JP2007522805A - 新規化合物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新規の凝固因子FVIIaポリペプチドに関する。
【選択図】 なし

Description

発明の分野
本発明は、凝固能力／活性を有する新規ヒト凝固第VII/VIIa因子タンパク質、ならびにそのポリペプチドを含む医薬組成物、使用および治療法に関する。
発明の背景
血液凝固は、最終的にフィブリン凝血塊を生じさせる種々の血液成分（または因子）の複雑な相互作用からなるプロセスである。一般的に、凝固「カスケード」と呼ばれるものに関与する血液成分は、活性化因子（それ自体は活性化された凝固因子）の作用によりタンパク質分解酵素に変換される、酵素的に不活性なタンパク質（プロ酵素またはチモーゲン）である。このような変換を受けた凝固因子は、一般的に「活性因子」と呼ばれ、凝固因子の名前に文字「a」を付加することにより表される（例えば第VIIa因子）。
止血プロセスの開始は、血管壁に対する傷害の結果として露出する組織因子および第VIIa因子間の複合体形成によって媒介される。この複合体はその後、第IX因子および第X因子をそれらの活性型に変換する。第Xa因子は、組織因子を有する細胞上でわずかな量のプロトンビンをトロンビンに変換する。トロンビンは、血小板を活性化し、ならびに第V因子および第VIII因子を第Va因子および第VIIIa因子へと活性化し、これらは共に完全なトロンビンバーストへと導くさらなるプロセスにおいて補因子となる。このプロセスには第IXa因子（第VIIIa因子との複合体）による第Xa因子の生成が含まれ、活性化された血小板の表面で起こる。トロンビンは、最終的にフィブリノゲンをフィブリンに変換し、結果としてフィブリン凝血塊の形成を生じる。近年、第VII因子および組織因子が血液凝固の主要イニシエータであることがわかっている。
第VII因子は、血中で単鎖チモーゲンとして循環している微量血漿糖タンパク質である。このチモーゲンは、触媒的に不活性である。単鎖第VII因子は、第Xa因子、第XIIa因子、第IXa因子、第VIIa因子、またはトロンビンによって、インビトロで二本鎖第VIIa因子に変換されてよい。第Xa因子は、第VII因子の主要な生理学的活性化因子であると信じられている。止血に含まれる他のいくつかの血漿タンパク質のように、また、他の多数の凝固タンパク質のように、野生型第VII因子はその活性についてビタミンKに依存しており、これはタンパク質のアミノ末端の近くに形成される、多数のグルタミン酸残基のガンマカルボキシル化のために必要とされる。これらのガンマカルボキシル化グルタミン酸は、野生型第VII因子のリン脂質とのカルシウムイオン誘導相互作用のために必要とされる。チモーゲン第VII因子の活性化された二本鎖分子への変換は、内部Arg152-Ile153ペプチド結合の切断によって生じる。組織因子、リン脂質、およびカルシウムイオンの存在下で、二本鎖第VIIa因子は、第X因子または第IX因子をタンパク質限定加水分解により速やかに活性化する。
それ故、野生型第VII因子は、カルボキシグルタミン酸残基に富むドメイン（「GLAドメイン」）、ヒト上皮細胞成長因子と相同性の配列を含む領域、およびセリンプロテアーゼ触媒三連構造を含む触媒的なドメインを含むドメイン構造を有する。触媒的ドメインは、本来グリコシル化される。
被験者における凝固カスケードを刺激または改善することが望ましいことが多い。第VIIa因子は、凝固因子欠乏（例えば血友病AおよびB、または凝固因子XIもしくはVIIの欠乏）、または凝固因子阻害物質のようないくつかの原因を有する出血性疾患の制御のために用いられてきた。第VIIa因子は、正常に機能している血液凝固カスケード（凝固因子のいずれに対しても凝固因子の欠乏または阻害物質がない）を有する被験者に起こった過剰な出血を制御するためにも用いられてきた。このような出血は、例えば不完全な血小板機能、血小板減少症、またはウォンウィルブランド病により引き起こされてもよい。出血は、手術および組織傷害の他の形態と関連する主要な問題でもある。
FVIIは、組み換えで調製することができるが、細菌はタンパク質の膜結合に必要なビタミンK依存性ガンマ-カルボキシル化を導入する能力をもたないので、野生型第VII因子の主要構造については、原核宿主細胞中での機能性タンパク質の生成が不可能である。慣例上、野生型FVIIの生成は、より高等な哺乳類細胞における発現に制限される。しかしながら、哺乳類細胞における発現は、原核生物における発現よりも複雑で、時間がかかり、収量は概してより制限され；一般的に、哺乳類細胞における生成はそれ故、原核宿主細胞を用いた生成よりも費用がかかる。
野生型FVIIaは、他と対照的に、相同のセリンプロテアーゼがエネルギー的に好ましくない活性コンホメーションを有する。その結果は、遊離野生型ヒト第VIIa因子の最適な酵素活性では全くなく、それは同種の、膜結合補因子組織因子(TF)との結合において劇的に高められる。自然環境において、遊離野生型ヒト第VIIa因子の酵素原性は、血管障害およびそれに伴うTF露出におけるFVIIa止血性活性の誘発および適切な位置を折よく保証する。
欧州特許第200,421号（ZymoGenetics）は、哺乳類の細胞中における、ヒト第VII因子をコード化するヌクレオチド配列および第VII因子の組み換え体の発現に関する。ディッキンソンら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 14379-14384)は、Leu305がAlaによって置換された第VII因子の変種(FVII(Ala305))に関する。
Iwanagaら(Thromb. Haemost. (supplement August 1999), 466, abstract 1474)は、残基316〜320が欠失し、または残基311〜322がトリプシン由来の対応する残基で置換された第VIIa因子の変種に関する。Sakaiら(J. Biol. Chem. 1990;265:1890-1894) および Nicolaisen ら (FEBS Lett. 1992;306:157-160) は、FVIIaのGLAドメインに関する。
公開された国際特許出願WO 01/83725, WO 02/22776, WO 03/027147, WO 03/037932, および WO 04/029090は全て、維持された、または増強された活性を有する第VIIa因子の変種に関する。WO 02/077218は、血清半減期を延長した第VIIa因子の誘導体に関する。
発明の概要
組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して、実質的に同じまたは増大したタンパク質分解活性を有する、製造により費用のかからない、より簡単なタンパク質を提供することが本発明の目的である。
本発明は広い側面において、組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して、実質的に同じまたは増大したタンパク質分解活性を有するFVIIポリペプチドに関するものであり、ここでのFVIIポリペプチドは、本質的に、機能性脂質膜結合性ドメインをもたない。
第一の側面において、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドに関するものであり、ここでのアミノ酸置換は、K157, V158, E296, M298, L305, M306, D309, S314, D334, S336, K337, F374からなる群より選択される1以上のアミノ酸のいずれか他のアミノ酸との置換であり、ここでのFVIIポリペプチドは本質的にGLA残基をもたない。
第二の側面において、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含む、第VII因子ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド構築物に関するものであり、ここでのアミノ酸置換は、K157, V158, E296, M298, L305, M306, D309, S314, D334, S336, K337, F374からなる群より選択される1以上のアミノ酸の他のいずれか他のアミノ酸との置換であり、ここでのFVIIポリペプチドは本質的にGLA残基をもたない。
「構築物」という用語は、関心のあるポリペプチドをコード化する、完全にまたは部分的に自然発生のヌクレオチド配列に基づいてもよいポリヌクレオチドセグメントを示すことが意図されている。前記構築物は、任意に他のポリヌクレオチドセグメントを含んでもよい。同様に、「ポリヌクレオチド構築物によりコード化され得るアミノ酸」という用語は、上記で定義したポリヌクレオチド構築物によりコード化され得るアミノ酸、すなわちAla, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp 、および Glnを包含する。
さらなる側面において、本発明は、本発明の第VII因子ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド構築物を含む組み換えベクターを提供する。
ここで使われる場合、「ベクター」という用語は、宿主細胞中で増幅の能力がある核酸実体を意味する。それ故、ベクターは自己複製ベクター、すなわち、例えばプラスミドのように染色体外の実体として存在し、その複製は染色体の複製とは無関係の複製であってよい。あるいは、ベクターは宿主細胞に導入されるとき、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されてもよい。ベクターの選択は、多くの場合それが導入される宿主細胞に依存してよい。ベクターには、これに限定するものではないが、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルス、またはコスミドベクターが含まれる。ベクターは通常、複製開始点および少なくとも1つの選択可能な遺伝子、すなわち、容易に検出可能な生成物をコード化する遺伝子または細胞増殖に必要な存在をコード化する遺伝子を含む。
さらなる側面において、本発明は、ポリヌクレオチド構築物またはベクターを含む組み換え宿主細胞を提供する。1つの実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。
1つの実施形態において、宿主細胞は哺乳類起源である。1つの実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞である。1つの実施形態において、宿主細胞は、CHO細胞、HEK細胞、およびBHK細胞からなる群より選択される。1つの実施形態において、宿主細胞は微生物である。1つの実施形態において、宿主細胞は、大腸菌、枯草菌、ロドコッカス属、ストレプトマイセス属、放線菌類、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、エルウィニア属、サルモネラ属、酵母、ピッチア(Picchia)、原虫、ペニシリウム属、フザリウム属、アスペルギルス属、ポドスポラ(Podospora)、およびバンカビ属からなる群より選択される。
「宿主細胞」という用語は、ここで使われる場合、雑種細胞を含む異種DNAがその中で発現され得る細胞を意味する。典型的な宿主細胞には、これに限定するものではないが、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、ヒトの細胞を含む、BHK、CHO、HEK、およびCOS細胞のような哺乳類細胞が含まれる。
さらなる側面において、本発明は、ポリヌクレオチド構築物を含み、および発現するトランスジェニック動物を提供する。
さらなる側面において、本発明は、ポリヌクレオチド構築物を含み、および発現するトランスジェニック植物を提供する。
さらなる側面において、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドを製造する方法に関するものであり、ここでのアミノ酸置換は、K157, V158, E296, M298, L305, M306, D309, S314, D334, S336, K337, F374からなる群より選択される1以上のアミノ酸の、いずれか他のアミノ酸との置換であり、ここでのFVIIポリペプチドは本質的にGLA残基をもたず、前記方法は、適切な培養培地において、第VII因子ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド構築物を含有する宿主細胞を、ポリヌクレオチド構築物の発現を可能にする条件下で培養すること、および得られたポリペプチドを増殖培地または宿主細胞から回収することを含む。1つの実施形態において、得られたポリペプチドは細胞溶解により宿主細胞から回収される。
ここで使われる場合、「適切な培養培地」という用語は、細胞の培養ならびに本発明の第VII因子ポリペプチドをコード化する核酸配列の発現に必要な栄養分および他の成分を含有する培地を意味する。
さらなる側面において、本発明は、第VII因子ポリペプチドを製造するための方法に関するものであり、前記方法は、トランスジェニック動物により作られる乳汁からポリペプチドを回収することを含む。
さらなる側面において、本発明は、第VII因子ポリペプチドを製造するための方法に関するものであり、前記方法は、ポリヌクレオチド構築物を含有するトランスジェニック植物の宿主細胞を培養すること、および得られた植物からポリペプチドを回収することを含む。
さらなる側面において、本発明はFVIIポリペプチドを含有する医薬組成物に関するものであり、ここでのFVIIポリペプチドは、本質的にGLA残基を持たず；任意に、薬剤的に許容可能な担体を含む。1つの実施形態において、前記FVIIポリペプチドは野生型ヒトFVIIaである。
さらなる側面において、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドを含有する医薬組成物に関するものであり、ここでのアミノ酸置換は、K157, V158, E296, M298, L305, M306, D309, S314, D334, S336, K337, F374
からなる群より選択される1以上のアミノ酸の、いずれか他のアミノ酸との置換であり、ここでのFVIIポリペプチドは、本質的にGLA残基を持たず；前記組成物は、任意に、薬剤的に許容可能な担体を含む。
さらなる側面において、本発明はFVIIポリペプチドの使用に関するものであり、ここでのFVIIポリペプチドは本質的にGLA残基を持たず；前記使用は、出血性疾患もしくは出血エピソードの治療のため、または正常な止血系の増強のための薬剤の調製を目的とする。1つの実施形態において、前記FVIIポリペプチドは野生型ヒトFVIIaである。
さらなる側面において、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドの使用に関するものであり、ここでのアミノ酸置換は、K157, V158, E296, M298, L305, M306, D309, S314, D334, S336, K337, F374からなる群より選択される1以上のアミノ酸の、いずれか他のアミノ酸との置換であり、ここでのFVIIポリペプチドは本質的にGLA残基を持たず；前記使用は、出血性疾患もしくは出血エピソードの治療のため、または正常な止血系の増強のための薬剤の調製を目的としたものである。1つの実施形態において、前記使用は血友病AまたはBの治療を目的としたものである。
この文脈において、「治療」という用語は、出血を阻止することまたは最小限にすることを目的として、手術のように予期された出血を阻止すること、および外傷のようにすでに起きている出血を制御することの両方を含む。本発明による第VIIa因子の予防的な投与は、それ故、「治療」という用語に含まれる。
「出血エピソード」という用語は、制御されない、および過剰な出血を含むことを意味する。出血エピソードは、手術および組織傷害の他の形態の両方と関連して主要な問題となり得る。制御されない、および過剰な出血は、正常な止血系を有する被験者、および止血または出血障害を有する被験者において起こり得る。ここで用いられる場合、「出血障害」という用語は、先天的な、後天的な、または誘発された、出血において明らかにされる細胞または分子起源の欠損を示す。例は、凝固因子欠乏症（例えば、血友病AおよびB、または凝固因子XIもしくはVIIの欠乏症）、凝固因子阻害物質、不完全な血小板機能、血小板減少症、またはウォンウィルブランド病である。
過剰な出血は、正常に機能している血液凝固カスケード（凝固因子のいずれに対しても凝固因子欠乏または阻害物質がない）を有する被験者においても起こり、並びに、不完全な血小板機能、血小板減少症、またはウォンウィルブランド病によっても引き起こされ得る。血友病の場合の止血系は、主要な出血を引きおこす重要な凝固「化合物」（血小板またはウォンウィルブランド因子タンパク質のようなもの）を異常に欠いているかまたは有しているので、このような場合、出血は血友病により引き起こされた出血とみなしてよい。手術または広範な外傷に付随した大規模な組織傷害を経験する被験者において、正常な止血機構は即時性の止血の傷害により打ち消される可能性があり、正常な止血機構にもかかわらず出血を発展させる可能性がある。出血が、外科的な止血に対する実現性が限られる脳、内耳部分、および目のような器官において起こる場合に、満足な止血を達成することは問題である。同様な問題は、種々の器官（肝臓、肺、腫瘍組織、消化管）から生検材料をとる過程において、および腹腔鏡手術において生じ得る。これら全ての場合の共通点は、出血が拡大した場合（出血性胃炎および子宮のおびただしい出血）についても言えることであるが、外科的技術（縫合、クリップなど）によって止血を提供することの難しさである。急性の、およびおびただしい出血は、治療を受けることにより不完全な止血が誘発された、抗凝血治療を受けている被験者においても起こり得る。そのような被験者は、抗凝血効果に迅速に対抗しなければならない場合、外科的処置をする必要がある可能性がある。恥骨後方の根治的前立腺切除は、一般的に局在性の前立腺癌を有する被験者に対して行われる方法である。その手術は、著しい、および時に大量の血液損失によりしばしば複雑になる。前立腺切除の間の考慮に入れるべき血液の損失は、主に、外科的止血に容易には到達できない種々の高密度に血管新生した部位を伴う複雑な解剖学的側面に関係があり、その結果として広い範囲からの拡散した出血を生じ得る。不十分な止血の場合において問題を引き起こし得るもう1つの状況は、正常な止血機構を有する被験者が、血栓塞栓性疾患を防ぐために抗凝血治療をなされたときである。そのような治療には、ヘパリン、プロテオグリカンの他の形態、ワルファリン、またはビタミンKアンタゴニストの他の形態、ならびにアスピリンおよび他の血小板凝集阻害剤が含まれてよい。本発明の1つの実施形態において、出血は血友病に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は獲得した阻害物質を伴う血友病に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は血小板減少症に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血はウォンウィルブランド病に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は重篤な組織傷害に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は重篤な外傷に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は手術に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は腹腔鏡手術に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は出血性胃炎に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は子宮のおびただしい出血に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は機械的な止血に対する可能性が限られている臓器において生じる。もう1つの実施形態において、出血は、脳、内耳部分、または目で生じるものである。もう1つの実施形態において、出血は生検を取る過程に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は抗凝血治療に付随したものである。
