CN101023180B - O-连接的糖型多肽和制备它们的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含具有改变的O-连接的糖基化的模式的糖蛋白,特别是因子VII,因子IX的组合物,以及制备这些的方法。
Description
发明领域
本发明涉及包含具有改变的O-连接的糖基化模式的糖蛋白,特别是因子VII、因子IX和其它凝血因子的组合物。
发明背景
许多糖蛋白的生物活性高度依赖于与该糖蛋白相连的特定寡糖结构的存在或缺失。治疗性糖蛋白的糖基化模式可影响治疗功效的许多方面,如溶解性、抗蛋白分解的攻击、热灭活、免疫原性、半衰期、生物活性、生物利用度和稳定性。
糖基化是一种复杂的翻译后修饰,它是细胞依赖性的。翻译后,蛋白被转运到内质网(ER)、被糖基化并送到高尔基体(Golgi)进一步加工,随后靶向和/或分泌。在糖基化过程中,形成N-连接或O-连接的糖蛋白。
参与凝固或纤维蛋白溶解的血清蛋白质(包括,例如,因子VII和因子IX)证实是治疗多种病理状况的有效治疗剂。因此,对于包含这些蛋白的制剂存在日益增加的需求,这些蛋白是药学上可接受的并且显示出均匀和预定的临床功效。
由于使用人血浆作为药物产品的来源有许多缺点,优选在重组系统中生产这些蛋白。然而,凝固蛋白经历多种共-修饰和翻译后-修饰,包括,例如,天冬酰胺-连接的(N-连接的)糖基化;丝氨酸-或苏氨酸-连接的(O-连接的)糖基化;以及glu残基的γ-羧化。当将异源细胞用作大规模生产蛋白的宿主时,这些修饰在定性或定量上可能不同。具体而言,异源细胞中的生产常常导致不同的糖型排列,相同的多肽具有不同的共价连接的寡糖结构。
在不同的系统中,治疗性蛋白的寡糖结构中的变化与,尤其与, 免疫原性和体内清除率的改变相关。因此,在本领域中对于下列组合物和方法仍然存在需求,所述组合物和方法可提供糖蛋白制剂,特别是含有重组因子IX或重组人因子VII或经修饰的因子VII或因子VII-相关多肽的制剂,它们含有预定的糖型模式。
发明概述
本发明涉及包含显示出预定丝氨酸或苏氨酸-连接的糖型模式的多肽的制剂。就相连的聚糖或寡糖链而言,该制剂为至少约80%均一的,优选至少约90%,至少约95%,或至少约98%均一的
此处所用糖型模式是指具有不同结构的寡糖链制剂内的分布,所述结构与位于多肽氨基酸主链中的EGF-样结构域中的丝氨酸或苏氨酸残基共价连接。
一方面,本发明提供一种含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键的一部分的糖蛋白的制剂,所述制剂含有实质上均匀的丝氨酸/苏氨酸-连接的糖基化模式。
在本发明的一个实施方案中,糖基化模式为至少80%均匀,优选至少85%,至少90%,至少95%或至少98%均匀。
在一个实施方案中,丝氨酸/苏氨酸-连接的聚糖是Xyl-Xyl-Glc-;在另一个实施方案中,该聚糖是Xyl-Glc-;在又一个实施方案中,该聚糖是Glc-。
在不同实施方案中,糖蛋白选自:因子VII多肽、因子VII-相关多肽、因子IX多肽、因子X多肽、因子XII多肽和蛋白质Z多肽。在优选实施方案中,糖蛋白选自:人因子VII、因子VII序列变体、人因子IX和因子IX序列变体。在一个实施方案中,糖蛋白是因子VII变体,其中当按照在本发明说明书中描述的“体外水解测定法”中测试时,因子VII-变体的活性与天然人因子VIIa(野生型FVIIa)的活性之间的比为至少约1.25,优选至少约2.0,或至少约4.0。
另一方面,本发明提供用于制备含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys 基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键一部分的糖蛋白的制剂的方法,所述制剂含有实质上均匀的丝氨酸/苏氨酸-连接的糖基化模式。该方法适用于重建或改变在其最初表达之后,糖蛋白上呈现的糖基化模式。
更具体而言,本发明提供一种用于修饰糖蛋白的聚糖(具体而言,O-连接的聚糖),以便改进或提高它们的药学性质的一般酶方法。一种方法包括使用木糖苷酶处理糖蛋白,以便除去任意的末端木糖残基;其它方法包括通过用木糖基转移酶处理而使木糖残基与糖蛋白上暴露的葡萄糖或木糖残基相连;第三种方法包括使葡萄糖残基与多肽主链中的丝氨酸和/或苏氨酸氨基酸残基相连,由此产生糖基化多肽。
附图简要说明
图1显示wt-因子VII的丝氨酸52糖基化。
图2显示因子VII的O-糖基化作图。
图3显示制备显示预定丝氨酸/苏氨酸-连接的糖基化的糖蛋白制剂的反应方案。
图4显示表明级分“A”和“B”的第一次HIC循环的色谱图。
图5显示通过将级分“A”再次装载到HIC柱上获得的色谱图;在峰部分,部分10中鉴定出了Glc-O-Ser52-FVII。
图6显示通过将级分“B”再次装载到HIC柱上获得的色谱图;在峰部分,部分15中鉴定出了Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVII。
图7A显示峰部分,部分10的胰蛋白酶肽图;箭头表示Glc-O-Ser52 O-糖肽。
图7B显示峰部分,部分15的胰蛋白酶肽图;箭头表示Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52 O-糖肽。
图8A显示峰部分,部分10的总质量分析;箭头表示Glc-O-Ser52-rFVIIa O-糖型。
图8B显示峰部分,部分15的总质量分析;箭头表示Xyl-Xyl-Glc-O-rFVIIa O-糖型。
详细说明
此处使用了下列缩写词:
Glc =葡萄糖基
Xyl =木糖基
Ser =丝氨酸(一个字母代码:S)
Thr =苏氨酸(一个字母代码:T)
Pro =脯氨酸(一个字母代码:P)
Cys =半胱氨酸(一个字母代码:C)
FVII =因子VII
FVIIa=活化的(两条链)因子VII
FIX =因子IX
FIXa =活化的(两条链)因子IX
此处所用“糖型模式”(或“糖基化模式”)是指具有不同结构的寡糖链制剂内的分布,所述结构与位于多肽氨基酸主链中的丝氨酸或苏氨酸残基共价连接。
“同质性”是指在整个一组具有缀合聚糖的多肽中的结构一致性。因此,如果所有包含的糖蛋白分子均含有与相关糖基化位点相连的相同聚糖,则认为该糖蛋白制剂约100%均一。例如,如果至少90%的因子VII多肽分子含有与丝氨酸52相连的目标聚糖(例如,Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52),则认为因子VII多肽的制剂是至少90%均一的。
“实质上均匀的糖型”或“实质上均匀的糖基化”或“实质上均匀的糖基化模式”,当涉及糖肽种类时,是指接受体部分,即,丝氨酸或苏氨酸残基的百分比,它们可被目标聚糖糖基化。例如,就因子VII而言,如果实质上52位的所有(如下面所定义的)丝氨酸残基均被目标聚糖糖基化,则存在实质上均匀的糖基化模式。本领域技术人员应了解,原料可含有糖基化的丝氨酸和/或苏氨酸残基,它们被具有与目标聚糖相同结构的种类糖基化。因此,计算出的百分比糖基化包括被本发明 目标聚糖糖基化的丝氨酸/苏氨酸残基,以及已被原料中的目标聚糖糖基化的那些丝氨酸/苏氨酸残基。
术语“实质上”欲指糖蛋白中至少约80%,如至少约90%,至少约95%,或至少约98%的丝氨酸/苏氨酸残基被预定的、特定聚糖或目标聚糖糖基化。糖基化模式通常通过本领域技术人员已知的一种或多种方法来测定,例如,胰蛋白酶消化,接着进行高效液相色谱法(HPLC),液相色谱法-质谱法(LC-MS),基质辅助激光解吸质量飞行时间光谱测定法(MALDITOF),毛细管电泳等。
术语“接受体部分”欲包括向其转移所需寡糖或单糖基团的基团或部分,例如,但不限于,位于Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序内的丝氨酸/苏氨酸残基,与这种丝氨酸/苏氨酸残基共价连接的Glc-残基,或分别与Glc-O-Ser/Thr或Xyl-Glc-O-Ser/Thr部分中的Glc-残基或Xyl-残基共价连接的Xyl-残基。
术语“糖供体部分”欲包括具有适于作为相关催化酶(例如,葡萄糖基转移酶,木糖苷酶,或木糖基转移酶)底物发挥作用的供体部分的离去基团(例如,木糖-UDP或葡萄糖-UDP)的活化糖供体分子(例如,所需寡糖或单糖结构,例如,木糖基-木糖基-供体,木糖基-供体,或葡萄糖基-供体)。
寡糖被认为具有还原和非-还原末端,不管还原末端的糖事实上是还原糖。按照被接受的命名法,此处将非-还原末端放在左侧,还原末端放在右侧来描述寡糖(例如,Xyl-Xyl-Glc-O-Ser)。
含EGF结构域的多肽
术语“含EGF结构域的多肽”欲包括含一种或多种表皮生长因子(EGF)-样结构域的肽、寡肽和多肽。EGF结构域或重复单位是具有约40个氨基酸的小的基序,其由形成三个二硫键的6个保守半胱氨酸限定。含EGF-结构域的多肽全部含有用于O-葡萄糖修饰的共有序列:Cys1-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys2(即,Cys1-X1-Ser-X2-Pro-Cys2或Cys1-X1-Thr-X2-Pro-Cys2共有序列),其中Cys1和Cys2是EGF重 复单位的第一个和第二个保守半胱氨酸,并且X1和X2独立地是任意氨基酸。
术语“糖蛋白”欲包括含EGF结构域的多肽,它含有与位于该多肽主链氨基酸序列中的EGF-结构域的一个或多个丝氨酸/苏氨酸氨基酸残基相连的一个或多个聚糖。
此处所用术语“聚糖”或,可互换的,“糖链”,“寡糖链”或“寡糖部分”是指与单一丝氨酸/苏氨酸残基共价连接的整个寡糖结构。该聚糖可含有一个或多个糖单位;聚糖的例子包括,例如,Glc-,Xyl-Glc-,和Xyl-Xyl-Glc-。
术语“O-糖基化位点”欲表示位于基序Cys1-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys2内的丝氨酸/苏氨酸(即,Ser或Thr)处的糖基化位点,其中Cys1和Cys2是EGF重复单位的第一个和第二个保守半胱氨酸,并且X1和X2独立地是任意氨基酸。这些包括人wt-FVII的Ser-52(S52)位的糖基化位点和同源多肽中的相应残基,例如,但不限于,FVII序列变体和FIX多肽。术语“相应的残基”欲指当进行序列对比时,与野生型因子VII的Ser52残基相对应的Ser或Thr氨基酸残基(见图1)。氨基酸序列的同源性/同一性方便地由对比的序列确定,其中使用用于序列对比的适宜计算机程序,例如,ClustalW程序,1.8版,1999(Thompson等人,1994,Nucleic AcidResearch,22:4673-4680)。例如,wt-因子VII Ser52-残基与wt-因子IX的Ser53-残基相对应。应进一步了解的是,可产生含有非-天然存在的Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序且由此含有可按照本发明被糖基化的非-天然存在的O-糖基化位点的多肽变体。在本发明的一个实施方案中,O-糖基化位点是丝氨酸-糖基化位点,并且基序是Cys1-X1-Ser-X2-Pro-Cys2。在另一个实施方案中,O-糖基化位点是苏氨酸-糖基化位点且基序是Cys1-X1-Thr-X2-Pro-Cys2。
术语“末端葡萄糖”欲包括作为聚糖或寡糖链中的末端糖残基连接的葡萄糖残基,即各触角的末端糖是葡萄糖。术语“末端木糖”欲包括作为聚糖或寡糖链中的末端糖残基连接的木糖残基。
酶
蛋白O-葡萄糖基转移酶可按照,例如,Shao等人所述(Glycobiology 12(11):763-770(2002))进行制备。
α-木糖苷酶可以,例如,按照Monroe等人所述(Plant Physiologyand Biochemistry 41:877-885(2003))进行制备。
酶,UDP-D-木糖:β-D-葡萄糖苷α-1,3-D-木糖基转移酶可按照Omichi等人所述(Eur.J.Biochem.245:143-146(1997)),从HepG2细胞制备。
酶,UDP-D-木糖:α-D-木糖苷α1,3-木糖基转移酶可按照Minamida等人所述((J.Biochem.(Tokyo120:1002-1006(1996)),从HepG2细胞制备。
