MX2014012512A - Agentes terapeuticos para administracion subcutanea optimizados. - Google Patents

Agentes terapeuticos para administracion subcutanea optimizados.

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MX2014012512A
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John Charles Mayo
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Abstract

Métodos y formulaciones de dosificación para una administración subcutánea en donde los agentes terapéuticos están modificados para aumentar la hidrofilicidad y las dimensiones moleculares con relación al estado nativo del agente terapéutico, donde la relación Cmáx:Cpromedio es menor que la relación Cmáx:Cpromedio del agente cuando se administra por vía intravenosa.

Description

AGENTES TERAPÉUTICOS PARA ADMINISTRACIÓN SUBCUTÁNEA OPTIMIZADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la administración subcutánea de agentes terapéuticos, asi como con las modificaciones de dichos agentes para que sean adecuados para una administración subcutánea.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se utilizan muchas moléculas hidrofóbicas (lipofílicas) en el tratamiento de infecciones, enfermedades y trastornos. En general, las moléculas lipofílicas se administran directamente en el torrente sanguíneo de un paciente, para asi asegurar una administración rápida en el sitio de la infección, enfermedad, etc. Sin embargo, la vida media y/o la biodisponibilidad de dichas moléculas pueden estar suboptimizadas. Las desventajas de una administración intravenosa incluyen reacciones locales y generales a la provisión de cantidades relativamente grandes de agente a un paciente y la inconveniencia de la administración intravenosa.
Los inventores de la presente han encontrado sorprendentemente que la modificación de un agente terapéutico, y el aumento de la hidrofilicidad y de las dimensiones moleculares del agente, dan como resultado la incapacidad de dicho agente para ingresar directamente en el sistema vascular. Sin embargo, el agente modificado aún está biodisponible debido a su capacidad para ingresar en el sistema circulatorio de un paciente a través del sistema linfático acuoso. La modificación se selecciona para reducir la adherencia del agente terapéutico a la superficie de los tejidos conectivos y para aumentar así su solubilidad en el fluido tisular. Los agentes terapéuticos modificados de la presente invención son de particular utilidad cuando se suministran en el espacio subcutáneo, dado que son demasiado grandes para ingresar directamente en el sistema vascular desde el espacio subcutáneo y por ello son transportados a través del cuerpo por el sistema linfático, ingresando al sistema circulatorio por el ducto torácico (ducto linfático derecho y venas subclavias). Sorprendentemente, esto da como resultado una infusión constante, predecible, del agente en el sistema circulatorio del paciente. Por lo tanto, la presente invención se refiere a la administración subcutánea de un agente modificado, para así volver al efecto del agente modificado más predecible en cuanto a su longevidad, velocidad de infusión y velocidad de eliminación y por lo tanto, en cuanto a la duración del efecto. Esto se logra volviendo al agente más hidrofílico y modificando sus dimensiones moleculares de manera tal que luego de su administración subcutánea al paciente, dicho agente modificado no puede pasar a través de las paredes de los vasos sanguíneos para ingresar en la sangre sino que es transportado por el líquido intersticial ingresando al sistema linfático. Esto da como resultado una liberación predecible, controlada, al sistema vascular desde el sistema linfático. Elimina la necesidad de considerar el nivel de vascularización alrededor del sitio de administración como se describirá más adelante.
La invención se puede aplicar a péptidos, biomoléculas, incluyendo todos los factores sanguíneos, hormonas, antibióticos, anticuerpos monoclonales y algunas moléculas pequeñas. Se puede utilizar cualquier modificación adecuada que no interfiera con el efecto terapéutico de la molécula, que aumente la hidrofilicidad y que modifique sus dimensiones moleculares (que pueden incluir el peso molecular, o el tamaño físico del agente modificado) para asegurar que no pueda ingresar directamente en la vasculatura sin pasar primero a la vena subclavia a través del sistema linfático por el ducto torácico. La modificación elegida puede tener el efecto concomitante de regular la eliminación del agente del cuerpo (por excreción, digestión, ataque inmunológico o de otra manera) de modo que se "equilibre" la velocidad de infusión y la velocidad de eliminación del agente para lograr un efecto terapéutico óptimo.
Los ejemplos de modificaciones adecuadas incluyen la conjugación del agente con un polímero, preferiblemente un polímero biocompatible, tal como polietilenglicol (PEG), polifosfatidil colina (PC), polipropilenglicol (PPG), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, óxido de polietileno (PEO), poliol polioxietilado, alcohol poliolefínico, polihidroxialquilmetacrilato, polisacáridos, ácido poli a-hidroxi, alcohol polivinílico, polifosfaceno, poli N-acriloilmorfolina, polímeros de óxido de polialquileno, ácido polimaleico, poli DL-alanina, carboximetilcelulosa, dextrano, almidón o derivados de almidón, ácido hialurónico, quitina, polimetacrilatos, ácido polisiálico (PSA), polihidroxi alcanoatos, poliaminoácidos y combinaciones de los mismos. El polímero biocompatible puede ser de estructura lineal o ramificada.
Otros ejemplos de polímeros blocompatibles comprenden proteínas seleccionadas, pero en un sentido no taxativo, del grupo que consiste en albúmina, transferrina, inmunoglobulinas incluyendo anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo como por ejemplo anticuerpos de un solo dominio, VL, VH, Fab, F(ab')2, Fab', Fab3, scFv, di-scFv, sdAb, Fe y combinaciones de los mismos.
Otros métodos para modificar el agente terapéutico pueden comprender el uso de proteínas de fusión; la incorporación en vesículas de administración vesiculares tales como liposomas, transferosomas o micelas; la incorporación / unión a dendrímeros; la formación de complejos de oligómeros del agente. La modificación elegida puede tener el efecto concomitante de regular la eliminación del agente del cuerpo (por excreción, digestión, ataque inmunológico o de otra manera) de modo que se "equilibre" la velocidad de infusión y la velocidad de eliminación del agente para lograr un efecto terapéutico óptimo.