ここで用いられる「被験者」という用語は、動物、特にヒトのような哺乳類を意味し、適切な場合は「患者」という用語と交換して使用できることが意図されている。
「正常な止血系の増強」という用語は、トロンビンを生成する能力の増強を意味する。
さらなる側面において、本発明は、被験者における出血障害もしくは出血エピソードの治療のため、または正常な止血系の増強のための方法に関するものであり、前記方法は、治療的もしくは予防的に有効な量のFVIIポリペプチドを、それらを必要とする被験者に対して投与することを含み、前記FVIIポリペプチドは本質的にGLA残基を持たない。1つの実施形態において、前記FVIIポリペプチドは野生型ヒトFVIIaである。
さらなる側面において、本発明は、被験者における出血障害もしくは出血エピソードの治療のため、または正常な止血系の増強のための方法に関するものであり、前記方法は、配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含む治療的または予防的に有効な量のFVIIポリペプチドを、それを必要とする被験者に投与することを含む方法であり、ここでのアミノ酸置換は、K157, V158, E296, M298, L305, M306, D309, S314, D334, S336, K337, F374からなる群より選択される1以上のアミノ酸の、いずれか他のアミノ酸との置換であり、ここでのFVIIポリペプチドは本質的にGLA残基を持たない。1つの実施形態において、前記出血障害は血友病AまたはBである。
さらなる側面において、本発明は、薬剤として使用するための、本質的にGLA残基を持たない因子FVIIポリペプチドに関する。
さらなる側面において、本発明は、薬剤として使用するための、配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドに関するものであり、ここでのアミノ酸置換は、K157, V158, E296, M298, L305, M306, D309, S314, D334, S336, K337, F374からなる群より選択される1以上のアミノ酸の、いずれか他のアミノ酸との置換であり、ここでのFVIIポリペプチドは本質的にGLA残基を持たない。
発明の詳細な説明
本発明の発明者は、組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して、実質的に同じまたは増大したタンパク分解活性を有する第VII因子ポリペプチドを調製することが可能であろうということを認識するに至ったが、ここでは、ガンマ-カルボキシグルタミン酸含有脂質膜結合性ドメインは欠けているか、または機能を持たない。
FVIIaの活性を調節する機構の、我々の理解における最近の進歩は、遊離酵素においてチモーゲン性決定因子として機能する側鎖の位置を正確に示している。このようなアミノ酸残基の置換により、結果として増大した内因性（TF-非依存性）の触媒効率を有するFVIIa分子を生じる。相対的に高い内因性の活性をもつこのようなFVIIaの変種の一部は、遊離第VIIa因子のチモーゲン様構造が、限定された数の重要なアミノ酸残基により規定されるということを示している。これら過活性のFVIIaの変種の1つは、158、296、および298位に突然変異を含んでおり、遊離FVIIaというよりむしろTF-結合に似たいくつかの性質を示す。野生型FVIIaと比較して増大した内因性の酵素活性および阻害物質感受性とは別に、これらFVIIaの変種は、カルシウムイオンに対する必要性の減弱、および、この残基のAsp343との塩橋形成を示す、より深く埋め込まれたプロテアーゼドメインN-末端（Ile153）を有する。
既に示したように、野生型ヒトFVIIaおよび野生型ヒトFVIIaと比較して増大したタンパク質分解活性を有するFVIIaの変種は、異なった性質を持つ。遊離の野生型ヒトFVIIaはチモーゲン様構造を持つが、野生型ヒトFVIIaと比較して増大したタンパク質分解活性を有するFVIIa変種はTF-結合FVIIaに似たいくつかの性質を示す。
本発明によると、「本質的にGLA残基を持たない」FVIIポリペプチドは、実質的に、宿主細胞由来のGLA残基、すなわち4-カルボキシグルタミン酸（ガンマ-カルボキシグルタミン酸）がないFVIIポリペプチドである。
本発明の1つの側面は、本質的にGLA残基を持たないFVIIポリペプチドに関する。1つの実施形態において、前記FVIIポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する39〜406からなるFVIIポリペプチド（(1-38)がない-組み換えヒトFVIIa）ではない。1つの実施形態において、FVIIポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する45〜406からなるFVIIポリペプチド（(1-44)がない-組み換えヒトFVIIa）ではない。
1つの実施形態において、FVIIポリペプチドは全くGLA残基を持たない。本発明の1つの実施形態において、配列番号1のアミノ酸配列に対する6,7,14,16,19,20,25,26,29,および35からなるリストより選択される任意の位置のGLA残基は、いずれか他のアミノ酸により置換されている。本発明の1つの実施形態において、配列番号1のアミノ酸配列に対する6,7,14,16,19,20,25,26,29,および35からなるリストより選択される任意の位置のGLA残基は、Glu, Gln, Asp, およびAsnからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されている。本発明の1つの実施形態において、配列番号1のアミノ酸配列に対する6,7,14,16,19,20,25,26,29,および35から選択される任意の位置のGLA残基は、Gluによって置換されている。本発明の1つの実施形態において、配列番号1のアミノ酸配列に対する6,7,14,16,19,20,25,26,29,および35から選択される任意の位置のGLA残基は、Glnによって置換されている。配列番号1のアミノ酸配列に対する6,7,14,16,19,20,25,26,29,および35から選択される任意の位置のGLA残基の置換は、FVIIポリペプチドをコード化するヌクレオチド構築物からの機能性プロペプチドの除去により、Gluによって置換されてよいということが理解される。それ故、本発明の1つの実施形態において、本発明により第VII因子ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド構築物は、機能性プロペプチドを欠いている。
本発明の1つの実施形態において、配列番号1のアミノ酸配列に対する6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29,および35からなるリストより選択される任意の位置の1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,または10 GLA残基は、いずれか他のアミノ酸によって置換される。
本発明のもう1つの実施形態において、FVIIポリペプチドは、ガンマカルボキシル化できない宿主細胞中での合成により、本質的にGLA残基を持たない。1つの実施形態において、宿主細胞はガンマカルボキシラーゼを発現しない。
本発明のもう1つの実施形態において、ビタミンKアンタゴニストの存在下、宿主細胞中で合成することにより、FVIIポリペプチドは本質的にGLA残基を持たない。1つの実施形態において、ビタミンKアンタゴニストは、ワルファリン、クマリン、およびアセノクマロールからなるリストより選択される。
本発明によると、FVIIポリペプチドは、ヒト野生型FVIIおよび／または他のポリペプチド由来のものには通常存在しない、脂質膜結合性ドメインを有していてもよい。適した脂質膜結合性ドメインは、5,225,537に開示されており、該特許の全体を本明細書の一部としてそのまま援用する。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでのK157はいずれか他のアミノ酸で置換される。
「いずれか他のアミノ酸」という用語は、ここで使われる場合、その位置に本来存在するアミノ酸とは異なる1つのアミノ酸を意味する。これは、限定するものではないが、ポリヌクレオチドによってコード化され得るアミノ酸を含む。好ましくは、この異なるアミノ酸は天然L-型であり、ポリヌクレオチドによりコード化され得る。特異的な例はL-システイン(Cys)である。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、V158がいずれか他のアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、E296がいずれか他のアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、M298がいずれか他のアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、L305がいずれか他のアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、M306がいずれか他のアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、D309がいずれか他のアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、S314がいずれか他のアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、D334がいずれか他のアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、S336がいずれか他のアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、K337がいずれか他のアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、F374がいずれか他のアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、プロテアーゼドメインの残りの位置において少なくとも1つのアミノ酸がいずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、プロテアーゼドメインの残りの位置において、多くて20の付加的アミノ酸がいずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、配列番号1の159〜170から選択される位置のアミノ酸に対応する少なくとも1つのアミノ酸が、いずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、配列番号1の290〜304から選択される位置のアミノ酸に対応する少なくとも1つのアミノ酸が、いずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、R304がTyr、Phe、Leu、およびMetからなる群より選択されるアミノ酸により置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、配列番号1の307〜312から選択される位置のアミノ酸に対応する少なくとも1つのアミノ酸が、いずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、配列番号1の330〜339から選択される位置のアミノ酸に対応する少なくとも1つのアミノ酸が、いずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、A274がいずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、A274がMet、Leu、Lys、およびArgからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、K157がGly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、およびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、V158がSer、Thr、Asn、Gln、Asp、およびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、E296がArg、Lys、Ile、Leu、およびValからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、M298がLys、Arg、Gln、およびAsnからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、L305がVal、Tyr、およびIleからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、M306がAspおよびAsnからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、D309がSerおよびThrからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、S314がGly、Lys、Gln、およびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、D334がGlyおよびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、S336がGlyおよびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、K337がAla、Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、およびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、F374がProおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、F374がTyrによって置換されたポリペプチドである。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜38を含まない。1つの実施形態において、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜38は、第VII因子ポリペプチドの合成の後、タンパク質分解酵素により除去されている。1つの実施形態において、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜38をコード化するポリヌクレオチド配列は、第VII因子ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド構築物から除去されている。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜44を含まない。1つの実施形態において、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜44は、第VII因子ポリペプチドの合成の後、タンパク質分解酵素により除去されている。1つの実施形態において、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜44をコード化するポリヌクレオチド配列は、第VII因子ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド構築物から除去されている。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜85を含まない。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜90を含まない。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜152を含まない。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドは、少なくとも配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列39〜406からなる。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドは、少なくとも配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列45〜406からなる。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドは、少なくとも配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列86〜406からなる。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドは、少なくとも配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列91〜406からなる。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドは、少なくとも配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列153〜406からなる。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでのアミノ酸は、ポリヌクレオチド構築物によりコード化され得るいずれか他のアミノ酸で置換される。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドは活性化型である。