UDP-β-D-葡萄糖可从商业得到,例如Sigma(Sigma U4625)。
UDP-D-木糖可从商业得到,例如Sigma(Sigma U5875)。
糖蛋白
基序:Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys似乎主要在多模块蛋白,如凝固和纤维蛋白溶解因子的表皮生长因子(EGF)结构域中发现。该基序是进行O-葡萄糖修饰的共有序列,由此形成丝氨酸-葡萄糖(Glc-O-Ser)或苏氨酸-葡萄糖(Glc-O-Thr)键。凝血因子VII、IX、X和XII以及血浆蛋白Z、原纤蛋白和血小板反应蛋白已经全部显示含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys共有序列。这些之中,因子VII和IX及蛋白Z已被描述含有共有序列Cys-X1-Ser-X2-Pro-Cys。
血小板反应蛋白为一族胞外蛋白,其参与细胞-细胞和细胞-基质的通讯。该蛋白自血小板分泌。它们可在组织发生和修复过程中调节细胞表型。
蛋白Z是维生素k-依赖性血浆蛋白,它的结构与因子VII、IX和X的相似。然而,与这些蛋白形成对照的是,蛋白Z不是丝氨酸蛋白酶的酶原,这是因为它缺少催化三联体的His和Ser残基。像蛋白C 和S一样,蛋白Z可信地通过辅助抑制活化的因子X(FXa),参与限制凝固反应。
因子X(Stuart Prower因子)是维生素K-依赖性丝氨酸蛋白酶,其通过参与将凝血酶原活化成凝血酶而参与血液凝固过程。
因子XII(Hageman因子)是通过与受损血管的内皮下表面接触而活化的凝血因子。连同激肽释放酶原一起,它起接触因子的作用,引发血液凝固的内在途径。激肽释放酶原可将因子XII活化成XIIa。
因子IX(Christmas因子)是维生素K-依赖性丝氨酸蛋白酶,其通过参与将FX活化成FXa而参与血液凝固过程。
因子VII(前转变素)是维生素K-依赖性丝氨酸蛋白酶,其通过参与将凝血酶原活化成凝血酶而参与血液凝固过程。通过与血管壁损伤部位暴露的组织因子(TF)接触,FVII被活化成FVIIa。
因子VII多肽和因子VII-相关多肽
此处所用术语“因子VII多肽”或“FVII多肽”是指包含野生型人因子VIIa的氨基酸序列1-406的任意蛋白(即,具有美国专利No.4,784,950中公开的氨基酸序列的多肽),其变体以及因子VII-相关多肽,因子VII衍生物和因子VII缀合物。这包括FVII变体,因子VII-相关多肽,因子VII衍生物和因子VII缀合物,它们显示出相对于野生型人因子VIIa实质上相同或提高的生物活性。
术语“因子VII”欲包括它们未裂解(酶原)形式的因子VII多肽,以及已被蛋白酶解加工产生它们各自生物活性形式的那些,其可被命名为因子VIIa。通常,因子VII在残基152和153之间裂解,产生因子VIIa。因子VII的这类变体可显示出相对于人因子VII不同的性质,包括稳定性,磷脂结合,改变的比活性等。
此处所用“野生型人FVIIa”是具有美国专利No.4,784,950中公开的氨基酸序列的多肽。
此处所用“因子VII-相关多肽”包括多肽,包括变体,其中因子VIIa的生物活性相对于野生型因子VIIa的活性已被实质改变,如降 低。这些多肽包括,但不限于,其中已经引入了特定的氨基酸序列改变的因子VII或VIIa,其改变或破坏了该多肽生物活性。
此处所用术语“因子VII衍生物”欲指显示出相对于野生型因子VII实质上相同或提高的生物活性的FVII多肽,其中母肽的一个或多个氨基酸已被基因和/或化学和/或酶修饰,例如,通过烷基化,糖基化,PEG化,酰化,酯形成或酰胺形成等。这包括,但不限于PEG化的人因子VIIa,半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa及其变体。因子VII衍生物的非限制性例子包括葡萄糖PEG化的FVII衍生物,如WO03/31464和美国专利申请US 20040043446,US 20040063911,US20040142856,US20040137557和US20040132640(NeoseTechnologies,Inc.)中公开的;FVII缀合物,如WO01/04287,美国专利申请20030165996,WO01/58935,WO03/93465(Maxygen ApS)和WO02/02764,美国专利申请20030211094(University of Minnesota)中公开的。
术语“提高的生物活性”是指i)FVII多肽的蛋白酶解活性与重组野生型人因子VIIa相比实质上相同或增加,或ii)FVII多肽的TF结合活性与重组野生型人因子VIIa相比实质上相同或增加,或iii)FVII多肽的血浆半衰期与重组野生型人因子VIIa相比实质上相同或增加。术语“PEG化的人因子VIIa”是指人因子VIIa,其具有与人因子VIIa多肽缀合的PEG分子。应了解,PEG分子可与因子VIIa多肽的任意部分,包括任意氨基酸残基或因子VIIa多肽的碳水化合物部分相连。术语“半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa”是指具有与引入到人因子VIIa中的半胱氨酸的巯基缀合的PEG分子的因子VIIa。
与重组野生型人因子VIIa相比,蛋白酶解活性实质上相同或增加的因子VII变体的非限制性例子包括S52A-FVIIa、S60A-FVIIa(Lino等人,Arch.Biochem.Biophys.352:182-192,1998);如在美国专利No.5,580,560中公开的显示蛋白酶解稳定性增加的FVIIa变体;已在残基290和291之间或残基315和316之间被蛋白酶解裂解的因子VIIa(Mollerup等人,Biotechnol.Bioeng.48:501-505,1995);因子VIIa 的氧化形式(Kornfelt等人,Arch.Biochem.Biophys.363:43-54,1999);PCT/DK02/00189(与WO02/077218相对应)中公开的FVII变体;和如WO02/38162中公开的显示出蛋白酶解稳定性增加的FVII变体,(Scripps Research Institute);如在WO99/20767,美国专利US6017882和US6747003,美国专利申请20030100506(University of Minnesota)和WO00/66753,美国专利申请US20010018414,US2004220106,和US200131005,美国专利US6762286和US6693075(University ofMinnesota)中公开的具有修饰的Gla-结构域且显示膜结合提高的FVII变体;和如WO01/58935,美国专利US6806063,美国专利申请20030096338(Maxygen ApS),WO03/93465(Maxygen ApS),WO04/029091(Maxygen ApS),WO04/083361(Maxygen ApS),和WO04/111242(Maxygen ApS)以及WO04/108763(Canadian BloodServices)中公开的FVII变体。
与野生型FVIIa相比,生物活性增加的FVII变体的非限制性例子包括如在WO01/83725,WO02/22776,WO02/077218,PCT/DK02/00635(对应于WO03/027147),丹麦专利申请PA200201423(对应于WO04/029090),丹麦专利申请PA200101627(对应于WO03/027147);WO02/38162(Scripps Research Institute)中公开的FVII变体;和如在JP2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)中公开的活性提高的FVIIa变体。
因子VII变体的例子包括,但不限于,L305V-FVII,
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S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,
S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
S314E/L305V/V158T/E296V/M298QK337A-FVII,K316H/L305V/K337A-FVII,
K316H/L305V/V158D-FVII,K316H/L305V/E296V-FVII,K316H/L305V/M298Q-FVII,
K316H/L305V/V158T-FVII,K316H/L305V/K337A/V158T-FVII,
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K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,K316Q/L305V/K337A-FVII,
K316Q/L305V/V158D-FVII,K316Q/L305V/E296V-FVII,K316Q/L305V/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158T-FVII,K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII,
K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII,K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII,
316Q/L305V/K337A/V158D-FVII,K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII,
K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII,K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII,
K316Q/L305/V158T/E296V-FVII,K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII,
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K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,
K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII,K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII,
K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,F374Y/K337A-FVII,F374Y/V158D-FVII,
F374Y/E296V-FVII,F374Y/M298Q-FVII,F374Y/V158T-FVII,F374Y/S314E-FVII,
F374Y/L305V-FVII,F374Y/L305V/K337A-FVII,F37Y/L305V/V158D-FVII,
F374Y/L305V/E296V-FVII,F374Y/L305V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/V158T-FVII,
F374Y/L305V/S314E-FVII,F374Y/K337A/S314E-FVII,F374Y/K337A/V158T-FVII,
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F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII,F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII,