Una vez suministrado en el espacio subcutáneo, el agente modificado localizado allí puede ser transportado por el sistema linfático para pasar por infusión al sistema vascular a través de las venas subclavias, después de lo cual dichas modificaciones también controlan la eliminación del agente del cuerpo de manera tal que la relación entre la velocidad de infusión desde el espacio subcutáneo hacia la circulación y la velocidad de eliminación del producto farmacéutico del cuerpo se pueden equilibrar y controlar para así optimizar la eficiencia terapéutica y la eficacia del agente modificado.
Uno de los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden ser modificados para una administración subcutánea de esta manera incluye los factores de coagulación sanguíneos. La cascada de la coagulación sanguínea involucra numerosas proteínas diferentes que sirven de distinta manera para activarse entre sí y promover la formación de un coágulo sanguíneo y el mantenimiento de una hemostasis sana. En algunas formas de realización, el factor de coagulación sanguíneo que se puede modificar de acuerdo con la invención se selecciona del grupo que consiste en el Factor VII, Factor Vlla, Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand y la proteína C. En algunas formas de realización, el factor de coagulación sanguíneo preferiblemente es el Factor VII, el Factor VIII o el Factor IX.
Un ejemplo de agente terapéutico relacionado con la invención incluye el factor de coagulación sanguíneo VII (denominado FBI en la presente), que es un zimógeno de 53,000 Dalton (Da), glicosilado, de cadena simple, dependiente de la vitamina K, que contiene 12 enlaces disulfuro nativo (O'Hara et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84: 5158-5162 (1987)). La protefna es producida predominantemente en el hígado. El FVII está relacionado con la cascada extrínseca de la coagulación sanguínea (Figura 1 ). La protefna está organizada en cuatro dominios discretos: un dominio de ?-carboxiglutamato (Gla) N-terminal, dos dominios tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF) y un dominio serina proteasa C-terminal. El zimógeno en circulación presenta muy poca actividad proteasa en ausencia de su cofactor, el factor tisular (TF), que se encuentra en el subendotelio vascular. Después de un daño vascular, el FVII se une al TF con gran afinidad y es convertido en la enzima activa, de dos cadenas, FVIIa por clivaje específico de la unión peptídica entre la arginina 152 y la isoleucina 153. La cadena liviana de FVIIa está compuesta por los dominios Gla y tipo EGF N-terminales y la cadena pesada está compuesta por el dominio serina proteasa. Las cadenas pesada y liviana están unidas entre sí por un solo enlace disulfuro entre la cisteína 135 y cistefna 262. Una vez activado, el FVIIa cataliza rápidamente la conversión de FX en FXa y de FIX en FlXa. Luego el FXa forma un complejo con FVa para clivar la protrombina, dando como resultado la generación de pequeñas cantidades de trombina (Aitken, M. G. EMA, 16: 446-455 (2004)). Esta generación de trombina activa a las plaquetas y a los cofactores V, VIII y XI sobre la superficie de las plaquetas. La activación conduce a un estallido de trombina que provoca la polimerización de fibrina y la formación de un tapón hemostático.
El FVIIa recombinante humano fue desarrollado y comercializado por Novo Nordisk como NovoSeven® (eptacog alfa [activado], código ATC B02BD08). NovoSeven® cuenta con licencia para el tratamiento de episodios de hemorragia en pacientes con hemofilia A o B que han desarrollado anticuerpos inhibidores contra FVIII o IX, respectivamente (Jurlander et al., Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 27: 373-383 (2001 ); Roberts er a/., Blood, 15: 3858-3864 (2004)). El tratamiento ha demostrado ser seguro y efectivo desde su lanzamiento en 1996. Sin embargo, debido a la vida media ¡n vivo relativamente corta (2.3 horas; Resumen de las bases de aprobación de NovoSeven®, N° de referencia de la FDA 96-0597) de las proteínas, puede ser necesario administrar múltiples infusiones de dosis altas del producto (90 ytg kg"1) en el tiempo durante un episodio de hemorragia individual con el fin de lograr la hemostasis. La vida media corta del producto y la dosis alta requerida para obtener el efecto terapéutico deseado excluye el uso habitual de NovoSeven® para un tratamiento profiláctico con inhibidores de los hemofílicos. Por ello, persiste claramente la necesidad de desarrollar moléculas de FVIIa con una mayor vida media, de producir mejoras en la farmacocinética (PK) y en la farmacodinámica (PD).
El Factor VIII (FVIII) es un factor de coagulación sanguíneo esencial también conocido como factor anti-hemofílico (AHF). En seres humanos, el Factor VIII está codificado por el gen F8. Los defectos en este gen dan como resultado la hemofilia A, un trastorno de la coagulación ligado a X recesivo bien conocido que afecta aproximadamente a 1 de cada 5,000 varones.
El gen F8 ligado a X codifica un polipéptido de 2351 aminoácidos de 26 exones que después del clivaje del péptido señal se convierte en la molécula FVIII madura de 2332 aminoácidos (Wang et al., Int. J. Pharmaceutics, 259: 1-15 (2003)). Se ha encontrado que el FVIII es sintetizado y liberado al torrente sanguíneo por el endotelio vascular, glomerular y tubular, y las células sinusoidales del hígado aunque todavía existe una considerable ambigüedad con respecto a cuál sería el sitio de liberación primario en humanos. La molécula FVIII está organizada en seis dominios proteicos; NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. La molécula madura contiene numerosas de modificaciones de postraducción incluyendo glicosilación ligada a N y ligada a O, sulfonación y formación de enlaces disulfuro. FVIII contiene un total de 23 residuos cisteína, de las cuales 16 forman 8 enlaces disulfuro en los dominios A y C de la proteína (McMullen et al., Protein Science, 4: 740-746 (1995)). Debido a la modificación de postraducción de la proteína, su peso molecular en circulación puede ser de hasta 330 kDa dependiendo del nivel y tipo de glicosilación. FVIII también es procesado proteolíticamente de modo que la especie en circulación es un heterodímero compuesto por una cadena pesada (A1-A2-B) y una cadena liviana (A3-C1-C2). Cuando el FVIII es secretado hacia la circulación se une al Factor de von Willebrand (vWF) de una manera no covalente. La unión de las dos moléculas comprende los dominios A3 y C2 de la cadena liviana de FVIII (Lacroix-Desmazes et al., Blood, 112: 240-249 (2008)). La unión al vWF aumenta la estabilidad y la vida media en circulación del FVIII. Aunque la unión al vWF aumenta la vida media en circulación del FVIII, su vida media nativa es de 15-19 horas.