本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドのタンパク質分解活性および配列番号1において示した天然の第VIIa因子ポリペプチドのタンパク質分解活性の比は、少なくとも約1.25である。本発明の1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの比は少なくとも約2.0であり、好ましくは少なくとも約4.0である。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、野生型ヒトFVIIaより高いタンパク質分解活性を有する。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドは野生型ヒトFVIIであり、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜38を含まない。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドは野生型ヒトFVIIであり、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜44を含まない。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドは野生型ヒトFVIIであり、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜152を含まない。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、配列番号1の野生型ヒトFVIIのアミノ酸配列39〜406を含む。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、配列番号1の野生型ヒトFVIIのアミノ酸配列45〜406を含む。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、配列番号1の野生型ヒトFVIIのアミノ酸配列153〜406を含む。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドは、以下からなる群より選択される配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸置換を含む：L305V, L305V/M306D/D309S, L305I, L305T, F374P, V158T/M298Q, V158D/E296V/M298Q, K337A, M298Q, V158D/M298Q, L305V/K337A, V158D/E296V/M298Q/L305V, V158D/E296V/M298Q/K337A, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A, K157A, E296V, E296V/M298Q, V158D/E296V, V158D/M298K, and S336G, L305V/K337A, L305V/V158D, L305V/E296V, L305V/M298Q, L305V/V158T, L305V/K337A/V158T, L305V/K337A/M298Q, L305V/K337A/E296V, L305V/K337A/V158D, L305V/V158D/M298Q, L305V/V158D/E296V, L305V/V158T/M298Q, L305V/V158T/E296V, L305V/E296V/M298Q, L305V/V158D/E296V/M298Q, L305V/V158T/E296V/M298Q, L305V/V158T/K337A/M298Q, L305V/V158T/E296V/K337A, L305V/V158D/K337A/M298Q, L305V/V158D/E296V/K337A, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A, S314E/K316H, S314E/K316Q, S314E/L305V, S314E/K337A, S314E/V158D, S314E/E296V, S314E/M298Q, S314E/V158T, K316H/L305V, K316H/K337A, K316H/V158D, K316H/E296V, K316H/M298Q, K316H/V158T, K316Q/L305V, K316Q/K337A, K316Q/V158D, K316Q/E296V, K316Q/M298Q, K316Q/V158T, S314E/L305V/K337A, S314E/L305V/V158D, S314E/L305V/E296V, S314E/L305V/M298Q, S314E/L305V/V158T, S314E/L305V/K337A/V158T, S314E/L305V/K337A/M298Q, S314E/L305V/K337A/E296V, S314E/L305V/K337A/V158D, S314E/L305V/V158D/M298Q, S314E/L305V/V158D/E296V, S314E/L305V/V158T/M298Q, S314E/L305V/V158T/E296V, S314E/L305V/E296V/M298Q, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A, K316H/L305V/K337A, K316H/L305V/V158D, K316H/L305V/E296V, K316H/L305V/M298Q, K316H/L305V/V158T, K316H/L305V/K337A/V158T, K316H/L305V/K337A/M298Q, K316H/L305V/K337A/E296V, K316H/L305V/K337A/V158D, K316H/L305V/V158D/M298Q, K316H/L305V/V158D/E296V, K316H/L305V/V158T/M298Q, K316H/L305V/V158T/E296V, K316H/L305V/E296V/M298Q, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A, K316Q/L305V/K337A, K316Q/L305V/V158D, K316Q/L305V/E296V, K316Q/L305V/M298Q, K316Q/L305V/V158T, K316Q/L305V/K337A/V158T, K316Q/L305V/K337A/M298Q, K316Q/L305V/K337A/E296V, K316Q/L305V/K337A/V158D, K316Q/L305V/V158D/M298Q, K316Q/L305V/V158D/E296V, K316Q/L305V/V158T/M298Q, K316Q/L305V/V158T/E296V, K316Q/L305V/E296V/M298Q, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A, F374Y/K337A, F374Y/V158D, F374Y/E296V, F374Y/M298Q, F374Y/V158T, F374Y/S314E, F374Y/L305V, F374Y/L305V/K337A, F374Y/L305V/V158D, F374Y/L305V/E296V, F374Y/L305V/M298Q, F374Y/L305V/V158T, F374Y/L305V/S314E, F374Y/K337A/S314E, F374Y/K337A/V158T, F374Y/K337A/M298Q, F374Y/K337A/E296V, F374Y/K337A/V158D, F374Y/V158D/S314E, F374Y/V158D/M298Q, F374Y/V158D/E296V, F374Y/V158T/S314E, F374Y/V158T/M298Q, F374Y/V158T/E296V, F374Y/E296V/S314E, F374Y/S314E/M298Q, F374Y/E296V/M298Q, F374Y/L305V/K337A/V158D, F374Y/L305V/K337A/E296V, F374Y/L305V/K337A/M298Q, F374Y/L305V/K337A/V158T, F374Y/L305V/K337A/S314E, F374Y/L305V/V158D/E296V, F374Y/L305V/V158D/M298Q, F374Y/L305V/V158D/S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q, F374Y/L305V/E296V/V158T, F374Y/L305V/E296V/S314E, F374Y/L305V/M298Q/V158T, F374Y/L305V/M298Q/S314E, F374Y/L305V/V158T/S314E, F374Y/K337A/S314E/V158T, F374Y/K337A/S314E/M298Q, F374Y/K337A/S314E/E296V, F374Y/K337A/S314E/V158D, F374Y/K337A/V158T/M298Q, F374Y/K337A/V158T/E296V, F374Y/K337A/M298Q/E296V, F374Y/K337A/M298Q/V158D, F374Y/K337A/E296V/V158D, F374Y/V158D/S314E/M298Q, F374Y/V158D/S314E/E296V, F374Y/V158D/M298Q/E296V, F374Y/V158T/S314E/E296V, F374Y/V158T/S314E/M298Q, F374Y/V158T/M298Q/E296V, F374Y/E296V/S314E/M298Q, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E, S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; R152E-Factor VII, S344A-Factor VII, および P11Q/K33E, T106N, K143N/N145T, V253N, R290N/A292T, G291N, R315N/V317T, K143N/N145T/R315N/V317T; および、233Thrから240Asnまでのアミノ酸配列において置換、付加、または欠失を有するFVII、304Argから329Cysまでのアミノ酸配列において置換、付加、または欠失を有するFVII。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドのタンパク質分解活性および野生型第VIIa因子のタンパク質分解活性の比は、ここで述べたアッセイ1で試験した場合、少なくとも約1.25である。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドのタンパク質分解活性および野生型第VIIa因子のタンパク質分解活性の比は、ここで述べたアッセイ1で試験した場合、少なくとも約4.0のように少なくとも約2.0である。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドのタンパク質分解活性および野生型第VIIa因子のタンパク質分解活性の比は、ここで述べたアッセイ2で試験した場合、少なくとも約1.25である。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドのタンパク質分解活性および野生型第VIIa因子のタンパク質分解活性の比は、ここで述べたアッセイ2で試験した場合、少なくとも約4.0のように少なくとも約2.0である。
ここで用いられる場合、「野生型ヒトFVIIa」は、米国特許第4,784,950号（図1）において開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
ここで用いられる場合、「第VII因子プリペプチド」または「FVIIポリペプチド」という用語は、天然のヒト第VII因子（配列番号1）またはその変種のアミノ酸配列1〜406を含むタンパク質を意味する。限定するものではないが、これはヒト第VII因子、ヒト第VIIa因子、およびその変種を含む。これは、組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して、実質的に同じまたは増大したタンパク質分解活性を示す第VII因子の変種、ならびに第VII因子誘導体および第VII因子抱合体を含む。「第VII因子」という用語は、切断されていない（チモーゲン）形態の、ならびにそれぞれの生理活性形を得るためにタンパク分解性に加工された第VII因子ポリペプチドを包含することを意図しており、それらは第VIIa因子と表されてよい。典型的に、第VII因子は第VIIa因子を生成するために残基152および153の間で切断される。このような第VII因子の変種は、ヒト第VII因子と比較して、安定性、リン脂質結合性、変化した特異的活性等を含む異なる性質を示してよい。
「脂質膜結合性ドメイン」は、この文脈においては、細胞膜脂質ドメインに結合するタンパク質ドメインである。「脂質膜結合性ドメイン」は、典型的に、ガンマ-カルボキシグルタミン酸残基を含み、通常は第VII、IX、およびX因子；タンパク質C、タンパク質S；オステオカルシン、マトリックスGlaタンパク質、およびプロリンに富むGlaタンパク質1のようなビタミンK依存性タンパク質から誘導される。他の脂質膜結合性ドメインは、米国特許第5,225,537号において開示されており、この米国特許を本明細書の一部として援用する。
「N-末端Gla-ドメイン」または単に「Gla-ドメイン」という用語は、具体的には、配列番号1で明らかにした第VII因子のアミノ酸配列1〜37を意味する。
3文字表示の「Gla」は、4-カルボキシグルタミン酸（ガンマ-カルボキシグルタミン酸）を意味する。
「第VII因子誘導体」という用語は、ここで用いられる場合、野生型第VII因子と比較して実質的に同じまたは改善された生物学的活性を示すFVIIポリペプチドを意味するように意図されており、親ペプチドの1以上のアミノ酸は、例えばアルキル化、グリコシル化、PEG化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成等のように、遺伝的におよび／または化学的におよび／または酵素的に修飾されている。限定するものではないが、これにはPEG化ヒト第VIIa因子、システイン-PEG化ヒト第VIIa因子、およびそれらの変種が含まれる。第VII因子誘導体の非限定的な例には、WO 03/31464 ならびに米国特許出願 US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557, および US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.)において開示されたグリコPEG化FVII誘導体; WO 01/04287, 米国特許出願20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) および WO 02/02764, 米国特許出願20030211094 (ミネソタ大学)において開示されたFVII抱合体が含まれる。
「PEG化ヒト第VIIa因子」という用語は、第VIIa因子ポリペプチドに結合したPEG分子を有するヒト第VIIa因子を意味する。PEG分子は、第VIIa因子ポリペプチドのアミノ酸残基または糖部分を含む、第VIIa因子ポリペプチドの任意の部分に付着してよいということが理解される。「システイン-PEG化ヒト第VIIa因子」という用語は、ヒト第VIIa因子において誘導されたシステインのスルフヒドリル基に結合したPEG分子を有する第VIIa因子を意味する。
血液凝固における第VIIa因子の生物学的活性は、(i)組織因子(TF)に結合する能力、および(ii)活性化された第IX因子または第X因子（それぞれ第IXa因子または第Xa因子）を生成するために、第IX因子または第X因子のタンパク質分解性の切断を触媒する能力に由来する。本発明の目的のために、第VIIa因子の生物学的活性は、例えば米国特許第5,997,864号において述べられているように、第VII因子-欠乏性血漿およびトロンボプラスチンを用いて、血液凝固を促進するための製剤の能力を測定することにより定量されてもよい。この分析において、生物学的活性は対照試料と比較した凝固時間の減少として表され、1単位/mlの第VII因子活性を含むプールヒト血清標準物質と比較することにより「第VII因子単位」に変換される。あるいは、第VIIa因子の生物学的活性は、(i)脂質膜中に包埋されたTFおよび第X因子を含む系において、第Xa因子を生成するための第VIIa因子の能力を測定すること(Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997);(ii)水系中の第X因子加水分解を測定すること；(iii)表面プラスモン共鳴に基づいた装置を用いてTFに対する物理的結合を測定すること(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997)、および(iv)合成基質の加水分解を測定することにより定量されてもよい。
あるいは、第VIIa因子の生物学的活性は、Perssonら, PNAS 98, 13583-13588, 2001において述べられているように、血小板上でのトロンビンの産生により定量されてもよい。
「組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して実質的に同じまたは増大したタンパク質分解活性」という用語は、ここで使われる場合、ここで述べたように1以上の凝固試験、またはタンパク質分解試験を用いて試験したときに、組み換え野生型ヒト第VIIa因子の活性の50％より高い活性を意味する。1つの実施形態において、その活性は組み換え野生型ヒト第VIIa因子の活性の80％より高い。もう1つの実施形態において、その活性は組み換え野生型ヒト第VIIa因子の活性の90％より高い。さらなる実施形態において、その活性は組み換え野生型ヒト第VIIa因子の活性の100％より高い。さらなる実施形態において、その活性は組み換え野生型ヒト第VIIa因子の活性の120％より高い。さらなる実施形態において、その活性は組み換え野生型ヒト第VIIa因子の活性の200％より高い。さらなる実施形態において、その活性は組み換え野生型ヒト第VIIa因子の活性の400％より高い。
第VII因子の変種には、組み換えヒト第VIIa因子と比較して、タンパク質分解活性が実質的に同等であろうと増大していようと、限定するものではないが、1以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換により、野生型第VII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
「変種」という用語は、ここで用いられる場合、野生型ヒトFVIIの配列を有する第VII因子を示すことが意図されており、ここでは親タンパク質の1以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、および／または親タンパク質の1以上のアミノ酸が欠失し、および／または1以上のアミノ酸がタンパク質中に挿入され、および／または1以上のアミノ酸が親タンパク質に付加されている。このような付加は、親タンパク質のN-末端の終わりもしくはC-末端の終わり、または両方で起こり得る。この定義に含まれる「変種」も、その活性化型においてFVII活性を有する。1つの実施形態において、FVIIポリペプチド変種は、天然ヒト第VII因子（配列番号1）のアミノ酸配列91〜368を少なくとも含む。
1つの実施形態において、変種は、野生型ヒトFVIIの配列と70％の同一性を持つ。1つの実施形態において、変種は、野生型ヒトFVIIの配列と80％の同一性を持つ。もう1つの実施形態において、変種は、野生型ヒトFVIIの配列と90％の同一性を持つ。さらなる実施形態において、変種は、野生型ヒトFVIIの配列と95％の同一性を持つ。
