/05363、EP 809,996、US 5,629,384、WO 96/41813、WO 96/07670、US 5,473,034、US 5,516,673、EP 605,963、US 5,382,657、EP 510,356、EP 400,472、EP 183,503和EP 154,316。
可通过任何常规方法来进行多肽的寡糖链与活化聚合物分子的缀合。常规方法对于熟练技术人员而言是知道的。
熟练技术人员将认识到，将要使用的活化方法和/或缀合化学取决于寡糖的附着基团以及聚合物分子的功能性基团(例如胺、羟基、羧基、醛、酮、巯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺、乙烯砜、或卤代醋酸酯)。
可以理解，聚合物缀合可设计成生成就附着的聚合物分子的数目、这些分子的大小和形式(例如它们是线性的或是分支的)、以及寡糖链中的附着位点而言的最佳分子。可以根据例如需要实现的期望效果来选择将要使用的聚合物的分子量。例如，若缀合的主要目的是获得具有高分子量的缀合物(例如用于降低肾清除)，则常常希望缀合尽可能少的高分子量聚合物分子以获得期望分子量。
本发明还包括通过接头将聚合物分子偶联至多肽上。合适的接头对于熟练技术人员而言是众所周知的。优选的范例是氰尿酰氯(Abuchowski等人，1977，J.Biol.Chem.，252：3578-3581；US4,179,337；Shafer等人，1986，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24：375-378)。缀合之后，依照本领域已知方法封闭残余的活化聚合物分子，例如通过向反应混合液中添加伯胺，并通过合适方法清除由此生成的灭活聚合物分子。这些方法对于熟练技术人员而言是众所周知的；参阅例如March，《Advanced Organic Chemistry》即高级有机化学，第3版，John Wiley & Sons，纽约，1985；Greene等人，《Protectivegroups in Organic Synthesis》即有机合成中的保护性基团，John Wiley& Sons，纽约，1991；Taylor，1991，《Protein Immobilization，Fundamentals and Applications》即蛋白质固定的原理和应用，MarcelDekker，纽约；Wong，1992，《Chemistry of Protein Conjugation andCrosslinking》蛋白质缀合和交联的化学，CRC出版社，伯克莱屯；Hermanson等人，1993，《Immobilized Affinity Ligand Techniques》固定化亲和配体技术，Academic出版社，纽约；Dunn等人编，《PolymericDrugs and Drug Delivery Systems》聚合药物和聚合投递系统，ACS系列讨论会，第469卷，美国化学学会，1991)。
可以理解，根据具体情况，例如多肽的氨基酸序列、所使用的活化PEG化合物的性质、和具体的PEG化条件，包括PEG与多肽的摩尔比，可以获得不同程度的PEG化，通常在PEG：多肽比例较高时获得较高程度的PEG化。然而，由任何指定PEG化方法得到的PEG化多肽通常将包含具有略微不同PEG化程度的多肽缀合物的随机分布。
在本发明的一个有趣的实施方案中，本发明的多肽缀合物包含共价附着于位于因子VII多肽寡糖基团末端的唾液酸基团之一上的聚合物分子，其中所述聚合物分子是附着于多肽上的唯一聚合物分子。在另一个实施方案中，两个聚合物分子共价附着于因子VII多肽的一个或多个寡糖基团上；在其它实施方案中，三个、四个、五个、六个、或七个聚合物分子共价附着于因子VII多肽上。
在一个实施方案中，因子VII多肽是图1所示野生型FVII或FVIIa多肽；在另一个实施方案中，因子VII多肽是因子VII相关多肽；在它的一个实施方案中，因子VII相关多肽是因子VII氨基酸序列变体。
优选的是，这些多肽缀合物包含单个PEG分子。具体而言，优选分子量至少大约5kDa，特别是大约10-25kDa，诸如大约15-25kDa，例如大约20kDa或大约10kDa的线性或分支PEG分子。
优选的是，在本发明的缀合物中，选择聚合分子的数目和分子量，使得通过聚合分子添加的总分子量在5-25kDa范围内，诸如例如10-25kDa、大约5kDa、大约10kDa、大约15kDa、或大约20kDa。用于生成具有预定寡糖样式且附着了聚合物的因子VII制剂的方法
用于生成因子VII制剂的方法：
可以使用表达糖基化因子VII或因子VII相关多肽的任何适当宿主细胞(即能够在多肽的糖基化位点附着寡糖基团的宿主细胞)来生成因子VII、因子VII变体、或因子VII相关多肽。还可以由来自人或其它物种的血浆分离因子VII。
在有些实施方案中，宿主细胞是表达内源因子VII基因的人细胞。在这些细胞中，内源基因可以是完整的，或者可以在原位修饰，或者可以原位修饰因子VII基因以外的序列以改变内源因子VII基因的表达。可以使用能够表达内源因子VII基因的任何人细胞。
在其它实施方案中，异源宿主细胞被处理成由重组基因表达人因子VII。宿主细胞可以是脊椎动物、昆虫、或真菌细胞。优选的是，细胞是能够进行所有整个哺乳动物N-连接糖基化、O-连接糖基化、和γ-羧基化的哺乳动物细胞。参阅例如美国专利号4,784,950。优选的哺乳动物细胞系包括CHO(ATCC CCL 61)、COS-1(ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)、和HEK293(ATCC CRL 1573；Graham等人，J.Gen.Virol.，36：59-72，1977)细胞系。优选的BHK细胞系是tk-ts13 BHK细胞系(Waechter和Baserga，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：1106-1110，1982)，下文称为BHK 570细胞。BHK 570细胞系可以由美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection，12301 Parklawn Dr.，罗克维尔，马里兰州，20852)以ATCC编号CRL 10314获得。tk-ts13 BHK细胞系还可以由ATCC以编号CRL 1632获得。另外，可以使用许多其它细胞系，包括大鼠Hep I(大鼠肝癌；ATCC CRL 1600)、大鼠Hep II(大鼠肝癌；ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)、和DUKX细胞(CHO细胞系)(Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216-4220，1980)(DUKX细胞还称为CXB11细胞)、和DG44(CHO细胞系)(Cell，33：405，1983和SomaticCell and Molecular Genetics，12：555，1986)。同样有用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤、以及骨髓瘤与其它细胞的融合体。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞是适应了在缺乏血清的条件下生长且被处理成表达因子VII的BHK 21细胞。在有些实施方案中，细胞可以是所表达的糖基化酶(诸如例如糖基转移酶和/或糖苷酶)谱在质量上或数量上与衍生它们的细胞类型相比有所不同的突变或重组细胞。还可以将细胞处理成表达其它异源肽或蛋白质，包括例如截短形式的因子VII。在一个实施方案中，宿主细胞是被处理成共表达目的因子VII多肽(即因子VII或因子VII相关多肽)和另一种异源肽或多肽(诸如例如修饰酶)或因子VII片段的CHO细胞。
