KR20140146171A - 최적화된 피하 치료약 - Google Patents

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Abstract

치료약이 치료약의 천연 상태와 관련된 친수성 및 분자 치수를 증가시키기 위해 변형된 것이고, 여기서, Cmax:Caverge 비는 정맥 내로 전달된 상기 약의 Cmax:Caverge 비보다 낮은 것인, 피하 투여용 방법 및 투여 제제를 제공한다.

Description

최적화된 피하 치료약{OPTIMISED SUBCUTANEOUS THERAPEUTIC AGENTS}
본 발명은 치료약 (therapeutic agent)의 피하 전달 뿐만 아니라, 상기 치료약이 피하 전달에 적합하도록 그를 변형시키는 것에 관한 것이다.
다수의 소수성 (친유성) 분자가 감염, 질환 및 장애 치료에 사용된다. 친유성 분자는 일반적으로 감염, 질환 등의 부위로 확실히 빠르게 전달되도록 하기 위해 환자의 혈류 내로 직접 투여된다. 그러나, 상기 분자의 반감기 및/또는 생체이용률은 차선화될 수 있다. 정맥 내 투여의 단점으로는 환자 내로의 비교적 많은 양의 약 전달에 대한 국소 및 전신 반응, 및 정맥 내 투여의 불편함을 포함한다.
본 발명자들은 놀랍게도, 치료약을 변형시켜 상기 치료약의 친수성 및 분자 치수를 증가시키면, 상기 약은 혈관계로 직접 진입하지 못하게 불능화된다는 것을 발견하게 되었다. 그러나, 상기 변형된 약은 수성 림프계를 통해 환자의 순환계로 진입할 수 있는 그의 능력에 기인하여 여전히 생체이용가능해진다. 치료약의 결합 조직에의 표면 부착을 억제시키고, 조직액 중에의 그의 용해도를 증가시키기 위하여 변형이 선택된 것이다. 본 발명의 변형된 치료약은 피하 공간으로 전달될 때에 특히 유용한데, 그 이유는 상기 치료약이 너무 커서 피하 공간으로부터 직접 혈관계로 진입할 수 없고, 따라서, 림프계에 의해 신체 전체로 수송되어 흉관 (우림프관 및 쇄골하 정맥)을 통해 순환계로 진입할 수 있기 때문이다. 놀랍게도 이를 통해서 상기 치료약은 환자의 순환계 내로 예측가능하게 안정적으로 주입된다. 따라서, 본 발명은 상기 변형된 약의 수명, 주입 속도 및 제거 속도에 있어서 그의 효과를 더욱 예측가능하게 만들고, 이로써, 효과의 지속 기간도 그러하게 만들기 위한, 상기 변형된 약의 피하 전달에 관한 것이다. 이는 상기 약을 더욱 친수성이 되도록 만들고, 환자에게로의 피하 전달시 상기 변형된 약이 혈관을 통해 혈류로 진입하지 못하게 하되, 간질액에 의해서는 수송되어 그가 림프계로 진입할 수 있도록 그의 분자 치수를 변형시킴으로써 달성된다. 이를 통해서 림프계로부터 혈관계로의 방출은 조절형으로 예측가능해진다. 이에 의해 하기 논의되는 바와 같이 전달 부위 주변의 혈관화 수준을 고려해야 할 필요는 없어진다.
본 발명은 펩티드, 모든 혈액 인자를 비롯한 생체분자, 호르몬, 항생제, 모노클로날 항체 및 일부 소분자에 적용될 수 있다. 분자의 치료학적 효과는 방해하지 않고, 친수성은 증가시키며, 먼저 흉관에서 림프계를 통해 쇄골하 정맥을 통하지 않고는 확실하게 맥관 구조로 직접 진입하지 못하도록 그의 분자 치수 (이는 상기 변형된 약의 분자량, 또는 물리적 크기를 포함할 수 있음)를 변형시키는, 임의의 적합한 변형이 사용될 수 있다. 선택된 변형은 최적의 치료학적 효과를 위해 약의 주입 속도 및 제거 속도가 "균형을 유지하도록" (배설, 소화, 면역학적 공격, 또는 다른 수단에 의한) 신체로부터의 약 제거를 조절하는 수반되는 효과를 가질 수 있다.
적합한 변형의 예로는 중합체, 적합하게는 생체적합성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리포스파티딜 콜린 (PC), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리에틸렌 옥시드 (PEO), 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리올레핀 알콜, 폴리히드록시알킬메타크릴레이트, 다당류, 폴리 α-히드록시산, 폴리비닐 알콜, 폴리포스포스파스파젠, 폴리 N-아크릴로일모르폴린, 폴리알킬렌 옥시드 중합체, 폴리말레산, 폴리 DL-알라닌, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 전분 또는 전분 유도체, 히알루론산, 키틴, 폴리메타크릴레이트, 폴리시알산 (PSA), 폴리히드록시 알카노에이트, 폴리 아미노산 및 그의 조합과 약과의 컨쥬게이션을 포함한다. 상기 생체적합성 중합체는 직선형 또는 분지형 구조를 가질 수 있다.
생체적합성 중합체의 다른 예로는 알부민, 트랜스페린, 모노클로날 항체, 항체 단편, 예를 들어, 단일 도메인 항체, VL, VH, Fab, F(ab')2, Fab', Fab3, scFv, 디-scFv, sdAb, Fc를 비롯한, 면역글로불린, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는 단백질이다.
치료약을 변형시키는 다른 방법은 융합 단백질 사용; 소포성 전달 비히클, 예컨대, 리포좀, 트랜스퍼좀 또는 미셀 내로의 혼입; 덴드리머 내로의 혼입 또는 그에의 부착 또는; 약의 올리고머 복합체 형성을 통해 이루어질 수 있다. 선택된 변형은 최적의 치료학적 효과를 위해 약의 주입 속도 및 제거 속도가 "균형을 유지하도록" (배설, 소화, 면역학적 공격, 또는 다른 수단에 의한) 신체로부터의 약 제거를 조절하는 수반되는 효과를 가질 수 있다.
일단 피하 공간으로 전달되고 나면, 그렇게 위치하는 상기 변형된 약은 림프계를 통해 수송되어 쇄골하 정맥을 통해 혈관계로 주입될 수 있고, 이후 상기 변형은 또한 피하 공간으로부터 순환으로의 주입 속도 대 신체로부터의 약물 제품의 제거 속도의 비가 상기 변형된 약의 치료학적 효능 및 효과를 최적화시키는 방식으로 균형을 유지하도록 및 조절되도록 신체로부터의 약의 제거를 조절한다.
상기와 같은 방식으로 피하 전달을 위한 것으로 변형될 수 있는 치료약의 예는 혈액 응고 인자를 포함한다. 혈액 응고 캐스캐이드는 서로 활성화시키고, 혈전 형성을 촉진시켜 건강한 지혈을 유지시키는 다양한 역할을 하는 다수의 상이한 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 변형시키고자 하는 혈액 응고 인자는 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트(von Willebrand's) 인자 및 단백질 C로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 혈액 응고 인자는 적합하게 인자 VII, 인자 VIII 또는 인자 IX이다.
본 발명과 관련된 치료약의 예로는 12개의 천연 이황화 결합을 함유하며, 53,000 달톤 (Da)이고, 당화된, 비타민 K 의존성, 단일 쇄 효소원인 혈액 응고 인자 VII (본원에서 FVII로 지칭됨)을 포함한다 (문헌 [O'Hara et al., Proc . Nat'l Acad . Sci . USA , 84: 5158-5162 (1987)]). 상기 단백질은 주로 간에서 생산된다. FVII은 외인성 혈액 응고 캐스캐이드에 관여한다 (도 1). 상기 단백질은 4개의 개별 도메인: N-말단 γ-카르복시글루타메이트 (Gla) 도메인, 2개의 표피 성장 인자-유사 (EGF) 도메인 및 C-말단 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다. 순환 효소원은 혈관 내피하층에서 발견되는 그의 보조 인자 조직 인자 (TF)의 부재하에서는 프로테아제 활성을 거의 보이지 않는다. 혈관 손상 후, FVII은 고친화도로 TF에 결합하여 아르기닌 152와 이소류신 153 사이의 펩티드 결합의 특이적인 절단에 의해 활성인 2쇄 효소 FVIIa로 전환된다. FVIIa 경쇄는 N-말단 Gla 및 EGF-유사 도메인으로 구성되고, 중쇄는 세린 프로테아제 도메인으로 구성된다. 중쇄 및 경쇄는 시스테인 135와 시스테인 262 사이의 단일 이황화 결합에 의해 결합된다. 일단 활성화되고 나면, FVIIa는 FX에서 FXa로의 전환, 및 FIX에서 FIXa로의 전환을 빠르게 촉매화시킨다. 이어서, FXa는 FVa와 복합체를 형성하여 프로트롬빈을 절단함으로써 소량의 트롬빈을 생성한다 (문헌 [Aitken, M. G. EMA, 16: 446-455 (2004)]). 이러한 트롬빈 생성은 혈소판, 및 혈소판 표면 상의 보조 인자 V, VIII 및 XI을 활성화시킨다. 상기 활성화를 통해 트롬빈 버스트(burst)가 형성되고, 이로써 피브린 중합화 및 지혈전 형성이 유발된다.
인간 재조합 FVIIa가 개발되었고, 노보세븐(NovoSeven)® (엡타코그 알파(eptacog alfa) [활성형], ATC 코드 B02BD08)으로서 노보 노르디스크(Novo Nordisk)에 의해 상업화되었다. 노보세븐®은 각각 FVIII 또는 IX에 대한 억제성 항체가 발생되는 혈우병 A 또는 B 환자에서의 출혈 에피소드 치료용으로서 허가받은 것이다 (문헌 [Jurlander et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 27: 373-383 (2001)]; [Roberts et al., Blood, 15: 3858-3864 (2004)]). 상기 치료법은 1996년도에 출시된 이래로 안전하고 효과적인 것으로 입증되어 왔다. 그러나, 상기 단백질의 생체내 반감기는 비교적 짧기 때문에 (2.3시간; 문헌 [Summary Basis for Approval NovoSeven®], FDA 참조 번호 96-0597)), 지혈시키기 위해서는 단일 출혈 에피소드 동안 시간이 경과함에 따라 고용량의 생성물 (90 ㎍ kg-1)의 다회 주입이 요구될 수 있다. 생성물의 반감기가 짧고, 원하는 치료학적 효과를 얻기 위해서는 고용량이 요구되기 때문에 억제제를 사용하여 혈우병을 예방적으로 처치하는 데에는 일반적으로 노보세븐®이 사용되지 못한다. 그러므로, 약동학적 성질 (PK) 및 약력학적 성질 (PD)은 개선되어 있으면서, 반감기가 증가되어 있는 FVIIa 분자의 개발이 요구된다는 것은 명백하다.
인자 VIII (FVIII)은 항혈우병 인자 (AHF)로도 알려져 있는, 필수 혈액 응고 인자이다. 인간에서, 인자 VIII은 F8 유전자에 의해 코딩된다. 상기 유전자 결함은, 남성 5,000명당 대략 1명에 영향을 미치는, 주지된 열성 X 연관 응고 장애인, 혈우병 A로 이어진다.
X 연관 F8 유전자는 26개 엑손으로부터의 2,351개 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 코딩하고, 이는 신호 펩티드 절단 후, 2,332개의 아미노산으로 이루어진 성숙한 FVIII 분자로 제공된다 (문헌 [Wang et al., Int . J. Pharmaceutics, 259: 1-15 (2003)]). 인간에서의 1차 방출 부위에 관해서는 여전히 상당부 모호하기는 하지만, FVIII은 합성되어 혈관, 사구체, 및 세뇨관 내피, 및 간의 굴모양혈관(sinusoidal) 세포에 의해 혈류로 방출되는 것으로 밝혀졌다. FVIII 분자는 6개의 단백질 도메인으로 구성된다; NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. 성숙한 분자는 N 연관 및 O 연관 당화, 술폰화 및 이황화 결합 형성을 비롯한, 다수의 번역 후 변형을 포함한다. FVIII은 총 23개의 시스테인 잔기를 함유하며, 이 중 16개는 단백질의 A 및 C 도메인에서 8개의 이황화 결합을 형성한다 (문헌 [McMullen et al., Protein Science , 4: 740-746 (1995)]). 단백질의 번역 후 변형에 기인하여, 단백질의 순환 분자량은 당화의 수준 및 유형에 따라 최대 330 kDa까지 될 수 있다. FVIII은 또한 단백질 가수분해적으로 프로세싱됨에 따라 순환 종은 중쇄 (A1-A2-B) 및 경쇄 (A3-C1-C2)로 구성된 이종이량체가 된다. FVIII이 순환으로 분비될 때, 이는 비-공유적 방식으로 폰 빌레브란트 인자 (vWF)에 결합한다. 두 분자의 결합에 FVIII의 경쇄의 A3 및 C2 도메인이 관여한다 (문헌 [Lacroix-Desmazes et al., Blood, 112: 240-249 (2008)]). vWF에 결합하면 FVIII의 안정성 및 순환 반감기는 증가한다. 비록 vWF에의 결합이 FVIII의 순환 반감기를 증가시키기는 하지만, FVIII 고유의 반감기는 15-19 시간이다.
인자 VIII은 내인성 혈관 응고 경로에 참여하는 필수 보조 인자이다. 응고 캐스캐이드에서 그의 역할은 "핵 형성 주형"으로 작용하여 활성화된 혈소판의 표면상에서 올바른 공간 배향으로 FX아제 복합체의 성분을 조직하는 것이다 (문헌 [Shen et al., Blood , 111:1240-1247 (2008)]). FVIII은 먼저 트롬빈 (인자 IIa) 또는 FXa에 의해 활성화된 후, 이어서, FVIIIa의 형태로 vWF로부터 해리된다. 이어서, FVIIIa는 혈관 손상 부위에서 활성화된 혈소판과 결합하고, A2 및 A3 매개 상호작용을 통해 FIXa와 결합한다. 혈소판 표면 상의 Ca2 +의 존재하에서 FVIII에의 FIXa의 결합은 FIXa의 단백질 가수분해적 활성을 대략 200,000배만큼 증가시킨다. 이어서, 상기 복합체는 FX를 FXa로 활성화시킨다. 이어서, 인자 Xa는 그의 보조 인자 인자 Va와 함께, 더 많은 트롬빈을 활성화시킨다. 트롬빈은 결국 피브리노겐을 피브린으로 절단하고, 이어서, 피브린 혈전으로 중합화되고 교차결합 (인자 XIII 사용)한다.
vWF에 의해 더 이상 보호되지 않으면서, 활성화된 FVIII은 (가장 현저하게는 활성화된 단백질 C 및 인자 IXa에 의해) 프로세스에서 단백질 가수분해적으로 불활성화되며, 혈류로부터 빠르게 제거된다.
인자 IX (이는 또한 크리스마스(Christmas) 인자로도 알려져 있음)는 응고계의 세린 프로테아제이고, 상기 단백질 결핍은 혈우병 B를 유발한다. 인자 IX는 불활성 효소원 전구체로서 생산되고, 이어서, 프로세싱됨에 따라 신호 펩티드를 제거한 후, 추가로 당화되고, 이어서, 인자 XIa 또는 인자 VIIa에 의해 절단되어 이황화 브릿지에 의해 연결된 2쇄 형태로 제조된다 (문헌 [Scipio et al., J Clin Invest. 1978;61 (6): 1528-1538]). 일단 Ca2 +, 막 인지질, 및 인자 VIII 보조 인자의 존재하에서 인자 IXa로 활성화되고 나면, 이는 인자 X 중의 아르기닌-이소류신 결합을 가수분해하여 인자 Xa를 형성한다. 인자 IX는 항트롬빈에 의해 억제된다.
혈우병 B는 효과적인 응고촉진성 단백질의 결핍을 초래하는, 과도한 인자 IX 유전자 돌연변이에 의해 유발되는 X 연관 출혈 장애이다. 크리스마스 질환으로도 또한 알려져 있는 혈우병 B는 내인성 캐스캐이드의 정상적인 개시를 방해하는 비-기능성 또는 결핍성 FIX의 결과이다. 중증의, 그리고 잠재적으로는 생명을 위협하는 출혈 사례는 적절한 양의 FIX의 시기적절한 투여에 의해 회복될 수 있는 상기 병증과 함께 발생될 수 있다. 지혈은 순환 효소원이 치료학적 범위 내에 존재하는 한은 유지될 수 있다.
역사적으로, 혈우병 B는 혈장 FIX 또는 프로트롬빈 복합체 농축물의 정맥 내 전달에 의해 치료되어 왔고, 더욱 최근에는 고도로 정제된 혈장 유래의 재조합 FIX의 전달에 의해 치료되었다. 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)로부터의 재조합 인간 FIX의 출현으로 크라스마스 질환의 치료법은 예방적 요법이 현재 특히 유아에서 가능하다는 점에서 변환되었다. 그러나, 이와 관련된 제한 인자의 반감기는 짧고, 그의 잠재적인 "강력한 효능(super potency)"은 예방적 요법을 대략 3일 간격으로 제한한다.
혈액 응고 및 다른 장애를 앓는 환자를 치료하고자 하는 의사가 직면하게 되는 문제들 중 하나는 상기 환자에게 투여되는 치료약, 예컨대, 혈액 응고 인자 조성물의 장기 지속적인 치료학적 투여량을 달성하는 방법이다. 특히 상기 약의 예방적 용도에 관한 또 다른 문제는 체내 치료약의 주입, 분포 및 제거 수준을 예측가능한 항정 상태로 유지시켜 상기 약 및 그의 효과, 둘 모두의 수준이 들쭉날쭉하게 "버스트" 또는 "피크"가 되지 못하도록 막는다는 것이다.
예를 들어, 혈액 응고 조절은 혈전을 형성하는 기능상실 뿐만 아니라, 원치않는 혈전 형성인 혈전증, 둘 모두를 비롯한, 주된 건강상의 문제들 다수를 제시하는 과정이다. 원치않는 응괴를 예방하는 약은 많은 상황하에서 사용되고, 다양한 약들이 이용가능하다. 불행하게도, 현 요법들 대부분은 바람직하지 못한 부작용을 가지고 있다. 경구적으로 투여되는 항응고제, 예컨대, 와파린은 간에서 비타민 K의 작용을 억제시키는 작용을 하여 비타민 K-의존성 단백질에서 글루탐산 잔기의 완전한 카르복실화를 방해함으로써 순환계 중 활성 단백질의 농도를 저하시키고, 응괴를 형성할 수 있는 능력을 감소시킨다. 와파린 요법은 약물의 그의 표적과의 경쟁적 성질에 의해 복잡해진다. 식이 비타민 K의 변동은 와파린의 과다 복용 또는 과소 복용을 초래할 수 있다. 응고 활성의 변동은 상기 요법의 바람직하지 못한 결과이다.
예컨대, 저분자량 헤파린을 비롯한 헤파린과 같은 주사 물질 또한 통상 항응고제로서 사용된다. 또한, 상기 화합물은 과다 복용되기 쉽고, 주의 깊게 모니터링되어야 한다.
치료학적 펩티드의 유용성을 제한하는 또 다른 현상은 상기 펩티드 중 일부에서 나타나는, 비교적 짧은 생체내 반감기이다. 전반적으로, 생체내 반감기가 짧다는 것의 문제는 치료학적 당펩티드가 빈번하게 및 고투여량으로 투여되어야 하는 것을 의미하는데, 이는 궁극적으로는 보다 국소 유해 반응의 위험이 더 높고, 당단백질 치료약을 더욱 장기간 동안 치료학상 유효 수준으로 유지시키는 데 더욱 효율적인 방법이 이용가능하다면 필요할 수 있는 의료비가 더 높다는 것으로 해석된다.
치료약이 확실하게 림프계를 통해 전달될 수 있도록 하는 능력을 통해 약을 조절 방식으로 주입할 수 있다. 증가된 친수성은 또한 분해 효소, 면역계 등에 의한 손상으로부터 분자를 은폐시키는 데 도움이 된다. 추가로, 물 중에서의 증가된 이동성은 치료약의 생체이용가능성을 증가시켜 투여량 요건을 낮춘다. 결국 이를 통해 부작용은 감소하게 되고, 치료 효능은 증가하게 되며, 의사의 치료에 소요되는 시간은 단축된다.
본 발명자들은 놀랍게도 치료약의 더욱 일관된 '항정 상태' 수준은 치료약이 본 발명에 따라 변형되고, 피하 공간으로 전달되었을 때에 전신으로 달성될 수 있다는 것을 밝혔다. '항정 상태'로의 일관성 증가는 대사율 및/또는 면역계 분해율, 및 신장 또는 GI 관을 통한 제거 속도에 대해 균형이 유지된, 림프계를 통해 혈관계 내로의 도입 (즉, 주입) 속도의 조합이 원인이 될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 상기 변형된 약의 피하 전달은 볼루스 주사 전달 반복시에 전통적으로 관찰되는 '들쭉날쭉한' 최고점 및 최저점을 완화시킬 수 있다. 그러나, Cmax가 정맥 내 주사에 의해 달성되는 것과 동일하도록 하기 위해서는 더 많은 다량의 용량이 피하 전달에 의해 투여될 수 있고, 이러한 경우, 상기 변형된 약의 치료학적 효과 지속 기간의 장기화는 림프계를 통한 혈관계 내로의 주입 속도의 저속화에 기인하여 달성될 것이다. 따라서, 본 발명은 투여 빈도를 감소시킬 수 있다. 별법으로, 동일한 투여 빈도는 정맥 내 전달 대신, 본 발명에 따라 피하 전달이 사용될 때, 보다 적은 저용량으로 구상될 수 있다.
