CN114728044A - 用于皮下施用和按需求治疗的经修饰的因子vii多肽 - Google Patents

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Abstract

本文提供经修饰的FVII多肽和经修饰的FVIIa多肽，以及用经修饰的因子VIIa多肽治疗急性和间歇性出血的方法。为实现治疗和用途，在一些实施例中，所述经修饰的多肽皮下施用以提供按需求治疗。在一些实施例中，所述按需求治疗是在二十四小时时段内以多次给药方案提供。皮下施用本发明经修饰的多肽呈现出增加的凝血活性、效能、生物可用性和延长的持续时间。

Description

用于皮下施用和按需求治疗的经修饰的因子VII多肽
相关申请的交叉参考
本申请要求于2020年4月15日申请的美国临时专利申请第63/010,656号和于2020年2月4日申请的美国临时专利申请第62/970,152号、于2019年8月15日申请的美国临时专利申请第62/887,599号、于2020年8月15日申请的美国非临时专利申请第16/994,573号和2020年8月15日申请的国际申请第PCT/US2020/046577号的优先权，其中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
序列表的参考
在此提交序列表的电子版，其内容以全文引用的方式并入。在2020年8月14日创建电子档案，大小为1.23兆字节，且标题为CTBI_003_03TW_SeqList_ST25.txt。
背景技术
凝血级联路径为蛋白水解路径，其中各酶以酶原形式或非活性形式存在于血浆中。调节酶原的裂解以自前体分子释放活性形式。路径充当一系列控制活化过程的正反馈回路和负反馈回路，其中最终目标为产生凝血酶，其可随后将可溶性血纤维蛋白原转化成纤维蛋白以形成凝块。一般来说，凝血路径中的这些因素通过凝血的内源、外源或普通路径中的一个或多个参与凝血(参见图1)。
因子VII(FVII)为维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶糖蛋白，其在动物中合成，包括哺乳动物，在肝脏中呈单链酶原形式且分泌至血流中。FVII是负责引发蛋白水解事件的级联从而引起凝血酶产生和纤维蛋白沉积的凝血蛋白酶。血液中的绝大部分FVII呈未活化单链酶原形式，但少量以双链活化形式存在，在本文中称为“FVIIa”或“FVIIa多肽”。因此，“活化因子VII”或“FVIIa”是指FVII多肽的任何活化双链形式，且“未活化FVII”或“FVII”一般是指因子VII多肽的未活化单链酶原形式。FVII的活化发生在Arg152-Ile153键的蛋白水解分裂(相对于成熟人类FVII多肽的位置)时，产生一种双链多肽，其含有通过二硫桥键连接的152个氨基酸的轻链(大致20kDa)和254个氨基酸的重链(大致30kDa)。然而，FVII自其酶原形式裂解成FVIIa不足以实现完全活性。FVIIa需要与组织因子(TF)复合以实现完全活性。另外，尽管双链形式通常由蛋白水解裂解产生，但其也可以用合成方式产生。因此，活化因子VII包括具有低凝血活性的酶原类双链形式、完全活化形式(在结合至组织因子时出现的约1000倍活性)和以完全活化双链形式存在或经构形变化为完全活化形式的突变形式。
在血友病患者中，出血为主要临床表达，且可自发地、与创伤相关或在手术程序期间和之后出现。举例来说，当与无血友病的受试者相比时，患有血友病的受试者通常出血时间较长或与损伤程度不成比例。患有A型血友病(HA)或B型血友病(HB)的患者的特征在于HA中的凝血因子VIII(FVIII)或HB中的因子IX(FIX)的不足。这些患者通常最初通过因子替代疗法治疗。然而，一些患有HA或HB的患者可产生中和抗体，在本文中也称为“抑制剂”，其回应于因子替代疗法针对野生型FVIII或FIX，使得替代疗法变得无效。
FVII在凝块形成中的作用已在FVII作为临床抗凝血剂和止血疗法的目标方面受到显著关注。患有血友病和其他出血病症，包括具有或不具有抑制剂的A型血友病或B型血友病的患者缺乏快速且容易用于治疗急性出血的治疗选择。本文提供使用因子VII多肽的方法和组合物来解决这一需求。
发明内容
本文提供用于按需求施用经修饰的FVIIa多肽的方法，用以治疗患有出血病症，包括A型血友病、B型血友病、具有抑制剂的A型血友病或B型血友病、C型血友病、FVII缺陷、后天性血友病、格兰茨曼氏血小板无力症(Glanzmann thrombasthenia)的受试者的出血、用抗凝血剂治疗的受试者的出血和其他这类受试者。受试者出血还包括由创伤(例如损伤)引起的出血，和间歇性出血(例如由手术和/或月经)，以及其他出血(例如由患有血友病和其他凝血障碍的受试者经历的关节出血)。
在一些实施例中，经修饰的FVII和FVIIa多肽在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的多肽中或在多肽的对应残基中包括至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换，且位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换，且任选的进一步包括在对应于FVII多肽位置128的位置处和对应于FVII多肽位置129的位置处具有修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换；且位置129处的修饰为Ala(A)。提供这些经修饰的多肽用于按需求治疗以通过皮下施用来预防或治疗出血事件。与未经修饰的FVII相比，这些经修饰的多肽呈现增加的凝血活性。还提供使用这类经修饰的多肽皮下施用进行的治疗方法和给药范例。值得注意的是，出人意料并且意外地，与未经修饰的FVII相比，在低于预期的剂量下皮下施用经修饰的活化多肽呈现增加的效能、凝血活性以及延长的持续时间和延时的暴露。在一些例示性实施例中，这类经修饰的活化多肽包括包含SEQ ID NO:280或SEQ ID NO:138中所阐述的氨基酸序列的多肽。
因此，在一个方面中，本文提供治疗受试者的出血事件的方法，其包含向受试者皮下施用一定剂量的经修饰的因子VIIa，经修饰的因子VIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；皮下施用经修饰的FVIIa具有增加的活性或效能；且在出血事件之前和/或之后约5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa，从而减少或停止出血量或矫治或治愈出血的病因。在另一方面中，本文提供向经历出血的受试者或向可能经历出血的受试者提供按需求治疗的方法，其包含向受试者施用一定皮下剂量的经修饰的FVIIa，经修饰的FVIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；并且所述剂量为每公斤受试者体重约10至约120μg。
在一些实施例中，经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置128的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换。在一些实施例中，经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置129的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中位置129处的修饰为Ala(A)。
在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之后约5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之前约5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用。在一些实施例中，每3-7、2-5、4-6或4-12小时皮下施用重复皮下剂量的经修饰的FVIIa直至出血停止、病因得到矫治、或任何伤口经治愈或持续1至2、3、4或5天。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时施用。在一些实施例中，出血为间歇性或可由受试者预测的；且在出血开始之前，用一定皮下剂量的经修饰的FVIIa治疗受试者。在一些实施例中，出血事件由创伤或损伤引起；且在出血事件之后15分钟、1、2、3或4小时，用一定皮下剂量的经修饰的FVIIa治疗受试者。在一些实施例中，受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；在手术之前5、4、3、2、1小时或更短时间皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa；在手术期间用FVIIa经静脉内治疗受试者；且在手术之后至少一次皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa直至不存在出血和/或出血风险，或直至受试者经治愈或病因得到矫治。在一些实施例中，受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；在手术之前至少4小时、或3小时、或2小时、或1小时向受试者施用一定剂量的经修饰的FVIIa；在手术之后2至3小时皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa；在另外2至3小时之后任选的再次施用经修饰的FVIIa；且其后一天一次或两次施用经修饰的FVIIa直至受试者经治愈或出血的病因得到矫治。在一些实施例中，受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；和在手术之后每4至6小时皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa直至出血停止或受试者经治愈或出血的病因得到矫治。
在一些实施例中，出血是由于手术或创伤引起。在一些实施例中，出血是创伤或损伤的结果。在一些实施例中，出血表现为急性关节血肿、单一关节血肿、慢性嗜血性关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠出血、气道出血、口腔出血、自发性出血、关节出血、脑出血或突破性出血。在一些实施例中，出血是由于拔牙或牙龈出血。在一些实施例中，出血为急性的且由创伤或手术引起，或间歇性出血为月经出血或关节出血或目标关节出血或经治愈或矫治的手术伤口。
在一些实施例中，出血为手术出血。在一些实施例中，出血为手术出血；且手术为关节手术、肢体手术、心脏手术、血管成形术、上呼吸道手术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、关节置换术、血管手术、牙科手术或器官移植手术。在一些实施例中，手术为选自骨髓、心脏、肺、胰脏和肝脏移植的移植手术。在一些实施例中，手术为髋关节或膝关节置换术或关节固定术。
在一些实施例中，施用为每2-4小时或3-6小时或4-6小时。在一些实施例中，施用经修饰的FVIIa多次，直至出血停止或任何伤口经治愈或出血得到矫治。
在一些实施例中，出血为间歇性或可预测的；且受试者在出血之前经预治疗。在一些实施例中，其中在出血之前约4小时或更短时间实现预治疗。在一些实施例中，在出血之前约3小时或更短时间，或2小时或更短时间，或1小时或更短时间实现预治疗。在一些实施例中，在出血之前至少15分钟实现预治疗。
在一些实施例中，一次或多次剂量的经修饰的FVIIa在出血之前皮下施用。在一些实施例中，一次或多次剂量的经修饰的FVIIa在出血开始之后皮下施用。在一些实施例中，在出血开始1分钟至2小时内施用一定剂量的经修饰的FVIIa。在一些实施例中，皮下施用经修饰的FVIIa多次，直至出血停止或伤口愈合或出血得到矫治。
在一些实施例中，以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次剂量为约10μg/kg至30μg/kg、10μg/kg至60μg/kg、10μg/kg至90μg/kg、10μg/kg至120μg/kg、30μg/kg至60μg/kg、30μg/kg至90μg/kg、30μg/kg至120μg/kg、10μg/kg至500μg/kg、或15μg/kg至400μg/kg、或15μg/kg至350μg/kg、或20μg/kg至400μg/kg、或20μg/kg至350μg/kg、或30μg/kg至350μg/kg、或25μg/kg至350μg/kg。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的单次剂量为每剂量约10μg/kg至500μg/kg、或15μg/kg至400μg/kg、或15μg/kg至350μg/kg、或20μg/kg至400μg/kg、或20mg/kg至350μg/kg、或30μg/kg至350μg/kg、或25μg/kg至350μg/kg。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量的体积为10mL或更小或5mL或更小。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量的体积为1mL至2mL、或1.25mL至1.5mL、或1mL至10mL。
在一些实施例中，本文所提供的方法进一步包含施用额外凝血剂治疗或因子。在一些实施例中，所述治疗包含施用抗体艾美赛珠单抗(emicizumab)-kxwh和/或因子VIII抑制剂旁路活性产品。在一些实施例中，其中额外凝血因子选自以下中的一个或多个：血浆纯化或重组凝血因子、促凝血剂(例如维生素K、维生素K衍生物和蛋白C抑制剂)、血浆、血小板、红血球和皮质类固醇。在一些实施例中，本文所提供的方法进一步包含施用抗组织因子路径抑制剂(TFPI)抗体。在一些实施例中，抗TFPI抗体为康次珠单抗(concizumab)。在一些实施例中，本文所提供的方法进一步包含施用靶向抗凝血酶(AT)的RNA干扰(RNAi)治疗剂。在一些实施例中，靶向AT的RNAi治疗剂为菲图司兰(fitusiran)。
在一些实施例中，以本文所提供的方法治疗的受试者患有选自以下的疾病或病状：凝血障碍、血液病症、出血性异常、血友病和其他出血病症。在一些实施例中，所述受试者患有A型血友病、B型血友病、具有抑制剂的A型血友病、具有抑制剂的B型血友病、因子VII缺陷、格兰茨曼氏血小板无力症、后天性血友病或采取抗凝血剂疗法。在一些实施例中，受试者患有血友病；且血友病选自以下之中：A型血友病、B型血友病和C型血友病、具有抑制剂的A型血友病和具有抑制剂的B型血友病。在一些实施例中，血友病为先天性的。在一些实施例中，血友病为后天性的。在一些实施例中，受试者具有针对因子VIII或因子IX的自体抗体。在一些实施例中，以本文所提供的方法治疗的受试者患有血友病，且以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约60至约120μg/kg。在一些实施例中，以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约60μg/kg。在一些实施例中，以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约120μg/kg。在一些实施例中，受试者患有因子VII缺陷。在一些实施例中，以所治疗受试者的重量计，受试者患有因子VII缺陷且经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约10至约20μg/kg。
在一些实施例中，受试者已接受口服抗凝血剂疗法。在一些实施例中，口服抗凝血剂疗法包含以下中的一个或多个：肝素、达比加群、利伐沙班、阿派沙班、贝米肝素、那屈肝素、瑞肝素、依诺肝素、帕肝素、舍托肝素、达肝素和亭扎肝素。
在一些实施例中，经修饰的FVIIa的效能大于SEQ ID NO:3的FVIIa。在一些实施例中，在组织因子存在下，经修饰的FVIIa具有增加的凝血活性。在一些实施例中，经修饰的FVIIa在组织因子依赖性分析中具有大于100％、150％、200％或250％或大于在相同分析中未经修饰的FVIIa(SEQ ID NO:3)的kcat/km。在一些实施例中，经修饰的FVIIa具有凝血活性，其为相同分析中SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa活性的至少1.5倍。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的效能为SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa的至少3倍、或4倍、或5倍。在一些实施例中，如通过活化部分凝血活酶时间(aPTT)和/或血栓弹力图(TEG)或任何评定凝血酶产生的分析所评定，FVIIa具有增加的效能。在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽的凝血活性为SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa多肽的凝血活性的至少110％、150％、200％、250％、300％、400％、500％或更多。在一些实施例中，与未经修饰的FVIIa相比，经修饰的FVIIa具有增加的血清半衰期或增加的末端消除半衰期。在一些实施例中，与具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列的未经修饰的FVIIa相比，经修饰的FVIIa具有较大凝血活性或效能。在一些实施例中，当呈活化形式时，经修饰的FVIIa多肽呈现促凝血活性。在一些实施例中，促凝血活性大于具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列的FVIIa多肽的促凝血活性。
在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽为由SEQ ID NO:280的氨基酸序列组成的双链活化因子VII(FVIIa)多肽，其在位置152处的精氨酸与位置153处的异亮氨酸之间裂解。在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽为由SEQ ID NO:138的氨基酸序列组成的双链活化因子VII(FVIIa)多肽，其在位置152处的精氨酸与位置153处的异亮氨酸之间裂解。在一些实施例中，第一链和第二链通过至少一个二硫桥键连接。在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽与SEQ ID NO:280具有至少90％氨基酸序列一致性，其中对应于SEQ ID NO:280的位置128、129、286和298的氨基酸是不变的。在一些实施例中，双链多肽的第一链和第二链分别由SEQ ID NO:280的氨基酸1-152和153-406组成。
在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽包含一种或多种氨基酸修饰，所述一种或多种氨基酸修饰增加对抗凝血酶III的抗性，增加与磷脂的结合和/或对其的亲和力，增加对于组织因子的亲和力，增加内在活性，增加TF依赖性活性，增加凝血活性，改变多肽的构形以改变酶原性，通过使高度活性FVIIa构形与较低活性FVIIa构形之间的平衡偏移以有利于高度活性构形来增加催化或凝血活性，增加对蛋白酶的抗性，降低糖基化，增加糖基化，降低免疫原性，增加稳定性和/或促进化学基团键联。在一些实施例中，未经修饰的FVIIa多肽的一级序列由SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列组成。在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽经转译后修饰。在一些实施例中，转译后修饰包含糖基化。在一些实施例中，转译后修饰为O-连接的糖基化。在一些实施例中，转译后修饰为N连接的糖基化。在一些实施例中，转译后修饰为谷氨酸羧化成γ-羧基谷氨酸。在一些实施例中，转译后修饰为天冬氨酸羟基化成β-羟基天冬氨酸。在一些实施例中，FVIIa多肽的修饰为氨基酸置换、插入、缺失或其组合。
在一些实施例中，与静脉内施用经修饰的FVIIa相比，皮下施用经修饰的FVIIa具有增加的末端消除半衰期。
在一些实施例中，在多次给药方案中施用一定剂量的经修饰的FVIIa。在一些实施例中，多次给药方案包含在约24小时内至少两次或至少三次剂量。在一些实施例中，多次给药方案的至少一次剂量包含每公斤受试者体重约30、约60、约90或约120μg。在一些实施例中，多次给药方案的各剂量为相同的。在一些实施例中，多次给药方案的各剂量相隔约2至约6小时持续预定时段进行。在一些实施例中，所述预定时段为约24小时。在一些实施例中，多次给药方案包含约24小时内的最大3次给药。在一些实施例中，以所治疗受试者的重量计，多次给药方案的各剂量为60μg/kg。在一些实施例中，多次给药方案以递增给药方案形式施用。在一些实施例中，至少一次剂量的经修饰的FVIIa在皮下施用之前静脉内施用。在一些实施例中，任何单次剂量的经修饰的FVIIa在受试者的两个不同解剖部位处以分开剂量形式施用。在一些实施例中，任何单次剂量的经修饰的FVIIa在受试者的单个解剖部位处以分次剂量形式施用。在一些实施例中，任何单次剂量的经修饰的FVIIa的量为约2至约6mg。在一些实施例中，受试者为成人、青少年、儿童或婴儿。
在一些实施例中，经修饰的FVIIa以单一疗法形式施用。
在一些实施例中，皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于静脉内施用经修饰的FVIIa多肽。在一些实施例中，皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于静脉内施用未经修饰的FVIIa多肽。在一些实施例中，皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于皮下施用未经修饰的FVIIa多肽。在一些实施例中，活性或效能为经修饰的FVIIa的生物可用性和/或药物动力学概况。
在另一方面中，提供用于单次剂量皮下施用的医药组合物，其包含在医药学上可接受的载体中的单次治疗有效剂量的经修饰的FVIIa，用于皮下施用以用于按需求治疗出血；其中经修饰的FVIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；且经修饰的FVIIa具有增加的活性或效能。
在另一方面中，本文提供通过编码核酸分子的表达施用经修饰的FVII多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包括施用重组载体。在另一方面中，本文提供经修饰的FVII多肽，其用于使用非病毒载体的离体基因表达疗法中。在一些实施例中，细胞经工程改造以表达经修饰的FVII多肽，例如通过将编码经修饰的FVII多肽的核酸整合至基因体部位中，使在基因体部位中以可操作方式连接至调节序列或如此以使得其经置放而以可操作方式连接至调节序列。在一些实施例中，这类细胞随后局部或全身性地向受试者(例如需要治疗的患者)施用。
附图说明
图1描绘凝血级联。所述图展示用于独立产生FXa的凝血的内源路径和外源路径以及所述路径至普通路径的汇聚以产生凝血酶和纤维蛋白以便形成凝块。
图2描绘基于细胞的凝血模型(参见例如Hoffman等人(2001)Thromb Haemost85:958-965)。所述图描绘分成三个阶段(开始、扩增和传播)的凝血事件。
图3描绘FVIIa可引发凝血酶形成的机制。所述图说明FVIIa介导的凝血酶生成的TF依赖性路径与TF非依赖性路径两者。
图4A为说明在A型血友病小鼠损伤之前，用皮下(SQ)给药本公开经修饰的FVIIa进行的例示性急性损伤模型研究设计的图式。
图4B为说明在A型血友病小鼠损伤之后，用皮下给药本公开经修饰的FVIIa进行的例示性急性损伤模型研究设计的图式。
图5为描绘在损伤之前15分钟使用皮下施用经修饰的FVIIa的研究结果的图式。
图6为展示皮下施用经修饰的FVIIa的按需求作用的结果的图式。
图7为描绘在损伤之后一分钟皮下施用经修饰的FVIIa的剂量反应的图式。
图8描绘正常反应与未经治疗的A型血友病反应的例示性凝血酶产生曲线。
图9描绘当与
Figure BDA0003582772610000081
组合时T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa、
Figure BDA0003582772610000082
或
Figure BDA0003582772610000083
对峰值凝血酶产生的作用。
图10-12分别描绘在将多肽皮下注射至小鼠之后的两种经修饰的FVIIa多肽、T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa和Q286R/M298Q FVIIa以及野生型重组FVIIa(rFVIIa)的血浆浓度。这些图展示T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa比其他分子在体内停留时间更长。
图13描绘在静脉内推注注射T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽至小鼠后的血浆浓度。T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa分子的末端消除半衰期展示在静脉内注射之后比在皮下注射之后快。
图14描绘使用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的各种剂量组进行模拟模型化的结果，指示T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa显示正反器药物动力学，且所述模拟与使用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的临床结果一致。
图15A描绘使用三种不同皮下T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa治疗方案对70kg成人进行的临床试验模拟结果。这些结果指示60μg/kg的多次给药方案为治疗出血病症的一种选择。
图15B-15C分别描绘使用一次、两次或三次皮下剂量T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa进行临床试验群体药物动力学模拟的结果，以及给药方案和所得计算的概述的图式。
图16A-16B分别描绘大鼠展示典型自发性出血表达，并且图16A的大鼠在皮下施用第一次剂量的经修饰的FVIIa之后24小时。
图17A-17B为说明在患有血友病的人类中递增经修饰的FVIIa的皮下剂量的研究设计的两个例示性变化形式的图式。
图17C为描绘在患有血友病的人类中递增皮下剂量后观测到的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的平均药物动力学水平的图式。
图17D为描绘患有血友病的人类中的多次皮下给药研究的结果的图式。
图18A-18B分别描绘在向正常大鼠皮下施用单次剂量之后，在血浆中测量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa和Q286R/M298Q FVIIa多肽的算术和对数血浆浓度。
图19A-19E描绘对用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽治疗的五只血友病狗测量的血栓弹力图(TEG)曲线和血容比。
图20A-20E描绘对用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽进行皮下治疗之前和之后的血友病狗W03测量的TEG迹线。
图21A-21J描绘对用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽进行皮下治疗之前和之后的血友病狗R11测量的TEG迹线。
图21K-21M描绘对用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽进行静脉内治疗后的血友病狗R11测量的TEG迹线。
图22A-22T描绘对用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽进行皮下治疗之前和之后的血友病狗R04测量的TEG迹线。
图23A-23P描绘对用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽进行皮下治疗之前和之后的血友病狗W64测量的TEG迹线。
图24A-24F描绘对用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽进行皮下治疗之前和之后的血友病狗V30测量的TEG迹线。
图25A-25B分别描绘患有自发性出血的大鼠在开始和整体治疗结果时的出血严重程度评分，其中大鼠经皮下施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽或经媒剂处理。
图26描绘在T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽、Q286R/M298Q FVIIa与未经修饰的重组FVIIa多肽之间进行比较，比较各自静脉内和皮下施用时，估计平均半衰期和末端消除半衰期的药物动力学观测结果。
具体实施方式
本文提供变体FVII(未活化)和FVIIa多肽(活化)，在本文中也分别称为经修饰的FVII多肽和经修饰的FVIIa多肽。在活化后，出人意料地，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽在皮下施用时提供优势，使得所施用FVIIa的量降低，所述降低为维护血清中足够浓度的活性FVII以用于止血所需。这可能引起例如实现可比生物作用、较高舒适性和受试者接受度以及减弱二次作用所必需的较低剂量和/或给药频率。本文所提供的经修饰的FVIIa多肽在皮下施用时与静脉内施用时相比还出人意料地呈现增加的末端消除半衰期。
在本文进一步描述的例示性实施例中，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽在皮下施用时呈现改良的药物动力学特性。值得注意的是，出人意料且意外地，在低于本预期的剂量下皮下施用经修饰的FVIIa多肽呈现所期望的作用，包括但不限于增加的效能、凝血活性、生物可用性和延长的持续时间和延时的暴露。呈现改良的药物动力学特性(活化后)的本公开的例示性经修饰的多肽在具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中包含取代Q286R/M298Q或包含取代T128N/P129A/Q286R/M298Q；在一些实施例中，包含取代T128N/P129A/Q286R/M298Q的这一例示性经修饰的FVII或经修饰的FVIIa多肽可包含如SEQID NO:280中所阐述的氨基酸序列，且可以未活化形式或以活化形式提供。
提供本公开的经修饰的多肽以用于通过皮下施用按需求治疗出血事件。这些经修饰的FVIIa多肽在组织因子(TF)等存在和不存在下可呈现活化后增加的凝血活性、增加的效能、增加的生物可用性、增加的用于FX活化的催化活性。本文还提供使用这类经修饰的FVIIa多肽皮下施用的治疗方法和给药方案。
应注意，如本文所用，因子VII(FVII、F7；亦称为因子7、凝血因子VII、血清因子VII、血清凝血酶原转化加速剂、SPCA、前转化素和依他凝血素α(eptacog alpha))是指丝氨酸蛋白酶，其为凝血级联的一部分。FVII包括Gla域、两个EGF域(EGF-1和EGF-2)和丝氨酸蛋白酶域(或肽酶S1域)，其在丝氨酸蛋白酶的肽酶S1家族的所有成员，例如在胰凝乳蛋白酶情况下被高度保存。具有信号肽和原肽的例示性前体FVII的序列阐述在SEQ ID NO:1中。例示性成熟FVII多肽(人类成熟FVII)阐述在SEQ ID NO:3中。在自酶原类形式产生构形变化时发生的FVII的完全活化发生在与FVII的辅因子(组织因子(TF))结合时。另外，可将突变引入FVII中，使得在不存在组织因子的情况下引起构形变化。
如上文所论述，因子VII可以单链形式内源性存在，且活化FVIIa可以其双链形式存在，包括酶原类和完全活化的双链形式。提及FVII多肽和FVIIa多肽亦可包括呈单链或双链形式的前体多肽和成熟FVII多肽、具有抗凝血活性的其截短形式，且包括由剪接变体编码的对偶基因变体和物种变体，以及其他变体，包括与SEQ ID NO:1或其成熟形式SEQ IDNO:3中所阐述的前体多肽具有至少40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大序列一致性的多肽。
在例示性实施例中，包括经修饰的FVIIa多肽，例如SEQ ID NO:138和280和其变体的那些。还包括保留至少一种FVIIa活性，例如TF结合、因子X结合、磷脂结合和/或凝血活性的那些经修饰的多肽。通过保持活性，可改变活性，例如相比于野生型FVIIa降低或增加，只要保留的活性水平足以产生可检测效果即可。FVIIa多肽包括但不限于组织特异性同工型和其对偶基因变体、通过核酸转译制备的合成分子、通过化学合成(例如包括通过重组方法接合较短多肽的合成)产生的蛋白质、自人类和非人类组织分离的蛋白质和其细胞、嵌合FVII多肽和其经修饰形式。经修饰的FVIIa多肽还包括长度足够的FVII的片段或部分或包括适当区域以保留全长成熟多肽的至少一种活性(如果需要，活化时)。经修饰的FVIIa多肽还包括含有其他修饰，例如化学或转译后修饰的多肽和不含化学修饰或转译后修饰的多肽。这类修饰包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化(farnysylation)、羧化、羟基化、磷酸化和所属领域中已知的其他多肽修饰。
如本文所用，效能是指FVIIa在活体外、离体或活体内，例如在动物模型中或在人类中的活性。参见例如实例。举例来说，如例示的，当各自皮下施用时，在停止出血方面，约10μg SEQ ID NO:280的经修饰的FVIIa具有与约50μg未经修饰的FVIIa(SEQ ID NO:3或
Figure BDA0003582772610000121
FVIIa)相同的活体内活性。在例示性实施例中，经修饰的FVIIa的效能比未经修饰的FVIIa大约5倍。
应理解，经修饰的FVIIa多肽呈现或保留的活性可为任何活性，包括但不限于凝血或凝血活性、促凝血活性；蛋白水解或催化活性，例如实现因子X(FX)活化或因子IX(FIX)活化；抗原性(与多肽结合或与多肽竞争以结合至抗FVII抗体的能力)；结合组织因子、因子X或因子IX或结合活化血小板的能力；和/或结合至磷脂的能力。在一些情况下，与未经修饰的FVIIa多肽相比，经修饰的FVIIa多肽可具有增加的活性。在一些情况下，与未经修饰的FVIIa多肽相比，经修饰的FVIIa多肽可拥有降低的活性。经修饰的FVIIa多肽的活性可为未经修饰的多肽的任何水平的活性，其中两种多肽均呈相同形式，与不含有争议的修饰的多肽相比，包括但不限于1％活性、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％或更大的活性。举例来说，与呈相同形式的未经修饰的FVIIa多肽相比，经修饰的FVIIa多肽可呈现增加或降低的活性。举例来说，其可保留至少约或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或至少99％的未经修饰的FVIIa多肽的活性。在其他实施例中，活性变化比未经修饰的FVII大至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或更多倍。待保留的特定水平随多肽的预期用途变化并且可凭经验确定。活性可例如使用活体外或活体内分析，例如本文或下文实例中所描述的那些分析来测量。
如本文所用，“凝血活性”或“凝血活性”或“促凝血活性”是指多肽实现凝血的能力。评定凝血活性的分析为所属领域技术人员已知，且包括但不限于促凝血活酶时间(prothromboplastin time，PT)分析或活化部分凝血活酶时间(aPTT)分析。
如本文所用，“按需求”治疗包括：(1)向出血的受试者施用治疗，(2)向不出血但可能开始出血(例如，在医学治疗/手术之前治疗)，或预期以其他方式参与活性，或处于可引起受试者出血的情况下(例如，通常引起损伤的剧烈身体活动，例如竞技体育)的受试者施用按需求预防性治疗(例如，以预期方式提供)，(3)在出血的临床观测之前对受试者治疗，和(4)在出血开始之后使用预定方案对受试者治疗。就(3)来说，存在当受试者在临床上观测到出血之前(例如当其具有关节出血事件时)可感觉到出血时的情况；因此，可在观测到出血之前治疗出血。在本文所提供的例示性实施例中，按需求皮下施用经修饰的FVIIa多肽以预防或减少出血，且可根据给药时程或方案施用。
应理解，可以预期方式提供的“按需求预防性治疗”包括提供给预期经历出血的受试者或提供给可能经历出血的受试者的治疗。在一些实施例中，如受试者确定需要，向受试者提供按需求预防性治疗。在本文所提供的例示性实施例中，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽中的任一者以预期参与活性或在可能引起受试者出血的情形下的预期方式，向受试者按需求预防性皮下施用。举例来说，本文提供的经修饰的FVIIa多肽中的任一者可施用至将要参与身体活动的受试者，例如但不限于锻炼、运动、手动劳动和具有提高的损伤风险的任何其他活性。在本文所提供的例示性实施例中，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽中的任一者以预期经历出血的方式(例如由于但不限于手术或牙科程序(例如拔牙、常规牙齿清洁和/或牙龈清洁)的出血)向受试者按需求预防性皮下施用。
如本文所涵盖，并非按需求预防性治疗的预防性治疗或防治为以连续且一致方式提供的治疗，可包括向可能经历不受控制或自发性出血的受试者或由于损伤或自发性出血而可能经历长期出血的受试者提供的治疗。可以常规、连续且一致的方案向受试者提供这类预防性治疗。这类方案可包括例如每周或每日常规剂量。