可以通过下列步骤来进行用于生成因子VII(它包含上文(1)-(6)所述的任何糖型样式)的制剂的方法和用于优化因子VII和因子VII相关多肽的糖型分布的方法：
(a)在第一组预定培养条件下培养表达因子VII或因子VII相关多肽的细胞；
(b)由培养物回收因子VII或因子VII相关多肽以获得包含所述多肽的制剂；并
(c)分析连接至多肽上的寡糖的结构以测定糖型样式。
这些方法还可以包括：
(d1)改变步骤(a)的培养条件以获得第二组预定培养条件；
(e1)重复步骤(b)-(d1)直至获得期望的糖型样式；
(f1)在聚合物分子将共价附着于多肽的寡糖基团上的条件下使因子VII或因子VII相关多肽接触聚合物分子。
或者，这些方法还可以包括：
(d2)化学和/或酶促处理制剂以改变寡糖结构；并
(e2)重复步骤(b)-(d2)直至获得期望的糖型样式。
这些方法还可以包括：对具有预定糖型样式的制剂进行至少一种生物活性(包括例如凝结、因子X蛋白水解、或TF结合)或其它功能性(诸如例如药物动力学特征或稳定性)的测试，并将特定糖型样式与特定生物活性或功能性特征联系起来，以鉴定期望的糖型样式。
步骤(d1)中可以改变的培养条件变量包括但不限于：细胞来源，诸如例如由与最初所用的细胞不同的物种衍生的细胞；或者一种或多种糖基转移酶或糖苷酶或糖基化装置的其它成分有所改变的突变或重组细胞(参阅Grabenhorst等人，Glycoconjugate J.，16：81，1999；Bragonzi等人，Biochem.Biophys.Acta，1474：273，2000；Weikert，NatureBiotechnol.，17：1116，1999)；多肽的表达水平；代谢条件，诸如例如葡萄糖或谷氨酰胺浓度；血清的存在与否；维生素K的浓度；蛋白水解产物、激素、痕量金属、盐、以及工艺参数(像温度、溶解氧水平和pH)。
可以在步骤(d2)中用于修饰制剂的寡糖样式的酶促处理包括但不限于以一定顺序、在能够实现对具有特定末端结构的寡糖链的分布产生期望改变的条件下用一种或多种唾液酸酶(神经氨酸苷酶)、半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶、半乳糖转移酶、岩藻糖转移酶、和/或唾液酸转移酶进行的处理。糖基转移酶可以由Calbiochem(拉霍亚，加利福尼亚州)购买，而糖苷酶可以由Glyko(诺瓦托，加利福尼亚州)购买。
在一系列实施方案中，对表达因子VII或相关多肽的宿主细胞进行特定培养条件，其中它们分泌具有上文(1)-(6)所述的任何期望寡糖结构样式的糖基化因子VII多肽。这些培养条件包括但不限于减少血清或完全不用。优选的是，宿主细胞适应了在缺乏血清的条件下生长，并在生长期和生产期两个阶段都在缺乏血清的条件下培养。这些适应化流程描述于例如Scharfenberg等人，《Animal Cell TechnologyDevelopments towards the 21st Century》即走向21世纪的动物细胞技术发展，E.C.Beuvery等人编，Kluwer Academic Publishers，第619-623页，1995(BHK和CHO细胞)；Cruz，Biotechnol.Tech.，11：117-120，1997(昆虫细胞)；Keen，Cytotechnol.，17：203-211，1995(骨髓瘤细胞)；Berg等人，Biotechniques，14：972-978，1993(人肾293细胞)。在一个优选的实施方案中，加到细胞中的培养基不含蛋白质或由动物组织或动物细胞培养物分离的其它成分。参阅例如下文实施例1。通常，除了常规成分以外，适于生产因子VII的培养基含有因子VII中谷氨酰胺残基γ-羧化所需要的维生素K，浓度为0.1-50mg/L。
在另一系列的实施方案中，通过对因子VII或因子VII相关多肽制剂进行酶促和/或化学修饰其中所含的N-连接和/或O-连接的寡糖来生成糖型，诸如用唾液酸转移酶或半乳糖转移酶对制剂进行修饰，诸如例如US 6,399,336中所述。优选的是，修饰N-连接的寡糖。唾液酸转移酶能够以高百分比对糖蛋白上的受体基团(例如末端半乳糖)进行唾液酸化。通常每mg糖蛋白使用大约50mU或更少唾液酸转移酶来获得期望结果。通常的结果是，具有通过这种方法改变了的糖型样式的糖蛋白上的寡糖链与未改变的多肽相比，将有较大百分比的末端半乳糖残基得到唾液酸化。实质上，在使用这些方法后，可能将100％的末端半乳糖残基唾液酸化。这些方法通常能够在大约48小时或更短时间内实现期望水平的唾液酸化。优选的是，对于糖蛋白上N-连接的碳水化合物的糖基化，唾液酸转移酶能够将唾液酸转移至序列Gal(β1-＜4)GlcNAc-上，即完全唾液酸化的碳水化合物结构上的末端唾液酸下面最常见的倒数第二个序列。使用(β1-＞4)GlcNAc-作为受体基团的唾液酸转移酶的范例是ST3GalIII、ST3Gal IV、和ST3Gal V(通过α2-＞3连接附着NeuAc)以及ST6GalI和ST6Gal II(通过α2-＞6连接附着NeuAc)(参阅US 6,399,336)。(唾液酸转移酶的命名法描述于Tsuji等人，Glycobiology，6：v-xiv，1996)。
因此，如果希望终产物中两种连接都有，那么两种酶的混合物可能是有价值的。简而言之，使用例如唾液酸转移酶循环(其中包括CMP-唾液酸合成酶)来实现糖蛋白的唾液酸化。这个循环中的CMP-再生系统包括胞苷单磷酸(CMP)、核苷三磷酸、磷酸供体、能够将磷酸由磷酸供体转移至核苷二磷酸的激酶、和能够将末端磷酸由核苷三磷酸转移至CMP的核苷单磷酸激酶。再生系统中还采用CMP-唾液酸合成酶，它将唾液酸转移至CMP。在唾液酸化循环中，在存在添加的ATP时通过核苷单磷酸激酶将CMP转变成CDP。ATP是在存在添加的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)时通过丙酮酸激酶(PK)由它的副产物ADP催化再生的。CDP进一步转变成CTP，这一转变是在存在PEP时由PK催化的。CTP与唾液酸反应而形成无机焦磷酸(PPi)和CMP-唾液酸，后一个反应是由CMP-唾液酸合成酶催化的。在半乳糖基葡萄糖苷唾液酸化后，释放的CMP再次进入再生循环而重新形成CDP、CTP、和CMP-唾液酸。形成的PPi得到清除，并形成无机磷酸作为副产物。丙酮酸也是副产物。由于这种方法的自含和循环特性，一旦所有反应物和酶都存在，反应将继续下去，直至一种底物(例如游离的NeuAc和PEP，或者受体)耗尽。唾液酸转移酶描述于例如US5,374,541和US 6,399,336中。