다시 말해, 주어진 지속 기간 (예컨대, 4일) 동안에 걸쳐, 피하로 투여된 상기 변형된 약의 용량의 Cmax:Caverage의 비는 동일 용량을 정맥 내로 투여하였을 때의 값보다 낮다. 혈류 중 상기 변형된 약 수준의 일관성은 증가되어 있기 때문에, 이는 명백하게 장점이 된다.
당업자가 이해하는 바와 같이, Cmax:Caverage 또는 Cmax:Cmin의 비가 더 낮기 때문에 (즉, 정맥 내로 투여된 약물의 전형적인 "들쭉날쭉한" 프로파일과 비교하였을 때, 최고점 및 최저점에 대한 평탄화된 그래프), 더 낮은 Cmax는 환자에게 유익할 수 있다.
예를 들어, 인자 VIIa는 상기와 같은 문제를 보여주며, 변형은 그에 대한 본 발명의 해결안임을 제시한다. 인자 VII 및 VIIa의 인간에서의 순환 반감 시간은 약 2-4시간 정도이다. 즉, 2-4시간 이내에 혈청 중 펩티드의 농도는 절반으로 감소된다. 인자 VIIa가 특정 형태의 혈우병을 치료하기 위한 응고촉진제로서 사용될 때, 표준 프로토콜은 VIIa를 고투여량 (45 내지 90 ㎍/kg 체중)으로 매 2시간마다 주사하는 것이다 (문헌 [Hedner et al., Transfus. Med. Rev. 7: 78-83 (1993)] 참조). 따라서, 상기 단백질을 응고촉진제로서, 또는 항응고제로서 (인자 VII의 경우) 사용될 때, 상기 단백질은 빈번한 간격으로 및 고투여량으로 투여되어야 한다.
앞서 상기 치료학적 생성물의 물리화학적 특징을 개선시키는 데 있어 바이오제약의 생체적합성 중합체에의 컨쥬게이션이 성공적으로 사용되어 왔다. 컨쥬게이션을 통해 개선된 단백질의 특징으로는 PK, PD 및 면역원성을 포함한다. 화학적 모이어티를 단백질에 부착시키면 그의 순환 반감기는 유의적으로 증가될 수 있다 (문헌 [Jevsevar et al., Biotechnol . J., 5: 113-128 (2010)]). 분자량이 사구체 여과 한계 미만인 분자종의 경우, 분자량이 큰 모이어티의 컨쥬게이션을 통해 상기 생성물은 신장 제거 (renal clearance)되지 못한다. 또한, 화학 모이어티를 제약 생성물에 첨가하면 입체 장애를 통해 분자의 수용체 매개 제거를 방해할 수 있다.
치료약의 친수성을 증가시키는 변형 분자, 예컨대, 생체적합성 중합체를 사용하면, 이는 또한 도입된 치료약에 대한 면역 반응을 감소시키거나, 그를 예방하는 데에도 도움이 될 수 있다. 변형은 상기 약 주변에 "물 차폐막"을 제공할 수 있으며, 이는 다르게는 면역계의 반응을 유발할 수 있는 임의의 에피토프를 "은폐"시킬 수 있다. 변형된 치료약 주변의 물 분자의 존재는 상기 치료약이 수용액 중에 존재할 때 포접 화합물 구조를 형성할 수 있다.
추가로, 상기 약을 피하 전달할 수 있도록 하기 위해 변형을 사용하면, 많은 투여량의 볼루스 주사 또는 정맥 내 주입과 관련된 반응, 예컨대, 특정 항생제의 정맥 내 투여와 관련된 "레드맨 신드롬(red-man syndrome)"을 회피하면서, 림프계를 통해 신체 내로 치료약을 점진적으로 도입할 수 있다.
따라서, 상기 치료약을 피하 전달용으로 변형시키고, 후속되는 림프계를 통한 혈관계 내로 주입함으로써 많은 이점이 구상될 수 있다.
따라서, 본 발명은 제1 측면으로서, 환자에게 치료약을 피하로 투여하는 단계를 포함하며, 이로써 Cmax:Caverage 비가 정맥 내로 전달된 상기 약의 Cmax:Caverage 비보다 낮고, 여기서, 상기 약은 친수성을 증가시키고, 치료약의 천연 상태와 관련된 분자 치수를 변형시키기 위해 변형된 것인, 환자에게 치료약을 투여하는 방법을 제공한다. 피하 투여로 상기 약은 정맥 내 투여와 비교하였을 때, 치료 기간 동안 환자의 혈류 중에 더욱 일관된 농도로 존재하게 되고, 이로써 Cmax:Caverage 비는 감소될 수 있다.
치료약이 주사 부위에서 환자의 순환계로 직접 진입하지 못하도록, 치료약을 피하로 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 변형된 약이 투여 부위로부터 직접 순환계로 진입하지 못하도록 친수성을 증가시키고, 치료약의 천연 상태와 관련된 분자 치수를 변형시키기 위해 상기 약을 변형시킨 것인, 환자의 림프계에 치료약을 투여하는 방법 또한 제공한다.
환자에게 상기 변형된 약을 피하로 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 약은 친수성을 증가시키고, 치료약의 천연 상태와 관련된 분자 치수를 변형시키기 위해 변형된 것인, 환자에게로의 치료약의 피하 투여시 치료약이 환자의 국소 순환계 내로 직접 진입하지 못하게 방해하는 방법을 추가로 제공한다.
상기 변형된 약의 피하 투여를 통해 정맥 내 볼루스 주사에 의한 것보다 더 높은 고용량의 약을 환자에게 투여할 수 있고; 환자는 상기 변형된 약을 정맥 내로 투여하는 경우보다 더 먼저 재-투약받을 수 있고; 상기 변형된 약의 정맥 내 투여보다 더 적거나 또는 그와 등가인 면역원성 반응을 일으키는데; 이를 통해 정맥 내로 투여되었을 때의 상기 변형된 약의 치료학적 이점보다 12시간 이상 더 긴 지속 기간 동안 치료학적 이점을 환자에게 제공할 수 있고; 약은 정맥 내로 안전하게 전달될 수 있는 상기 변형된 약의 농도보다 더 높은 농도로 전달가능하다.
친수성은 적어도 상기 변형된 약의 분자 치수 대 비상기 변형된 약의 분자 치수의 비에 의해 증가된다. 친수성이란, 본 발명과 관련하여 표면 부착에 대한 능력은 더 낮고, 물 중 분산성은 더 높은 것을 암시하는 물과의 친화도로서 정의될 수 있는 친수성 대 친유성 평형 (HLB)을 의미한다.
본 발명의 방법은 치료약을 변형시켜 상기 치료약의 친수성을 변경시키는 단계를 포함하며, 여기서, 친수성 수준은 생체이용률 수준과 비례하는 것인, 대상체에서 피하 데포 (depot)로부터 치료약을 전달하는 속도를 조절하는 방법을 제공한다.
놀랍게도 피하 공간으로부터의 데포 방출 지속 기간을 최장기화시키기 위해서는 변형 정도는 더 낮아야 한다는 것을 발견하게 되었다. 이론에 의해 제한하지 않으면서, 이는 치료약 중 일부를 피하 조직에 노출시키는 변형의 정도를 적게 하면 림프를 통한 확산 속도가 저속화된다는 것에 의해 합리적으로 설명될 수 있다. 반대로, 더 높은 정도의 변형은 생성물이 완전히 자유롭게 혈액 순환으로 빠르게 진입할 수 있게 방치하는 치료약을 포함한다.
또한, 생체이용률은 더욱 고도로 변형된 치료약, 즉, 단일 변형된 종과 비교하여 이중 또는 삼중 변형된 종에 유리한 것으로 나타났다. 이에, 본 발명자들은 변형 및 수화 정도가 높을수록 이동성 및 이에 따른 생체이용률이 더 높은 정도로 개선된다는 것을 확인할 수 있었다.
결과적으로, 임의의 주어진 치료약의 경우, 피하 데포로부터의 방출은 이제 치료약의 변형 수준을 증가 또는 감소시킴으로써 조절될 수 있다.
본 발명에 따르면, 피하 전달은 피하 주사, 국부 적용, 경피용 패취, 미세피부 박피, 고압 건식 분제 전달, 또는 치료약을 피하 공간으로 도입하는 임의의 다른 방법에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 치료약 및 변형을 포함하는 상기 변형된 약으로서, 여기서, 변형은 제1 및 추가 측면에 따른 방법에서 사용하기 위해 친수성을 증가시키고, 치료약의 천연 상태와 관련된 약의 분자 치수를 변형시키는 것인 상기 변형된 약을 제공한다. 약의 변형은 친수성을 50% 이상만큼 증가시킬 수 있고, 치료약의 천연 상태와 관련된 약의 분자 치수를 50% 이상만큼 증가시킬 수 있다.
시판되는 수개의 바이오제약 제품에서 사용되어 온 생체적합성 중합체의 예로는 폴리에틸렌 글리콜 (본원에서 PEG로 지칭됨)이 있다. PEG 분자를 또 다른 분자에 공유적으로 부착시키는 공정을 페길화라고 명명한다. 현재까지는 페길화된 제품 9종이 FDA 시장 승인을 받은 상태이며, 4개, 페크인트론(PegIntron)® (쉐링-푸라우(Schering-Plough)), 페가시스(Pegasys)® (호프만-라 로슈(Hoffman-La Roche)), 뉴라스타(Neulasta)® (암젠(Amgen)) 및 미세라(Micera)® (호프만-라 로슈)는 블록버스터 약물이다. 단백질 치료약을 활성화된 PEG 분자에 컨쥬게이트시키는 데 다수의 상이한 화학물질이 사용되어 왔다. 단백질 상의 아미노 기를 통해 단백질에 PEG 모이어티를 공유적으로 연결시키는 데 무작위 페길화가 성공적으로 사용되어 왔다. 부착 부위는 전적으로 그러한 것은 아니지만, 가장 빈번하게는 리신 잔기 측쇄 상의 ε-아미노 기였다. 상기와 같은 무작위 반응을 통해서는 PEG 모이어티 부착 개수 및 부위가 다른 컨쥬게이트로 이루어진 매우 복합적인 혼합물이 생산될 수 있다. 심지어 무작위 컨쥬게이션 반응의 정제 이후에도 위치 이성질체가 존재할 수 있으며, 이는 물리화학적 및 제약 특징이 매우 상이하다는 것을 입증한다. 다수의 부위-특이 페길화 기법이 개발되었고, 이는 현재 더욱 잘 정의된 바이오제약을 생산하는 데 사용되고 있다. 부위-특이 페길화가 이루어지도록 하기 위해 취하는 접근 방법으로는 N-말단, 시스테인, 글리칸, 이황화 및 폴리히스티딘 표적화된 페길화를 포함한다.
펩티드의 면역원성을 감소시키기 위해 펩티드 치료약을 유도체화하기 위해 PEG를 사용하는 것이 입증된 바 있다. 예를 들어, US 4179337에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜에 커플링된 비-면역원성 폴리펩티드, 예컨대, 효소 및 펩티드 호르몬이 개시되어 있다. 면역원성 감소 이외에도, 해당 폴리펩티드의 PEG-컨쥬게이트의 크기 증가에 기인하여 순환에서 제거 시간은 연장된다.
PEG, 및 그의 유도체를 펩티드에 부착시키는 주된 모드는 펩티드 아미노산 잔기를 통한 비-특이적 결합이다 (US 4088538, US 4496689, US 4414147, US 4055635, 및 WO 87/00056 참조). PEG를 펩티드에 부착시키는 또 다른 모드는 당펩티드 상의 글리코실 잔기의 비-특이적인 산화를 통해서 이루어진다 (WO 94/05332 참조).
상기 비-특이적인 방법에서, 폴리에틸렌글리콜은 무작위, 비-특이적 방식으로 펩티드 골격 상의 반응성 잔기에 첨가된다. 물론, PEG 분자를 무작위로 첨가하는 것에는 최종 생성물의 균질성 부족, 및 펩티드의 생물학적 또는 효소적 활성의 감소 가능성을 비롯한, 그의 단점들이 있기는 하다. 그러므로, 치료학적 펩티드를 제조하기 위해서는, 특이적으로 표지화되고, 쉽게 특징이 규명될 수 있으며, 본질적으로 균질성인 생성물이 생성되는 유도체화 전략법이 우수하다.
치료약, 예컨대, 재조합 혈액 응고 인자, 예컨대, FVIIa, FVM I 및 FIX의 페길화의 최신 동향은 하기와 같이 요약될 수 있다. WO 98/32466에서는 FVII이 페길화될 수 있지만, 대상체에 대한 어떤 추가 정보도 포함하지 않는다는 것이 제안되었다. US 2008/0200651에서는 인공적으로 도입된 시스테인 잔기를 통해 PEG 분자가 컨쥬게이트된, 야생형, 또는 증가된 활성을 가지는 FVII 폴리펩티드가 생체내 반감기 증가를 입증하였다는 것이 제안되었다. US 2008/0221032에는 FVIIa-폴리시알산 컨쥬게이트를 제조함으로써 생체내 반감기가 유의적으로 증가되었음을 입증하는 분자가 생성되었다는 것이 기술되어 있다. US 2009/0176967에는 생체적합성 중합체, 예컨대, PEG가 커플링될 수 있는 FVII 폴리펩티드의 C-말단에 특이 작용기를 도입시키는 데 효소가 작용될 수 있다는 것이 교시되어 있다. US 2009/0227504에는 하나 이상의 아스파라긴 및/또는 세린 연결 올리고당 쇄가 1종 이상의 중합체 기로 공유적으로 변형되어 있는, 혈청 반감기가 개선되어 있음을 입증하는 FVIIa (또는 FVIIa-유사 분자) 제제가 기술되어 있다. US 2010/0028939에는 효소 갈락토스 옥시다제를 사용하여 천연 당단백질을 변형시켜 글리칸 말단 상의 반응성 알데히드 작용기를 생산할 수 있는 방법이 기술되어 있다. 이어서, 반응성 알데히드를 사용하여 중합성 모이어티를 단백질에 컨쥬게이트시킴으로써 약리학적 특징이 개선된 생성물을 생산할 수 있다. US 2010/0056428에는 글리코실 기에서 중합성 모이어티, 예컨대, PEG의 옥심에 의한 당단백질의 유도체화에 의해 FVIIa의 약동학적 특징을 개선시킬 수 있다는 것이 제안되어 있다. FVIII 및 FIX와 관련된 상응하는 보고는 공개되어 있으며, 이는 각각 US 2008/0255026 및 US 7683158을 참조할 수 있다.
단백질을 페길화 시키는 또 다른 접근법은 폴리테릭스(Polytherics)에 의해 개발되었고, 이는 PEG 중합체가 단백질 중 한쌍의 시스테인 잔기의 환원된 이황화 결합을 통해 관심 단백질에 부착되어 있는, 테라PEG(TheraPEG)™로 알려져 있다 (WO 2005/007197). 상기 기법은 인자 FIXa로부터의 오염이 없는 인자 IX의 페길화된 버전 (WO 2009/130602), 페길화된 인자 VII (WO 2011/135308) 및 페길화된 인자 VIII (WO 2011/135307)을 제조하는 데 사용되어 왔다
이에, 변형된 치료약, 예컨대, 혈액 응고 인자의 페길화된 형태를 피하 투여할 경우, 특히 "용량이 조절되었을 때"에는 정맥 내 투여에 의해 전달되는 등가 형태와 비교하면, 반감기가 개선될 수 있고, 혈장 중에서의 활성은 연장될 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 발견되었다. 피하 주사가 제공되는 특정 위치는 상기 변형된 약이 혈액계에서 출현하게 되는 개시 시간을 증가 또는 감소시킬 수 있다. 어느 경우에서든, Cmax:Caverage 비는 더 낮아진다; 보통 지속 방출형 제제 등과 관련된 유사한 약동학적 프로파일이 관찰된다. 비변형된 치료약을 피하로 투여할 경우 단점은 상기 치료약이 심혈관계로 직접 진입할 수 있으며, 이로써 생성된 Cmax 및 지속 기간은 대개 피하 주사 부위의 혈관 상태에 따라 달라진다는 점이다. 고도로 혈관화된 영역은 명백하게는 약이 상기 부위로 피하 주사에 의해 투여되었을 때에 혈관화가 더 적게 이루어진 부위로의 주사보다 더 빠르게 일정량의 약을 흡수할 것이다. 상기와 같은 모순은 본 발명의 피하 전달용의 상기 변형된 약을 사용함으로써 극복될 수 있다.
본 발명에 따른 변형된 치료약을 제공함으로써 분자를 림프계를 통해 심혈관계로 전달할 수 있으며, 따라서, 상기 치료약 제공은 주사 부위의 맥관 구조와는 상관이 없는 바, 림프계를 통해 더욱 예측가능하고, 일관된 속도로 순환 내로 전달할 수 있다.
혈액 응고 인자를 비롯한, 치료약의 제제화에 대한 당업계의 선행 고찰은 피하 투여용으로 상기 인자를 제제화하는 것으로부터 도출될 수 있는 이점을 감지하지 못했다. 특히, 피하로 투여되었을 때 상기 제제는 장기간 동안 정상 지혈을 전달할 수 있고, 유지시킬 수 있거나, 또는 항정 주입 효과가 달성된 것에 기인하여, (Cmax:Caverage짐 또는 제안도 없었다. 혈관벽이 콜라겐을 함유하는 림프계는 수성 유체를 제공한다. 너무 크기 때문에 혈관벽을 통과하지 못하는 임의 분자는 혈액에 도달하기 위해서는 림프 배액에 의존하여야 한다. 그러나, 분자에 소수성 특징이 어느 정도 존재할 경우, 조직이 림프계에 진입하기 전 조직에 및 림프관벽, 둘 모두에 부착될 수 있고, 이에 유체 중에서 부동성이 될 것이다. 반대로, 친수성 모이어티가 제공될 경우, 상기 변형된 약은 림프의 수성 상에 더욱 쉽게 분산될 것이며, 흉관에서 혈류로 진입하여 상기 림프계 내로 쉽게 배수될 것이다.
임의 측면의 치료약은 소분자, 거대분자, 중합체 및 폴리펩티드일 수 있고, 여기서, 소분자로는 최면제 및 진정제, 항부정맥제, 항산화제, 항천식제, 피임제, 교감신경흥분제, 이뇨제, 지질 조절제, 항안드로겐제를 비롯한 호르몬제, 항기생충제, 항응고제, 신생물제, 항신생물제, 혈당강하제, 정신 자극제, 신경안정제, 호흡기 약물, 항경련제, 근이완제, 항파킨슨제 (도파민 길항제), 시토카인, 성장 인자, 항암제, 항혈전제, 혈압강하제, 심혈관 약물, 진통제, 항염증제, 항불안성 약물 (항불안제), 식욕 억제제, 항편두통제, 근육 수축제, 항감염제 (항생제, 항바이러스제, 항진균제, 백신), 항관절염제, 항말라리아제, 구토 방지제, 항간질제, 기관지 확장제, 영양제 및 보충제, 성장 보충제, 항장염제, 백신, 항체, 진단제, 및 조영제를 포함한다.