如本文所用，“经修饰的因子VII多肽”和“经修饰的因子VII”(产生本公开的活化的经修饰的FVIIa多肽)是指与未经修饰的因子VII多肽相比具有一个或多个氨基酸差异且可呈未活化或活化形式的FVII多肽。一个或多个氨基酸差异可为氨基酸突变，例如一个或多个氨基酸置换(取代)、插入或缺失，或可为全局的插入或缺失和其任何组合。举例来说，相比于未经修饰的FVII多肽，本文提供的经修饰的FVII多肽可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50个或更多个氨基酸差异。涵盖任何修饰，只要所得多肽呈现至少一种与天然FVIIa多肽相关的FVII活性，例如凝血或凝血活性、促凝血活性；蛋白水解或催化活性，例如实现因子X(FX)活化或因子IX(FIX)活化；抗原性(与多肽结合或竞争以结合至抗FVII抗体的能力)；结合至组织因子、因子X或因子IX或活化血小板的能力；和/或结合至磷脂的能力。例示性经修饰的FVII多肽描述于PCT公开案第WO2009126307A2号，其以全文引用的方式并入。
如本文所用，“凝血抑制剂”是指用以抑制或阻止凝血或凝块形成的蛋白质或分子。抑制或阻止凝血可在活体内或活体外观测，并且可以使用所属领域中已知的任何方法分析，包括但不限于促凝血活酶时间(PT)分析或活化部分凝血活酶时间(aPTT)分析。
如本文所用，组织因子路径抑制剂(TFPI，也称为TFPI-1)为一种涉及形成抑制FVIIa活性的四级TF/FVIIa/TFPI/FXa抑制复合物的孔尼兹型抑制剂(Kunitz-typeinhibitor)。TFPI在替代性剪接之后表示为两种不同前体形式，TFPIα(SEQ ID NO:75)和TFPIβ(SEQ ID NO:77)前体，其在分泌期间裂解以分别产生276氨基酸(SEQ ID NO:76)和223氨基酸(SEQ ID NO:78)成熟蛋白。TFPI含有3个孔尼兹域，其中孔尼兹1域负责结合和抑制FVIIa。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指任何脊椎动物，包括但不限于人类和其他灵长类动物(例如，黑猩猩、食蟹猕猴和其他猿和猴物种)、农畜(例如，牛、绵羊、猪、山羊和马)、家养哺乳动物(例如，狗和猫)、实验动物(例如，兔、啮齿动物，例如小鼠、大鼠和天竺鼠)和鸟类(例如，家鸟、野鸟和赛鸟，例如鸡、火鸡和其他鹑鸡类鸟类、鸭、鹅等)。在一些实施例中，受试者为哺乳动物。在例示性实施例中，受试者为人类。
经修饰的FVII和FVIIa多肽
为了清楚起见，本文提供主题的经修饰的FVII多肽组合物和主题的经修饰的FVIIa多肽组合物。皮下施用本文所述的按需求治疗实施例涵盖施用本公开的经修饰的FVIIa多肽(施用活化形式)。因此，当本文论述治疗时，会提及本公开的经修饰的FVIIa多肽。
本文提供经修饰的FVIIa多肽，其经设计以呈现增加的活性或效能，例如增加的生物可用性和凝血活性，且可充当改良的治疗剂以治疗适合于因子VII疗法，例如通过皮下按需求施用的疾病和病状。
这类经修饰的FVIIa多肽可用于按需求治疗出血病症或事件，例如血友病或损伤，其中FVIIa多肽可用于促进凝血且减少/停止出血。在一些实施例中，本文提供的经修饰的FVIIa多肽可用于具有针对FVIIIa和FIXa的自体抗体的血友病患者中。本文所提供的经修饰的FVIIa多肽提供包括降低所施用FVIIa的量的优势，所述量为在血清中维持足够浓度的活性FVIIa以用于止血所需的。这可能引起例如实现相当生物作用、较高舒适性和受试者接受度以及减弱二次作用所必需的较低剂量和/或给药频率。在其他实施例中，相比于静脉内施用时，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽在皮下施用时展示增加的末端消除半衰期。
转至修饰，其可制成任何形式的FVII多肽，包括对偶基因和物种变体、剪接变体、所属领域中已知的变体或杂交或嵌合FVII分子。举例来说，本文所提供的修饰可在SEQ IDNO:1或2中所阐述的前体FVII多肽、SEQ ID NO:3中所阐述的成熟多肽或与SEQ ID NO:1-3中所阐述的FVII多肽中的任一者具有40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的其任何物种、对偶基因或经修饰的变体和活性片段中制成。
本文中所提供的起始未经修饰的参考多肽的修饰包括氨基酸置换或取代、氨基酸的添加或缺失或其任何组合。举例来说，经修饰的FVII多肽包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50个或更多个经修饰的位置的多肽。本文还提供与起始参考FVII多肽相比具有两个或更多个修饰的经修饰的FVII多肽。在一些实施例中，经修饰的FVII多肽包括两种修饰或四种修饰。
本文所提供的任何修饰可与所属领域技术人员已知的任何其他修饰组合，只要所得经修饰的FVIIa多肽在呈其双链形式时呈现增加的凝血活性。通常，经修饰的FVIIa多肽呈现增加的凝血活性。可由于修饰而改变的活性或特性包括但不限于凝血或凝结剂活性；促凝血活性；蛋白水解或催化活性，例如实现因子X(FX)活化或因子IX(FIX)活化；抗原性(与多肽结合或与多肽竞对抗以结合至抗FVII抗体的能力)；结合组织因子、组织因子抑制因子(TFPI)、抗凝血酶III、因子X或因子IX的能力；结合至磷脂、血清白蛋白或血小板整合素αIIbβ3的能力；血清半衰期；三维结构；pI；和/或构形。在本文所提供的经修饰的FVIIa多肽中包括满足以下的那些多肽：对抗凝血酶III(AT-III)的抗性增加、在TF存在和/或不存在下催化活性增加、对组织因子路径抑制剂(TFPI)的抗性增加、对Zn2+抑制作用的抗性增加、药物动力学特性改良(例如血清半衰期增加、内源活性增加、糖基化改变、对血清白蛋白的亲和力和/或与其的结合增加、对血小板整合素αIIbβ3的亲和力增加和/或与其的结合增加、和/或对活化血小板的亲和力增加和/或与其的结合增加。
在一些实例中，修饰可影响FVIIa多肽的两种或更多种特性或活性。举例来说，与未经修饰的FVIIa多肽相比，修饰可使得经修饰的FVIIa多肽的促凝血活性增加和效能增加。可分析本文所提供的经修饰的FVIIa多肽的各特性和活性以鉴别修饰的影响范围。这类分析为所属领域中已知的。
所得经修饰的FVII多肽包括单链酶原多肽的那些多肽或产生双链酶原类多肽的那些多肽。举例来说，本文所提供的作为单链多肽的任何经修饰的多肽可通过其他凝血因子自动活化或活化以产生经修饰的双链形式(即FVIIa)。经修饰的FVIIa多肽的活性通常以其双链形式呈现。
因此，借助于本文所提供的修饰，经修饰的FVIIa多肽可呈现增加的凝血活性、增长的凝血活性持续时间和/或增强的治疗指数。这可以TF依赖性和/或TF-非依赖性方式观测到。通常，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽的增加的凝血活性、增长的凝血活性持续时间和/或增强的治疗指数可在适当分析中活体外或离体观测到，或活体内观测到，例如在向受试者(例如人类或非人类受试者)施用时。与起始或未经修饰的FVIIa多肽相比，经修饰的FVIIa多肽的增加的活性可增加至少或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％或更大。
对FVIIa多肽的例示性修饰以增加催化活性
本文提供经修饰的FVIIa多肽，其尤其呈现增加的凝血活性。不受任何理论或机制束缚，在一些实施例中，这类FVIIa多肽可由一个或多个可影响氧阴离子孔的构形的残基的氨基酸取代产生。在特定位置(例如通过胰凝乳蛋白酶编号的位置143，或通过成熟FVII编号的286)引入不同氨基酸残基可改变经修饰的FVIIa多肽的构形以使得在催化期间氧阴离子孔更有效。这可能产生相比于未经修饰的FVIIa多肽具有增加的催化活性的经修饰的FVIIa多肽。归因于影响氧阴离子孔的突变的催化活性的变化可表现为增加的凝血活性。可在组织因子存在和/或不存在下观测本文所提供的经修饰的FVIIa多肽的催化和凝血活性的增加(即可为TF依赖性和/或TF非依赖性的)。因此，当在适当活体外、活体内或离体分析中评估时，例如在作为促凝血治疗剂向受试者施用后，与未经修饰的FVIIa多肽相比，经修饰的FVIIa多肽可显示增加的凝血活性。
可通过涉及形成氧阴离子孔或接近氧阴离子孔的一个或多个氨基酸残基的修饰来改变氧阴离子孔的构形以诱导更有效的构形。如本文所提供，这类氨基酸残基的例示为Q286(对应于SEQ ID NO:3中所阐述的成熟FVII多肽编号)，其通过胰凝乳蛋白酶编号对应于Q143。Q286可通过例如氨基酸取代、缺失或插入来修饰。当修饰由氨基酸取代实现时，位置286处的谷酰氨酸残基可经任何其他氨基酸残基置换。
Q286与形成FVIIa多肽的活性位点的区域和活性位点裂隙的残基位置相邻且接触。因此，已陈述这一位置处的修饰应使得催化活性降低(参见例如美国专利第6806063号)。这已在先前研究中加以证实(参见例如国际专利公开案第WO2007031559号)，其中谷酰氨酸残基经丙氨酸(Q286A)置换。所得经修饰的FVIIa多肽相比于野生型多肽呈现出降低的活化因子X的能力。在其他研究中，对于因子X，相同突变对FVIIa突变体的催化活性(Dickinson等人,(1996)Proc.Nat.Acad.Sci.USA.93:14379-14384)或合成受质(国际专利公开案第WO2007031559号)基本上无影响。
然而，如本文中所证实(参见实例)，FVII多肽在位置286(对应于SEQ ID NO:3中所阐述的成熟FVII多肽编号；对应于由胰凝乳蛋白酶编号的位置143)处，尤其用碱性残基，例如精氨酸(Arg、R)的修饰，产生具有增加的催化和凝血活性的经修饰的FVIIa多肽。在一些实施例中，包含位置286处用精氨酸残基的修饰的FVIIa多肽产生经修饰的FVIIa多肽，其展示通过皮下，例如施用在出血发生之后对出血进行的按需求治疗的功效。在一些实施例中，皮下施用在出血发生之后约一分钟时进行。在一些实施例中，所述皮下施用的剂量比皮下施用未经修饰的FVIIa多肽所需的剂量低。在一些实施例中，皮下施用的剂量比静脉内施用未经修饰的FVIIa多肽所需的剂量低。
因此，本文提供在对应于SEQ ID NO:3中所阐述的成熟FVII多肽的氨基酸位置286(通过胰凝乳蛋白酶编号的氨基酸位置143)的氨基酸位置处含有修饰的经修饰的FVII多肽，所述修饰例如用碱性氨基酸进行的氨基酸置换。本文中在氨基酸位置286处所提供的修饰可在任何FVII多肽中制成，包括SEQ ID NO:1或2中所阐述的前体FVII多肽、SEQ ID NO:3中所阐述的成熟FVII多肽或与SEQ ID NO:1-3中所阐述的FVII多肽中的任一者具有40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性的其任何物种、对偶基因或经修饰的变体和活性片段。
位置286处的碱性氨基酸取代
提供经修饰的FVII多肽，其中位置286(对应于SEQ ID NO:3中所阐述的成熟FVII多肽编号；对应于由胰凝乳蛋白酶编号的位置143)处的谷酰氨酸经碱性氨基酸残基，例如精氨酸(Arg、R)、组氨酸(His、H)或赖氨酸(Lys、K)中的任一者置换。特定来说，本文提供经修饰的FVII多肽，其中位置286处的谷酰氨酸经精氨酸(即Q286R，对应于由胰凝乳蛋白酶编号的Q143R)置换。模型化研究指示用精氨酸取代谷酰氨酸引起两种关键相互作用损失，稳定了野生型或未经修饰的FVII中FVIIa氧阴离子孔的非活性构形。
含有氨基酸取代Q286R的经修饰的FVIIa多肽的增加的凝血活性可为催化活性提高的结果。可在存在和/或不存在组织因子(TF)的情况下观测到增加的催化活性。因此，增加的催化活性可为TF依赖性和/或TF非依赖性的。FVII的例示性修饰为Q286R/M298Q，其为FVIIa多肽，其在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中位置286处的修饰是以Arg(R)的氨基酸置换，且位置298处的修饰是以Gln(Q)的氨基酸置换。这一例示性经修饰的FVII或FVIIa多肽可包含如SEQ ID NO:138中所阐述的氨基酸序列。这一例示性经修饰的FVIIa多肽可在TF存在和不存在下呈现增加的用于FX活化的催化活性，且可具有大于未经修饰的FVIIa的活性或效能。举例来说，这类例示性经修饰的FVIIa多肽在皮下施用时具有增加的活性或效能。在一些实施例中，皮下施用经修饰的FVIIa多肽的活性或效能大于静脉内施用经修饰的FVIIa多肽。在一些实施例中，皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于静脉内施用未经修饰的FVIIa多肽。在一些实施例中，皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于皮下施用未经修饰的FVIIa多肽。
经改变的糖基化和改变糖基化的例示性修饰
可通过调节糖基化程度、水平和/或类型来改变蛋白质的特性和活性。举例来说，糖基化可通过增加蛋白质的稳定性、溶解性和降低其免疫原性来增加多肽的血清半衰期。糖基化可通过降低蛋白质的蛋白水解来增加蛋白质的稳定性，且可保护蛋白质免于热降解、暴露于变性剂、受氧自由基损坏和pH变化。糖基化还可以允许目标蛋白避开可涉及且结合至其他蛋白质(包括细胞表面受体)的清除机制。含有唾液酸的碳水化合物部分可影响蛋白质的溶解性。唾液酸部分为高度亲水性的且可保护目标蛋白的疏水性残基。这减少目标蛋白的聚集和沉淀。减少的聚集还有助于阻止针对目标蛋白的免疫反应。碳水化合物可进一步保护免疫系统的免疫原性序列。由碳水化合物部分占据的空间体积可减小由免疫系统调查的可用表面区域。这些特性引起目标蛋白的免疫原性降低。
本文提供与未经修饰的FVII多肽相比，已经通过改变糖基化的水平和/或类型而修饰的FVII多肽。相比于未经修饰的FVII，糖基化可增加或降低。在一些情况下，糖基化水平增加，产生高糖基化FVII多肽。这可例如通过并入至少一个未在碳水化合物部分所连接的未经修饰的FVII多肽中发现的非天然糖基化位点来实现。高糖基化FVII多肽还可以通过碳水化合物部分连接至至少一个在未经修饰的FVII多肽中发现但未糖基化的天然糖基化位点产生。在其他实例中，相比于未经修饰的FVII多肽，经修饰的FVII多肽中的糖基化水平降低。这可以通过消除一个或多个天然糖基化位点(例如通过氨基酸置换或缺失)来实现。
蛋白质的糖基化程度、水平和/或类型的改变已在所属领域中描述为降低免疫原性、增加稳定性、降低施用频率和/或减少不良副作用，例如发炎的方式。通常，这通过增加糖基化水平来实现。糖基化位点提供用于附接多肽上碳水化合物部分的位点，使得当多肽产生于能够糖基化的真核细胞中时，所述多肽经糖基化。
不受理论或机制束缚，FVII中存在四个天然糖基化位点；在N145和N322处存在两个N糖基化位点，且在S52和S60处存在两个O糖基化位点，与SEQ ID NO:3中所阐述的成熟FVII多肽中的氨基酸位置对应。
FVII多肽可在一个或多个位置处经修饰以改变多肽的糖基化。与未经修饰的FVII多肽相比，本文提供的具有经改变的糖基化的经修饰的FVII多肽可不具有糖基化、O连接的糖基化、N连接的糖基化和/或其组合。在一些实例中，经修饰的FVII多肽包括1、2、3、4、5或更多个碳水化合物部分，各连接至不同糖基化位点。糖基化位点可为天然糖基化位点和/或非天然糖基化位点。在一些实例中，经修饰的FVII多肽在超过一个非天然糖基化位点处经糖基化。举例来说，经修饰的FVII多肽可经修饰以引入1、2、3、4、5个或更多个非天然糖基化位点。T128N/P129A为对FVII多肽的修饰降低糖基化水平的一个实例，通过在FVII的轻链的EGF2域中的此两个取代产生额外N连接的糖基化位点。
在其他实施例中，可对本文提供的经修饰的FVII多肽的氨基酸序列进行进一步修饰，使得引入额外糖基化位点，由此相比于未经修饰的FVII多肽，增加经修饰的FVII多肽的糖基化水平。糖基化位点可为N-连接或O-连接的糖基化位点。可对引入一个或多个新糖基化位点的FVII多肽作出的修饰的实例包括但不限于US6806063和WO200393465中所述的修饰。与未经修饰的FVII多肽相比，可引起经修饰的FVII多肽的糖基化增加的例示性修饰包括但不限于T128N和T128N/P129A。FVII的例示性修饰为T128N/P129A，其为FVII多肽，其包括至少在对应于FVII多肽位置128的位置处和对应于FVII多肽位置129的位置处具有修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中，位置128处的修饰是以Asn(N)的氨基酸置换，且位置129处的修饰为Ala(A)。此例示性经修饰的FVII多肽具有额外N-连接的糖基化位点，且可具有大于未经修饰的FVIIa的活性或效能。在一些实施例中，与未经修饰的FVIIa相比，具有一个或多个额外N连接的糖基化位点的经修饰的FVIIa多肽可呈现比未经修饰的FVIIa高的或增加的生物可用性。
增加对TFPI的抗性的修饰
在一个实例中，可对在通过成熟FVII编号的氨基酸位置286处含有修饰的经修饰的FVII多肽作出额外修饰，从而引起对TFPI的抗性增加。这类对TFPI的抗性可例如通过在参与与TFPI的相互作用且与其结合以降低或阻止这类结合的FVII中的一个或多个残基突变来实现，从而使经修饰的FVIIa多肽对与凝血开始相关的TFPI的天然抑制作用具有抗性。举例来说，可在为FVII/TFPI接触残基或非常接近相互作用表面的残基的氨基酸残基处进行修饰。
组合和额外修饰
上文所述的修饰中的任何一个或多个可与上文所述或所属领域中别处所述的任何其他修饰组合。在一个实例中，可对FVII多肽序列进行额外修饰，使得其与其他因子、分子和蛋白的相互作用改变。还可对本文提供的改变多肽的构形或折叠的经修饰的FVII多肽进行额外修饰。还可对FVII多肽进行额外修饰以实现转译后修饰。举例来说，多肽可经修饰以包括额外糖基化位点，使得所得经修饰的FVII多肽与未经修饰的FVII多肽相比具有增加的糖基化。还可作出修饰以引入可随后连接至化学部分的氨基酸残基，例如用来增加经修饰的FVIIa多肽的稳定性的氨基酸残基。FVIIa多肽的稳定性还可以通过修饰潜在蛋白水解位点改变，从而增加经修饰的FVIIa多肽对蛋白酶的抗性。
本文提供的组合修饰的例示是包括至少Q286R突变的那些修饰(对应于SEQ IDNO:3中所阐述的成熟FVII多肽编号；对应于由胰凝乳蛋白酶编号的Q143R)。含有Q286R修饰的经修饰的FVII多肽可含有1、2、3、4、5、6个或更多个额外修饰。可包括这些额外修饰以例如改变催化活性、对AT-III的抗性、对TFPI的抗性、对由Zn2+的抑制的抗性、内源活性、酰胺水解活性、磷脂结合和/或亲和力、糖基化、对蛋白酶的抗性、半衰期和与其他因子或分子(例如FX、FIX、血清白蛋白和血小板整合素αIIbβ3)的互动。通常，本文所提供的含有两种或更多种修饰的经修饰的FVIIa多肽，其中一种修饰为氨基酸取代Q286R，相比于野生型FVIIa多肽呈现增加的凝血活性。
在一些实例中，相比于野生型多肽以及相比于仅含有任一突变的FVIIa多肽，含有两种或更多种修饰(其中一者为Q286R)的经修饰的FVIIa多肽，呈现增加的催化和凝血活性。举例来说，本文提供含有Q286R和M289Q氨基酸取代的经修饰的FVIIa多肽(具有对应于SEQ ID NO:3中所阐述的成熟FVII多肽的编号的Q286R/M298Q；对应于由胰凝乳蛋白酶编号的Q143R/M156Q)。与野生型FVII、Q286R单突变体和M298Q单突变体相比，Q286R/M298Q组合FVII修饰的多肽对于其受质，因子X呈现增加的催化活性。
具有修饰组合的FVII的例示性修饰为T128N/P129A/Q286R/M298Q，其为在与具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中包含至少对应于位置128的位置处、对应于位置129的位置处、对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰的FVIIa多肽，其中位置128处的修饰是以Asn(N)的氨基酸置换，位置129处的修饰为Ala(A)，位置286处的修饰是以Arg(R)的氨基酸置换，且位置298处的修饰是以Gln(Q)的氨基酸置换。这一例示性经修饰的FVII多肽具有额外N连接的糖基化位点，且当活化成FVIIa时，可在TF存在和不存在下呈现增加的用于FX活化的催化活性，且可具有大于未经修饰的FVIIa的活性或效能。与其他经修饰的FVIIa多肽，例如本文中也描述的经修饰的T128N/P129A FVIIa多肽相比，这一例示性经修饰的FVIIa多肽还可以呈现增加的药物动力学特性。值得注意的是，单独M298Q突变可使FVIIa多肽相对于未经修饰的FVIIa多肽变得更具催化活性，且因此预期其将通过抗凝血酶III(AT-III)变得更快抑制。然而，本文所述的T128N/P129A/Q286R/M298Q组合突变证实对AT具有意外抗性同时维持增加的活性。在一些实施例中，就静脉内施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽来说，T128N/P129A/Q286R/M298Q组合突变可提供具有增加的活性或效能(例如生物可用性和/或药物动力学概况)的FVIIa多肽。在一些实施例中，就皮下和/或静脉内施用未经修饰的FVIIa来说，T128N/P129A/Q286R/M298Q组合突变在向受试者皮下施用时可提供具有增加的活性或效能(例如生物可用性和/或药物动力学概况)的FVIIa多肽。
FVII多肽的产生
FVII多肽，包括经修饰的FVIIa多肽、或其FVII域或其他维生素K多肽的FVII多肽，可通过所属领域中众所周知的用于蛋白纯化和重组蛋白表达的方法获得。可使用所属领域技术人员已知的用于鉴别编码所需基因的核酸的任何方法。可使用所属领域中可使用的任何方法，例如从细胞或组织源，例如从肝脏，获得编码FVII多肽或其他维生素K多肽的全长(即，包涵整个编码区)cDNA或基因体DNA纯系。经修饰的FVII多肽可如本文所述，例如通过定点突变诱发进行工程改造。
FVII可使用所属领域中已知的用于克隆和分离核酸分子的任何可用方法克隆或分离。这类方法包括核酸的PCR扩增和库筛检，包括核酸杂交筛检、基于抗体的筛检和基于活性的筛检。
用于扩增核酸的方法可用于分离编码FVII多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。含有核酸的物质可用作起始物质，可自所述起始物质分离出编码FVII的核酸分子。举例来说，DNA和mRNA制剂、细胞提取物、组织提取物(例如来自肝脏)、流体样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病受试者的样品可用于扩增方法中。核酸库还可以用作起始物质的来源。引子可经设计以扩增编码FVII的分子。举例来说，可基于产生FVII的表达序列设计引子。可基于FVII氨基酸序列的反转译设计引子。由扩增产生的核酸分子可经定序和确认以编码FVII多肽。
其他核苷酸序列可接合成编码FVII的核酸分子，包括含有限制核酸内切酶位点的连接子序列以将合成基因克隆至载体中，例如蛋白质表达载体或经设计用于扩增编码核心蛋白的DNA序列的载体。此外，指定功能性DNA组件的其他核苷酸序列可以操作方式连接至编码FVII的核酸分子。这类序列的实例包括但不限于经设计以促进胞内蛋白质表达的启动子序列，和经设计以促进蛋白质分泌的分泌序列。其他核苷酸序列，例如指定蛋白质结合区的序列还可以连接至编码FVII的核酸分子。这类区域包括但不限于促进FVII吸收至特异性目标细胞中或以其他方式增强合成基因的药物动力学的序列。
所鉴别和分离的核酸可接着插入至适当克隆载体中。可使用所属领域中已知的多种载体-宿主系统。可能载体包括但不限于质体或经修饰的病毒，但载体系统必须与所用宿主细胞兼容。这类载体包括但不限于噬菌体，例如λ衍生物；或质体，例如pBR322或pUC质体衍生物或蓝图载体(Bluescript vector)(Stratagene,La Jolla,CA)。插入至克隆载体中可例如通过将DNA片段接合至具有互补黏性末端的克隆载体中来实现。插入可使用TOPO克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)实现。如果用于分裂DNA的互补限制位点不存在于克隆载体中，那么可以酶促方式修饰DNA分子的末端。或者，任何所希望的位点可通过将核苷酸序列(连接子)接合至DNA末端上来产生；这些接合连接子可含有特定的化学合成的编码限制核酸内切酶识别序列的寡核苷酸。在一替代性方法中，裂解载体和FVII蛋白质基因可以通过同聚物加尾进行修饰。重组分子可通过例如转型、转染、感染、电穿孔和声孔作用引入寄主细胞中，以便产生基因序列的多个拷贝。
在特定实施例中，用并入所分离的FVII蛋白质基因、cDNA或合成DNA序列的重组DNA分子转化宿主细胞能够产生多个基因拷贝。因而，基因可通过使转型体生长、自转型体分离重组DNA分子且在需要时自经分离的重组DNA取得插入基因来大量获得。
凝血活性
经修饰的FVIIa多肽可通过使用所属领域中众所周知的分析来测试凝血活性。举例来说，一些分析包括但不限于两阶段凝固分析(Liebman等人,(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3879-3883)；凝血酶原时间分析(PT，其可测量外源路径中FVIIa的TF依赖性活性)；分析，其为PT测试的修改；活化部分凝血活酶时间(aPTT，其可测量FVIIa的TF非依赖性活性)；活化凝固时间(ACT)；再钙化活化凝固时间；李怀特凝固时间(Lee-White Clotting time)；或血栓弹力图(TEG)(Pusateri等人(2005)Critical Care9:S15-S24)。举例来说，经修饰的FVIIa多肽的凝血活性可通过基于PT的分析确定，其中FVII在FVII缺陷型血浆中稀释，且与凝血酶原时间试剂(具有磷脂和钙的重组TF)混合，例如可以InnovinTM购自Dade Behring的形式获得。以光学方式检测凝块形成，且测定凝固的时间且将其与单独FVII缺陷型血浆进行比较。
效能可在活体内测定，例如活体内狗模型。可使用aPTT和/或TEG测试评定用以鉴别具有足够效能的经修饰的FVIIa的凝血(参见例如实例1)。
临床分析
许多分析可用于在临床使用之前评定FVIIa的活性。这类分析可包括活体内凝血、蛋白质稳定性和半衰期的评定和表型分析。表型分析和评定FVIIa治疗疗效的分析包括，评定FVII的血液含量(例如在施用之前和在施用之后的时间点，包括在第一次施用之后、在紧接着最后一次施用之后以及在两者之间的时间点测量血清FVII，矫治身体质量指数(BMI))；使用上文所述的方法在用FVIIa(例如PT分析)治疗之后评定活体外凝血以及对FVII治疗的表达型反应，包括与经未经修饰和/或野生型FVIIa或安慰剂治疗的受试者相比随着时间推移而症状减轻。可监测用FVIIa多肽治疗的患者的失血、输注需求和血红蛋白。可在一段时间内定期监测患者的常规施用或重复施用，或回应于例如出血、创伤或手术程序的急性事件的施用后情况。
调配物
含有经修饰的FVIIa的医药组合物可以通过将所选择量的多肽与一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂混合而以任何常规方式调配，以用于本文所提供的按需求治疗。载体或赋形剂的选择在施用职业技能范围内，且可视多种参数而定。这些参数包括例如施用模式和所治疗病症。本文所提供的医药组合物可经调配用于单次剂量(直接)施用或用于稀释或其他修改。所述调配物中化合物的浓度可有效递送当施用时有效用于预定治疗的量。通常，组合物经调配以用于单次剂量施用，但并非必需。在一些实施例中，为调配组合物，将一定重量分率的化合物或其混合物以有效浓度溶解、悬浮、分散或以其他方式混合于所选媒剂中，以使得所治疗的病状减轻或改善。
在一些实施例中，提供用于单次剂量按需求皮下施用的医药组合物，其在医药学上可接受的载体中包含单次治疗有效剂量的经修饰的FVIIa，用于皮下施用以用于按需求治疗出血。在一些实施例中，医药组合物的经修饰的FVIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中，或在FVII多肽的对应残基中，包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，且任选的至少对应于位置128的位置处和对应于位置129的位置处的修饰，其中位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换，位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换，位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换，且位置129处的修饰为Ala(A)，且其中经修饰的FVIIa的活性或效能大于未经修饰的FVIIa。在一些实施例中，提供一种治疗受试者的出血的方法，其包含皮下施用本文所提供的医药组合物。在一些实施例中，通过使用装置来向受试者皮下施用包含经修饰的FVIIa多肽的FVIIa多肽或医药组合物。在一些实施例中，装置为注射笔。在一些实施例中，皮下施用在检测出血事件之后按需求进行。在一些实施例中，皮下施用在出血事件之前按需求进行。在一些实施例中，皮下施用在出血事件之前按需求预防性地进行。在一些实施例中，皮下施用在出血事件之后按需求进行。在一些实施例中，皮下施用在出血事件之后按需求进行，直至出血事件已停止或已减少或出血已得到矫治。
本文所提供的经修饰的FVIIa多肽可调配用于以双链FVIIa蛋白形式施用受试者。经修饰的FVII多肽可在调配之前通过所属领域中已知的任何方法活化(即呈FVIIa形式)。
剂量
如将了解，所施用治疗剂的精确量或剂量视特定FVIIa多肽、施用途径和其他考虑因素而定，例如疾病的严重程度和受试者的体重和一般状态。必要时，可凭经验确定或外推具体剂量和持续时间以及治疗方案。举例来说，重组和天然FVIIa多肽的例示性剂量可用作起点来确定合适剂量。举例来说，已通过推注输注以90μg/kg剂量历经2至5分钟向经历出血事件的患有A型血友病或B型血友病的患者静脉内施用已活化成rFVIIa
Figure BDA0003582772610000242
的野生型重组FVII(rFVII)多肽，实现至少2μg/ml的有效循环水平。每2小时重复剂量直至实现止血。与这类重组FVIIa相比，本文中提供的经修饰的FVIIa多肽可在减少的剂量和/或频率下有效，或可相对于野生型重组FVIIa得到改良以治疗A型血友病或B型血友病。举例来说，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽可以80μg/kg、70μg/kg、60μg/kg、50μg/kg、40μg/kg、30μg/kg、20μg/kg、15μg/kg、10μg/kg或更小的剂量施用，且经皮下施用。在一些实施例中，皮下剂量可更高，例如100μg/kg、110μg/kg、120μg/kg或更高。治疗持续时间和注射之间的时间间隔可随出血的严重程度和患者对治疗的反应而变化，且可相应地进行调整。当进行剂量测定时，可考虑例如经修饰的FVIIa与未经修饰的FVIIa相比的活性程度和半衰期的因素。
在另一实例中，已通过推注注射以15-30μg/kg的剂量历经2至5分钟向经历出血事件的患有先天性FVII缺陷的患者静脉内施用已活化成rFVIIa
Figure BDA0003582772610000241
的重组FVII(rFVII)多肽。每4至6小时重复剂量直至实现止血。当以按需求皮下方式施用时，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽与这类重组FVIIa相比在减少的剂量和/或频率下可为有效的。举例来说，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽可以20μg/kg、15μg/kg、10μg/kg、5μg/kg、3μg/kg或更小的剂量施用，以治疗FVII缺陷。在一些实例中，剂量可较高，例如35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg或更高。治疗持续时间和注射之间的时间间隔会随出血的严重程度和患者对治疗的反应而变化，且可相应地进行调整。与未经修饰的FVIIa相比，例如经修饰的FVIIa的活性程度和半衰期的因素可用于进行剂量测定。举例来说，与未经修饰的FVIIa多肽相比呈现较长半衰期的经修饰的FVIIa多肽可以较低剂量施用和/或与未经修饰的FVIIa多肽相比可较不频繁地施用。类似地，与未经修饰的FVIIa多肽相比，使用显示增加的凝血活性的经修饰的FVIIa多肽的疗效所需剂量可减小频率和量。具体剂量和方案可由所属领域技术人员凭经验确定。
在一些实施例中，以所治疗受试者的重量计，用于治疗出血病症(例如A型或B型血友病)的本发明提供的经修饰的FVIIa多肽的单次皮下剂量为约10μg/kg至30μg/kg、10μg/kg至60μg/kg、10μg/kg至90μg/kg、10μg/kg至120μg/kg、30μg/kg至60μg/kg、30μg/kg至90μg/kg、30μg/kg至120μg/kg、10μg/kg至500μg/kg、或15μg/kg至400μg/kg、或15μg/kg至350μg/kg、或20μg/kg至400μg/kg、或20μg/kg至350μg/kg、或30μg/kg至350μg/kg、或25μg/kg至350μg/kg。在一些实施例中，以所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约30μg/kg、60μg/kg、90μg/kg或120μg/kg。在例示性实施例中，以所治疗受试者的体重计，单次皮下剂量为约60μg/kg。在例示性实施例中，以所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约20μg/kg。在例示性实施例中，以所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约30μg/kg。在例示性实施例中，以所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约40μg/kg。在例示性实施例中，以所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约50μg/kg。在例示性实施例中，以所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约90μg/kg。在例示性实施例中，以所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约100μg/kg。在例示性实施例中，以所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约120μg/kg。在一些实施例中，以所治疗受试者的体重计，本文所提供的用于治疗疾病或病症，例如因子VII缺陷的经修饰的FVIIa多肽的单次皮下剂量为约10μg/kg至约20μg/kg。
剂型
医药治疗学活性化合物和其衍生物可以单位剂型或多种剂型形式调配和施用。可提供调配物用于以以下剂型向人类和动物施用，包括但不限于含有适合量的化合物或其医药学上可接受的衍生物的锭剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂、无菌非经肠溶液或悬浮液、口服溶液或悬浮液和水油乳液。各单位剂量含有足以产生所需疗效的预定量的治疗学上的活性化合物，其与所需医药载体、媒剂或稀释剂结合。单位剂型的实例包括安瓿和注射器和单独封装的锭剂或胶囊。在一些实例中，单位剂量以在施用之前复原的冻干粉形式提供。举例来说，本发明的经修饰的FVIIa多肽可以冻干粉形式提供，所述冻干粉用适合溶液复原以产生单次剂量注射溶液。举例来说，以冻干粉形式提供的本发明的经修饰的FVIIa多肽可提供于容器或装置中。在一些实施例中，容器包含两个腔室，其中一个腔室含有冻干组合物；且另一腔室包含用于溶解冻干组合物的媒剂。在这类例示性实施例中，可将媒剂自一个腔室推送至含有冻干组合物的另一腔室中，由此复原以冻干形式提供的FVIIa多肽，且在适用于向有需要的受试者施用的组合物中提供FVIIa多肽。
在一些实施例中，冻干粉可含有FVIIa多肽和额外组分，例如盐，使得用无菌蒸馏水复原得到在缓冲溶液或盐水溶液中的FVIIa多肽。单位剂型可以分数份或倍数份施用。多剂型是打算以分开的单位剂型施用的封装于单一容器内的复数个单位剂型。剂量可相同但并非必需相同。多剂型的实例包括小瓶、锭剂或胶囊的瓶子或品脱瓶或加仑瓶。因此，多剂型可提供为不在封装中分开的多个单位剂量。
本文所提供的本公开的经修饰的FVIIa多肽中的任一者可以单次剂量形式以调配成不超过用于受试者的预定最大体积的体积提供。举例来说，可调配体积以向婴儿、儿童和青少年或向成年受试者施用。针对受试者调配的剂量可以重量计，例如约10μg/kg至120μg/kg(例如30μg/kg 60μg/kg、1200μg/kg)，且以大致2-4mL的体积提供。在一些实施例中，体积不超过3mL。在一些实施例中，单次所提供剂量的体积不超过1、或2、或3、或4、或5mL。在一些实施例中，单次所提供剂量的体积不超过1.5或2mL。在一些实施例中，单次所提供剂量的量为约1至约6mg的量。在一些实施例中，任何单次剂量的本文所提供的经修饰的FVIIa多肽的体积为约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6或约6.5mL体积。在一些实施例中，任何单次剂量的经修饰的FVIIa的体积为约4.5mL体积。
经修饰的FVIIa多肽的施用
本文所提供的经修饰的FVIIa多肽可通过使例如体液或其他组织样品的混合物与经修饰的FVIIa多肽接触来施用。举例来说，当离体施用化合物时，来自受试者的体液或组织样品可与涂布在管或过滤器，例如在旁路机器中的管或过滤器上的经修饰的FVIIa多肽接触。
经修饰的FVIIa多肽可施用一次或超过一次，例如为实现对受试者疗效所需的两次、三次、四次或任意次数。例示性多次给药方案描绘于例如图17A-17B中。多次施用可通过任何途径或途径组合实现，且可每小时、每2小时、每三小时、每四小时或更多小时施用。受试者可为成人、青少年、儿童或婴儿。