唾液酸转移酶的接受体将存在于待修饰的糖蛋白上。合适的接受体包括例如Gal(β1-＞4)GlcNAc-、Gal(β1-＞4)GalNAc-、Gal(β1-＞3)GalNAc-、Gal(β1-＞3)GlcNAc-、Gal(β1-＞6)GlcNAc-、Gal(β1-＞4)Glc-、和本领域熟练技术人员知道的其它接受体(参阅例如Paulson等人，1978，J.Biol.Chem.，253：5617-5624)。通常，接受体包含在附着于多肽中存在的天冬酰胺、丝氨酸、或苏氨酸残基的寡糖链中。
糖蛋白可以是完全或部分经过“修剪”而暴露唾液酸转移酶的接受体或可以添加一个或多个适当残基以获得合适接受体的模块。酶诸如糖基转移酶和内切糖苷酶可用于附着和修剪反应。例如，可以在对蛋白质进行唾液酸转移酶循环之前通过用唾液酸酶处理糖蛋白而“修剪”它以生成末端半乳糖基团，或者，甚至可以通过进一步的半乳糖苷酶处理而到达N-乙酰葡萄糖胺水平。用于获得具有合适唾液酸化接受体的多肽的方法参阅例如美国专利号5,272,066。
用于将聚合物分子共价附着于因子VII多肽的方法：
可以通过化学合成或例如用经修饰的唾液酸对多肽进行酶促处理而将多种化学模块诸如用于实践本发明的聚合物分子共价附着于因子VII多肽上的寡糖上。还可以通过接头将聚合物分子偶联至寡糖。合适的接头对于熟练技术人员而言是众所周知的。范例包括但不限于N-(4-乙酰苯基)马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基酯活化的马来酰亚胺衍生物，诸如商品化的琥珀酰亚胺基4-马来酰亚胺丁酸酯、1，6-二马来酰亚胺己烷。
可以将多种化学模块诸如用于实践本发明的聚合物分子共价附着于唾液酸，由此得到的“经修饰”(或缀合)的唾液酸随后掺入唾液酸转移酶循环，导致聚合物分子共价附着于糖蛋白。可以通过熟练技术人员知道的常规方法来生成缀合的唾液酸。还可以通过接头将聚合物分子偶联至唾液酸上。
FVII和FVII类似物的化学酶促衍生化
在实践本发明时使用的经修饰的糖磷酸核苷酸可以依照通式1和2进行取代：
通式1                                                   通式2
其中
-X是独立选自S、O、NH、或价键的成员；
-R1、R2、R3、R4、和R5是独立选自H、聚合物和共价附着于聚合物上的接头分子、酰基(包括乙酰基和羟乙酰基)、和烷基的成员；
-M+是选自Na+、K+、Li+、四丁基铵、或类似阳离子的阳离子。
在一个优选的实施方案中，R1和R2独立的是分子量为1-40,000Da的基于PEG的聚合物。
在一个还要更加优选的实施方案中，R1独立的是分子量为1-40,000Da的基于PEG的聚合物。
在方案1所示的一个例示性实施方案中，首先，依照Isecke，R.、Brossmer，R.，Tetrahedron，1994，50(25)：7445-7460所述，将胺、2-羟基、和羧基受保护的神经氨酸转变成它的9-氨基衍生物，接着，使用标准偶联条件，进一步用PEG-COOH进行衍生化。然后，在温和的酸性条件下将PEG衍生产物去保护，并酶促转变成相应的核苷酸糖。
方案1：
Figure A20081000946800381
在方案2所示的另一个例示性实施方案中，在Mitsunobu条件下用经过PEG衍生化的硫代酸处理N-乙酰神经氨酸，以生成PEG衍生化的N-乙酰神经氨酸，随后将其转变成糖核苷酸。
方案2：
Figure A20081000946800391
在方案3所示的一个例示性实施方案中，经修饰的半乳糖的硫醇与含马来酰亚胺模块的PEG反应。然后可以通过酶促或化学方法的将PEG-半乳糖化合物转变成相应的核苷酸糖。
方案3：
在方案4所示的另一个例示性实施方案中，6-氨基半乳糖(Fernandez，J.等人，J.Org.Chem.，1993，58(19)：5192-5199)与含受保护的氨基酸模块的PEG反应。甲酯是皂化的。然后可以通过酶促或化学方法将PEG-半乳糖化合物转变成相应的核苷酸糖。
方案4：
Figure A20081000946800401
在方案5所示的另一个例示性实施方案中，受保护的6-溴-半乳糖(Hodosi，G.、Podanyi，B.、和Kuszmann，J.，Carbohydr.Res.，1992，230(2)：327-342)与含硫醇模块的PEG反应。在酸性条件下除去异亚丙基。然后可以通过酶促或化学方法将PEG-半乳糖化合物转变成相应的核苷酸糖。
方案5：
Figure A20081000946800402
在方案6所示的另一个例示性实施方案中，受保护的半乳糖醛酸(Godage，Y.S.和Fairbanks，A.J.，Tetrahedron Lett.，2000，41(39)：7589-7594)与含胺部分的PEG反应。在酸性条件下除去异亚丙基。然后可以通过酶促或化学方法将PEG-半乳糖化合物转变成相应的核苷酸糖。
方案6：
Figure A20081000946800411
一般而言，可以使用天然或突变的糖基转移酶将糖核苷酸(诸如上文所述那些糖核苷酸)酶促转移至合适的糖蛋白(诸如FVII或FVII相关多肽)上，所述糖基转移酶例如包括但不限于：α2，3-唾液酸转移酶、α2，6-唾液酸转移酶、或β1，4-半乳糖转移酶。根据PEG衍生化的糖核苷酸的选择(CMP-SA-PEG或UDP-Gal-PEG)，可能优选在与糖基转移酶和PEG衍生化的糖核苷酸反应之前用唾液酸酶、半乳糖苷酶、或二者处理FVII相关多肽。
由此，在一个优选的实施方案中，用唾液酸酶处理FVII类似物，以生成唾液酸-FVII类似物，随后用唾液酸转移酶和依照通式1的CMP-SA-PEG类似物进行处理，以生成PEG衍生化的FVII类似物。
在另一个实施方案中，顺序处理FVII相关多肽，首先是唾液酸酶，其次是半乳糖苷酶，以生成唾液酸-半乳糖-FVII相关多肽。然后用半乳糖转移酶和依照通式2的UDP-Gal-PEG类似物处理这种类似物，以生成PEG衍生化的FVII类似物。
在系列实施方案中，采用直接或通过接头模块共价结合至聚合物上的经修饰半乳糖化合物。可以直接采用因子VII或因子VII相关多肽来获得较低水平的聚合物/多肽比率，或者首先用唾液酸酶处理因子VII或因子VII相关多肽以除去末端唾液酸，从而获得较高水平的聚合物/肽比率。通过用半乳糖苷酶处理多肽，可以进入经修饰半乳糖化合物的附着点。可以采用UDP活化形式的经修饰半乳糖化合物和半乳糖转移酶来形成经修饰的半乳糖化合物与经处理的多肽之间的键。这一类型的例示性实施方案例示于方案7中，其中黑色的圆代表因子VII或因子VII相关多肽，还例示了一些碳水化合物的末端部分。
方案7：
Figure A20081000946800421
FVII和FVII类似物的化学衍生化
使用高碘酸钠对碳水化合物残基进行化学氧化是制备FVII-PEG缀合物的候选方法。碳水化合物的化学氧化通常将生成多个反应性醛基，每一个都能够与PEG-亲核试剂，诸如PEG-酰肼、PEG-O-羟胺、和PEG-胺反应。