본 발명에서 사용하는 데 적합한 약의 예로는 칼시토닌, 에리트로포이에틴 (EPO), 세레다제, 세레자임, 시클로스포린, 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF), 트롬보포이에틴 (TPO), 알파-1 프로테이나제 억제제, 엘카토닌, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GMCSF), 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬 (HGH), 성장 호르몬 방출 호르몬 (GHRH), 헤파린, 저분자량 헤파린 (LMWH), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터루킨-1 수용체, 인터루킨-2, 인터루킨-1 수용체 길항제, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-6, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH), 인자 IX 인슐린, 프로인슐린, 인슐린 유사체 (예컨대, 미국 특허 번호 제5,922,675호에 기술된 바와 같은 모노-아실화된 인슐린), 아밀린, C-펩티드, 소마토스타틴, 소마토스타틴 유사체 (옥트레오티드 포함), 바소프레신, 여포 자극 호르몬 (FSH), 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 인슐린트로핀, 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 신경 성장 인자 (NGF), 조직 성장 인자, 각질세포 성장 인자 (KGF), 신경아교세포 성장 인자 (GGF), 종양 괴사 인자 (TNF), 내피 성장 인자, 부갑상샘 호르몬 (PTH), 글루카곤-유사 펩티드 티모신 알파 1, IIb/IIIa 억제제, 알파-1 항트립신, 포스포디에스테라제 (PDE) 화합물, VLA-4 억제제, 비스포스포네이트, 호흡기 신시티움 바이러스 항체, 낭성 섬유증 횡단막 조절인자 (CFTR) 유전자, 데옥시리보뉴클레아제 (Dn아제), 항슈도모나스 페니실린, 예컨대, 카르베니실린, 티카르실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 및 피페라실린; 세팔로스포린, 예컨대, 세프포독심, 세프프로질, 세프티부텐, 세프티족심, 세프트리악손, 세팔로틴, 세파피린, 세팔렉신, 세프라딘, 세폭시틴, 세파만돌, 세파졸린, 세팔로리딘, 세파클로르, 세파드록실, 세팔로글리신, 세푸록심, 세포라니드, 세포탁심, 세파트리진, 세파세트릴, 세페핌, 세픽심, 세포니시드, 세포페라존, 세포테탄, 세프메타졸, 세프타지딤, 로라카르베프, 및 모사락탐, 모노박탐, 예컨대, 아즈트레오남; 살균/투과 증가 단백질 (BPI), 항CMV 항체, 13-시스 레티노산, 마크롤라이드, 예컨대, 에리트로마이신, 올레안도마이신, 트롤레안도마이신, 록시트로마이신, 클라리트로마이신, 다베르신, 아지트로마이신, 플루리트로마이신, 디리트로마이신, 조사마이신, 스피라마이신, 미데카마이신, 류코마이신, 미오카마이신, 로키타마이신, 안다지트로마이신, 및 스위놀라이드 A; 플로로퀴놀론, 예컨대, 시프로플록삭신, 오플록삭신, 레보플록삭신, 트로바플록삭신, 알라트로플록삭신, 목시플록삭신, 노르플록삭신, 에노삭신, 그레파플록삭신, 가티플록삭신, 로메플록삭신, 스파르플록삭신, 테마플록삭신, 페플록삭신, 아미플록삭신, 플레록사신, 토수플록삭신, 프룰리플록삭신, 이르록삭신, 파주플록삭신, 클리나플록삭신, 및 시타플록삭신, 아미노글리코시드, 예컨대, 겐타마이신, 네틸마이신, 파라메신, 토브라마이신, 아미카신, 카나마이신, 네오마이신, 및 스트렙토마이신, 반코마이신, 테이코플라닌, 라모플라닌, 미데플라닌, 콜리스틴, 답토마이신, 그라미시딘, 콜리스티메테이트, 폴리믹신, 예컨대, 폴리믹신 B, 카프레오마이신, 바시트라신, 페넴; 페니실린, 예컨대, 페니실리나제-감수성 약, 예컨대, 페니실린 G, 페니실린 V, 페니실리나제-저항성 약, 예컨대, 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플록사실린, 나프실린; 그람 음성 미생물 활성제, 예컨대, 암피실린, 아목시실린, 및 헤타실린, 실린, 및 갈암피실린; 및 카르바페넴, 예컨대, 이미페넴, 메로페넴, 펜타미딘 이세티오네이트, 알부테롤 술페이트, 리도카인, 메타프로테레놀 술페이트, 베클로메타손 디프로피오네이트, 트리암시놀론 아세트아미드, 부데소니드 아세토나이드, 플루티카손, 이프라트로피움 브로마이드, 플루니솔리드, 크로몰린 소듐, 에르고타민 타르트레이트, 및 적용가능한 경우, 상기 것의 유사체, 효능제, 길항제, 억제제, 및 제약상 허용되는 염 형태, 항생제, 혈액 인자, 호르몬, 성장 인자, 또 다른 치료학적 펩티드 또는 단백질, 또는 모노클로날 항체 또는 소분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합하게는, 변형시키고자 하는 약은 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 및 단백질 C로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈액 응고 인자는 적합하게 인자 VII, 인자 VIII 또는 인자 IX이다.
본 발명에 따른 약은 임의의 생체적합성 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리포스파티딜 콜린 (PC), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리에틸렌 옥시드 (PEO), 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리올레핀 알콜, 폴리히드록시알킬메타크릴레이트, 다당류, 폴리 α-히드록시산, 폴리비닐 알콜, 폴리포스포스파스파젠, 폴리 N-아크릴로일모르폴린, 폴리알킬렌 옥시드 중합체, 폴리말레산, 폴리 DL-알라닌, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 전분 또는 전분 유도체, 히알루론산, 키틴, 폴리메타크릴레이트, 폴리시알산 (PSA), 폴리히드록시 알카노에이트, 폴리 아미노산 및 그의 조합에 의해 변형될 수 있다. 생체적합성 중합체는 직선형 또는 분지형 구조를 가질 수 있다.
추가의 실시양태에서, 생체적합성 중합체는 알부민, 트랜스페린, 모노클로날 항체, 항체 단편, 예를 들어, 단일 도메인 항체, VL, VH, Fab, F(ab')2, Fab', Fab3, scFv, 디-scFv, sdAb, Fc를 비롯한, 면역글로불린, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는 단백질이다.
일부 실시양태에서, 피하로 전달되는 변형된 치료약의 친수성/가용성 증가를 통해 상기 약은 정맥 내로 전달되는 경우에서보다 더 높은 농도로 전달 매질 중에서 구성될 수 있다. 약물 제품이 주사에 의해 투여되는 경우, 상기를 통해 보다 소량의 주사량이 사용될 수 있으며, 이는 피하 투여에 더욱 적합하다. 추가로, 보다 고농도일 때 비상기 변형된 약에서 자기 촉매 반응이 일어날 것으로 예측될 수 있는 경우에는, 변형을 통해 상기 약의 자기 분해는 일어나지 못하게 되는데, 비변형된 형태에서의 자기 분해는 바람직하지 못하고 위험한 부산물을 생성할 수 있다. 예를 들어, 비변형된 혈액 인자 IX는 고농도에서 자기 촉매 반응을 통해 인자 IXa를 생산하게 되는데, 이는 위험한 혈전성을 띤다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 변형된 치료약의 피하 전달 부피는 2 ml 이하이다. 적합하게, 전달 부피는 5 ㎕, 10 ㎕, 25 ㎕, 50 ㎕, 100 ㎕, 250 ㎕, 500 ㎕, 750 ㎕, 또는 1 ml일 수 있다. 대체 실시양태에서, 약의 전달 부피는 1.5 ml, 2 ml, 2.5 ml, 3.0 ml 또는 3.5 ml 이하일 수 있다. 환자의 혈류 내로 직접 전달되는 것이 아니기 때문에, 본 발명을 통해 더 높은 고농도의 활성제가 정맥 내 주사에 의한 것보다 더 안전하게 단일 피하 주사로 전달될 수 있다는 것에 주목하는 것이 중요하다. 정맥 내로 투여된 고농도의 혈액 응고 인자는 환자에서 바람직하지 못하고, 위험한 혈전을 유발할 수 있는 바, 이는 특히 혈액 응고 인자를 다룰 때에 중요하다. 피하 전달을 하면 활성제를 림프계를 통해 혈류 내로 항정 상태로 주입할 수 있고, 이로써 혈액계로 직접 전달되는 활성제의 위험 수준의 효과를 피할 수 있다. 그러므로, 혈류 내로의 약의 전달 농도는 환자의 림프계에 의해 조절되는 바, 더 높은 고농도가 피하 투여량으로 전달될 수 있고, 이로써, 전통적으로 정맥 내 전달로 사용되는 부피보다 더 소량의 부피가 사용될 수 있다.
림프계를 통해 순환계에 도달하도록 하기 위해, 혈관벽을 통해 혈관계 내로 직접 진입하지 못하도록 막기 위한 목적으로 친수성을 증가시키고, 분자 치수를 변형시키는 친수성 변형에 의해 변형될 수 있고, 피하 전달을 통해 환자에게 투여가능한 치료약이 본 발명의 범주 내에 포함된다. 상기 약을 변형시키는 방법 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 투여 형태는 1일 1회 이상, 1일 2회 이상, 주당 약 1회, 주당 약 2회, 2주당 약 1회, 또는 월 약 1회로 투여하기 위한 것일 수 있다. 변형된 치료약의 피하 데포로부터의 방출 속도를 조절할 수 있는 능력은 투여가 더욱 편리하게 조절될 수 있다는 것을 의미한다.
특정의 치료학적 물질의 경우, 1일 1회 투여 요법이 충분하겠지만, 다른 물질의 경우에는 더욱 빈번한 투여 요법이 더욱 적절하거나, 바람직할 수 있으며, 이 경우, 피하로 투여되는 각 투여량으로 전달되는 양은 표준 정맥 내 투여량에 비해 감소된 양일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 투여 형태는 1일 1회, 1일 2회 (또는 필요할 경우, 그 초과로) 투여될 수 있다.
본 발명을 통해 혈액 중 약의 농도가 빠르게 상승한 후, 이어서 하락하는 것 (즉, "들쭉날쭉한" 것)을 막을 수 있다. 본 발명은 비상기 변형된 약 또는 동일한 변형된 생성물을 정맥 내로 반복 전달하였을 때 전통적으로 관찰되는 기간보다 더 긴 장기간 동안에 걸쳐 환자의 혈액 중 약을 더욱 일관되고, 예측가능한 농도로 제공한다.
본 발명의 추가의 이점은 정맥 내로 안전하게 투여될 수 있는 용량보다 더 높은 고용량으로 약을 피하로 투여할 수 있다는 점이다. 이를 통해서는 정맥 내 전달을 통해서 보다 고용량의 투약 또는 더욱 빈번한 투약에 의해 보통 안전하게 달성될 수 있는 이점보다도 더욱 장기간의 지속 기간에 걸쳐 치료학적 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, 혈액 인자의 경우, 상기 생성물은 흉관을 통해 쇄골하 정맥 내로 전달되기 때문에, 본 방법을 통해서는 단일 시점에 정맥 내로 정맥 내 투여될 수 있는 것보다 더 많은 다량의 생성물이 단일 시점에 단일 용량으로 피하로 투여될 수 있다. 고용량의 볼루스를 정맥 내로 전달하면 바람직하지 못한 혈전성 사례가 유발될 수 있다.
본 발명의 추가의 이점을 통해서는 약의 혈중 농도가 일관된 수준으로 유지될 수 있도록 하는 간격으로 약을 재투약할 수 있으며, 이로써 혈액 중 약의 농도가 치료학상 관련없는 수준으로 하락할 때까지 재투약을 기다려야 할 필요없이, 지속적으로 일정하고 예측가능한 치료학적 효과를 제공할 수 있다. 전통의 실행에서는 정맥 내 재투약은 그의 즉각적인 Cmax 및 작용 개시와 함께, 치료약 수준이, 신규 주사로부터의 Cmax 첨가가 잠재적으로 혈전성 수준에 도달하지는 못하지만 (즉, 유해 사례의 위험은 감소되지만), 환자가 그 자신의 혈류 중 약의 수준이 "건강하지 못한" 범위에 도달한 것을 의미하는 수준으로까지 하락한 것으로 추정될 때까지 지연된다. 다시 말해, 약이 혈류 중에 여전히 "건강한 수준" 또는 치료학적 효과적인 수준으로 존재하는 동안에는 보통 환자에게 약의 후속 투약을 제공하지 않는다. 그러나, 본 발명을 통해서는 약의 혈중 수준이 여전히 치료학상 효과적인 범위에 존재하는 동안에도 약을 재투약할 수 있으며, 이로써 본 발명은 예방에 더욱 이상적으로 적합한, 혈류 중 단백질을 더욱 일관된 치료학적 수준으로 제공할 수 있다. 흉관을 통해 혈류 내로 약을 일관되게 전달할 수 있기 때문에, 혈류 중 약이 바람직하지 못하게 높은 수준으로까지 증가하는 것에 관한 문제는 피할 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따라, 대상체에게 피하 투여하기 위한 것으로 제제화되었을 때, 상기 대상체에서 전체 혈액 응고 시간을 20분 이하로 유지시키는 데 충분한 투여 형태를 월 1회 이하로 제공하는, 피하 투여용의, 변형된 혈액 응고 인자로 이루어진 제약 조성물의 투여 형태를 제공한다. 투여 형태의 Cmax가 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 10% 이상 내지 90% 이하인 것인, 혈액 응고 장애 치료에 사용하기 위한 것으로서, 월 1회 이하로 피하 투여하기 위한, 페길화된 혈액 응고 인자로 이루어진 액체 투여 형태 또한 제공한다. 적합하게, Cmax는 20% 내지 80%, 또는 30% 내지 70%, 또는 40% 내지 60%이다. 적합하게, 혈액 응고 인자는 FVII, FVIII, 또는 FIX일 수 있다.
"이하"는 투여 형태가 명시된 기간보다 더욱 빈번하게 투여될 수는 있지만, 반드시 그러할 필요는 없음을 의미하며; 상기 투여 형태의 피하 투여 효과는 효과가 그 기간 동안 지속적으로 관찰된다는 것을 의미한다. 그러나, Cmax가 더 낮고, 일관되기 때문에, 부작용 없이 환자에게 더욱 빈번하게 투약될 수도 있다.
적합하게, 혈액 응고 인자의 투여 형태는 상기 대상체에서 전체 혈액 응고 시간을 15분 미만으로, 또는 적합하게, 12분 미만으로 유지시키는 데 충분할 수 있다. 한 실시양태에서, 혈액 응고 인자의 투여 형태는 1주 1회 이상용의 투여 형태, 또는 월 1회 이상, 2주당 1회 이상, ½주당 1회 이상용의 투여 형태이다.
본 발명에 따른 투여 형태는 인자 VIIa, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIII, 인자 V, 폰 빌레브란트 인자 및 단백질 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 혈액 응고 인자를 포함할 수 있다. 적합하게, 혈액 응고 인자는 FVII, FVIII, 또는 FIX일 수 있다.
본 발명의 투여 형태는 본원에서 정의된 바와 같이, 임의의 생체적합성 중합체에 의해 변형될 수 있다. 적합하게, 변형은 페길화이다.
투여 형태의 Cmax는 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 10% 이상 내지 90% 이하일 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 형태의 Cmax는 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 10% 내지 25%일 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 형태의 Cmax는 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 40% 내지 60%일 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 형태의 Cmax는 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 75% 내지 80%일 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 형태의 Cmax는 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 75% 또는 78.8%일 수 있다. 한 실시양태에서, Cmax는 75 내지 80%이고, 혈액 인자는 FVII일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Cmax는 10% 내지 25%이고, 혈액 인자는 FVIII일 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, Cmax는 40% 내지 60%이고, 혈액 인자는 FIX일 수 있다.
투여량이 1 내지 1,000 IU/kg, 또는 5 내지 500 IU/kg, 또는 100 내지 250 IU/kg 또는 25 내지 50 IU/kg인 것인, 본 발명에 따른 투여 제제 또한 제공한다.
본 발명의 투여 형태를 통해서는 투여 형태를 덜 빈번하게 투약할 수 있으며, 이는 대상체에서 전체 혈액 응고 시간을 20분 이하, 또는 15분 이하, 또는 10분 이하로 유지시키는 데에는 여전히 충분하다. 한 실시양태에서, 투여 형태는 전체 혈액 응고 시간을 12분 미만으로 유지시키는 데 충분하다. 투여 형태는 2주당 1회 이하, 주 1회 이하, 주 2회 이하, 매 3일마다 1회 이상, 매 2일마다 1회 이하, 1일 1회 이하, 또는 더욱 빈번하거나, 덜 빈번한 투여 형태를 제공한다.
본 발명의 한가지 이점은, 약이 혈액 응고 인자일 때 투여 형태는, 전체 혈액 응고 시간을 계속해서 건강한 범위로 유지시키기 위한 목적으로 상기 간격보다 더욱 빈번하게 환자에게 투여될 필요는 없지만, 방출 조절형 제제의 것과 유사한 "항정 상태"를 제공하는 데 도움을 주기 위해서 더욱 빈번하게 투여될 수 있다는 점이라는 것에 주목하는 것이 중요하다. '정상' 전체 혈액 응고 시간은 일반적으로 당업자에 의해 10 내지 12분인 것으로 간주되고, 15분 미만인 임의의 시간도 혈우병을 앓지 않은 인간에서는 건강한 것으로 간주된다. 일단 전체 혈액 응고 시간이 20분을 초과하고 나면, 이는 건강하지 않은 범위로 간주된다. 15 내지 20분은 비록 출혈이 제어하에 있기는 하지만, 정상이 아닌 것을 나타내는 것으로 간주된다.
또 다른 실시양태에서, 투여 형태는 볼루스 정맥 내 주사의 혈장 반감기에 의해 예측되는 것보다 덜 빈번하게 투여된다. 예를 들어, 변형된 인자 IX의 볼루스 주사는 주 1회인 것을 필요로 할 수 있는 반면, 본 발명에 따른, 피하로 전달되는 동일한 약은 단지 10일당 1회 이하인 것을 필요로 할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에 따라, 혈액 응고 인자를 정맥 내로 투여하는 것과 동일한 빈도로 또는 그보다 덜 빈번하게 피하 투여하기 위한, 25 내지 50 IU/kg의 변형된 혈액 응고 인자로 이루어진 제약 조성물의 투여 형태를 제공한다.
그러므로, 본 발명의 제제는 최대 7일까지 지혈 정상값을 유지시킬 수 있는데, 여기서, 정상값은 전체 혈액 응고 시간 (WBCT)이 15분 미만, 적합하게는 약 12분 이하인 것으로 정의된다.
본 발명의 제제의 Cmax는 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 10% 이상 90% 이하이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 값은 75%, 78% 또는 80% 이상일 수 있고, 혈액 인자는 FVII일 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 값은 15%, 18% 또는 20% 이상일 수 있고, 혈액 인자는 FVIII일 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 상기 값은 40%, 45% 또는 50% 이상일 수 있고, 혈액 인자는 FIX일 수 있다.
상기 변형된 약이 페길화된 혈액 인자인 것인, 본 발명의 구체적인 실시양태의 제제는 월 1회 이하 피하 투여용으로 제제화될 때, 25 내지 50 IU/kg의 투여량을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여량은 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 IU/kg일 수 있다. 투여량은 25 IU/Kg 내지 30 IU/Kg, 35 IU/Kg 내지 40 IU/Kg, 또는 40 IU/Kg 내지 50 IU/Kg일 수 있다.
한 실시양태에서, 투여 형태가 150 IU/Kg의 용량으로 제조되었을 때, 상기 제제는 그를 필요로 하는 대상체에게 매 2주당 1회 투여하는 데 적합할 수 있다. 상기 제제는 매 2주당 1회 이하로 투여하는 데 적합할 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따라, 변형된 혈액 응고 인자 투여 형태는 피하 투여용으로 제제화되었을 때, ½주 이상의 기간 동안 정상 지혈을 유지시킬 수 있다.
본 발명에 따른 투여 형태는 피하로 투여되었을 때, 변형된 혈액 응고(coagulation) (응고(clotting)) 인자를 동일한 치료학적 종점을 달성하는 데 필요한 양보다 더 적은 양이 되게 하며, 이로써, 치료를 필요로 하는 대상체에게 더욱 안전한 생성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 정맥 내로 투여되는 변형된 혈액 응고 인자의 조정된 용량의 절반이 대상체에서 1주 이상 동안 정상 지혈을 달성하는 데 충분하며, 특히, 여기서, 혈액 응고 인자는 인자 VIIa 또는 인자 VIII이다. 정상 지혈의 적합한 값은 상기 기술된 바와 같이, 전체 혈액 응고 시간 (WBCT)이 약 12분인 것이다.
본 발명의 제제는 적합하게는 동일한 치료학적 효과를 달성하기 위한 목적으로 동일한 변형된 혈액 응고 인자를 포함하는 정맥 내 투여용으로 제제화된 참조 제제의 용량이 조절된 치료학상 유효량의 절반보다 더 적은 양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 혈액 응고 인자는 인자 IX이다.
따라서, 본 발명은 투여 형태가 동일한 지속 기간 동안 효과적인 작용을 달성하기 위한 목적으로 정맥 내 투여에 필요한 용량이 조절된 양의 50%를 포함하는 것인, 피하 투여를 위한 변형된 혈액 응고 인자의 투여 형태를 제공한다.
피하 투여용으로 적합한 제제는 적합하게는 수성 또는 실질적으로 수성 제제로서 제조될 수 있다. 상기 제제는 상기 부가염, 보존제 및 안정제, 및/또는 필요에 따라 부형제 또는 애주번트를 포함할 수 있다. 본 발명의 투여 형태는 적합한 수성 매질 중에서 즉석으로 제제화될 수 있는 즉석 무수 분제로서 제공될 수 있다.
상기 투여 형태를 완충처리된 수성 제제로서 제제화하는 것이 일반적으로 바람직할 수 있다. 적합한 완충제 용액으로는 아미노산 (예를 들어, 히스티딘), 무기산 및 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속 염 (예를 들어, 나트륨 염, 마그네슘 염, 칼륨 염, 리튬 염 또는 칼슘 염-예시하면, 염화나트륨, 인산나트륨)을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 성분, 예컨대, 계면활성제 또는 유화제 (예를 들어, 트윈 80(Tween 80)® 또는 임의의 다른 형태의 트윈®)가 존재할 수 있고, 안정제 (예를 들어, 벤즈아미딘 또는 벤즈아미딘 유도체)이 존재할 수 있다. 부형제, 예컨대, 당 (예를 들어, 수크로스) 또한 존재할 수 있다. 적합한 pH 값은 생리학적 pH, 예컨대 pH 6.8 내지 7.4이다. 액체 투여 형태는 상기 투여 비히클 중에서 사용하기 위한 것으로 제조될 수 있다.