F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII,F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII,
F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII,F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII,
F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII,F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII,
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F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII,
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F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII,
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F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII,F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII,
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F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII,F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII,F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII,F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII,F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-
FVII,F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII,
F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII,
F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII,
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII,
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII,S52A-Factor VII,S60A-Factor
VII;R152E-Factor VII,S344A-Factor VII,T106N-FVII,K143N/N145T-FVII,V253N-FVII,
R290N/A292T-FVII,G291N-FVII,R315N/V317T-FVII,K143N/N145T/R315N/V317T-FVII;
和233Thr-240Asn的氨基酸序列中具有置换、加成或缺失的FVII;304Arg-329Cys的氨基酸序列中具有置换、加成或缺失的FVII;和153Ile-223Arg的氨基酸序列中具有置换、加成或缺失的FVII。
相对于野生型因子VIIa,生物活性实质上相同或提高的因子VII变体包括显示出野生型因子VIIa比活性的至少约25%,如至少约50%,至少约75%,至少约90%,至少约120,至少约130,或至少约150%的那些,其已在相同的细胞类型中生产,在上述凝固测定法,蛋白酶解测定法,或TF结合测定法的一种或多种中测试时。相对于野生型因子VIIa,生物活性实质上降低的因子VII变体是显示出低于野生型因子VIIa的比活性的约25%,优选低于约10%,更优选低于约5%且最优选低于约1%的那些,其已在相同的细胞类型中生产,在上述凝固测定法,蛋白酶解测定法,或TF结合测定法的一种或多种中测试时。相对于野生型因子VII,生物活性被实质上改变的因子VII变体包括,但不限于,显示TF-非依赖性因子X蛋白酶解活性的因子VII变体和结合TF但不裂解因子X的那些。
因子VIIa在血液凝固中的生物活性来源于其下列能力:(i)结合组织因子(TF)和(ii)催化因子IX或因子X的蛋白酶解裂解,以产生活化的因子IX或X(分别为因子IXa或Xa)。就本发明目的而言,因子VIIa的生物活性可按照例如美国专利No.5,997,864中所述,使用因子VII-缺失血浆和促凝血酶原激酶,通过测量制剂促进血液凝固的能力而量化。在该测定法中,生物活性以凝固时间相对于对照样品的减少来表示,并通过与含1个单位/ml因子VII活性的混合人血清标准品比较而转化成“因子VII单位”。可选择性地,因子VIIa的生物活性可通过如下方法而量化:(i)在含有包埋在脂质膜中的TF和因子X的系统中,测量因子VIIa产生因子Xa的能力(Persson等人,J.Biol.Chem.272:19919-19924,1997);(ii)测量含水系统中的因子X的水解(见,下面的“一般方法”);(iii)使用基于表面胞质团共振的仪器,测量其与TF的物理结合(Persson,FEBS Letts.413:359-363,1997)(iv)测量合成底物的水解(见,下面的“一般方法”);和(v)测量体外系统中,TF-独立性的凝血酶的产生(见,下面的“一般方法”)。
因子IX多肽和因子IX-相关多肽
本发明包括因子IX多肽,如具有例如Jaye等人,Nucleic AcidsRes.11:2325-2335,1983(野生型人因子IX)中公开的氨基酸序列的那些。
在实践本发明时,可有效预防或治疗出血的任意因子IX多肽均可使用。这包括来源于血液或血浆,或通过重组方式产生的因子IX多肽。
此处所用“因子IX多肽”包括,不限于,因子IX,以及因子IX-相关多肽。术语“因子IX”欲包括,不限于,具有如Jaye等人,NucleicAcids Res.1983(见上面)(野生型人因子IX)所述氨基酸序列的多肽,以及来源于其它物种的野生型因子IX,如牛、猪、犬、鼠和鲑鱼因子IX。它还包括因子IX的天然等位变异形式,其可从一个个体到另外一个个体中存在并发生。另外,糖基化或其它翻译后修饰的程度和位置可根据所选宿主细胞和宿主细胞环境的性质而变化。术语“因子IX”还欲包括它们未裂解(酶原)形式的因子IX多肽,以及已被蛋白酶解加工产生它们各自的生物活性形式的因子IX多肽,其可被命名为因子IXa。
“因子IX-相关多肽”包括,不限于,相对于人因子IX被化学修饰和/或相对于人因子IX含有一个或多个氨基酸序列改变(即,因子IX变体)的因子IX多肽,和/或相对于人因子IX含有截短氨基酸序列(即,因子IX的片段)的因子IX多肽。这类因子IX-相关多肽可显示出相对于人因子IX不同的性质,包括稳定性、磷脂结合、比活性改变等。
术语“因子IX-相关多肽”欲包括它们未裂解(酶原)形式的这类多肽,以及已被蛋白酶解加工产生它们各自的生物活性形式的那些,其可被命名为“因子IXa-相关多肽”或“活化的因子IX-相关多肽”。
此处所用“因子IX-相关多肽”包括,不限于,相对于野生型人因子IX,生物活性实质上相同或提高的多肽,以及相对于野生型人因子IX的活性,其中因子IX的生物活性已被实质上改变或降低的多肽。这些多肽包括,不限于,已被化学修饰的因子IX或因子IXa和其中已经引入特异的氨基酸序列改变的因子IX变体,其改变或破坏了该 多肽的生物活性。
它还包括具有稍被修饰的氨基酸序列的多肽,例如,具有修饰的N-末端,包括N-末端氨基酸缺失或加成的多肽,和/或相对于人因子IX已经被化学修饰的多肽。
因子IX-相关多肽,包括因子IX的变体,无论相对于野生型因子IX显示实质上相同或更好的生物活性,还是,可选择性地,相对于野生型因子IX显示实质上改变或降低的生物活性,包括,不限于,通过一个或多个氨基酸的插入、缺失、或置换而具有不同于野生型因子IX序列的氨基酸序列的多肽。
因子IX-相关多肽(包括变体),包括显示出野生型因子IX比活性的至少约10%,至少约20%,至少约30%,至少约40%,至少约50%,至少约60%,至少约70%,至少约80%,至少约90%,至少约100%,至少约110%,至少约120%,并且至少约130%的那些,其已在相同的细胞类型中生产,在本发明说明书中描述的因子IX活性测定法中测试。
相对于野生型因子IX,生物活性实质上相同或提高的因子IX-相关多肽(包括变体)包括显示出野生型人因子IX特异性生物活性的至少约25%,优选至少约50%,更优选至少约75%,更优选至少约100%,更优选至少约110%,更优选至少约120%,并且最优选至少约130%的那些,其已在相同的细胞类型中产生,在一种或多种所述的特异性因子IX活性测定法中测试时。就本发明目的而言,因子IX的生物活性可按照本发明说明书后面所述的进行量化(见“一般方法”)。
相对于野生型因子IX,生物活性实质上降低的因子IX-相关多肽(包括变体)是显示出低于野生型因子IX的比活性的约25%,优选低于约10%,更优选低于约5%且最优选低于约1%的那些,其已在相同的细胞类型中生产,在上述一种或多种特异性因子IX活性测定法中测试时。
因子IX多肽的非-限制性例子包括血浆-衍生的人因子IX,如例 如Chandra等人,Biochem.Biophys.Acta 1973,328:456;Andersson等人,Thromb.Res.1975,7:451;Suomela等人,Eur.J.Biochem.1976,71:145所述。
用于测试因子IX的活性,并由此提供选择用于本发明的适宜因子IX变体的方法适宜测定法可按照例如Wagenvoord等人,Haemostasis 1990;20(5):276-88所述的简单体外试验进行。因子IX的生物活性还可通过测量制剂校正因子IX-不足的血浆的凝固时间的能力,如Nilsson等人1959.(Nilsson IM,Blombaeck M,Thilen A,vonFrancken I.,Carriers of haemophilia A-A laboratory study,Acta MedScan 1959;165:357)所述而量化。在该测定法中,生物活性以单位/ml血浆表示(1个单位相当于标准混合血浆中存在的FIX的量)。
在本发明的一些实施方案中,因子IX是在“产色测定法”(见下面)中测试时,所述因子IX多肽的活性与天然人因子IX(野生型因子IX)的活性之间的比为至少约1.25的因子IX-相关多肽;在其它实施方案中,该比值为至少约2.0;在其它实施方案中,该比值为至少约4.0。
O-连接的糖基化
在实践本发明时,寡糖的模式可使用本领域已知的任意方法测定,包括,不限于:高效液相色谱法(HPLC);毛细管电泳(CE);核磁共振(NMR);使用离子化技术,如快速-原子轰击、电喷雾、或基质-辅助的激光解吸(MALDI)的质谱法(MS);气相色谱法(GC);和使用外糖苷酶连同阴离子-交换(AIE)-HPLC、尺寸排阻色谱法(SEC)或MS处理。见,例如,Weber等人,Anal.Biochem.225:135(1995);Klausen等人,J.Chromatog.718:195(1995);Morris等人,in Mass Spectrometry of Biological Materials,McEwen等人,eds.,Marcel Dekker,(1990),PP137-167;Conboy等人,Biol.Mass Spectrom.21:397,1992;Hellerqvist,Meth.Enzymol.193:554(1990);Sutton等人,Anal.Biohcem.318:34(1994);Harvey等人,Organic Mass Spectrometry 29:752(1994)。