用PEG-酰肼和PEG-O-羟胺分别能够制备稳定的FVII-PEG-酰腙和FVII-PEG-肟缀合物。用PEG-胺能够制备略不稳定的Shiff碱缀合物形式。然而，通过氰硼氢化钠的还原形成仲胺键，能够进一步稳定这种缀合物。FVII-PEG-酰腙缀合物也可以用氰硼氢化钠还原而形成N，N′-连接的肼缀合物。
糖缀合的因子VII制剂的纯化
在用于本文时，“因子VII制剂”指已经与合成它们的细胞或反应介质分开的多种因子VII多肽、因子VIIa多肽、或因子VII相关多肽，包括变体和化学修饰形式。
因子VII制剂和缀合物的纯化：
可以通过本领域知道的任何方法来实现将重组生产的多肽与它们的细胞来源相分离，包括但不限于将包含期望产物的细胞培养基与粘附细胞培养物分开；离心或过滤以除去非粘附细胞；诸如此类。
任选的是，可以进一步纯化因子VII多肽。可以使用本领域知道的任何方法来实现纯化，包括但不限于：亲和层析，诸如例如在抗因子VII抗体柱上进行(参阅例如Wakabayashi等人，J.Biol.Chem.，261：11097，1986；和Thim等人，Biochem.，27：7785，1988)；疏水相互作用层析；离子交换层析；大小排阻层析；电泳流程(例如制备性等电聚焦(IEF)、差异溶解性(例如硫酸铵沉淀)、或抽提等等。通常参阅Scopes，《ProteinPurification》即蛋白质纯化，Springer-Verlag，纽约，1982；和《Protein Purification》即蛋白质纯化，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers，纽约，1989。纯化后，制剂优选包含少于大约10％(以重量计)、更优选少于大约5％、且最优选少于大约1％的由宿主细胞衍生的非因子VII蛋白质。
可以使用因子XIIa或具有胰蛋白酶样特异性的其它蛋白酶，诸如例如因子IXa、激肽释放酶、因子Xa、和凝血酶，通过蛋白水解切割来激活因子VII和因子VII相关多肽。参阅例如Osterud等人，Biochem.，11：2853，1972；Thomas，美国专利号4,456,591；和Hedner等人，J.Clin.Invest.，71：1836，1983。或者，可以通过流经离子交换层析柱诸如Mono
Figure A20081000946800431
(Pharmacia)等来激活因子VII。然后可以如下文所述配制并施用由此得到的激活的因子VII。
因子VII制剂的功能特性
与参考制剂相比，具有共价附着了聚合物分子的预定寡糖样式的因子VII多肽和因子VII相关多肽的本发明制剂展示改进的功能特性。所述改进的功能特性可以包括但不限于：1)物理特性，诸如例如贮藏稳定性；2)药物动力学特性，诸如例如生物利用度和半衰期；和3)在人体中的免疫原性。
参考制剂指包含具有与进行比较的本发明制剂所含多肽相同的氨基酸序列、但未缀合本发明制剂中的任何聚合物分子的多肽的制剂(诸如例如非缀合形式的野生型因子VII或特定变体或化学修饰形式)。例如，参考制剂通常包含非缀合的野生型因子VII或非缀合的因子VII相关多肽。
可以通过测量(1)将干粉贮藏于25℃时制剂的生物活性衰减20％所需要的时间，和/或(2)制剂中因子VIIa聚集体的比率加倍所需要的时间，由此评估因子VII制剂的贮藏稳定性。
在有些实施方案中，当本发明制剂与参考制剂二者以干粉贮藏于25℃时，本发明的制剂展示生物活性衰减20％所需要的时间相对于参考制剂实现相同现象所需要的时间增加至少大约30％、优选至少大约60％、且更优选至少大约100％。生物活性测量可以使用凝结测定法、蛋白水解测定法、TF结合测定法、或不依赖TF的凝血酶生成测定法中的任何方法来进行。
在有些实施方案中，当本发明制剂与参考制剂二者以干粉贮藏于25℃时，本发明的制剂展示聚集体加倍所需要的时间相对于参考制剂而言增加至少大约30％、优选至少大约60％、且更优选至少大约100％。如下所述，通过在蛋白质Pak 300 SW柱(7.5×300mm)(Waters，80013)上进行凝胶渗透HPLC来测定聚集体的含量。用洗脱液A(0.2M硫酸铵、5％异丙醇，用磷酸将pH调至2.5，然后用三乙胺将pH调至7.0)平衡柱，然后将25μg样品加样到柱上。用洗脱液A以流速0.5ml/min洗脱30分钟，并通过测量215nm的吸光率来进行检测。根据因子VII聚集体峰面积/因子VII峰总面积(单体和聚集体)之比来计算聚集体的含量。
“生物利用度”指施用后在预定时间在血浆中能够检测到的因子VII或因子VII相关制剂占施用剂量的比率。通常，生物利用度是如下在测试动物中测量的：以大约25-250μg/kg的剂量施用制剂；施用后预定时间采集血浆样品；并使用凝结测定法(或任何生物测定法)、免疫测定法、或相当测定法中的一种或多种方法测定样品中因子VII或因子VII相关多肽的含量。数据通常以因子VII对时间作图来显示，而生物利用度表述成曲线下的面积(AUC)。待测制剂的相对生物利用度指待测制剂的AUC与参考制剂的AUC之间的比率。
在有些实施方案，本发明的制剂展示参考制剂的生物利用度的至少大约110％、优选至少大约120％、更优选至少大约130％、且最优选至少大约140％。可以在任何哺乳动物物种中测量生物利用度，优选狗，而且用于计算AUC的预定时间可以涵盖10分钟-8小时的不同增量。
“半衰期”指因子VII多肽或因子VII相关多肽的血浆浓度由特定值降至该值的一半所需要的时间。可以使用与生物利用度相同的流程来测定半衰期。在有些实施方案中，本发明的制剂展示半衰期相对于参考制剂的半衰期增加至少大约0.25小时、优选至少大约0.5小时、更优选至少大约1小时、且最优选至少大约2小时。
制剂的“免疫原性”指制剂在施用于人后引发有害免疫应答的能力，可以是体液应答、细胞应答、或二者。已知因子VIIa多肽和因子VIIa相关多肽不会在人体中引发可检测的免疫应答。但是，在任何人类亚群中，可能存在对施用的特定蛋白质展示敏感性的个体。可以通过使用本领域知道的常规方法对敏感个体中存在的抗因子VII抗体和/或因子VII反应性T细胞定量来测量免疫原性。在有些实施方案中，本发明的制剂展示在敏感个体中的免疫原性相对于参考制剂在该个体中的免疫原性降低了至少大约10％、优选至少大约25％、更优选至少大约40％、且最优选至少大约50％。
药物组合物
本发明的制剂可用于治疗任何因子VII反应综合症，诸如例如出血紊乱，包括但不限于那些由凝结因子缺乏(如血友病A和B或凝结因子XI或VII缺乏)、由血小板减少或von Willebrand氏病、或由凝结因子抑制剂引起的出血紊乱，或者任何原因的过度出血。还可以对与手术或其它创伤有关的患者或者接受抗凝剂疗法的患者施用所述制剂。
包含依照本发明的、与野生型因子VII相比生物活性实质性降低的因子VII相关多肽的制剂可以作为抗凝剂，诸如例如用于经历血管成形术或其它手术操作的患者，这些手术可能增加例如再狭窄中发生的血栓形成或血管堵塞的风险。开出抗凝剂药方的其它医学适应症包括但不限于深静脉血栓形成、肺栓塞、中风、弥漫性血管内凝血(DIC)、与革兰氏阴性内毒素血症有关的肺和肾中的纤维蛋白沉积、心肌梗塞；急性呼吸窘迫综合症(ARDS)、全身性炎性应答综合症(SIRS)、溶血性尿毒症综合症(HUS)、MOF和TTP。
包含依照本发明的因子VII和因子VII相关制剂的药物组合物主要意欲肠胃外施用，以进行预防性和/或治疗性处理。优选的是，肠胃外施用药物组合物，即静脉内、皮下、或肌肉内施用。它们可以通过连续或脉动输注进行施用。