"변형된 혈액 응고 인자"는 상기 기술된 바와 같이 하나 이상의 변형제에 연결되어 있는 혈액 응고(coagulation) 인자 (혈액 응고(clotting) 인자)이다. 일부 실시양태에서, 상기 변형은 PEG이다. PEG 분자는 혈액 응고 인자에 직접 또는 간접적으로 연결되어 있을 수 있다. 페길화된 혈액 응고 인자는 또한 "PEG 분자에 컨쥬게이트된 혈액 응고 인자" 또는 "혈액 응고 인자-PEG 컨쥬게이트"로도 정의될 수 있다.
변형된 혈액 응고 인자 (혈액 응고 인자)는 적합하게 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 및 단백질 C 중 1종 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈액 응고 인자는 적합하게 인자 VII, 인자 VIII 또는 인자 IX이다.
본원에서 사용되는 바, "혈액 인자 컨쥬게이트"라는 용어는 상기 정의된 바와 같이 변형, 예컨대, PEG 모이어티, 다른 컨쥬게이트된 모이어티를 포함하도록 변형된 혈액 응고 인자 단백질을 의미한다.
인자 VIIa (FVIIa) 및 인자 VII (FVII)이라는 용어는 또한 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 상호교환적으로 사용된다. FVIII은 인자 VIII에 대한 약어로서 사용되고, FIX는 인자 IX에 대한 약어로서 사용되며, 본원에 기술된 혈액 인자에 대해서도 그러하다.
상기 혈액 응고 (응고) 인자는 임의의 적합한 공급원으로부터 유래된 것일 수 있고, 분자생물학적 기법을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 제조되거나, 또는 화학적으로 합성되거나, 또는 포유동물의 모유에서 유전자도입에 의해 생산된 재조합 단백질 수 있거나, 또는 상기 인자는 천연 공급원으로부터 단리된 것일 수 있다 (예컨대, 혈액 혈장으로부터 정제된 것일 수 있음). 적합하게, 상기 인자는 포유동물 혈액 응고 인자, 예컨대, 인간 혈액 응고 인자이다. 혈액 응고(clotting) 인자에 대해 언급하는 것은 혈액 응고(coagulation) 인자를 포함한다.
본원에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 하나 이상의 변형제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 중합체와의 컨쥬게이션 ("페길화")에 의해 변형된 혈액 응고 인자로 이루어진 제제에 관한 것이다. 상기 혈액 응고 인자의 변형은 임의의 편리한 수단에 의해 이루어질 수 있다.
트윈®은 현재 혈액 제품의 제제화에서 광범위하게 사용된다. 트윈®80은 트윈® 분자 1개당 대략 0.8 kDa에 등가인 분자량을 보유하는 페길화된 지방산이다.
상기 논의된 바와 같이, 혈액 인자는 모두 그 중에서도 특히 표면 부착 특성에 의해 특징이 규명되었다. 이는 효소 및 보조 인자가 캐스캐이드 중의 다른 참여 인자에, 혈소판의 표면에, 및 손상 부위의 조직에 부착되는 것을 필요로 하는 응고 캐스캐이드의 필요한 특징이다. 사실상, 혈전이 손상 부위에 그대로 남아있고, 위험한 혈전증을 유발하게 되지 않는다는 것이 특히 중요하다. 이러한 특성은 혈액 인자, 예컨대, VIIa VIII 및 IX가 임의의 유리 및 플라스틱 표면에 과도하게 부착될 수 있는 바, 약물 제품의 제제화에서 도전 과제를 제시한다. 실제로, 이는 폴리소르베이트 (예컨대, 트윈® 80)의 광범위한 사용으로 완화된다.
본 발명의 한 실시양태에서, FVIII은 그에 컨쥬게이트된 20 kDa의 직쇄 폴리에틸렌 글리콜 모이어티를 가지고 있다. PEG의 컨쥬게이션은 더 이상은 추가로 트윈® 사용을 필요로 하지 않을 정도로 상기 인자의 표면 부착 특성을 완화시킨다.
PEG-FVIII은 응고 과정에서 활성화되었을 때에도 여전히 혈소판의 표면에 부착되며, 전반적인 응고 과정에서 소형 성분이다. 이와 관련하여 혈전은 손상 부위의 혈소판 상에서 정상적인 방식으로 형성될 수 있다.
모노-페길화된 인자를 가지고, 이로써 상기 제제화에서 추가의 트윈®에 대한 요구 사항을 필요 없게 함으로써 폴리에틸렌 글리콜의 양을 감소시킬 수 있다. 코지네이트(Kogenate)® FS (바이엘(Bayer) FVIII)를 사용하여 계산함으로써 상기 제제화에 사용되는 FVIII 1 mol당 PEG의 총량을 확인하고, 그의 제제화에서 추가의 트윈®에 대해서는 어떤 요구도 없는 단일 컨쥬게이트된 20 kDa 모이어티를 비교하였다. 따라서, 용량 대 용량 기준으로 본 발명의 실시양태는 폴리에틸렌 글리콜을 25.8배 감소시키며, 이는 투약 빈도 또한 감소된 것을 고려해 볼 때, PEG 투여를 전체적으로 대략 80배 정도로 감소시킬 수 있다.
본 발명자들은 (예를 들어, 표적 치료약의 모노-페길화에 비하여 디-페길화를 통해) 표적 치료약의 함수능(water-carrying capability)을 증가시키면, 피하 투여 후 생성물의 혈류 내로의 통과 속도는 가속화될 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 역으로, 함수능을 감소시키면 (예를 들어, 생성물의 디-페길화에 비하여 생성물을 모노-페길화하면), 피하 투여 후 생성물의 혈류 내로의 통과 속도는 저속화될 수 있고, 이는 데포 효과를 제공할 수 있다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, (예컨대, 모노-페길화를 통해, 또는 더 작은 PEG 분자를 가짐으로써) 함수 능력이 더 적은 동일한 생성물은 저항성을 띠면서, (예컨대, 멀티-페길화를 통해, 또는 더욱 큰 PEG 분자의 부착을 통해) 더욱 큰 함수능을 가지도록 변형된 동일한 생성물보다 더욱 장기간 동안 피하 공간 전역에 걸쳐 분산되어 있는 것으로 보이며, 이는 증진된 데포 효과를 제공한다.
이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, (예를 들어, 디- 또는 멀티-페길화를 통해 그의 PEG 포함 범위를 증가시킴으로써, PEG 크기를 증가시킴으로써, 또는 직쇄형 PEG 분자에 비하여 분지형 PEG 분자를 사용함으로써) 생성물을 더욱 큰 함수 특징을 가지도록 디자인하는 것이 피하 공간 내에서의 수 분산성을 증가시켜 림프관을 통해 혈장 내로 진입하는 속도를 가속화시키는 것으로 보이며; (예를 들어, 모노-페길화를 통해 또는 더 작은 PEG 분자의 사용을 통해) 더 적은 함수 특징을 가지도록 디자인된 생성물의 친수성 감소는 그의 분산성을 감소시키고, 그가 수성 림프계를 통해 혈장 내로 진입하는 속도를 저속화시킴으로써 더 많은 소수성 치료약이 노출되도록 하는 것으로 보인다.
친수성 및 소수성 사이의 평형을 선택적으로 조정함으로써 피하 투여를 위한 분자의 분산 특징을 조절할 수 있는 능력을 통해서 림프를 통한 피하 공간으로부터 혈장으로의 생성물의 조절 방식의 방출을 정교한 정도로 제어할 수 있는데, 이는 치료약의 특징, 환자의 요구 및 생리 상태 또는 상기의 조합 또는 다른 영향 인자에 따라 조정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형이 PEG일 때, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 직선형 또는 분지형 구조를 가질 수 있고, 임의의 편리한 경로를 통해 치료약에 부착될 수 있다. 치료약이 단백질, 예컨대, 혈액 응고 인자 또는 본원에 기술된 다른 치료학적 단백질일 때, PEG의 컨쥬게이션은 천연 단백질 중의 세린 또는 트레오닌 잔기를 통해, 천연 단백질에 부착된 당 잔기 상의 히드록실 잔기를 통해, 또는 하나 이상의 시스테인 잔기를 통해 이루어질 수 있다. PEG 모이어티는 천연 또는 재조합 형태의 단백질 중에 존재하는 상기 잔기를 통해 부착될 수 있다. 재조합 발현에 의해 제조된 단백질을 통해 원하는 아미노산 잔기를 단백질 서열 내로 삽입시키고/거나, 특이 글리코실라제 효소를 이용하는 당화 패턴을 제어하는 부위 특이 조작이 가능해진다. 다른 페길화 경로로는 아미드 또는 N-말단 아미노 기 페길화, 또는 카르복실 기 페길화를 포함한다.
PEG 모이어티는 또한 하나 이상의 환원된 시스테인 이황화 결합을 통해 혈액 응고 인자, 즉, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C에 컨쥬게이트될 수 있다. 유리 시스테인 잔기는 단백질 중 시스틴 이황화 결합의 환원의 결과이다. 예를 들어, 컨쥬게이션은 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C 중 이황화 결합을 형성한 두 시스테인 잔기의 환 잔기를 브릿징하는 링커 기에 의해 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 이황화 결합은 천연 이황화 결합이거나, 또는 재조합적으로 도입된 이황화 결합일 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 친수성 모이어티, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 쇄는 보통 천연 형태의 혈액 응고 인자에서 이황화 브릿지를 형성하는 두 시스테인 잔기 간의 2가 링커 모이어티를 통해 부착된다.
PEG 분자는 임의의 적합한 분자량, 예를 들어, 1 kDa 내지 100 kDa, 10 내지 500 kDa, 적합하게는 5 내지 30 kDa 또는 20 내지 30 kDa을 가질 수 있다. 일부 적합한 분자량은 5, 10, 20, 또는 30 kDa을 포함한다. 적합하게, PEG 분자는 5 kDa 내지 40 kDa일 수 있다.
인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C와 함꼐 컨쥬게이트를 형성하는 여러 상이한 유형의 폴리에틸렌 글리콜 중합체가 존재한다. 단일 폴리에틸렌 글리콜 쇄를 함유하는 선형 PEG 중합체가 존재하고, 분지형 또는 다중-아암 PEG 중합체가 존재한다. 분지형 폴리에틸렌 글리콜은 통합 기를 통해 함께 결합되어 있는, 2개 이상의 별개의 선형 PEG 쇄를 함유한다. 예를 들어, 두 PEG 중합체는 리신 잔기에 의해 함께 결합될 수 있다. 한 선형 PEG 쇄는 α-아미노 기에 결합하는 반면, 나머지 다른 한 PEG 쇄는 ε-아미노 기에 결합한다. 리신 코어의 남은 카르복실 기는 단백질에의 공유 부착을 위해 이용가능하도록 남겨진다. 선형 및 분지형 폴리에틸렌 글리콜 중합체, 둘 모두 다양한 분자량으로 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 한 실시양태에서, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C-컨쥬게이트는 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 및 단백질 C에 결합된 하나 이상의 선형 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈액 응고 인자는 인자 III, 인자 VIII 또는 인자 IX이고, 여기서, 각 PEG의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C-컨쥬게이트는 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C에 결합된 하나 이상의 선형 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 함유하며, 여기서, 각 선형 PEG는 약 1 kDa 내지 약 40 kDa의 분자량을 가진다. 특정 실시양태에서, 각 선형 PEG의 분자량은 약 10 kDa 내지 약 30 kDa이다. 특정 실시양태에서, 각 선형 PEG의 분자량은 약 20 kDa이다. 특정 실시양태에서, 각 선형 PEG의 분자량은 약 10 kDa이다. 특정 실시양태에서, 각 선형 PEG의 분자량은 10 kDa 미만이다. 특정 실시양태에서, 혈액 인자 컨쥬게이트는 혈액 응고 인자에 결합된 선형 PEG 중합체를 1개 초과로 함유하고, 예를 들어, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C에 2, 3, 또는 최대 8개의 선형 PEG 중합체가 결합되어 있다. 일부 실시양태에서, 혈액 인자 컨쥬게이트는 다중 선형 PEG 중합체를 함유하고, 이들 각각의 선형 PEG의 분자량은 약 5-30 kDa이다.
본 발명의 혈액 인자 컨쥬게이트는 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C에 결합된 하나 이상의 분지형 PEG 중합체를 함유할 수 있으며, 여기서, 각각의 분지형 PEG의 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa이다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 혈액 인자 컨쥬게이트는 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C에 결합된 하나 이상의 분지형 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 함유하고 여기서, 각 분지형 PEG의 분자량은 약 1 kDa 내지 약 100 kDa이다. 특정 실시양태에서, 각 분지형 PEG의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 40 kDa이다. 특정 실시양태에서, 각 분지형 PEG의 분자량은 약 10 kDa, 20 kDa, 또는 약 30 kDa이다. 특정 실시양태에서, 각 분지형 PEG의 분자량은 약 10 kDa 미만이다. 특정 실시양태에서, 혈액 인자 컨쥬게이트가 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C에 결합된 1개 초과의 분지형 PEG 중합체를 함유하고, 예를 들어, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C에 2, 3, 또는 최대 8개의 분지형 PEG 중합체가 결합되어 있다. 일부 실시양태에서, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C-PEG 컨쥬게이트는 최대 8개의 분지형 PEG 중합체를 함유하고, 여기서, 각 분지형 PEG의 분자량은 약 5-40 kDa이고, 적합하게는 10 내지 30 kDa이다.
혈액 인자-PEG 컨쥬게이트는 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 침전 및 막 기반 분리를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지되어 있는 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 수 있다.
적합하게, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C-컨쥬게이트의 PEG 모이어티는, 혈액 응고 인자에서 이황화 결합을 형성하는 2개의 시스테인 잔기에 결합될 수 있다. 그러므로, PEG 함유 링커는 이황화 결합을 브릿징한다. 상기 컨쥬게이션 방법의 예는 WO 2005/007197, WO 2009/047500 및 WO 2010/010324에 기술되어 있다.
상기 논의된 바와 같이, 다른 페길화 경로로는 문헌 [Stennicke et al., (Thromb. Haemost. 2008, 100(5), 920-8)]에 기술되어 있는 바와 같은 표준 당페길화 방법, 또는 US 5644029에 기술되어 있는 바와 같은 N-말단 아미드 페길화를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, PEG 모이어티는 도 2에 제시된 반응식에 따라 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C에 컨쥬게이트될 수 있다. 도 2에서, R1 기는 PEG 모이어티와, 혈액 인자 분자 상의 이황화 결합의 황 원자에 걸쳐 있는 링커 기 사이에 제시되어 있다.
R1은 직접 결합, 알킬렌 기 (바람직하게, C1 -10 알킬렌 기), 또는 임의적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기 (여기서, 아릴 기로는 페닐, 벤조일 및 나프틸 기를 포함하고; 여기서, 적합한 헤테로아릴 기로는 피리딘, 피롤, 푸란, 피란, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 피리다진, 피리미딘 및 퓨린을 포함하고; 여기서, 중합체에의 결합은 가수분해 방식으로 분해가능한 결합에 의해, 또는 분해가 불가능한 결합에 의해 이루어질 수 있음)일 수 있는 치환기를 나타낸다.
임의적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기 상에 존재할 수 있는 특정 치환기로는 예를 들어,
Figure pct00001
할로겐, 예를 들어, 불소 또는 염소, -C≡CR, -C=CR2 및 13C=CHR (여기서, R 또는 R'은 독립적으로 수소 원자 또는 알킬 (바람직하게, C1 -6) 또는 아릴 (바람직하게, 페닐) 기를 나타냄)로부터 선택되는, 동일하거나, 또는 상이한 치환기 중 하나 이상을 포함한다. 전자 흡인성 치환기가 존재하는 것이 특히 바람직하다. 한 실시양태에서, R1에서 임의적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기로는 R1 단위를 PEG 모이어티에 연결하는 아미드 (NHCO) 기에 의해 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기를 포함한다.
따라서, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C의 시스테인 잔기 사이의 원래의 이황화 결합의 2개의 황 원자 사이의 링커 기는 3-탄소 브릿지를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C의 시스테인 잔기 사이의 원래의 이황화 결합의 2개의 황 원자 사이의 링커 기는 (CH2)2CHC(O)-이다.
본 발명의 한 실시양태에서, PEG 모이어티는 상기 기술된 바와 같이 컨쥬게이트될 수 있고, 여기서 PEG 모이어티에 컨쥬게이트된 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C를 포함하는 조성물이 하기 구조식을 갖는다:
Figure pct00002
상기 식에서, R1은 상기 정의된 바와 같고, "인자"는 혈액 응고 인자를 나타낸다.
상기 정의된 바와 같은 R1 중의 임의적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기가 아미드 (NHCO) 기에 의해 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기를 포함하는 실시양태에서, 컨쥬게이트 단백질의 구조식은 하기와 같을 수 있다 (여기서, R3은 하기에서 정의되는 바와 같음):
Figure pct00003
.
R3은 직접 결합, 알킬렌 기 (바람직하게, C1 -10 알킬렌 기), 또는 임의적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기 (여기서, 아릴 기로는 페닐, 벤조일 및 나프틸 기를 포함하고; 여기서, 적합한 헤테로아릴 기로는 피리딘, 피롤, 푸란, 피란, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 피리다진, 피리미딘 및 퓨린을 포함하고; 여기서, 중합체에의 결합은 가수분해 방식으로 분해가능한 결합에 의해, 또는 분해가 불가능한 결합에 의해 이루어질 수 있음)일 수 있는 치환기를 나타내고, "인자"는 혈액 응고 인자를 나타낸다.
임의적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기 상에 존재할 수 있는 특정 치환기로는 예를 들어,
Figure pct00004
할로겐, 예를 들어, 불소 또는 염소, -C≡CR, -C=CR2 및 13C=CHR (여기서, R 또는 R'은 독립적으로 수소 원자 또는 알킬 (바람직하게, C1-6) 또는 아릴 (바람직하게, 페닐) 기를 나타냄)로부터 선택되는, 동일하거나, 또는 상이한 치환기 중 하나 이상을 포함한다. 전자 흡인성 치환기가 존재하는 것이 특히 바람직하다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 투여 형태는 폴리에틸렌글리콜 분자가 직쇄 (적합하게 단분산성) 형태인, 본원에 정의된 바와 같은 혈액 응고 인자의 페길화된 형태로 구성될 수 있다. PEG는 3 탄소 브릿지 모이어티를 통해 혈액 응고 인자에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, PEG는 1 내지 100 kDa일 수 있고; 일부 실시양태에서는 5 내지 30 kDa; 일부 실시양태에서는 10 kDa, 및 다른 실시양태에서는 20 kDa일 수 있다.
투여 형태는 적합한 수성 비히클 중에서 제제화함으로써 피하 투여용으로 제조될 수 있다. 대부분의 실시양태에서, 적합한 수용액은 비이온성 계면활성제 (예를 들어, 트윈® 80), 및 임의적으로 안정제 (예를 들어, 벤즈아미딘 또는 벤즈아미딘 유도체, 예를 들어, US 7612066 참조)의 존재하에서 하나 이상의 아미노산 및/또는 염 (예를 들어, 히스티딘 및 NaCl)을 포함하는 조성물을 이용하여 생리학적 pH (예를 들어, pH 6.8로) 완충처리된다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 비이온성 계면활성제/유화제로는 폴리소르베이트, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 (폴리소르베이트 80, 트윈® 80), 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 61, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 21, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 81, 폴리소르베이트 85, 및 폴리소르베이트 120, 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 예컨대, 폴리옥실 8 스테아레이트 (PEG 400 모노스테아레이트), 폴리옥실 2 스테아레이트, 폴리옥실 4 스테아레이트, 폴리옥실 6 스테아레이트, 폴리옥실 12 스테아레이트, 폴리옥실 20 스테아레이트, 폴리옥실 30 스테아레이트, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥실 50 스테아레이트, 폴리옥실 100 스테아레이트, 폴리옥실 150 스테아레이트, 및 폴리옥실 4 디스테아레이트, 폴리옥실 8 디스테아레이트, 폴리옥실 12 디스테아레이트, 폴리옥실 32 디스테아레이트, 폴리옥실 150 디스테아레이트를 포함한다.
조성물 중 상기 성분의 적합한 농도 범위는 예를 들어, 5 mM 내지 25 mM 히스티딘 (적합하게 10 mM 내지 15 mM 히스티딘), 10 mM 내지 50 mM NaCl (적합하게 30 mM 내지 40 mM NaCl) 및 0.001 내지 0.01% 트윈® 80 (적합하게 0.005% 내지 0.008% 트윈® 80) 및 임의적으로 0.5 mM 내지 5 mM 벤즈아미딘 (적합하게 1 mM 내지 2 mM 벤즈아미딘)일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "뮤테인"이라는 용어는, 원래의 혈액 인자와 비교하였을 때, 생성된 생성물의 활성은 크게 변화시키지 않으면서, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C의 천연적으로 발생된 성분의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 것이 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환되거나, 또는 결실되거나, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 혈액 인자의 원래의 서열에 부가되어 있는, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C의 유사체를 의미한다. 이러한 뮤테인은 공지된 합성법에 의해 및/또는 부위-지정 돌연변이유발 기법, 또는 그에 적합한 임의의 다른 공지 기법에 의해 제조된다.