在一些实施例中，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽可在治疗受试者的出血事件的方法中施用，其中在出血事件之前和/或之后约5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用经修饰的FVIIa多肽，借此出血量减少或停止或出血病因得到矫治或治愈。在一些实施例中，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽皮下施用至有需要的受试者，其中所述施用为一定剂量的经修饰的FVIIa，所述经修饰的FVIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中：
位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；
位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；
皮下施用经修饰的FVIIa具有增加的活性或效能；且
在出血事件之前和/或之后约5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa，从而减少或停止出血量或矫治或治愈出血的病因。
在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽进一步包括在对应于FVII多肽位置128的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换。在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽进一步包括在对应于FVII多肽位置129的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中位置129处的修饰为Ala(A)。
在一些实施例中，皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于静脉内施用经修饰的FVIIa多肽。在一些实施例中，皮下施用的经修饰的FVIIa的活性或效能大于静脉内施用的未经修饰(或经不同修饰)的FVIIa多肽。在一些实施例中，皮下施用经修饰的FVIIa多肽的活性或效能大于皮下施用的未经修饰(或经不同修饰)的FVIIa多肽。
在一些实施例中，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽以按需求治疗的形式向受试者皮下施用以治疗出血事件，使得在检测出血事件之后施用经修饰的FVIIa多肽。在一些实施例中，在出血事件之后约5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用经修饰的FVIIa，借此出血量减少或停止或出血病因得到矫治或治愈。
在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之前约5小时内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之前约4小时内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之前约3小时内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之前约2小时内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之前约1小时内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之后约5小时内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之后约4小时内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之后约3小时内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之后约2小时内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之后约1小时内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之前约5分钟内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之前约4分钟内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之前约3分钟内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之前约2分钟内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之前约1分钟内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之后约5分钟内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之后约4分钟内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之后约3分钟内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之后约2分钟内皮下施用。在一些实施例中，经修饰的FVIIa的剂量在出血事件之后约1分钟内皮下施用。
在一些实施例中，皮下多次施用本文所提供的经修饰的FVIIa多肽，直至待治疗的出血事件停止或待治疗的伤口愈合或出血减少、停止或以其他方式得到矫治。
在一些实施例中，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽在向经历出血的受试者或可能经历出血的受试者提供按需求治疗的方法中皮下施用，所述方法包含向受试者施用一定皮下剂量的经修饰的FVII，其中经修饰的FVII为活化FVII(经修饰的FVIIa)，且经修饰的FVIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；且剂量为每公斤受试者体重约10至约100μg。在一些实施例中，经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置128的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换。在一些实施例中，经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置129的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中位置129处的修饰为Ala(A)。
在一些例示性实施例中，待用本文所提供的经修饰的FVIIa多肽中的任一者治疗的受试者重量为约75kg，且向受试者提供剂量为约60μg/kg的经修饰的FVIIa多肽。在这类例示性实施例中，经修饰的FVIIa多肽的所提供剂量以约4.5mg的量提供。在一些实施例中，向受试者施用单次剂量4.5mg的量。在一些实施例中，向受试者施用多次剂量的经修饰的FVIIa多肽。在一些例示性实施例中，欲用本文提供的经修饰的FVIIa多肽中的任一者治疗的受试者为约30kg、或约60kg、或约75kg、或约100kg。在这类例示性实施例中，所提供的经修饰的FVIIa多肽的体积可凭经验基于受试者的体重确定。举例来说，在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽的剂量可以60μg/kg的剂量提供，且对于约25kg的受试者可以约1.5mg的剂量提供，或对于约30kg的受试者可以约1.8mg的剂量提供，或对于约50kg的受试者可以约3mg的剂量提供，或对于约60kg的受试者可以约3.6mg的剂量提供，或对于约75kg的受试者可以约4.5mg的剂量提供，或对于约100kg的受试者可以约6mg的剂量提供。
在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽的剂量可以20μg/kg的剂量提供，且对于约75kg的受试者可以约1.5mg的剂量提供，或对于约100kg的受试者可以约2mg的剂量提供，或对于约50kg的受试者可以约1mg的剂量提供，或对于约25kg的受试者可以约0.5mg的剂量提供。
在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽的剂量可以120μg/kg的剂量提供，且对于约75kg的受试者可以约95mg的剂量提供，或对于约100kg的受试者可以约12mg的剂量提供，或对于约50kg的受试者可以约6mg的剂量提供，或对于约25kg的受试者可以约3mg的剂量提供。
在一些实施例中，剂量为每公斤受试者体重约20μg至每公斤受试者体重约60μg。在一些实施例中，剂量为每公斤受试者体重约60μg。在一些实施例中，受试者患有血友病。在一些实施例中，受试者患有具有抑制剂的血友病。在一些实施例中，受试者患有具有或不具有抑制剂的血友病，且剂量为约60μg/kg。在一些实施例中，受试者患有具有或不具有抑制剂的血友病，且剂量为约120μg/kg。
在一些实施例中，受试者患有因子VII缺陷，且以受试者的体重计，剂量为约10μg/kg。在一些实施例中，受试者患有因子VII缺陷，且以受试者的体重计，剂量为约20μg/kg。
在一些实施例中，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽在多次给药方案中皮下施用。在一些实施例中，所述多次给药方案包含在约24小时内的至少两次、三次、四次、五次或六次剂量。在一些实施例中，多次给药方案包含在约24小时内不超过两次、三次、四次、五次或六次剂量。在一些实施例中，多次给药方案的至少一次剂量包含每公斤受试者体重约30、约45、约60、约90或约120μg。在一些实施例中，多次给药方案的各剂量为相同的。在一些实施例中，多次给药方案的各剂量不相同。在一些实施例中，多次给药方案的各剂量相隔约2至约6小时持续预定时段进行。在一些实施例中，所述预定时段为约24小时。在一些实施例中，多次给药方案在24小时时段内包含最大三次剂量。在一些实施例中，在24小时时段内，多次给药方案包含最大两次、或三次、或四次、或五次、或六次剂量。在一些实施例中，以所治疗受试者(例如成人、青少年、儿童或婴儿)的重量计，多次给药方案的各剂量为30μg/kg、45μg/kg、60μg/kg、90μg/kg或120μg/kg。
在一些实施例中，用具有本文所提供的经修饰的FVIIa多肽中的任一者的多次给药方案治疗受试者的出血事件，其中多次给药方案以递增给药方案形式施用，其中多次给药方案的各剂量为比先前剂量高的剂量。
在一些实施例中，本文所提供的经修饰的FVIIa多肽中的任一者在多次给药方案中使用皮下施用向受试者施用。在一些实施例中，具有本文所提供的FVIIa多肽中的任一者的多次给药方案在预期出血情况下施用或在出血开始时施用。在一些实施例中，多次给药方案以递增给药方案形式施用。
在一些实施例中，用具有本文所提供的经修饰的FVIIa多肽中的任一者的多次给药方案治疗受试者的出血事件，其中在皮下施用经修饰的FVIIa多肽之前静脉内施用至少一次剂量的经修饰的FVIIa多肽。
在一些实施例中，施用本文所提供的经修饰的FVIIa多肽中的任一者的多次给药方案的任何单次剂量均以分次剂量施用，其中单次剂量以除注射之外的方式提供。在一些实施例中，在受试者的两个不同解剖部位处施用分次剂量。在一些实施例中，在受试者的相同解剖部位处施用分次剂量。
最适合的施用途径将视所治疗的疾病病况(例如出血病症的部位)而变化。在一些实施例中，通过皮下施用具有本文所提供的FVIIa多肽的多次给药方案来施用出血或预期出血的治疗。在一些实施例中，向不同解剖部位施用多次剂量。向不同解剖部位的例示性施用另外论述于实例9中且描绘于图17A-17B中。可施用任何剂量的本文所提供的经修饰的FVIIa多肽中的任一者的例示性解剖部位包括但不限于大腿、腹部、臂。多次剂量可在交替部位中施用，例如第一次剂量可在大腿中施用，且第二次剂量可在腹部中施用。同样，第一次剂量可在一个解剖部位的身体一侧上施用，且下一次剂量可在相同或不同解剖学部位的身体的另一侧上施用。
在经修饰的FVIIa多肽调配为贮存制剂的情况下，长效调配物可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射施用。因此，治疗性化合物可例如用适合的聚合或疏水性材料调配(例如在可接受的油中调配成乳液)或用离子交换树脂调配，或调配成微溶衍生物(例如微溶盐)。
需要时，组合物可存在于可含有一个或多个含有活性成分的单位剂型的封装中、试剂盒和施配器装置中。在一些实施例中，装置提供为注射笔。举例来说，封装含有金属或塑料箔，例如泡壳包装。包装或施配器装置可随附施用说明书。含有活性剂的组合物可封装为含有封装材料、本文所提供的药剂和指示所提供药剂针对的病症的标签的制品。
施用编码经修饰的FVII多肽的核酸(基因疗法)
还提供适用于基因疗法的具有编码经修饰的FVII多肽的核酸分子和编码其的表达载体的组合物。核酸可例如全身性或通过其他途径活体内施用，或例如通过去除细胞(包括淋巴球)、将核酸引入其中和再引入至宿主或兼容接受者中来离体施用，而非递送蛋白质。
经修饰的FVII多肽可通过核酸分子的表达递送至细胞和组织。经修饰的FVII多肽可以编码经修饰的FVII多肽的核酸分子形式施用，包括离体技术和直接活体内表达。核酸可通过所属领域技术人员已知的任何方法递送至细胞和组织。经分离的核酸序列可并入载体中以用于进一步操纵。如本文所用，载体(或质体)是指用于将异源DNA引入细胞中以用于其表达或复制的离散要素。这类媒剂的选择和使用完全在技术人员的技能范围内。
通过编码核酸分子的表达来施用经修饰的FVII多肽的方法包括施用重组型载体。载体可经设计以保持游离型，例如通过包括复制起点，或可经设计以整合至细胞的染色体中。经修饰的FVII多肽还可以用于使用非病毒载体的离体基因表达疗法中。举例来说，细胞可经工程改造以表达经修饰的FVII多肽，例如通过将经修饰的FVII多肽编码核酸整合至基因体部位中，使在基因体部位中以可操作方式连接至调节序列或如此以使得其经置放以可操作方式连接至调节序列。这类细胞接着可局部或全身性地施用至受试者，例如需要治疗的患者。
治疗用途
本文中提供的经修饰的FVIIa多肽可用于治疗采用基于重组FVII疗法的任何病状。通常，这类治疗包括需要提高凝血，例如提高止血反应的那些治疗。经修饰的FVIIa多肽单独或与其他药剂组合具有治疗活性。本文所提供的经修饰的多肽经设计以保持治疗活性，但呈现经修饰的特性，尤其为对AT-III增加的抗性和增加的催化活性。本文所提供的经修饰的多肽还可以呈现对TFPI增加的抗性、对Zn2+的抑制作用增加的抗性、改良的药物动力学特性(例如血清半衰期)、对活化血小板增加的结合和/或亲和力、对血清白蛋白增加的结合和/或亲和力和/或对血小板整合素αIIbβ3增加的结合和/或亲和力。由于经修饰的FVIIa多肽的凝血活性增加，这类经修饰特性，例如可改良多肽的治疗有效性。这一部分提供例示性用途和施用方法。这些所描述的疗法为例示性的且不限制经修饰的FVIIa多肽的应用。
本文所提供的经修饰的FVIIa多肽可用于各种治疗以及采用FVII的诊断方法中。这类方法包括但不限于下文所描述和所列的生理和医学病状的治疗方法。与野生型FVII相比，本文提供的经修饰的FVIIa多肽可呈现改良的活体内活性和疗效，包括较低剂量以实现相同效果，以及在施用和治疗方面的其他改良，例如较少和/或较不频繁的施用、减少的副作用和增加的疗效。尽管应理解经修饰的FVIIa多肽可以FVII酶原形式(即单链形式)施用，但通常本文提供的经修饰的FVIIa多肽在例如通过其他凝血因子自动活化或活化之后，例如在纯化期间，以活化双链形式施用。
特定来说，经修饰的FVIIa多肽打算用于其中FVII已用于治疗的治疗方法中。这类方法包括但不限于治疗疾病和病症的方法，例如但不限于凝血障碍、血液病症、出血性异常、血友病(例如A型血友病、B型血友病和因子VII缺陷)以及后天性血液病症(例如由肝病引起的后天性因子VII缺陷)。经修饰的FVIIa多肽还可以用于治疗额外出血疾病和病症，例如但不限于血小板减少症(例如，归因于化学治疗方案)、冯威里氏病(Von Willebrand'sdisease)、遗传性血小板病症(例如，储存池疾病，例如阙东二氏和哈布二氏综合征(Chediak-Higashi and Hermansky-Pudlak syndromes)、凝血脂素A2功能障碍、格兰茨曼氏血小板无力症(Glanzmann's thrombasthenia))、溶血性尿毒综合征、遗传性出血性毛细管扩张(也称作小肠遗传性出血性毛细血管扩张综合征(Rendu-Osler-Weber syndrome))、过敏性紫斑病(亨偌-丝奇恩赖紫癜)和弥散性血管内凝血。
在一些实施例中，待通过FVIIa多肽治疗的出血发生于例如脑、内耳区域、眼睛、肝脏、肺、肿瘤组织、胃肠道的器官中。在其他实施例中，出血为扩散的，例如在出血性胃炎和大量子宫出血中。患有出血病症，例如A型和B型血友病的患者通常在手术或创伤期间处于出血并发症的风险下。这类出血可表现为急性关节血肿(关节出血)、慢性嗜血性关节病、血肿(例如肌肉、腹膜后、舌下和咽后)、血尿(肾管出血)、中枢神经系统出血、肠胃出血(例如UGI出血)和脑出血，其还可以用经修饰的FVIIa多肽治疗。另外，与手术(例如，肝切除术)或拔牙相关的任何出血都可以用经修饰的FVIIa多肽治疗。在一个实施例中，经修饰的FVIIa多肽可用于治疗受试者的由于创伤或手术或血小板计数或活性降低引起的出血事件。针对经历手术的患者的例示性方法包括预防出血的治疗和在手术之前、期间或之后的治疗，所述手术例如但不限于心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊椎手术、脑手术、血管手术、牙科手术或器官移植手术(包括移植骨髓、心脏、肺、胰脏或肝脏)。在一些实施例中，待治疗出血事件和具有出血事件的受试者经历手术，且在手术之前，例如在手术之前4、3、2、1小时或更短时间皮下施用一定剂量本的文所提供的经修饰的FVIIa多肽。
使用经修饰的FVIIa多肽治疗疾病和病状可通过使用如本文中所描述的适合调配物的任何适合施用途径实现，包括但不限于注射、经肺、经口和经皮施用。在一些实施例中，使用经修饰的FVIIa多肽治疗疾病和病状可通过皮下施用FVIIa多肽来实现。
必要时，可凭经验确定或外推具体剂量和持续时间以及治疗方案。举例来说，重组和天然FVIIa多肽的例示性剂量可用作起点来确定合适剂量。举例来说，已活化成rFVIIa
Figure BDA0003582772610000331
的重组FVII(rFVIIa)多肽已通过推注输注以90μg/kg的剂量历经在2至5分钟经静脉内施用经历出血事件的患有A型血友病或B型血友病的患者，实现至少2μg/ml的有效循环水平，且平均半衰期为2.7小时。每2小时重复剂量直至实现止血。由于例如对AT-III的抗性增加、催化活性增加、对Zn2+抑制作用的抗性增加、对TFPI的抗性增加、药物动力学特性改良(例如血清半衰期增加、对活化血小板的结合和/或亲和力增加、对血清白蛋白的结合和/或亲和力增加)和/或对血小板整合素αIIbβ3的结合和/或亲和力增加，具有增加的凝血活性的经修饰的FVIIa多肽与这类重组FVIIa相比可在减少的剂量和/或频率下有效。举例来说，以受试者的体重计，相比于对于未经修饰的FVIIa多肽的皮下剂量所需的约120μg/kg的剂量，对于经修饰的FVIIa多肽的皮下剂量，可提供约60μg/kg的剂量。未经修饰的FVIIa多肽可由于施用这类较高剂量所需的较大体积而难以向受试者皮下施用。野生型或未经修饰的FVIIa多肽的剂量可用作测定经修饰的FVIIa多肽的剂量的指导。与未经修饰的FVII相比，例如经修饰的FVIIa的活性程度和半衰期的因素可用于进行所述测定。特定剂量和方案可凭经验确定。
在一些实施例中，本文提供的一些例示性经修饰的FVIIa多肽可呈现优于其他经修饰的FVIIa多肽(当皮下施用时)的改良的药物动力学特性。值得注意的是，出人意料且意外地，与未经修饰的FVII相比，在低于预期的剂量下皮下施用经修饰的FVIIa多肽呈现增加的效能、凝血活性以及延长的持续时间和延长时间的暴露。呈现改良的药物动力学特性的例示性经修饰的FVIIa多肽包含突变T128N/P129A/Q286R/M298Q，其产生活化FVIIa多肽，所述多肽包括至少在对应于FVII多肽位置128的位置处、对应于FVII多肽位置129的位置处、对应于FVII多肽位置286的位置处和对应于FVII多肽位置298的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换，位置129处的修饰为Ala(A)，位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换，且位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换。当相比于另一例示性经修饰的FVII(T128N/P129A)时，这一例示性经修饰的FVIIa多肽可呈现改良的药物动力学特性；所述经修饰的FVII为FVIIa多肽，包括至少在对应于FVII多肽位置128的位置处和对应于FVII多肽位置129的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换，且位置129处的修饰为Ala(A)。在例示性实施例中，例示性FVIIa多肽包含SEQ ID NO:280的序列。
剂量水平和方案可基于已知剂量和方案确定，且必要时可基于经修饰的多肽的特性变化外推和/或可基于多种因素凭经验确定。这类因素包括受试者的体重、一般健康状况、年龄、所采用的特定化合物的活性、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、疾病的严重程度和病程，和患者对疾病的处置和治疗医师的判断。活性成分(多肽)通常与医药学上有效的载体组合。可与载体材料组合以制造单一剂型或多剂型的活性成分的量可取决于所治疗的主体和具体施用模式而变化。
FVIIa多肽对血液凝固时间的作用可使用所属领域中已知的凝固测试中的任一者来监测，包括但不限于全血凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(aPTT)、活化凝固时间(ACT)、再钙化活化凝固时间或李怀特凝固时间。
在改良患者病况时，可视需要施用维持剂量的化合物或组合物；且可修改剂量、剂型或施用频率或其组合。在一些情况下，在疾病症状的任何复发后或基于预定剂量，受试者可能需要长期间歇性治疗。在其他情况下，可能需要额外施用以回应于例如出血、创伤或手术程序的急性事件。在一些实施例中，待治疗的受试者的出血事件由创伤或损伤引起，且受试者在出血之前和/或之后15分钟、1、2、3或4小时内用一定皮下剂量的本文所提供的经修饰的FVIIa治疗。
其中FVII(作为FVIIa施用)可单独或与其他药剂组合用作治疗剂的例示性条件描述于PCT公开案第WO2009126307A2号中，其以全文引用的方式并入本文中。这些包括但不限于先天性或后天性出血病症、移植后出血、抗凝血剂疗法诱发的出血、后天性血友病和创伤和外科出血。先天性出血病症包括但不限于血友病(例如A型血友病和B型血友病)、FVII缺陷、FV缺陷、FX缺陷、冯威里氏因子(vWD)和血小板相关的出血病症(例如格兰茨曼氏血小板无力症和哈布二氏综合征)。后天性出血病症包括但不限于化疗后血小板减少症、由例如爆发性肝衰竭(FHF)、肝病、维生素K缺乏、溶血尿毒综合征、血栓性血小板减少症(TTC)和散播性血管内凝血病(DIC)的病状引起的后天性凝血病。受试者中待治疗的出血事件还可以包括受试者间歇性或可预测的出血事件。在一些实施例中，在出血开始之前，用一定皮下剂量的本文所提供的经修饰的FVIIa多肽治疗受试者。在一些实施例中，在出血开始之后，用一定皮下剂量的本文所提供的经修饰的FVIIa多肽治疗受试者。
在一些实施例中，本文提供的经修饰的FVIIa多肽适用于按需求治疗出血事件。本文提供的经修饰的FVIIa多肽中的任一者可施用已检测到出血事件的受试者。这些经修饰的FVIIa多肽可皮下施用。在一些实施例中，按需求皮下施用至少单次剂量的本文所提供的FVIIa多肽中的任一者治疗受试者的出血事件。
经修饰的FVIIa多肽作为单一疗法
本文所述的经修饰的FVIIa多肽中的任一者可以单一疗法形式施用。如本文所用，“单一疗法”可指在无其他治疗剂(例如但不限于其他生物制剂和小分子化合物)的额外施用的情况下施用本文中所描述的经修饰的FVIIa多肽中的任一者。可根据本文所描述的施用方法中的任一者向有需要的受试者施用单一疗法。在一些实施例中，皮下施用本文提供的FVIIa多肽且作为单一疗法施用。
组合疗法
本文中所描述的经修饰的FVIIa多肽中的任一者可与其他治疗剂或程序组合、在其他治疗剂或程序之前、间歇地同其他治疗剂或程序一起或在其之后施用，所述其他治疗剂或程序包括但不限于其他生物制剂、小分子化合物和手术。对于其中指示或已使用FVII(包括FVIIa和rFVIIa)且其中其他药剂和治疗可供使用的任何疾病或病状，包括上文例示的所有那些疾病或病状，FVII可与所述疾病或病状组合使用。因此，可以类似方式使用本文提供的经修饰的FVIIa多肽。视待治疗的疾病或病状而定，例示性组合包括但不限于与其他经纯化血浆或重组凝血因子、促凝血剂(例如维生素K、维生素K衍生物和蛋白C抑制剂)、血浆、血小板、红血球和皮质类固醇的组合。
在一些实施例中，本文提供的经修饰的FVIIa多肽与额外凝血剂治疗或因子或其他药剂一起向受试者施用。在一些实施例中，治疗包含施用抗体艾美赛珠单抗-kxwh和/或因子VIII(FVIII)抑制剂旁路活性产品。
在一些实施例中，向具有抗组织因子路径抑制剂(TFPI)抗体的受试者施用本文提供的经修饰的FVIIa多肽。在一些实施例中，抗TFPI抗体为康次珠单抗。
在一些实施例中，本文中提供的经修饰的FVIIa多肽与靶向抗凝血酶(AT)的RNA干扰(RNAi)治疗剂组合向受试者施用。在一些实施例中，靶向AT的RNAi治疗剂为菲图司兰。
制品和试剂盒
经修饰的FVIIa多肽或编码经修饰的FVII多肽的核酸或其衍生物或生物活性部分的医药化合物可封装为含有以下的制品：封装材料、有效治疗止血疾病或病症的医药组合物和指示经修饰的FVIIa多肽或核酸分子将用于治疗止血疾病或病症的标签。
经修饰的FVIIa多肽和核酸分子还可以作为试剂盒形式提供。试剂盒可包括本文所描述的医药组合物和施用物品。举例来说，经修饰的FVIIa可与用于施用的装置一起提供，例如注射器、吸入器、剂量杯、滴管或施加器。试剂盒可任选的包括关于应用的说明书，包括剂量、给药方案和施用模式说明。试剂盒还可以包括本文中所描述的医药组合物和用于诊断的物品。举例来说，这类试剂盒可包括用于测量受试者的FVIIa或FVIIa调节系统的浓度、量或活性的物品。
在一些例示性实施例中，本文提供包含至少三个小瓶的试剂盒，每个小瓶包含用于皮下施用的单次剂量的经修饰的FVIIa多肽，或其医药组合物。在一些实施例中，经修饰的FVIIa多肽包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列。在一些实施例中，各小瓶包含含SEQ IDNO:280的氨基酸序列的经修饰的FVIIa多肽，且各小瓶包含相同剂量，所述剂量例如足以皮下施用有需要的受试者每公斤体重60μg的剂量。在其他实施例中，各小瓶包含含SEQ IDNO:280的氨基酸序列的FVIIa多肽，且小瓶中的剂量不相同。在一些实施例中，在24小时时段期间施用试剂盒中的所有小瓶。在一些实施例中，在24小时时段期间施用试剂盒中的所有小瓶，其中FVIIa多肽是在多次给药方案中施用，其中多次给药方案的各剂量相同，且其中多次给药方案的各剂量相隔约三小时。在一些实施例中，多次给药方案的各剂量为有需要的受试者每公斤体重的约30μg、45μg、60μg、90μg或120μg。在一些实施例中，向受试者施用FVIIa多肽一次，且按需要施用一次或多次重复剂量的FVIIa多肽，直至停止出血。在一些实施例中，一次或多次重复剂量为一次剂量，或两次剂量，或三次剂量。
例示性枚举实施例
本公开的例示性枚举实施例如下：
实施例I-1.一种治疗受试者的出血事件的方法，其包含皮下施用一定剂量的经修饰的因子VIIa(FVIIa)，其中：
经修饰的FVIIa具有大于FVIIa的活性或效能，FVIIa未经修饰且氨基酸序列阐述于SEQ ID NO:3中；和
在出血事件之前和/或之后约5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa，从而减少或停止出血量或矫治或治愈出血的病因。
实施例I-2.如实施例I-1的方法，其中所述皮下剂量的经修饰的FVIIa每3-7、2-5、4-6或4-12小时皮下施用，直至出血停止或病因得到矫治，或任何伤口经治愈或持续1至2、3、4或5天。
实施例I-3.如实施例I-1或I-2的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时施用。
实施例I-4.如实施例I-1至I-3中任一项的方法，其中：
出血为间歇性或可由受试者预测的；和
在出血开始之前，用一定皮下剂量的经修饰的FVIIa治疗受试者。
实施例I-5.如实施例I-1至I-3中任一项的方法，其中：
出血由创伤或损伤引起；和
在出血15分钟、1、2、3或4小时内，用一定皮下剂量的经修饰的FVIIa治疗受试者。
实施例I-6.如实施例I-1至I-5中任一项的方法，其中：
受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；
在手术之前4、3、2、1小时或更短时间皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa；
在手术期间用FVIIa经静脉内治疗受试者；和
在手术之前或之后至少一次皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa，直至无出血和/或出血风险或直至治愈受试者或矫治病因。
实施例I-7.如实施例I-1至I-5中任一项的方法，其中：
受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；
在手术之前至少3小时或2小时向受试者施用一定剂量的经修饰的FVIIa；和
随后在手术之后2至3小时皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa；
经修饰的FVIIa任选的在另外2至3小时之后再次施用；且
其后一天一次或两次施用经修饰的FVIIa，直至受试者经治愈或出血的病因得到矫治。
实施例I-8.如实施例I-1至I-5中任一项的方法，其中：
受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；
在手术之后每4至6小时皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa直至出血停止或受试者经治愈或出血的病因得到矫治。
实施例I-9.如实施例I-1至I-5中任一项的方法，其中出血是由于手术或创伤。
实施例I-10.如实施例I-1至I-5中任一项的方法，其中出血表现为急性关节血肿、单一关节血肿、慢性嗜血性关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠出血、气道出血、口腔出血、自发性出血、关节出血或脑出血。
实施例I-11.如实施例I-1至I-5中任一项的方法，其中出血是由于拔牙或牙龈出血。
实施例I-12.如实施例I-1至I-5中任一项的方法，其中：出血为手术出血。
实施例I-13.如实施例I-1至I-5中任一项的方法，其中
出血为手术出血；且
手术为关节手术、肢体手术、心脏手术、血管成形术、上呼吸道手术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、关节置换术、血管手术、牙科手术或器官移植手术。
实施例I-14.如实施例I-12的方法，其中手术为选自骨髓、心脏、肺、胰脏和肝脏移植的移植手术。
实施例I-15.如实施例I-12的方法，其中手术为髋关节或膝关节置换术或关节固定术。
实施例I-16.如实施例I-1至I-15中任一项的方法，其中出血为急性的且由创伤或手术引起，或间歇性出血为月经出血或关节出血或目标关节出血或经治愈或矫治的手术伤口。
实施例I-17.如实施例I-16的方法，其中施用为每2-4小时或3-6小时或4-6小时。
实施例I-18.如实施例I-1至I-17中任一项的方法，其中：
出血为间歇性或可预测的；和
受试者在出血之前经预治疗。
实施例I-19.如实施例I-18的方法，其中在出血之前约4小时或更短时间实现预治疗。
实施例I-20.如实施例I-19的方法，其中在出血之前约3小时或更短时间，或2小时或更短时间，或1小时或更短时间实现预治疗。
实施例I-21.如实施例I-19的方法，其中在出血之前至少15分钟实现预治疗。
实施例I-22.如实施例I-1至I-21中任一项的方法，其中出血是手术的结果。
实施例I-23.如实施例I-1至I-21中任一项的方法，其中出血为创伤或损伤的结果。
实施例I-24.如实施例I-1至I-21中任一项的方法，其中出血来自伤口。
实施例I-25.如实施例I-1至I-21中任一项的方法，其中出血为月经出血或为关节出血。
实施例I-26.如实施例I-1至I-25中任一项的方法，其中皮下施用一个剂量的经修饰的FVIIa。
实施例I-27.如实施例I-1至I-25中任一项的方法，其中施用经修饰的FVIIa多次，直至出血停止或任何伤口经治愈或出血得到矫治。
实施例I-28.如实施例I-1至I-27中任一项的方法，其中一次或多次剂量的经修饰的FVIIa在出血之前皮下施用。
实施例I-29.如实施例I-1至I-28中任一项的方法，其中一次或多次剂量的经修饰的FVIIa在出血开始之后皮下施用。
实施例I-30.如实施例I-1至I-29中任一项的方法，其中在出血开始1分钟至2小时内施用一定剂量的经修饰的FVIIa。
实施例I-31.如实施例I-1至I-30中任一项的方法，其中皮下施用经修饰的FVIIa多次，直至出血停止或伤口愈合或出血得到矫治。
实施例I-32.如实施例I-1至I-31中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次剂量为约10μg/kg至500μg/kg、或15μg/kg至400μg/kg、或15μg/kg至350μg/kg、或20μg/kg至400μg/kg、或20mg/kg至350μg/kg、或30μg/kg至350μg/kg、或25μg/kg至350μg/kg。
实施例I-33.如实施例I-1至I-32中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为60-120μg/kg。
实施例I-34.如实施例I-1至I-33中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为10至500μg/kg、30至300μg/kg或60至120μg/kg。
实施例I-35.如实施例I-1至I-34中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的单次剂量为每剂量约10μg/kg至500μg/kg、或15μg/kg至400μg/kg、或15μg/kg至350μg/kg、或20μg/kg至400μg/kg、或20mg/kg至350μg/kg、或30μg/kg至350μg/kg、或25μg/kg至350μg/kg。
实施例I-36.如实施例I-1至I-35中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的单次皮下剂量的体积为10mL或更小或5mL或更小。
实施例I-37.如实施例I-1至I-36中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的单次皮下剂量的体积为1mL至2mL、或1.25mL至1.5mL、或1mL至10mL。
实施例I-38.如实施例I-1至I-37中任一项的方法，其进一步包含施用额外的凝血剂治疗或因子。
实施例I-39.如实施例I-1至I-38中任一项的方法，其中治疗包含施用抗体艾美赛珠单抗-kxwh和/或因子VIII抑制剂旁路活性产品。
实施例I-40.如实施例I-39的方法，其中额外凝血因子选自以下中的一个或多个：血浆纯化或重组凝血因子、促凝血剂(例如维生素K、维生素K衍生物和蛋白C抑制剂)、血浆、血小板、红血球和皮质类固醇。
实施例I-41.如实施例I-1至I-40中任一项的方法，其中受试者患有血友病。
实施例I-42.如实施例I-1至I-40中任一项的方法，其中受试者患有选自以下的疾病或病状：凝血障碍、血液病症、出血性异常、血友病和其他出血病症。
实施例I-43.如实施例I-1至I-40中任一项的方法，其中受试者患有A型血友病、B型血友病、具有抑制剂的A型血友病、具有抑制剂的B型血友病、因子VII缺陷、格兰茨曼氏血小板无力症、后天性血友病或采取抗凝血剂疗法。
实施例I-44.如实施例I-41的方法，其中受试者患有血友病；且血友病选自以下之中：A型血友病、B型血友病和C型血友病、具有抑制剂的A型血友病和具有抑制剂的B型血友病。
实施例I-45.如实施例I-41的方法，其中血友病为先天性的。
实施例I-46.如实施例I-41的方法，其中血友病为后天性的。
实施例I-47.如实施例I-41的方法，其中受试者具有针对因子VIII或因子IX的自体抗体。
实施例I-48.如实施例I-1至I-47中任一项的方法，其中受试者已接受口服抗凝血剂疗法。
实施例I-49.如实施例I-48的方法，其中口服抗凝血剂疗法包含以下中的一个或多个：肝素、达比加群、利伐沙班、阿派沙班、贝米肝素、那屈肝素、瑞肝素、依诺肝素、帕肝素、舍托肝素、达肝素和亭扎肝素。
实施例I-50.如实施例I-1至I-49中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的效能大于SEQ ID NO:3的FVIIa。
实施例I-51.如实施例I-1至I-49中任一项的方法，其中在无组织因子存在下，与SEQ ID NO:3的野生型FVIIa相比，经修饰的FVIIa具有增加的凝血活性。