例如可通过胰蛋白酶肽作图测定O-糖型的相对含量。简言之,糖 蛋白使用胰蛋白酶消化,根据聚糖结构,通过RP-HPLC色谱法,质谱法或其它适宜的分析分离技术来分离含O-糖基化位点的多肽。如果需要,为了获得适宜的分离,可在使用胰蛋白酶消化之前,使该糖蛋白还原并烷基化,并通过RP-HPLC色谱法纯化含O-糖基化位点的多肽链。然后,使该纯化多肽经过胰蛋白酶消化,接着按照上面所述分析。
用于生产具有预定模式的O-连接寡糖的糖蛋白制剂的方法
接受体糖蛋白的来源不是本发明的关键方面。通常,糖蛋白在培养的原核生物细胞或真核生物细胞,如哺乳动物、酵母菌、昆虫、真菌或植物细胞中表达。然而,该蛋白还可从天然来源,如血浆、血清或血液中分离。该糖蛋白可以是全长蛋白或片段。
本发明提供包括具有实质上均匀的糖基化模式的糖蛋白种类的组合物。该方法适用于在其初始表达之后,重建或改变存在于糖蛋白上的糖基化模式。因此,本发明的方法提供用于大规模制备具有预选或预定均匀衍生化模式的糖型的实践方法。该方法特别适于修饰治疗性肽,包括但不限于,在细胞培养细胞或转基因动物中生产的过程中未完全糖基化的糖蛋白。然而,本发明的制剂和组合物还可通过纯化天然来源,如血浆,血清或血液,或细胞培养液并分离其中所需糖型而制备。
按照本发明重建的多肽通常通过细胞培养过程制备。适宜的宿主细胞包括,不限于,表达内源基因,如,因子VII、IX、X、或XII基因或蛋白Z基因的人细胞。在这些细胞中,内源基因可以是完整的或已被原位修饰,或内源基因以外的序列可被原位修饰,从而改变内源糖蛋白基因的表达。可使用能够表达内源糖蛋白基因的任意人细胞。其它包括的宿主细胞是被设计表达糖蛋白,如,来源于重组基因的人因子VII或IX或X或XII的异源宿主细胞。宿主细胞可以是脊椎动物、昆虫或真菌细胞。优选,细胞是哺乳动物细胞,具有哺乳动物N-连接的糖基化;O-连接的糖基化;和γ-羧化的完全谱。见,例如,美 国专利Nos.4,784,950。优选的哺乳动物细胞系包括CHO(ATCC CCL61),COS-1(ATCC CRL 1650),幼小仓鼠的 肾(BHK)和HEK293(ATCC CRL 1573;Graham等人,J.Gen.Virol.36:59-72,1977)细胞系。优选的BHK细胞系是tk-ts13 BHK细胞系(Waechter和Baserga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106-1110,1982),此后称其为BHK 570细胞。BHK 570细胞系可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection),12301 Parklawn Dr.,Rockville,MD 20852获得,ATCC登记号为CRL 10314。tk-ts13 BHK细胞系也可从ATCC获得,登记号为CRL 1632。此外,可使用许多其它细胞系,包括Rat Hep I(Rat hepatoma;ATCC CRL 1600)、Rat Hep II(Rathepatoma;ATCC CRL 1548)、TCMK(ATCC CCL 139)、人肺(ATCCHB 8065)、NCTC 1469(ATCC CCL 9.1)和DUKX细胞(CHO细胞系)(Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220,1980)。(DUKX细胞也称作CXB11细胞),和DG44(CHO细胞系)(Cell,33:405,1983和Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555,1986)。3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其它细胞的融合体也是适用的。适宜宿主细胞包括BHK 21细胞,其已经适应在没有血清的条件下生长并已被设计表达因子VII。该细胞可以是表达较之衍生它们的细胞类型定性或定量不同的糖基化酶(如,糖基转移酶和/或糖苷酶)谱的突变体或重组细胞。该细胞还可被设计表达其它异源肽或蛋白,包括,如因子VII的截短形式。该宿主细胞还可以是CHO细胞,其已被设计共表达目标因子VII多肽(即,因子VII或因子-VII-相关多肽)和另一种异源肽或多肽,例如,修饰酶或因子VII片段。
方法:本发明包括用于生产包含上述预定的丝氨酸/苏氨酸-连接的糖型模式的制剂的方法,在其它实施方案中,包括用于优化糖蛋白的糖型分布的方法(见图3)。所述单个加工步骤可用于不同组合中,以便获得所需糖型模式。下面给出非限制性例子。
一方面,这些方法通过下列步骤实施:
(a)从制备它的细胞,例如,从工程细胞(细胞培养物)中或通过从天然来源中分离糖蛋白,获得含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键的一部分的糖蛋白的制剂;
(b)在适于将单糖或寡糖基团从供体部分转移到接受体部分的条件下,使该糖蛋白制剂与所需单-或寡糖部分的活化供体及适于转移所需单-或寡糖基团的酶接触,由此生产具有改变的糖基化模式的糖肽。
另一方面,这些方法通过下列步骤实施:
(aa)从制备它的细胞,例如,从工程细胞(细胞培养物)中或通过从天然来源中分离糖蛋白,获得含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键的一部分的糖蛋白的制剂;
(bb)在适于除去单糖或寡糖基团的条件下,使该糖蛋白制剂与适于除去所述末端单糖或寡糖基团的酶接触,由此产生具有改变的糖基化模式的糖肽。
在其中一个实施方案中,该方法包括步骤(b)和(bb)的组合。在一个实施方案中,该方法进一步包括分离具有改变的糖基化模式的糖蛋白的步骤。
在一个实施方案中,该方法进一步包括下列步骤:
分析与该多肽连接的寡糖结构以确定糖型模式,并且,任选地,重复步骤(b)和/或(bb),直到获得所需糖型模式。
这些方法可进一步包括如下步骤:使具有预定糖型模式的制剂经过至少一次生物活性(包括,例如,凝固,因子X蛋白酶解,或TF结合)或其它功能性(如,药物动力学特征或稳定性)的试验,并将特定的糖型模式与特定的生物活性或功能性特征关联起来,以便鉴定所需糖型模式。
在一个实施方案中,所需糖型模式是实质上均匀的葡萄糖-O-丝氨酸/苏氨酸糖基化:在该实施方案中,其中最初获得的糖蛋白含有末端木糖,该方法(方法B)包括下列步骤:
(a)从制备它的细胞;例如,从工程细胞(细胞培养物)中或通过从天然来源中分离糖蛋白,获得含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键的一部分的糖蛋白的制剂;
(b)在适于从糖蛋白中除去木糖残基的条件下,使步骤(a)中获得的制剂与α-木糖苷酶接触,由此产生具有改变的糖基化模式的糖蛋白。
在一个实施方案中,该方法进一步包括分离步骤b中制备的具有Glc-O-Ser/Thr糖基化的糖蛋白的步骤。
在一个实施方案中,该方法进一步包括如下步骤:分析与该多肽连接的寡糖结构,以确定糖型模式,并且,任选地,重复步骤(b)直到获得所需糖型。
在用于制备实质上均匀的葡萄糖O-丝氨酸/苏氨酸糖基化形式的所需糖型模式的另一个实施方案中,该方法(方法C)包括下列步骤:
(a)例如从工程细胞(细胞培养物)中或通过从天然来源中分离糖蛋白,获得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序的多肽的制剂;
(b)在适于将葡萄糖残基从葡萄糖供体部分转移到丝氨酸/苏氨酸接受体部分的条件下,使步骤(a)中获得的制剂与O-葡萄糖基转移酶及活化的葡萄糖供体接触,由此产生具有改变的糖基化模式的多肽。
在一个实施方案中,该方法进一步包括分离步骤b中制备的具有Glc-O-Ser/Thr糖基化的糖蛋白的步骤。
在一个实施方案中,该方法进一步包括如下步骤:分析与该多肽连接的寡糖结构,以确定糖型模式,并且,任选地,重复步骤(b)直到获得所需糖型。
在一个实施方案中,所需糖型模式是实质上均匀的木糖-葡萄糖-O-丝氨酸/苏氨酸糖基化:在该实施方案中,该方法(方法A1)包括下列步骤:
(a)例如从工程细胞(细胞培养物)中或通过从天然来源中分离糖蛋白,获得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键的一部分的糖蛋白的制剂;
)在适于将木糖残基从木糖供体部分转移到接受体部分的条件下,使步骤(a)中获得的制剂与UDP-D-木糖:β-D-葡糖苷α-1,3-D-木糖基转移酶及活化的木糖基供体接触,由此产生具有改变的糖基化模式的糖肽。
在一个实施方案中,该方法进一步包括分离步骤b中制备的具有Xyl-Glc-O-Ser/Thr糖基化的糖蛋白的步骤。
在一个实施方案中,该方法进一步包括如下步骤:分析与该多肽连接的寡糖结构,以确定糖型模式,并且,任选地,重复步骤(b)直到获得所需糖型。
在一个实施方案中,该方法进一步包括在步骤(b)之前,通过使步骤(a)中获得的制剂经过方法B而除去末端木糖-残基的步骤。
在一个实施方案中,所需糖型模式是实质上均匀的木糖-木糖葡萄糖-O-丝氨/苏氨酸糖基化:在该实施方案中,该方法(方法A2)包括下列步骤:
(a)例如从工程细胞(细胞培养物)中或通过以天然来源中分离糖蛋白,获得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键的一部分的糖蛋白的制剂;
(b)在适于将木糖残基从木糖供体部分转移到接受体部分的条件下,使步骤(a)中获得的制剂与UDP-D-木糖:β-D-葡糖苷α-1,3-D-木糖基转移酶及活化的木糖基供体接触,由此产生具有改变的糖基化模式的糖肽;
(c)在适于将木糖残基从木糖供体部分转移到接受体部分的条件下,使步骤(b)中获得的制剂与UDP-D-木糖:α-D-木糖苷α-1,3-木糖基转移酶及活化的木糖基供体接触,由此产生具有改变的糖基化模式的糖肽。
在其中一个实施方案中,该方法进一步包括在使制剂经过步骤(c)之前,分离步骤(b)中获得的制剂的步骤。
在一个实施方案中,该方法进一步包括分离步骤(c)中制备的具有Xyl-Xyl-Glc-O-Ser/Thr糖基化的糖蛋白的步骤。
在一个实施方案中,该方法进一步包括如下步骤:分析与该多肽连接的寡糖结构从而确定糖型模式,并且任选地,重复步骤(b)和/或步骤(c)直到获得所需糖型模式。
在一个实施方案中,该方法进一步包括在步骤(b)之前,通过使步骤(a)中获得的制剂经过方法B而除去末端木糖-残基的步骤。
在不同的实施方案中,糖蛋白显示实质上均匀的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser糖基化、Xyl-Glc-O-Ser糖基化和Glc-O-Ser糖基化;Ser是所含Cys-X1-Ser-X2-Pro-Cys基序的丝氨酸(X1和X2独立地是任意氨基酸残基)。在其它不同的实施方案中,糖蛋白显示实质上均匀的Xyl-Xyl-Glc-O-Thr糖基化、Xyl-Glc-O-Thr糖基化和Glc-O-Thr糖基化;Thr是所含Cys-X1-Thr-X2-Pro-Cys基序的苏氨酸(X1和X2独立地是任意氨基酸残基)。
在不同的实施方案中,该多肽选自下列清单:因子VII多肽、因子VII-相关多肽、因子IX多肽、因子IX-相关多肽、因子X多肽和因子X-相关多肽。
在优选实施方案中,该糖蛋白制剂选自下列清单:
显示实质上均匀的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII多肽,
显示实质上均匀的Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII多肽
显示实质上均匀的Glc-O-Ser52糖基化的因子VII多肽
显示实质上均匀的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII-相关多肽
显示实质上均匀的Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII-相关多肽