El Factor VIII es un cofactor esencial que participa en la vía de coagulación sanguínea intrínseca. Su rol en la cascada de coagulación consiste en actuar como un "templado de nucleación" para organizar los componentes del complejo FXasa en la orientación espacial correcta sobre la superficie de plaquetas activadas (Shen et al., Blood, 111 : 1240-1247 (2008)). El FVIII es activado inicialmente por la trombina (Factor Ha) o por el FXa y luego se disocia del vWF en la forma del FVIIIa. El FVIIIa se une luego a las plaquetas activadas en el sitio de la lesión vascular y se une al FlXa por una interacción mediada por A2 y A3. La unión del FlXa al FBI, en la presencia de Ca2+, sobre la superficie de plaquetas aumenta la actividad proteolítica del FlXa en aproximadamente 200,000 veces. Después, este complejo activa FX en FXa. El Factor Xa, con su cofactor el Factor Va, activa luego más trombina. La trombina a su vez diva al fibrinógeno en fibrina que luego se polimeriza y entrecruza (usando el Factor XIII) en un coágulo sanguíneo de fibrina.
Cuando ya no está protegido por el vWF, el FVIII activado es inactivado proteolíticamente en el proceso (fundamentalmente por la proteína C y el Factor IXa activados) y es depurado rápidamente del flujo sanguíneo.
El Factor IX (también conocido como el factor Christmas) es una serina proteasa del sistema de coagulación y una deficiencia de esta proteína es la causa de la hemofilia B. El Factor IX es producido como un precursor de zimógeno inactivo que luego es procesado para eliminar el péptido señal, seguido por una glicosilación adicional y subsiguiente clivaje por el Factor Xla o el Factor Vlla para producir una forma de dos cadenas ligadas por un puente disulfuro (Scipio et al J Clin Invest, 1978; 61(6): 1528-1538). Una vez activado como el Factor IXa, y en la presencia de Ca2+, fosfolípidos de membrana y un cofactor del Factor VIII, hidroliza un enlace de arginina-isoleucina en el Factor X para formar el Factor Xa. El Factor IX es inhibido por la antitrombina.
La hemofilia B es un trastorno de hemorragia ligado a X causado por una cantidad de mutaciones en el gen del factor IX, dando como resultado una deficiencia de la proteína procoagulante efectiva. La hemofilia B, también conocida como enfermedad de Christmas, es la consecuencia de un FIX no funcional o deficiente que impide el inicio normal de la cascada intrínseca. En esta condición se pueden desarrollar eventos de hemorragia severos y potencialmente mortales que se pueden corregir mediante la administración oportuna de una cantidad adecuada del FIX. La hemostasis se puede mantener mientras el zimógeno en circulación se encuentra en el rango terapéutico.
Históricamente, la hemofilia B se ha tratado mediante administración intravenosa de FIX plasmático o concentrado del complejo de protrombina y más recientemente con un FIX recombinante y derivado de plasma altamente purificado. El advenimiento del FIX recombinante humano de células de ovario de hámster chino (células CHO) ha transformado el tratamiento de la enfermedad de Christmas haciendo posible ahora una terapia profiláctica, en particular en niños pequeños. Sin embargo, en este sentido el factor limitante es la vida media corta y su potencial "super potencia" que conjuntamente han restringido la terapia profiláctica a intervalos de aproximadamente 3 días.
Uno de los problemas para los médicos que buscan un tratamiento de pacientes con trastornos de la coagulación sanguínea y otros trastornos es la manera de hallar una dosificación terapéutica de larga duración de un agente terapéutico, tal como una composición de un factor de coagulación sanguíneo, para ser administrada a dichos pacientes. Otro problema, en particular con respecto al uso profiláctico de dichos agentes, es el mantenimiento de un nivel de infusión, distribución y eliminación predecible, de estado estable, de los agentes terapéuticos en el cuerpo, evitando así los "estallidos" o "picos" en forma de dientes de sierra de los niveles del agente y de sus efectos.
Por ejemplo, la regulación de la coagulación sanguínea es un proceso que presenta numerosos problemas de salud importantes, incluyendo tanto la imposibilidad de formar coágulos sanguíneos como la trombosis, que es la formación de coágulos sanguíneos indeseados. Los agentes que impiden la formación de coágulos indeseados se usan en muchas situaciones y existe una gran variedad de agentes disponibles. Desafortunadamente, la mayoría de las terapias actuales tienen efectos secundarios indeseables. Los anticoagulantes administrados por vía oral, tal como la warfarina, actúan inhibiendo la acción de la vitamina K en el hígado, impidiendo de esa manera una carboxilación completa de residuos de ácido glutámico en las proteínas dependientes de vitamina K, dando como resultado una concentración disminuida de las proteínas activas en el sistema circulatorio y una capacidad reducida para formar coágulos. La terapia con warfarina es complicada debido a la naturaleza competitiva del fármaco con su blanco. Las fluctuaciones de la vitamina K de la dieta pueden dar como resultado una sobredosis o subdosts de warfarina. Las fluctuaciones en la actividad de coagulación son el resultado indeseable de esta terapia.
Las sustancias inyectadas, tal como la heparina, incluyendo la heparina de bajo peso molecular, también son anticoagulantes utilizados comúnmente. Nuevamente, estos compuestos tienen el riesgo de sobredosis y deben ser monitoreados cuidadosamente.
Otro fenómeno que limita la utilidad de los péptidos terapéuticos es la vida media in vivo relativamente corta que presentan algunos de estos péptidos. En términos generales, el problema con la vida media corta in vivo significa que los glicopéptidos terapéuticos deben administrarse con frecuencia y a dosificaciones elevadas, que finalmente se traduce en un mayor riesgo de reacciones adversas locales y mayores costos de asistencia de salud que las necesarias si estuviera disponible un método más eficiente para mantener niveles terapéuticamente eficaces de los fármacos de glicoproteínas.