組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して、実質的に同じまたは増大したタンパク質分解活性を有する第VII因子の変種の非限定的な例には、S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Iino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998);米国特許第5,580,560号において開示されている、増大したタンパク質分解の安定性を示すFVIIaの変種；残基290および291の間、または残基315および316の間でタンパク分解的に切断された第VIIa因子(Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995);第VIIa因子の酸化型(Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); PCT/DK02/00189において開示されたようなFVIIの変種; および WO 02/38162 (Scripps 研究所)において開示されたように、増大したタンパク質分解安定性を示すFVIIの変種; ならびに WO 01/58935 (Maxygen ApS) および WO 04/029091 (Maxygen ApS)において開示されたようなFVIIの変種が含まれる。
組み換え野生型ヒト第VIIa因子と比較して、実質的に同じまたは増大したタンパク質分解活性を有する第VII因子の変種の非限定的な例には、S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998);米国特許第5,580,560号において開示された、増大したタンパク質分解の安定性を示すFVIIaの変種;残基290および291の間、または残基315および316の間でタンパク質分解性に切断された第VIIa因子(Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995);第VIIa因子の酸化型 (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); PCT/DK02/00189 (WO 02/077218に対応)に開示されたようなFVIIの変種; およびWO 02/38162 (Scripps研究所)において開示されたように、増大したタンパク分解の安定性を示すFVIIの変種; WO 99/20767, 米国特許 US 6017882 および US 6747003, 米国特許出願 20030100506 (ミネソタ大学) および WO 00/66753, 米国特許出願 US 20010018414, US 2004220106, および US 200131005, 米国特許 US 6762286 および US 6693075 (ミネソタ大学)において開示されたように、修飾されたGla-ドメインを有し、増強された膜結合性を示すFVIIの変種; WO 01/58935, 米国特許 US 6806063, 米国特許出願 20030096338 (Maxygen ApS), WO 03/93465 (Maxygen ApS), WO 04/029091 (Maxygen ApS), WO 04/083361 (Maxygen ApS), および WO 04/111242 (Maxygen ApS), ならびに WO 04/108763 （カナディアンブラッドサービス(Canadian Blood Services)）において開示されたようなFVIIの変種が含まれる。
野生型FVIIaと比較して増大した生物学的活性を有するFVIIの変種の非限定的な例には、WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635 ( WO 03/027147に対応), デンマーク特許出願PA 2002 01423 (WO 04/029090に対応), デンマーク特許出願 PA 2001 01627 ( WO 03/027147対応); WO 02/38162 (Scripps 研究所)において開示されたようなFVIIの変種；およびJP 2001061479 (Chemo-Sero-治療研究所)において開示されたように、増強された活性を有するFVIIaの変種が含まれる。
第VII因子の変種の非限定的な例には、L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, and S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII, K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII, F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-Factor VII, S60A-Factor VII; R152E-Factor VII, S344A-Factor VII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G291N-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/V317T-FVII;および233Thrから240Asnまでのアミノ酸配列において置換、付加、または欠失を有するFVII；304Argから329Cysまでのアミノ酸配列において置換、付加、または欠失を有するFVII；153Ileから223Argまでのアミノ酸配列において置換、付加、または欠失を有するFVIIが含まれる。
アミノ酸の置換に対して使われる用語は以下の通りである。最初の文字は、ヒト野生型FVIIのある位置に天然に存在するアミノ酸を表す。次に続く番号は、ヒト野生型FVIIにおける位置を表す。2番目の文字は、天然のアミノ酸を置換する（交換する）、異なるアミノ酸を表す。1つの例はM298Qであり、これは、ヒト野生型FVIIの298位のメチオニンがグルタミンによって置換されている。もう1つの例において、V158T/M298Qは、ヒト野生型FVIIの158位におけるバリンがチロシンによって置換されており、同じ第VII因子ポリペプチドにおいて、ヒト野生型FVIIの298位におけるメチオニンがグルタミンによって置換されている。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、少なくとも約1.25である。1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、少なくとも約2.0である。さらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、少なくとも約4.0である。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、第VIIa因子活性試験法で試験した場合に、少なくとも約1.25である。1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、第VIIa因子活性試験で試験した場合に、少なくとも約2.0である。さらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、第VIIa因子活性試験で試験した場合に、少なくとも約4.0である。第VIIa因子の活性は、以下の「試験法」で述べる試験法により測定されてよい。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、「インビトロ加水分解試験法」で試験した場合、少なくとも約1.25である。1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、「インビトロ加水分解試験法」で試験した場合、少なくとも約2.0である。さらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、「インビトロ加水分解試験法」で試験した場合、少なくとも約4.0である。
本発明のさらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドはポリペプチドであり、ここでの第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、「インビトロタンパク質分解試験法」で試験した場合、少なくとも約1.25である。1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、「インビトロタンパク質分解試験法」で試験した場合、少なくとも約2.0である。さらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、「インビトロタンパク質分解試験法」で試験した場合、少なくとも約4.0である。さらなる実施形態において、第VII因子ポリペプチドの活性および野生型ヒト第VIIa因子の活性の比は、「インビトロタンパク質分解試験法」で試験した場合、少なくとも約8.0である。
本発明は、野生型ヒト第VIIa因子と比較して増大した活性を有する第VII/VIIa因子の変種に適している。増大した活性を有する第VII/VIIa因子の変種は、以下で述べる適切な試験法で試験することにより見出され得る。これらの試験法は簡便な予備のインビトロ試験として行われ得る。それ故、「試験法」の節では、本発明の第VIIa因子の変種の活性に対する簡便な試験（「インビトロ加水分解試験法」と標題をつけた）を開示する。それらに基づいて、特別な関心のある第VIIa因子の変種は、「インビトロ加水分解試験法」で試験した場合、その変種の活性および野生型ヒト第VII因子の活性の比が1.0以上、例えば少なくとも約1.25、好ましくは少なくとも約2.0、少なくとも約3.0のように、または、さらに好ましくは、少なくとも約4.0であるような変種である。
この変種の活性は、第X因子のような生理学的基質（「インビトロタンパク質分解試験法」）（以下の「試験法」を参照）を、100〜1000nMの適切な濃度で用いて測定することも可能であり、生成した第Xa因子は、適切な色素生産性基質(例えば S-2765)の添加後に測定される。加えて、活性試験法は生物学的温度で行われてよい。
トロンビンを生成するための第VIIa因子の変種の能力は、生物学的な濃度の関連する全ての凝固因子および阻害物質(擬態血友病Aの状態の場合、マイナス第VIII因子)、ならびに活性化された血小板を含む試験法で試験することもできる(本明細書の一部として採用される Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547のp.153で述べられているように)。
当該分野において知られているような「同一性」という用語は、配列を比較することにより決定される場合、2以上のポリペプチド分子または2以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当該分野において、「同一性」は、2以上のヌクレオチド残基列または2以上のアミノ酸残基列の間の一致の数により決定される場合には、核酸分子間またはポリペプチド間の配列の関連性の程度も意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち「アルゴリズム」）により処理された、ギャップアラインメント（もしあるなら）での、より小さい2以上の配列間の一致のパーセントを評価する。
「類似」という用語は関連した概念であるが、「同一性」と対照的に、同一性の一致および保存的置換の一致の両方を含む配列の関係を示す。2つのポリペプチド配列が、例えば、10/20の同一のアミノ酸を有し、残りが全て非保存的置換である場合、同一性および類似性のパーセントは共に50％である。同じ例において、保存的置換の位置がさらに5ある場合、同一性のパーセントは50％のままであるが、類似性のパーセントは75％になる（15/20）。それ故、保存的置換がある場合、2つのポリペプチド間の類似性の程度は、それら2つのポリペプチド間の同一性のパーセントよりも高くなるであろう。
「単離されたポリペプチド」という用語は、本発明のポリペプチドであって、(1)自然界において付随しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質（すなわち混入物）の少なくとも50％から分離されているか、(2)「単離されたポリペプチド」が本来結合するポリペプチドの全てまたはある部分に共有結合的に結合していないか、(3)本来共有結合的に結合しないポリペプチドに、動作可能に共有結合的に結合しているか、または(4)自然界には生じないポリペプチドを示す。好ましくは、単離されたポリペプチドは、実質的に、治療的、診断的、予防的または研究的な使用を妨げるような、天然環境中で見られる他の混入ポリペプチドまたは他の混入物を含まない。
野生型ヒトFVIIのアミノ酸配列に対する保存的修飾（およびコード化するヌクレオチドに対応する修飾）は、天然に存在するFVIIポリペプチドと同様の機能的および化学的特徴を有するFVIIポリペプチドを生じるであろう。対照的に、FVIIポリペプチドの機能的および／または化学的特徴における実質的な修飾は、(a) 例えばシート状またはらせん状構造のように、置換の領域における分子主鎖の構造の維持、(b)標的位置における分子の電荷または疎水性の維持、または(c)側鎖のかさ高さの維持に対する効果が有意に異なる、野生型ヒトFVIIのアミノ酸配列における置換を選択することによりなされてよい。
例えば、「保存的なアミノ酸置換」には、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたは全く影響がないような本来のものとは異なる残基での、天然のアミノ酸残基の置換が含まれてよい。さらに、ポリペプチド中の任意の天然残基は、前に「アラニン走査突然変異誘発」の目的で記述されているように、アラニンによって置換されてもよい（例えば、アラニン走査突然変異誘発について議論しているMacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35:1-24を参照されたい)。
関連したポリペプチドの同一性および類似性は、既知の方法により容易に判断され得る。そのような方法には、限定するものではないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; および Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)において述べられているものが含まれる。
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最大の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムに説明されている。2つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラムによる方法には、限定するものではないが、GCG プログラムパッケージが含まれ、これにはGAP(Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, および FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))が含まれる。 BLASTX プログラムは、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)および他の出所(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra)から公的に入手可能である。 周知のスミス ウォーターマン(Smith Waterman)アルゴリズムもまた、同一性を決定するために用いられてよい。
2つのアミノ酸配列を整列させるためのあるアラインメントスキームは、2つの配列の短い領域のみの一致を結果として生じてもよく、この小さな整列領域は、例え2つの全長配列間に有意な関係がなくても非常に高い配列同一性を有する可能性がある。従って、好ましい実施形態において、選択アラインメント法(GAPプログラム)は、標的ポリペプチドの少なくとも50の隣接するアミノ酸に及ぶアラインメントを結果として生じ得る。
例えば、コンピューターアルゴリズムGAP (遺伝学コンピューターグループ, ウィスコンシン大学, マディソン, ウィスコンシン州)を用いると、パーセント配列同一性を決定する2つのポリペプチドは、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な一致（アルゴリズムにより決定されるように「全範囲の一致」）のために整列される。ギャップ開始ペナルティー（平均ダイアゴナルの3倍として評価され；「平均ダイアゴナル」は使われる比較マトリックスのダイアゴナルの平均であり；「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリックスによるそれぞれの完全なアミノ酸の一致に割り当てられるスコアまたは番号である）、およびギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの1/10倍である）、ならびにPAM 250 またはBLOSUM 62のような比較マトリックスがアルゴリズムと組み合わせて使われる。標準比較マトリックス(Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978) for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) for the BLOSUM 62 comparison matrixを参照)は、アルゴリズムによっても用いられる。
ペプチド配列比較のための好ましいパラメータは以下を含む：アルゴリズム： Needleman et al, J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970); 比較マトリックス: Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992)からのBLOSUM 62 ; ギャップペナルティ: 12, ギャップ伸長ペナルティ: 4, 類似性の閾値: 0
GAPプログラムは、上記パラメータと共に役立つ。上述のパラメータはGAPアルゴリズムを用いたポリペプチド比較（末端ギャップのペナルティなしで）のための省略時パラメータである。
核酸分子配列の比較のための好ましいパラメータは、以下を含む： Needleman et al., J. Mol Biol., 48:443-453 (1970); 比較マトリックス: 整合=+10, 不整合=0, ギャップペナルティ: 50, ギャップ伸長ペナルティ: 3
GAPプログラムは、上記パラメータと共に役立つ。前述のパラメータは核酸分子の比較のための省略時パラメータである。
プログラムマニュアル, ウィスコンシンパッケージ, バージョン 9, 9月, 1997において発表されているものを含む、他の代表的なアルゴリズム、ギャップ開始ペナルティ、ギャップ伸長ペナルティ、比較マトリックス、類似性の閾値等が用いられてもよい。なされるべき特別な選択は、当業者にとって明らかであってよく、DNAとDNA、タンパク質とタンパク質、タンパク質とDNAのように、なされるべき特別な比較に依存してもよく；付加的に、その比較は、与えられた配列対の間（この場合、GAP または BestFitが一般的に好ましい）であっても、または1つの配列と大きな配列データベースの間（この場合、FASTA または BLASTAが好ましい）であってもよい。
野生型第VII因子に関する、実質的に修飾された生物学的活性を有する第VII因子の変種には、限定するものではないが、TF-非依存性第X因子タンパク質分解活性を示す第VII因子の変種が含まれる。
上記で述べたように、本発明はさらに、被験者における出血エピソードの治療または正常な止血系の増強のための方法であって、それらを必要とする被験者に、治療的または予防的に有効な量の第VII因子ポリペプチドを含有する組成物を投与することを含む方法に関する。