药物组合物或配方包含依照本发明的制剂，并联合、优选溶于制药学可接受载体、优选水性载体或稀释剂中。可以使用多种水性载体，诸如水、缓冲液、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、诸如此类。本发明的制剂还可以配制成脂质体制剂，用于投递或靶向到损伤部位。脂质体制剂概括描述于例如美国专利号4,837,028、4,501,728、和4,975,282中。组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌。可以包装由此生成的水溶液备用，或者在无菌条件下过滤并冻干，在施用前将冻干制剂与无菌水溶液。
组合物中可以包含制药学可接受的辅助物质或佐剂，包括但不限于pH调节和缓冲剂和/或张力调节剂，诸如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、等。
这些配方中的因子VII或因子VII相关多肽的浓度可以广泛变化，即由低于大约0.5％(以重量计)、通常是或至少大约1％(以重量计)至高达15％或20％(以重量计)，而且将主要根据流体体积、粘度等选择，并与选择的具体施用模式一致。
由此，用于静脉内输注的典型药物组合物可以配制成包含250ml无菌Ringer氏溶液和10mg制剂。用于制备可肠胃外施用的组合物的实际方法对于本领域熟练技术人员而言将是知道的或显而易见的，而且更加详细的描述于例如《Remington′s Pharmaceutical Sciences》即雷明顿制药科学，第18版，Mack出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州，1990。
包含本发明制剂的组合物可以施用于预防性和/或治疗性处理目的。在治疗性应用中，如上所述对早就患有疾病的受试者施用组合物，施用的量足以治愈、减轻、或部分阻止疾病及其并发症。足以实现这一目的的量定义为“治疗有效量”。对于每种目的的有效量将取决于疾病或损伤的严重程度，以及受试者的体重和一般状况。然而，一般而言，有效量的范围将是70kg受试者每天大约0.05mg至大约500mg制剂，更常用的剂量是每天大约1.0mg至大约200mg制剂。可以理解，可以利用常规实验，通过构建数值矩阵并测试矩阵中的不同点来实现适当剂量的测定。
可以通过例如喷雾、灌注、二联气囊导管、stent、掺入血管移植物或stent、用于包被气囊导管的水凝胶、或其它完善建立的方法等手段来进行本发明制剂的局部投递，诸如局部应用。在任何情况下，药物组合物提供的制剂的量应当足以有效治疗受试者。
本发明的药物组合物还可以包含其它生物活性剂，诸如例如非因子VII相关凝血剂或抗凝剂。
缓释制剂
缓释制剂的范例包括含有多肽或缀合物的固体疏水聚合物的半渗透基质，基质具有合适的形式，诸如薄膜或微囊。缓释基质的实施例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸与乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如
Figure A20081000946800481
技术或LupronDepot@(由乳酸-乙醇酸寡聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)、和聚D-(-)-3-羟丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够在较长的时间里释放分子，诸如长达或超过100天，而某些水凝胶在较短的时间里释放蛋白质。当封装的多肽在体内保持长时间后，它们可能因暴露于37℃湿气而变性或聚集，导致生物学活性的丧失和免疫原性的可能改变。可以根据有关机制而设计稳定化的合理策略。例如，若发现聚集机制是通过硫醇-二硫化物交换形成分子间S-S键，则可以通过修饰巯基、由酸性溶液冻干、控制含湿量、使用适当添加剂、和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
下列非限制性实施例例示了本发明的某些方面。
实施例
实施例1：高唾液酸含量的产品的糖PEG化
通过将分子量10,000Da的PEG共价附着于唾液酸来制备聚乙二醇-CMP-唾液酸(PEG-CMPSA)。
用唾液酸酶处理唾液酸含量为87-99％的因子VIIa(例如如美国专利号5,272,066中所述)，并以PEG-CMPSA作为供体分子用唾液酸转移酶再次唾液酸化(例如如美国专利号6,399,336中所述)。在PEG化反应达到最大掺入后，向反应混合液中加入CMPSA以对任何暴露的末端半乳糖进行加帽。
通过SDS-PAGE、CE-PAGE、等电聚焦凝胶、和CE-IEF来分析PEG化唾液酸的掺入。
掺入了94-100％的唾液酸；平均掺入了1-4个PEG基团。
实施例2：具有中等唾液酸含量的产品的糖PEG化
通过将分子量为10,000Da的PEG共价附着于唾液酸来制备聚乙二醇-CMP-唾液酸(PEG-CMPSA)。
以PEG-CMPSA作为供体分子用唾液酸转移酶处理唾液酸含量为87-93％的因子VIIa(例如如美国专利号6,399,336中所述)。在PEG化反应达到最大掺入后，向反应混合液中加入CMPSA以对任何暴露的末端半乳糖进行加帽。
通过SDS-PAGE、CE-PAGE、等电聚焦凝胶、和CE-IEF来分析PEG化唾液酸的掺入。
掺入了87-100％的唾液酸；平均掺入了0.1-0.5个PEG基团。
实施例3
将PEG化的胞苷5′-单磷酸-唾液酸衍生物(CMP-SA-PEG)：N-乙酰-O2-甲基-9-氨基-9-脱氧-神经氨酸甲酯(10mg，0.031mmol，依照Isecke，R.、Brossmer，R.，Tetrahedron，1994，50(25)，7445-7460制备)溶于水(2ml)，并加入mPEG-SBA(170mg，0.03mmol，5kDa，Shearwater 2M450H01)。于室温搅动混合液直至反应完成(依照TLC)。通过冻干法来除去溶剂，并将残渣再次溶于甲醇与0.1M NaOH溶液的1∶1混合液(5ml)中。将混合液于室温搅动1小时，然后于4℃通过Dowex50W-X8(H+)树脂柱，并冻干。然后将残渣再次溶于水(5ml)，加入Dowex50W-X8(H+)树脂，并搅动混合液直至反应完成(TLC)。
如下所述，大体依照E.S.Simon、M.D.Bednarski、和G.M.Whitesides，J.Am.Chem.Soc.，1998，110，7159-7163制备通式1的唾液酸衍生物的胞苷5′-单磷酸类似物：将胞苷5′-单磷酸神经氨酸合成酶溶于9-PEG化的N-乙酰-9-氨基-9-脱氧-神经氨酸(如上所述制备)溶液，并加到CTP溶液中。将混合液调至pH8.5，并加入MgCl2·6H2O。于室温搅动反应液，并通过蠕动泵加入1N NaOH以维持pH接近8.5。当小样的1H-NMR显示反应完成后，通过标准离子交换层析分离产物。
实施例4