La capacidad para asegurar el suministro de los agentes terapéuticos por medio del sistema linfático provee una infusión controlada del agente. La mayor hidrofilicidad también ayuda a proteger a la molécula contra daños por enzimas de degradación, el sistema inmune, etc. Aún más, la mayor movilidad en agua vuelve a los agentes terapéuticos más biodisponibles, lo cual conduce a requerimientos menores de dosificación. Esto a su vez puede dar como resultado menos efectos secundarios, un tratamiento más eficiente y menos tiempo de cuidado médico.
Sorprendentemente, los inventores han mostrado que se puede obtener un nivel de agente terapéutico de 'estado estable' más consistente de manera sistemática cuando se lo modifica de acuerdo con la invención y se administra en el espacio subcutáneo. Esta mayor consistencia en el 'estado estable' puede atribuirse a una combinación de velocidad de introducción en el sistema vascular a través del sistema linfático (es decir, una infusión), balanceada contra las velocidades de metabolismo y/o de degradación por el sistema inmune y la velocidad de eliminación por los ríñones o el tracto Gl.
La administración subcutánea de un agente modificado de acuerdo con la presente invención puede permitir entonces mitigar los picos y depresiones de 'dientes de sierra' observados comúnmente con una administración repetida de inyección de bolos. Sin embargo, se puede administrar una dosis más grande por administración subcutánea de manera tal que la Cmáx sea la misma que la obtenida con una inyección intravenosa, en cuyo caso se logra una mayor duración del efecto terapéutico del agente modificado debido a la menor velocidad de infusión por el sistema linfático hacia el sistema vascular. Por consiguiente, la presente invención puede dar como resultado una administración menos frecuente. Como alternativa, se podría considerar la misma frecuencia de administración con una menor dosis cuando se emplea una administración subcutánea de acuerdo con la invención, en lugar de la administración intravenosa.
En otras palabras, para una duración dada (tal como 4 días) la relación de CmáX:CPromedio de una dosis administrada por vía subcutánea de un agente modificado es menor que cuando se administra la misma dosis por vía intravenosa. Esto constituye claramente una ventaja dado que los niveles del agente modificado en el torrente sanguíneo son más consistentes.
Como podrá apreciar el especialista en el arte, una menor Cmáx puede ser beneficioso para el paciente, como también una menor relación de Cmáx: Comedio o Cmáx:Cm¡n (es decir, un gráfico de picos y depresiones aplanados en comparación con el perfil típico de "dientes de sierra" de un fármaco administrado por vía intravenosa).
El Factor Vlla, por ejemplo, ilustra este problema y la modificación muestra la solución de la invención al mismo. Los Factores VII y Vlla tienen valores de vida media en circulación de aproximadamente 2-4 horas en seres humanos. Es decir, en el transcurso de 2-4 horas, la concentración del péptido en suero se reduce a la mitad. Cuando se usa al Factor Vlla como procoagulante para tratar determinadas formas de hemofilia, el protocolo estándar consiste en inyectar Vlla cada dos horas y a dosificaciones altas (45 a 90 g/kg de peso corporal). Véase, Hedner et al., Transfus. Med. Rev. 7: 78-83 (1993)). Por consiguiente, el uso de estas proteínas como procoagulantes o anticoagulantes (en el caso del factor VII) requiere que las proteínas sean administradas a intervalos frecuentes y a dosificaciones altas.
La conjugación de biofármacos con polímeros biocompatibles se ha utilizado exitosamente con anterioridad para mejorar las características fisicoquímicas de tales productos terapéuticos. Las características de las proteínas que fueron mejoradas por conjugación incluyen PK, PD y la inmunogenicidad. La unión de un grupo químico a una proteína puede aumentar significativamente su vida media en circulación (Jevsevar ef al., Biotechnol., J., 5: 113-128 (2010)). En el caso de especies moleculares con pesos moleculares inferiores al límite de filtración glomerular, la conjugación de un grupo de gran peso molecular impide la depuración renal del producto. Además, la adición de grupos químicos a productos farmacéuticos puede prevenir la eliminación mediada por receptores de la molécula por impedimento esférico.
El uso de modificación de moléculas, tales como polímeros biocompatibles que vuelven a los agentes terapéuticos más hidrofílicos también puede ayudar a reducir o prevenir una respuesta inmune al agente terapéutico introducido. La modificación provee un 'escudo de agua' alrededor del agente, que puede 'ocultar' cualquier epitope al cual de no existir respondería el sistema inmune. La presencia de las moléculas de agua alrededor del agente terapéutico modificado puede formar una estructura de clatrato cuando está en solución acuosa.
Aún más, el uso de la modificación para facilitar la administración subcutánea del agente permite una introducción gradual del agente terapéutico en el cuerpo a través del sistema linfático, evitando así la reacción asociada con inyecciones de bolos o con una infusión intravenosa de dosificaciones grandes, tal como el "síndrome de hombre rojo" asociado con la administración intravenosa de determinados antibióticos.
Por consiguiente, se prevén muchas ventajas con la modificación de dichos agentes terapéuticos para una administración subcutánea y la subsiguiente infusión en el sistema vascular a través del sistema linfático.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, la presente invención provee, como un primer aspecto, un método de administración de un agente terapéutico a un paciente, que comprende administrar dicho agente terapéutico por vía subcutánea al paciente, de manera tal que la relación Cmáx:Cpromed¡0 es menor que la relación Cmáx:Cpromedio del agente cuando se administra por vía intravenosa, y en donde el agente está modificado a fin de incrementar la hidrofilicidad y de modificar las dimensiones moleculares con relación al estado nativo del agente terapéutico. La administración por vía subcutánea es tal que el agente se encuentra a una concentración más consistente en el torrente sanguíneo del paciente durante el período de tratamiento en comparación con la administración intravenosa, lo cual permite reducir la relación Cmá0<:Cpromedio- También se provee un método de administración de un agente terapéutico en el sistema linfático de un paciente, que comprende el paso de administrar dicho agente terapéutico por vía subcutánea, de manera tal que no ingresa directamente en el sistema circulatorio del paciente en el sitio de inyección, y en donde el agente terapéutico está modificado para aumentar la hidrofilicidad y para modificar las dimensiones moleculares con relación al estado nativo del agente terapéutico, de manera tal que dicho agente modificado no puede ingresar directamente en la circulación desde el sitio de administración.