显示实质上均匀的Glc-O-Ser52糖基化的因子VII-相关多肽
显示实质上均匀的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII变体
显示实质上均匀的Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的因子VII变体
显示实质上均匀的Glc-O-Ser52糖基化的因子VII变体
显示实质上均匀的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX多肽
显示实质上均匀的Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX多肽
显示实质上均匀的Glc-O-Ser53糖基化的因子IX多肽
显示实质上均匀的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX-相关多肽
显示实质上均匀的Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX-相关多肽
显示实质上均匀的Glc-O-Ser53糖基化的因子IX-相关多肽
显示实质上均匀的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX变体
显示实质上均匀的Xyl-Glc-O-Ser53糖基化的因子IX变体
显示实质上均匀的Glc-O-Ser53糖基化因子IX变体
应了解,通过使用适宜的转移酶及活化Xyl-Xyl-供体,可将寡糖如Xyl-Xyl-转移到接受体Glc-O-Ser/Thr部分。
色谱方法:本发明还包括用于生产上述包含预定丝氨酸/苏氨酸-连接的糖型模式的制剂,并从包含所述多肽和具有不需要的糖型模式的多肽的组合物中纯化具有所需糖型模式的O-糖基化多肽的疏水作用色谱方法。
一方面,该方法包括下列步骤:
(a)从制备它的细胞,例如,从工程细胞(细胞培养物)中或通过从天然来源中分离糖蛋白,获得含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键的一部分的糖蛋白的制剂;
(b)使用包含水,任选包含盐成分,和任选包含缓冲液的溶液,使该糖蛋白与疏水作用材料结合,
(c)任选使用包含水,任选包含盐成分,和任选包含缓冲液的溶液洗涤该疏水作用材料,以从疏水作用材料中洗脱污染物;
(d)使用包含有机修饰剂、水、任选包含盐成分,和任选包含缓冲液的溶液,以线性或逐步梯度或在盐成分中等度地,洗涤该疏水作用材料,以使将具有所需糖型模式的糖蛋白与不具有所需糖型的糖蛋白从疏水作用材料上分离;
(e)收集包含具有所需糖型的糖蛋白的级分。
在一个实施方案中,上述方法进一步包括通过使步骤(e)中获得的 制剂经过步骤(a)-(e)而重复步骤(a)-(e)的步骤。如果认定需要,该进一步的步骤可重复多次。
应了解本发明的制剂还可通过包含纯化步骤(由此从细胞培养液或天然来源中捕获具有所需糖基化的糖蛋白种类)与上述酶方法的组合的方法制备。
上述方法可进一步包括如下步骤:使具有预定糖型模式的制剂经过至少一种生物活性(包括,例如,凝固,因子X蛋白酶解,或TF结合)或其它功能性(例如,药物动力学特征或稳定性)的试验,并将特定糖型模式与特定生物活性或功能性特征关联起来,以便鉴定所需糖型模式。
进一步的酶处理可与上述方法结合使用,以修饰制剂N-或O-连接聚糖的寡糖模式;这种处理包括,不限于,使用一种或多种唾液酸酶(神经氨酸苷酶)、半乳糖苷酶、岩藻糖苷酶;半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶和/或唾液酸转移酶处理,处理的顺序和条件使得在具有特定末端结构的寡糖链的分布中获得所需修饰。糖基转移酶可从Calbiochem(La Jolla,CA)商业获得且糖苷酶可从Glyko,Inc.,(Novato,CA)商业得到。
糖蛋白制剂
此处所用“糖蛋白制剂”是指已经从合成它们的细胞中分离出来的众多糖型。该糖蛋白制剂包括灭活形式,活化形式,功能相关多肽,如变体和化学修饰形式,其已经从合成它们的细胞中分离出来。
例如,此处所用“因子VII制剂”是指已经从合成它们的细胞中分离出来或从天然来源中分离出来的众多因子VII多肽、因子VIIa多肽、或因子VII-相关多肽,包括变体和化学修饰形式。同样,“因子IX制剂”是指已经从合成它们的细胞中分离出来或从天然来源(例如,血浆,血清,血液)中分离出来的众多因子IX多肽、因子IXa多肽、或因子IX-相关多肽,包括变体或化学修饰形式。
多肽自它们源细胞中的分离可通过本领域已知的任何方法实现, 包括,不限于,从粘附细胞培养物中取出含所需产物的细胞培养基;离心或过滤以除去未-粘附细胞等。
任选地,该多肽可被进一步纯化。纯化可使用本领域已知的任何方法实现,包括,不限于,如,在抗-因子VII或抗-因子IX抗体柱上进行的亲和色谱法(见,例如,Wakabayashi等人,J.Biol.Chem.261:11097,1986;和Thim等人,Biochem.27:7785,1988);疏水作用色谱法;离子-交换色谱法;尺寸排阻色谱法;电泳操作(例如,制备型等电点聚焦(IEF)、差别溶解性(例如,硫酸铵沉淀法),或提取法等。通常,见,Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,New York,1982;和Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden,editors,VCHPublishers,New York,1989。纯化之后,该制剂优选含有低于约10重量%,更优选低于约5%且最优选低于约1%的来源于宿主细胞的非-相关蛋白。
因子VII和因子VII-相关多肽、因子IX和因子IX-相关多肽、或因子X和因子X-相关多肽分别可通过蛋白酶解裂解获得,其中使用因子XIIa或具有胰蛋白酶-样特异性的其它蛋白酶,如,因子IXa、激肽释放酶、因子Xa和凝血酶。见,例如,Osterud等人,Biochem.11:2853(1972);Thomas,美国专利No.4,456,591;和Hedner等人,J.Clin.Invest.71:1836(1983)。可选择性地,因子VII、IX或X分别可通过使它通过离子-交换色谱柱,如(Pharmacia)等而被活化。然后可配制所得活化多肽,例如,因子VII,并按照下面所述给药。
糖蛋白制剂的功能性质
本发明具有预定寡糖模式的糖蛋白制剂(包括因子VII多肽、因子VII-相关多肽、因子IX多肽和因子IX-相关多肽)相对于对照制剂显示改进的功能性质。该改进的功能性质可包括,不限于,a)物理性质,如储藏稳定性;b)药物动力学性质,如生物利用度和半衰期;c)人中的免疫原性,和d)生物活性,如凝固活性。
对照制剂是指包含与其进行比较的本发明制剂中所含多肽相同的 多肽的制剂(如,野生型因子VII或野生型因子IX或特定变体或化学修饰形式),除了显示不同的丝氨酸/苏氨酸-连接的糖基化模式以外。
糖蛋白(例如,因子VII)制剂的储藏稳定性可通过测量下列指标来评价:(a)25℃下以干粉形式储藏时,制剂的生物活性衰减20%所需的时间,和/或(b)制剂中所述糖蛋白的(例如,因子VIIa)聚集物的比例加倍所需的时间。
在一些实施方案中,当两种制剂均在25℃下以干粉形式储藏时,相对于对照制剂中出现相同现象所需的时间,本发明制剂显示生物活性衰减20%所需的时间增加至少约30%,优选至少约60%且更优选至少约100%。生物活性的测量可使用凝固测定法、蛋白酶解测定法、TF-结合测定法、或TF-非依赖性凝血酶产生中的任一测定法来进行。
在一些实施方案中,当两种制剂均在25℃下以干粉形式储藏时,相对于对照制剂,本发明制剂显示聚集物加倍所需的时间增加至少约30%,优选至少约60%,并且更优选至少约100%。聚集物的含量可按照技术人员已知的方法测定,例如,凝胶渗透HPLC法。例如,因子VII聚集物的含量是如下通过在Protein Pak 300 SW柱(7.5×300mm)(Waters,80013)上进行凝胶渗透HPLC而测定的。该柱使用洗脱剂A(0.2M硫酸铵,5%异丙醇,用磷酸将pH调节至2.5,之后用三乙胺将pH调节至7.0)平衡,之后将25μg样品应用到柱上。洗脱是使用洗脱剂A,以0.5ml/分流速进行30分钟,并通过测量215nm处的吸光度而进行检测。聚集物的含量是根据因子VII聚集物的峰面积/因子VII峰的总面积(单体和聚集物)计算的。
“生物利用度”是指在给药后的预定时间,可在血浆中检测到的所给予剂量的(例如,因子VII或因子VII-相关)糖蛋白制剂的比例。通常,通过如下步骤在试验动物中测量生物利用度:给予约25-250μg/kg剂量的制剂;在给药后的预定时间获得血浆样品;并使用凝固测定法(或任意生物测定法)、免疫测定法或等价方法中的一种或多种测定样品中(例如,因子VII或因子VII-相关)糖基化多肽的含量。数据通常以多肽[例如,因子VII]对时间的图表示,生物利用度以曲线下的面积 (AUC)表示。试验制剂的相对生物利用度是指试验制剂的AUC与对照制剂的AUC之间的比值。
在一些实施方案中,本发明制剂显示出对照制剂生物利用度的至少约110%,优选至少约120%,更优选至少约130%且最优选至少约140%的相对生物利用度。生物利用度可在任意哺乳动物物种中测量,优选狗,并且用于计算AUC的预定时间可包括10分钟-8小时的不同增量。
“半衰期”是指(例如,因子VII多肽或因子VII-相关多肽)糖蛋白的血浆浓度从特定值降至该值一半所需的时间。半衰期可使用与用于测定生物利用度的相同程序测定。在一些实施方案中,相对于对照制剂的半衰期,本发明制剂显示半衰期增加至少约0.25h,优选至少约0.5h,更优选至少约1h,并且最优选至少约2h。
制剂的“免疫原性”是指给予人时,制剂引发不论是体液的、细胞的、还是两者的有害免疫反应的能力。还不知晓因子VIIa多肽和因子VIIa-相关多肽在人中引发可检测的免疫反应。然而,在任何人亚居群中,可能存在显示出对所给予的特定蛋白敏感的个体。免疫原性可使用本领域已知的常规方法,通过量化敏感个体中抗-因子VII抗体和/或因子VII-应答T-细胞而测量。在一些实施方案中,相对于对照制剂的所述个体免疫原性,本发明制剂显示敏感个体中的免疫原性降低至少约10%,优选至少约25%,更优选至少约40%且最优选至少约50%。
药物组合物和使用方法
本发明制剂可用于治疗应答相关糖蛋白的任何综合征。因子VII-、FIX和FX-应答综合征,分别,包括综合征如,出血病症,包括,不限于,由凝血因子缺乏引起的那些(例如,A和B型血友病或凝血因子XI或VII的缺乏);由血小板减少症或冯维勒布兰德氏病引起的那些,或由凝血因子抑制剂引起的那些,或任何原因引起的过量出血。该制剂还可给予与手术或其它创伤有关的患者,或接受抗凝剂治疗的患者。
本发明含因子VII-相关多肽的制剂,其相对于野生型因子VII具 有实质上降低的生物活性,可在例如经历血管成形术或其它外科手术(其可能增加发生于例如再狭窄中的血栓形成或血管阻塞危险)的患者中用作抗凝剂。开抗凝剂处方的其它医学适应征包括,不限于,深度静脉血栓形成、肺栓塞、中风、弥散性血管内血凝血(DIC)、与革兰氏阴性内毒血症有关的肺和肾中的血纤蛋白沉积、心肌梗塞;急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、系统性炎性反应综合征(SIRS)、溶血性尿毒症综合征(HUS)、MOF、和TTP。
本发明含因子VII和因子VII-相关制剂的药物组合物主要计划用于胃肠道外给药,用于预防性和/或治疗性治疗。优选,胃肠道外,即静脉内、皮下或肌内给予该药物组合物。它们可通过连续或脉动输注给药。
药物组合物或制剂含有本发明的制剂以及,优选溶于其中的,药学上可接受的载体,优选含水载体或稀释剂。可使用各种含水载体,如水,缓冲水,0.4%盐水,0.3%甘氨酸等。还可将本发明制剂配制成用于递送或靶向损伤部位的脂质体制剂。脂质体制剂一般地在,例如,美国专利Nos.4,837,028、4,501,728和4,975,282中描述。该组合物可通过常规、熟知的灭菌技术灭菌。可将所得水溶液包装使用,或在无菌条件下过滤并冻干,在给药之前,将该冻干制剂与无菌水溶液混合。