将FVIIa(1mg)溶于1ml 0.1M醋酸钠pH5.5，并用10mM高碘酸钠将它的多糖于室温氧化30分钟达到一定水平。然后将溶液在100mM醋酸钠pH 5.5中透析。透析后，将PEG-C(O)-NHNH2(通过mPEG-SBA(2mg，5kDa，Shearwater 2M450H01)的肼解来制备)与经过氧化的FVIIa混合，并一边温和摇动一边让其于室温反应过夜。将由此得到的FVIIa-PEG缀合物溶液在100mM Tris-HCl缓冲液pH7.5中透析(截留值为10kDa的透析膜)，并保存于4℃。
药理学方法
下列测定法可用于测定因子VII和因子VII相关多肽的生物学活性、半衰期、和生物利用度。
测定法1：体外水解测定法
下面的方法可用于测定因子VIIa的生物活性。该测定法在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，丹麦)中进行。向因子VIIa(终浓度100nM，溶于含有0.1M NaCl、5mM CaCl2、和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM HepespH7.4)中加入呈色底物D-Ile-Pro-Arg-对硝基苯胺(终浓度1mM，S-2288，Chromogenix，瑞典)。在SpectraMaxTM340读板仪(MolecularDevices，美国)中连续测量405nm的吸光率。将保温20分钟期间形成的吸光率减去不合酶的空白孔的吸光率，由此计算待测因子VIIa与参考因子VIIa的活性之间的比率。
测定法2：体外蛋白水解测定法
下面的方法可用于测定因子VIIa的生物活性。该测定法在微量滴定板(MaxiSorp，Nunc，丹麦)中进行。将因子VIIa(10nM)和因子X(0.8μM)(溶于100μl含有0.1M NaCl、5mM CaCl2、和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes pH7.4)保温15分钟。然后加入50μl含有0.1M NaCl、20mM EDTA、和1mg/ml牛血清清蛋白的50mM Hepes pH7.4终止对因子X的切割。加入呈色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对硝基苯胺(终浓度0.5mM，S-2765，Chromogenix，瑞典)，测量所生成的因子Xa的数量。在SpectraMaxTM 340读板仪(Molecular Devices，美国)中连续测量405nm的吸光率。将10分钟期间形成的吸光率减去不含FVIIa的空白孔的吸光率，由此计算待测因子VIIa与参考因子VIIa的活性之间的比率。
测定法3：功能性体内半衰期的测量
可以以文献中描述的许多方法来进行体内生物学半衰期的测量。用于测量rFVIIa及其变体的体内半衰期的测定法的范例描述于FDA参考号96-0597中。简而言之，测量在施用缀合物、多肽、或组合物之前和施用后24小时期间采集的血浆中的FVIIa凝结活性。测量稳定状态时分布的表观体积中值，并测定清除中值。
测定法4：因子VII多肽的生物利用度
例如，可以如下所述在狗模型中测量生物利用度：在分成四组的12只比格狗中进行四腿交叉研究的实验。所有动物接受剂量大约90μg/kg的待测制剂A和参考制剂B(溶于含有2.92mg/ml NaCl、1.47mg/mlCaCl2·2H2O、30mg/ml甘露醇、和聚山梨酸酯80的甘氨酰甘氨酸缓冲液pH5.5中)。初次施用后10、30、和60分钟、2、3、4、6、和8小时采集血样。由样品获得血浆，并通过ELISA对因子VII定量。
每种样品的生物利用度表述成因子VII的血浆浓度曲线下的剂量调整面积(AUC/剂量)。相对生物利用度表述成待测制剂与参考制剂的平均AUC/剂量之间的比率乘以100，并计算相对生物利用度的90％置信度。
野生型人因子VII的氨基酸序列：
Ala-Asn-Ala-Phe-Leu-GLA-GLA-Leu-Arg-Pro-Gly-Ser-Leu-GLA-Arg-GLA-Cys-Lys-
                 5                   10                  15
GLA-GLA-Gln-Cys-Ser-Phe-GLA-GLA-Ala-Arg-GLA-Ile-Phe-Lys-Asp-Ala-GLA-Arg-
     20                  25                  30                  35
Thr-Lys-Leu-Phe-Trp-Ile-Ser-Tyr-Ser-Asp-Gly-Asp-Gln-Cys-Ala-Ser-Ser-Pro-
             40                  45                  50
Cys-Gln-Asn-Gly-Gly-Ser-Cys-Lys-Aap-Gln-Leu-Gln-Ser-Tyr-Ile-Cys-Phe-Cys-
 55                  60                  65                  70
Leu-Pro-Ala-Phe-Glu-Gly-Arg-Asn-Cys-Glu-Thr-His-Lys-Asp-Asp-Gln-Leu-Ile-
         75                  80                  85                  90
Cys-Val-Asn-Glu-Asn-Gly-Gly-Cys-Glu-Gln-Tyr-Cys-Ser-Asp-His-Thr-Gly-Thr-
                 95                 100                 105
Lys-Arg-Ser-Cys-Arg-Cys-His-Glu-Gly-Tyr-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Gly-Val-Ser-
    110                 115                 120                 125
Cys-Thr-Pro-Thr-Val-Glu-Tyr-Pro-Cys-Gly-Lys-Ile-Pro-Ile-Leu-Glu-Lys-Arg-
            130                 135                 140
Asn-Ala-Ser-Lys-Pro-Gln-Gly-Arg-Ile-Val-Gly-Gly-Lys-Val-Cys-Pro-Lys-Gly-
145                 150                 155                 160
Glu-Cys-Pro-Trp-Gln-Val-Leu-Leu-Leu-Val-Asn-Gly-Ala-Gln-Leu-Cys-Gly-Gly-
        165                 170                 175                 180
Thr-Leu-Ile-Asn-Thr-Ile-Trp-Val-Val-Ser-Ala-Ala-His-Cys-Phe-Asp-Lys-Ile-