实施例I-52.如实施例I-1至I-49中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa在组织因子存在下具有增加的凝血活性。
实施例I-53.如实施例I-1至I-52中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa在组织因子依赖性分析中具有大于100％、150％、200％或250％或大于在相同分析中未经修饰的FVIIa(SEQ ID NO:3)的kcat/km。
实施例I-54.如实施例I-1至I-53中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa具有凝血活性，其为在相同分析中SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa的活性的至少1.5倍。
实施例I-55.如实施例I-1至I-54中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的效能为SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa的效能的至少3倍。
实施例I-56.如实施例I-1至I-55中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的效能为SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa的效能的至少4倍。
实施例I-57.如实施例I-1至I-56中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的效能为SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa的效能的至少5倍。
实施例I-58.如实施例I-1至I-57中任一项的方法，其中如通过活化部分凝血活酶时间(aPTT)和/或血栓弹力图(TEG)或任何评定凝血酶产生的分析所评定，FVIIa具有增加的效能。
实施例I-59.如实施例I-1至I-58中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽的凝血活性为SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa多肽的凝血活性的至少110％、150％、200％、250％、300％、400％、500％或更多。
实施例I-60.如实施例I-1至I-59中任一项的方法，其中与未经修饰的FVIIa相比，经修饰的FVIIa具有增加的血清半衰期或增加的末端消除半衰期。
实施例I-61.如实施例I-1至I-60中任一项的方法，其中：
经修饰的FVIIa多肽在对应于具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVIIa多肽中包含对应于位置286和298的位置处的氨基酸置换；
位置286处的氨基酸置换为Arg(R)，且位置298处的氨基酸置换为Gln(Q)；
经修饰的FVIIa多肽在呈活化形式时呈现促凝血活性；和
经修饰的FVIIa多肽的氨基酸序列与具有SEQ ID NO:1-3中的任一者中所阐述的氨基酸序列的多肽具有至少90％序列一致性。
实施例I-62.如实施例I-1至I-61中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽包含关于SEQ ID NO:3的氨基酸置换Q286R/M298Q。
实施例I-63.如实施例I-1至I-62中任一项的方法，其中：
经修饰的FVIIa多肽在对应于具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVIIa多肽中包含对应于位置286的位置处的氨基酸置换；
位置286处的氨基酸置换为Arg(R)；
经修饰的FVIIa多肽在呈活化形式时呈现大于具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列的FVIIa多肽的促凝血活性；和
与具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的多肽相比，经修饰的FVIIa多肽包含至多总计2、3、4、5、6或7个氨基酸置换、插入或缺失。
实施例I-64.如实施例I-1至I-62中任一项的方法，其中：
经修饰的FVIIa多肽在对应于具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVIIa多肽中包含对应于位置286和298的位置处的氨基酸置换；
位置286处的氨基酸置换为Arg(R)，且位置298处的氨基酸置换为Gln(Q)；
经修饰的FVIIa多肽在呈活化形式时呈现促凝血活性；和
与具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的多肽相比，经修饰的FVIIa多肽包含至多总计2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸置换、插入或缺失。
实施例I-65.如实施例I-1至I-64中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽在SEQID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVIIa多肽中包含对应于位置128、129、286和298的位置处的氨基酸置换，其中：
对应于位置128的位置处的氨基酸置换为Asn(N)，位置129为Ala(A)，位置286为Arg(R)，且位置298为Gln(Q)；
未经修饰的FVIIa多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO.3的多肽；
经修饰的FVIIa多肽中的对应位置通过经修饰的FVIIa多肽的氨基酸序列与SEQID NO:3中所阐述的氨基酸序列的比对来鉴别；和
经修饰的FVIIa多肽在呈其活化形式时呈现大于SEQ ID NO:3的FVIIa多肽的促凝血活性。
实施例I-66.如实施例I-1至I-65中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽包含一种或多种修饰，所述一种或多种修饰添加一个或多个糖基化位点。
实施例I-67.如实施例I-66的方法，其中添加一个或多个糖基化位点的修饰通过选自以下的氨基酸置换引入：关于SEQ ID NO:3的T128N/P129A、E394N/P395A/R396S、G318N、K109N、A122N/G124S、A51N、T130N/E132S、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、S119N/L121S、K109N/A175S、S119N/L121S/A175S、T128N/P129A/A175S和A122N/G124S/A175S。
实施例I-68.如实施例I-66的方法，其中糖基化位点通过选自以下的修饰引入：关于SEQ ID NO:3的S52A、S60A、E394N/P395A/R396S、R202S、A292N/A294S、G318N、A175S、K109N、A122N/G124S、A51N、T130N/E132S、A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、A122N/G124S/394N/P395A/R396S/G318N、S52A/S60A、S52N/P54S、S119N/L121S、T128N/P129A、Q66N/Y68S、S52N/P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R396S、K109N/A292N/A294S、K109N/A175S、S119N/L121S/A175S、T128N/P129A/A175S和A122N/G124S/A175S。
实施例I-69.如实施例I-1至I-66中任一项的方法，其中糖基化位点通过修饰A122N/G124S引入。
实施例I-70.如实施例I-1至I-69中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa包含选自以下的修饰：关于SEQ ID NO:3的Q286R、Q286R/H257A、Q286R/S222A、Q286R/S222A/H257A、Q286R/S222A/Gla交换FIX、Q286R/H257A/Gla交换FIX、Q286R/S222A/H257A/Gla交换FIX、Q286R/Q366V、A175S/Q286R/Q366V、S222A/Q286R/Q366V、H257S/Q286R、H257S/Q286R/Q366V、S222A/H257A/Q286R/Q366V、Q286R/H373A、Q286R/K341D、Q286R/Q366D、Q286R/Q366N、Q286R/H373F、S52A/S60A/Q286R、S52A/S60A/Q286R/H373F、T239V/Q286R、T239V/Q286R/H373F、T239I/Q286R/H373F和A122N/G124S/A175S/Q286R。
实施例I-71.如实施例I-1至I-70中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa包含与SEQID NO:3中选自以下中的任一者的位置对应的位置处的氨基酸置换：51、52、54、60、66、68、109、119、122、124、130、132、158、161、175、196、197、199、202、216、222、237、239、257、287、290、292、294、296、298、305、314、318、321、337、341、366、373、374、394、395和396。
实施例I-72.如实施例I-1至I-71中任一项的方法，其中FVIIa多肽包含关于SEQID NO:3置换T128N/P129A/Q286R/M298Q。
实施例I-73.如实施例I-1至I-72中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽包含选自对应于T239V、Q366N和H373F的置换中的额外氨基酸置换。
实施例I-74.如实施例I-1至I-73中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽包含SEQ ID NO:138、155、280、288、337、338、356和367中的任一者中所阐述的氨基酸序列。
实施例I-75.如实施例I-74的方法，其中经修饰的FVIIa多肽的一级序列由SEQ IDNO:280中所阐述的序列组成。
实施例I-76.如实施例I-1至I-73中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽为由SEQ ID NO:280的氨基酸序列组成的双链活化因子VII(FVIIa)多肽，其在位置152处的精氨酸与位置153处的异亮氨酸之间裂解。
实施例I-77.如实施例I-76的方法，其中第一链和第二链通过至少一个二硫桥键连接。
实施例I-78.如实施例I-1至I-77中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽与SEQID NO:280具有至少90％氨基酸序列一致性，其中对应于SEQ ID NO:280的位置128、129、286和298的氨基酸不变。
实施例I-79.如实施例I-1至I-77中任一项的方法，其中双链多肽的第一链和第二链分别由SEQ ID NO:280的氨基酸1-152和153-406组成。
实施例I-80.如实施例I-1至I-74中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽包含选自对应于以下的置换中的氨基酸置换：关于SEQ ID NO:3的Q286R/M298Q/Q366N、T128N/P129A/Q286R/M298Q、V158D/Q286R/E296V/M298Q、S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q、A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N、V158D/Q286R/E296V/M298Q和T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q。
实施例I-81.如实施例I-1至I-74中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽在FVIIa多肽中包含选自以下中的修饰：关于SEQ ID NO:3的Q286R/Gla交换FIX、Q286R/H257A、Q286R/S222A、Q286R/S222A/H257、Q286R/S222A/Gla交换FIX、Q286R/H257A/Gla交换FIX、Q286R/S222A/H257A/Gla交换FIX、Q286R/M298Q、Q286R/M298Q/K341Q、Q286R/M298Q/K199E、Q286R/M298Q/Gla交换FIX、Q286R/Q366V、Q286R/A292N/A294S/Q366V、A175S/Q286R/Q366V、S222A/Q286R/Q366V、H257S/Q286R、H257S/Q286R/Q366V、S222A/H257A/Q286R/Q366V、Q286R/H373A、S222A/H257A/Q286R/M298Q、V158D/E296V/M298Q、{Gla交换FIX/E40L}/Q286R/M298Q、{Gla交换FIX/K43I}/Q286R/M298Q、{Gla交换FIX/Q44S}/Q286R/M298Q、{Gla交换FIX/M19K}/Q286R/M298Q、{Gla交换FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R、T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q、Gla交换FIX/T128N/P129A/S222A/Q286R、Gla交换FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F、S52A/S60A/Q286R、Gla交换FIX/S52A/S60A/S222A/Q286R、S52A/S60A/Q286R/M298Q、Gla交换FIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q、S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q、S52A/S60A/Q286R/H373F/、S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F、T239V/Q286R、Gla交换FIX/S222A/T239V/Q286R、T239V/Q286R/M298Q、S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q、Gla交换FIX/T239V/Q286R/M298Q、T239V/Q286R/H373F、T239V/Q286R/M298Q/H373F、T239I/Q286R、Gla交换FIX/S222A/T239I/Q286R、T239I/Q286R/M298Q、S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q、Gla交换FIX/T239I/Q286R/M298Q、T239I/Q286R/H373F、T239I/Q286R/M298Q/H373F、Gla交换FIX/S222A/Q286R/H373F、Gla交换FIX/S222A/Q286R/M298Q、Gla交换FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F、V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F、H257A/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/M298Q、Gla交换FIX/S222A/H257S/Q286R/、S222A/H257S/Q286R/M298Q、H257S/Q286R/M298Q/H373F、S222A/Q286R/M298Q/H373F、S222A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/Q286R、A122N/G124S/A175S/Q286R、Gla交换FIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R、Gla交换FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q、A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F、A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F、{Gla交换FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N、{Gla交换FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N、{Gla交换FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N、V158D/Q286R/E296V/M298Q、T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F、T239V/Q286R/M298Q/Q366N、T239I/Q286R/M298Q/Q366N、T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q、T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q、T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F、T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q和T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F。
实施例I-82.如实施例I-1至I-74中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa包含一种或多种选自以下中的氨基酸修饰：关于SEQ ID NO:3的S279C/V302C、L280C/N301C、V281C/V302C、S282C/V299C、在位置4处插入酪氨酸、F4S、F4T、P10Q、P10E、P10D、P10N、Q21N、R28F、R28E、I30C、I30D、I30E、K32D、K32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32C、K32A、K32S、D33C、D33F、D33E、D33K、A34C、A34E、A34D、A34I、A34L、A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、T37C、T37D、T37E、K38C、K38E、K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、L39E、L39Q、L39H、W41N、W41C、W41E、W41D、I42R、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42K、S43Q、S43N、Y44K、Y44C、Y44D、Y44E、S45C、S45D、S45E、D46C、A51N、S53N、G58N、G59S、G59T、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、L65N、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、E82S、E82T T83K、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、E116D、G117N、G124N、S126N、T128N、L141C、L141D、L141E、E142D、E142C、K143C、K143D、K143E、R144E、R144C、R144D、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N145I、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q、N145E、N145R、N145W、N145D、N145C、K157V、K157L、K157I、K157M、K157F、K157W、K157P、K157G、K157S、K157T、K157C、K157Y、K157N、K157E、K157R、K157H、K157D、K157Q、V158L、V158I、V158M、V158F、V158W、V158P、V158G、V158S、V158T、V158C、V158Y、V158N、V158E、V158R、V158K、V158H、V158D、V158Q、A175S、A175T、G179N、I186S、I186T、V188N、R202S、R202T、I205S、I205T、D212N、E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、Q250C、V253N、E265N、T267N、E270N、A274M、A274L、A274K、A274R、A274D、A274V、A274I、A274F、A274W、A274P、A274G、A274T、A274C、A274Y、A274N、A274E、A274H、A274S、A274Q、F275H、R277N、F278S、F278A.F278N、F278Q、F278G、L280N、L288K、L288C、L288D、D289C、D289K、L288E、R290C、R290G、R290A、R290S、R290T、R290K、R290D、R290E、G291E、G291D、G291C、G291N、G291K、A292C、A292K、A292D、A292E、T293K、E296V、E296L、E296I、E296M、E296F、E296W、E296P、E296G、E296S、E296T、E296C、E296Y、E296N、E296K、E296R、E296H、E296D、E296Q、M298Q、M298V、M298L、M298I、M298F、M298W、M298P、M298G、M298S、M298T、M298C、M298Y、M298N、M298K、M298R、M298H、M298E、M298D、P303S、P303T、R304Y、R304F、R304L、R304M、R304G、R304T、R304A、R304S、R304N、L305V、L305Y、L305I、L305F、L305A、L305M、L305W、L305P、L305G、L305S、L305T、L305C、L305N、L305E、L305K、L305R、L305H、L305D、L305Q、M306D、M306N、D309S、D309T、Q312N、Q313K、Q313D、Q313E、S314A、S314V、S314I、S314M、S314F、S314W、S314P、S314G、S314L、S314T、S314C、S314Y、S314N、S314E、S314K、S314R、S314H、S314D、S314Q、R315K、R315G、R315A、R315S、R315T、R315Q、R315C、R315D、R315E、K316D、K316C、K316E、V317C、V317K、V317D、V317E、G318N、N322Y、N322G、N322F、N322M、N322S、N322I、N322L、N322T、N322V、N322P、N322K、N322H、N322Q、N322E、N322R、N322W、N322C、G331N、Y332S、Y332A、Y332N、Y332Q、Y332G、D334G、D334E、D334A、D334V、D334I、D334M、D334F、D334W、D334P、D334L、D334T、D334C、D334Y、D334N、D334K、D334R、D334H、D334S、D334Q、S336G、S336E、S336A、S336V、S336I、S336M、S336F、S336W、S336P、S336L、S336T、S336C、S336Y、S336N、S336K、S336R、S336H、S336D、S336Q、K337L、K337V、K337I、K337M、K337F、K337W、K337P、K337G、K337S、K337T、K337C、K337Y、K337N、K337E、K337R、K337H、K337D、K337Q、K341E、K341Q、K341G、K341T、K341A、K341S、G342N、H348N、R353N、Y357N、I361N、F374P、F374A、F374V、F374I、F374L、F374M、F374W、F374G、F374S、F374T、F374C、F374Y、F374N、F374E、F374K、F374R、F374H、F374D、F374Q、V376N、R379N、L390C、L390K、L390D、L390E、M391D、M391C、M391K、M391N、M391E、R392C、R392D、R392E、S393D、S393C、S393K、S393E、E394K、P395K、E394C、P395D、P395C、P395E、R396K、R396C、R396D、R396E、P397D、P397K、P397C、P397E、G398K、G398C、G398D、G398E、V399C、V399D、V399K、V399E、L400K、L401K、L401C、L401D、L401E、R402D、R402C、R402K、R402E、A403K、A403C、A403D、A403E、P404E、P404D、P404C、P404K、F405K、P406C、K32N/A34S、K32N/A34T、F31N/D33S、F31N/D33T、I30N/K32S、I30N/K32T、A34N/R36S、A34N/R36T、K38N/F40S、K38N/F40T、T37N/L39S、T37N/L39T、R36N/K38S、R36N/K38T、L39N/W41S、L39N/W41T、F40N/I42S、F40N/I42T、I42N/Y44S、I42N/Y44T、Y44N/D46S、Y44N/D46T、D46N/D48S、D46N/D48T、G47N/Q49S、G47N/Q49T、K143N/N145S、K143N/N145T、E142N/R144S、E142N/R144T、L141N/K143S、L141N/K143T、I140N/E142S、I140N/E142T、R144N/A146S、R144N/A146T、A146N/K148S、A146N/K148T、S147N/P149S/、S147N/P149T、R290N/A292S、R290N/A292T、D289N/G291S、D289N/G291T、L288N/R290S、L288N/R290T、L287N/D289S、L287N/D289T、A292N/A294S、A292N/A294T、T293N/L295S、T293N/L295T、R315N/V317S、R315N/V317T、S314N/K316S、S314N/K316T、Q313N/R315S、Q313N/R315T、K316N/G318S、K316N/G318T、V317N/D319S、V317N/D319T、K341N/D343S、K341N/D343T、S339N/K341S、S339N/K341T、D343N/G345S、D343N/G345T、R392N/E394S、R392N/E394T、L390N/R392S、L390N/R392T、K389N/M391S、K389N/M391T、S393N/P395S、S393N/P395T、E394N/R396S、E394N/R396T、P395N/P397S、P395N/P397T、R396N/G398S、R396N/G398T、P397N/V399S、P397N/V399T、G398N/L400S、G398N/L400T、V399N/L401S、V399N/L401T、L400N/R402S、L400N/R402T、L401N/A403S、L401N/A403T、R402N/P404S、R402N/P404T、A403N/F405S、A403N/F405T、P404N/P406S和P404N/P406T。
实施例I-83.如实施例I-1至I-82中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽包含一种或多种选自以下的修饰：关于SEQ ID NO:3的D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、R290M、R290V、K341E、K341R、K341Q、K341N、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA、K197I198insS、T239S、T239N、T239Q、T239V、T239L、T239H、T239I、L287T、P321K、P321E、P321Y、P321S、Q366D、Q366E、Q366N、Q366T、Q366S、Q366V、Q366I、Q366L、Q366M、H373D、H373E、H373S、H373F、H373A、K161S、K161A、K161V、H216S、H216A、H216K、H216R、S222A、S222K、S222V、S222N、S222E、S222D、H257A、H257S、Gla交换FIX、{Gla交换FIX/E40L}、{Gla交换FIX/K43I}、{Gla交换FIX/Q44S}、{Gla交换FIX/M19K}、{Gla交换FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}、Gla交换FX、Gla交换Prot C、Gla交换Prot S、Gla交换凝血酶、S52A、S60A、E394N、P395A、R396S、R202S、A292N、A294S、G318N、A175S、K109N、A122N、G124S、A51N、T130N、E132S、S52N、P54S、S119N、L121S、T128N、P129A、Q66N、Y68S、S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF、S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE、H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE、T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE、S103S111delinsDICLPRWGCLWED、H115S126delinsDICLPRWGCLWED、T128P134delinsDICLPRWGCLWED、P406insIEDICLPRWGCLW、P406insGGGSIEDICLPRWGCLW、P406insDICLPRWGCLWED、P406insGGGSDICLPRWGCLWED、S103S111delinsSFGRGDIRNV、H115S126delinsSFGRGDIRNV、T127P134delinsSFGRGDIRNV、P406insCSFGRGDIRNVC、P406insGGGSCSFGRGDIRNVC、V158T、V158D、L287T、E296V、M298K和M298Q。
实施例I-84.如实施例I-1至I-83中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽包含一种或多种氨基酸修饰，所述一种或多种氨基酸修饰提高对抗凝血酶III的抗性，提高与磷脂的结合和/或亲和力，提高对于组织因子的亲和力，提高内在活性、提高TF依赖性活性，提高凝血活性、改变多肽的构形以改变酶原性，通过使高度活性FVIIa构形与较低活性FVIIa构形之间的平衡偏移以有利于所述高度活性构形来增加催化或凝血活性，增加对蛋白酶的抗性，降低糖基化，增加糖基化，降低免疫原性，增加稳定性和/或促进化学基团键联。
实施例I-85.如实施例I-1至I-84中任一项的方法，其中未经修饰的FVIIa多肽的一级序列包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列。
实施例I-86.如实施例I-1至I-84中任一项的方法，其中未经修饰的FVIIa多肽的一级序列由SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列组成。
实施例I-87.如实施例I-1至I-86中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽经转译后修饰。
实施例I-88.如实施例I-87的方法，其中转译后修饰包含糖基化。
实施例I-89.如实施例I-88的方法，其中转译后修饰为O连接的糖基化。
实施例I-90.如实施例I-88或I-89中任一项的方法，其中转译后修饰为N连接的糖基化。
实施例I-91.如实施例I-87至I-90中任一项的方法，其中转译后修饰为谷氨酸羧化成γ-羧基谷氨酸。
实施例I-92.如实施例I-87至I-91中任一项的方法，其中转译后修饰为天冬氨酸羟基化成β-羟基天冬氨酸。
实施例I-93.如实施例I-1至I-92中任一项的方法，其中FVIIa多肽的修饰为氨基酸置换、插入、缺失或其组合。
实施例I-94.一种用于单次剂量皮下施用的医药组合物，其在医药学上可接受的载体中包含单次治疗有效剂量的经修饰的FVIIa，用于皮下施用以用于按需求治疗出血。
实施例I-95.如实施例I-94的医药组合物，其中经修饰的FVIIa如实施例I-1至I-93中的任一者中所描述。
实施例I-96.如实施例I-94或I-95中任一项的医药组合物，其用于如实施例I-1至I-93中任一项的方法中。
实施例I-97.如实施例I-94至I-96中任一项的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在1ml至10ml的体积下为100μg至35mg。
实施例I-98.如实施例I-94至I-97中任一项的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在1ml至10ml的体积下为500μg至25mg。
实施例I-99.如实施例I-94至I-98中任一项的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在0.1ml至10ml的体积下为50μg至40mg。
实施例I-100.如实施例I-94至I-98中任一项的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在0.5ml至10ml的体积下为1mg至10、15、20或25mg。
实施例I-101.如实施例I-94至I-100中任一项的医药组合物，其体积为1ml至5ml，或1ml至3ml，或1ml至1.5ml。
实施例I-102.一种容器，其包含如实施例I-94至I-101中任一项的医药组合物。
实施例I-103.如实施例I-102的容器，其为注射器或注射笔。
实施例I-104.如实施例I-102或I-103的容器，其中医药组合物经冻干。
实施例I-105.如实施例I-102至I-104中任一项的容器，其包含两个腔室，其中一个腔室含有冻干组合物；且另一腔室包含用于溶解冻干组合物的媒剂。
实施例I-106.一种治疗受试者的出血的方法，其包含皮下施用如实施例I-94至I-101中任一项的医药组合物。
实施例I-107.如实施例I-106的方法，其中组合物在出血的1、2、或3小时内或15分钟内施用。
实施例I-108.一种用于在出血之前或之后4、3、2、或1小时或更短时间内通过皮下施用治疗出血的经修饰的FVIIa，其中与具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列的未经修饰的FVIIa相比，经修饰的FVIIa具有较大凝血活性或效能。
实施例I-109.如实施例I-1至I-93中任一项中所描述的经修饰的FVIIa。
实施例I-110.如供用于实施例I-1至I-93、I-106和I-107中的任一者的方法中的经修饰的FVIIa。
实施例I-111.如实施例I-61的方法，其中经修饰的FVIIa包含SEQ ID NO:280或SEQ ID NO:138中所阐述的氨基酸序列。
实施例I-112.如实施例I-1至I-93、I-106、I-107和I-111中任一项的方法，其中与静脉内施用经修饰的FVIIa相比，皮下施用经修饰的FVIIa具有增加的末端消除半衰期。
实施例I-113.如实施例I-112的方法，其中经修饰的FVIIa包含SEQ ID NO:280中所阐述的氨基酸序列。
实施例I-114.如实施例I-112的方法，其中经修饰的FVIIa包含SEQ ID NO:138中所阐述的氨基酸序列。
实施例I-115.一种治疗有需要受试者的出血病症的方法，其包含向受试者皮下施用一定剂量的经修饰的因子VIIa(FVIIa)，
其中经修饰的FVIIa具有大于未经修饰的FVIIa的活性或效能，如SEQ ID NO:3中所阐述；和
其中在多次给药方案中施用一定剂量的经修饰的FVIIa。
实施例I-116.如实施例I-115的方法，其中多次给药方案在24小时时段内包含至少两次或至少三次剂量。