본 발명에 따른 뮤테인은 엄격한 조건하에서 본 발명에 따른 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C를 코딩하는 DNA 또는 RNA에 하이브리드화하는 핵산, 예컨대, DNA 또는 RNA에 의해 코딩된 단백질을 포함한다. "엄격한 조건"이라는 용어는 당업계의 숙련가가 통상 "엄격한" 것으로 지칭하는, 하이브리드화 및 후속되는 세척 조건을 의미한다 (문헌 [Ausubel et al ., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience, N.Y., sections 63 and 6.4 (1987, 1992)]; [Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (1989)]).
제한 없이, 엄격한 조건의 예로는 예컨대, 5분 동안 2xSSC 및 0.5% SDS, 및 15분 동안 0.1% SDS에서 연구 중인 하이브리드의 계산된 Tm보다 12-20℃ 아래에서; 37℃에서 30-60분 동안 0.1xSSC 및 0.5% SDS, 및 이어서, 68℃에서 30-60분 동안 0.1xSSC 및 0.5% SDS 중에서의 세척 조건을 포함한다. 당업계의 숙련가는, 엄격성 조건은 또한 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브 (예컨대, 10-40개의 염기) 또는 혼합된 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에 따라 달라진다는 것을 이해한다. 혼합된 프로브가 사용될 경우, SSC 대신 테트라메틸 암모늄 클로라이드 (TMAC)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
임의의 상기 뮤테인은 바람직하게 예컨대, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C와 실질적으로 유사하거나, 또는 더욱더 우수한 활성을 가지도록 하기 위해 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C의 것의 충분히 중복성인 아미노산 서열을 가진다.
인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C의 한가지 특징적인 활성은 혈액 응고 캐스캐이드, 및 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C를 검출하는 검정법에 참여할 수 있는 그의 능력이다. 뮤테인이 실질적인 혈액 인자 활성을 가지고 있는 한, 이는 혈액 인자와 실질적으로 유사한 활성을 가지는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 상기 뮤테인에 대해 본원에 기술된 검정법을 수행하는 단계를 포함하는 통상의 실험에 의해서, 임의의 주어진 뮤테인이 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C와 적어도 실질적으로 동일한 활성을 가지는지 여부를 측정할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 임의의 상기 뮤테인은 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C의 아미노산 서열과 40% 이상의 동일성 또는 상동성을 가진다. 더욱 바람직하게, 상기 뮤테인은 그와 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 가장 바람직하게는, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 동일성 또는 상동성을 가진다.
동일성은 서열 비교에 의해 측정되는, 둘 이상의 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계를 반영한다. 일반적으로, 동일성이란, 비교되는 서열의 길이에 걸쳐 각각 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 서열의 꼭 들어맞는 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드, 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 의미한다.
꼭 들어맞는 대응이 없는 서열에 대한 "동일성(%)"을 측정할 수 있다. 일반적으로, 비교되는 두 서열을 주어진 서열 사이의 상관관계가 최대가 되도록 정렬한다. 이 경우 정렬 정도를 증강시키기 위해 서열 하나 또는 둘 모두 "갭"을 삽입시키는 것을 포함할 수 있다. 동일성(%)은 특히 길이가 동일하거나, 또는 매우 유사한 서열에 대해 적합한, 비교되는 각 서열 전장에 걸쳐 (소위 전역 정렬), 또는 길이가 동일하지 않은 서열에 더욱 적합한, 보다 짧은 정의된 길이에 걸쳐 (소위 국부 정렬) 측정될 수 있다.
둘 이상의 서열의 동일성 및 상동성을 비교하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 따라서, 예를 들어, 위스콘신 시퀀스 어날리시스 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package) 버전 9.1 (문헌 [Devereux, et al., Nucleic acids Research, 12: 387 (1984)])에서 이용가능한 프로그램, 예를 들어, 프로그램 BESTFIT 및 GAP가 두 폴리뉴클레오티드 사이의 동일성(%) 및 두 폴리펩티드 서열 사이의 동일성(%) 및 상동성(%)을 측정하는 데 사용될 수 있다. BESTFIT는 스미스(Smith) 및 원터만(Waterman)의 "국부 상동성" 알고리즘을 사용하고 (문헌 [Advances in Applied Mathematics , 2; 482-489 (1981)]), 두 서열 사이에 유사성이 최상이 단일 영역을 찾아낸다. 서열 사이의 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 다른 프로그램 또한 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, BLAST 계열의 프로그램 (문헌 [Atschul et al., J. Molec . Biol ., 215: 403 (1990)], www.ncbi.nlm.nih.gov의 NCBI의 홈페이지를 통해 접속가능) 및 FASTA (문헌 [Pearson W R, Methods in Enzymology, 183: 63-98 (1990)])가 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C의 뮤테인은 과도한 실험 없이도, 본원에 제시된 교시 및 가이던스에 기초하여 당업계의 숙련가에 의해 통상적으로 수득될 수 있는, 실질적으로 상응하는 서열의 유한 세트를 치환 펩티드로서 포함한다.
본 발명에 따라 뮤테인으로 바람직한 변이는 "보존적" 치환으로 알려져 있는 것이다. 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C의 보존적 아미노산 치환은, 군을 이루는 구성원들 간의 치환이 분자의 생물학적 기능을 보존하는 충분히 유사한 물리화학적 특성을 가지는 군 내의 동의의 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산의 작용을 변경시키지 않으면서 상기 정의된 서열 중에서 아미노산의 삽입 및 결실도 이루어질 수 있으며, 특히, 삽입 또는 결실이 단지 소수의 아미노산, 예컨대, 30개 미만, 바람직하게 10개 미만의 아미노산만을 포함하고, 예컨대, 시스테인 잔기와 같이, 기능적 입체구조에 중요한 아미노산을 제거 또는 치환하지 않는다면 삽입 및 결실도 이루어질 수 있다는 것 또한 명백하다. 상기와 같은 결실 및/또는 삽입에 의해 제조된 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 범주 내에 포함된다.
따라서, 아미노산 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이 대개 서로 치환될 수 있다 (지방족 측쇄를 가지는 아미노산). 이러한 가능한 치환들 중 글리신 및 알라닌은 (이는 상대적으로 짧은 측쇄를 가지기 때문에) 서로 치환하는 데 사용되고, 발린, 류신 및 이소류신은 (이는 소수성인 보다 큰 지방족 측쇄를 가지기 때문에) 서로 치환하는 데 사용된다. 대개 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산으로는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 (방향족 측쇄를 가지는 아미노산); 리신, 아르기닌 및 히스티딘 (염기성 측쇄를 가지는 아미노산); 아스파르테이트 및 글루타메이트 (산성 측쇄를 가지는 아미노산); 아스파라긴 및 글루타민 (아미드 측쇄를 가지는 아미노산); 및 시스테인 및 메티오닌 (황 함유 측쇄를 가지는 아미노산)을 포함한다. 이러한 성질의 치환은 대개 "보존적" 또는 "반보존적" 아미노산 치환으로 언급된다.
본 발명의 융합 단백질에 대한 서열에 상대적인 아미노산 변이는 예컨대, 부위-지정 돌연변이유발법에 의해 임의의 적합한 기법을 사용함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 범주 내의 아미노산 치환 또는 삽입은 천연적으로 발생된, 또는 비천연적으로 발생된 아미노산을 사용하여 이루어질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 천연 또는 합성 아미노산 사용 여부와는 상관없이 단지 L-아미노산만이 존재하는 것이 바람직하다.
추가로, 또 다른 펩티드 또는 단백질 단편에 융합된 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C를 포함하는 융합 단백질 또한 사용될 수 있되, 단, 융합 단백질은 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C의 활성을 보유하여야 한다. 본 명세서에서 "융합 단백질"이라는 용어는 일반 용어로서 수소 결합 또는 염 브릿지를 비롯한 화학적 수단에 의해, 또는 단백질 합성을 통해 펩티드 결합에 의해, 또는 그 둘 모두에 의해 함께 결합된 하나 이상의 단백질을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "기능성 유도체"는 당업계에 공지된 수단에 의해 잔기 상의 측쇄로서 존재하거나, N- 또는 C-말단 기에의 부가인 작용기로부터 제조될 수 있고, 제약상 허용되는 상태 그대로 유지되는 한, 즉, 혈액 인자의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴시키지 않고, 그를 함유하는 조성물에 독성 특성을 부여하지 않는 한, 본 발명에 포함되는, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C, 및 그의 뮤테인의 유도체를 포함한다.
이들 유도체는 예를 들어, 카르복실 기의 지방족 에스테르, 암모니아와 또는 1차 또는 2차 아민과의 반응에 의한 카르복실 기의 아미드, 아실 모이어티 (예컨대, 알카노일 또는 카르복실릭 아로일 기)와 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노 기의 N-아실 유도체, 또는 예를 들어, 이용가능한 히드록실 잔기의 당화를 비롯한, 아실 모이어티와 형성된 유리 히드록실 기의 O-아실 유도체 (예를 들어, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 것)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 "혈액 인자의 활성 단편"은 본원에서 정의된 바와 같은 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C 또는 뮤테인의 단편일 수 있다. 단편이라는 용어는 분자의 임의의 서브세트, 즉, 원하는 생물학적 활성을 보유하는, 더 짧은 펩티드를 의미한다. 단편은 혈액 인자 분자의 어느 말단에서든 아미노산을 제거하고, 생성된 단편을 본원에 기술된 바와 같은 그의 특성에 대해 시험으로써 쉽게 제조될 수 있다. 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단으로부터 한번에 1개의 아미노산을 제거하는 프로테아제는 공지되어 있으며, 따라서, 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단편을 측정하는 것은 단지 통상의 실험만을 포함한다.
본 발명은 추가로 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 및 단백질 C, 그의 뮤테인 및 활성 단편의 활성 분획으로서, 단독으로, 또는 그에 연결된 회합된 분자 또는 잔기, 예컨대, 당, 또는 포스페이트 잔기와 함께 단백질 분자의 폴리펩티드 쇄의 임의의 단편 또는 전구체를, 또는 단백질 분자 또는 당 잔기의 응집체를 단독으로 포함하되, 단, 상기 분획은 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C와 실질적으로 유사한 활성은 가져야 한다.
본원에서 "염"이라는 용어는 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C 분자 또는 그의 유사체의 카르복실 기의 염 및 아미노산 기의 산 부가 염, 둘 모두를 의미한다. 카르복실 기의 염은 당업계에 공지된 수단에 의해 형성될 수 있고, 무기 염, 예를 들어, 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철 또는 아연 염 등, 및 예를 들어, 아민과 함께 형성된 것, 예컨대, 트리에탄올아민, 아르기닌 또는 리신, 피페리딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기와의 염을 포함한다. 산 부가 염으로는 예를 들어, 광산, 예컨대, 염산 또는 황산과의 염, 및 유기산, 에컨대, 아세트산 또는 옥살산과의 염을 포함한다. 물론, 임의의 상기 염은 본원에 기술된 바와 같이 혈액 인자의 생물학적 활성을 보유하여야 한다.
환자에게 치료약을 투여하는 것과 관련하여 본원에서 사용되는 바, "곡선하면적" 또는 "AUC"란 시점 0에서부터 무한 시점까지의 시간에 대한 함수로서 환자의 전신 순환에서 약물의 농도를 기술하는 곡선하 총면적으로서 정의된다. 본원에서 사용되는 바, "제거" 또는 "신장 제거"라는 용어는 약물의 양을 함유하는 혈장의 분당 배설되는 부피로서 정의된다.
환자에게 펩티드 약물을 투여하는 것과 관련하여 본원에서 사용되는 바, "반감기" 또는 "t½"이라는 용어는 환자에서 약물의 혈장 농도가 ½만큼 감소되는 데 소요되는 시간으로서 정의된다. 펩티드 약물과 관련된 반감기는 다중의 제거 기전, 재분포 및 당업계에 주지된 다른 기전에 따라 1개 초과로 존재할 수 있다. 보통, 알파 및 베타 반감기는 알파 단계는 재분포와 관련되고, 베타 단계는 제거와 관련되도록 정의된다. 그러나, 대부분이 혈류로 한정되는 단백질 약물의 경우, 제거 반감기는 2개 이상 존재할 수 있다. 당업계에 주지되어 있는 바와 같이, 페길화가 알파 단계 및 베타 단계 반감기에 미치는 정확한 영향은 크기 및 다른 파라미터에 따라 달라질 것이다. "반감기"에 대한 추가 설명은 문헌 [Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin and RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101-120]에서 살펴볼 수 있다.
환자에게 펩티드 약물을 투여하는 것과 관련하여 본원에서 사용되는 바, "체류 시간"이라는 용어는 약물이 투약 후 환자의 체내에 머무는 평균 기간으로서 정의된다.
환자에게 펩티드 약물을 투여하는 것과 관련하여 본원에서 사용되는 바, "면역원성"이라는 용어는 투약 후, 또는 반복 투약 후 환자에서 면역 반응을 유도하는 펩티드 약물의 성향으로서 정의된다.
본원에서 사용되는 바, "분자 치수"라는 용어는 약의 중량, 크기 및/또는 형상을 의미한다. 따라서, "변형에 의한 분자 치수 증가"란 약의 물리적 크기가 너무 크기 때문에 혈관벽을 통해 혈류 내로 통과하지 못하도록 분자 치수를 증가시킨다는 것을 의미한다. 그러나, 분자 치수가 반드시 분자량 증가를 의미하는 것은 아니며, 예를 들어, 약이 변형에 앞서 절두된 경우에 그러하다. 분자 치수는 분자/중량, 크기 및/또는 입체구조를 포함할 수 있되, 단, 상기 변형된 약은 활성을 보유하여야 하고, 림프계에 의해서 혈관으로 전달되지 않고는 혈관으로 직접 통과할 수 없어야 한다.
본원에서 사용되는 바, "피하 전달" 또는 "피하 투여"라는 용어는 치료약이 비푸를 통해 피하 공간으로 직접 전달되도록 하는 임의의 적합한 수단에 의한 전달을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, 상기 변형된 약의 피하 용량과 관련하여 "용량이 조절된"이라는 것은 상기 변형된 약에 대한 정맥 내 용량에 분율 정맥 내 Cmax/피하 Cmax를 곱한 값을 의미한다. 본원에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 방법을 통해서는 정맥 내로 투여되는 비상기 변형된 약 또는 상기 변형된 약과 비교하였을 때 덜 빈번하게 및/또는 보다 높은 고용량으로 환자에게 투여할 수 있다. 피하 용량과 관련하여 "용량이 조절되지 않은"이라는 것은 정맥 내로 전달되는 것과 같이 상기 변형된 약의 정맥 내 용량과 동일한 용량이 전달된다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "피하 공간"이라는 용어는 피부 아래 결합 조직을 의미한다. 이는 혈관, 혈류 및 내부 기관은 배제한다.
"천연 상태"란, 변형 이전의 약이 존재하는 상태로서, 이 상태에서 약은 일반적으로 제약상 허용되는 형태로 환자에게 정맥 내로 투여되는 것인 상태를 의미한다.
본 발명의 피하 투여 형태는 추가로 제약상 허용되는 희석제, 애주번트 또는 담체를 포함할 수 있다. 피하 투여용으로 적합화된 피하 투여 형태로는 항산화제, 완충제, 정균제 및 제제가 의도된 수혜자의 혈액과 실질적으로 등장성이 되도록 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및/또는 비수성 멸균 주사액(들); 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁제를 포함할 수 있다. 주사액에 사용될 수 있는 부형제로는 예를 들어, 물, 알콜, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함한다. 조성물은 단위-투약 또는 다회-투약용 용기, 예를 들어, 실링된 앰플 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 직전에 휴대하고 있는 멸균 액체, 예를 들어, 주사용수 첨가만을 필요로 하는 냉동 건조된 (동결건조된) 조건하에서 보관될 수 있다. 즉석 주사액 및 현탁제는 멸균 분제, 과립제 및 정제로부터 제조될 수 있다.
일반적으로, 피하 투여 형태는 보존제, 가용화제, 안정화제, 유화제, 착색제, 염 (본 발명의 활성 물질은 그 자체가 제약상 허용되는 염의 형태로 제공될 수 있음), 완충제, 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이는 본 발명의 물질 이외에도 치료학상 활성인 약 또한 함유할 수 있다. 본 발명의 피하 투여 형태는 제약상 허용되는 희석제, 애주번트, 또는 담체와 함께 조합하여 사용될 수 있다. 상기 부형제는 염수, 완충처리된 염수 (예컨대, 포스페이트 완충처리된 염수), 덱스트로스, 리포좀, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에 기술된 피하 투여 형태의 피하 투여는 환자의 질환을 치료하는 데 효과적인, 임의의 유효하고 편리한 방식으로 착수될 수 있다. 투여 형태는 액체 형태 또는 고체 형태일 수 있다. 액체 형태는 즉석 사용용으로 제조될 수 있거나, 또는 농축물로 제조된 후, 피하 투여 전에 희석될 수 있다. 고체 형태는 적합하게는 피하 투여용으로 적합한 투여 비히클 중에서 재구성될 수 있다. 요법에서, 또는 예방제로서, 주사가능한 조성물로서 개체에게 투여되는 활성제는 예를 들어, 멸균 수성 분산액, 바람직하게, 등장성일 수 있다.
본 발명의 추가의 측면에 따라, 투여 형태의 Cmax가 혈액 응고 장애 치료에 사용하기 위한 변형된 혈액 인자의 정맥 내 투여에 의해 달성되는 Cmax의 10% 이상 내지 90% 이하인 것인, 월 1회 이하로 피하로 투여하기 위한 변형된 혈액 응고 인자의 액체 투여 형태를 제공한다.
본 발명의 상기 측면은 또한 혈액 응고 질환 또는 외상 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에서 정의된 바와 같은 변형된 혈액 응고 인자의 투여 형태를 피하로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 혈액 응고 질환 또는 외상을 치료하는 방법을 포함한다.
그러므로, 본 발명은 또한 대상체에서의 혈액 응고 장애 치료용의, 본원에서 정의된 바와 같은 투여 형태를 포함하는 약제의 제조에서 변형된 혈액 응고 인자의 용도로서, 여기서, 상기 약제는 피하 투여용인 것이고, 그의 Cmax는 변형된 혈액 인자의 정맥 내 투여에 의해 달성되는 Cmax의 10% 이상 내지 90% 이하인 것인, 용도도 제공한다. 적합하게, Cmax는 20% 내지 80%, 또는 30% 내지 70%, 또는 40% 내지 60%이다. 한 실시양태에서, Cmax는 75 내지 80%이고, 혈액 인자는 FVII일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, Cmax는 10% 내지 25%이고, 혈액 인자는 FVIII일 수 있다. 추가의 또 다른 실시양태에서, Cmax는 40% 내지 60%이고, 혈액 인자는 FIX일 수 있다.
혈액 응고 질환 또는 장애는 혈액 응고 인자의 기능 상실, 또는 자가항체 생성을 특징으로 할 수 있다. 혈액 응고 질환의 예로는 혈우병 A 및 혈우병 B를 포함한다.
인자 VIIa는 혈우병 A 또는 B에서 출혈 에피소드를 치료하는 데, 또는 각각 FVIII 또는 IX에 대한 억제성 항체가 발생하는 환자 치료에서 사용될 수 있다. 인자 VIII은 혈우병 A 환자에서 출혈 에피소드를 치료하는 데 사용될 수 있고, 인자 IX는 혈우병 B 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "치료"라는 용어는 인간 또는 인간이 아닌 포유동물에게 유익할 수 있는 임의의 요법을 포함한다. "인간이 아닌 포유동물" 치료는 말을 비롯한 가축 포유동물 및 반려 동물 (예컨대, 고양이 및 개), 및 양과, 염소과, 돼지과, 소과, 및 말과 구성원을 비롯한, 농장/농업용 동물의 치료로 확장된다. 치료는 임의의 현존 병증 또는 장애에 관한 것일 수 있거나, 예방적인 것 (예방적 처치)일 수 있다. 치료는 유전 질환 또는 후천성 질환에 대한 것일 수 있다. 치료는 급성 또는 만성 질환에 대한 것일 수 있다.
본 발명의 피하 투여 형태는 단독으로, 또는 다른 화합물, 예컨대, 치료학적 화합물 또는 분자, 예컨대 항염증성 약물, 진통제 또는 항생제, 또는 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C의 활성을 촉진시키거나, 증강시킬 수 있는 다른 제약상 활성제, 예를 들어, 또 다른 혈액 응고 인자와 함께 사용될 수 있다. 상기와 같이 다른 화합물과 함께 투여하는 것은 동시, 별개 또는 순차적 투여일 수 있다. 성분은 적절할 경우, 설명서를 포함할 수 있는 키트 형태로 제조될 수 있다.