该组合物可含有药学上可接受的辅助性物质或助剂,包括,不限于,pH调节剂和缓冲剂和/或张力调节剂,如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。
这些制剂中的因子VII或因子VII-相关多肽的浓度可广泛变化,即从低于约0.5重量%,通常为或至少约1重量%到多达15或20重量%,并且主要可根据所选择的特定给药模式,通过流体体积、粘度等选择。
因此,用于静脉内输注的典型药物组合物可被配制含有250ml无菌林格氏溶液和10mg所述制剂。用于制备可胃肠道外给药的组合物的实际方法是本领域技术人员已知或显而易见的,并例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA(1990)中更详细描述。
可给予含本发明制剂的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中,以足以治愈、减轻或部分抑制疾病及其并发症的量,将组合物给予已经患有上述疾病的受治疗者。足以实现该目的的用量被定义为“治疗有效量”。各目的的有效量取决于疾病或损伤的严重程度以及受治疗者的体重和一般状况。然而,通常对于70kg受治疗者而言,有效量为约0.05mg直至约500mg制剂/天,更常使用约1.0mg至约200mg制剂/天的剂量。应了解测定适宜的剂量可使用常规实验,通过构造值的矩阵并测试矩阵中的不同点而实现。
本发明制剂的局部送递,例如,局部应用,可通过喷雾、灌注、双气囊导管、或插入到血管移植物中的支架、或支架、用于涂覆气囊导管的水凝胶或其它已经建立的方法实施。无论如何,该药物组合物应提供足以有效治疗受治疗者量的制剂。
本发明的药物组合物可进一步包括其它生物活性剂,如,非-因子VII-相关凝血剂或抗凝剂。
实验
一般方法
α-木糖苷酶测定法
α-木糖苷酶测定法在含有适宜底物,例如,可从相关糖蛋白(例如,rFVIIa)的O-糖肽图获得的O-糖肽的pH4.5的适宜缓冲液,例如,50mM醋酸钠中进行。在可进行实验测定的适宜时间后,通过加入例如三氟乙酸终止反应,并通过HPLC分析试验混合物。
α-木糖基转移酶测定法
α-木糖基转移酶测定法是在含有适宜底物,例如可从相关糖蛋白(例如,rFVIIa)的O-糖肽图获得的O-糖肽或按照Minamida等人所述制备的吡啶基-胺化寡糖(Minamida等人,Detection of UDP-D-xylose:α-D-xyloside α1-3xylosyltransferase activity in human hepatoma cell line HepG2.J.Biochem.1201002-1006,1996)的适宜缓冲液,例如,10 mM Hepes,pH 7.2,0.1%Triton X-100,0.5 mM UDP-木糖(SigmaU5875)中进行的。在可进行实验性测定的适宜时间后,通过加入三氟乙酸终止反应,并通过HPLC分析试验混合物。
使α-木糖苷酶和α-木糖基转移酶测定法的时间最佳化且任选使温度和pH最佳化。
O-葡萄糖基转移酶测定法
O-葡萄糖基转移酶测定法按照例如Shao等人(Glycobiology 12(11)763-7702002)所述进行。
因子VII测定法
测试因子VIIa活性并由此选择适宜的因子VIIa变体的适宜测定法可作为简单的初步体外试验进行。该测定法还适于选择适宜的因子VIIA变体。
体外水解测定法
可测定天然的(野生型)因子VIIa和因子VIIa变体(此后将两者称作“因子VIIa”)的比活性。还可对它们进行平行测定,以直接比较它们的比活性。该测定在微量滴定板(MaxiSorp,Nunc,Denmark)中进行。将产色底物D-Ile-Pro-Arg-对-硝基酰苯胺(S-2288,Chromogenix,Sweden),终浓度1mM,加入到因子VIIa(终浓度100nM)的含0.1MNaCl,5mM CaCl2和1mg/ml牛血清白蛋白的50 mM Hepes,pH 7.4的溶液中。在SpectraMaxTM 340平板阅读器(Molecular Devices,USA)中连续测量405nm处的吸光度。减去不含酶的空白孔中的吸光度后,20-分钟培育时间内产生的吸光度用于计算变体与野生型因子VIIa活性之间的比值:
比值=(A405nm因子VIIa变体)/(A405nm因子VIIa野生型)
基于上述比值,可鉴定出具有可与天然因子VIIa相比较的或更高 活性的因子VIIa变体,例如,变体活性与天然因子VII(野生型FVII)活性之间的比值约为1,对高于1.0。
因子VIIa或因子VIIa变体的活性还可使用生理学底物,如因子X,适当地,在100-1000nM浓度下测量,其中所产生的因子Xa在加入适宜产色底物(例如,S-2765)之后测量。此外,活性测定可在生理温度下运行。
体外蛋白酶解测定法
平行测定天然的(野生型)因子VIIa和因子VIIa变体(此后将两者称作“因子VIIa”),以比较它们的比活性。该测定在微量滴定平板(MaxiSorp,Nunc,Denmark)中进行。将100微升含0.1M NaCl,5mMCaCl2和1 mg/ml牛血清白蛋白的50mM Hepes,pH 7.4中的因子VIIa(10nM)和因子X(0.8微摩尔浓度)培育15分钟。然后,通过加入50微升含0.1M NaCl,20mM EDTA和1mg/ml牛血清白蛋白的50mMHepes,pH7.4终止因子X裂解。所产生因子Xa的量是通过加入产色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对-硝基酰苯胺(S-2765,Chromogenix,Sweden),终浓度0.5mM而测量的。在SpectraMaxTM 340平板阅读器(Molecular Devices,USA)中连续测量405nm处的吸光度。减去不含FVIIa的空白孔的吸光度后,在10分钟内产生的吸光度用于计算变体与野生型因子VIIa蛋白酶解活性之间的比值:
比值=(A405 nm因子VIIa变体)/(A405 nm因子VIIa野生型)。
基于上述比值,可鉴定出具有可与天然因子VIIa相比较的或更高活性的因子VIIa变体,例如,变体活性与天然因子VII(野生型FVII)活性之间的比值约为1,对高于1.0。
凝血酶产生测定法:
因子VII或因子VII-相关多肽(例如,变体)产生凝血酶的能力可在包含生理学浓度的所有相关凝血因子和抑制剂以及活化血小板的测定中测量(如在Monroe等人(1997)Brit.J.Haematol.99,542-547第 543页中所述,其引入此处作为参考)。
凝固测定法
第一代测定法
因子VII多肽的活性还可主要按照WO92/15686或US5,997,864中所述,使用一步凝固测定法测量。简言之,在50 mM Tris(pH7.5),0.1%BSA中稀释要测试的样品,并取100μL与100μL因子VII缺失血浆和200μL含10 mM Ca2+的促凝血酶原激酶C一起培育。测量凝固时间并将其与使用连续稀释的对照标准品或含枸橼酸盐的正常人血浆混合物的标准曲线相比较。
第二代测定法
基本上相同,除了使用重组人组织因子代替促凝血酶原激酶C以外。
因子IX测定法
因子IX活性的试验:
用于测试因子IX活性,并由此提供用于选择用于本发明的适宜因子IX的方法的适宜测定法可按例如Wagenvoord等人Haemostasis1990;20(5):276-88所述作为简单体外试验进行。
因子IX的生物活性还可通过测量制剂校正因子IX-缺失血浆的凝固时间的能力而量化,如在Nilsson等人,1959.(Nilsson IM,BlombaeckM,Thilen A,von Francken I.,Carriers of haemophilia A-Alaboratory study,Acta Med Scan 1959;165:357)中所述。在该测定法中,将生物活性表示为单位/ml血浆(1个单位相当于正常混合血浆中存在的FIX的量)。
实施例
下列实施例是本发明的非-限制性举例说明。
实施例1
通过提取和纯化制备α-木糖苷酶
酶,α-木糖苷酶,可从各种来源制备,例如,按照Monroe等人(Plant Physiology and Biochemistry 41:877-885(2003))所述从植物材料制备。例如,将来源于例如鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的植物组织在含有2个体积缓冲液A(40mM Hepes,pH7.0,1M NaCl)的研钵中,使用石英砂研杵研磨,并以15000xg离心过滤的提取物15分钟。加入硫酸铵至例如80%饱和。通过15000xg离心15分钟而收集沉淀出来的蛋白,并将其再次溶于缓冲液A中。通过色谱法,例如,在Concanavalin A-Sepharose柱、阴离子交换柱和/或技术人员已知的其它色谱柱上纯化α-木糖苷酶。在洗脱过程中收集各级分,并利用α-木糖苷酶测定法鉴定含α-木糖苷酶的级分。
实施例2
通过在大肠杆菌(E.coli)中克隆和表达并纯化而制备α-木糖苷酶
编码α-木糖苷酶的基因,其可水解α木糖苷键,先前已被克隆并表征,显示与所表征的α-木糖苷酶明显同源性的基因已在来源于多种原核生物和真核生物的基因组中被注释。该基因序列可在数据库如SWISS-PROT或NCBI中获得,并且可通过PCR从各自生物的基因组DNA扩增。检索蛋白数据库存在α-木糖苷酶蛋白之后,选择几个候选物在大肠杆菌中克隆并表达。下列候选基因是基于数据库(A)中已经存在的注释,先前公开的表征(P)或基于对已知α-木糖苷酶的同源性分析(H)而选择的:基因tm0308(海栖热袍菌(Thermotoga maritima):A);基因bt3085(2139bp)和基因bt3659(2475bp)(多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron):A);基因bf0551(2238bp)和基因bf1247(2538bp)(脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis):A);基因bl02681(2310bp)(地衣型芽孢杆菌(Bacillus licheniformis):H);基因bh1905(2328 bp)(Bacillus halodurans:H),基因xylS(2196bp)(硫磺矿硫化叶菌Sulfolobus solfataricus:P);基因yicI(2319bp)(大肠杆菌:P)。
α-木糖苷酶在大肠杆菌中克隆和表达的策略
SignalP软件(Bendtsen,J.D.等人,J.Mol.Biol.,340:783-795,2004)用于评价信号肽是否可能存在于候选酶的N-末端中。推测分泌BF0551、BF1247、BT3085、BT3659,如通过信号肽酶I裂解位点的强预测显示的。编码起始-甲硫氨酸的甲硫氨酸密码子包括在第一个氨基酸的前面,在预测的裂解位点之后。
来源于多形拟杆菌(ATCC 29148D)、脆弱类杆菌(ATCC 25285D)、Bacillus haludurans(ATCC 21591D&BAA-125D)、硫磺矿硫化叶菌(ATCC 35092D)、海栖热袍菌(ATCC 43589D)的纯化基因组DNA自美国典型培养物保藏中心获得。在大肠杆菌(K-12株衍生物)和地衣型芽孢杆菌(ATCC 28450)的情况下,基因组DNA是按照制造商的说明,使用DNeasy组织试剂盒(Qiagen),从在LB培养基中过夜培养的细菌细胞制备的。
用于PCR扩增的正向和反向引物被设计在分别包含限制酶裂解位点NdeI(或XbaI)和XmaI的5’-末端伸展。PCR使用下列条件进行:1)95℃ 3分钟:变性,2)94℃ 30秒:变性,3)55℃或60℃ 30秒:退火,4)72℃ 2分钟:伸展。步骤2-4重复15个循环。在1%溴化乙锭琼脂凝胶上分离PCR产物,并切除凝胶中显示合适预测大小的带,并使用GFX DNA纯化试剂盒(Amersham Pharmacia)纯化。按照制造商(Invitrogen)的说明,将纯化的PCR产物克隆到pCR2.1TOPO载体中。对显示合适的限制酶裂解分布的克隆测序,以评价DNA序列。使用相关限制酶,使代表α-木糖苷酶基因的插入物从pCR2.1TOPO载体中释放。使用相关限制酶裂解含有NdeI(和XbaI)和XmaI位点的pET11a大肠杆菌表达载体(Novagen),并按照对于PCR产物所述纯化载体部分。按照制造商的说明,使用快速连接试剂盒(Rapid Ligation Kit)(Roche)将载体和插入物连接在一起。