Se provee además un método para prevenir el ingreso de un agente terapéutico directamente en el sistema circulatorio local de un paciente luego de la administración por vía subcutánea del agente terapéutico a dicho paciente, donde dicho método comprende el paso de administrar por vía subcutánea el agente modificado al paciente y en donde el agente está modificado con el fin de aumentar la hidrofilicidad y de modificar las dimensiones moleculares con relación al estado nativo del agente terapéutico.
La administración por vía subcutánea del agente modificado permite: administrar una dosis más alta del agente al paciente que con la inyección de bolo intravenoso; administrar una nueva dosis al paciente antes que si el agente modificado se administra por vía intravenosa; una respuesta inmunogénica menor o equivalente que con la administración intravenosa del agente modificado; provee un beneficio terapéutico al paciente por una duración de por lo menos 12 horas más que el beneficio terapéutico del agente modificado cuando se administra por vía intravenosa; y el agente se puede administrar a una concentración mayor que la concentración del agente modificado que puede administrarse con seguridad por vía intravenosa.
La hidrofilicidad aumenta en por lo menos la relación de las dimensiones moleculares del agente modificado con respecto a las dimensiones moleculares del agente no modificado. La hidrofilicidad se refiere al balance hidrofílico-lipofílico (HLB), que se puede definir como la afinidad por el agua que en el contexto de esta invención implica una menor capacidad de adhesión superficial y una mayor dispersión en agua.
Los métodos de la invención permiten modular la velocidad de distribución de un agente terapéutico desde un depósito subcutáneo en un sujeto, que comprende modificar el agente terapéutico para alterar la hidrofilicidad de dicho agente, donde el nivel de hidrofilicidad es proporcional al nivel de biodisponibilidad.
Sorprendentemente, se ha encontrado que para lograr la mayor duración de liberación depot desde el espacio subcutáneo, se requiere un menor grado de modificación. Sin vinculación a ninguna teoría, se puede razonar que con un menor grado de modificación queda expuesto algo de agente terapéutico al tejido subcutáneo, lo cual confiere una velocidad lenta a la difusión a través de la linfa. Por el contrario, un mayor grado de modificación cubre al agente terapéutico por completo dejando que el producto ingrese rápidamente a la circulación sanguínea.
También se ha mostrado que la biodisponibilidad favorece a los agentes terapéuticos más modificados, es decir, especies di o trimodificadas en comparación con las especies monomodificadas. Por ello los inventores de la presente han confirmado que los grados de modificación y los niveles de hidratación más altos promueven un grado mayor de movilidad y por consiguiente de biodisponibilidad.
En consecuencia, para cualquier agente terapéutico dado, ahora la liberación desde un depósito subcutáneo puede modularse aumentando o disminuyendo el nivel de modificación del agente terapéutico.
De acuerdo con la invención, la administración subcutánea puede ser por inyección subcutánea, aplicación tópica, parche transdérmico, abrasión microdérmica, administración de polvo seco a presión alta o mediante cualquier otro método para introducir un fármaco en el espacio subcutáneo.
Un aspecto adicional de la invención provee un agente modificado que comprende un agente terapéutico y una modificación, en donde la modificación aumenta la hidrofilicidad y modifica las dimensiones moleculares del agente con relación al estado nativo del agente terapéutico para su uso en un método de acuerdo con el primer aspecto y aspectos adicionales. La modificación del agente puede aumentar la hidrofilicidad en por lo menos un 50% y las dimensiones moleculares en por lo menos un 50% del agente con relación al estado nativo del agente terapéutico.
Un ejemplo de un polímero biocompatible que se ha usado en varios productos biofarmacéuticos comerciales es el polietilenglicol (denominado PEG en la presente). El proceso de unir covalentemente una molécula de PEG con otra molécula se conoce como PEGilación. Hasta la fecha, hay nueve productos PEGilados que han recibido la aprobación de comercialización de la FDA, siendo cuatro de ellos fármacos populares: Peglntron® (Schering-Plough), Pegasys® (Hoffman-La Roche), Neulasta® (Amgen) y Micera® (Hoffman-La Roche). Se han utilizado diferentes químicas para conjugar proteínas terapéuticas con moléculas de PEG activadas. Se ha usado exitosamente la PEGilación aleatoria para unir covalentemente unidades de PEG a proteínas a través de los grupos amino de las proteínas. Los sitios de unión han comprendido con mayor frecuencia, si bien no exclusivamente, el grupo e-amino de las cadenas laterales de residuos de lisina. Dichas reacciones aleatorias pueden producir mezclas muy complejas de conjugados que varian en cuanto a número y sitio de unión de unidades PEG. Aún después de la purificación de las reacciones de conjugación aleatorias, puede haber isómeros de posición que presentan características fisicoquímicas y farmacéuticas muy diferentes. Se han desarrollado técnicas de PEGilación específicas del sitio y ahora se aprovechan para producir biofármacos mejor definidos.
Los abordajes para que la PEGilación sea específica del sitio incluyen PEGilación dirigida al extremo N-terminal, a cisteína, a glucano, a disulfuro y a polihistidina.
Se ha demostrado que el uso de PEG para derivatizar péptidos terapéuticos reduce la inmunogenicidad de los péptidos. Por ejemplo, en US 4179337 se divulgan polipéptidos no inmunogénicos, tales como enzimas y hormonas peptídicas, acoplados a polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol. Además de una inmunogenicidad reducida, el tiempo de depuración de la circulación se prolonga debido al mayor tamaño del conjugado PEG de los polipéptidos en cuestión.
El principal modo de unión de PEG, y sus derivados, a los péptidos es una unión no específica a través de un residuo de aminoácido de un péptido (véase US 4088538, US 4496689, US 4414147, US 4055635 y WO 87/00056). Otro modo de unir PEG a péptidos es por medio de ia oxidación no especifica de residuos glicosilo de un glicopéptido (véase WO 94/05332).