实施例I-117.如实施例I-116的方法，其中多次给药方案的至少一次剂量包含每公斤受试者体重约30、约60、约90或约120μg。
实施例I-118.如实施例I-116至I-117中任一项的方法，其中多次给药方案的各剂量为相同的。
实施例I-119.如实施例I-116至I-118中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa包含SEQ ID NO:280中所阐述的氨基酸序列。
实施例II-1.一种治疗受试者的出血事件的方法，其包含向受试者皮下施用一定剂量的经修饰的因子VIIa，所述经修饰的因子VIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中：
位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；
位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；
皮下施用经修饰的FVIIa具有增加的活性或效能；且
在出血事件之前和/或之后约5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa，从而减少或停止出血量或矫治或治愈出血的病因。
实施例II-2.如实施例II-1的方法，经修饰的FVIIa在具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中进一步包含对应于位置128的位置处的修饰，其中：
位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换。
实施例II-3.如实施例II-1至II-2中任一项的方法，经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置129的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中：
位置129处的修饰为Ala(A)。
实施例II-4.如实施例II-1至II-3中任一项的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之后约5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用。
实施例II-5.如实施例II-1至II-3中任一项的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之前约5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用。
实施例II-6.如实施例II-5的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之前约5小时内皮下施用。
实施例II-7.如实施例II-5的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之前约4小时内皮下施用。
实施例II-8.如实施例II-5的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之前约3小时内皮下施用。
实施例II-9.如实施例II-5的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之前约2小时内皮下施用。
实施例II-10.如实施例II-5的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之前约1小时内皮下施用。
实施例II-11.如实施例II-4的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之后约5小时内皮下施用。
实施例II-12.如实施例II-4的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之后约4小时内皮下施用。
实施例II-13.如实施例II-4的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之后约3小时内皮下施用。
实施例II-14.如实施例II-4的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之后约2小时内皮下施用。
实施例II-15.如实施例II-4的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之后约1小时内皮下施用。
实施例II-16.如实施例II-5的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之前约5分钟内皮下施用。
实施例II-17.如实施例II-5的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之前约4分钟内皮下施用。
实施例II-18.如实施例II-5的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之前约3分钟内皮下施用。
实施例II-19.如实施例II-5的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之前约2分钟内皮下施用。
实施例II-20.如实施例II-5的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之前约1分钟内皮下施用。
实施例II-21.如实施例II-4的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之后约5分钟内皮下施用。
实施例II-22.如实施例II-4的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之后约4分钟内皮下施用。
实施例II-23.如实施例II-4的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之后约3分钟内皮下施用。
实施例II-24.如实施例II-4的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之后约2分钟内皮下施用。
实施例II-25.如实施例II-4的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa在出血事件之后约1分钟内皮下施用。
实施例II-26.如实施例II-1至II-25中任一项的方法，其中每3-7、2-5、4-6或4-12小时皮下施用重复皮下剂量的经修饰的FVIIa直至出血停止、所述病因得到矫治、或任何伤口经治愈或持续1至2、3、4或5天。
实施例II-27.如实施例II-1至II-25中任一项的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时施用。
实施例II-28.如实施例II-1至II-27中任一项的方法，其中：
出血为间歇性或可由受试者预测的；和
在出血开始之前，用一定皮下剂量的经修饰的FVIIa治疗受试者。
实施例II-29.如实施例II-1至II-27中任一项的方法，其中：
出血事件由创伤或损伤引起；和
在出血事件之后15分钟、1、2、3或4小时，用一定皮下剂量的经修饰的FVIIa治疗受试者。
实施例II-30.如实施例II-1至II-29中任一项的方法，其中：
受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；
在手术之前5、4、3、2、1小时或更短时间皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa；
在手术期间用FVIIa经静脉内治疗受试者；和
在手术之后至少一次皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa直至不存在出血和/或出血风险，或直至受试者经治愈或所述病因得到矫治。
实施例II-31.如实施例II-1至II-29中任一项的方法，其中：
受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；
在手术之前至少4小时、或3小时、或2小时、或1小时向受试者施用一定剂量的经修饰的FVIIa；
在手术之后2至3小时皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa；
经修饰的FVIIa任选的在另外2至3小时之后再次施用；且
其后一天一次或两次施用经修饰的FVIIa，直至受试者经治愈或出血的病因得到矫治。
实施例II-32.如实施例II-1至II-29中任一项的方法，其中：
受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；和
在手术之后每4至6小时皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa直至出血停止或受试者经治愈或出血的病因得到矫治。
实施例II-33.如实施例II-1至II-29中任一项的方法，其中出血是由于手术或创伤。
实施例II-34.如实施例II-1至II-33中任一项的方法，其中出血表现为急性关节血肿、单一关节血肿、慢性嗜血性关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠出血、气道出血、口腔出血、自发性出血、关节出血、脑出血或突破性出血。
实施例II-35.如实施例II-1至II-33中任一项的方法，其中出血是由于拔牙或牙龈出血。
实施例II-36.如实施例II-1至II-33中任一项的方法，其中出血为手术出血。
实施例II-37.如实施例II-1至II-33中任一项的方法，其中：
出血为手术出血；且
手术为关节手术、肢体手术、心脏手术、血管成形术、上呼吸道手术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、关节置换术、血管手术、牙科手术或器官移植手术。
实施例II-38.如实施例II-36的方法，其中手术为选自骨髓、心脏、肺、胰脏和肝脏移植的移植手术。
实施例II-39.如实施例II-36的方法，其中手术为髋关节或膝关节置换术或关节固定术。
实施例II-40.如实施例II-1至II-39中任一项的方法，其中出血为急性的且由创伤或手术引起，或间歇性出血为月经出血或关节出血或目标关节出血或经治愈或矫治的手术伤口。
实施例II-41.如实施例II-40的方法，其中施用为每2-4小时或3-6小时或4-6小时。
实施例II-42.如实施例II-1至II-41中任一项的方法，其中：
出血为间歇性或可预测的；和
受试者在出血之前经预治疗。
实施例II-43.如实施例II-42的方法，其中在出血之前约4小时或更短时间实现预治疗。
实施例II-44.如实施例II-43的方法，其中在出血之前约3小时或更短时间，或2小时或更短时间，或1小时或更短时间实现预治疗。
实施例II-45.如实施例II-43的方法，其中在出血之前至少15分钟实现预治疗。
实施例II-46.如实施例II-1至II-45中任一项的方法，其中出血为手术的结果。
实施例II-47.如实施例II-1至II-45中任一项的方法，其中出血为创伤或损伤的结果。
实施例II-48.如实施例II-1至II-45中任一项的方法，其中出血来自伤口。
实施例II-49.如实施例II-1至II-45中任一项的方法，其中出血为月经出血或为关节出血。
实施例II-50.如实施例II-1至II-49中任一项的方法，其中施用经修饰的FVIIa多次，直至出血停止或任何伤口经治愈或出血得到矫治。
实施例II-51.如实施例II-1至II-50中任一项的方法，其中一次或多次剂量的经修饰的FVIIa在出血之前皮下施用。
实施例II-52.如实施例II-1至II-51中任一项的方法，其中一次或多次剂量的经修饰的FVIIa在出血开始之后皮下施用。
实施例II-53.如实施例II-1至II-52中任一项的方法，其中在出血开始1分钟至2小时内施用一定剂量的经修饰的FVIIa。
实施例II-54.如实施例II-1至II-53中任一项的方法，其中皮下施用经修饰的FVIIa多次，直至出血停止或伤口愈合或出血得到矫治。
实施例II-55.如实施例II-1至II-54中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次剂量为约10μg/kg至30μg/kg、10μg/kg至60μg/kg、10μg/kg至90μg/kg、10μg/kg至120μg/kg、30μg/kg至60μg/kg、30μg/kg至90μg/kg、30μg/kg至120μg/kg、10μg/kg至500μg/kg、或15μg/kg至400μg/kg、或15μg/kg至350μg/kg、或20μg/kg至400μg/kg、或20μg/kg至350μg/kg、或30μg/kg至350μg/kg、或25μg/kg至350μg/kg。
实施例II-56.如实施例II-1至II-55中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约60至约120μg/kg。
实施例II-57.如实施例II-1至II-56中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约60μg/kg。
实施例II-58.如实施例II-1至II-56中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为10至500μg/kg、30至300μg/kg或60至120μg/kg。
实施例II-59.如实施例II-1至II-57中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的单次剂量为每剂量约10μg/kg至500μg/kg、或15μg/kg至400μg/kg、或15μg/kg至350μg/kg、或20μg/kg至400μg/kg、或20mg/kg至350μg/kg、或30μg/kg至350μg/kg、或25μg/kg至350μg/kg。
实施例II-60.如实施例II-1至II-59中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的单次皮下剂量的体积为10mL或更小或5mL或更小。
实施例II-61.如实施例II-1至II-60中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的单次皮下剂量的体积为约1mL至2mL、或1.25mL至1.5mL、或1mL至10mL。
实施例II-62.如实施例II-1至II-61中任一项的方法，其进一步包含施用额外的凝血剂治疗或因子。
实施例II-63.如实施例II-1至II-62中任一项的方法，其中治疗包含施用抗体艾美赛珠单抗(emicizumab)-kxwh和/或因子VIII抑制剂旁路活性产品。
实施例II-64.如实施例II-63的方法，其中额外凝血因子选自以下中的一个或多个：血浆纯化或重组凝血因子、促凝血剂(例如维生素K、维生素K衍生物和蛋白C抑制剂)、血浆、血小板、红血球和皮质类固醇。
实施例II-65.如实施例II-1至II-64中任一项的方法，其进一步包含施用抗组织因子路径抑制剂(TFPI)抗体。
实施例II-66.如实施例II-65的方法，其中抗TFPI抗体为康次珠单抗。
实施例II-67.如实施例II-1至II-66中任一项的方法，其进一步包含施用靶向抗凝血酶(AT)的RNA干扰(RNAi)治疗剂。
实施例II-68.如实施例II-67的方法，其中靶向AT的RNAi治疗剂为菲图司兰。
实施例II-69.如实施例II-1至II-68中任一项的方法，其中受试者患有选自以下中的疾病或病状：凝血障碍、血液病症、出血性异常、血友病和其他出血病症。
实施例II-70.如实施例II-1至II-69中任一项的方法，其中受试者患有A型血友病、B型血友病、具有抑制剂的A型血友病、具有抑制剂的B型血友病、因子VII缺陷、格兰茨曼氏血小板无力症、后天性血友病或采取抗凝血剂疗法。
实施例II-71.如实施例II-1至II-70中任一项的方法，其中受试者患有血友病；且血友病选自以下之中：A型血友病、B型血友病和C型血友病、具有抑制剂的A型血友病和具有抑制剂的B型血友病。
实施例II-72.如实施例II-71的方法，其中血友病为先天性的。
实施例II-73.如实施例II-71的方法，其中血友病为后天性的。
实施例II-74.如实施例II-71至II-73中任一项的方法，其中受试者具有针对因子VIII或因子IX的自体抗体。
实施例II-75.如实施例II-71至II-74中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约60μg/kg至约120μg/kg。
实施例II-76.如实施例II-71至II-75中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约60μg/kg。
实施例II-77.如实施例II-71至II-75中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约120μg/kg。
实施例II-78.如实施例II-70的方法，其中受试者患有因子VII缺陷。
实施例II-79.如实施例II-78的方法，其中以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约10至约20μg/kg。
实施例II-80.如实施例II-78至II-79中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约10μg/kg。
实施例II-81.如实施例II-78至II-79中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约20μg/kg。
实施例II-82.如实施例II-1至II-81中任一项的方法，其中受试者已接受口服抗凝血剂疗法。
实施例II-83.如实施例II-82的方法，其中口服抗凝血剂疗法包含以下中的一个或多个：肝素、达比加群、利伐沙班、阿派沙班、贝米肝素、那屈肝素、瑞肝素、依诺肝素、帕肝素、舍托肝素、达肝素和亭扎肝素。
实施例II-84.如实施例II-1至II-83中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的效能大于具有SEQ ID NO:3的FVIIa。
实施例II-85.如实施例II-1至II-84中任一项的方法，其中在无组织因子存在下，与SEQ ID NO:3的野生型FVIIa相比，经修饰的FVIIa具有增加的凝血活性。
实施例II-86.如实施例II-1至II-84中任一项的方法，其中在组织因子存在下，经修饰的FVIIa具有增加的凝血活性。
实施例II-87.如实施例II-1至II-86中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa在组织因子依赖性分析中具有大于100％、150％、200％或250％或大于在相同分析中未经修饰的FVIIa(SEQ ID NO:3)的kcat/km。
实施例II-88.如实施例II-1至II-87中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa具有凝血活性，其为在相同分析中SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa的活性的至少1.5倍。
实施例II-89.如实施例II-1至II-88中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的效能为SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa的至少3倍、或4倍、或5倍。
实施例II-90.如实施例II-1至II-89中任一项的方法，其中如通过活化部分凝血活酶时间(aPTT)和/或血栓弹力图(TEG)或任何评定凝血酶产生的分析所评定，FVIIa具有增加的效能。
实施例II-91.如实施例II-1至II-90中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽的凝血活性为SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa多肽的凝血活性的至少110％、150％、200％、250％、300％、400％、500％或更多。
实施例II-92.如实施例II-1至II-91中任一项的方法，其中与未经修饰的FVIIa相比，经修饰的FVIIa具有增加的血清半衰期或增加的末端消除半衰期。
实施例II-93.如实施例II-1至II-92中任一项的方法，其中与具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列的未经修饰的FVIIa相比，经修饰的FVIIa具有较大凝血活性或效能。
实施例II-94.如实施例II-1至II-93中任一项的方法，其中：
当呈活化形式时，经修饰的FVIIa多肽呈现促凝血活性。
实施例II-95.如实施例II-94的方法，其中：
促凝血活性大于具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列的FVIIa多肽的促凝血活性。
实施例II-96.如实施例II-1至II-95中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽为包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列或包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的双链活化因子VII(FVIIa)多肽，其在位置152处的精氨酸与位置153处的异亮氨酸之间裂解。
实施例II-97.如实施例II-96的方法，其中第一链与第二链通过至少一个二硫桥键连接。
实施例II-98.如实施例II-1至II-97中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽与SEQ ID NO:280具有至少90％氨基酸序列一致性，其中对应于SEQ ID NO:280的位置128、129、286和298的氨基酸为不变的。
实施例II-99.如实施例II-1至II-97中任一项的方法，其中双链多肽的第一链和第二链分别由SEQ ID NO:280的氨基酸1-152和153-406组成。
实施例II-100.如实施例II-1至II-99中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽包含一种或多种氨基酸修饰，所述一种或多种氨基酸修饰增加对抗凝血酶III的抗性，增加与磷脂的结合和/或对其的亲和力，增加对于组织因子的亲和力，增加内在活性，增加TF依赖性活性，增加凝血活性，改变多肽的构形以改变酶原性，通过使高度活性FVIIa构形与较低活性FVIIa构形之间的平衡偏移以有利于所述高度活性构形来增加催化或凝血活性，增加对蛋白酶的抗性，降低糖基化，增加糖基化，降低免疫原性，增加稳定性和/或促进化学基团键联。
实施例II-101.如实施例II-1至II-100中任一项的方法，其中未经修饰的FVIIa多肽的一级序列由SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列组成。
实施例II-102.如实施例II-1至II-101中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽经转译后修饰。
实施例II-103.如实施例II-102的方法，其中转译后修饰包含糖基化。
实施例II-104.如实施例II-103的方法，其中转译后修饰为O-连接的糖基化。
实施例II-105.如实施例II-103或实施例II-104的方法，其中转译后修饰为N连接的糖基化。
实施例II-106.如实施例II-102至II-105中任一项的方法，其中转译后修饰为谷氨酸羧化成γ-羧基谷氨酸。
实施例II-107.如实施例II-102至II-106中任一项的方法，其中转译后修饰为天冬氨酸羟基化成β-羟基天冬氨酸。
实施例II-108.如实施例II-1至II-107中任一项的方法，其中FVIIa多肽的修饰为氨基酸置换、插入、缺失或其组合。
实施例II-109.如实施例II-1至II-108中任一项的方法，其中与静脉内施用经修饰的FVIIa相比，皮下施用经修饰的FVIIa具有增加的末端消除半衰期。
实施例II-110.如实施例II-1至II-109中任一项的方法，其中在多次给药方案中施用一定剂量的经修饰的FVIIa。
实施例II-111.如实施例II-110的方法，其中多次给药方案包含在约24小时内至少两次或至少三次剂量。
实施例II-112.如实施例II-110至II-111中任一项的方法，其中多次给药方案的至少一次剂量包含每公斤受试者体重约30μg、每公斤受试者体重约45μg、每公斤受试者体重约60μg、每公斤受试者体重约90μg或每公斤受试者体重约120μg。
实施例II-113.如实施例II-110至II-112中任一项的方法，其中多次给药方案的各剂量为相同的。
实施例II-114.如实施例II-110至II-112中任一项的方法，其中多次给药方案的各剂量相隔约2至约6小时持续预定时段进行。
实施例II-115.如实施例II-114的方法，其中预定时段为约24小时。
实施例II-116.如实施例II-110至II-115中任一项的方法，其中多次给药方案在约24小时内包含最大3次剂量。
实施例II-117.如实施例II-110至II-116中任一项的方法，其中以所治疗受试者的重量计，多次给药方案的各剂量为60μg/kg。
实施例II-118.如实施例II-110至II-117中任一项的方法，其中多次给药方案以递增给药方案形式施用。
实施例II-119.如实施例II-1至II-118中任一项的方法，其中至少一次剂量的经修饰的FVIIa在皮下施用之前静脉内施用。
实施例II-120.如实施例II-1至II-119中任一项的方法，其中任何单次剂量的经修饰的FVIIa在受试者的两个不同解剖部位处以分开剂量形式施用。
实施例II-121.如实施例II-1至II-119中任一项的方法，其中任何单次剂量的经修饰的FVIIa在受试者的单个解剖部位处以分开剂量形式施用。
实施例II-122.如实施例II-1至II-121中任一项的方法，其中任何单次剂量的经修饰的FVIIa的量为约2至约6mg。
实施例II-123.如实施例II-1至II-122中任一项的方法，其中任何单次剂量的经修饰的FVIIa的量为约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6或约6.5mg。
实施例II-124.如实施例II-1至II-123中任一项的方法，其中任何单次剂量的经修饰的FVIIa的量为约4.5mg。
实施例II-125.如实施例II-1至II-124中任一项的方法，其中受试者为成人。
实施例II-126.如实施例II-1至II-124中任一项的方法，其中受试者为青少年、儿童或婴儿。
实施例II-127.如实施例II-1至II-126中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa以单一疗法形式施用。
实施例II-128.如实施例II-1至II-127中任一项的方法，其中皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于静脉内施用经修饰的FVIIa多肽。
实施例II-129.如实施例II-1至II-128中任一项的方法，其中皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于静脉内施用未经修饰的FVIIa多肽。
实施例II-130.如实施例II-1至II-129中任一项的方法，其中皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于皮下施用未经修饰的FVIIa多肽。
实施例II-131.如实施例II-1至II-130中任一项的方法，其中活性或效能为经修饰的FVIIa的生物可用性和/或药物动力学概况。
实施例II-132.如实施例II-1至II-131中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa包含SEQ ID NO:280或SEQ ID NO:138中所阐述的氨基酸序列。
实施例II-133.一种向经历出血的受试者或向可能经历出血的受试者提供按需求治疗的方法，其包含向受试者施用一定皮下剂量的经修饰的FVIIa，所述经修饰的FVIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中：
位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；
位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；和
所述剂量为每公斤受试者体重约10至约120μg。
实施例II-134.如实施例II-133的方法，经修饰的FVIIa在具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中进一步包含对应于位置128的位置处的修饰，其中：
位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换。
实施例II-135.如实施例II-133至II-134中任一项的方法，经修饰的FVIIa在具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中进一步包含对应于位置129的位置处的修饰，其中：
位置129处的修饰为Ala(A)。
实施例II-136.如实施例II-133至II-135中任一项的方法，其中在多次给药方案中施用所述皮下剂量的经修饰的FVIIa。
实施例II-137.如实施例II-136的方法，其中多次给药方案包含在24小时时段内的至少两次或至少三次剂量。
实施例II-138.如实施例II-136至II-137中任一项的方法，其中多次给药方案的各剂量为相同的。
实施例II-139.如实施例II-136至II-138中任一项的方法，其中多次给药方案在24小时时段内包含两次剂量。
实施例II-140.如实施例II-136至II-138中任一项的方法，其中多次给药方案在24小时时段内包含三次剂量。
实施例II-141.如实施例II-136至II-140中任一项的方法，其中多次给药方案的各剂量相隔约2至约6小时持续预定时段进行。
实施例II-142.如实施例II-141的方法，其中多次给药方案的各剂量相隔约3小时持续预定时段进行。
实施例II-143.如实施例II-141至II-142中任一项的方法，其中预定时段为约24小时。
实施例II-144.如实施例II-133至II-143中任一项的方法，其中受试者患有A型血友病、B型血友病、具有抑制剂的A型血友病、具有抑制剂的B型血友病、因子VII缺陷、格兰茨曼氏血小板无力症、后天性血友病或采取抗凝血剂疗法。
实施例II-145.如实施例II-144的方法，其中受试者患有血友病；且血友病选自以下之中：A型血友病、B型血友病和C型血友病、具有抑制剂的A型血友病和具有抑制剂的B型血友病。
实施例II-146.如实施例II-145的方法，其中血友病为先天性的。
实施例II-147.如实施例II-145的方法，其中血友病为后天性的。
实施例II-148.如实施例II-133至II-147中任一项的方法，其中受试者已接受口服抗凝血剂疗法。
实施例II-149.如实施例II-148的方法，其中口服抗凝血剂疗法包含以下中的一个或多个：肝素、达比加群、利伐沙班、阿派沙班、贝米肝素、那屈肝素、瑞肝素、依诺肝素、帕肝素、舍托肝素、达肝素和亭扎肝素。
实施例II-150.如实施例II-133至II-149中任一项的方法，其中所述剂量为每公斤受试者体重约20至约60μg。
实施例II-151.如实施例II-133至II-150中任一项的方法，其中所述剂量为每公斤受试者体重约60μg。
实施例II-152.如实施例II-133至II-151中任一项的方法，其中按需求治疗包含向经历出血的受试者施用所述治疗。
实施例II-153.如实施例II-152的方法，其中在出血开始之后约1分钟至约1小时、或约2、或约3、或约4小时施用皮下剂量。
实施例II-154.如实施例II-152至II-153中任一项的方法，其中在出血开始之后约1分钟施用皮下剂量。
实施例II-155.如实施例II-152至II-153中任一项的方法，其中皮下剂量在出血开始之后约1小时施用。
实施例II-156.如实施例II-133至II-155中任一项的方法，其中按需求治疗包含向可能经历出血的受试者施用治疗。
实施例II-157.如实施例II-156的方法，其中皮下剂量是在出血的可能性之前约1分钟至约1小时、或约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7小时施用。
实施例II-158.如实施例II-156至II-157中任一项的方法，其中皮下剂量是在出血的可能性之前约1分钟施用。
实施例II-159.如实施例II-156至II-157中任一项的方法，其中皮下剂量是在出血的可能性之前约1小时施用。
实施例II-160.如实施例II-133至II-159中任一项的方法，其中皮下剂量是在使用装置的情况下施用。
实施例II-161.如实施例II-160的方法，其中装置为注射笔。
实施例II-162.如实施例II-133至II-161中任一项的方法，其中皮下施用经修饰的FVIIa具有增加的活性或效能。
实施例II-163.如实施例II-162的方法，其中皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于静脉内施用经修饰的FVIIa多肽。
实施例II-164.如实施例II-162至II-163中任一项的方法，其中皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于静脉内施用未经修饰的FVIIa多肽。
实施例II-165.如实施例II-162至II-164中任一项的方法，其中皮下施用经修饰的FVIIa的活性或效能大于皮下施用未经修饰的FVIIa多肽。
实施例II-166.如实施例II-162至II-165中任一项的方法，其中活性或效能为经修饰的FVIIa的生物可用性和/或药物动力学概况。
实施例II-167.如实施例II-162至II-166中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa多肽为包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列的双链活化因子VII(FVIIa)多肽，其在位置152处的精氨酸与位置153处的异亮氨酸之间裂解。
实施例II-168.一种用于单次剂量皮下施用的医药组合物，其在医药学上可接受的载体中包含单次治疗有效剂量的经修饰的FVIIa，用于皮下施用以用于按需求治疗出血；其中经修饰的FVIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中：
位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；
位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；和
经修饰的FVIIa具有增加的活性或效能。
实施例II-169.如实施例II-168的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的活性或效能大于静脉内施用经修饰的FVIIa多肽。
实施例II-170.如实施例II-168至II-169中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的活性或效能大于静脉内施用未经修饰的FVIIa多肽。
实施例II-171.如实施例II-168至II-170中任一项的方法，其中经修饰的FVIIa的活性或效能大于皮下施用未经修饰的FVIIa多肽。
实施例II-172.如实施例II-168至II-171中任一项的医药组合物，经修饰的FVIIa在具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中进一步包含对应于位置128的位置处的修饰，其中：
位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换。
实施例II-173.如实施例II-168至II-172中任一项的医药组合物，经修饰的FVIIa在具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中进一步包含对应于位置128的位置处和对应于位置129的位置处的修饰，其中：
位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换；和
位置129处的修饰为Ala(A)。
实施例II-174.如实施例II-168至II-173中任一项的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在1ml至10ml的体积下为100μg至35mg。
实施例II-175.如实施例II-168至II-174中任一项的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在1ml至10ml的体积下为500μg至25mg。
实施例II-176.如实施例II-168至II-175中任一项的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在0.1ml至10ml的体积下为50μg至40mg。
实施例II-177.如实施例II-168至II-176中任一项的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在0.5ml至10ml的体积下为1mg至10、15、20或25mg。