혈액 응고 캐스캐이드에서의 활성 수준은 임의의 적합한 검정법에 의해, 예를 들어, 전체 혈액 응고 시간 (WBCT) 검사 또는 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT)에 의해 측정될 수 있다.
전체 혈액 응고 시간 (WBCT) 검사는 전체 혈액이 외부 환경, 보통 유리관 또는 접시에서 응괴를 형성하는 데 소요되는 시간을 측정한다.
활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 검사는 혈액 응고 경로 중 일부의 파라미터를 측정한다. 이는 혈우병에서 및 정맥 내 헤파린 요법에서 비정상적으로 상승된다. APTT는 정맥으로부터 수 ml의 혈액을 필요로 한다. APTT 시간은 "내인성 경로"로 알려져 있는 응고 시스템의 한 부분의 척도이다. APTT 값은 특정 응고 과정이 실험실 검사에서 발생하는 데 소요되는 시간 (초)이다. 상기 결과는 항체 정상 혈액의 "대조군" 샘플과 비교된다. 시험 샘플이 대조군 샘플보다 더 장시간 소요될 경우, 이는 내인성 경로에서 응고 기능이 감소되었음을 나타낸다. 일반 의료 요법은 보통 APTT 범위가 대략 45 내지 70초가 되도록 하는 것으로 목표로 하지만, 상기 값은 또한 시험군 대 정상군의 비로서, 예를 들어, 정상군의 1.5배로서도 표시될 수 있다. 헤파린 처리 부재시 높은 APTT는 혈우병에 기인할 수 있으며, 이는 추가 검사를 필요로 할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 피하 투여 형태, 및 피하 투여용 주사액을 포함하는 투여 비히클을 포함하는 부품들로 된 키트로서, 적합하게는 그의 사용서를 포함하는 것인 키트를 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 대상체에게 피하 투여하기 위한 것으로 제제화되었을 때, 상기 대상체에서 전체 혈액 응고 시간을 15분 미만으로 유지시키는 데 충분한 투여 형태를 월 1회 이하로 제공하는, 피하 투여용의, 변형된 혈액 응고 인자 (적합하게, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C)로 이루어진 제약 조성물의 투여 형태를 제공한다. 투여 제제의 Cmax는 적합하게는 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 10% 이상 내지 90% 이하일 수 있다.
그러므로, 본 발명은 대상체에게 피하 투여하기 위한 것으로 제제화되었을 때, 상기 대상체에서 전체 혈액 응고 시간을 12분 미만으로 유지시키는 데 충분한 투여 형태를 월 1회 이하로 제공하는, 피하 투여용의, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 VIIa, 인자 V, 인자 XIII, 폰 빌레브란트 인자 또는 단백질 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형된 혈액 응고 인자로 이루어진 제약 조성물의 투여 형태를 제공한다.
그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명은 월 1회 이하로 피하 투여하기 위한, 25 내지 50 IU/kg의 인자 VIIa, 인자 VIII 및 인자 IX로 이루어진 군으로부터 선택되는 페길화된 혈액 응고 인자로 이루어진 제약 조성물의 투여 형태를 제공한다.
본 발명의 액체 투여 형태는 혈액 응고 장애 치료에 사용하기 위한 것으로서, 월 1회 이하로 피하 투여하기 위한, 본원에서 정의된 변형된 혈액 응고 인자를 포함할 수 있으며, 여기서, 투여 형태의 Cmax는 10% 이상 내지 90% 이하이다.
상기 조성물은 혈액 응고 질환 또는 외상 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따른 혈액 응고 인자의 투여 형태를 피하로 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서의 혈액 응고 질환 또는 외상 치료 방법에서 특히 유용하다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 투여 형태는 피하로 투여되었을 때, 각각의 변형된 혈액 응고 인자가 유사 정맥 내로 투여되었을 때의 순환 역가 및 응고 활성, 둘 모두에 있어서의 수준에 필적하는 생체이용률 및 효능을 가진다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 단백질 중 단일 이황화 결합으로의 3 탄소 브릿지 모이어티를 통해 직쇄, 단분산성 폴리에틸렌글리콜 분자로 변형된, 본원에 정의된 바와 같은 혈액 응고 인자를 포함하는, 피하 투여용의 투여 형태를 제공한다.
본 발명의 액체 투여 형태는 비이온성 계면활성제 및 임의적으로 안정제의 존재하에 생리학적 상태로 완충처리된 수용액 중에서 PEG-컨쥬게이트된 혈액 응고 인자를 제제화함으로써 제조될 수 있다.
본 발명의 제2 및 후속 측면에 바람직한 특징은 제1 측면에 대한 것을 준용한다.
본 발명에 따른 상기 변형된 약의 제품 효과는 정맥 내로 전달된 동일한 상기 변형된 약보다 우수한 것으로 밝혀졌다. 제품 효과는 예를 들어, WBCT 개선으로 정의될 수 있다. 이는 초기 WBCT를 특정 시점의 WBCT로 나눈 값으로 정의된다. 상기 방법을 사용하였을 때, 피하로 전달된 변형된 혈액 응고제는 일관되게 동일한 시점에 정맥 내로 전달된 동일한 제품보다 더 높은 제품 효과를 보였다.
본 발명에 따르면, 예를 들어, 생체적합성 중합체 첨가에 의해 변형된 치료약의 피하 투여로부터 더 낮은 면역 반응이 유발된다. 이러한 효과는 본 발명 이전에 제약 제제 투여 분야의 숙련가가 예측했었을 효과와는 정반대인 것이다. 예를 들어, 혈액 인자 제제 분야에서는 일반적으로 비변형된 혈액 인자를 피하로 투여하면, 면역 반응이 자극을 받거나 (FVIII 억제제가 생성되거나), 또는 현존하는 FVIII 억제제 집단에 의해 면역 반응이 유발될 것으로 예상된다고 인정되고 있다.
베데스다 유닛(Bethesda)으로 혈액 응고 인자에 대한 상대적인 면역 반응을 측정할 수 있다. 베데스다 유닛 (BU)은 혈액 응고 억제제 활성의 척도이다. 문헌 [Practical Haemostasis]에 따르면, "1 베데스다 유닛 (Bu)은 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 정상 혈장 중 1 유닛의 인자 VIII:C의 50%를 중화시키는 혈장 샘플 중 억제제의 양으로서 정의된다" (문헌 [Schumacher, Harold Robert (2000). Handbook of Hematologic Pathology. Informa Health Care, p. 583]).
본 발명에서는 매우 놀라운 결과가 관찰되었다. 면역 (억제제) 반응 발생률을 저하시키기 위해, 면역 반응 수준이 전신 노출 수준과 직접적인 관련이 있는, 피하 투여를 채용할 것을 제안한다. 피하 전달을 제공함으로써 Cmax는 급진적으로 저하될 수 있고, 그를 통해 면역 반응은 저하된다.
일례로, 본 발명은 혈액 인자가 중합체, 예컨대, PEG에 컨쥬게이트되었을 때에 그와 접하게 되는 놀라운 데포 효과를 기술한다. 추가로, PEG의 크기 (또는 양)으로부터 단백질 상에 부과되는 수화 수준을 조작함으로써 혈액 인자가 피하 공간으로부터 이용가능하게 하는 속도를 조작할 수 있다는 결과를 얻었다.
본 출원에서 밝혀진 결과로부터, 한 중합체 쇄에 의해 변형된 치료약의 경우, 상기 약은 두 중합체 쇄가 첨가된 상응하는 디-컨쥬게이트된 형태보다 더 느린 속도로 혈장 내로 진입한다는 것을 알 수 있었다.
다시 말해, 모노-컨쥬게이트된 생성물은 디-컨쥬게이트된 생성물과의 비교시, 노출된 단백질이 더 많은 것으로 보인다. 이러한 상태는 더욱 고도로 컨쥬게이트된 형태가 수 분산성이 더욱 크고, 따라서, 림프관을 통한 혈장 내로의 진입 속도는 빨라질 수 있다는 것을 의미한다.
그러므로, 놀랍게도, 데포 방출 지속 기간을 최장기화시키기 위해서는 변형 정도는 더 낮아야 한다. 이론으로 제한하고자 하지 않으면서, 이는 치료약 중 일부를 피하 조직에 노출시키는 변형의 정도를 적게 하면 림프를 통한 확산 속도가 저속화된다는 것에 의해 합리적으로 설명될 수 있다. 반대로, 더 높은 정도의 변형은 생성물이 완전히 자유롭게 혈액 순환으로 빠르게 진입할 수 있게 방치하는 치료약을 포함한다.
전반적으로, 변형시킨 후, 피하 전달하는 조합을 통해 피하 (SQ) 투여 후, 겉보기 반감기는 관찰 결과 35배 증가되는 매우 놀라운 전체 효과를 얻었다.
최종적으로, 전반적으로는 생체이용률은 더욱 고도로 컨쥬게이트된 형태에 유리하다는 것을 알 수 있었고, 이를 통해 변형 수준 및 수화 수준이 높을수록 이동성 및 따라서 생체이용률을 더 높은 정도로 개선시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
각 측면의 모든 특징은 상기를 준용하여, 본 발명의 모든 다른 측면에 적용된다.
본원에서는 하기 도면을 참조한다:
도 1은 혈액 응고 캐스캐이드를 보여주는 것이다. 약어: HMWK - 고분자량 키니노겐; PK - 프리칼리크레인; PL - 인지질.
도 2는 컨쥬게이션 시약의 일례로서 페길화 시약을 사용한, 이황화 특이 생체중합체 컨쥬게이션 화학법에 관여하는 단계를 보여주는 것이다 (문헌 [Shaunak et al., in Nat . Chem . Biol . 2006; 2(6):312-313]).
도 3은 대상체 개 1에게로 PEGhrFIX, 및 대상체 개 2에게로 hrFIX을 피하 (SQ) 투여한 후의 전체 혈액 응고 시간 (WBCT)을 보여주는 것이다.
도 4는 SQ 투여 후, 시간 경과에 따른 APTT (활성화 부분 트롬보플라스틴 시간) 값을 보여주는 것이다.
도 5는 SQ 투여 후, 잔류 혈장의 APTT를 보여주는 것이다.
도 6은 SQ 투여 후, 기준선에 대한 상대적인 APTT 값을 보여주는 것이다.
도 7은 25 IU/Kg SQ 투여 후, 대상체 개 9에서의 WBCT를 보여주는 것이다.
도 8은 200 ug/kg rFVIIa 투여 후, FVIIa의 PK 프로파일 및 파라미터를 보여주는 것이다.
도 9는 800 ug/kg 테라PEG-rFVIIa 투여 후, FVIIa의 PK 프로파일 및 파라미터를 보여주는 것이다.
도 10은 1,600 ug/kg 테라PEG-rFVIIa 투여 후, FVIIa의 PK 프로파일 및 파라미터를 보여주는 것이다.
도 11은 (모든 개에서의) 혈장 중 FVIII의 농도를 보여주는 것이다.
도 12는 (오직 SQ 투여받은 개에서만) 혈장 중 FVIII의 농도를 보여주는 것이다.
도 13은 정맥 내 (IV) 투여된 것과 비교하여 피하 (SQ) 투여된 PEGFVIII에 대한 면역 데이터 (베데스다 값)를 보여주는 것이며, 대상체 수는 "n"으로 제시된다.
이제 본 발명은 단지 예시 목적으로 포함되고, 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하는, 하기 실시예를 참고로 하여 추가로 기술될 것이다. 본 발명의 투여 제제의 피하 투여에 대해 언급하는 것은 SQ (s.c.)로 제시되고, 정맥 내 투여는 IV (i.v.)로 제시된다.
실시예 1: 투여 형태의 제조 및 피하 투여
본 연구는 피하 투여 후, hrFIX의 생체이용률 및 효능을 평가하는 것을 포함한다. 네이키드 (페길화되지 않은) hrFIX를 그의 페길화된 유사체를 순환 역가 및 응고 활성, 둘 모두에 대해 비교하였다.
10 kDa의 직쇄, 단분산성 폴리에틸렌글리콜을 3 탄소 브릿지를 통해 단일 이황화 결합에 컨쥬게이트시키는 표준 기술에 따라 10 kDa 페길화된 hrFIX를 제조하였다.
10 mM 히스티딘, 40 mM NaCl 및 0.005 % 트윈® 80을 이용하여 pH 6.8로 완충처리된 적합한 수용액을 형성함으로써 투여용 시험 물품을 제조하였다. 1 mM 벤즈아미딘을 안정제로서 첨가하였다.
hrFIX는 25% 희석된 PEGrFIX에 필적하는 응고 시간을 보였다는 희석 연구를 토대로 하였을 때, 본 연구에 대해 할당된 효능은 4 X 단백질 등가물이었다. 대조군 물품을 동결건조된 분제로서 공급받고, 재구성을 위해 동봉된 설명서에 따라 투여용으로 제조하였다. 전달 비히클은 PEG에 대해 상기 기술된 것과 동일하였다.
본 연구에 대한 부속으로서 rFIX의 피하 (SQ) 투여의 가능성에 대하여 연구하기로 결정하였다. PEG이 단백질에 차폐막 효과를 제공하였다는 상기 관찰 결과로부터 페길화된 형태의 rFIX는 SQ 투여에 적합할 것이라고 전망되었다. 역사적으로, SQ 경로는 FIX에 대해서는 이용불가능한 것으로 간주되었는데, 그 이유는 상기를 통해 항체 생산의 발생이 악화될 수 있고, 혈중 의미있는 양으로 번역되지 않기 때문이다.
본 연구 중 상기 부분에서, PEGhrFIX 50 IU/Kg을 추가의 시험 동물 (개 1)에 피하 투여하고, 2마리의 다른 시험 대상체, 즉, 각각 개 6 및 개 2에 네이키드 hrFIX를 2회에 걸쳐 SQ 투여한 것과 비교하였다.
이러한 특정의 설명에서, 각 동물은 기준선에서 미세한 차이를 보였는 바, 이에, 비교의 용이함을 위해 투여 전 APTT 수준을 1로 정규화시켰다. 개 1 및 개 2는 2010년 1월 시행된 이전 PEGrFIX 시험에서 시험 대상체였고, 그로부터 보고된 정맥 내 투여 이후의 혈장 역가는 비교를 위해 이용가능하였다.
역가의 붕괴 및 혈액 응고에 미치는 효과를 추적 연구하기 위해 혈액 샘플을 정규 시간에 걸쳐 채취하였다. 하기 표 1은 정맥 내 투여 후 순환 FIX로서 22시간째에 측정된 역가를 요약한 것이다.
Figure pct00005
하기 표 2에는 피하 (SQ) 투여 후 22시간째 측정된 순환 FIX 역가 비교가 제시되어 있다.
Figure pct00006
SQ 경로에 의해 25 IU/Kg의 베네픽스(Benefix)가 순환 중 검출불가능하였고, 50 IU/Kg의 PEGhrFIX는 혈장 중에서 거의 검출불가능한 것을 알 수 있었다. 극명한 대조로, PEGhrFIX SQ 투여는 IV 투여된 제품의 수준 (9.9)에 근접한 수준 (7.8)이었다.
이어서, 상기 역가가 응고 시간 보정에 미치는 효과를 조사하였다. 제1 사례에서, 전체 혈액 응고 시간을 기록하였다. 피하 투여 후 WBCT는 하기 표 3 및 도 3에 제시되어 있다. 추가로, 헤모크론® 주니어(Hemochron® Junior)에 대한 APTT 또한 기록하였고, 하기 표 4 (시트르산 처리된 전체 혈액) 및 도 4 (피하 투여 후)에 제시되어 있다. 잔류 혈장 샘플에 대한 APTT 값은 하기 표 5 및 도 5 (이 또한 피하 투여 후)에 제시되어 있다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
도 6 - 데이터 보정을 통해 네이키드 rFIX는 (사실상) 피하 주사로부터는 생체이용가능하지 않다는 것으로 명확하게 나타났다. 이는 전적으로 공개된 문헌 및 당업계의 일반 지식으로부터 예측된다. rFIX의 높은 순환 역가는 PEGhrFIX의 피하 주사 이후에 검출될 수 있다는 것은 완전히 더욱 놀라운 사실이다. 실제로, 피하로 주사된 PEGrFIX 중 약 80%가 지혈 조절 참여에 이용될 수 있다는 것을 하기 표 10에서 알 수 있다.
측정된 응고 시간에서 가장 극명한 대조를 이루며, rFIX에 대한 WBCT 및 APTT, 둘 모두 거의 보정되지 않은 반면, 피하 주사로부터의 PEGhrFIX의 응고 시간은 즉시 보정되었다. 이러한 측정에 의한 지혈 지속 기간은 단일 50 IU/Kg 피하 주사로부터는 대략 1주까지 연장되었다.
실시예 2: 개 9에게로의 hrFIX 피하 투여 ( SQ )
상기 SQ 연구의 성공을 고려하여, 추가의 PEGhrFIX 단일 SQ 투여를 수행하고, 장기간 동안에 걸쳐 유사하게 지혈 조절을 추적 연구하기로 결정하였다. 중화 항체가 SQ 투여 경로에 미치는 영향을 조사하기 위해 선택된 시험 대상체는 나이브 대상체 개 9였다.
개에서의 인간 혈액 인자 연구는 인간 단백질에 대한 개 면역계의 반응에 의해 혼동된다. 따라서, 인간 rFIX는 개에서의 연구에서는 이종단백질이며, 시험 물품 투여 후 일부 시점에서는 중화 항체를 예상하여야 했다. 실제로, 시험 대상체에게 인간 혈액 인자를 재도입시켰을 때, 항체 생산은 더 현저하게, 및 더 빠른 속도로 나타났다. 대상체 개 1 및 개 7에서는 피하 투여 후, 결과로서 지속 기간은 단축되었다.
시험 대상체 개 9는 나이브 동물이었고, 소량을 피하로 제공받았으며, 이로써, 본 발명의 페길화된 혈액 인자가 제공할 수 있는 진정한 지속적 보호를 나타내었다. 개 9는 이전에 인간 혈액 인자에 노출된 경험이 없기 때문에, 진정한 근본적인 (및 고도로 놀라운) 결과가 관찰되었다.
도 7은 1 ml (부피 1 ml)의 용량으로 개 9에게 25 IU/Kg의 페길화된 IB1001을 피하 투여한 후의 WBCT 결과를 나타낸 것이며, 이 결과는 하기 표 6에도 제시되어 있다.
Figure pct00010
실시예 3: 비교 실시예
FIX 및 PEG-FIX의 정맥 내 투여 및 피하 투여의 비교
Figure pct00012
그 결과, 피하 용량의 Cmax는 정맥 내 용량의 Cmax의 78.8%인 것으로 나타났다. 정상군과의 비교로 나타낸 IV 및 SQ에 대한 값(%)은 낮게 보이지만, 이는 실제로는 실험상 아티팩트(artefact)였다. 각 경우에서 FIX는 샘플 제조와 같이 세포와 함께 스핀 다운되는 것으로 가정되었다. 정맥 내 용량에 대한 값 9.9%는 실제로는 우수한 결과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다. 결과적으로, 주어진 Cmax 값 계산치에 의해 나타난 바와 같이, 피하 용량에 대한 7.8%과의 비교는 바람직할 수 있다.
결론:
피하 주사에 의해 hrFIX를 25 및 50 IU/Kg, 둘 모두로 투여한 결과, 순환 역가는 거의 검출불가능하였고, 개 대상체에서 혈우병은 보정되지 못했다.
상기와는 극명한 대조로, 50 IU/Kg의 PEGhrFIX를 피하 투약한 결과, 생체이용률은 대략 80%까지 상승하였고, 1주의 지속 기간 동안 응고 시간을 정상 범위 내로 보정되었다.
실시예 4: 20 kDa PEG 를 포함하는 인자 VIIa
본 실시예에서는 피하 주사로부터의 혈액 인자의 PEGFVIIa 생체이용률에 관한 연구를 보고한다. 혈우병을 앓는 2마리의 개 (HB)를 시점 0에서 효능 등가량의 PEGFVIIa로 처리하였는데; 1마리는 정맥 내로 (IV), 1마리는 피하로 (SQ) 수행하였다. FVIIa 단백질에 대해 측정하기 위해 혈액 샘플을 채취하고, 혈장을 회수하였다. 결과를 나타낸 하기 표에는 피하 투여로부터의 생체이용률은 89.5%인 것으로 나타나 있다.
Figure pct00013
PEG 존재는 수 가용성을 부여하는데, 이는 림프관에서의 이동성을 촉진시킨다. 본 데이터 결과, IV 주사와 관련된 볼루스 최고점 및 최저점보다 FVIIa가 항정 상태로 조절 방식으로 주입되는 것으로 나타났다.
피하로 전달되었을 때, 곡선하면적은 페길화된 FVIIa에 대해 89.5%의 생체이용률을 나타내었고, 더욱 항정 상태인 FVIIa 수준을 보였다.
실시예 5: PEGFVIII 약물 제품
비교를 위해, 코지네이트® FS (상업적으로 이용가능한 재조합 FVIII)를 참조하였다. 페길화된 부형제, 트윈® 80을 대량으로 사용하였다.