En estos métodos no específicos, se agrega polietileneglicol de una manera aleatoria, no especifica a los residuos reactivos sobre el esqueleto peptídico. Por supuesto, la adición aleatoria de moléculas de PEG tiene sus desventajas, incluyendo la falta de homogeneidad del producto final, y la posibilidad de una reducción en la actividad biológica o enzimática del péptido. Por ello, en la producción de péptidos terapéuticos, una estrategia de derivatización que da como resultado la formación de un producto marcado específicamente, fácilmente caracterizable, esencialmente homogéneo, es considerada superior.
El estado del arte en la PEGilación de agentes terapéuticos, tales como factores de coagulación sanguíneos recombinantes, tal como el FVIIa, el FVIII y el FIX, se puede resumir de la siguiente manera. En WO 98/32466 se sugiere que el FVII puede ser PEGilado, pero no contiene ninguna información adicional sobre el tema. En US 2008/0200651 se divulga que polipéptidos FVII con una actividad de tipo salvaje, o aumentada, con una molécula de PEG conjugada a los mismos por medio de un residuo cisteína introducido artificialmente presentan una mayor vida media in vivo. En US 2008/0221032 se describe la producción de un conjugado de FVIIa-ácido polisiálico que resultó en una molécula que presenta una vida media in vivo significativamente aumentada. En US 2009/0176967 se divulga que se pueden usar enzimas para introducir grupos funcionales específicos en el extremo C-terminal del polipéptido FVII al cual se pueden acoplar polímeros biocompatibles, tal como PEG. En US 2009/0227504 se describen preparaciones de FVIIa (o de moléculas tipo FVIIa) donde se modifica covalentemente una, o más, cadenas de oligosacáridos ligados a asparagina y/o serina con por lo menos un grupo polimérico que presentan una vida media en suero mejorada. En US 2010/0028939 se describe cómo se pueden modificar las glicoproteínas naturales usando la enzima galactosa oxidasa para producir funcionalidades aldehido reactivas en los extremos glucano. Luego se pueden usar los aldehidos reactivos para conjugar unidades poliméricas con la proteína para obtener un producto con características farmacológicas mejoradas. En US 2010/0056428 se sugiere que es posible mejorar las características farmacocinéticas del FVIIa por derivatización de la glicoproteína por una oxima de una unidad polimérica tal como PEG en un grupo glicosilo. Se han publicados los correspondiente informes con relación al FVIII y FIX; véase US 2008/0255026 y US 7683158, respectivamente.
Otro abordaje para la PEGilación de proteínas fue desarrollado por Polytherics y se conoce como TheraPEG™, en donde se une un polímero de PEG a la proteína de interés por medio de un enlace disulfuro reducido de un par de residuos de cisteína en la protelna (WO 2005/007197). La técnica se ha utilizado para preparar una versión PEGilada del Factor IX libre de contaminación a partir del Factor FlXa (WO 2009/130602), el Factor VII PEGilado (WO 2011/135308) y el Factor VIII PEGilado (WO 2011/135307).
Ahora los inventores de la presente han descubierto que la administración por vía subcutánea de agentes terapéuticos modificados, tales como formas PEGiladas de los factores de coagulación sanguíneos puede dar como resultado una vida media mejorada y una actividad en plasma prolongada en comparación con las formas equivalentes administradas mediante administración intravenosa, en particular cuando "se ajusta la dosis". La ubicación específica en la cual se aplica la inyección subcutánea puede aumentar o disminuir el tiempo inicial en que el agente modificado aparece en el sistema sanguíneo. En cualquier caso, se logra una relación Cmáx^Cpromedio menor; se observan perfiles farmacocinéticas similares que habitualmente están asociados con formulaciones de liberación sostenida y semejantes. La desventaja de administrar agentes no terapéuticos modificados por vía subcutánea es que pueden ingresar directamente en el sistema cardiovascular, y así la Cmáx resultante y la duración dependen en gran medida de la condición vascular del sitio de la inyección subcutánea. Claramente, una región altamente vascularizada captará más rápidamente una cantidad del agente cuando se lo administra mediante una inyección subcutánea en dicha área que una inyección en un área menos vascularizada. Es posible superar tales inconsistencias con el uso de los agentes modificados de la invención para una administración subcutánea.
La provisión de un agente terapéutico modificado de acuerdo con la presente invención da como resultado una molécula suministrada en el sistema cardiovascular a través del sistema linfático y por ello es independiente de la vasculatura en el sitio de inyección, lo cual conduce a una velocidad de administración más predecible, consistente, en la circulación a través del sistema linfático.
Las especulaciones previas en el arte acerca de las formulaciones de agentes terapéuticos, incluyendo factores de coagulación sanguíneos, no apreciaban las ventajas que podrían derivar de la formulación de tales factores para su administración por vía subcutánea. En particular, no hay indicio o sugerencia alguna que dichas formulaciones, cuando administradas por vía subcutánea, permitirían suministrar y mantener una hemostasis normal por periodos de tiempo prolongados o que podrían proveer un nivel de biodisponibilidad del fármaco más constante (menor relación Cmáx Cpromedio), que se debe al efecto de infusión constante obtenido. El sistema linfático provee un líquido acuoso, en el cual las paredes de los vasos contienen colágeno. Cualquier molécula que sea demasiado grande como para atravesar las paredes de los vasos sanguíneos debe utilizar el drenaje linfático para alcanzar el torrente sanguíneo. Sin embargo, si existe un grado de carácter hidrofóbico en la molécula, es probable que se adhiera al tejido antes de ingresar en el sistema linfático y en las paredes del vaso linfático y, por lo tanto, será inmóvil en el fluido. Por el contrario cuando se provee un grupo hidrofílico, los agentes modificados se dispersarán con más facilidad en la fase acuosa de la linfa y serán drenados fácilmente hacia el sistema para ingresar en el torrente sanguíneo por el ducto torácico.