实施例II-178.如实施例II-168至II-177中任一项的医药组合物，其体积为1ml至5ml、或1ml至3ml、或1ml至1.5ml。
实施例II-179.一种容器，其包含如实施例II-168至II-178中任一项的医药组合物。
实施例II-180.如实施例II-179的容器，其中容器为注射器或注射笔。
实施例II-181.如实施例II-179或实施例II-180的容器，其中医药组合物是冻干的。
实施例II-182.如实施例II-179至II-181中任一项的容器，其包含两个腔室，其中一个腔室含有冻干组合物；且另一腔室包含用于溶解冻干组合物的媒剂。
实施例II-183.一种按需求治疗受试者的出血的方法，其包含向受试者皮下施用如实施例II-167至II-178中任一项的医药组合物。
实施例II-184.如实施例II-183的方法，其中组合物在出血之前或之后1、2或3小时内或15、45、60、75或90分钟内施用。
实施例III-1.一种经修饰的因子VIIa，其用于治疗受试者的出血事件的方法中，其中：
经修饰的因子VIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中：
位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；
位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；且其中：
所述方法包含向受试者皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa。
实施例III-2.如实施例III-1的供使用的经修饰的因子VIIa，其中经修饰的FVIIa具有：
(a)在皮下施用时大于经修饰的FVIIa多肽在静脉内施用时的凝血活性或效能的凝血活性或效能；和/或
(b)在皮下施用时大于未经修饰的FVIIa多肽在静脉内施用时的凝血活性或效能的凝血活性或效能；任选的其中未经修饰的FVIIa具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列；和/或
(c)在皮下施用时大于未经修饰的FVIIa多肽在皮下施用时的凝血活性或效能的凝血活性或效能；任选的其中未经修饰的FVIIa具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列。
实施例III-3.如实施例III-1或实施例III-2的供使用的经修饰的因子VIIa，其中经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置128的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中：
位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换。
实施例III-4.如实施例III-1至III-3中任一项的供使用的经修饰的因子VIIa，所述经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置129的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中：
位置129处的修饰是以Ala(A)进行氨基酸置换。
实施例III-5.如实施例III-1至III-4中任一项的供使用的经修饰的因子VIIa，其中在出血事件之前和/或之后在约7、或6、或5、或4、或3、或2、或1或更少小时或分钟内皮下施用剂量。
实施例III-6.如实施例III-1至III-5中任一项的供使用的经修饰的因子VIIa，其中所述剂量为每公斤受试者体重约10至约120μg。
实施例III-7.如实施例III-1至III-6中任一项的供使用的经修饰的因子VIIa，借此减少或停止出血的量或矫治或治愈出血的病因。
实施例III-8.如实施例III-1至III-7中任一项的供使用的经修饰的因子VIIa，其中所述方法向经历出血的受试者或向有可能经历出血的受试者提供按需求治疗。
实施例III-9.一种经修饰的因子VIIa，其用于治疗受试者的出血事件的方法中，其中
经修饰的因子VIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中，包含至少对应于位置128的位置处、对应于位置129的位置处、对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中：
位置128处的修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换；
位置129处的修饰是以Ala(A)进行氨基酸置换；
位置286处的修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；和
位置298处的修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；且其中：
所述方法包含向受试者皮下施用一定剂量的经修饰的FVIIa；其中在出血事件之前和/或之后在约7或6或5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用所述剂量；且其中所述剂量为每公斤受试者体重约10至约120μg。
实施例III-10.如实施例III-9的供使用的经修饰的因子VIIa，其中经修饰的FVIIa具有：
(a)在皮下施用时大于经修饰的FVIIa多肽在静脉内施用时的凝血活性或效能的凝血活性或效能；或
(b)在皮下施用时大于未经修饰的FVIIa多肽在静脉内施用时的凝血活性或效能的凝血活性或效能；任选的其中未经修饰的FVIIa具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列；或
(c)在皮下施用时大于未经修饰的FVIIa多肽在皮下施用时的凝血活性或效能的凝血活性或效能；任选的其中未经修饰的FVIIa具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列。
实施例III-11.如实施例III-1至III-10中任一项的供使用的经修饰的因子VIIa，其中经修饰的因子VIIa包含如SEQ ID NO:280或SEQ ID NO:138中所阐述的氨基酸序列。
实例
以下实例仅出于说明的目的而包括在内且不打算限制本发明的范围。
如后续实例中所使用，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽包含如SEQ ID NO:280中所阐述的氨基酸序列，且Q286R/M298Q FVIIa多肽包含如SEQ ID NO:138中所阐述的氨基酸序列。
实例1：对患有先天性A型血友病的小鼠中变体FVIIa促凝血活性进行活体内评定，且用皮下施用预治疗变体FVIIa
FVIIa多肽的克隆、表达、纯化和活化
FVIIa多肽的克隆、表达、纯化和活化方法和FVIIa多肽的药物动力学计算如公布于2009年10月15日的PCT公开案第WO2009126307A2号中所描述进行，其以全文引用的方式并入。
这一实例证实在损伤之前和之后的时间点，使用A型血友病小鼠的尾夹出血模型来皮下给药经修饰的FVIIa的促凝血作用。使用A型血友病小鼠模型(“血红素A”B6；129S4-F8tm1Kaz/J；Bi等人(1995)Nat Gen 10(1):119-21)评定变体FVIIa多肽的促凝血活性。这些FVIII缺陷小鼠再现A型血友病的关键特征。纯合子雌性和半合子雄性表达小于1％正常因子VIII活性且展现延长的凝固时间。A型血友病小鼠在各时间点预先给药，经修饰的FVIIa含有如实例1中所述产生的置换T128N/P129A/Q286R/M298Q(参见SEQ ID NO:280)。进行尾巴尖端的手术去除以开始出血。测量损失的血液量以评定这一模型中含有T128N/P129A/Q286R/M298Q的经修饰的FVIIa的促凝血活性。
在尾损伤之前15、30、60或90分钟向小鼠皮下施用1.5mg/kg经修饰的FVIIa多肽(T128N/P129A/Q286R/M298Q)(每组3只小鼠)。在开始出血之前，通过腹膜内施用100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪使各小鼠麻醉。3只小鼠在尾损伤之前5分钟静脉内施用1.5mg/kg经修饰的FVIIa用作阳性对照。3只小鼠在尾损伤之前90分钟皮下施用用作阴性对照。
在经修饰的FVIIa施用之后的必需时间量下，尾巴使用尖锐剃刀片从尖端切2mm，以开始出血。随后将尾巴浸没于15mL管中，其中收集管每4分钟间隔更换。在实验结束时，通过时程1批准方法对小鼠执行安乐死。
为测定出血期间失血量，分析含有盐水和血液的管内含物的血红蛋白含量。使用QuantiChromTM血红素分析试剂盒测量血红素含量，其已对啮齿动物验证(产品码DIHB-250，Universal Biologicals(Cambridge)Ltd)。在无菌水中将Triton×100稀释1至4倍，且将100L添加至1mL样品中以引起溶血。随后在546nm的波长下测量样品的吸光度。为计算损失的血液量，对照标准曲线读取吸光度，所述标准曲线通过测量546nm已知量的鼠类血液的吸光度产生，所述鼠类血液在盐水中稀释且如上用Triton×100溶血。
施用1.5mg/kg剂量经修饰的FVIIa后的失血结果展示于下表1中。目视检查试管，且血液的相对量符合表中的发现。在20分钟时段内，媒剂组(缓冲液，n＝3)中的失血为652±110μL。阳性对照(静脉内施用，1.5mg/kg经修饰的FVIIa；n＝3)中的失血在20分钟时段内为171±76μL，其类似于在损伤之前15分钟皮下施用经修饰的FVIIa的小鼠中的失血。
表1：用含有T128N/P129A/Q286R/M298Q的经修饰的FVIIa的预治疗减小失血
条件 损伤前施用的分钟数 途径 平均总失血量(μL)
媒剂 90 皮下 652±110
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 5 静脉内 171±76
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 15 皮下 240±54
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 30 皮下 374.0±81.5
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 60 皮下 406±20
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 90 皮下 492±55
因此，比野生型更有效的经修饰的FVIIa可按需求皮下施用以在预期出血之前或在出血开始减轻或停止其之后预防或减轻出血(还参见下文实例2和3)。
实例2：评定患有先天性A型血友病且在损伤之前15分钟经变体FVIIa预治疗的小鼠的经修饰的FVIIa促凝血活性的剂量反应研究
图4A为说明针对A型血友病小鼠损伤前皮下给药的急性损伤模型的研究设计的图式。进行剂量反应研究，其中在尾损伤之前15分钟皮下施用0.15、0.45、1.5、3或4.5mg/kg含有T128N/P129A/Q286R/M298Q(SEQ ID NO:280)的经修饰的FVIIa或媒剂。如上文详述进行尾损伤、血液收集和血红蛋白含量评定。针对每一条件评定三只小鼠。
如图4A中所描绘，急性损伤研究中使用阳性对照、阴性对照和测试组。对于阳性对照来说，在损伤之前5分钟，向一组小鼠静脉内施用1.5mg/kg含有T128N/P129A/Q286R/M298Q(参见SEQ ID NO:280)的经修饰的FVIIa。对于阴性对照来说，在损伤之前15分钟对一组小鼠进行皮下施用。对于测试组来说，在尾损伤之前15分钟皮下施用0.15、0.45、1.5、3或4.5mg/kg经修饰的FVIIa。
接受媒剂的小鼠在20分钟分析中平均损失684μL血液。在施用经修饰的FVIIa的小鼠中出血量减少。在用增加的浓度的经修饰的FVIIa治疗的小鼠中，所述FVIIa在损伤之前15分钟经皮下施用，以剂量依赖性方式降低失血总量(ED50＝387μg/kg；参见下表2)。举例来说，3.0mg/kg经修饰的FVIIa的皮下施用引起失血149μL，其与损伤(168μL)之前在静脉内施用之后5分钟的失血量类似。
图5为描绘在损伤之前15分钟，使用皮下施用经修饰的FVIIa的研究结果的图式。结果还概述于下表2中。图5描绘非线性曲线图，其中所述非线性曲线拟合是限定在等于经盐水处理组的平均值的无影响浓度和在正常历史性对照浓度的最大浓度之间，所述对照浓度是获自用作为正常对照数据的B6；129S小鼠。两个未经剂量标记的对照组还包括于曲线图中。这些对照如下：阴性对照为生理盐水的皮下施用，且阳性对照为以1.5mg/kg的剂量静脉内施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa。
表2：在损伤之前皮下施用含有T128N/P129A/Q286R/M298Q的经修饰的FVIIa以剂量依赖性方式减小失血
条件 损伤前施用的分钟数 途径 平均总失血量(μL)
媒剂 15 皮下 684±58
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 5 静脉内 168±44
0.15mg/kg经修饰的FVIIa 15 皮下 526±29
0.45mg/kg经修饰的FVIIa 15 皮下 438±50
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 15 皮下 254±77
3.0mg/kg经修饰的FVIIa 15 皮下 149±26
实例3：对患有先天性A型血友病的小鼠评定在损伤之后施用的变体FVIIa促凝血活性的剂量反应研究
图4B为说明针对A型血友病小鼠损伤后皮下给药(按需求)的急性损伤模型的研究设计的图式。进行剂量反应研究，其中在尾损伤之后一分钟皮下施用1.5或4.5mg/kg含有T128N/P129A/Q286R/M298Q(SEQ ID NO:280)的经修饰的FVIIa或媒剂。如上文详述进行尾损伤、血液收集和血红蛋白含量评定。通过自尾巴的末端2mm用尖锐剃刀片引起尾损伤开始出血，且将尾巴置放于温热的盐水中以用于血液采集。损伤后一分钟，皮下施用经修饰的FVIIa或媒剂。在额外19分钟内，每4分钟评定出血，总出血时间共20分钟。针对各条件评定三只小鼠。
在20分钟分析中，在损伤之后1分钟接受媒剂的小鼠失血635±50μL。在损伤之后一分钟皮下施用经修饰的FVIIa小鼠中失血量减少。对于1.5mg/kg和4.5mg/kg皮下施用的经修饰的FVIIa的平均失血量分别为452±52μL和350±46μL。因此，在用增加的浓度的经修饰的FVIIa通过紧接在损伤之后的皮下途径来治疗的小鼠中，失血总量以剂量依赖性方式减少。与媒剂(p＝0.002)相比，在损伤之后皮下施用最高剂量(4.5mg/kg)显著减少出血。这些结果描绘于图6中且也概述于下表3中。图6为展示与经静脉内施用的
Figure BDA0003582772610000701
相比，皮下施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的按需求作用的结果的图式，两者均在出血开始之后一分钟施用。每组含有3只小鼠。媒剂展示未经治疗的A型血友病出血的总失血，以mL为单位，而正常小鼠展示正常出血反应。这些结果展示，在损伤之后和之前，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa在皮下施用时为有效的，且可按需求使用T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa治疗急性出血。这些数据还提供用皮下施用治疗血友病的出血以及FVII缺陷的基础。
表3：在损伤和后续皮下施用含有T128N/P129A/Q286R/M298Q的经修饰的FVIIa之后失血减少
条件 损伤后施用的分钟数 途径 平均总失血量(μL)
媒剂 1 皮下 635±50
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 1 皮下 452±52
4.5mg/kg经修饰的FVIIa 1 皮下 350±46
使用的剂量反应研究的结果描绘于图7中；图7为描绘在损伤之后一分钟皮下施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的剂量反应的图式。实心点表示所测试的个别小鼠的失血。实线表示所计算的线性回归。虚线表示线性回归的95％信赖区间(CI)。
表4概述在损伤之后的各个时间点和随后皮下施用T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa时观测到的失血减少的结果。
表4：在损伤和随后皮下施用经修饰的FVIIa之后的各种时间点的失血减少
条件 损伤后的分钟数 平均失血量(μL)
媒剂 4 127.5
媒剂 8 75
媒剂 12 132.83
媒剂 16 104.67
媒剂 20 194.5
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 4 122.83
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 8 70.33
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 12 73
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 16 68.83
1.5mg/kg经修饰的FVIIa 20 117.3
4.5mg/kg经修饰的FVIIa 4 89.67
4.5mg/kg经修饰的FVIIa 8 76.67
4.5mg/kg经修饰的FVIIa 12 77.67
4.5mg/kg经修饰的FVIIa 16 60.33
4.5mg/kg经修饰的FVIIa 20 45.5
以上实例中的结果证实，本文中提供的经修饰的FVIIa，尤其比
Figure BDA0003582772610000711
FVIIa有效至少4或5倍，例如至少5或6倍的那些，可用于按需求疗法，以在创伤之后通过皮下施用治疗创伤出血，还在预期出血之前通过预治疗来治疗预期出血，例如间歇性出血和的手术出血。
这一实例和先前实例中的实验的结果展示，在损伤之前早在15分钟皮下施用经修饰的FVIIa显著减少A型血友病小鼠的出血。在损伤之前15分钟，在向A型血友病小鼠施用时，皮下施用经修饰的FVIIa引起剂量依赖性出血减少。在最高剂量下实现完全功效，因为经治疗小鼠的出血与在止血能力正常的小鼠中观测到的失血相当。在皮下施用之后，经修饰的FVIIa的ED50计算为387μg/kg。当在损伤之后一分钟以急救按需求疗法形式给药时，皮下施用经修饰的FVIIa，出血显著自635±50μL(媒剂)减少至350±46μL，p＝0.02。
患有血友病的患者，包括具有和不具有抑制剂的A型或B型血友病，缺乏快速且易于用于治疗急性出血的治疗选择。其仅选择为静脉内施用置换或旁路疗法。这些结果展示，可按需求在出血之前和之后，例如损伤出血，皮下施用经修饰的FVIIa，或治疗患有这些病症的受试者在出血开始前可感觉的出血，例如关节出血。这些数据指示与
Figure BDA0003582772610000721
FVIIa相比更有效或更有活性的经修饰的FVIIa可按需求用于治疗急性出血患者或用于预防或减少出血。
实例4：与其他血友病疗法组合的含有T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的经修饰的FVIIa
用艾美赛珠单抗(或艾美赛珠单抗-kxwh，由Genentech以
Figure BDA0003582772610000722
的商标出售)治疗的血友病患者可经历突破性出血或对于程序或手术需要额外止血覆盖度(参见例如onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/rth2.12227，第116页)。包括rFVIIa(Eptacog Alfa(经活化)；
Figure BDA0003582772610000723
因子VIIa)和aPCC(
Figure BDA00035827726100007211
由Takeda出售)的可获得疗法已与
Figure BDA0003582772610000724
一起使用，以治疗出血或在需要额外覆盖度时使用。
Figure BDA0003582772610000725
为一种对患有具有或不具有因子VIII抑制剂的A型血友病(HA)的人类的治疗。
Figure BDA0003582772610000726
为重组野生型因子VIIa(FVIIa)。
Figure BDA0003582772610000727
为旁路活性的因子VIII(FVIII)抑制剂。
虽然
Figure BDA0003582772610000728
FVIIa与
Figure BDA0003582772610000729
(HAVEN 1至4临床试验)组合看起来安全，但已在同时使用FEIBA和Hemlibra的情况下观测到血栓性事件。虽然在按指导使用时安全且有效，但
Figure BDA00035827726100007210
FVIIa必须静脉内输注。对于用Hemlibra皮下(SQ)治疗的患者，还可以皮下给药佐剂rFVIIa。本文所述的经修饰的FVIIa多肽，例如具有置换T128N/P129A/Q286R/M298Q(表示为T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa)的FVIIa，且可皮下施用具有类似活性或效能的其他FVIIa，以实现药理学相关血浆浓度。其可在预期或间歇性出血之前或在出血之后不久皮下按需求施用。因此，这些经修饰的FVIIa多肽提供解决血友病疗法中未满足需求的解决方案。
图8描绘正常反应和未经治疗的A型血友病(HA)反应的例示性凝血酶产生曲线。正常反应的特征在于开始阶段(滞后时间)，随后形成大量凝血酶(繁殖)，随后为峰值凝血酶浓度，且随后通过天然抗凝血剂(Castoldi和Rosing,2011)抑制凝血酶产生。相当地，未经治疗的HA反应较平且具有较低峰值凝血酶产生，且时间较长以达到峰值凝血酶产生。最大凝血酶产生可在供体之间变化，且其还可以视分析条件而定；因此，当进行凝血酶产生的分析时，通常比较实验在同一受质中进行。
使用标准PPP低组织因子和含有磷脂的凝血酶产生分析试剂(#TS31.00,Thrombinoscope,Stago)进行凝血酶产生分析。单一供体柠檬酸的A型血友病血浆(GeorgeKing Bio-Medical)外加浓度增加的测试化合物如下：
Figure BDA0003582772610000731
0.25和0.50IU/mL
Figure BDA0003582772610000732
0、25、50和100μg/mL
Figure BDA0003582772610000733
RT：0、1、2.5、5、10和50μg/mL
T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa：0、0.1、0.5、1、2.5、5和10μg/mL
相较于外加
Figure BDA0003582772610000734
T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa或
Figure BDA0003582772610000735
的HA样品，在分析中包括经收集的正常对照血浆以设定峰值凝血酶产生的“正常化”水平。
图9描绘当与
Figure BDA0003582772610000736
组合时T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa、
Figure BDA0003582772610000737
或
Figure BDA0003582772610000738
对峰值凝血酶产生的作用。所展示数据为缓冲液(媒剂)、T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa、
Figure BDA0003582772610000739
和
Figure BDA00035827726100007310
的平均值+SD。在存在和不存在用艾美赛珠单抗-kxwh
Figure BDA00035827726100007311
的单株抗体疗法的情况下，用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa、
Figure BDA00035827726100007312
FVIIa或
Figure BDA00035827726100007313
治疗来自患有先天性A型血友病的患者的人类血浆。FVIIa在无FVIII/FIX存在下引起凝血酶产生。在各测试化合物下方指示血浆浓度，且HA血浆具有单一供体来源。
媒剂和各测试化合物的
Figure BDA00035827726100007314
浓度展示于实心水平线下方。点线表示HA血浆中的峰值凝血酶产生水平(下部线)，和来自健康个体的混合血浆(上部线)中的峰值凝血酶产生水平。星号指示与
Figure BDA00035827726100007315
在0.5IU/mL下的差异。不可能超过0.5IU/mL
Figure BDA00035827726100007316
因为其达到分析极限。数据表示在单独时刻使用相同批次的血浆进行的重复两次或重复三次实验，且各样品在各实验内以一式三份方式进行。在各实验中，在各培养盘上包括对照样品。这些结果也亦概括于下表5中。
自上文受试者测量峰值凝血酶含量(nM)。在这一分析中，数据显示经修饰的FVIIa相比于
Figure BDA00035827726100007317
FVIIa展现约10倍增加的效能。
表5：含有T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的经修饰的FVIIa呈现与FDA批准的FVIII抑制剂旁路药物类似的概况
Figure BDA0003582772610000741
实例5：在人类受试者中皮下和静脉内施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的药物动力学
向诊断有具有抑制剂的A型或B型血友病(HA或HB)的受试者经静脉内(IV)或皮下(SQ)施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa(SEQ ID NO:280)。抑制剂为HA或HB受试者中回应于因子替代疗法而针对野生型FVIII或FIX产生的中和抗体。在皮下或静脉内施用后的不同时间点完成药物动力学评定。与静脉内施用的经修饰的FVIIa相比，经皮下施用的修饰的FVIIa，例如T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa，半衰期延长。
A.方法
符合条件的受试者为患有严重先天性具有抑制剂的A型或B型血友病，且在登记之前6个月期间频繁出血发作病史的18岁和以上年龄的男性。排除标准包括：接收预防治疗，先前参与了评估经修饰的rFVIIa药剂的临床试验，在筛选时由中央实验室检测到FVII或FVIIa的已知阳性抗体；存在除A型或B型血友病以外的凝血病症或对参与的显著禁忌。
患有血友病且记录年度出血率>12的10名受试者参与研究。9名受试者完成研究。一名受试者由于与含有置换T128N/P129A/Q286R/M298Q的经修饰的FVIIa施用不相关的严重不良事件(SAE)而未完成研究。
将30μg/kg含有置换T128N/P129A/Q286R/M298Q的经修饰的FVIIa在T＝0向受试者皮下或静脉内施用一次。在给药后每3小时收集一次血液持续24小时。如上文实例9中所详述测定皮下或静脉内施用的FVII蛋白质的半衰期和额外药物动力学和凝血参数。
B.结果
结果阐述于下表6中。数据和结果展示，与静脉内施用的3.6小时半衰期相比，向患有A型或B型血友病的受试者皮下施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa使药物的表观半衰期延长至16.6小时。
表6：IV或SQ施用之后的药物动力学结果
Figure BDA0003582772610000751
半衰期α＝再分布阶段的半衰期；半衰期β＝消除阶段的半衰期(即归因于代谢的消除)；Cmax＝给药后的最大浓度；Tmax＝当达到Cmax时的时间；AUC0-t＝暴露；AUC0-∞＝暴露
实例6：正常小鼠中皮下和静脉内施用经修饰的FVIIa的药物动力学
两种经修饰的FVIIa变体T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa(SEQ ID NO:280)和Q286R/M298Q FVIIa(SEQ ID NO:138)和未经修饰的重组人类FVIIa(rFVIIa，SEQ ID NO:3)用于使用皮下(SQ)或静脉内(IV)施用至不患血友病的正常小鼠的药物动力学研究中。Q286R/M298Q FVIIa不包括T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽中发现的添加的N端糖基化位点。
在皮下或静脉内施用后的不同时间点完成药物动力学评定。与静脉内施用的经修饰的FVIIa相比，经皮下施用的修饰的FVIIa，例如T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa，展示半衰期延长。
A.方法
获得八周龄CD-1雄性小鼠且在具有标准随意取用的嚼食和水的圈养条件下，在十二小时日/十二小时夜的周期内，适应至少三天。在实验日之前不需要空腹。
皮下研究方法
关于SQ施用，经修饰的FvIIa变体以2.1mg/ml的储备液浓度作为测试物品提供。在实验当天，将测试物品解冻且用缓冲液稀释至0.3mg/ml。对于IV施用，也以储备液浓度提供测试物品。用于稀释的缓冲溶液为10mM L-组氨酸、29mM蔗糖、390mM甘氨酸、10mM氯化钙二水合物、3.35mM L-甲硫氨酸、0.03％Tween 80，pH 6.0。所有测试制品和溶液储存于-80℃下。
对于SQ研究，以5mg/kg的剂量体积施用1.5mg/kg的剂量将测试溶液注入肩胛间区域中。对于所测试的各化合物，将小鼠分成七组，每组三只。对来自各小鼠的两个血液样品使用稀疏取样方法。自面部静脉抽取第一血液样品，且在CO2吸入后通过心脏穿刺在末端收集第二血液样品。所采集的各样品的设定和时间(给药前或给药后的时间)展现于下表7中。
表7：实验小鼠组的样品收集时间
组A 组B 组C 组D 组E 组F 组G
样品1 给药前 0.083小时 0.25小时 0.5小时 0.75小时 1小时 1.5小时
样品2 2小时 3小时 4小时 5小时 6小时 12小时 24小时
将来自各组的动物1、来自各组的动物2和来自各组的动物3集合在一起以获得药物动力学(PK)拟合的三个血浆浓度-时间曲线。这些分别称为第1组、第2组和第3组。
静脉内研究方法
对于IV研究，五个CD-1小鼠在横向尾静脉中接受0.1mg/kg的IV推注注射。随后在注射后5、15、30、60和120分钟自小鼠获得连续血液样品。将血液样品收集至含有129mM柠檬酸盐储备溶液的管中以制备1份柠檬酸盐储备溶液至9份血液的溶液。通过轻微移液五次进行血液样品至柠檬酸盐储备溶液的混合。随后将样品储存于湿冰上直至通过离心(在收集30分钟内在4℃下4000×g持续5分钟)进行血浆处理。随后将血浆样品转移至湿冰上的25μl等分试样中，转移至单独的96孔盘(受质管)中且储存于-80℃下。
分析
为分析凝块活性的血浆浓度，类似于上文实例9中描述的分析，通过
Figure BDA0003582772610000761
分析(Stago Diagnostica)分析血浆样品。通过使用rFVIIa标准曲线(
Figure BDA0003582772610000762
标准曲线)将凝块活性转化回ng/ml。因此，下文所论述的结果是针对
Figure BDA0003582772610000763
标准曲线报导。
对于药物动力学分析，通过具有血管外吸收(模型#101)或IV推注(模型#102)的非隔室方法，使用Microsoft Excel 2.0中的附加程序PKSolver分析药物浓度-时间数据。所进行的分析类似于上文实例9中所述的分析。通过PKSolver程序自动选择三至五个数据点以便估计末端消除半衰期。
rFVIIa组中的一只小鼠在24小时展示可测量但低血浆浓度，其具有与12小时时的血浆浓度相同的量值。因此，数据分析不包括24小时结果。
图和统计分析是在Graph Pad Prism 8.0中制备。除非另外说明，否则结果展现为平均值和标准偏差(SD)。
B.结果
图10-12分别描绘在将1.5mg/kg SQ注射至CD-1小鼠之后，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa、Q286R/M298Q FVIIa和rFVIIa
Figure BDA0003582772610000771
的血浆浓度。图10-12中的图A描绘算术尺度，且图10-12中的图B描绘对数尺度。所有三种蛋白酶自皮下贮存物快速吸收，其中在施用之后约2小时出现最大峰值浓度(Tmax)。
对于T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa、Q286R/M298Q FVIIa和rFVIIa，最大血浆浓度(Cmax)分别为750.3±145.8ng/ml、409.8±169.7ng/ml和248.0±48.3ng/ml(P<0.007，ANOVA)。T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa和Q286R/M298Q FVIIa之间的Cmax的平均差为340.5ng/ml(24,96至656,0ng/ml，95％C.I.)和530.7ng/ml(215,2至846,2ng/ml，95％C.I.)。
对于T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa、Q286R/M298Q FVIIa和rFVIIa，明显末端消除半衰期(T1/2)分别为4.53±0.03小时(h)、3.16±0.27h和3.19±0.62h(P<0.008，ANOVA)。T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa与Q286R/M298Q FVIIa之间的T1/2的平均差为1.37h(0.43至2.3h，95％C.I.)，且T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa与rFVIIa之间的T1/2的平均差为1.34h(0.40至2.3，95％C.I.)。
当相比于Q286R/M298Q FVIIa和rFVIIa多肽时，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽在体内保持更长时间，其中平均滞留时间(MRT)为7.01±0.29h。Q286R/M298Q FVIIa和rFVIIa的MRT分别为5.64±0.08h和5.53±0.74h(P<0.012)。T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa与Q286R/M298Q FVIIa之间的MRT的平均差为1.37h(0.29至2.4h，95％C.I.)，且T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa与rFVIIa之间的MRT的平均差为1.48h(0.40至2.56h，95％C.I.)。
在SQ施用1.5mg/kg至CD-1小鼠之后，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa、Q286R/M298Q FVIIa和rFVIIa的所估计PK参数展现于下表8中。来自这些研究的原始数据展现于下表9中。
表8：估计的药物动力学参数，皮下注射
Figure BDA0003582772610000781
表9：估计的药物动力学参数研究的原始数据
Figure BDA0003582772610000791
不包括圆括号中的数值.BLQ：低于定量极限
图13描绘在静脉内推注注射T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽至CD-1小鼠之后的血浆浓度。图13中的图A描绘算术尺度，且图13中的图B描绘对数尺度。单次剂量IV推注注射为0.1mg/kg。T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa快速地自血浆清除，其中T1/2为41±3.9分钟。此研究的PK参数展现于下表10A中。
表10A：估计的药物动力学参数：静脉内注射
Figure BDA0003582772610000801
T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的末端消除半衰期展示为在静脉内注射之后比在皮下注射T128N/P129A/Q286R/M298Q之后更快。因此FVIIa可遵循正反器药物动力学，其中吸收比自身体消除药物慢得多。因此，SQ注射之后可见的延长半衰期反映施用贮存物的吸收率。
如图10-11中所示，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa和Q286R/M298Q FVIIa的血浆浓度在给药后3和4小时分别测量为较低的。这些数据点不视为严重影响末端消除速率常数，且因此T1/2的估计，因为这一参数通过使用超过这些两个数据点的血浆浓度而估计。然而，SQ施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa之后0至无穷大的血浆浓度-时间曲线下计算面积(AUC0-inf)可减少且因此影响生物可用性(F)的计算。在SQ施用之后，可通过以下方程序计算CD-1小鼠中的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的平均生物可用性F：
F＝AUC0-inf,sc/AUC0-inf,iv*Div/Dsc＝15.0％(12.1％-17.8％,95％C.I.)