通过技术人员已知的化学转化或热激方法将连接产物转化到大肠杆菌TOP10(Invitrogen)中。将细胞接种在LB/氨苄西林(Amp)-培养基培养平板上过夜。从平板中选择单一集落,并在LB/Amp培养基中生长过夜。使用限制裂解酶和所释放插入物的大小的评价,筛选各集落 的纯化pET质粒是否存在合适的插入物。
大肠杆菌Rosetta DE3(Novagen)是用含α-木糖苷酶基因的pET质粒转化的并接种在chloramphinicol(Cam)/Amp LB平板上。将来源于过夜平板的细胞重悬浮于液体Cam/Amp LB培养基中,并稀释至OD600=0.1。繁殖液体培养基中的细胞,直到OD600=0.4-0.8。然后使细胞平衡至18℃的温度30分钟,并在18℃下,使用0.5mM IPTG o/n诱导蛋白诱导。采集细胞,并将沉淀颗粒重悬浮于缓冲液(例如,25mMTris HCl pH7或10 mM磷酸钾缓冲液,pH7)中,至相当于OD600=~10的细胞密度。在冰上声波处理细胞3-7次15-30秒,在冰上间断30秒。离心除去细胞碎片并测定上清液的活性。
α-木糖苷酶活性的测定
评价声波处理所得上清液的对硝基苯基α-D吡喃木糖苷(Sigma)是否存在α-木糖苷酶活性。37℃下,在缓冲液(例如,10mM钾缓冲液,pH7或25 mM Tris HClpH7缓冲液)中,将粗酶与5mM对-硝基苯基α-D吡喃木糖苷培养1-2小时。也测定粗酶含Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52糖基化的人FVII的片段(由FVII的氨基酸残基39-62组成的肽片段)以评价该酶是否可裂解α-1,3木糖苷键。与肽的培养在37℃下进行3小时或过夜。然后在培养之后,通过MALDI MS直接评价有或没有与α-木糖苷酶培育的肽,从而评价该酶是否可从糖肽中除去0、1或2个木糖。
α-木糖苷酶的纯化
表达的α-木糖苷酶的部分纯化是在与rFVII培育之前进行的。在适宜缓冲液(例如,10mM磷酸盐缓冲液,pH7)中的细胞破裂之后,获得上清液(来源于约20-50ml细胞培养物)。就来源于嗜热菌(例如,tm0308,BH1905,XylS)的酶而言,在50-70℃加热上清液30分钟,在冰上冷却10分钟并通过15.000G离心15分钟而除去沉淀,以便除去热不稳定的大肠杆菌污染物。
将该上清液无菌过滤并涂在1ml DEAE FF柱(AmershamPharmacia)上。纯化是使用AKTA探测器(Amersham Pharmacia)FPLC进行的,并使用下列缓冲液:缓冲液A:25mM磷酸钠pH7,缓冲液B:25mM磷酸钠pH7和1M NaCl。上样后,使用缓冲液A洗去未结合的样品5CV。0-100%缓冲液B的梯度用于20CV,在这过程之中,分级洗脱靶蛋白。纯化之后,通过在对-硝基苯基α-D吡喃木糖苷上培育或通过SDS PAGE,测定在所得色谱图中包含主峰的级分。将含α-木糖苷酶活性的级分在20mM Tris HCl pH7,2mMCaCl2缓冲液中稀释,并在Vivaspin 20 50.000 MWCO柱(Vivascience)上,通过以2900rpm离心而浓缩。
丝氨酸52上仅为葡萄糖的rFVIIa的O-糖型
丝氨酸52上仅为葡萄糖的rFVIIa的O-糖型是通过在适宜缓冲液,例如双甘氨肽或20mM Tris HCl pH7.0,2mM CaCl2中,与纯化的α-木糖苷酶培育适宜的时间而获得的,该时间可实验确定。显现脱糖基化的质谱是通过分析rFVIIα-木糖苷酶培育物ESI-MS(Q-STAR)而获得的。
所得聚糖-重建的rFVIIa从α-木糖苷酶纯化,例如通过阴离子交换色谱法或凝胶过滤或适宜组合。所制备的rFVIIa的O-糖型的纯度通过rFVIIa的O-糖肽图进行证实。
实施例3
通过海栖热袍菌推定α-木糖苷酶基因(tm0308)在大肠杆菌中克隆和表达并纯化历制备α-木糖苷酶
对于tm0308自始至终遵循上述策略(见实施例2)。海栖热袍菌推定α-木糖苷酶基因(tm0308)被PCR扩增并克隆到大肠杆菌pET11a载体中。在大肠杆菌Rosetta(DE3)表达株中表达并用对-硝基苯基α-D吡喃木糖苷评价粗TM0308制剂之后,可获得可溶性tm0308,其清楚显示出α-木糖苷酶活性。使用DEAE FF色谱法,接着通过超滤向上-浓缩而部分纯化α-木糖苷酶。以不同的酶/FVII比,将部分纯化的酶与溶于25mM Tris pH7,2mM CaCl2缓冲液中的FVII在50℃培育3小时或37℃培育过夜。具有相同组成的α-木糖苷酶和rFVII,并向其中 加入合成底物的对照表明,该酶在这些条件下是活性的并且在用和没用木糖苷酶处理下在SDS-凝胶上和通过ESI-MS显现FVII是可能的。然而,可在该第一次实验中检测到没有明显除去与Glc-O-Ser52连接的木糖。相反,观察到从含Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52的纯化还原且烷基化的FVIIa肽中除去了木糖。
实施例4
通过在大肠杆菌中克隆并表达而制备α-木糖苷酶
按照实施例2描述的策略,已将下列构建体克隆到pET表达载体中:基因bl02681(2310 bp)(地衣型芽孢杆菌:H);基因bl1905(2328bp)(Bacillus halodurans:H)、基因xylS(2196 bp)(硫磺矿硫化叶菌:P);基因yicI(2319 bp)(大肠杆菌:P)。
根据上述策略该构建体将在Rosetta中表达,分离,纯化并评价α-木糖苷酶活性。
将各α-木糖苷酶与rFVIIa在适宜缓冲液,例如双甘氨肽或20mMTris HCl pH7.0,2mM CaCl2中培育适宜的时间,该时间可实验测定,显现脱糖基化的MS光谱可通过分析rFVIIα-木糖苷酶培育物ESI-LC-MS(Q-STAR)获得。
通过例如阴离子交换色谱法或凝胶过滤或其适宜组合,从α-木糖苷酶中纯化所得聚糖-重建的rFVIIa。所制备的rFVIIa的O-糖型的纯度通过rFVIIa的O-糖肽图加以证实。
实施例5
通过在大肠杆菌中克隆并表达而制备截短的α-木糖苷酶
近来解开了YicI的晶体结构。因此,表示YicI蛋白的活性、催化结构域的截短α-木糖苷酶(或其它相似的α-木糖苷酶)的克隆可是可能的且正被设计,因为较小的酶,如果是活性的,可更好地接近存在于天然rFVIIa中的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52。从该结构预测酶中包含活性位点的结构域。编码YicI序列该部分的基因序列是从已经存在的 YicI pET11a质粒,例如通过YicI基因相关区域的PCR扩增而制备的。用于PCR的引物将和限制酶位点一起扩展,其可用于将截短的YicI基因连接到pET11a载体中。表达和纯化之后,评价该截短酶的如上所述rFVIIa脱糖基化的可能性。
实施例6
通过α-木糖基转移酶处理制备丝氨酸52上仅为木糖-葡萄糖或丝氨酸52上仅为木糖-木糖-葡萄糖的rFVIIa
α-木糖基转移酶的制备
酶,UDP-D-木糖:β-D-葡萄糖苷α-1,3-D-木糖基转移酶可按照Omichi等人(1997)所述,从HepG2细胞制备。简言之,使HepG2细胞在补充有10%胎牛血清的培养基中生长。微粒体部分是通过细胞的匀化,接着离心而制备。α-木糖基转移酶是通过色谱法纯化的,例如阴离子交换柱和/或本领域技术人员已知的其它色谱柱。在洗脱过程中收集级分,并使用α-木糖基转移酶测定法鉴定含α-木糖基转移酶的级分。
酶,UDP-D-木糖:α-D-木糖苷α1,3-木糖基转移酶可按照Minamida等人(1996)所述从HepG2细胞制备。简言之,使HepG2细胞在补充了10%胎牛血清的培养基中生长。微粒体部分是通过细胞的匀化,接着离心而制备。α-木糖基转移酶是通过色谱法纯化的,例如阴离子交换柱和/或本领域技术人员已知的其它色谱柱。在洗脱过程中收集级分,并使用α-木糖基转移酶测定法鉴定含α-木糖基转移酶的级分。
α-木糖基转移酶测定法
α-木糖基转移酶测定法在适宜缓冲液中进行,例如,10mM Hepes,pH7.2,0.1%Triton X-100,0.5mM UDP-木糖(Sigma U5875),其中含有适宜底物,例如,可从rFVIIa的O-糖肽图或按照Minamida等人所述(Minamida等人,Detection of UDP-D-xylose:α-D-xylosideα1-3xylosyltransferase activity in human hepatoma cell line HepG2.J.Biocham.1201002-1006,1996)制备的吡啶基胺化寡糖获得的O-糖肽。 该反应在适宜时间后通过加入三氟乙酸终止,所述时间可实验测定,并通过HPLC分析测定混合物。
丝氨酸52上仅为木糖-葡萄糖的rFVIIa的O-糖型
丝氨酸52上仅为木糖-葡萄糖的rFVIIa的O-糖型是通过下列方法获得的:(1)如上所述,使用木糖苷酶处理rFVIIa,(2)通过例如阴离子-交换色谱法从木糖苷酶中纯化木糖苷酶处理的rFVIIa,和(3)在适宜缓冲液,例如双甘氨肽,pH7.0,10mM氯化钙中,培养木糖苷酶-处理的rFVIIa和纯化的UDP-D-木糖:β-D-葡萄糖苷α-1,3-D-木糖基转移酶及UDP-D-木糖适宜的时间,该时间可实验测定。例如通过阴离子-交换色谱法从UDP-D-木糖:β-D-葡萄糖苷α-1,3-D-木糖基转移酶中纯化所得糖-重建的rFVIIa。所制备的rFVIIa的O-糖型的纯度通过rFVIIa的O-糖肽图加以证实。
丝氨酸52上仅为木糖-木糖-葡萄糖的rFVIIa的O-糖型
丝氨酸52上为木糖-木糖-葡萄糖的O-糖型是通过下列方法获得的:(1)如上所述,使用木糖苷酶处理rFVIIa,(2)通过例如阴离子-交换色谱法从木糖苷酶中纯化木糖苷酶处理的rFVIIa,(3)如上所述使用UDP-D-木糖:β-D-葡萄糖苷α-1,3-D-木糖基转移酶和UDP-D-木糖进一步处理,和(4)在适宜缓冲液,例如双甘氨肽,pH7.0,10mM氯化钙中,培养该产物和纯化的UDP-D-木糖:α-D-木糖苷α1,3-木糖基转移酶及UDP-D-木糖适宜的时间,该时间可实验测定。例如通过阴离子-交换色谱法从UDP-D-木糖:α-D-木糖苷α1,3-D-木糖基转移酶中纯化所得糖-重建的rFVIIa。所制备的rFVIIa的O-糖型的纯度通过rFVIIa的O-糖肽图加以证实。
实施例7
rFVIIa的O-糖型模式的分析
rFVIIa轻链的胰蛋白酶肽作图
rFVIIa的O-糖型的相对含量是通过rFVIIa轻链的胰蛋白酶肽作图测定的。rFVIIa被还原和烷基化,并在RP-HPLC柱上纯化rFVIIa 轻链,其中使用溶于水:三氟乙酸中的乙腈梯度洗脱。纯化的rFVIIa轻链被缓冲-交换到Tris缓冲液,pH7.5,并用胰蛋白酶消化。在RP-HPLC柱上(例如,NucleosilC18,5μ,300,4.0x250mm,Macherey-Nagel 720065)分析rFVIIa轻链的胰蛋白酶消化物,其中使用溶于水:三氟乙酸中的乙腈梯度(0%-45%乙腈,100分钟内)洗脱(见图2)。流速1.0ml/分,检测是215nm UV。
约60-65分钟之后,洗脱出含rFVIIa的O-糖肽的峰,其中第一和第三个峰包含具有与丝氨酸52连接的木糖-木糖-葡萄糖的O-糖肽,第二和第四个峰包含具有与丝氨酸52连接的葡萄糖的O-糖肽。
相似地,第一和第二个峰包含具有与丝氨酸60连接的四糖的O-糖肽,第三和第四个峰包含具有与丝氨酸60连接的岩藻糖的O-糖肽。
rFVIIa的胰蛋白酶肽作图