폴리소르베이트인 트윈® 80의 분자량은 1,310 g/mol이며, 그 중 880 g은 페길화로부터 유도된 것이다 (각각 44 g/mol을 보유하는 총 20개의 단량체 단위, , (CH2-CH2-O)).
따라서, 계산은 하기와 같이 이루어진다:
몰 PEG 길이 등가량:
참조: 전공논문 실시예에서 입수한 250 IU 바이알 제품
FVIII 분자량 3.00E+05 g/mol
IU/g 4.00+06 IU/g
IU/바이알 2.50E+02 IU/바이알
바이알 부피 2.50E+00 ml/바이알
폴리소르베이트 농도 6.40E-05 g/ml
분자량 폴리소르베이트 1.31E+03 g/mol
분자량 PEG/mol 폴리소르베이트 880 g/mol
Figure pct00014
트윈®/FVIII 비 5.86E+02
PEG 등가 분자량 5.16E+05
그러므로, 코지네이트® FS에서 각 FVIII 분자는 관련된 516 kDa PEG의 등가량을 가졌다. 비교하면, 본 발명에 따라 제조된 PEGFVIII 투여 제제는 단일 20 kDa PEG를 가졌다.
결론: 용량 대 용량 기준으로 폴리에틸렌 글리콜은 25.8배 감소되며; 코지네이트®가 예방적 용도로 주 3회 기준인 것에 비해 본 발명의 PEG-FVIII 투여 제제는 주 1회 투여될 수 있다는 점을 고려해 볼 때, PEG 투여를 약 80배 감소시키는 바, 잠재적으로 전체적인 감소가 이루어지며; 투약 기간 동안에 걸쳐 본 발명의 FVIII 투여 제제에 의해 투여된 PEG 양은 코지네이트®에 의해 투여된 양의 1.25%이다.
실시예 6: 피하 투여 FVIIa
본 연구의 목적은 혈우병 B를 앓는 개에서의 정맥 내 및 피하 투여한 후의 테라페길화된 비-테라페길화된 재조합 인간 FVIIa (각각 테라PEGrFVIIa 및 FVIIa)의 약동학적 성질을 조사하는 것이었다.
WO 2011/135308에 따라 트랜스제닉 FVIIa (rFVIIa)의 테라페길화를 수행하였다. 테라PEGrFVIIa를 동결건조제로서 다회분으로 시험 부지로 공급하였고, 고 순도수로 재구성하여 FVIIa 활성을 유지시키는 생리학상 허용되는 완충제 중 1 mg/ml 테라PEGrFVIIa를 수득하였다.
실험 동물은 조기 종결 코돈 및 불안정한 FIX 전사체를 생성케 하는 F9 유전자 중 5-bp 결실 및 C→T 전이에 의해 유발된 선천성 중증 혈우병 B를 앓는, 라사 압소(Lhasa Apso)-바센지(Basenji)의 교배견이었다. 투약에 앞서, 전혈구 화학, 혈청 화학 프로필 피브리노겐, 피브리노겐 유래 펩티드 (FDP), 트롬빈 시간 및 뇨 분석을 비롯한 시험을 모든 개에 대해 수행하여 정상 건강 상태를 확인하였다. 정맥 내 (IV)로 제공된 약물은 요골측 피부 정맥을 통한 볼루스 주사로 투여하였다. 피하 (SQ) 용량은 단일 용량으로 견갑골 사이에 투여하였다.
하기 표 11에 기술된 바와 같이 동물에게 투약하는 데 사용되는 단일 용량 용액을 제조하기 위해 개별 회분의 테라PEGrFVIIa를 재구성한 후, 조합하였다.
Figure pct00015
Figure pct00016
5 ml 혈액 샘플을 프로토콜에 따라(protocolled) 하기 시점에 각각의 개로부터 채취하였다:
약물 투여 전 및 투약 후 10, 30분째, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 및 240시간째.
4 ml의 혈액 샘플을 얼음 상의, 0.109 M 시트르산삼 나트륨 항응고제 (9:1 v/v)를 포함하는 튜브로 옮겨 놓았다. 남은 시트르산 처리된 혈액을 원심분리하여 혈장을 제조하고, 생성된 혈장 샘플을 분취량으로 -80℃에서 보관하였다. 분취량의 혈장을 ELISA에 의해 FVIIa 농도에 대해 검정하였다.
스테고 아세라크롬(Stago Asserachrom) VII:Ag ELISA 검정법은 혈장 샘플 중 인자 VII/VIIa 농도를 정량적으로 측정하기 위한 효소 결합 면역검정 방법이다. 상기 검정법은 토끼 항인간 FVII 항체로 사전 코팅된 마이크로타이터 웰로 구성된 샌드위치 ELISA이다. 항체는 PEG-FVIIa와 FVIIa에 대해 다른 친화도를 가지기 때문에, 시험 혈장 중에 존재하는 FVIIa에 적절한 단백질의 희석, 즉, rFVIIa를 투여받은 개로부터 유래된 혈장에 대한 검정인 경우, rFVIIa (0.78 내지 50 ng/ml), 또는 PEG-rFVIIa를 투여받은 개로부터 유래된 혈장에 대한 검정인 경우, PEG-rFVIIa (0.78 내지 50 ng/ml)에 의해 표준 곡선을 작성하였다.
혈장 샘플을 적절한 농도로 희석시켜 표준 곡선 내에 포함되도록 만들었다. 희석된 혈장 샘플 및 표준을 로딩하고, 세척하기 전, 실온에서 인큐베이션시킨 후, 이어서, 토끼 항인간 FVII HRP 컨쥬게이트 및 OPD (비색 HRP 기질)로 발색시켰다. 플레이트를 492 nm에서 판독하고, 시험 샘플의 농도 (ng/ml)를 표준 곡선으로부터 해독하였다.
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
약동학적 성질
200 ug/kg FVIIa, 800 ug/kg 테라PEG-rFVIIa 및 1,600 ug/kg 테라PEG-rFVIIa에 대한 IV 및 SQ 프로파일 및 PK 파라미터는 도 8, 9 및 10 (표 12, 표 13 및 표 14)에 제시되어 있다. 테라PEG-rFVIIa의 반감기는 14 내지 27시간인 것으로 밝혀졌으며, 이는 비-페길화된 rFVIIa의 반감기가 2.3시간인 것에 비하여 확실히 연장된 것이다. 1,600 ug/kg IV 용량의 테라PEG-rFVIIa의 AUC는 800 ug/kg IV 용량의 것보다 1.8x 더 높았다. 그러나, 1,600 ug/kg SQ 용량은 800 ug/kg 용량의 것보다 단지 1.2x 더 높았다. 이는 800 ug/kg 및 1,600 ug/kg에 대한 생체이용률 계산치가 각각 67% 및 45%라는 것에 반영되며, 이는 비-페길화된 rFVIIa에 대해 관찰되는 11%의 SQ 생체이용률에 비하여 유의적인 증가를 나타내었다.
800 ug/kg IV 용량의 테라PEG-rFVIIa의 AUC는 200 ug/kg IV 비-페길화된 rFVIIa 이후의 AUC 것의 84x이고, 800 ug/kg SQ 용량의 테라PEG-rFVIIa에 대한 AUC는 200 ug/kg SQ 비-페길화된 rFVIIa의 것의 300x였다.
실시예 7: FVIII 피하 투여 FVIII
본 연구의 목적은 혈우병 A를 앓는 개에게 정맥 내로 및 피하로 투여되었을 때 테라페길화된 혈장 유래 FVIII (테라PEG-pdFVIII)의 약동학적 성질 및 약력학적 성질을 조사하는 것이었다. 테라PEG-pdFVIII은 20 kDa 선형 PEG를 이용하여 WO 2011/135307에 기술되어 있는 바와 같이 제조하였고, 이를 추가로 정제하여 정제된 테라PEG-pdFVIII을 수득하였다.
실험 동물은 선천성 중증 혈우병 A를 앓는, 그레이하운드(greyhound)의 교배견이었고, 자발적인 출혈 치료를 위해 이전에 개 혈장을 투여받은 적은 있지만, 인간 FVIII을 이용하는 치료에 대해서는 경험이 없는 나이브였다. 투약에 앞서, 전혈구 화학, 혈청 화학 프로필 피브리노겐, 피브리노겐 유래 펩티드, 트롬빈 시간 및 뇨 분석을 비롯한 시험을 모든 개에 대해 수행하여 정상 건강 상태를 확인하였다.
하기 표 15에는 각각 개의 체중 및 FVIII 투여 용량이 제시되어 있다. 각각 개는 테라PEG-pdFVIII을 보다 고용량으로 (대략 0.14 mg/kg) 또는 보다 저용량으로 (0.07 mg/kg), 또는 비-페길화된 pdFVIII을 0.03 mg/kg으로 단일 투약으로 받았다. 정맥 내 (IV) 투여는 요골측 피부 정맥을 통한 볼루스 용량으로 제공하였다. 피하 (SQ) 투여는 단일 용량으로 견갑골 사이에 제공하였다.
Figure pct00020
혈액 샘플을 프로토콜에 따라 하기 시점에 각각의 개로부터 채취하였다. 약물 투여 전 및 10, 30분째, 투약 후 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 및 240시간시간째. 전체 혈액 응고 검정법 및 활성화 응고 시간 검정법을 위해 (시트르산으로 처리되지 않은) 전체 혈액을 사용하였다. 남은 혈액 샘플을 얼음 상의, 0.109 M 시트르산삼 나트륨 항응고제 (9:1 v/v)를 포함하는 튜브로 옮겨 놓았다. 시트르산 처리된 혈액에 대해 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 검정법을 수행하였다. 시트르산 처리된 혈액을 원심분리하여 혈장을 제조하고, FVIII 항원 ELISA를 위해 생성된 혈장 샘플을 분취량으로 -80℃에서 보관하였다. 분취량의 혈장을 ELISA에 의해 FVIIa 농도에 대해 검정하였다.
전체 혈액 응고 시간 검정법 ( WBCT )
혈액 샘플을 2개의 바큐튜브(vacutube)로 나눠 담고 (2 X 0.5 ml), 완전히 수평인 위치에서 흐름 중단에 의해 응괴가 측정될 때까지 튜브를 주기적으로 신중하게 레벨링하면서 주의 깊게 관찰하였다. 이어서, 응괴의 정질은 완전히 도립된 위치에서 튜브를 잡고 관찰하였다. 두 샘플 모두에 대해 혈전이 시각적으로 관찰될 때까지 샘플 추출물로부터의 전체 시간의 평균값으로서 WBCT를 기록하고, 도립된 위치에서의 응괴의 정질 또한 기록하였다.
활성화 응고 시간 ( ACT ) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 ( APTT )
제조사의 설명서에 따라 헤마크론 주니어(Haemachron Jr) 응고 분석 장치 (인터내셔널 테크니다인 코포레이션(International Technidyne Corps.))를 사용하여 ACT 및 APTT 검사를 수행하였다.
제조사의 설명서에 따라 어피니티 바이오로지컬스(Affinity Biologicals: 캐나다 온티라오주 앵커스터)로부터 입수한 비줄라이즈(Visulize) FVIII 항원 키트를 사용하여 ELISA에 의해 혈장 샘플 중 FVIII 항원의 농도를 측정하였다.
결과
전체 혈액 응고 시간 ( WBCT )
보다 고용량의 테라PEG-pdFVIII (HA1-4)을 받은 모든 개에서는 지혈 (WBCT <12분)이 80-100시간 동안 유지되었다. WBCT 프로파일에 있어서는 IV와 SQ 투여 사이에 어떤 차이도 보이지 않았다. 보다 저용량의 테라PEG-pdFVIII (HA6)을 SQ로 투여받은 경우에는 지혈이 56-75시간 동안 유지되었다. 대조적으로, 비-페길화된 FVIII을 SQ로 투여받은 경우, 비록 WBCT가 단축되기는 하였지만, WBCT가 12분 미만으로 지속되지는 못했다.
활성화 응고 시간 ( ACT )
ACT는 보다 고용량의 테라PEG-pdFVIII (HA1-4)을 받은 모든 개에서 투약 후 대략 80시간 동안 200초 미만의 정상 범위로 감소되었다. ACT 프로파일에 있어서는 IV와 SQ 투여 사이에 어떤 차이도 없었다.
보다 저용량의 테라PEG-pdFVIII (HA6)을 SQ로 투여받은 경우에는 ACT가 36 h 이상 동안 200초 미만으로 유지되었다. 대조적으로, 비-페길화된 FVIII을 SQ로 투여받은 경우, 비록 ACT가 단축되기는 하였지만, ACT가 200초 미만으로 지속되지는 못했다.
활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 ( APTT )
APTT는 보다 고용량의 테라PEG-pdFVIII (HA1-4)을 받은 모든 개에서 투약 후 대략 60시간 동안 60초 미만으로 감소되었다. APTT 프로파일에 있어서는 IV와 SQ 투여 사이에 어떤 차이도 없었다.
보다 저용량의 테라PEG-pdFVIII (HA6)을 SQ로 투여받은 경우에는 APTT가 40 시간 동안 60초 미만으로 유지되었다. 대조적으로, 비-페길화된 FVIII을 SQ로 투여받은 경우, 비록 APTT가 단축되기는 하였지만, APTT가 80초 미만으로 지속되지는 못했다. 상기 개체에 대한 APTT가 투약 후 연구 기간 동안 기준선 값 미만으로 유지된 이유에 대해서는 알려져 있지 않지만, 이는 개 개체간 차이에 기인하는 것일 수 있다.
FVIII 혈장 농도 및 약동학적 성질
모든 개에서의 시간에 대한 FVIII 혈장 농도가 도 11에 제시되어 있다. 오직 SQ로 투약받은 개에 대한 데이터는 도 12에 제시되어 있다. 원시 데이터는 하기 표 23-28에 열거되어 있다. 중요한 PK 파라미터는 하기 표 16에 제시되어 있다.
HA1 및 2에 대한 SQ로 투여된 테라PEG-FVIII의 반감기는 각각 18.3 시간 및 16.6 시간이었다. IV로 투여된 경우, HA3 및 4에 대한 반감기는 각각 15.2 시간 및 13.9 시간으로 약간 더 짧았다. 생체이용률은 SQ 투여 후 32%인 것으로 계산되었다. 비-페길화된 FVIII (HA5)의 SQ 투여 후 FVIII의 농도는 대개 정량 수준 미만이었고, 따라서, 어떤 PK 파라미터도 계산할 수 없었다.
Figure pct00021
결론
WBCT, APTT 및 ACT에 의해 측정된 바, 보다 고용량의 테라PEG-FVIII을 피하 전달하였을 때, 단일 투약 후 80-100시간 동안 지혈 조절이 이루어졌다. 상기 검정법에서 SQ의 프로파일은 IV로 투여된 등가 용량의 테라PEG-FVIII의 프로파일과 구별하기 어려웠다. 이를 통해 테라PEG-FVIII을 SQ로 전달하는 것이 실현가능하다는 것이 확실하게 입증되었다.
테라PEG-pdFVIII의 반감기 범위는 13.9 내지 18.3 시간이었다. 혈우병 A를 앓는 개에서 7-11 시간인 것으로 보고된, 시판된 재조합 FVIII의 반감기와 비교하였을 때, 이는 반감기가 확실히 연장되었음을 입증한다 (문헌 [Karpf et al., Haemophilia 17, 5 (2011)]). 따라서, 테라PEG-FVIII은 SQ로 생체이용가능할 뿐만 아니라, 연장된 반감기도 나타내었다.
테라PEG-pdFVIII의 SQ 투여 후 FVIII의 PK 프로파일은 IV 투여와 비교하여 훨씬 감소된 Cmax 및 AUC를 가졌고, 생체이용률은 32%인 것으로 측정되었다. 그러나, 상기 용량 수준에서는 PK 곡선의 "서방성"인 성질에 기인하여 노출은 IV 투약 후와 유사한 시간량 동안 SQ 투여 후 5% 정상 수준보다 높게 유지되었으며, 이는 등가인 기능적 반응을 설명할 수 있다. SQ로 전달된 테라PEG-FVIII에 대한 지속 기간 연장과 연관된, Cmax 및 AUC 감소를 통해 상기 제품의 잠재된 추가의 안전성 특징 및 투약 옵션은 강조되었다.
비-페길화된 FVIII를 피하 투여하였을 때에는 혈장 중에서 FVIII가 검출불가능하였고, 비록 응고 시간이 단축되기는 하였지만, 지혈은 지속적으로 유지되지 못했다. 이는 비-페길화된 FVIII의 SQ 생체이용률은 매우 낮지만, 극소량의 FVIII가 지혈에 영향을 줄 수 있다는 것을 입증하였다. 비-페길화된 FVIII과는 대조적으로, 저용량의 테라PEG-pdFVIII은 최대 9% 정상의 혈장 수준을 유도하였고, 지혈은 56-75시간 동안 유지되었다. 그러므로, 테라PEG를 pdFVIII에 첨가함에 따라, SQ로 투여되었을 때에는 생체이용률 및 기능적 반응이 증가하였다. 결론적으로, FVIII의 테라페길화를 통해 피하로 투여될 수 있고, 작용 지속 기간이 연장된, 우수한 생성물을 얻을 수 있었다는 것이 본 연구를 통해서 명백하게 입증되었다.
Figure pct00022
Figure pct00023
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Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
실시예 8: 개에서의 피하 투여에 대한 면역 반응
본 발명에서는 피하 투여로부터 더 낮은 면역 반응이 유발되는 것으로 관찰되었다. 이러한 효과는 본 발명 이전에 혈액 인자 투여 분야의 숙련가가 기대했었을 효과와는 정반대인 것이다. 피하로 투여하면, 현존하는 매우 높은 수준의 면역 반응 (FVIII 억제제 빈도)이 악화될 것이라고 일반적으로 인정되고 있다.
본 발명에서는 매우 놀라운 결과가 관찰되었다. 면역 (억제제) 반응 발생률을 저하시키기 위해, 면역 반응 수준이 전신 노출 수준과 직접적인 관련이 있는, 피하 투여를 채용할 것을 제안한다. 피하 전달을 제공함으로써 Cmax는 급진적으로 저하될 수 있고, 그를 통해 면역 반응은 저하된다.
본 발명의 실시예에서는, 페길화된 생성물을 대부분의 면역 환경 검사, 즉, 개 시스템 검사에 노출시켰다. 정맥 내로 투여되었을 때, 베데스다 값 (억제제 정량 유닛)이 가장 높았고, 최단 기간인 것을 알 수 있었다. 대조적으로, 피하 전달한 경우, Cmax 및 더 낮고, 더 후속되는 베데스다 반응으로 입증되는 바와 같이, 전신 노출은 훨씬 더 낮은 것으로 나타났다. 실제로, 모든 최저값은 전신 노출은 거의 없고, 억제제 값을 제공한다는 관찰 결과도 없는, SQ로 투여된 네이키드 FVIII이었다. 수득된 대표적인 데이터에 대해서는 도 13/하기 표 23을 참조할 수 있다.
Figure pct00029
도 13의 플롯은 처리에 의해 자극을 받았을 때, 시간 경과에 따라 얼마나 많은 억제제 활성이 혈액 혈장 중에서 관찰되는지를 입증한다. SQ로 처리하였을 때에는 더욱 느리게 시스템에 용해되고, 면역계에 덜 자극적인 것과 비교하여, IV로 직접 처리한 경우, 더 높은 수준의 억제제가 더욱 빠르게 발생한 것으로 나타났다.
실시예 9: 래트에서의 피하 투여에 대한 비교 연구
본 실시예는 혈액 인자가 중합체, 예컨대, PEG에 컨쥬게이트되었을 때에 그와 접하게 되는 놀라운 데포 효과를 기술한다. 추가로, PEG의 크기 (또는 양)으로부터 단백질 상에 부과되는 수화 수준을 조작함으로써 혈액 인자가 피하 공간으로부터 이용가능하게 하는 속도를 조작할 수 있다는 결과를 얻었다.
3가지 다른 형태의 페길화를 통해 페길화된 인자 VIIa의 상대적인 약동학적 성질을 래트 대상체에서 연구하여 피하 공간으로부터의 전달에 있어서의 그의 성능을 비교하였다.
천연, 재조합 인자 VIIa 뿐만 아니라, 3가지 다른 형태의 페길화된 FVIIa를 피하로 (SQ) 또는 정맥 내 (IV) 투여에 의해 래트 대상체에게 투여하였다:
a) 테라페길화된 FVIIa: (별기와 같이 및 WO 2011/135308에 기술되어 있는 바와 같이) 폴리테릭스 리미티드(Polytherics Ltd.)의 "테라PEG" 기술을 사용하여 FVIIa를 20 kDa PEG 분자에 모노-페길화시켰다;
b) 글리코페길화된 FVIIa: 표준 글리코페길화 기술을 사용하여 FVIIa를 PEG에 컨쥬게이트시킴으로써 일부는 또한 유의적인 양으로 더욱 고도한 PEG 생성물을 가지는 디-컨쥬게이트된 20 kDa PEG에 의해 지배되는 시험 생성물을 수득하였다:
c) HATU-촉매화된, 페길화된 FVIIa: (US 5644029에 기술된 것으로부터 유도된 컨쥬게이션 방법을 사용하여) FVIIa를 20 kDa PEG에 모노-페길화시켰다.