药物动力学研究的结果展示，在正常CD-1小鼠中皮下施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa引起半衰期延长，与静脉内施用化合物相比，展示约6倍的增加。平均SQ生物可用性经估计为约15％。
实例7：皮下和静脉内施用经修饰的FVIIa的群体药物动力学
使用不同给药方案的模拟，静脉内(IV)和皮下(SQ)施用经修饰的FVIIa多肽(T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa)的群体药物动力学(PopPK或群体PK)进行建模且表征以进一步告知剂量选择。对于成年受试者进行模拟，且包括对患有A型血友病(HA)或B型血友病(HB)或因子VII缺陷(FVIID)的成人的模拟。
A.方法
在单次IV给药(4.5、9、18和30μg/kg)和单次IV(18μg/kg)和SQ给药(30和60μg/kg)之后，评估作为T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa暴露数据分析的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的活性。非线性混合作用模型化用以依序模型化描述IV和SQ数据两者的数据，包括非线性和异速生长尺度律(allometric scaling)。模型区分是基于参数不确定性、目标函数值的合理性和变化(ΔOFV＝-3.84，p<0.05，一个自由度)。针对70kg成年受试者进行模拟。
第一群体PK模型(称为MAA-POPPK-001)基于可用临床试验数据研发静脉内和皮下给药数据。还使用所研发的第二群体PK模型且基于第一模型(称为MAA-POPPK-002)进行额外模型化。
B.结果
图14A-14D描绘跨越所有剂量组对T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa浓度的目视预测检查，展示由模拟产生的最终PopPK模型。空心圆表示个别观测结果。实线表示所观测数据的中值。加阴影区域表示基于1000个模拟的经模拟数据的95％信赖区间。这些结果描述由T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa展示的临床数据，以上实例中有描述。
图15A描绘使用3种不同皮下T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa治疗方案对70kg成人进行的临床试验模拟结果。实心黑线为T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的模拟浓度。黑色长虚线表示如对于具有抑制剂的A型血友病(HA)和B型血友病(HB)中的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa所定义的目标水平(24至120ng/ml)。黑色虚线-点线展现T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa活性水平，在270μg/kg rFVIIa
Figure BDA0003582772610000811
IV(3,000ng/ml)之后等效于Cmax，假定T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的10倍效能增加，如在人类血友病A血浆中使用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa和rFVIIa所进行的凝血酶产生实验中所记录。
T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的皮下生物可用性估计为33％，其中受试者间可变性为76％。IV给药的末端消除半衰期估计为3.3小时，且吸收和消除SQ半衰期均估计为11.8小时，指示正反器药物动力学。模拟指示每日给药以及多次给药，例如在24小时内(在24小时周期内每3-6小时，例如在0、3和6小时，在60、90和120μg/kg的剂量下)实现在目标范围内或高于目标范围的暴露两次和三次。使用60μg/kg剂量，可在24小时时段内施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa三次，而不显著超出所定义的目标范围，如图15A中所描绘。因此，可在24小时内在60μg/kg SQ剂量和1-3剂量的给药方案的情况下实现止血的目标水平。
图15B-15C描绘分别使用一次、两次或三次剂量的T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa多肽和给药方案与所得计算的概述的临床试验群体药物动力学模拟的结果的图式。自患者的实际数据组优化1000群体的这些模拟，且展示所提出的Cmax和持续六小时的至多60μg/kg的三个剂量的AUC皮下给药方案的覆盖度。患有血友病的受试者已安全地暴露于815ng/mL和2788ng*hr/mL的平均Cmax和AUC水平。使用MAA-POPPK-001模型，展示在各个时间点之后高于目标范围的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽浓度的受试者的百分比概括于下表10B中。
随后使用MAA-POPPK-002模型对一千名具有称重40至105kg血友病的虚拟受试者群体进行其他临床试验模拟。模拟额外给药方案，且所测量的第二PK参数如下：最大浓度(Cmax)、达到最大浓度的时间(Tmax)、最小浓度(Cmin)和在0-24小时之间的浓度相对于时间曲线(AUC)下的面积。将模拟群体PK概况与两个患者群体中的每一个的预定义目标范围相比。此外，计算在不同给药方案的不同时间点目标时间和目标以上群体的分数。表10C-10D概述成年受试者在不同给药方案之后使用MAA-POPPK-002模型的预测药物动力学。
模型化展示，在患有血友病的受试者中，皮下(SQ)施用之后T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的生物可用性估计为26％，其中受试者间可变性(IIV)为54％。通过模拟估计末端消除半衰期为静脉内(IV)施用之后3.3小时。SQ施用之后的吸收半衰期估计为12.9小时，其中IIV为30％，指示正反器动力学。SQ施用之后的末端消除半衰期分别估计为血友病和因子VII缺陷(FVIID)中的15.5小时和12.9小时的中值。
在单次剂量向患有血友病的受试者施用60μg/kg后，达到目标的中值时间(24ng/mL)为2.2小时。血友病模拟指示，在60μg/kg的单次剂量后3小时，51％群体达到目标水平。类似地，70％、90％和91％的受试者分别在以3小时间隔给药60μg/kg一次、两次或三次之后6小时达到目标以上。在24小时之后，33％、81％和96％的受试者分别在60μg/kg一次、两次或三次之后保持高于目标。
在FVIID中，在分别以20、30或60μg/kg单次SQ注射T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa多肽之后，达到目标的模拟中值时间(2ng/mL)为1.5、1.2和0.8小时。20μg/kg的单次剂量使得在给药之后80％、90％和68％的患者高于目标3、6和24小时。进一步增加剂量至30或60μg/kg使得在给药之后6小时内群体的98％至100％达到目标水平。
表10B：模拟以上目标范围的1000名受试者的群体药物动力学和百分比
Figure BDA0003582772610000831
表10C：在对患有HA/HB的成人的不同阶段3个方案后，预测T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa药物动力学
Figure BDA0003582772610000832
缩写：AUC0-24h＝0至24小时之间的浓度相对于时间曲线下面积；Cmax＝最大值或峰值浓度；Tmax＝实现Cmax的时间。
表10D：在成年FVIID受试者中执行不同给药方案之后，预测T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa药物动力学
Figure BDA0003582772610000841
这些结果支持在受试者中清除之前，以60μg/kg的一个、两个或三个皮下剂量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa可有效24小时。再给药或再治疗的选择也允许个别定制给药方案以根据个体需要优化T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的使用。这些模拟还展示在24-120ng/ml的所需目标范围内T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的延长的持续时间/延时的暴露的预测，所述预测是基于
Figure BDA0003582772610000842
的目标范围。
实例8：皮下经修饰的FVIIa对A型血友病大鼠的自发性出血的作用
因子VIII(FVIII)缺陷(“F8-/-大鼠”)的纯质性得以确认的雄性和雌性大鼠用于研究皮下经修饰的FVIIa多肽对自发性出血的作用。这些A型血友病(HA)大鼠呈现与在HA狗和人类中所见的自发性出血相当的自发性出血。
在检测到出血后治疗F8-/-大鼠，其可包括内出血或可观测到的出血。图16A描绘展示在左后脚上的自发性出血(其为内出血)的典型代表的大鼠。在检测这类出血后，以385μg/kg的剂量皮下施用一剂量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa。如果需要，那么将剂量重复2-3次，其中各剂量之间约4-6小时。图16B描绘图16A的大鼠，在第一次剂量的皮下T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa之后24小时，展示相比于图16A中描绘的自发性出血所示的肿胀，左后脚肿胀的可见减少。图16B中描绘的大鼠接受两次剂量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa。两组大鼠中所用的给药方案概述于下表11中。
表11：在A型血友病大鼠中皮下施用的给药方案
组 剂量 体积 途径 第1剂量 第2剂量 第3剂量 第4剂量 第5剂量
A 0μg/kg(媒剂) 1mL/kg SC 0小时 2.5±0.5小时 ～2小时 24±2小时 24±4小时
B 385μg/kg 1mL/kg SC 0小时 2.5±0.5小时 ～2小时 24±2小时 48±4小时
三只大鼠成功地经治疗，在研究中无治疗失败。治疗成功定义为在以24小时时间点评定的12小时内的1至3剂量T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa之后的出血功效评级，为“极佳”或“良好”。治疗失败定义为在以24小时时间点评定的12小时内的3个连续剂量T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa之后的出血功效评级，为“一般”或“差”。功效等级如下所定义：
极佳：在开始注射之后24小时(+2小时窗口)出血迹象明确或突然改善
良好：在开始注射之后24小时(+2小时窗口)出血迹象适度改善，可能需要超过一次注射
一般：在开始注射之后24小时(+2小时窗口)出血迹象很可能或轻微改善，需要超过一次注射
差：在开始注射之后24小时(+2小时窗口)出血迹象无改善或恶化，可能需要抢救疗法
这些结果展示一旦检测到T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa可适用于在按需求治疗中皮下施用，以便治疗出血。T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa可在第一次剂量24小时内以每3至6小时60μg/kg的剂量皮下施用，持续最多3次剂量。可任选的施用随访治疗，视需要每天至多一次，持续两天。在大致250克的F8-/-大鼠中，70kg受试者中等于60μg/kg的异速生长按比例等效为385μg/kg。举例来说，针对人类受试者，使用等效或类似的稀释液用于皮下施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa。
实例9：对皮下施用患有血友病的成年受试者递增剂量的经修饰的FVIIa多肽的药物动力学、
药力学和安全性的评估
评估皮下(SQ)施用患有血友病的成年受试者递增剂量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的药物动力学、药力学和安全性。还评估相同剂量的分次剂量(两个不同的注射解剖学部位)是否将提供与单次注射类似的药物动力学。
图17A-17B为说明在患有血友病的人类中递增皮下剂量的研究设计的两个变化形式的图式。经修饰的FVIIa，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa，在图17A中由“经修饰的FVIIa”表示。在七个给药阶段或水平中，由至少一个受试者接受T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa。在一些水平下，在不同解剖部位进行两次皮下施用T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa。在一些水平下，在相同解剖部位进行两次皮下施用T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa。以受试者的重量计，所用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的剂量为18、30、45或60μg/kg。单次剂量可能需要超过一次注射。
研究的八个受试者的人口统计数据概述于以下表12中。
表12：递增皮下剂量研究的受试者人口统计数据
Figure BDA0003582772610000861
在皮下施用之后，药物动力学(PK)结果证实如下：
T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa Tmax，SQ＝7.5小时；IV＝0.20小时
SQ T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa Cmax＝范围18.7至54.2ng/ml
T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa平均滞留时间，SQ＝25.6小时；IV＝3.8小时
图17C为描绘在研究递增剂量中观测到的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的平均药物动力学水平的图式。计算标准PK参数，例如末端半衰期、时间0至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC0-t)和时间0至最后可测量血浆浓度的时间的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC0-inf)、清除率、分布体积、平均滞留时间和生物可用性(皮下施用)。使用由Lee等人(Lee,1990；Lee,1997)描述的半参数模型计算末端半衰期。基于梯形规则的非隔室方法用于计算曲线下面积(AUC)和自其得出的参数。针对各参数报导的描述性统计数据包括平均值±标准偏差。在适当时，使用双侧测试在0.05显著性水平下进行所有统计测试。
所观测到的药物动力学参数概述于下表13中。
表13：递增皮下施用的药物动力学参数
Figure BDA0003582772610000871
图17D为描绘图17A-17B中概述的研究设计受试者的多次给药研究的结果的图式。点线展现24ng/ml的目标水平，其基于用于手术的
Figure BDA0003582772610000872
的连续输注的有效水平。举例来说，大致24-120ng/ml为T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的目标使用水平。如图17D中所示，受试者能够以60μg/kg的单次皮下剂量(线C)维持目标水平约18小时，且能够在使用两个或三个剂量(线A和B)时维持目标水平超过24小时。
这些结果证实T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa可用于递增剂量治疗方案中，且分次剂量展示与单次剂量类似的药物动力学概况。T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa可用于实现且维持较长治疗水平，以允许对具有或不具有抑制剂的A型和B型血友病受试者用皮下注射治疗急性出血事件。这些结果展示与图15A中描绘的群体PK模拟类似的曲线。
实例10：评估正常大鼠单次剂量皮下施用经修饰的FVIIa多肽的药物动力学
评估在正常大鼠中单次剂量皮下(SQ)施用经修饰的FVIIa多肽的药物动力学。评估T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa和Q286R/M298Q FVIIa多肽。
研究设计
将具有留置两侧颈静脉插管或单个颈静脉插管的正常雄性史泊格多利大白鼠(Sprague Dawley rat)用于研究。将T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽提供于2.1mg/ml的储备液浓度(向4.62毫克/小瓶添加2.2ml无菌水供复原)中。在实验当天，解冻测试物品且用缓冲液稀释至0.7或1.5mg/ml。用以下制备用于稀释的缓冲溶液：10mM L-组氨酸、29mM蔗糖、390mM甘氨酸、10mM氯化钙二水合物、3.35mM L-甲硫氨酸、0.03％Tween 80，pH6.0。
将大鼠分成4组，每组各3只动物。组1接受1.5mg/kg Q286R/M298Q FVIIa多肽，剂量体积为1mL/kg。组2和组3分别接受剂量体积为0.39或1mL/kg的0.27或1.5mg/kg T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽。组4接受剂量体积为1ml/kg的媒剂。将测试溶液注射于颈部的肩胛间区域中。
在组1至3中，在给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6和12小时抽取血液样品。在24小时吸入CO2之后通过心脏穿刺获得1500μL的末端血液样品。在组4中，在给药前和给药后24小时获得血液样品。对于样品处理，将血液样品收集至含有129mM柠檬酸盐储备溶液(1份柠檬酸盐储备溶液比9份血液)的管中。当转移血液至柠檬酸盐时，通过轻缓地移液5次来混合两种组分。将样品储存在湿冰上直至通过离心处理成血浆(4000×g，在收集30分钟内在4℃下持续5分钟)。收集血浆样品且在-80℃下储存直至分析。
随后使用
Figure BDA0003582772610000881
VIIa-rTF分析，一种来自Diagnostica Stago的使用软件版本2.40的
Figure BDA0003582772610000882
4凝血仪器的试剂用试剂盒，来分析(Charles River)血浆样品的测试物品含量。使用基于Microsoft Excel软件重对数尺度的Power Fit，以ng/mL为单位转化凝血时间(秒)。
药物动力学和统计分析
通过具有血管外吸收的非隔室方法，使用Microsoft Excel 2.0[1]中的程序PKSolver分析药物浓度时间数据。通过用于估计测试物品的末端消除半衰期的程序自动选择三至五个数据点。在无任何对多次比较的矫治的情况下，通过不配对的司徒登t测试来分析T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa与Q286R/M298Q FVIIa多肽之间的差异。除非另外说明，否则结果展现为平均值和SD。差异展示为平均值和SE。
在曲线下面积(AUC)值的对数转换之后计算相对生物可用性。随后差值经转化回以获得T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa与Q286R/M298Q FVIIa多肽之间的AUC比率。在Graph Pad Prism 8.0中制备图式和统计分析。
图18A-18B分别描绘在向正常大鼠各自皮下施用单次剂量之后，在血浆中测量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa和Q286R/M298Q FVIIa多肽的算术和对数血浆浓度。这些图描绘如上文所描述的组1、组2和组3的结果。直至给药后2小时，可重叠1.5mg/kg T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa和Q286R/M298Q FVIIa多肽的血浆浓度，其后所述多肽出现偏差，其中T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa展示最高血浆浓度。峰值血浆浓度Cmax呈现给药后5小时和4小时，分别对于T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa和Q286R/M298Q FVIIa为309.1±34.9和179.0±50.3ng/mL，差异为130.0±35.4ng/mL(P<0.02)。在低剂量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa下，在血浆中可检测到T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa之前约0.5至1小时的滞后时间，其中在3小时时平均Cmax为68.7±19.3ng/mL。高剂量和低剂量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa之间的Cmax的差值呈现与剂量成比例。
对于T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa和Q286R/M298Q FVIIa，明显半衰期(T1/2)估计为4.3±0.8h和3.0±0.4h，差异为1.3±0.5h(P＝0.06)。
所估计药物动力学参数和原始数据分别展示于表14A和14B中。由于在两只大鼠中所测量的平坦血浆浓度-时间曲线和在一只大鼠中稳定增加的血浆浓度，未估计低剂量T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的PK参数。
当与Q286R/M298Q FVIIa的5.8±0.47h相比时，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa分子在主体中保持较长，平均滞留时间(MRT)为8.2±0.89h，差值为2.4±0.58h(P<0.02)。
当与Q286R/M298Q FVIIa(AUC(T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa)/AUC(Q286R/M298Q FVIIa))相比时，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的相对生物可用性估计为1.80(1.04-3.13，95％C.I.，P<0.05)。
其自图18A-18B呈现，在展示给药后6小时血浆浓度的出人意料的降低时，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa的血浆浓度-时间曲线不与Q286R/M298Q FVIIa一样平滑。因此，T1/2的标准偏差比T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa高2倍，且T1/2的差异仅达到边界显著性。还应注意，各治疗组中仅包括3只动物。
这些结果展示，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽在皮下注射至史泊格多利雄性大鼠之后呈现约4小时的表观半衰期。在施用的剂量下，T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa的全身性暴露量与剂量成比例。当与不具有通过T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的两个特定取代T128N和P129A引入的额外N糖基化位点的Q286R/P298Q FVIIa多肽相比时，在正常大鼠中单次皮下注射之后，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽展示高大致2倍的生物可用性。
表14A：皮下注射的估计药物动力学参数
Figure BDA0003582772610000901
表14B：大鼠研究中的单次皮下剂量的原始数据
Figure BDA0003582772610000911
BLQ：低于定量极限
实例11：对血友病狗使用经修饰的FVIIa多肽进行按需求治疗
呈现自发性出血的血友病狗用于评估按需求皮下(SQ)施用经修饰的FVIIa多肽，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽。
研究设计
T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽提供于4.6mg小瓶中且用2.2mL无菌水复原，在复原之后得到2100μg/mL的最终浓度。
当诊断有出血临床症状时，在研究中包括血友病狗，且以最大120μg/kg剂量接受T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的SQ施用。如果出血在三小时内不停止，那么通过在重复测量中呈现连续降低的血容比(HCT)，或展示持续出血的临床征象，再给药T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽。再给药进行至多总计一天三次剂量，持续最多五天。在整个治疗中自血友病狗获取用于高岭土血栓弹力图(高岭土-TEG)的血液样品。
血栓弹力图
在预先施用rFVIIa之后使用血栓弹力图(TEG)反映血友病中的凝血潜力，且此处用于评估向血友病狗施用的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽。用血液样品进行TEG分析，其中舍弃前3mL血液，且随后抽取1mL血液且与高岭土(血液分光镜(Haemoscope))混合。将360μL等分试样的预混合血液/引发剂置放于测量仪器(Haemoscope TEG 5000血栓弹力图)中且分析。使TEG记录进行约60至90分钟。在各选定取样点抽取血液且在使用仪器收集之后2分钟内测试血液。
结果
五只狗包括于研究中且根据方案进行单独治疗。三只狗展现有后腿血肿，一只狗展现有右前腿的出血，且一只狗展现在其胸部左侧有血肿。个别概述表展示于以下表15-1至表15-5中。
狗W03具有左后腿血肿(不负重)。对它用SQ施用的120μg/kg T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽治疗两次。各剂量相隔4.5小时。血容比快速增加，稳定，且第二天，狗在受感染的腿部上负有一定重量，其中肿胀略微减小且坚硬。未指示进一步治疗。在随后两天内，肿胀逐渐减小，且所述腿完全负重，且狗为活跃的。TEG结果不受治疗影响，且确定所有R值大于60分钟。狗W03数据的汇总在以下表15-1中，且图19A描绘狗W03的TEG特征和血容比。图20A-20E描绘在SQ治疗之后的不同时间点自狗W03测量的TEG迹线。
表15-1狗W03概述表
Figure BDA0003582772610000921
缩写：BAR＝聪明、机警和有反应；FVIII-＝VIII因子缺陷；HCT＝血容比；LR＝左后；SC＝皮下；TEG＝血栓弹力图。
狗R11在胸部左侧呈现大血肿。在研究之前两天，施用11.3U/kg剂量的重组狗FVIII(rcFVIII)。尽管接受这一处理，但HCT自37.5％下降至20.5％。进一步施用19U/kgrcFVIII以及450mL全血(WB)。第二天，HCT为36.5％，血肿坚硬，自胸部引流进入腹股沟区域，且施用200mL正常狗血浆(NCP)。八小时之后，HCT降低至31％且进一步施用250mL NCP。
未能充分对rcFVIII和WB输注起反应之后，以60μg/kg的剂量相隔三小时SQ施用三次剂量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽，且第二天以60μg/kg的最终剂量回应于错误低血容比IV施用。在24小时之后在35％下测量血容比，且评定出血经解决。在开始rcFVIII治疗之前测定无TEG。治疗后TEG反映10.2分钟的低R时间，且在治疗之后仅观测到轻微变化。狗R11数据的概述在下表15-2中，且图19B描绘狗W03的TEG曲线和血容比。图21A-21M描绘在SQ治疗之前和之后以及在第二天IV治疗之前和之后的各种时间点自狗R11测量的TEG迹线。T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽在图式中也称为“经修饰的FVIIa”。
表15-2狗R11概述表
Figure BDA0003582772610000931
Figure BDA0003582772610000941
缩写：FVIII-＝因子VIII缺陷；HCT＝血容比；SC＝皮下；TEG＝血栓弹力图；WB＝全血。
狗R04具有右后腿血肿，但继续负重。血容比不受影响且保持稳定，在观测四天期间为约40％。在第1天将三个剂量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽相隔三小时施用。在第2天，血肿尺寸降低，且隔六小时注射两个剂量。最后，在第3天施用两个剂量，各相隔五个小时。观察到血肿几乎消退，其中显著引流至肘关节中。所有处理均为120μg/kgT128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽，皮下给药。认为出血在第4天解决，且排出已减少且腿为完全负重。这些结果概述于以下表15-3中。
进行关于治疗的TEG分析。自40分钟的基线R值，回应于用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的治疗，R时间减短，自第1天33分钟降至第2天R时间修正至14分钟的低值。在第3天在治疗之前R时间增加至32分钟，随后降至24分钟。TEG曲线和狗R04的血容比描绘于图19C中，在图22A-22T中描绘了TEG迹线。TEG迹线在SQ施用T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa多肽之前和之后。
表15-3狗R04概述表
Figure BDA0003582772610000942
Figure BDA0003582772610000951
缩写：BAR＝聪明、机警和有反应；FVIII-＝因子VIII缺陷；HCT＝血容比；SC＝皮下；TEG＝血栓弹力图。
呈现有右后腿血肿的狗W64，其在隔离后未负重三天且未有改善。血容比保持在观测时段内正常范围内的40-47％。T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽在第1天以120μg/kg的剂量施用SQ三次，且在第2天、第3天和第4天施用两次。在个别日，以三个小时间隔施用剂量。在第一次治疗T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽之后两天，狗开始在右前腿上负有一定重量，且随后在后续两天内逐渐改善。认为出血在第4天消退。这些结果概述于以下表15-4中。
在与治疗相关的所有四天进行TEG分析，且观测到对T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa多肽治疗的明显反应。自60分钟的基线R值，回应于用T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa多肽的治疗，R时间在第1天下降至23分钟。在第2天，预施用的R时间为38分钟，接着降至低至24分钟；在第3天观测到增加至39分钟，且再次降至24分钟。在第4天，在治疗前，R时间为33分钟，接着在治疗后下降至25分钟。图19C描绘狗W03的TEG曲线和血容比，且图23A-23P中描绘狗W64的TEG迹线。TEG迹线在SQ施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽之前和之后。
表15-4狗W64概述表
Figure BDA0003582772610000971
缩写：BAR＝聪明、机警和有响应；FVIII-＝因子VIII缺陷；HCT＝血容比；na＝不适用；SC＝皮下；TEG＝血栓弹力图。
狗V30在右前腿中呈现出血，且起初用195mL NCP治疗。第二天，狗继续存在，其中右前腿不负重跛行，每个方案间隔进行三次SQ施用120μg/kg剂量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽。然后，狗开始使用腿，且认为出血消退。在诊断时测定60％HCT且不进行进一步分析，因为认为狗恢复。这些数据概述于以下表15-5中。未进行给药前TEG，但确定基线R时间为在出血事件之后60分钟，4天。在第一次注射后半小时33分钟时观测到对T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽施用的明显反应，随后在三次注射后下降至最少15分钟，在停止治疗时恢复至基线。图19E描绘狗V30的TEG曲线和血容比。图24A-24F描绘SQ施用狗V30之后的TEG迹线和转化为未治疗基线的迹线。
表15-5狗V30概述表
Figure BDA0003582772610000981
缩写：FVIII-＝因子VIII缺陷；HCT＝血容比；NCP＝正常狗血浆；SC＝皮下；TEG＝血栓弹力图。
如上所述，向患有自发性出血的五只血友病狗皮下施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽以控制出血。根据所述方案，狗每天至多治疗三次，剂量为120μg/kg，或比三个小时时间间隔长。五只狗在1至4天期间接受2至9皮下剂量的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽。
对T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的皮下施用的总体临床反应在对照出血下呈阳性，且在狗的情况下一般改善。因此，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的皮下施用似乎有效作为对血友病中的自发性出血的按需求治疗。所展现的数据支持先前结果，证实在血友病性小鼠中T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的止血作用，在尾损伤之后皮下按需求治疗(参见实例1和2)。皮下T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽施用作为单一疗法有效，且在向具有自发性持续出血的血友病狗施用时引起临床症状消退。
实例12：经修饰的FVIIa多肽皮下施用对A型血友病大鼠中自发性出血的作用
如先前所论述(参见实例8)，评估T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的皮下(SQ或SC)施用其作为在血友病A(HA)大鼠中自发发生的出血事件的按需求治疗的用途，在初始剂量后24小时评定。所述发现的进一步论述如下。
研究设计
T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽提供于含有4.6mg药品的小瓶中，且用2.2ml无菌水复原至2.1mg/mL的浓度，且立即冷冻。媒剂对照组由如下调配有T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的媒剂组成：10Mm L-组氨酸、29mM蔗糖、390mM甘氨酸、10mM氯化钙二水合物、3.35mM L-甲硫氨酸和0.03％Tween-80，pH 6.0。研究中所用的给药方案提供于下文表16-1中。
表16-1：各治疗组的给药方案
Figure BDA0003582772610000991
出血的严重程度评分和各评分的实例展现于下表16-2中。
表16-2：用实例进行出血严重程度评分
Figure BDA0003582772610000992
结果
十二只F8-/-大鼠参与研究，且记录总计14个独立出血事件的数据。大鼠在首次观测出血时的年龄介于22至76天范围内。在两只动物中，在第一和第二次出血事件之间的天数为15至22天，各在交叉方案中观测到且各在按照方案所允许的两个出血中治疗。两组之间在治疗时年龄不存在显著差异(P＝0.33)。
如由严重程度评分，无生命威胁出血的类型为四个轻度、九个中度，且当观测相关症状时，在第一场合记录一次严重出血。在经分配以接受T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽或媒剂的两个治疗组大鼠中，出血严重程度的分布随机且相当(P＝0.66)。图25A-25B分别描绘患有自发性出血的大鼠在开始和总体治疗结果下的严重程度出血评分，其中大鼠用SQ施用385μg/kg下的T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽或媒剂处理，至多三次。
处理总共14个独立出血事件。一个出血事件各治疗十只大鼠且两个出血事件治疗两只大鼠，各具有交叉指定。在对照组中，用媒剂处理六只大鼠，持续轻度或中度出血。如通过在第一次给药之后24小时临床评分所评定，用SC媒剂对照处理一只大鼠的轻微出血，自发消退。对照组中的其他五只大鼠未能对用公平(n＝2)或不良结果(n＝3)的治疗起反应。总体来说，对于媒剂对照组，如通过组中总治疗数目中的治疗成功的分数所评估的为17％。
相比之下，在活性治疗组中，六只大鼠接受单次剂量的T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa多肽，一只大鼠接受两次剂量，且一只大鼠接受三次剂量，均根据方案，持续总计8只经治疗的出血。在所有情况下，无动物展示对包括注射部位的T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa多肽的SC治疗的任何不良影响。值得注意的是，给药最多的大鼠允许三次，呈现在研究中所观测到的唯一严重出血(JRAJ15.2c，展示于以下表17-1中)。在经处理的八只大鼠中，两只大鼠显示良好反应和改善，而六只大鼠的疗法结果极佳使得如通过二元失效/成功比率所评估，在这一实验中T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽实现100％功效。这些剂量和结果的概述展现于下表17-1中，且具有大鼠的治疗结果的出血来源的概述展现于下表17-2中。
表17-1
Figure BDA0003582772610001011
缩写：经修饰的FVIIa＝T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa a大鼠在交叉处理中接受媒剂和经修饰的FVIIa两者。
表17-2：对患有自发性出血的A型血友病大鼠用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽或媒剂治疗的24小时内出血起始和治疗结果
Figure BDA0003582772610001012
Figure BDA0003582772610001021
缩写：Rx＝T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽385μg/kg SQ或媒剂SQ。
a大鼠在交叉处理中接受T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽和媒剂。
在接受交叉处理的两只大鼠中，1)JRAJ15.2c在用T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa多肽处理严重出血时具有良好结果，但在用媒剂处理中度严重出血时仅具有一般结果；和2)JRAJ3.2f在用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽处理中度严重出血时具有极佳结果，且经媒剂处理轻度出血具有极佳结果。
当与媒剂对照物相比时，用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽处理的大鼠展示明显改善和统计显著优越性(P＝0.007)。
更严重出血(一个严重和一个中度)为需要最强烈疗法来解决的出血。所报导的数据还展示，仅轻度中的一个和无中度出血自发地恢复。按需求皮下施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽展示可有效地治疗HA大鼠中的自发性出血事件。在一至三次治疗剂量之后SQ T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的功效为100％，以治疗轻度、中度和重度出血。相比之下，用SQ媒剂处理的六只大鼠中仅一个具有积极治疗结果；所有其他媒剂处理的动物在第一次给药之后24小时未死亡出血事件的改善或显著恶化。这些结果支持在出血开始之后SQ施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽能够按需求治疗出血，且大部分出血在无治疗性干预的情况下将不会得到解决。
实例13：在大鼠静脉内和皮下施用之后各种经修饰和未经修饰的FVIIa多肽的比较非隔室药物动力学
在单次静脉内(IV)或皮下(SQ)施用之后评估T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽、Q286R/M298Q FVIIa多肽和未经修饰的FVIIa多肽(在本文中称为重组FVIIa或rFVIIa)的药物动力学(PK)。各自以单次IV或SQ剂量形式提供至三十一只大鼠。
IV给药如下：0.3mg/kg T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽和Q286R/M298QFVIIa多肽和0.6mg/kg rFVIIa，而SQ给药如下：1.5mg/kg T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa多肽和Q286R/M298Q FVIIa多肽和3mg/kg rFVIIa。大鼠随机分配成六个组，其中血液取样在IV组给药前和给药后0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6和8小时进行，和在SQ组给药前和给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、16和24小时进行。在所述研究的方法中，将另外的十五只大鼠分配至SQ组(T128N/P129A/Q286R/M298Q n＝6、Q286R/M298Q n＝6，和rFVIIan＝3)，在T128N/P129A/Q286R/M298Q和Q286R/M298Q之后0.5和16小时具有两个取样点，且在rFVIIa后0、0.5和16小时时具有三个样品点。使用
Figure BDA0003582772610001031
VIIa-TF分析测定药物浓度。使用Phoenix WinNonlinTM进行非隔室分析(NCA)且获得以下参数：消除速率常数(ke)、消除半衰期(t1/2)、观测到的最大浓度(Cmax)以及时间最大浓度(tmax)、最终观测到的样品的时间(tlast)、自时间零至最终测量的样品的浓度-时间曲线下面积(AUC(0-last))、自时间零至无穷大的浓度-时间曲线下面积(AUC(0-∞))、分布体积(Vd)和清除率(CL)。各化合物的IV与SQ之间的生物可用性通过计算SC途径的剂量标准化AUC(0-∞)的平均值与IV途径的剂量标准化AUC(0-∞)的平均值的比率得到。将16小时样品与所有Cmax后样品合并以使用线性回归在进行IV和SC施用之后得到所有三种药物的平均半衰期。
使用针对多重比较调节的单向未配对ANOVA来评估三种化合物之间的NCA-推导PK参数的统计学差异。对于IV组，在rFVIIa与其他两种药物之间在ke中看到统计差异。对于SQ组，观测到T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽与其他两种药物之间(AUC(0-∞))/剂量的统计差异，但不在ke中。计算T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽的生物可用性为22.0％，Q286R/M298Q多肽的生物可用性为15.2％且rFVIIa的生物可用性为11.3％。对于T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽、Q286R/M298Q多肽和rFVIIa，在IV施用之后使用回归分析所得的平均t_1/2为1.68、1.76和1.16小时。在SC施用T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa多肽之后可见最长t_1/2，其相较于rFVIIa和Q286R/M298Q多肽长两倍。在SC施用T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽、Q286R/M298Q多肽和rFVIIa之后，平均t_1/2为5.01、3.00和2.57小时。由于污染、溶血或凝固，NCA不包括总共十五只动物。
对于表18-1和18-2中的IV和SQ给药，分别列出个别PK参数估计值以及剂量标准化PK参数以及统计概述。紧靠着显著不同的PK参数给与星号。
表18-1：IV给药之后每种ID和化合物的PK参数的统计概述
Figure BDA0003582772610001041