O-糖型模式可通过rFVIIa的胰蛋白酶肽作图分析。rFVIIa被缓冲-交换到Tris缓冲液,pH7.5并用胰蛋白酶消化。在RP-HPLC柱(例如,Nucleosil C18,5μ,300,4.0×250mm,Macherey-Nagel 720065)上分析rFVIIa的胰蛋白酶消化产物,用水:三氟乙酸中的乙腈梯度(0%-45%乙腈,100分钟内)洗脱。流速1.0ml/分并在215nm UV检测。
约67-70分钟之后,洗脱出含rFVIIa的O-糖肽的峰,其中第一个峰包含具有与丝氨酸52连接的木糖-木糖-葡萄糖的O-糖肽,第二个峰包含具有与丝氨酸52连接的葡萄糖的O-糖肽。
rFVIIa的总质量分析
O-糖型模式可通过rFVIIa的总质量分析进行分析。在用1%甲酸平衡并用90%甲醇中的3%甲酸洗脱而在Millipore ZipTip C4柱上使rFVIIa脱盐。通过毫微喷雾技术,在Qstar XL质谱仪上分析洗脱出的样品。
约50500 Da的主峰代表具有与丝氨酸52连接的葡萄糖的rFVIIaO-糖型,约50800 Da的主峰代表具有与丝氨酸52连接的木糖-木糖- 葡萄糖的rFVIIa O-糖型。
实施例8
Glc-O-Ser52-FVII和Xyl-XylGlc-O-Ser52-FVII的纯化
Glc-O-ser52-FVII和Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVII是使用疏水作用色谱法(HIC)的两次循环纯化的。装有Toso Haas TSK-Gel苯基5PW的柱子(1.0cm内径×7.0cm长度=5.5ml柱体积(CV))使用5 CV 10mM组氨酸,10mM CaCl2,2.0 M NH4-醋酸盐,pH6.0平衡。给该柱装载约2.5mg FVII pr.ml树脂。在装载之前,向装载溶液中加入2.0 M NH4-醋酸盐和10mM CaCl2。用5 CV 10mM组氨酸,10mMCaCl2,2.0 M NH4-醋酸盐,pH6.0洗涤该柱。使用从10mM组氨酸,10mM CaCl2,2.0 M NH4-醋酸盐,pH6.0到10mM组氨酸,10mMCaCl2,pH6.0的20CV的线性梯度进行洗脱。纯化以6 CV/h的流速在5℃下进行。在洗脱过程中收集级分。
在两个重叠的主峰中洗脱出FVII(见图4:第一次HIC循环的色谱图)。混合含第一个峰的级分(级分“A”,图4)并通过HIC的第二次循环进一步纯化,其中使用与第一次HIC循环相同的色谱过程(见图5:通过将级分“A”再次装载到HIC柱上获得的色谱图)。充分混合含第二个峰的级分(级分“B”,图4)并通过HIC的第二次循环进一步纯化,其中使用与第一次HIC循环相同的色谱过程(见图6:通过将级分“B”再次装载到HIC柱上获得的色谱图)。
鉴定通过将级分“A”再次装载到第二HIC步骤上获得的峰级分,部分10中的纯化Glc-O-Ser52-FVII(图5)。鉴定通过将部分“B”再次装载到第二HIC步骤上获得的峰部分,部分15中的纯化Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVII(图6)。该鉴定通过实施例7中所述rFVIIa的胰蛋白酶肽作图(图7A和7B)和实施例7中所述rFVIIa的总质量分析(图8A和8B)获得。两种分析均显示峰部分,部分10中较高含量的Glc-O-Ser52-rFVIIa和较低含量的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa,以及峰部分,部分15中较低含量的Glc-O-Ser52-rFVIIa和较高含量的 Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa。两个峰部分中O-糖型含量的量化不能获得,这是由于该部分中相对较低的rFVIIa含量(图7A和7B:胰蛋白酶肽作图:与O-糖肽共同-洗脱或接近洗脱的rFVIIa的其它肽片段,因此不能测定出含量低的O-糖肽含量)(图8A和8B:总质量分析:rFVIIa的其它O-和/或N-糖型,例如,在质谱中出现的缺少一个N-乙酰基神经氨酸的rFVIIa的N-糖型,并且因此不能测定含量低的rFVIIa的O-糖型含量)。
从HIC获得的峰部分的比活性(表1)是通过第一代凝固测定法测定的。发现Glc-O-Ser52-rFVIIa O-糖型具有低的比活性,而Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa O-糖型具有高的比活性。
表1.使用第一代凝固测定法测定从HIC获得的峰部分的比活性。rFVIIa的含量通过HPLC测定
样品 | 比活性 |
PS5002-014 Frak.10 | 44 IU/μg |
PS5002-015 Frak.15 | 61 IU/μg |
PS5002-014/015原料 | 53 IU/μg |
实施例9
通过疏水作用色谱法纯化
高度纯化的Glc-O-Ser52-rFVIIa制剂和高度纯化的Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa制剂可按照上面所述,通过用疏水作用色谱法反复纯化而获得。具有较高rFVIIa含量的高度纯化的Glc-O-Ser52-rFVIIa和Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa制剂可通过增加原料的用量如上述进行疏水作用色谱法而获得。具有较高rFVIIa含量的高度纯化制剂中的rFVIIa的各O-糖型含量可按照实施例7中所述,通过rFVIIa轻链的胰蛋白酶肽作图而量化。高度纯化制剂的比活性可通过上述第一代凝固测定法测定。
Claims (35)
1.一种含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键的一部分的糖蛋白的制剂,其中所述糖蛋白是因子VII多肽,该制剂含有至少80%均匀的丝氨酸/苏氨酸连接的糖基化模式。
2.根据权利要求1所述的制剂,其中所述糖基化模式是至少85%均匀的。
3.根据权利要求1所述的制剂,其中所述糖基化模式是至少90%均匀的。
4.根据权利要求1所述的制剂,其中所述糖基化模式是至少95%均匀的。
5.根据权利要求1所述的制剂,其中所述糖基化模式是至少98%均匀的。
6.根据权利要求1所述的制剂,其中丝氨酸/苏氨酸连接的聚糖是Xyl-Xyl-Glc-。
7.根据权利要求1所述的制剂,其中丝氨酸/苏氨酸连接的聚糖是Xyl-Glc-。
8.根据权利要求1所述的制剂,其中丝氨酸/苏氨酸连接的聚糖是Glc-。
9.根据权利要求1至8任何一项所述的制剂,其中所述糖蛋白是人因子VII。
10.根据权利要求1至8任何一项所述的制剂,其中所述糖蛋白为因子VII的变体并且当在“体外水解测定法”或“体外蛋白酶解测定法”中测试时,其中因子VII变体的活性与天然人因子VIIa的活性之间的比为至少1.25。
11.根据权利要求1至8任何一项所述的制剂,其中所述糖蛋白为因子VII的变体并且当在“体外水解测定法”或“体外蛋白酶解测定法”中测试时,其中因子VII变体的活性与天然人因子VIIa的活性之间的比为至少2.0。
12.根据权利要求1至8任何一项所述的制剂,其中所述糖蛋白为因子VII的变体并且当在“体外水解测定法”或“体外蛋白酶解测定法”中测试时,其中因子VII变体的活性与天然人因子VIIa的活性之间的比为至少4.0。
13.一种制备权利要求1至12任何一项所述制剂的方法,其中丝氨酸/苏氨酸连接的聚糖是-Glc;该方法包括下列步骤:
(a)从制备它的细胞中,获得含有Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键的一部分的糖蛋白的制剂,其中所述糖蛋白是因子VII多肽;
(b)在适于从所述糖蛋白中除去木糖残基的条件下,使在步骤(a)中获得的制剂与α-木糖苷酶接触,由此产生具有改变的糖基化模式的糖蛋白。
14.根据权利要求13所述的方法,它还包括分离在步骤(b)中制备的具有葡萄糖-O-丝氨酸/苏氨酸糖基化的糖蛋白的步骤。
15.根据权利要求13所述的方法,其中所述糖基化为丝氨酸糖基化。
16.根据权利要求13至15任何一项所述的方法,它还包括如下步骤:分析与多肽连接的寡糖的结构,以测定糖型模式。
17.根据权利要求16所述的方法,它还包括重复步骤(b)直到获得所需的糖型模式。
18.一种制备权利要求1至12任何一项所述制剂的方法,其中所述丝氨酸/苏氨酸-连接的聚糖是Glc;该方法包括下列步骤:
(a)获得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序的因子VII多肽的制剂;
(b)在适于将葡萄糖残基从葡萄糖供体部分转移到丝氨酸/苏氨酸接受体部分的条件下,使在步骤(a)中获得的制剂与O-葡萄糖基转移酶和活化的葡萄糖供体接触,由此产生具有改变的糖基化模式的糖蛋白。
19.根据权利要求18所述的方法,它还包括分离步骤(b)中制备的具有葡萄糖-O-丝氨酸/苏氨酸糖基化的糖蛋白的步骤。
20.根据权利要求18所述的方法,其中所述糖基化为丝氨酸糖基化。
21.根据权利要求18至20任何一项所述的方法,它还包括如下步骤:分析与多肽连接的寡糖的结构,以确定糖型模式。
22.根据权利要求21所述的方法,它还包括重复步骤(b)直到获得所需的糖型模式。
23.一种制备权利要求1至12任何一项所述制剂的方法,其中所述丝氨酸/苏氨酸连接的聚糖是Xyl-Glc-;该方法包括下列步骤:
(a)获得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键的一部分的因子VII多肽的制剂;
(b)在适于将木糖残基从木糖供体部分转移到接受体部分的条件下,使步骤(a)中获得的制剂与UDP-D-木糖:β-D-葡糖苷α-1,3-D-木糖基转移酶及活化的木糖基供体接触,由此产生具有改变的糖基化模式的糖蛋白。
24.根据权利要求23所述的方法,它还包括分离步骤(b)中制备的具有木糖-葡萄糖-O-丝氨酸/苏氨酸糖基化的糖蛋白的步骤。
25.根据权利要求23所述的方法,其中所述糖基化为丝氨酸糖基化。
26.根据权利要求23所述的方法,它还包括如下步骤:分析与多肽连接的寡糖的结构,以确定糖型模式。
27.根据权利要求26所述的方法,它还包括重复步骤(b)直到获得所需的糖型模式。
28.根据权利要求23至27任何一项所述的方法,它还包括如下步骤:在步骤(b)之前,通过使步骤(a)中获得的制剂经历权利要求13至17任何一项所述的方法,除去末端木糖残基。
29.一种制备权利要求1至12任何一项所述制剂的方法,其中所述丝氨酸/苏氨酸-连接的聚糖是Xyl-Xyl-Glc-;该方法包括下列步骤:
(a)获得含Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys基序并且其中所述丝氨酸/苏氨酸形成Glc-O-Ser/Thr共价键的一部分的因子VII多肽的制剂;
(b)在适于将木糖残基从木糖供体部分转移到接受体部分的条件下,使步骤(a)中获得的制剂与UDP-D-木糖:β-D-葡糖苷α-1,3-D-木糖基转移酶及活化的木糖基供体接触,由此产生具有改变的糖基化模式的糖蛋白;
(c)在适于将木糖残基从木糖供体部分转移到接受体部分的条件下,使步骤(b)中获得的制剂与UDP-D-木糖:α-D-木糖苷α-1,3-木糖基转移酶及活化的木糖基供体接触,由此产生具有改变的糖基化模式的糖蛋白。
30.根据权利要求29所述的方法,它还包括在使所述制剂经历步骤(c)之前,分离步骤(b)中获得的制剂的步骤。
31.根据权利要求29所述的方法,它还包括分离步骤(c)中制备的具有木糖-木糖-葡萄糖-O-丝氨酸/苏氨酸糖基化的糖蛋白的步骤。
32.根据权利要求29所述的方法,其中所述糖基化为丝氨酸糖基化。
33.根据权利要求29所述的方法,它还包括如下步骤:分析与多肽连接的寡糖的结构,以确定糖型模式。
34.根据权利要求33所述的方法,它还包括重复步骤(b)和/或步骤(c)直到获得所需的糖型模式。
35.根据权利要求29至34任何一项所述的方法,它还包括在步骤(b)之前,通过使步骤(a)中获得的制剂经历权利要求13至16任何一项所述的方法,除去末端木糖残基的步骤。
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