                185                 190                 195
Lys-Asn-Trp-Arg-Asn-Leu-Ile-Ala-Val-Leu-Gly-Glu-His-Asp-Leu-Ser-Glu-His-
    200                 205                 210                 215
Asp-Gly-Asp-Glu-Gln-Ser-Arg-Arg-Val-Ala-Gln-Val-Ile-Ile-Pro-Ser-Thr-Tyr-
            220                 225                 230
Val-Pro-Gly-Thr-Thr-Asn-His-Asp-Ile-Ala-Leu-Leu-Arg-Leu-His-Gln-Pro-Val-
235                 240                     245             250
Val-Leu-Thr-Asp-His-Val-Val-Pro-Leu-Cys-Leu-Pro-Glu-Arg-Thr-Phe-Ser-Glu-
        255                 260                 265                 270
Arg-Thr-Leu-Ala-Phe-Val-Arg-Phe-Ser-Leu-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-Leu-Leu-
                275                 280                 285
Asp-Arg-Gly-Ala-Thr-Ala-Leu-Glu-Leu-Met-Val-Leu-Asn-Val-Pro-Arg-Leu-Met-
    290                 295                 300                 305 306
Thr-Gln-Asp-Cys-Leu-Gln-Gln-Ser-Arg-Lys-Val-Gly-Asp-Ser-Pro-Asn-Ile-Thr-
            310                 315                 320
Glu-Tyr-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Ser-Asp-Gly-Ser-Lys-Asp-Ser-Cys-Lys-Gly-
325                 330                 335                 340
Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-His-Ala-Thr-His-Tyr-Arg-Gly-Thr-Trp-Tyr-Leu-Thr-Gly-
        345                 350                 355                 360
Ile-Val-Ser-Trp-Gly-Gln-Gly-Cys-Ala-Thr-Val-Gly-His-Phe-Gly-Val-Tyr-Thr-
                365                 370                 375
Arg-Val-Ser-Gln-Tyr-Ile-Glu-Trp-Leu-Gln-Lys-Leu-Met-Arg-Ser-Glu-Pro-Arg-
    380                 385                 390                 395
Pro-Gly-Val-Leu-Leu-Arg-Ala-Pro-Phe-Pro
            400                 405 406

Claims (33)

1.包含多种因子VII多肽或因子VII相关多肽的制剂，其中所述多肽包含天冬酰胺连接的和/或丝氨酸连接的寡糖链，而且其中至少一个寡糖基团共价附着了分子量为300-100,000Da的至少一个聚合基团。
2.依照权利要求1的制剂，其中聚合基团附着于唾液酸模块上。
3.依照权利要求1或2的制剂，其中大约94-100％的寡糖链包含至少一个唾液酸模块。
4.依照权利要求3的制剂，其中大约94-100％的寡糖链包含至少一个唾液酸模块，而且其中少于大约25％的寡糖链包含至少一个未加帽的触角。
5.依照权利要求4的制剂，其中少于大约10％的寡糖链包含至少一个未加帽的触角。
6.依照权利要求5的制剂，其中少于大约5％的寡糖链包含至少一个未加帽的触角。
7.依照权利要求4-6任一项的制剂，其中大约96-100％的寡糖链包含至少一个唾液酸模块。
8.依照权利要求7的制剂，其中大约98-100％的寡糖链包含至少一个唾液酸模块。
9.依照权利要求1的制剂，其中天冬酰胺连接的寡糖链位于与野生型人FVIIa(图1)中氨基酸残基Asn-145和Asn-322对应的位置处。
10.依照权利要求1的制剂，其中丝氨酸连接的寡糖链位于与野生型人FVIIa(图1)中氨基酸残基Ser-52和Ser-60对应的位置处。
11.依照权利要求1的制剂，其中所述聚合物选自下组：聚环氧烷，包括聚亚烷基二醇、分支PEG、聚乙烯醇、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯-共-马来酸酐、聚苯乙烯-共-马来酸酐和葡聚糖、聚氨基甲酸酯、聚酯、和聚酰胺。
12.依照权利要求11的制剂，其中聚合物是聚乙二醇。
13.依照权利要求12的制剂，其中聚乙二醇是分子量大约500-20,000Da的PEG。
14.依照权利要求1的制剂，其中多肽具有野生型人因子VII的氨基酸序列(图1)。
15.依照权利要求1的制剂，其中多肽是由血浆衍生的人因子VIIa。
16.依照权利要求1的制剂，其中因子VII多肽选自下组：S52A-因子VII、S60A-因子VII、在第290位与第291位残基之间受到蛋白水解切割的因子VII、在第315位与第316位残基之间受到蛋白水解切割的因子VII、已发生氧化的因子VII、L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、S336G-FVII、第290位和/第291位的氨基酸残基已被取代的因子VII序列变体、以及第315位和/或第316位的氨基酸残基已被取代的因子VII序列变体。
17.依照权利要求1的制剂，其中因子VII多肽选自：