その被験者は、同じ出血または一連の出血に対して治療されると理解されるべきである。
「正常な止血系の増強」という用語は、トロンビンを生成する能力の増強を意味する。
ここで使われる場合、「出血障害」という用語は、出血において現れる細胞または分子起源の先天性の、後天性の、または誘発された欠陥を示す。それらの例は、凝固因子欠乏症（例えば、血友病AおよびB、または凝固因子XIまたはVIIの欠損）、凝固因子阻害物質、不完全な血小板機能、血小板減少症、またはウォンウィルブランド病である。
「出血エピソード」という用語は、手術および他の形態の組織障害の両方と関連して主要な問題である、制御されないおよび過剰な出血を含むことを意味する。制御されないおよび過剰な出血は、正常な凝固系を有する患者、および凝固または出血障害を有する患者において起こり得る。凝固因子欠乏症（血友病AおよびB、凝固因子XIまたはVIIの欠乏）または凝固因子阻害物質は、出血障害の原因であり得る。過剰な出血は、正常に機能する血液凝固カスケードを有する患者（凝固因子の欠乏または凝固因子のいずれに対する阻害物質もない）においても起こり、不完全な血小板機能、血小板減少症、またはウォンウィルブランド病により引き起こされ得る。このような場合において、止血系は、血友病における場合のように、主要な出血を引き起こす重要な凝固「化合物」（血小板またはウォンウィルブランド因子タンパク質のようなもの）を欠いているか、または異常な凝固「化合物」を持っているので、出血は、血友病により引き起こされた出血に関連するものであり得る。手術または広範な外傷に伴う過度の組織障害を経験する被験者においては、正常な止血機構も、即時の止血の要求には間に合わない可能性があり、正常な止血機構にもかかわらず、それらは出血を発展させる可能性がある。出血が、外科的な止血に対する可能性が限られる脳、内耳領域、および目のような臓器において生じる場合は、満足のいく止血を達成することもまた難しい問題である。同様の問題が種々の臓器（肝臓、肺、腫瘍組織、消化管）から生検を摂取する過程、ならびに腹腔鏡手術において生じ得る。これら全ての場合の共通点は、出血が拡大した場合（出血性胃炎および子宮のおびただしい出血）についても言えることであるが、外科的技術（縫合、クリップなど）によって止血を提供することの難しさである。急性の、およびおびただしい出血は、治療を受けることにより不完全な止血が誘発されている、抗凝血治療を受けている被験者においても起こり得る。そのような被験者は、抗凝血効果に迅速に対抗しなければならない場合、外科的処置をする必要がある可能性がある。恥骨後方の根治的前立腺切除は、一般的に局在性の前立腺癌を有する被験者に対して行われる方法である。その手術は、著しい、および時に大量の血液損失によりしばしば複雑になる。前立腺切除の際の著しい血液の損失は、主に、外科的止血のために容易にアクセスできない種々の高密度に血管新生した部位を伴う複雑な解剖学的側面に関係があり、その結果として広い範囲からの拡散した出血を生じ得る。不十分な止血の場合において問題を引き起こし得るもう1つの状況は、正常な止血機構を有する被験者が、血栓塞栓性疾患を防ぐために抗凝血治療をなされたときである。そのような治療には、ヘパリン、プロテオグリカンの他の形態、ワルファリン、またはビタミンKアンタゴニストの他の形態、ならびにアスピリンおよび他の血小板凝集阻害剤が含まれる可能性がある。
本発明の1つの実施形態において、出血は血友病に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は獲得した阻害物質を伴う血友病に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は血小板減少症に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血はウォンウィルブランド病に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は重篤な組織傷害に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は重篤な外傷に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は手術に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は腹腔鏡手術に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は出血性胃炎に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は子宮のおびただしい出血に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は機械的な止血に対する可能性が限られている臓器において生じる。もう1つの実施形態において、出血は、脳、内耳部分、または目で生じるものである。もう1つの実施形態において、出血は生検を摂取する過程に付随したものである。もう1つの実施形態において、出血は抗凝血治療に付随したものである。
ここで用いられる「被験者」という用語は、動物、特にヒトのような哺乳類を意味し、適切な場合は「患者」という用語と互換的に使用できることが意図されている。
本明細書および特許請求の範囲において、「アミノ酸」という用語は、式COOH-CR-NH3を有する分子を意味し、すなわちこの用語は、自然発生のおよび自然発生でないL-およびD-アミノ酸の両方の範囲を含む用語である。ほとんどの場合には、ここで論じられるアミノ酸操作には、自然界に存在するL-アミノ酸の使用が含まれてよい：
Figure 2007522805
 ここで述べられている第VII因子は、組み換え核酸技術により生成されてよい。一般的に、クローン化された野生型第VII因子核酸配列は、望ましいタンパク質をコード化するために修飾される。この修飾された配列は、その後、発現ベクターに挿入され、順番に宿主細胞中に形質転換または形質移入される。1つの実施形態において、より高等な真核生物の細胞、特に培養された哺乳類の細胞が宿主細胞として用いられる。ヒト第VII因子に対する完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、既知である( 組み換えヒト第VII因子のクローニングおよび発現について述べられているU.S. 4,784,950を参照されたい)。ウシ第VII因子の配列は、Takeya et al., J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988)において述べられている。
アミノ酸配列の変化は、種々の技術により達成されてよい。核酸配列の修飾は、部位特異的な突然変異誘発によってなされてよい。部位特異的な突然変異誘発のための技術は、当該分野において周知であり、例えばZoller および Smith (DNA 3:479-488, 1984) または 「伸長重複によるスプライシング」, Horton et al., Gene 77, 1989, pp. 61-68において述べられている。それ故、第VII因子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を用いることは、選択の変化を導き得る。同様に、特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いてDNA構築物を調製するための方法は、当業者にとって周知である(PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USAを参照されたい)。
本発明の第VII因子ポリペプチドをコード化する核酸構築物は、適切なゲノムまたはcDNA由来であってよく、例えばゲノムのまたはcDNAライブラリを調製することにより、および標準技術に従った合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによって、ポリヌクレオチドの全てまたは一部をコード化するDNA配列をスクリーニングすることにより得られる(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照されたい)。
第VII因子ポリペプチドをコード化する核酸構築物は、確立された標準方法により合成的に調製されてもよく、例えばBeaucage および Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869により述べられているホスホアミド法、または Matthesら, EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805により述べられている方法である。 ホスホアミド法に従うと、例えば自動DNA合成機でオリゴヌクレオチドが合成され、精製され、アニールされ、ライゲートされ、適切なベクター中においてクローン化される。
さらに核酸構築物は、標準技術に従って、合成、ゲノム、またはcDNA由来の断片をライゲートすることにより調製される合成およびゲノム由来の混合、合成およびcDNA由来の混合、ゲノムおよびcDNA由来の混合であってよく（適切な場合）、その断片は核酸構築物全体のさまざまな部分に対応する。
前記核酸構築物は、好ましくはDNA構築物である。本発明による第VII因子ポリペプチドの生成において用いるDNA配列は、適切な翻訳後のプロセシング（例えば、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化）および宿主細胞からの分泌を得るために、典型的には、第VII因子のアミノ-末端でプレプロポリペプチドをコード化する。このプレプロポリペプチドは、第VII因子の、または第IX因子、第X因子、プロトロンビン、タンパク質C、またはタンパク質Sのような他のビタミンK依存性血漿タンパク質のものであってよい。当業者によって理解されるように、付加的な修飾は、これらの修飾が凝血薬として作用するためのタンパク質の能力を著しく損ねないような第VII因子ポリペプチドのアミノ酸配列においてなされ得る。例えば、一般的に米国特許第5,288,629号において述べられているように、第VII因子ポリペプチドは、チモーゲン第VII因子がその活性化された二本鎖の形態に変換されるのを阻止するために、活性化切断部位において修飾されてもよい。
第VIIa因子の変種の発現において用いられる発現ベクターは、クローン化遺伝子またはcDNAの転写を指令する能力があるプロモーターを含んでよい。培養された哺乳類の細胞において用いられる好ましいプロモーターには、ウイルス性プロモーターおよび細胞性プロモーターが含まれる。ウイルス性プロモーターにはSV40プロモーター(Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864, 1981)およびCMVプロモーター(Boshart et al., Cell 41:521-530, 1985)が含まれる。特に好ましいウイルス性プロモーターは、アデノウイルス2由来の主要な遅延型プロモーターである(Kaufman および Sharp, Mol. Cell. Biol. 2:1304-1319, 1982)。細胞性プロモーターには、マウスカッパ遺伝子プロモーター(Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045, 1983)およびマウスVHプロモーター(Lohら, Cell 33:85-93, 1983)が含まれる。特に好ましい細胞性プロモーターは、マウスメタロチオネイン-1プロモーターである(Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983)。発現ベクターは、プロモーターから下流で且つ第VII因子配列自体の挿入部位から上流に位置する、一組のRNAスプライス部位を含んでもよい。好ましいRNAスプライス部位は、アデノウイルスおよび／またはイムノグロブリン遺伝子から得られてよい。また、挿入部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルも発現ベクター中に含まれる。特に好ましいポリアデニル化シグナルには、SV40由来の早いまたは遅延型のポリアデニル化シグナル(Kaufman および Sharp, 同書)、アデノウイルス5 Elb領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター (DeNoto et al. Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981)、またはヒト第VII因子遺伝子もしくはウシ第VII因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナルが含まれる。発現ベクターには、プロモーターおよびRNAスプライス部位の間に位置する、3つに分かれたアデノウイルス2リーダーのような非翻訳のウイルス性リーダー配列；ならびにSV40エンハンサーのようなエンハンサー配列が含まれてもよい。
クローン化DNA配列は、例えばリン酸カルシウムを介したトランスフェクション(Wigler et al., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973)またはエレクトロポレーション(Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982)により、培養された哺乳類の細胞に導入される。外因性のDNAを発現する細胞を同定および選択するために、選択を可能にする表現型（選択可能なマーカー）を与える遺伝子が、一般的に関心のある遺伝子またはcDNAと共に細胞に導入される。好ましい選択可能なマーカーには、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートのような薬剤に対する抵抗性を与える遺伝子が含まれる。選択可能なマーカーは、増幅可能である選択可能なマーカーであってよい。好ましい増幅可能である選択可能なマーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)配列である。選択可能なマーカーは、Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, 本明細書の一部として採用されている)により概説されている。当業者は、適切な選択可能マーカーを容易に選択することができるであろう。
選択可能なマーカーは、個々のプラスミド上の細胞に、関心のある遺伝子と同時に導入されてもよく、またはそれらは同じプラスミド上に導入されてもよい。同じプラスミド上で、選択可能なマーカーおよび関心のある遺伝子が異なるプロモーターまたは同じプロモータの制御下にあってよい場合、後者の配列は2つのシストロンのメッセージを生成する。この型の構築物は、当該分野において既知である（例えば、Levinson および Simonsen, 米国特許第4,713,339号)。「担体DNA」として知られる付加的なDNAを細胞に導入される混合物に加えることは都合がよいという可能性もある。細胞がDNAを取り込んだ後、それらは適切な培養培地において、典型的には1〜2日間、関心のある遺伝子を発現させるために培養する。細胞を培養するために用いられる培地は、適切な補充を含む最小または複合培地のように、宿主細胞を培養するのに適した通常の培地であってよい。適切な培地は、商業的供給者から入手可能であり、公開された配合（例えば、アメリカンタイプ培養コレクション）に従って調製されてもよい。培地は当該分野において既知の方法を用いて調製される(例えば、references for bacteria and yeast; Bennett, J.W. and LaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991を参照)。培養培地には、一般的に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質、および増殖因子が含まれる。ガンマ-カルボキシル化された第VII因子ポリペプチドの生成のために、培地には、ビタミンKが好ましくは約0.1 mg/ml から 約 5 mg/mlの濃度で含まれてよい。薬物選択は、その後、安定に、選択可能なマーカーを発現している細胞の増殖を選択するために適用される。増幅可能である選択可能なマーカーを形質移入した細胞について、増加したコピー数のクローン化配列を選択するために薬物濃度を増加し、それによって、発現レベルを増加させてよい。安定的に形質移入された細胞のクローンは、その後、望ましい第VII因子ポリペプチドの発現のためにスクリーニングされる。
好ましい哺乳類細胞株には、CHO (ATCC CCL 61)、COS-1 (ATCC CRL 1650)、ハムスター幼児腎臓(BHK)、およびHEK293 (例えば、 ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)細胞株が含まれる。好ましいBHK細胞株は、tk- ts13 BHK 細胞株 (Waechter および Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982)であり、以下でBHK570細胞として言及している。BHK 570 細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能であり、12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, ATCC承認番号 がCRL 10314未満である。tk- ts13 BHK 細胞株も承認番号CRL1632未満で、ATCCから入手可能である。加えて、多数の他の細胞株が用いられてもよく、Rat Hep I (ラット肝細胞腫; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (ラット肝細胞腫; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), ヒトの肺 (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1)、および DUKX 細胞 (Urlaub および Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)が含まれる。
本発明の第VII因子ポリペプチドを合成するために、トランスジェニック動物技術を用いてよい。宿主の雌性の哺乳類の乳腺中でタンパク質が生成されることが好ましい。乳腺中での発現、およびそれに続く関心のあるタンパクの乳汁中への分泌は、他の原料からのタンパク質の分離において直面する多くの障害を克服する。乳汁は容易に収集でき、大量に利用でき、生物化学的によく特徴付けられている。さらに、主要な乳汁タンパク質は、乳汁中に高濃度で存在している（典型的に、約1〜15g/l）。
商業的な見地から、大量の乳汁を産生する種を宿主として用いることが好ましいことは明らかである。マウスおよびラットのようなより小さい動物が使用され得る一方で（原理段階の証明において好ましい）、限定するものではないが、ブタ、ヤギ、ヒツジ、およびウシを含む家畜哺乳類を用いることが好ましい。ヒツジは、この種における遺伝子組み換えの前歴、乳汁の収量、コスト、およびヒツジの乳汁を収集するための設備が実行可能に利用できることという因子により、特に好ましい（例えば、宿主の種の選択に影響を及ぼす因子の比較を目的としたWO88/00239を参照されたい）。イーストフリースラントシープ（East Friesland sheep）のように酪農用に飼育された宿主動物の種を選択すること、または後日の遺伝子組み換え系統の繁殖による酪農家畜を用いることが一般的に望ましい。いずれの場合にも、既知の動物は、よい健康状態のものが用いられるべきである。