테라 PEG - FVIIa
20 kDa PEG를 5 mM 인산나트륨 (pH 8.0), 15 mM NaCl, 2 mM EDTA 중 10 mg/mL로 분산시켰다. 이어서, 20℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. FVIIa 바이알 (5.3 mg)을 20 mM 시트르산 나트륨 (pH 6.0), 0.1 M NaCl, 10 mM EDTA 중 0.8 mg/mL로 재구성하였다. 20℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, TCEP, 1.5 몰 등가량 (ME)의 24 mM 및 0.025 ME의 0.4 mM SeCM을 첨가하고, 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 2 ME의 활성화된 PEG를 환원된 FVIIa에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 5℃에서 17시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 페길화된 FVIIa를 정제하기 위한 목적으로 제제화 완충제 중에서 슈퍼덱스(Superdex) 200 칼럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다.
생성물 분석을 위해, 재구성된 rFVIIa, 활성화된 PEG, 반응 혼합물, 및 선택된 슈퍼덱스 분획 (25, 30, 35, 39, 45, 51, 80)을 비-환원된 SDS-PAGE 겔 상에서 전개시켰다. 페길화된 FVIIa를 함유하는 분획을 풀링하고, 동결건조시키기 전에 대략 3 mL로 농축시켰다. 동결건조시키기 전후, 상기 두 시점 모두에 환원된 및 비-환원된 SDS PAGE, 응고 활성 및 역상 HPLC 검정법에 의해 농축된 SEC 풀을 시험하였다.
글리코페길화된 FVIIa
rFVIIa 바이알 (5.3 mg)을 2.5 mL MOPS 완충처리된 염수 중에서 재구성하였다. 이어서, 재구성된 rFVIIa를 PD10 탈염 칼럼 상에서 MOPS 완충처리된 염수로 완충제 교환을 실시하고, 1 mg/mL로 희석시켰다. 완충제가 교환된 rFVIIa를 얼음 상에 놓고, 100 mM 과요오드산나트륨을 첨가하여 최종 농도가 2.5 mM이 되도록 만들었다. 혼합물을 암실에서 최대 30분 동안 인큐베이션시켰다. 글리세롤 (50%)을 첨가하여 최종 농도가 3%가 되도록 만들었다. 이어서, 제바(Zeba) 스핀 칼럼을 사용하여 혼합물을 0.1 M 아세트산 나트륨 완충제로 완충제 교환을 실시하였다. 50 mg/mL의 아미노 옥시 PEG 스톡 용액을 제조하고, 10 ME의 상기 PEG를 탈염된 FVIIa에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1-2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 4℃에서 밤새도록 추가로 인큐베이션시켰다. 이어서, 글리코페길화된 FVIIa를 상기 기술된 바와 같이 SEC 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
생성물 분석을 위해, 선택된 SEC 분획 (23, 27, 32, 35, 40, 및 80)을 비-환원된 SDS-PAGE 상에서 전개시켰다. 글리코페길화된 FVIIa를 함유하는 분획을 풀링하고, 동결건조시키기 전에 대략 3 mL로 농축시켰다. 동결건조시키기 전후, 상기 두 시점 모두에 환원된 및 비-환원된 SDS PAGE, 응고 활성 및 역상 HPLC 검정법에 의해 농축된 SEC 풀을 시험하였다.
HATU PEG - FVIIa
rFVIIa 바이알 (5.3 mg)을 2.5 mL 보레이트 완충제 중에서 재구성하고, PD10 칼럼 상에서 보레이트 완충제로 완충제 교환을 실시하고, 0.5 mg/mL로 희석시켰다. 아세토니트릴 중에서 메톡시-PEG 스톡 용액을 16 mg/mL로 만들었다. 완충제가 교환된 rFVIIa를 실온에서 10분 동안 1.0 ME의 HATU 및 2.5 ME의 DIEA로 활성화시켰다. 활성화시킨 후, 8 ME의 메톡시-PEG를 2-5분에 걸쳐 활성화된 rFVIIa에 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 80-100분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, HATU 페길화된 FVIIa를 상기 기술된 바와 같이 SEC 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
생성물 분석을 위해, 선택된 SEC 분획을 비-환원된 SDS-PAGE 상에서 전개시켰다. HATU 페길화된 FVIIa를 함유하는 분획을 풀링하고, 동결건조시키기 전에 대략 3 mL로 농축시켰다. 동결건조시키기 전후, 상기 두 시점 모두에 환원된 및 비-환원된 SDS PAGE, 응고 활성 및 역상 HPLC 검정법에 의해 농축된 SEC 풀을 시험하였다.
방법
건강한 래트 대상체에게 제제를 0.5 mg/kg 용량으로 IV 또는 SQ로 투여하였다. IV 투여를 위해, 적절한 부피의 시험 물품을 꼬리 정맥 내로 주사하였다. SQ 투여를 위해, 적절한 부피의 시험 물품을 목덜미에 주사하였다. 대조군 시험 물품 (천연 rFVIIa)를 투여한 후, 하기 시간 간격으로 혈액 샘플을 채취하였다:
Figure pct00030
시험 물품을 투여한 후, 하기 시간 간격으로 혈액 샘플을 채취하였다:
Figure pct00031
각 시점에서 혈액 샘플로부터 혈장을 제조하고, 스테고 아세라크롬 VII:Ag ELISA 검정법을 사용하여 FVIIa 농도를 측정하였다. 상기 검정법은 혈장 샘플 중 인자 VII/VIIa 농도를 정량적으로 측정하기 위한 효소 결합 면역검정 방법이다. 상기 검정법은 토끼 항인간 FVII 항체로 사전 코팅된 마이크로타이터 웰로 구성된 샌드위치 ELISA이다. 항체는 PEG-FVIIa와 FVIIa에 대해 다른 친화도를 가지기 때문에, 시험 혈장 중에 존재하는 FVIIa에 적절한 단백질의 희석, 즉, rFVIIa를 투여받은 래트로부터 유래된 혈장에 대한 검정인 경우, rFVIIa (0.78 내지 50 ng/ml), 또는 PEG-rFVIIa를 투여받은 래트로부터 유래된 혈장에 대한 검정인 경우, PEG-rFVIIa (0.78 내지 50 ng/ml)에 의해 표준 곡선을 작성하였다.
혈장 샘플을 적절한 농도로 희석시켜 표준 곡선 내에 포함되도록 만들었다. 희석된 혈장 샘플 및 표준을 로딩하고, 세척하기 전, 실온에서 인큐베이션시킨 후, 이어서, 토끼 항인간 FVII HRP 컨쥬게이트 및 OPD (비색 HRP 기질)로 발색시켰다. 플레이트를 492 nm에서 판독하고, 시험 샘플의 농도 (ng/ml)를 표준 곡선으로부터 해독하였다. 연구 결과는 페길화된 FVIIa 분자, 및 천연 FVIIa인 대조군 아암, 각각에 대하여 2가지 투여 경로: 정맥 내 (IV) 및 피하 (SQ) 경로가 존재하는 하기 표 26(a) 및 (b)에 제시되어 있는 바와 같다.
표 26(a) 및 (b)에 제시되어 있는 바와 같이, 페길화된 FVIIa 분자, 및 천연 FVIIa인 대조군 아암, 각각에 대하여 2가지 투여 경로: 정맥 내 (IV) 및 피하 (SQ) 경로가 존재하였다.
본 실시예는 혈액 인자가 중합체, 예컨대, PEG에 컨쥬게이트되었을 때에 그와 접하게 되는 놀라운 데포 효과를 기술한다. 추가로, PEG의 크기 (또는 양)으로부터 단백질 상에 부과되는 수화 수준을 조작함으로써 혈액 인자가 피하 공간으로부터 이용가능하게 하는 속도를 조작할 수 있다는 결과를 얻었다.
표 26(a) 및 (b)에 제시되어 있는 결과로부터 하기를 알 수 있었다:
· 네이키드 단백질과 비교해 볼 때, 페길화된 단백질은 모두 연장된 혈장 반감기를 가졌다.
모노-PEG 생성물, 즉, 테라PEG 및 HATU 페길화된 단백질의 혈장 내로의 진입 속도는 디-PEG 컨쥬게이트 (글리코PEG)보다 느렸고, 따라서, 데포 효과는 더욱 현저하였다. 이는 각 생성물의 IV 및 SQ 반감기 차이를 비교함으로써 도출될 수 있다.
· 테라PEG-FVIIa의 경우, SQ에 의해 투여된 동일한 제품의 경우, 23.2시간인 것과 비교하였을 때, IV t½은 8.68시간이었다. 이는 2.7배 증가되었음을 나타내며, 상기 모노-페길화된 생성물의 경우, 데포 효과가 매우 크다는 것을 암시한다.
· 유사하게, 모노-페길화된 HATU PEG-FVIIa의 경우, SQ t½은 IV t½에 비하여 1.7배 증가 (24.3/14.07)된 것으로 나타난 바와 같이, 증강된 데포 효과를 가졌다.
· 대조적으로, 고도로 페길화된 생성물인 글리코PEG-FVIIa의 경우, 상기 두 생성물 모두에 대한 반감기는 동등한 것에 더 가까웠으며 (22.3/19.34 = 1.15배), 이는 상기 생성물의 SQ 투여는 IV 투여와 비교하여 데포 효과가 거의 없다는 것을 나타낸다.
다시 말해, 모노-페길화된 생성물은 SQ로 투여되었을 때, 저항성을 띠면서, 디-페길화된 생성물보다 더욱 장기간 동안 피하 공간 전역에 걸쳐 분산되어 있는 것으로 보이며, 이는 증진된 데포 효과를 제공하였다. 모노-페길화된 생성물 상의 PEG 양의 감소로 더 많은 단백질이 노출될 것이며; 글리코PEG 생성물 상의 PEG 포함 범위가 클수록 피함 공간 내의 수 분산성을 증가하게 되며, 이로써, 림프관을 통한 혈장 내로의 진입 속도는 더 빨라지게 된다.
그러므로, 놀랍게도, 데포 방출 지속 기간을 최장기화시키기 위해서는 페길화 정도는 더 낮아야 한다. 이론에 의해 제한하지 않으면서, 이는 단백질 중 일부를 피하 조직에 노출시키는 페길화의 정도를 적게 하면 림프를 통한 확산 속도가 저속화된다는 것에 의해 합리적으로 설명될 수 있다. 반대로, 더 높은 정도의 페길화는 생성물이 완전히 자유롭게 혈액 순환으로 빠르게 진입할 수 있게 방치하는 단백질을 포함한다.
이는 상기 경우에는 페길화를 통한 표적 분자의 변형이 결국 방출 특징과, 이로써, 시간 경과에 따른 혈중 생성물의 농도 및 그의 생체이용률을 정교하게 변형시킬 수 있다는 교시를 입증한다.
전반적으로, 페길화 후, 피하 전달하는 조합을 통해 겉보기 반감기는 관찰 결과 35배 증가되는 매우 놀라운 전체 효과를 얻었다 (네이키드 FVIIa의 경우, 0.66시간인 것에서부터 피하 (SQ) 투여 후 23.2시간인 것으로 증가).
최종적으로, 전반적으로는 생체이용률은 더욱 고도로 페길화된 종, 즉, 글리코PEG에 유리하다는 것을 알 수 있었고, 이를 통해 더욱 고도한 PEG 및 수화 수준이 높을수록 이동성 및 따라서 생체이용률을 더 높은 정도로 개선시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
Figure pct00032
Figure pct00033

Claims (53)

  1. 환자에게 치료약 (therapeutic agent)을 피하로 투여하는 단계를 포함하며, 이로써 Cmax:Caverge 비는 정맥 내로 전달되었을 때 상기 약의 Cmax:Caverge 비보다 낮고, 여기서, 상기 치료약은 친수성을 증가시키고, 치료약의 천연 상태와 관련된 분자 치수를 변형시키기 위해 변형된 것인, 환자에게 치료약을 투여하는 방법.
  2. 치료약을 피하로 투여하는 단계를 포함하며, 이로써, 치료약은 주사 부위에서 환자의 순환계로 직접 진입하지 못하며, 여기서, 상기 치료약은 친수성을 증가시키고, 치료약의 천연 상태와 관련된 분자 치수를 변형시키기 위해 변형된 것인, 환자의 림프계에 치료약을 투여하는 방법.
  3. 환자에게 상기 변형된 약을 피하로 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 치료약은 친수성을 증가시키고, 치료약의 천연 상태와 관련된 분자 치수를 변형시키기 위해 변형된 것이고, 이로써, 상기 변형된 치료약은 투여 부위로부터 직접 국소 맥관 구조로 진입하지 못하는 것인, 환자에게로의 치료약의 피하 투여시 치료약이 환자의 국소 순환계 내로 직접 진입하는 것을 방해하는 방법.
  4. 치료약을 변형시켜 상기 약의 친수성을 변경시키는 단계를 포함하며, 여기서, 친수성 수준은 생체이용률 수준과 비례하는 것인, 대상체에서 피하 데포 (subcutaneous depot)로부터 치료약을 전달하는 속도를 조절하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 치료약의 피하 투여를 통해 단일 정맥 내 볼루스 주사에 의해 안전하게 전달될 수 있는 용량보다 더 높은 고용량의 상기 변형된 약을 환자에게 투여할 수 있는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 치료약의 피하 투여를 통해 환자는 상기 변형된 약을 정맥 내로 투여하는 경우보다 더 먼저 재-투약받을 수 있는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 치료약의 피하 투여를 통해 그의 변형된 형태 또는 천연 형태의 약의 정맥 내 투여보다 더 적거나 또는 그와 등가인 면역원성 반응을 일으키는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료약의 친수성이 치료약의 천연 상태와 관련하여 50% 이상만큼 증가된 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료약이 항생제, 혈액 응고 인자, 호르몬, 또 다른 치료학적 펩티드 또는 단백질, 소분자 또는 모노클로날 항체인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 혈액 응고 인자가 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIII, 인자 V, 폰 빌레브란트(von Willebrand's) 인자, 및 단백질 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 치료약의 생체적합성 중합체에의 컨쥬게이션인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리포스파티딜 콜린 (PC), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리에틸렌 옥시드 (PEO), 폴리옥시에틸화된 폴리올, 폴리올레핀 알콜, 폴리히드록시알킬메타크릴레이트, 다당류, 폴리 α-히드록시산, 폴리비닐 알콜, 폴리포스포스파스파젠, 폴리 N-아크릴로일모르폴린, 폴리알킬렌 옥시드 중합체, 폴리말레산, 폴리 DL-알라닌, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 전분 또는 전분 유도체, 히알루론산 키틴, 폴리메타크릴레이트, 폴리시알산 (PSA), 폴리히드록시 알카노에이트, 폴리 아미노산 및 그의 조합인 것인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 생체적합성 중합체가 PEG인 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 융합 단백질을 생산하기 위한 폴리펩티드의 융합; 소포성 전달 비히클, 예컨대, 리포좀, 트랜스퍼좀 또는 미셀 내로의 혼입; 덴드리머 내로의 혼입 또는 그에의 부착 또는; 치료약의 올리고머 복합체 형성인 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료약의 피하 전달 부피가 2 ml 이하인 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 치료약이 정맥 내로 안전하게 전달될 수 있는 상기 변형된 약의 농도보다 더 높은 농도로 전달가능한 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 치료약의 피하 전달이 정맥 내로 투여되었을 때의 상기 변형된 약의 치료학적 이점보다 12시간 이상 더 긴 지속 기간 동안 치료학적 이점을 환자에게 제공하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피하 전달이 피하 주사, 국부 적용, 경피용 패취, 미세피부 박피, 또는 고압 건식 분제 전달에 의한 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피하 전달이 1일 1회 이상, 1일 2회 이상, 주 1회 이상, 주 2회 이상, 2주당 1회 이상, 또는 월 1회 이상인 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한, 상기 치료약 및 변형을 포함하는 상기 변형된 약으로서, 여기서, 변형은 친수성을 증가시키고, 치료약의 천연 상태와 관련된 상기 약의 분자 치수를 변형시키는 것인, 상기 변형된 약.
  21. 변형이 약의 친수성을 치료약의 천연 상태와 관련하여 50% 이상만큼 증가시키는 것인, 제19항에 따라 사용하기 위한 상기 변형된 약.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 변형이 치료약에 융합된 생체적합성 중합체인 것인 상기 변형된 약.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 약의 피하 전달이 정맥 내로 투여되었을 때의 상기 변형된 약의 치료학적 이점보다 12시간 이상 더 긴 지속 기간 동안 치료학적 이점을 환자에게 제공하는 것인 상기 변형된 약.
  24. 상기 변형된 약의 피하 전달이 정맥 내로 투여되었을 때의 상기 변형된 약의 치료학적 이점보다 12시간 이상 더 긴 지속 기간 동안 치료학적 이점을 환자에게 제공하는 것인, 변형된 치료약으로 이루어진 제약 조성물의 투여 형태.
  25. 환자에게 피하 투여하기 위한 것으로 제제화되었을 때, 상기 환자에서 전체 혈액 응고 시간을 20분 이하로 유지시키는 데 충분한 투여 형태를 월 1회 이하로 제공하는, 피하 투여용의, 변형된 혈액 응고 인자로 이루어진 제약 조성물의 투여 형태.
  26. 투여 형태의 Cmax가 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 10% 이상 내지 90% 이하인 것인, 혈액 응고 장애 치료에 사용하기 위한 것으로서, 월 1회 이하로 피하 투여하기 위한, 페길화된 혈액 응고 인자로 이루어진 액체 투여 형태.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 형태가 2주당 1회 이하, 주 1회 이하, ½주당 1회 이하, 2일당 1회 이하, 또는 1일 1회 이하로 투여량을 제공하는 것인 투여 형태.
  28. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 형태가 상기 환자에서 전체 혈액 응고 시간을 15분 미만으로 유지시키는 데 충분한 것인 투여 형태.
  29. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 형태가 상기 환자에서 전체 혈액 응고 시간을 12분 미만으로 유지시키는 데 충분한 것인 투여 형태.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액 응고 인자가 인자 VIIa, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 Xa, 인자 XI, 인자 XIII, 인자 V, 폰 빌레브란트 인자 및 단백질 C로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 투여 형태.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형이 페길화인 것인 투여 형태.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 형태의 Cmax가 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 10% 이상 내지 90% 이하인 것인 투여 형태.
  33. 제32항에 있어서, 상기 제제의 Cmax가 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 10% 내지 20%인 것인 투여 형태.
  34. 제33항에 있어서, 상기 약이 인자 VIII인 것인 투여 형태.
  35. 제32항에 있어서, 상기 제제의 Cmax가 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 40% 내지 60%인 것인 투여 형태.
  36. 제35항에 있어서, 상기 약이 인자 IX인 것인 투여 형태.
  37. 제32항에 있어서, 상기 제제의 Cmax가 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 75% 내지 80%인 것인 투여 형태.
  38. 제32항에 있어서, 상기 제제의 Cmax가 정맥 내로 투여되었을 때의 등가 참조 투여 형태와 비교하였을 때 75%인 것인 투여 형태.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 약이 인자 VII인 것인 투여 형태.
  40. 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 투여량이 1 내지 1,000 IU/kg인 것인 투여 제제.
  41. 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 투여량이 5 내지 500 IU/kg인 것인 투여 제제.
  42. 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 투여량이 100 내지 250 IU/kg인 것인 투여 제제.
  43. 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 투여량이 50 내지 200 IU/kg인 것인 투여 제제.
  44. 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 투여량이 25 내지 50 IU/kg인 것인 투여 제제.
  45. 제24항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 형태가 1일 1회 이상, 1일 2회 이상, 주당 약 1회, 주당 약 2회, 2주당 약 1회, 또는 월 약 1회로 투여하기 위한 것인 투여 제제.
  46. 투여 형태가 피하 투여하기 위한 것이고, 여기서, 치료약은 약의 친수성을 변경시키기 위해 변형된 것이고, 여기서, 친수성 수준은 생체이용률 수준과 비례하는 것인, 치료약의 투여 제제.
  47. 제24항에 따른 변형된 치료약의 투여 형태를 피하로 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 질환을 치료하는 방법.
  48. 혈액 응고 질환 또는 외상 치료를 필요로 하는 환자에게 제24항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 혈액 응고 인자의 투여 형태를 피하로 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 혈액 응고 질환 또는 외상을 치료하는 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 투여 형태를 1일 1회 이상, 1일 2회 이상, 주당 약 2회 이상, 주당 약 1회 이상, 2주당 1회 이상, 또는 월 약 1회 이상 투여하는 것인 방법.
  50. 제47항 또는 제48항에 있어서, 투여 형태를 1일 1회 이상 투여하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 투여 형태를 1일 2회 투여하고, 여기서, 환자는 제1 투여에서 제1 투여 형태를 받고, 제2 투여에서 제2 투여 형태를 받는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 제2 투여 형태를 제1 투여에 대해 별개로, 그와 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것인 방법.
  53. 제24항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 피하 투여 형태, 및 투여 비히클을 포함하는 부품들로 된 키트.
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