L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，S314E/V158D-FVII，S314E/E296V-FVII，S314E/M298Q-FVII，S314E/V158T-FVII，K316H/L305V-FVII，K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII，K316H/E296V-FVII，K316H/M298Q-FVII，K316H/V158T-FVII，K316Q/L305V-FVII，K316Q/K337A-FVII，K316Q/V158D-FVII，K316Q/E296V-FVII，K316Q/M298Q-FVII，K316Q/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/K337A/E296V-FVII，S314E/L305V/K337A/V158D-FVII，S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII，S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V-FVII，S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D-FVII，K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII，K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V//158T/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/K337A-FVII，F374Y/V158D-FVII，F374Y/E296V-FVII，F374Y/M298Q-FVII，F374Y/V158T-FVII，F374Y/S314E-FVII，F374Y/L305V-FVII，F374Y/L305V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D-FVII，F374Y/L305V/E296V-FVII，F374Y/L305V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T-FVII，F374Y/L305V/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E-FVII，F374Y/K337A/V158T-FVII，F374Y/K337A/M298Q-FVII，F374Y/K337A/E296V-FVII，F374Y/K337A/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q-FVII，F374Y/V158D/E296V-FVII，    F374Y/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q-FVII，F374Y/V158T/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E-FVII，F374Y/S314E/M298Q-FVII，F374Y/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII，F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII，F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A -FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/V158T/E296V//M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-Factor VII，S60A-Factor VII；andP11Q/K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII
K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；由233Thr至240Asn的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII、由304Arg至329Cys的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII、以及由153Ile至223Arg的氨基酸序列中具有取代、添加、或缺失的FVII。
18.依照权利要求1的制剂，其中因子VII相关多肽选自下组：R152E-FVII、S344A-FVII、FFR-FVII、和缺乏Gla结构域的FVIIa。
19.依照权利要求1的制剂，其中在本说明书所述凝结测定法、蛋白水解测定法、或TF结合测定法中的一种或多种方法中进行测试时，因子VII相关多肽展示的比活是在相同细胞类型中生成的野生型因子VIIa的比活的至少大约25％。
20.依照权利要求1的制剂，其中在本说明书所述凝结测定法、蛋白水解测定法、或TF结合测定法中的一种或多种方法中进行测试时，因子VII相关多肽展示的比活是在相同细胞类型中生成的野生型因子VIIa的比活的大约25％以下。
21.依照权利要求1的制剂，其中所述制剂展示的生物利用度是参考制剂的生物利用度的至少大约110％。
22.依照权利要求1的制剂，其中所述制剂展示的血清半衰期是参考制剂的半衰期的至少大约125％。
23.依照权利要求11的制剂，其中所述聚合物选自聚亚烷基二醇(PAG)和羧甲基葡聚糖
24.依照权利要求23的制剂，其中所述聚合物选自聚乙二醇和聚丙二醇。
25.用于制备权利要求1-24的制剂的方法，所述方法包括在至少一个聚合物分子共价附着于所述多肽中至少一个寡糖链上的条件下使该多肽接触所述聚合物分子。
26.包含权利要求1-24任一项中定义的制剂和制药学可接受载体或佐剂的药物组合物。
27.权利要求1-24任一项中定义的包含因子VII多肽或因子VII相关多肽的制剂用于制备治疗因子VII反应性综合症的药物的用途。
28.权利要求27中定义的用途，其中所述综合症选自：血友病A、血友病B、因子XI缺陷、因子VII缺陷、血小板减少、von Willebrand氏病、凝血因子抑制剂的存在、手术、创伤、和抗凝剂疗法，包括稀释性凝血病、颅间出血、干细胞移植、上胃肠道出血、和肝病。
29.权利要求1-24任一项中定义的包含因子VII多肽或因子VII相关多肽的制剂用于制备预防有害出血的药物的用途。
30.权利要求1-24任一项中定义的包含因子VII多肽或因子VII相关多肽的制剂用于制备预防有害凝血的药物的用途。
31.权利要求30中定义的用途，其中有害凝血与选自下组的状况有关：血管成形术、深静脉血栓形成、肺栓塞、中风、弥漫性血管内凝血、与革兰氏阴性内毒素血症有关的肺和肾中的纤维蛋白沉积、以及心肌梗塞。
32.权利要求1-24任一项中定义的包含因子VII多肽或因子VII相关多肽的制剂用于制备防止由组织因子介导的反应的药物的用途。
33.权利要求32中定义的用途，其中由组织因子介导的反应与选自下组的状况有关：全身性炎性应答综合症、急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合症、多发性器官衰竭、溶血性尿毒症综合症、和血栓性血小板减少性紫癫。
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