El agente terapéutico de cualquiera de los aspectos puede ser una molécula pequeña, una macromolécula, un polímero y un polipéptido, en donde una molécula pequeña incluye hipnóticos y sedantes, antiarrítmicos, antioxidantes, agentes antiasmáticos, agentes hormonales incluyendo anticonceptivos, simpaticomiméticos, diuréticos, agentes reguladores de lípidos, agentes antiandrogénicos, antiparasitarios, anticoagulantes, neoplásicos, antineoplásicos, hipoglucémicos, psicoenergizantes, tranquilizantes, fármacos respiratorios, anticonvulsivantes, relajantes musculares, agentes antiparkinsonianos (antagonistas de dopamina), citoquinas, factores de crecimiento, agentes anticáncer, agentes antitrombóticos, antihipertensivos, fármacos cardiovasculares, analgésicos, antiinflamatorios, fármacos anti-ansiedad (ansiolíticos), supresores del apetito, agentes antimigraña, contracturantes musculares, agentes antiinfecciosos (antibióticos, antivirales, antifúngicos, vacunas), antiartríticos, agentes antimalaria, antieméticos, antiepilépticos, broncod ¡latadores, agentes nutricionales y suplementos, suplementos para el crecimiento, agentes antienteritis, vacunas, anticuerpos, agentes de diagnóstico y agentes de contraste.
Los ejemplos de agentes adecuados para su uso en la invención incluyen, pero en un sentido no taxativo, calcitonina, eritropoyetina (EPO), ceredasa, cerezima, ciclosporina, factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), trombopoyetina (TPO), inhibidor de la alfa-1 proteinasa, elcatonina, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GMCSF), hormona de crecimiento, hormona de crecimiento humana (HGH), hormona de liberación de la hormona de crecimiento (GHRH), heparina, heparina de bajo peso molecular (LMWH), alfa-interferón, beta-interferón, gamma-interferón, receptor de interleuquina-1 , interleuquina-2, antagonista del receptor de interleuquina-1 , interleuquina-3, interleuquina-4, interleuquina-6, hormona de liberación de la hormona luteinizante (LHRH), factor IX, insulina, proinsulina, análogos de insulina (por ejemplo, la insulina mono-acilada que se describe en la Patente de los EE.UU. N°: 5,922,675), amilina, péptido C, somatostatina, análogos de somatostatina incluyendo octreotida, vasopresina, hormona folículo estimulante (FSH), factor de crecimiento tipo insulina (IGF), insulinotropina, factor estimulante de colonias de macrófagos ( -CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factores de crecimiento tisular, factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento glial (GGF), factor de necrosis tumoral (TNF), factores de crecimiento endoteliales, hormona paratiroide (PTH), péptido tipo glucagón, timosina alfa 1 , inhibidor llb/llla, alfa-1 antitripsina, compuestos de fosfodiesterasa (PDE), inhibidores de VLA-4, bifosfonatos, anticuerpo contra el virus sincicial respiratorio, gen del regulador transmembrana de la fibrosis qulstica (CFTR), desoxirribonucleasa (Dnasa), penicilinas antipseudomonales como carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina y piperacilina; cefalosporinas como cefpodoxima, cefprozilo, ceftbuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefradrina, cefoxitina, cefamandol, cefazolina, cefaloridina, cefaclor, cefadroxilo, cefaloglicina, cefuroxima, ceforanida, cefotaxima, cefatrizina, cefacetrilo, cefepima, cefixima, cefonicida, cefoperazona, cefotetán, cefmetazol, ceftazidima, loracarbef y moxalactama, monolactamas como aztreonam; proteína para aumentar la permeabilidad/bactericida (BPI), anticuerpo anti-CMV, ácido 13-cis-retinoico, macrólidos tales como eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, roxitromicina, claritromicina, davercina, azitromicina, fluritromicina, diritromicina, josamicina, espiramicina, midecamicina, leucomicina, miocamicina, rokitamicina, andazitromicina y swinolida A; fluoroquinolonas tales como ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, trovafloxacina, alatrofloxacina, moxifloxicina, norfloxacina, enoxarina, grepafloxacina, gatifloxacina, lomefloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, pefloxacina, amifloxacina, fleroxacina, tosufloxacina, prulifloxacina, irloxacina, pazufloxacina, clinafloxacina y sitafloxacina, aminoglicósidos tales como gentamicina, netilmicina, paramecina, tobramicina, amikacina, kanamicina, neomicina y estreptomicina, vancomicina, teicoplanina, rampolanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina, colistimetato, polimixinas tal como la polimixina B, capreomicina, bacitracina, penemas; penicilinas incluyendo agentes sensibles a penicilinasa como la penicilina G, la penicilina V, agentes resistentes a la penicilinasa como meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, nafcilina; agentes activos contra microorganismos Gram-negativos como la ampicilina, amoxicilina y hetacilina, cilina y galampicilina; y carbapenemas tales como imipenem, meropenem, isetionato de pentamidina, sulfato de albuterol, lidocalna, sulfato de metaproterenol, diprepionato de beclometasona, triamcinolona acetamida, budesonida acetonida, fluticasona, bromuro de ipratropio, flunisolida, cromolina de sodio, tartrato de ergotamina y, cuando corresponda, análogos, agonistas, antagonistas, inhibidores y sales farmacéuticamente aceptables de los precedentes antibióticos, factores sanguíneos, hormonas, factores de crecimiento, otros péptidos o proteínas terapéuticos o anticuerpos monoclonales o moléculas pequeñas. Preferiblemente, el agente a modificar se puede seleccionar del grupo que consiste en el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand y la protefna C. En algunas formas de realización el factor de coagulación sanguíneo preferiblemente es el Factor VII, el Factor VIII o el Factor IX.
El agente de acuerdo con la invención se puede modificar con cualquier polímero biocompatible, tal como polietilenglicol (PEG), polifosfatidil colina (PC), polipropilenglicol (PPG), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, óxido de polietileno (PEO), poliol polioxietilado, alcohol poliolefínico, polihidroxialquilmetacrilato, polisacáridos, ácido poli a-hidroxi, alcohol polivinílico, polifosfaceno, poli N-acriloilmorfolina, polímeros de óxido de polialquileno, ácido polimaleico, poli DL-alanina, carboximetilcelulosa, dextrano, almidón o derivados de almidón, ácido hialurónico, quitina, polimetacrilatos, ácido polisiálico (PSA), polihidroxi alcanoatos, poliaminoácidos y combinaciones de los mismos. El polímero biocompatible puede ser de estructura lineal o ramificada.