乳腺中での発現を得るために、乳汁タンパク質遺伝子由来の転写プロモーターが用いられる。乳汁タンパク質遺伝子には、カゼイン（米国特許第5,304,489号参照）、ベータラクトグロブリン、ラクトアルブミン、および乳清酸性タンパク質をコード化する遺伝子が含まれる。前記ベータラクトグロブリン（BLG）プロモーターが好ましい。ヒツジのベータラクトグロブリン遺伝子の場合、5’フランキングプロモーターおよびベータラクトグロブリン遺伝子のコード化しない部分を包含する4.25kbp以下の DNAセグメントのように、5’フランキング配列のより大きい部分、約5kbpまでが好ましいが、その遺伝子の5’フランキング配列の少なくとも基部の406bpの領域が一般的に用いられる(Whitelaw et al., Biochem. J. 286: 31 39 (1992)を参照されたい)。他の種に由来するプロモーターDNAの同様の断片も適している。
ベータラクトグロブリン遺伝子の他の領域は、発現される遺伝子のゲノム領域として、構築物中に組み入れられてもよい。例えば、イントロンを欠いている構築物は、そのようなDNA配列を含有するものと比較して発現が不十分であるが、一般的には当該分野において容認される( Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836 840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478 482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1: 3 13 (1991); WO 89/01343; および WO 91/02318を参照されたい。これらはそれぞれ、本明細書の一部として援用されている)。この点について、可能であれば、タンパク質または関心のあるポリペプチドをコード化する遺伝子の天然のイントロンの全てまたは一部を含むゲノム配列を用いることが、一般的には好ましく、それ故、例えばベータラクトグロブリン遺伝子由来の少なくともいくつかのイントロンがさらに包含されることが好ましい。そのような領域の1つは、ヒツジのベータラクトグロブリン遺伝子の3’非翻訳の領域由来の、イントロンのスプライシングおよびRNAのポリアデニル化を提供するDNAセグメントである。遺伝子の天然の3’非翻訳配列に対して置換した場合、このヒツジのベータラクトグロブリンセグメントは、関心のあるタンパク質およびポリペプチドの発現レベルを増強し、安定化することができる。他の実施形態において、変種の第VII因子配列の開始ATGを囲む領域は、対応する乳汁の特異的なタンパク質遺伝子に由来する配列に置換される。このような置換は、発現を増強するための特異的な開始環境である推定上の組織を提供する。より小さい領域を置換してもよいが、変種第VII因子のプレプロおよび5’非翻訳配列の全体を、例えばBLG遺伝子のそれらで置換することは好都合である。
トランスジェニック動物中における第VII因子ポリペプチドの発現のために、第VII因子の変種をコード化するDNAセグメントは、発現ユニットを生成するために、発現に必要とされる付加的DNAセグメントに動作可能に結合している。このような付加的セグメントには、上記プロモーター、ならびにmRNAの転写およびポリアデニル化の終結を提供する配列が含まれる。発現ユニットにはさらに、修飾された第VII因子をコード化する配列に動作可能に結合している、分泌性シグナル配列をコード化するDNA配列が含まれてよい。この分泌性シグナル配列は、天然の第VII因子分泌シグナル配列でよく、または乳汁タンパク質のように、他のタンパク質のものでもよい（例えば本明細書の一部として採用されている、von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683 4690 (1986); および Meadeら, 米国特許第4,873,316号を参照されたい）。
発現ユニットは、基本的には核酸連結の任意の配列により構成されてよいが、トランスジェニック動物において使用される発現ユニットの構築は、変種の第VII因子配列を、付加的DNAセグメントを含むプラスミドまたはファージベクターに挿入することにより好都合に実行される。乳汁タンパク質をコード化するDNAセグメントを含むベクターを提供すること、および乳汁タンパク質に対するコード化配列を変種の第VII因子ポリペプチドのそれと置換することは特に都合がよく；それによって、乳汁タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合を生成する。いずれにしても、プラスミドまたは他のベクター中への発現ユニットのクローニングは、変種の第VII因子配列の増幅を促進する。増幅は、細菌性（例えば大腸菌）宿主細胞において都合よく実行され、それ故、ベクターには典型的に、細菌性の宿主細胞において機能する複製開始点および選択可能なマーカーが含まれてよい。発現ユニットはその後、選択した宿主種の受精卵（早期段階の胚を含む）に導入される。異種DNAの導入は、いくつかのルートのうちの1つにより達成することができ、マイクロインジェクション（例えば米国特許第4,873,191号）、レトロウイルス感染（Jaenisch, Science 240: 1468 1474 (1988))、または胚幹(ES)細胞を用いた部位特異的な組み込み(Bradley et al., Bio/Technology 10: 534 539 (1992)により概説されている)が含まれる。前記卵をその後、偽妊娠の雌の卵管または子宮に移植し、期日まで発育させた。生殖系列において導入されたDNAを保有する子孫は、その遺伝子を彼らの子孫に、通常のメンデルの様式で継承させることができ、それによりトランスジェニック家畜の発生を可能にする。トランスジェニック動物を作り出す一般的な方法は、当該分野において既知である(例えば、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6: 179 183 (1988); Wall et al., Biol. Repr
od. 32: 645 651 (1985); Buhler et al., Bio/Technology 8: 140 143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9: 835 838 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844 847 (1991); Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113 120 (1992); U.S. 4,873,191; U.S. 4,873,316; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; および GB 87/00458を参照されたい)。外来性のDNA配列を哺乳類およびそれらの生殖細胞に導入する技術は、最初にマウスにおいて発達した(例えば、Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380 7384 (1980); Gordon and Ruddle, Science 214: 1244 1246 (1981); Palmiter and Brinster, Cell 41: 343 345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438 4442 (1985); および Hogan et al. (ibid.)を参照されたい)。これらの技術は、引き続いて家畜種を含むより大きな動物に使われるように順応した(例えば、WO 88/00239, WO 90/05188, および WO 92/11757; ならびにSimons et al., Bio/Technology 6: 179 183 (1988)を参照されたい)。要約すると、トランスジェニックマウスまたは家畜の産生において現在まで用いられてきた最も効率的な経路において、関心のあるDNAの数百の直鎖状分子が、確立された技術に従って、受精卵の前核の1つに注入される。接合体の細胞質へのDNAの注入も用いられ得る。
トランスジェニック植物における製造が用いられてもよい。発現は、植物体の全体、または塊茎のような特定の器官に向けられてよい(Hiatt, Nature 344:469 479 (1990); Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12:449 453 (1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8:217 221 (1990); および EP 0 255 378を参照されたい)。
本発明の第VII因子ポリペプチドは、細胞培養培地または乳汁から回収される。本発明の第VII因子ポリペプチドは、当該分野において既知の種々の方法により精製されてよく、限定するものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和、疎水性、等電点電気泳動、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動(IEF)、示差溶解度（例えば、硫安塩析）、または抽出（例えば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照されたい)が含まれる。好ましくは、それらは抗-第VII因子抗体カラムを用いた親和性クロマトグラフィーにより精製されてよい。カルシウム依存性モノクローナル抗体は、Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097-11108, (1986) 、および Thim et al., Biochemistry 27: 7785-7793, (1988)により述べられている。付加的な精製は、高速液体クロマトグラフィーのような通常の化学的精製法によりなされてよい。クエン酸バリウム沈殿を含む他の精製方法は、当該分野において既知であり、ここで述べられている新規の因子FIIポリペプチドの精製に適用されてよい(例えば、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照されたい)。
原核細胞における第VII因子の組み換え発現を目的として、第VII因子ポリペプチドをコード化する核酸断片は、本発明の核酸断片を保有するクローン化または発現ベクターを形成するために適切なベクターに正常に挿入されてよい。本発明のこれらのベクターの構成に関わる詳細は、以下の形質転換した細胞および微生物の文脈において論じる。ベクターは、プラスミド、ファージ、コスミド、またはミニ染色体の形態であってよい。本発明で用いられる好ましいクローン化および発現ベクターは、自律増殖の能力があり、それ故、引き続くクローニングのための高レベルの発現または高レベルの複製を目的として、高いコピー数を可能にする。
本発明において用いられるベクターの一般的な概略は、5’-3’方向において、および動作可能な結合において以下の特徴を含む：第VII因子ポリペプチドをコード化する核酸断片の発現を促進するためのプロモーター、任意に該第VII因子ポリペプチドの分泌（細胞外の相に対して、もしくは適用できる場合は周辺質に）または膜への組み込みを可能にするリーダーペプチドをコード化する核酸配列、本発明の核酸断片、および任意に、ターミネーターをコード化する核酸配列。生産菌株または細胞株中の発現ベクターを用いて走査した場合、形質転換された細胞の遺伝的な安定性を目的として、宿主細胞に導入するときにベクターが宿主細胞のゲノム中に組み込まれることが好ましい。
本発明のベクターは、第VII因子ポリペプチドを製造するため、宿主細胞を形質転換するために用いられる。このように形質転換された細胞は、第2のポリアミノ酸をコード化する核酸断片およびベクターの増殖のために用いられるか、または第VII因子ポリペプチドの組み換え体製造のために用いられる培養細胞または細胞株であり得る。
1つの実施形態において、本発明の形質転換細胞は、バクテリア（エシェリヒア属[例えば大腸菌]、バチルス属[例えば枯草菌]、ロドコッカス属、ストレプトミセス属、放線菌類、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、エルウィニア属、またはサルモネラ属のような種）; 酵母 (酵母およびピッチアのような); 昆虫細胞; および原虫のような微生物である。あるいは、形質転換細胞は、菌類（ペニシリウム属、フサリウム属、アスペルギルス属、ポドスポラ、バンカビ属）または植物細胞のような多細胞生物に由来する。
1つの実施形態において、第VII因子ポリペプチドはグリコシル化されていない。
バクテリア大腸菌、桿菌、および他の属の菌株を含む原核生物の宿主細胞は、本発明において最も有用な宿主細胞である。これらの宿主を形質転換し、その中でクローン化された外来性のDNA配列を発現させるための技術は、当該分野において周知である（例えば、Sambrookら,同書,を参照されたい）。大腸菌のようなバクテリア中で、第VII因子ポリペプチドをコード化しているDNAを発現させる場合、そのポリペプチドは典型的に不溶性の顆粒として細胞質に保存されてよく、バクテリアの分泌性配列によりペリプラズム間隙に向けられてもよい。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒は、例えばグアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いることで回収および変性される。変性したポリペプチドは、その後、尿素溶液ならびに還元および酸化されたグルタチオンの組み合わせに対する透析、それに続き緩衝食塩水に対する透析によって変性剤を希釈することにより、再折りたたみされ得る。後者の場合、ポリペプチドは、ペリプラズム間隙の中身を放出させるために細胞を破壊することにより（例えば、音波破砕または浸透圧性ショックにより）、およびポリペプチドを取り出すことにより、可溶性および機能性の形態でペリプラズム間隙から取り戻すことができ、それにより、変性および再折り畳みが不要になる。細菌性細胞中で異種ジスルフィド結合-含有ポリペプチドを製造するための方法は、Georgiouら, 米国特許第6,083,715号により開示されている。
クローニングおよび／または最適化された発現を目的として、形質転換細胞は、第VII因子ポリペプチドをコード化する核酸断片を複製できることが好ましい。最後に第VII因子ポリペプチドを生成するために、形質転換細胞は、最初のポリアミノ酸をコード化する核酸断片を発現しなければならない。必須ではないが、発現生成物が培養培地に運び出されるか、または形質転換細胞の表面上に運ばれると都合がよい。
効率的な産生細胞が同定された場合、それらに基づいて、第VII因子ポリペプチドをコード化する核酸断片を発現する安定した細胞株を確立することが好ましい。好ましくは、この安定した細胞株は、それらの表面に第VII因子ポリペプチドを分泌または運び、それによりそれらの精製を容易にする。一般的に、宿主細胞に適合する種に由来する、レプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターは、宿主と関連して用いられる。ベクターは、通常複製部位を運び、ならびに形質転換細胞中で表現型選択ができる配列を作る。例えば、大腸菌は典型的に、大腸菌種由来のプラスミドであるpBR322を用いて形質転換される。pBR322プラスミドは、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含んでおり、それ故、形質転換細胞を識別する簡単な方法を提供する。pBR322プラスミドもしくは他の微生物のプラスミド、またはファージは、発現のために原核生物の微生物により使用されうるプロモーターも含んでいなければならないか、または含むように修飾されなければならない。
原核生物の組み換えDNA構造において最も一般的に用いられるプロモーターには、B-ラクタマーゼ（ぺニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系(Changら, 1978; Itakuraら, 1977; Goeddelら, 1979)、ならびにトリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddelら, 1979; EP-A-0 036 776)が含まれる。これらが最も一般的に用いられる一方、他の微生物のプロモーターが発見され、利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が公表されており、プラスミドベクターと共に技術者はそれらを機能的にライゲートすることができるようになった(Siebwenlistら, 1980)。ある一定の遺伝子は大腸菌中で、それら自身のプロモーター配列から効率よく発現されてよく、人工的な方法により他のプロモーターを加える必要がなくなる。
原核生物に加えて、酵母培養物のような真核細胞の微生物も使われてよく、ここでプロモーターは発現の駆動を可能にすべきである。多数の他の菌株が一般に入手可能であるが、酵母または一般のパン酵母が真核細胞の微生物の中で用いられる。酵母における発現のために、例えばプラスミドYRp7が一般的に用いられる。このプラスミドには既に、例えばATCC No. 44076 またはPEP4-1のように、トリプロファン中で成長する能力を欠いている酵母の突然変異体菌株に対して選択的マーカーを提供するtrpl遺伝子が含まれる。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrpl障害の存在は、その後、トリプトファン非存在下での培養により形質転換を検出するための効率的な環境を提供する。
酵母ベクターにおける適切なプロモーター領域には、エノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、へキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような3-ホスホグリセラートキナーゼまたは他の解糖作用の酵素に対するプローモーターが含まれる。適切な発現プラスミドを構成する場合、これらの遺伝子と付随した末端の配列はまた、mRNAおよび終末のポリアデニル化を提供するために、発現されることが望ましい配列の3’にライゲートされ発現ベクター中に組み込まれる。
培養状態により制御される転写の付加的な利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸ホスファタ−ゼ、窒素代謝に付随する分解酵素、および前記グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用の原因である酵素に対するプロモーター領域である。酵母適合性のプロモーター、複製開始点、および終止配列を含むベクターが適している。
治療を目的として、本発明の第VII因子ポリペプチドは実質上純粋であることが望ましい。それ故、本発明の好ましい実施形態において、本発明の第VII因子ポリペプチドは少なくとも約90〜95％の均質性、好ましくは98％の均質性にまで精製される。純度は、例えばゲル電気泳動およびアミノ-末端アミノ酸配列決定法により評価されてよい。