Figure BDA0003582772610001051
经图基调整的p值(Tukey-adjusted p-value)：*p值<0.05，**p值<0.01，***p值<0.001
￥Q286R/M298Q FVIIa与T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa之间的显著差异
Figure BDA0003582772610001052
Q286R/M298Q FVIIa与rFVIIa之间的显著差异
ΩT128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa与rFVIIa之间的显著差异
表18-2：在SC给药之后，每个ID和化合物的PK参数的统计概述
Figure BDA0003582772610001061
经图基调整的p值(Tukey-adjusted p-value)：*p值<0.05，**p值<0.01，***p值<0.001
￥Q286R/M298Q FVIIa与T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa之间的显著差异
Figure BDA0003582772610001062
Q286R/M298Q FVIIa与rFVIIa之间的显著差异
ΩT128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa与rFVIIa之间的显著差异
a并非由于太少动物而推导的SD和CV
使用NCA，在IV施用之后的平均半衰期(t1/2)对于T128N/P129A/Q286R/M298QFVIIa多肽估计为2.22小时，对于Q286R/M298Q多肽为1.87小时且对于rFVIIa为1.29小时，而在SQ施用之后的平均t1/2对于T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽估计为5.85小时，对于Q286R/M298Q多肽为2.32小时，且对于rFVIIa为2.86小时。在T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽SQ组中观测到最长t1/2。基于仅两只动物估计这一参数，因为来自剩余四只动物的数据在消除速率常数(在Cmax之后，经调整的R2<0.8或<3个样品)的估计方面精确度过低。
基于各药物的平均剂量调整的AUC0-∞，对于T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽F经计算为22.0％，对于Q286R/M298Q多肽为15.2％且对于rFVIIa为11.3％。这些概述于以下表18-3中：
表18-3：静脉内(IV)与皮下(SC)施用Q286R/M298Q多肽、T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽与rFVIIa之间的生物可用性(％)
Figure BDA0003582772610001071
还在IV或SQ施用之后，使用所有Cmax观测后的回归线的斜率(包括额外十五只动物的所有16小时样品)估计所有三个药物的平均半衰期。在Q286R/M298Q多肽SQ组中，给药后六次16小时观测结果中仅一个点高于LLOQ。这一样品为20.48ng/ml，高于LLOQ的20ng/ml。图26描绘关于具有回归线的各组半对数尺度以及其经调整的R2和所估计的斜率的六张浓度对时间标绘图。下表18-4展示线性回归的结果。
表18-4：通过合并药物和施用途径的Cmax和子集后所有观测结果使用回归线来估计平均ke和t1/2
Figure BDA0003582772610001081
在IV组中，平均t1/2对于T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽为1.68小时，对于CB813a为1.76小时，且对于rFVIIa为1.16小时，而在SC组中，平均t1/2对于T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽为5.01小时，对于Q286R/M298Q多肽为3.00小时，且对于rFVIIa多肽为2.57小时。表18-5展示NCA后的平均t1/2与IV途径和SC途径两者的合并观测结果的回归分析的比较。
表18-5：使用NCA的平均t1/2(小时)和合并观测结果的线性回归的比较
Figure BDA0003582772610001082
对于IV组，在rFVIIa与其他两种药物之间在ke中看到统计差异。在rFVIIa之后，平均ke(0.55h-1)比在Q286R/M298Q多肽(＝0.39h-1)或T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽(0.34h-1)之后显著更高。所有剂量标准化PK参数，例如
Figure BDA0003582772610001083
和
Figure BDA0003582772610001084
无显著不同。
至于SQ组，对于五只动物(在T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽中的四个和在rFVIIa中的一个)，除AUC0-∞，ke、t1/2、
Figure BDA0003582772610001085
和
Figure BDA0003582772610001086
未经推导，因为消除斜率据估计精确度太低(在Cmax之后经调整的R2<0.8或<3个样品)。两只大鼠保持在T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽组中以得到PK参数。在T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽和其他两种药物中
Figure BDA0003582772610001087
和
Figure BDA0003582772610001088
之间观测到统计差异。与Q286R/M298Q多肽(0.0019h·kg/ml)和rFVIIa(0.0014h·kg/ml)相比，T128N/P129A/Q286R/M298Q FVIIa多肽具有更高的
Figure BDA0003582772610001091
(0.0039h·kg/ml)，且与Q286R/M298Q多肽(565ml/h·kg)和rFVIIa(730ml/h·kg)相比，
Figure BDA0003582772610001092
更低(269ml/h·kg/ml)。在Q286R/M298Q多肽B813a(1826ml/kg)和rFVIIa(2915ml/kg)的C的
Figure BDA0003582772610001093
中也见到显著差异。

Claims (184)

1.一种治疗受试者中出血事件的方法，其包含向所述受试者皮下施用一定剂量的经修饰的因子VIIa，所述经修饰的因子VIIa在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中：
位置286处的所述修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；
位置298处的所述修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；
所述皮下施用所述经修饰的FVIIa具有增加的活性或效能；且
一定剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前和/或之后约5或4或3或2或1或更少小时或分钟内皮下施用，从而减少或停止出血量或矫治或治愈所述出血的病因。
2.根据权利要求1所述的方法，所述经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置128的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中：
位置128处的所述修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，所述经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置129的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中：
位置129处的所述修饰为Ala(A)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之后约5、或4、或3、或2、或1或更少小时或分钟内皮下施用。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前约5、或4、或3、或2、或1或更少小时或分钟内皮下施用。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前约5小时内皮下施用。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前约4小时内皮下施用。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前约3小时内皮下施用。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前约2小时内皮下施用。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前约1小时内皮下施用。
11.根据权利要求4所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之后约5小时内皮下施用。
12.根据权利要求4所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之后约4小时内皮下施用。
13.根据权利要求4所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之后约3小时内皮下施用。
14.根据权利要求4所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之后约2小时内皮下施用。
15.根据权利要求4所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之后约1小时内皮下施用。
16.根据权利要求5所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前约5分钟内皮下施用。
17.根据权利要求5所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前约4分钟内皮下施用。
18.根据权利要求5所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前约3分钟内皮下施用。
19.根据权利要求5所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前约2分钟内皮下施用。
20.根据权利要求5所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之前约1分钟内皮下施用。
21.根据权利要求4所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之后约5分钟内皮下施用。
22.根据权利要求4所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之后约4分钟内皮下施用。
23.根据权利要求4所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之后约3分钟内皮下施用。
24.根据权利要求4所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之后约2分钟内皮下施用。
25.根据权利要求4所述的方法，其中所述剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血事件之后约1分钟内皮下施用。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中每3至7、2至5、4至6或4至12小时皮下施用重复皮下剂量的所述经修饰的FVIIa直至所述出血停止、所述病因得到矫治、或任何伤口经治愈或持续1至2、3、4或5天。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述剂量的经修饰的FVIIa每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时施用。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中：
所述出血为间歇性或可由所述受试者预测的；和
所述受试者是在所述出血开始之前，用一定皮下剂量的所述经修饰的FVIIa治疗。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中：
所述出血事件由创伤或损伤引起；和
所述受试者是在所述出血事件之后15分钟、1、2、3或4小时，用一定皮下剂量的所述经修饰的FVIIa治疗。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中：
所述受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；
在手术之前5、4、3、2、1小时或更短时间皮下施用一定剂量的所述经修饰的FVIIa；
所述受试者在手术期间用FVIIa经静脉内治疗；和
在手术之后至少一次皮下施用一定剂量的所述经修饰的FVIIa直至不存在出血和/或出血风险，或直至所述受试者经治愈或所述病因得到矫治。
31.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中：
所述受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；
在手术之前至少4小时、或3小时、或2小时、或1小时向所述受试者施用一定剂量的所述经修饰的FVIIa；
在手术之后2至3小时皮下施用一定剂量的所述经修饰的FVIIa；
所述经修饰的FVIIa任选的在另外2至3小时之后再次施用；且
其后一天一次或两次施用所述经修饰的FVIIa，直至所述受试者经治愈或所述出血的病因得到矫治。
32.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中：
所述受试者患有血友病或其他出血病症或病状，且正在进行手术；和
在手术之后每4至6小时皮下施用一定剂量的所述经修饰的FVIIa直至出血停止或所述受试者经治愈或所述出血的病因得到矫治。
33.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述出血是归因于手术或创伤。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述出血是以以下表达：急性关节血肿、单一关节血肿、慢性嗜血性关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠出血、气道出血、口腔出血、自发性出血、关节出血、脑出血或突破性出血。
35.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述出血是归因于拔牙或牙龈出血。
36.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述出血为手术出血。
37.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中：
所述出血为手术出血；和
手术为关节手术、肢体手术、心脏手术、血管成形术、上呼吸道手术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、关节置换术、血管手术、牙科手术或器官移植手术。
38.根据权利要求36所述的方法，其中手术为选自骨髓、心脏、肺、胰脏和肝脏移植的移植手术。
39.根据权利要求36所述的方法，其中手术为髋关节或膝关节置换术或关节固定术。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述出血为急性的且由创伤或手术引起，或间歇性出血为月经出血或关节出血或目标关节出血或经治愈或矫治的手术伤口。
41.根据权利要求40所述的方法，其中施用为每2至4小时或3至6小时或4至6小时。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中：
所述出血为间歇性或可预测的；和
所述受试者在所述出血之前经预治疗。
43.根据权利要求42所述的方法，其中预治疗是在所述出血之前约4小时或更短时间实施。
44.根据权利要求43所述的方法，其中预治疗是在所述出血之前约3小时或更短时间，或2小时或更短时间，或1小时或更短时间实施。
45.根据权利要求43所述的方法，其中预治疗是在所述出血之前至少15分钟实施。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述出血为手术的结果。
47.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述出血为创伤或损伤的结果。
48.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述出血来自伤口。
49.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述出血为月经出血或为关节出血。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa施用多次，直至所述出血停止或任何伤口经治愈或出血得到矫治。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，其中一次或多次剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血之前皮下施用。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中一次或多次剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血开始之后皮下施用。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的方法，其中一定剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述出血开始1分钟至2小时内施用。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa皮下施用多次，直至所述出血停止或所述伤口愈合或出血得到矫治。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中以所述所治疗受试者的重量计，所述经修饰的FVIIa的单次剂量为约10μg/kg至30μg/kg、10μg/kg至60μg/kg、10μg/kg至90μg/kg、10μg/kg至120μg/kg、30μg/kg至60μg/kg、30μg/kg至90μg/kg、30μg/kg至120μg/kg、10μg/kg至500μg/kg、或15μg/kg至400μg/kg、或15μg/kg至350μg/kg、或20μg/kg至400μg/kg、或20μg/kg至350μg/kg、或30μg/kg至350μg/kg、或25μg/kg至350μg/kg。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中以所述所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约60至约120μg/kg。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的方法，其中以所述所治疗受试者的重量计，单次皮下剂量为约60μg/kg。
58.根据权利要求1至56中任一项所述的方法，其中以所述所治疗受试者的重量计，所述经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为10至500μg/kg、30至300μg/kg或60至120μg/kg。
59.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中经修饰的FVIIa的单次剂量为每剂量约10μg/kg至500μg/kg、或15μg/kg至400μg/kg、或15μg/kg至350μg/kg、或20μg/kg至400μg/kg、或20mg/kg至350μg/kg、或30μg/kg至350μg/kg、或25μg/kg至350μg/kg。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa的单次皮下剂量的体积为10mL或更小或5mL或更小。
61.根据权利要求1至60中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa的单次皮下剂量的体积为约1mL至2mL、或1.25mL至1.5mL、或1mL至10mL。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的方法，其进一步包含施用额外的凝血剂治疗或因子。
63.根据权利要求1至62中任一项所述的方法，其中所述治疗包含施用抗体艾美赛珠单抗(emicizumab)-kxwh和/或因子VIII抑制剂旁路活性产品。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述额外凝血因子选自以下中的一个或多个：血浆纯化或重组凝血因子；促凝血剂，例如维生素K、维生素K衍生物和蛋白C抑制剂；血浆；血小板；红血球和皮质类固醇。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的方法，其进一步包含施用抗组织因子路径抑制剂(TFPI)抗体。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述抗TFPI抗体为康次珠单抗(concizumab)。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的方法，其进一步包含施用靶向抗凝血酶(AT)的RNA干扰(RNAi)治疗剂。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述靶向AT的RNAi治疗剂为菲图司兰(fitusiran)。
69.根据权利要求1至68中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的疾病或病状：凝血障碍、血液病症、出血性异常、血友病和其他出血病症。
70.根据权利要求1至69中任一项所述的方法，其中所述受试者患有A型血友病、B型血友病、具有抑制剂的A型血友病、具有抑制剂的B型血友病、因子VII缺陷、格兰茨曼氏血小板无力症(Glanzmann thrombasthenia)、后天性血友病或采取抗凝血剂疗法。
71.根据权利要求1至70中任一项所述的方法，其中所述受试者患有血友病；且所述血友病选自以下之中：A型血友病、B型血友病和C型血友病、具有抑制剂的A型血友病和具有抑制剂的B型血友病。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述血友病为先天性的。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述血友病为后天性的。
74.根据权利要求71至73中任一项所述的方法，其中所述受试者具有针对因子VIII或因子IX的自体抗体。
75.根据权利要求71至74中任一项所述的方法，其中以所述所治疗受试者的重量计，所述经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约60μg/kg至约120μg/kg。
76.根据权利要求71至75中任一项所述的方法，其中以所述所治疗受试者的重量计，所述经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约60μg/kg。
77.根据权利要求71至75中任一项所述的方法，其中以所述所治疗受试者的重量计，所述经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约120μg/kg。
78.根据权利要求70所述的方法，其中所述受试者患有因子VII缺陷。
79.根据权利要求78所述的方法，其中以所述所治疗受试者的重量计，所述经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约10至约20μg/kg。
80.根据权利要求78至79中任一项所述的方法，其中以所述所治疗受试者的重量计，所述经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约10μg/kg。
81.根据权利要求78至79中任一项所述的方法，其中以所述所治疗受试者的重量计，所述经修饰的FVIIa的单次皮下剂量为约20μg/kg。
82.根据权利要求1至81中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受口服抗凝血剂疗法。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述口服抗凝血剂疗法包含以下中的一个或多个：肝素、达比加群(dabigatran)、利伐沙班(rivaroxaban)、阿派沙班(apixaban)、贝米肝素(bemiparin)、那屈肝素(nadroparin)、瑞肝素(reviparin)、依诺肝素(enoxaparin)、帕肝素(parnaparin)、舍托肝素(certoparin)、达肝素(dalteparin)和亭扎肝素(tinzaparin)。
84.根据权利要求1至83中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa的效能大于SEQID NO:3的所述FVIIa的效能。
85.根据权利要求1至84中任一项所述的方法，其中在无组织因子存在下，与SEQ IDNO:3的野生型FVIIa相比，所述经修饰的FVIIa具有增加的凝血活性。
86.根据权利要求1至84中任一项所述的方法，其中在组织因子存在下，所述经修饰的FVIIa具有增加的凝血活性。
87.根据权利要求1至86中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa在组织因子依赖性分析中具有大于100％、150％、200％或250％或大于在相同分析中未经修饰的FVIIa(SEQ ID NO:3)的kcat/km。
88.根据权利要求1至87中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa具有凝血活性，其为在相同分析中SEQ ID NO:3的未经修饰的FVIIa的活性的至少1.5倍。
89.根据权利要求1至88中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa的效能为SEQID NO:3的所述未经修饰的FVIIa的至少3倍、或4倍、或5倍。
90.根据权利要求1至89中任一项所述的方法，其中如通过活化部分凝血活酶时间(aPTT)和/或血栓弹力图(TEG)或任何评定凝血酶产生的分析所评定，所述FVIIa具有增加的效能。
91.根据权利要求1至90中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa多肽的凝血活性为SEQ ID NO:3的所述未经修饰的FVIIa多肽的所述凝血活性的至少110％、150％、200％、250％、300％、400％、500％或更多。
92.根据权利要求1至91中任一项所述的方法，其中与所述未经修饰的FVIIa相比，所述经修饰的FVIIa具有增加的血清半衰期或增加的末端消除半衰期。
93.根据权利要求1至92中任一项所述的方法，其中与具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列的所述未经修饰的FVIIa相比，所述经修饰的FVIIa具有较大凝血活性或效能。
94.根据权利要求1至93中任一项所述的方法，其中：
当呈活化形式时，所述经修饰的FVIIa多肽呈现促凝血活性。
95.根据权利要求94所述的方法，其中：
所述促凝血活性大于具有SEQ ID NO:3中所阐述的一级氨基酸序列的FVIIa多肽的促凝血活性。
96.根据权利要求1至95中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa多肽为包含SEQID NO:280的氨基酸序列或包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的双链活化因子VII(FVIIa)多肽，其在位置152处的精氨酸与位置153处的异亮氨酸之间裂解。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述第一链与所述第二链是通过至少一个二硫桥键连接。
98.根据权利要求1至97中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa多肽与SEQ IDNO:280具有至少90％氨基酸序列一致性，其中对应于SEQ ID NO:280的位置128、129、286和298的所述氨基酸是不变的。
99.根据权利要求1至97中任一项所述的方法，其中所述双链多肽的所述第一链和所述第二链分别由SEQ ID NO:280的氨基酸1至152和153至406组成。
100.根据权利要求1至99中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa多肽包含一种或多种氨基酸修饰，所述一种或多种氨基酸修饰增加对抗凝血酶III的抗性、增加与磷脂的结合和/或对其的亲和力、增加对于组织因子的亲和力、增加内在活性、增加TF依赖性活性、增加凝血活性、改变所述多肽的构形以改变酶原性、通过使高度活性FVIIa构形与较低活性FVIIa构形之间的平衡偏移以有利于所述高度活性构形来增加催化或凝血活性、增加对蛋白酶的抗性、降低糖基化、增加糖基化、降低免疫原性、增加稳定性和/或促进化学基团键联。
101.根据权利要求1至100中任一项所述的方法，其中所述未经修饰的FVIIa多肽的一级序列由SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列组成。
102.根据权利要求1至101中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa多肽经转译后修饰。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述转译后修饰包含糖基化。
104.根据权利要求103所述的方法，其中转译后修饰为O-连接的糖基化。
105.根据权利要求103或权利要求104所述的方法，其中转译后修饰为N连接的糖基化。
106.根据权利要求102至105中任一项所述的方法，其中转译后修饰为谷氨酸羧化成γ-羧基谷氨酸。
107.根据权利要求102至106中任一项所述的方法，其中转译后修饰为天冬氨酸羟基化成β-羟基天冬氨酸。
108.根据权利要求1至107中任一项所述的方法，其中所述FVIIa多肽的所述修饰为氨基酸置换、插入、缺失或其组合。
109.根据权利要求1至108中任一项所述的方法，其中与静脉内施用所述经修饰的FVIIa相比，所述皮下施用所述经修饰的FVIIa具有增加的末端消除半衰期。
110.根据权利要求1至109中任一项所述的方法，其中一定剂量的所述经修饰的FVIIa是以多次给药方案施用。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述多次给药方案包含在约24小时内至少两次或至少三次剂量。
112.根据权利要求110至111中任一项所述的方法，其中所述多次给药方案的至少一次剂量包含每公斤所述受试者体重约30μg、每公斤所述受试者体重约45μg、每公斤所述受试者体重约60μg、每公斤所述受试者体重约90μg或每公斤所述受试者体重约120μg。
113.根据权利要求110至112中任一项所述的方法，其中所述多次给药方案的各剂量为相同的。
114.根据权利要求110至112中任一项所述的方法，其中所述多次给药方案的各剂量相隔约2至约6小时持续预定时段进行。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述预定时段为约24小时。
116.根据权利要求110至115中任一项所述的方法，其中所述多次给药方案在约24小时内包含最大3次剂量。
117.根据权利要求110至116中任一项所述的方法，其中以所述所治疗受试者的重量计，所述多次给药方案的各剂量为60μg/kg。
118.根据权利要求110至117中任一项所述的方法，其中所述多次给药方案以递增给药方案形式施用。
119.根据权利要求1至118中任一项所述的方法，其中至少一次剂量的所述经修饰的FVIIa在所述皮下施用之前静脉内施用。
120.根据权利要求1至119中任一项所述的方法，其中任何单次剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述受试者的两个不同解剖部位处以分剂量形式施用。
121.根据权利要求1至119中任一项所述的方法，其中任何单次剂量的所述经修饰的FVIIa是在所述受试者的单个解剖部位处以分剂量形式施用。
122.根据权利要求1至121中任一项所述的方法，其中任何单次剂量的所述经修饰的FVIIa的量为约2至约6mg。
123.根据权利要求1至122中任一项所述的方法，其中任何单次剂量的所述经修饰的FVIIa的量为约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6或约6.5mg。
124.根据权利要求1至123中任一项所述的方法，其中任何单次剂量的所述经修饰的FVIIa的量为约4.5mg。
125.根据权利要求1至124中任一项所述的方法，其中所述受试者为成人。
126.根据权利要求1至124中任一项所述的方法，其中所述受试者为青少年、儿童或婴儿。
127.根据权利要求1至126中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa以单一疗法形式施用。
128.根据权利要求1至127中任一项所述的方法，其中所述皮下施用所述经修饰的FVIIa具有大于静脉内施用所述经修饰的FVIIa多肽的活性或效能。
129.根据权利要求1至128中任一项所述的方法，其中所述皮下施用所述经修饰的FVIIa具有大于静脉内施用未经修饰的FVIIa多肽的活性或效能。
130.根据权利要求1至129中任一项所述的方法，其中所述皮下施用所述经修饰的FVIIa具有大于皮下施用未经修饰的FVIIa多肽的活性或效能。
131.根据权利要求1至130中任一项所述的方法，其中所述活性或效能为所述经修饰的FVIIa的生物可用性和/或药物动力学概况。
132.根据权利要求1至131中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa包含SEQ IDNO:280或SEQ ID NO:138中所阐述的氨基酸序列。
133.一种向经历出血的受试者或向可能经历出血的受试者提供按需求治疗的方法，其包含向所述受试者施用一定皮下剂量的经修饰的FVIIa，所述经修饰的FVIIa在包含SEQ IDNO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中：
位置286处的所述修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；
位置298处的所述修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；和
所述剂量为每公斤所述受试者体重约10至约120μg。
134.根据权利要求133所述的方法，所述经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置128的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中：
位置128处的所述修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换。
135.根据权利要求133至134中任一项所述的方法，所述经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置129的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中：
位置129处的所述修饰为Ala(A)。
136.根据权利要求133至135中任一项所述的方法，其中所述皮下剂量的经修饰的FVIIa是以多次给药方案施用。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述多次给药方案包含在24小时时段内至少两次或至少三次剂量。
138.根据权利要求136至137中任一项所述的方法，其中所述多次给药方案的各剂量为相同的。
139.根据权利要求136至138中任一项所述的方法，其中所述多次给药方案在24小时时段内包含两次剂量。
140.根据权利要求136至138中任一项所述的方法，其中所述多次给药方案在24小时时段内包含三次剂量。
141.根据权利要求136至140中任一项所述的方法，其中所述多次给药方案的各剂量是相隔约2至约6小时持续进行预定时段。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述多次给药方案的各剂量是相隔约3小时持续进行预定时段。
143.根据权利要求141至142中任一项所述的方法，其中所述预定时段为约24小时。
144.根据权利要求133至143中任一项所述的方法，其中所述受试者患有A型血友病、B型血友病、具有抑制剂的A型血友病、具有抑制剂的B型血友病、因子VII缺陷、格兰茨曼氏血小板无力症、后天性血友病或采取抗凝血剂疗法。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述受试者患有血友病；且所述血友病选自以下之中：A型血友病、B型血友病和C型血友病、具有抑制剂的A型血友病和具有抑制剂的B型血友病。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述血友病为先天性的。
147.根据权利要求145所述的方法，其中所述血友病为后天性的。
148.根据权利要求133至147中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受口服抗凝血剂疗法。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述口服抗凝血剂疗法包含以下中的一个或多个：肝素、达比加群、利伐沙班、阿派沙班、贝米肝素、那屈肝素、瑞肝素、依诺肝素、帕肝素、舍托肝素、达肝素和亭扎肝素。
150.根据权利要求133至149中任一项所述的方法，其中所述剂量为每公斤所述受试者体重约20至约60μg。
151.根据权利要求133至150中任一项所述的方法，其中所述剂量为每公斤所述受试者体重约60μg。
152.根据权利要求133至151中任一项所述的方法，其中所述按需求治疗包含向经历出血的受试者施用所述治疗。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述皮下剂量是在所述出血开始之后约1分钟至约1小时、或约2、或约3、或约4小时施用。
154.根据权利要求152至153中任一项所述的方法，其中所述皮下剂量是在所述出血开始之后约1分钟施用。
155.根据权利要求152至153中任一项所述的方法，其中所述皮下剂量是在所述出血开始之后约1小时施用。
156.根据权利要求133至155中任一项所述的方法，其中所述按需求治疗包含向可能经历出血的受试者施用所述治疗。
157.根据权利要求156所述的方法，其中所述皮下剂量是在出血的可能性之前约1分钟至约1小时、或约2、或约3、或约4、或约5、或约6、或约7小时施用。
158.根据权利要求156至157中任一项所述的方法，其中所述皮下剂量是在出血的可能性之前约1分钟施用。
159.根据权利要求156至157中任一项所述的方法，其中所述皮下剂量是在出血的可能性之前约1小时施用。
160.根据权利要求133至159中任一项所述的方法，其中所述皮下剂量是在使用装置的情况下施用。
161.根据权利要求160所述的方法，其中所述装置为注射笔。
162.根据权利要求133至161中任一项所述的方法，其中所述皮下施用所述经修饰的FVIIa具有增加的活性或效能。
163.根据权利要求162所述的方法，其中所述皮下施用所述经修饰的FVIIa具有大于静脉内施用所述经修饰的FVIIa多肽的活性或效能。
164.根据权利要求162至163中任一项所述的方法，其中所述皮下施用所述经修饰的FVIIa具有大于静脉内施用未经修饰的FVIIa多肽的活性或效能。
165.根据权利要求162至164中任一项所述的方法，其中所述皮下施用所述经修饰的FVIIa具有大于皮下施用未经修饰的FVIIa多肽的活性或效能。
166.根据权利要求162至165中任一项所述的方法，其中所述活性或效能为所述经修饰的FVIIa的生物可用性和/或药物动力学概况。
167.根据权利要求162至166中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa多肽为包含SEQ ID NO:280的氨基酸序列的双链活化因子VII(FVIIa)多肽，其在位置152处的精氨酸与位置153处的异亮氨酸之间裂解。
168.一种用于单次剂量皮下施用的医药组合物，其包含单次治疗有效剂量的在医药学上可接受的载体中的经修饰的FVIIa用于皮下施用以按需求治疗出血；其中所述经修饰的FVIIa包含在包含SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列的FVII多肽中或在FVII多肽的对应残基中包含至少对应于位置286的位置处和对应于位置298的位置处的修饰，其中：
位置286处的所述修饰是以Arg(R)进行氨基酸置换；
位置298处的所述修饰是以Gln(Q)进行氨基酸置换；和
所述经修饰的FVIIa具有增加的活性或效能。
169.根据权利要求168所述的医药组合物，其中所述经修饰的FVIIa具有大于静脉内施用所述经修饰的FVIIa多肽的活性或效能。
170.根据权利要求168至169中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa具有大于静脉内施用未经修饰的FVIIa多肽的活性或效能。
171.根据权利要求168至170中任一项所述的方法，其中所述经修饰的FVIIa具有大于皮下施用未经修饰的FVIIa多肽的活性或效能。
172.根据权利要求168至171中任一项所述的医药组合物，所述经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置128的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中：
位置128处的所述修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换。
173.根据权利要求168至172中任一项所述的医药组合物，所述经修饰的FVIIa进一步包括在对应于FVII多肽位置128的位置处和对应于FVII多肽位置129的位置处的修饰，所述FVII多肽具有SEQ ID NO:3中所阐述的氨基酸序列，其中：
位置128处的所述修饰是以Asn(N)进行氨基酸置换；和
位置129处的所述修饰为Ala(A)。
174.根据权利要求168至173中任一项所述的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在1ml至10ml的体积下为100μg至35mg。
175.根据权利要求168至174中任一项所述的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在1ml至10ml的体积下为500μg至25mg。
176.根据权利要求168至175中任一项所述的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在0.1ml至10ml的体积下为50μg至40mg。
177.根据权利要求168至176中任一项所述的医药组合物，其中经修饰的FVIIa的量在0.5ml至10ml的体积下为1mg至10、15、20或25mg。
178.根据权利要求168至177中任一项所述的医药组合物，其体积为1ml至5ml、或1ml至3ml、或1ml至1.5ml。
179.一种容器，其包含根据权利要求168至178中任一项所述的医药组合物。
180.根据权利要求179所述的容器，其中所述容器为注射器或注射笔。
181.根据权利要求179或权利要求180所述的容器，其中所述医药组合物经冻干。
182.根据权利要求179至181中任一项所述的容器，其包含两个腔室，其中一个腔室含有所述冻干组合物；且另一腔室包含用于溶解所述冻干组合物的媒剂。
183.一种按需求治疗受试者的出血的方法，其包含向所述受试者皮下施用根据权利要求167至178中任一项所述的医药组合物。
184.根据权利要求183所述的方法，其中所述组合物是在所述出血之前或之后1、2或3小时内或15、45、60、75或90分钟内施用。
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