第VII因子ポリペプチドは、二本鎖の形態に変換するためにその活性化部位で切断される。活性化は、Osterud, et al., Biochemistry 11:2853-2857 (1972); Thomas, U.S. Patent No. 4,456,591; Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983); または Kisiel and Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983)により開示されているように、当該分野において既知の方法により実行されてよい。あるいは、Bjoernら (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565)により述べられているように、第VII因子は、モノQ（ファルマシアファインケミカルズ）等のようなイオン交換クロマトグラフィーカラムを通してそれを通過させることにより活性化されてよい。結果として活性化された第VII因子ポリペプチドは、その後、以下に述べるように配合され、投与される。
試験法
アッセイ1：
インビトロ加水分解試験法
野生型（天然）第VIIa因子および第VIIa因子の変種（共にこれ以後は「第VIIa因子」と呼ぶ）は、それらの比活性を直接比較するために並列で試験が行われる。試験はマイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, デンマーク)中で行われる。最終的な濃度が1mMの色素産生性基質 D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド (S-2288, Chromogenix, スウェーデン)を、0.1 M NaCl、 5 mM CaCl2、および 1 mg/ml ウシ血清アルブミンを含む50mMヘペス中の第VIIa因子（最終濃度100nM）、pH 7.4に加える。405nmにおける吸収をスペクトラマックス（SpectraMax：登録商標）340プレートリーダー（Molecular Devices, USA)で連続的に測定する。20分のインキュベートの間に生じた吸収は、酵素を含まないブランクのウェルの吸収を減算した後、変種および野生型第VIIa因子間の活性の比を算出するために用いる：
比＝(A405 nm 第VIIa因子の変種)/(A405 nm 第VIIa因子野生型)
アッセイ2：
インビトロタンパク質分解試験
野生型（天然）第VIIa因子および第VIIa因子の変種（共にこれ以後は「第VIIa因子」と呼ぶ）は、それらの比活性を直接比較するために並列で試験が行われる。試験はマイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, デンマーク)中で行われる。pH 7.4、0.1 M NaCl、5 mM CaCl2、および 1 mg/ml ウシ血清アルブミンを含む 50 mM ヘペス100μl中の第VIIa因子(10 nM) および因子X (0.8 μM)を15分間インキュベートする。因子Xの切断は、その後、pH 7.4で、0.1 M NaCl, 20 mM EDTA 、および1 mg/ml ウシ血清アルブミンを含む50 mMヘペス50μlの添加により停止させる。生成した第Xa因子の量は、最終濃度が0.5mMの色素生産性基質Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド(S-2765, Chromogenix,スウェーデン)の添加により評価される。405nmにおける吸収をスペクトラマックス（SpectraMax：登録商標）340プレートリーダー（Molecular Devices, USA)中で連続的に測定する。10分の間に生じた吸収は、FVIIaを含まないブランクウェルの吸収を減算した後、変種のおよび野生型第VIIa因子間のタンパク質分解活性の比を算出するために用いる：
比 = (A405 nm 第VIIa因子の変種)/(A405 nm 第VIIa因子の野生型)
実施形態は本発明のいくつかの側面の例示として意図されているので、ここで述べられているおよび主張されている本発明は、ここで開示されている特異的な実施形態によって範囲を限定されるものではない。等価な実施形態は、本発明の範囲内であることが意図されている。実際に、本発明の種々の改変は、ここで示し、且つ説明したものに加え、既述の説明から当業者に対して明らかになるであろう。このような修飾はまた、付属の特許請求の範囲の範囲内に含まれることも意図されている。抵触する場合、定義を含む本発明の開示が支配するであろう。
例1
配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸残基1〜44の除去を目的としたカテプシンG切断による、本発明によるFVIIポリペプチドの生成。
配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドをコード化するDNA構築物は、関心のある挿入を伴うスーパーコイルのおよび二重鎖のDNAベクター、ならびに公表された国際特許出願WO 01/83725、WO 02/22776、WO 03/027147、WO 02/077218、および WO 03/037932 、ならびに デンマーク特許出願 PA 2002 01423において述べられているような望ましい変異を含む2つの合成的プライマーを用いて、部位特異的な突然変異誘発により調製されてよい。簡単に言えば、オリゴヌクレオチドプライマーはベクターの反対の鎖に対してそれぞれ相補的であり、温度サイクルの間にPfuDNAポリメラーゼによって伸長される。プライマーの取り込みにおいて、ねじれ型のニックを含む変異したプラスミドが産生される。以下の温度サイクルにおいて、生成物は、親DNAの鋳型を消化するためおよび変異-含有の合成DNAを選択するために、メチル化されたおよびヘミメチル化されたDNAに対して特異的なDpnlで処理される。
特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いてDNA構築物を調製する方法は、当業者に周知である(PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USAを参照)。
配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドは、以前に述べたように(Thim et al. (1988) Biochemistry 27, 7785-7793; Persson and Nielsen (1996) FEBS Lett. 385, 241-243)、FVIIポリペプチドの変種の発現を得るために、本質的にはBHK細胞中での形質移入により調製されてよい。
配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドは、以下のように精製されてよい：
5 mM EDTA、0.1% トリトンX-100 、および10 mM トリスを加え、pH8.0に調整し、水を加えることにより伝導率を10-11 mS/cmに調整した後、条件培地をQセファロースファストフロー（ファルマシアバイオテク）の25mlカラム上に負荷する。
タンパク質の溶出は、10 mM トリス, 50 mM NaCl, 0.1% トリトン X-100, pH 8.0 から 10 mM トリス, 50 mM NaCl, 25 mM CaCl2, 0.1% トリトン X-100, pH 8.0までの段階によりなされる。FVIIポリペプチドの変種を含む画分を集め、CNBr-活性化セファロース4B（ファルマシアバイオテク）と共役したモノクローナル抗体F1A2（ノボノルディスク, Bagsvaerd, デンマーク)を含む25mlカラムに適用する。
カラムを10 mM CaCl2,100 mM NaCl 、および0.02% トリトン X-100を含む50 mM ヘペス, pH 7.5を用いて平衡化する。平行緩衝液および2 M NaClを含む平衡緩衝液を用いて洗浄した後、結合物質をCaCl2 の代わりに10 mM EDTAを含む平衡緩衝液で溶出する。使用または貯蔵する前に、EDTAを超える過剰なCaCl2が加えられるか、またはFVIIポリペプチドの変種がCa2+-含有緩衝液に移される。それぞれのステップの収量に引き続き、第VII因子 ELISA測定および精製されたタンパク質がSDS−PAGEにより分析される。
配列番号1のアミノ酸配列に関連する1以上のアミノ酸を含むFVIIポリペプチドの精製に続き、そのポリペプチドをNicolaisen et al., (1992) FEBS Lett. 306, 157-160において述べられているように、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸残基1〜44の除去のためのカテプシンG切断で処理する。
例2
FVIIポリペプチドをコード化するDNA構築物からの機能性脂質膜結合ドメインアミノ酸残基をコード化するDNA配列の除去による、本発明に従ったFVIIポリペプチドの生成。
残基42-406(FVII-(42-406))および83-406 (FVII-(83-406))を包含するFVIIポリペプチドにより例示されているように、短縮化された型のFVIIポリペプチドをコード化するDNAの構築：
N-末端が切断された型のFVIIポリペプチドをコード化するDNA構築物は、望ましい欠失をブリッジする2つの合成プライマー、ならびにプロセッシングされていないヒトFVIIが挿入されたスーパーコイルおよび二重鎖DNAベクターを用いて、部位特異的な突然変異誘発により調製される、すなわち、前記挿入物にはFVIIリーダーペプチド( 米国特許第4,784,950号において述べられている)に続き、成熟FVII配列(図1、配列番号1)が含まれる。それぞれのプライマーは、望ましい欠失に隣接するDNAベクターの2つの領域を同時にアニールするように設計されている。欠失は成熟FVIIのN-末端部分を包含しているため、1つの隣接する領域（アンダーラインを引いた）はリーダーペプチド配列中に位置する。
FVII-(42-406)に対応:
5’-GGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTC-3’
（配列番号2）
5’-GAGGCACACTGGTCCCCATCACTGTAAGAAATGCGCCGGCGCCGGTGCAGGACGCC-3’
（配列番号3）
FVII-(83-406)に対応:
5’- GGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTG-3’
（配列番号4）
5’- CACACAGATCAGCTGGTCATCCTTGTGCGTGCGCCGGCGCCGGTGCAGGACGCC-3’
（配列番号5）
オリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれベクター挿入物の反対側の鎖に対して相補的であるが、Pfu DNAポリメラーゼによる温度サイクルの間に伸長された。プライマーの組み込みにおいて、ねじれ型のニックを含む突然変異プラスミドが産生された。温度サイクルに続いて、その生成物は、親DNA鋳型を消化するためおよび突然変異含有合成DNAを選択するために、メチル化されたおよびヘミメチル化されたDNAに対して特異的なDpnlで処理された。
特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いてDNA構成物を調製するための方法は、当業者に周知である(PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USAを参照されたい)。
例3
残基1〜44を欠いたFVIIポリペプチドのプロコアギュラント活性の証明
抗-FVII抗体（最終濃度10ヒトベセズダ単位／ml）を、正常なドナーからのクエン酸添加のヒトの血液に添加して、血友病Aのような状態を誘導した。全長または(1〜44)のない-FVIIaをこの血液に、最終濃度が25または100nMになるように加えた。Innovin（複製された組み換えヒト組織因子、最終希釈度1:50000）およびt-PA（最終濃度1.8nM）を加えた。血液凝固は、CaCl2含有緩衝液の添加により惹起され、フィブリン凝血塊の発生は、血栓弾性記録法を用いて監視された。(1〜44)のない-FVIIaのプロコアギュラント活性は、FVIIaのそれと同様である。例えば、100nMの(1〜44)のない-FVIIaの存在は、2つの試料において490および455秒の凝固時間を与え、一方、100nMのFVIIaは、390および410秒の凝固時間を与えた。4つの試料全ては同じドナーの血液に基づくものであった。いわゆる角度値により表される凝血塊の発達の速度もまた、2つの(1〜44)のない-FVIIa(59および62°)ならびに2つのFVIIa試料（57および61°）の間で類似している。最大の凝血塊強度は、最大振幅値で表されるが、4つの試料において51〜54の間であり、FVIIaおよび(1〜44)のない-FVIIaについて類似していた。FVIIaの変種V158D/E296V/M298Q-FVIIaもまた、1nMで試験したとき、その全長および(1〜44)のない形態において同様の結果を示した。
野生型ヒト凝固第VII因子のアミノ酸配列 野生型ヒト凝固第VII因子のアミノ酸配列 野生型ヒト凝固第VII因子のアミノ酸配列

Claims (107)

  1. 配列番号1に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドであって、前記アミノ酸置換がK157, V158, E296, M298, L305, M306, D309, S314, D334, S336, K337, F374からなる群より選択される1以上のアミノ酸の、いずれか他のアミノ酸との置換であり、前記FVIIポリペプチドが本質的にGLA残基を持たないポリペプチド。
  2. K157がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1に記載の第VII因子ポリペプチド。
  3. V158がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1または2のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  4. E296がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  5. M298がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  6. L305がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  7. M306がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  8. D309がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  9. S314がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  10. D334がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  11. S336がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  12. K337がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1〜11のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  13. F374がいずれか他のアミノ酸で置換される、請求項1〜12のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  14. 請求項1〜13のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、プロテアーゼドメインの残りの位置における少なくとも1つのアミノ酸が、いずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチド。
  15. 請求項14に記載の第VII因子ポリペプチドであって、プロテアーゼドメインの残りの位置における多くて20の付加的アミノ酸が、いずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチド。
  16. 請求項14〜15のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、配列番号1の159〜170から選択される位置のアミノ酸に対応する少なくとも1つのアミノ酸が、いずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチド。
  17. 請求項14〜16のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、配列番号1の290〜304から選択される位置のアミノ酸に対応する少なくとも1つのアミノ酸が、いずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチド。
  18. 請求項17に記載の第VII因子ポリペプチドであって、R304がTyr、Phe、Leu、およびMetからなる群より選択されるアミノ酸により置換されたポリペプチド。
  19. 請求項14〜18のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、配列番号1の307〜312から選択される位置のアミノ酸に対応する少なくとも1つのアミノ酸が、いずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチド。
  20. 請求項14〜19のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、配列番号1の330〜339から選択される位置のアミノ酸に対応する少なくとも1つのアミノ酸が、いずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチド。
  21. A274がいずれか他のアミノ酸で置換された、請求項14〜20のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  22. 請求項21に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記A274がMet、Leu、Lys、およびArgからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  23. 請求項1〜22のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記K157がGly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、およびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  24. 請求項1〜23のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記V158がSer、Thr、Asn、Gln、Asp、およびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  25. 請求項1〜24のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記E296がArg、Lys、Ile、Leu、およびValからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  26. 請求項1〜25のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記M298がLys、Arg、Gln、およびAsnからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  27. 請求項1〜26のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記L305がVal、Tyr、およびIleからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  28. 請求項1〜27のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記M306がAspおよびAsnからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  29. 請求項1〜28のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記D309がSerおよびThrからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  30. 請求項1〜29のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記S314がGly、Lys、Gln、およびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  31. 請求項1〜30のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記D334がGlyおよびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  32. 請求項1〜31のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記S336がGlyおよびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  33. 請求項1〜32のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記K337がAla、Gly、Val、Ser、Thr、Asn、Gln、Asp、およびGluからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  34. 請求項1〜33のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記F374がProおよびTyrからなる群より選択されるアミノ酸によって置換されたポリペプチド。
  35. 請求項34に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記F374がTyrによって置換されたポリペプチド。
  36. 請求項1〜35のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜38を含まないポリペプチド。
  37. 請求項1〜35のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜44を含まないポリペプチド。
  38. 請求項1〜35のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜152を含まないポリペプチド。
  39. 請求項1〜36のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記第VII因子ポリペプチドが、少なくとも配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列39〜406からなるポリペプチド。
  40. 請求項1〜37のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記第VII因子ポリペプチドが、少なくとも配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列45〜406からなるポリペプチド。
  41. 請求項1〜38のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記第VII因子ポリペプチドが、少なくとも配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列153〜406からなるポリペプチド。
  42. 請求項1〜41のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記アミノ酸がポリヌクレオチド構築物によりコード化され得るいずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチド。
  43. 前記第VII因子ポリペプチドが活性型である、請求項1〜42のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  44. 請求項1〜43のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、前記第VII因子ポリペプチドのタンパク質分解活性および配列番号1で示される天然第VIIa因子ポリペプチドのタンパク質分解活性の比が、少なくとも約1.25であるポリペプチド。
  45. 前記の比が少なくとも約2.0、好ましくは少なくとも約4.0である、請求項44に記載の第VII因子ポリペプチド。
  46. 請求項1〜45に記載の第VII因子ポリペプチドをコード化する、ポリヌクレオチド構築物。
  47. ベクターである、請求項46に記載のポリヌクレオチド構築物。
  48. 請求項46〜47のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  49. 真核細胞である、請求項48に記載の宿主細胞。
  50. 哺乳類起源である、請求項49に記載の宿主細胞。
  51. 昆虫細胞である、請求項49に記載の宿主細胞。
  52. 請求項50に記載の宿主細胞であって、前記細胞がCHO細胞、HEK細胞、およびBHK細胞からなる群より選択される細胞。
  53. 微生物である、請求項48に記載の宿主細胞。
  54. 請求項53に記載の宿主細胞であって、微生物が大腸菌、枯草菌、ロドコッカス属、ストレプトミセス属、放線菌類、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、エルウィニア属、サルモネラ属、酵母、ピッチア(Piccia)、原虫、ペニシリウム属、フサリウム属、アスペルギルス属、ポドスポラ(Podospora)、およびバンカビ属からなる群より選択される宿主細胞。
  55. 請求項46に記載のポリヌクレオチドを含み、発現する、トランスジェニック動物。
  56. 請求項46に記載のポリヌクレオチドを含み、発現する、トランスジェニック植物。
  57. 請求項1〜45のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドを製造する方法であって、適切な培養培地中において請求項48〜54のいずれか1項に記載の宿主細胞を前記ポリヌクレオチド構築物の発現を可能にする条件下で培養することと、および得られたポリペプチドを前記培養培地または前記宿主細胞から回収することを含む方法。
  58. 請求項1〜45のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドを製造する方法であって、請求項55に記載のトランスジェニック動物により作られる乳汁から第VII因子ポリペプチドを回収することを含む方法。
  59. 請求項1〜45のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドを製造する方法であって、請求項56に記載のトランスジェニック植物の宿主細胞を培養すること、および前記植物から第VII因子ポリペプチドを回収することを含む方法。
  60. FVIIポリペプチドを含有する医薬組成物であって、前記FVIIポリペプチドが本質的にGLA残基を持たず；任意に、薬剤的に許容可能な担体を含む組成物。
  61. 配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドを含有する医薬組成物であって、前記アミノ酸置換がK157, V158, E296, M298, L305, M306, D309, S314, D334, S336, K337, F374からなる群より選択される1以上のアミノ酸の、いずれか他のアミノ酸との置換であり、前記FVIIポリペプチドが本質的にGLA残基を持たず；任意に、薬剤的に許容可能な担体を含む組成物。
  62. 請求項60に記載の医薬組成物であって、前記第VII因子ポリペプチドが本質的にGLA残基をもたない野生型ヒトFVIIであり；任意に、薬剤的に許容可能な担体を含む組成物。
  63. 請求項60〜62のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜38を含まない組成物。
  64. 請求項60〜63のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜44を含まない組成物。
  65. 請求項60〜64のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜152を含まない組成物。
  66. 請求項60、62〜65のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列39〜406を含んでなる組成物。
  67. 請求項60、62〜66のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列45〜406を含んでなる組成物。
  68. 請求項60、62〜67のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列153〜406を含んでなる組成物。
  69. 請求項60〜68のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、アミノ酸が、ポリヌクレオチド構築物によりコード化され得るいずれか他のアミノ酸で置換された組成物。
  70. 第VII因子ポリペプチドが活性型である、請求項60〜69のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  71. 請求項1〜45のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドを含有する医薬組成物であって、任意に薬剤的に許容可能な担体を含む組成物。
  72. FVIIポリペプチドの使用であって、前記FVIIポリペプチドが本質的にGLA残基を持たず；出血障害もしくは出血エピソードの治療、または正常な止血系の増強を目的とした薬剤の調製のための使用。
  73. 配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドの使用であって、前記アミノ酸置換が、K157, V158, E296, M298, L305, M306, D309, S314, D334, S336, K337, F374からなる群より選択される1以上のアミノ酸の、いずれか他のアミノ酸との置換であり、前記FVIIポリペプチドは本質的にGLA残基を持たず；出血障害もしくは出血エピソードの治療、または正常な止血系の増強を目的とした薬剤の調製のための使用。
  74. 請求項72に記載の使用であって、前記第VII因子ポリペプチドが、本質的にGLA残基をもたない野生型ヒトFVIIであり；任意に薬剤的に許容可能な担体を含む使用。
  75. 請求項72〜74のいずれか1項に記載の使用であって、前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜38を含まない使用。
  76. 請求項72〜75のいずれか1項に記載の使用であって、前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜44を含まない使用。
  77. 請求項72〜76のいずれか1項に記載の使用であって、前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜152を含まない使用。
  78. 請求項72、74〜77のいずれか1項に記載の使用であって、前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列39〜406を含んでなる使用。
  79. 請求項72，74〜78のいずれか1項に記載の使用であって、前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列45〜406を含んでなる使用。
  80. 請求項72，74〜79のいずれか1項に記載の使用であって、前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列153〜406を含んでなる使用。
  81. アミノ酸がポリヌクレオチド構築物によりコード化され得るいずれか他のアミノ酸で置換された、請求項72〜80のいずれか１項に記載の使用。
  82. 前記第VII因子ポリペプチドが活性型である、請求項72〜81のいずれか１項に記載の使用。
  83. 請求項1〜45のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドの使用であって、出血障害もしくは出血エピソードの治療、または正常な止血系の増強を目的とした薬剤の調製のための使用。
  84. 血友病AまたはBの治療のための、請求項72〜83のいずれか１項に記載の方法。
  85. 被験者の出血障害または出血エピソードの治療のため、または正常な止血系の増強のための方法であって、FVIIポリペプチドの治療的または予防的に有効な量をそれらを必要とする被験者に対して投与することを含み、ここでの前記FVIIポリペプチドは本質的にGLA残基を持たない方法。
  86. 被験者における出血障害または出血エピソードの治療のため、または正常な止血系の増強のための方法であって、配列番号1のアミノ酸配列に対する1以上のアミノ酸置換を含むFVIIポリペプチドの治療的または予防的に有効な量を、それらを必要とする被験者に対して投与することを含み、ここでの前記アミノ酸置換は、K157, V158, E296, M298, L305, M306, D309, S314, D334, S336, K337, F374からなる群より選択される1以上のアミノ酸の、いずれか他のアミノ酸との置換であり、ここでの前記FVIIポリペプチドは、本質的にGLA残基を持たない方法。
  87. 請求項85に記載の方法であって、ここでの前記第VII因子ポリペプチドは、本質的にGLA残基をもたない野生型ヒトFVIIであり、任意に、薬剤的に許容可能な担体を含む。
  88. 前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜38を含まない、請求項85〜87にいずれか１項に記載の方法。
  89. 前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜44を含まない、請求項85〜88のいずれか１項に記載の方法。
  90. 前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜152を含まない、請求項85〜89のいずれか1項に記載の方法。
  91. 前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列39〜406を含んでなる、請求項85，87〜90のいずれか１項に記載の方法。
  92. 前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列45〜406を含んでなる、請求項85，87〜91のいずれか１項に記載の方法。
  93. 前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列153〜406を含んでなる、請求項85，87〜92のいずれか１項に記載の方法。
  94. アミノ酸がポリヌクレオチド構築物によりコード化され得るいずれか他のアミノ酸で置換された、請求項85〜93のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記第VII因子ポリペプチドが活性型である、請求項85〜94のいずれか１項に記載の方法。
  96. 被験者における出血障害または出血エピソードの治療のため、または正常な止血系の増強のための方法であって、治療的または予防的に有効な量の請求項1〜45のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドを、それらを必要とする被験者に投与することを含む方法。
  97. 薬剤として使用するための、本質的にGLA残基を持たない第VII因子ポリペプチド。
  98. 請求項97に記載の第VII因子ポリペプチドであって、ここでの前記第VII因子ポリペプチドは、本質的にGLA残基をもたない野生型ヒトFVIIであり；任意に薬剤的に許容可能な担体を含むポリペプチド。
  99. 前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜38を含まない、請求項97〜98のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  100. 前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜44を含まない、請求項97〜99のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  101. 前記第VII因子ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列1〜152を含まない、請求項97〜100のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  102. 前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列39〜406を含んでなる、請求項97〜101のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  103. 前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列45〜406を含んでなる、請求項97〜102のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  104. 前記第VII因子ポリペプチドが配列番号1のアミノ酸配列153〜406を含んでなる、請求項97〜103のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  105. 請求項97〜104のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチドであって、ここでのアミノ酸が、ポリヌクレオチド構築物によりコード化され得るいずれか他のアミノ酸で置換されたポリペプチド。
  106. 前記第VII因子ポリペプチドが活性型である、請求項97〜105のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
  107. 薬剤としての使用を目的とした、請求項1〜45のいずれか１項に記載の第VII因子ポリペプチド。
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