En una forma de realización adicional, el polímero biocompatible es una proteína seleccionada, pero en un sentido no taxativo, del grupo que consiste en albúmina, transferrina, inmunoglobulinas incluyendo anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpo por ejemplo; anticuerpos de un solo dominio, VL, VH, Fab, F(ab')2, Fab', Fab3, scFv, di-scFv, sdAb, Fe y combinaciones de los mismos.
En algunas formas de realización, la mayor hidrofilicidad / solubilidad del agente terapéutico modificado suministrado por vía subcutánea permite constituir al agente a una mayor concentración en un medio de administración que si fuera administrado por vía intravenosa. En el caso de administrar el producto farmacéutico por inyección, se podrá emplear un menor volumen de inyección que es más adecuado administrar por vía subcutánea. Además, a concentraciones mayores, donde se podría esperar una autocatálisis de un agente no modificado, la modificación impide la autodigestión del agente, lo que en la forma no modificada podría haber conducido a productos secundarios indeseables, peligrosos. Por ejemplo, el factor sanguíneo IX no modificado se autocatalizará a concentraciones altas produciendo el factor IXa, que es peligrosamente trombogénico.
Por lo tanto, en otro aspecto de la presente invención, el volumen de administración subcutánea del agente terapéutico modificado no es mayor que 2 mi. Preferiblemente, el volumen de administración puede ser de 5 µ?, 10 µ?, 25 µ?, 50 µ?, 100 µ?, 250 µ?, 500 µ?, 750 µ? o 1 mi. En formas de realización alternativas, el volumen de administración del agente puede ser no mayor que 1.5 mi, 2 mi, 2.5 mi, 3.0 mi o 3.5 mi. Es importante destacar que la presente invención permite suministrar una mayor concentración de un agente activo en una sola inyección subcutánea de manera más segura que por inyección intravenosa, dado que no es administrado directamente en el torrente sanguíneo del paciente. Esto es particularmente importante cuando se trata de factores de coagulación sanguíneos, dado que la concentración alta de los factores de coagulación sanguíneos administrados por vía intravenosa puede dar como resultado coágulos sanguíneos indeseables y peligrosos en el paciente. La administración subcutánea permite una infusión constante del agente activo en el flujo sanguíneo a través del sistema linfático, evitando así el efecto de niveles peligrosos de un agente activo que está siendo suministrado directamente en el sistema sanguíneo. Por ello, dado que la concentración de administración del agente en el flujo sanguíneo es regulada por el sistema linfático del paciente, se puede suministrar una mayor concentración en una dosis para administración por vía subcutánea, que permitirá usar volúmenes menores que las utilizadas tradicionalmente con una administración intravenosa.
El alcance de la presente invención incluye agentes terapéuticos que pueden ser modificados por modificación hidrofílica para aumentar la hidrofilicidad y para modificar las dimensiones moleculares con el fin de prevenir su entrada directa en el sistema vascular por las paredes de los vasos sanguíneos y que pueden administrarse al paciente mediante administración subcutánea, para ingresar en el sistema circulatorio a través del sistema linfático. Los métodos para modificar tales agentes también están incluidos en la invención.
Las formas de dosificación de la invención puede administrarse por lo menos una vez por día, por lo menos dos veces por día, aproximadamente una vez por semana, aproximadamente dos veces por semana, aproximadamente una vez cada dos semanas o aproximadamente una vez por mes. La capacidad para modular la velocidad de liberación del agente terapéutico modificado desde el depósito subcutáneo significa que la administración puede ser controlada más convenientemente.
Para determinadas sustancias terapéuticas, será suficiente un régimen de dosificación de una vez por día, pero en el caso de otras sustancias puede ser más apropiado o deseable un régimen de dosificación más frecuente, donde será posible reducir la cantidad suministrada en cada dosificación administrada por vía subcutánea con relación a una dosificación intravenosa estándar. Así, por ejemplo, una forma de dosificación de la invención puede administrarse una vez por día, dos veces por día (o más si fuera necesario).
La presente invención permite prevenir la rápida elevación y subsiguiente caída (es decir, "dientes de sierra") de la concentración de un agente en la sangre. La presente invención provee una concentración más consistente y predecible del agente en la sangre de un paciente sobre un periodo de tiempo más prolongado que la observada tradicionalmente con agentes no modificados o el mismo producto modificado cuando es suministrado repetidamente por vía intravenosa.
Un beneficio adicional de la presente invención es que permite administrar una dosis más alta del agente por vía subcutánea que la que se puede administrar por vfa intravenosa. Esto da como resultado una mayor duración del beneficio terapéutico que la obtenida comúnmente y de manera segura con una dosificación mayor o más frecuente suministrada por ía intravenosa. Por ejemplo, en el caso de los factores sanguíneos, debido a que los productos se administrarán a través del ducto torácico hacia la vena subclavia, el método permite administrar una mayor cantidad de producto en un solo punto de tiempo como una sola dosis subcutánea que la cantidad posible de administrar en un solo punto de tiempo por vía intravenosa en una vena. El suministro de un bolo de dosis alta en una vena puede causar un evento trombótico indeseable.
Un beneficio adicional de la presente invención permite volver a administrar dosis del agente a intervalos para poder mantener la concentración en sangre del agente en un nivel consistente, proporcionando un efecto terapéutico sostenido constante y predecíble sin necesidad de esperar para administrar una redosificación hasta que la concentración del agente en la sangre disminuya hasta alcanzar niveles terapéuticamente irrelevantes. En la práctica tradicional, se ha retrasado la redosificación intravenosa, con su Cm^ y comienzo de acción inmediatos, hasta que se considera que el nivel del agente terapéutico ha caído hasta un nivel en el cual la adición de la Cmáx de la nueva inyección no alcanzará un nivel potencialmente trombogénico (es decir, reduciendo así el riesgo de un evento adverso), pero que significa que el paciente ha alcanzado un rango "no saludable" de nivel de un agente en su torrente sanguíneo. En otras palabras, normalmente no se suministran dosis subsiguientes al paciente de un agente en tanto todavía existan "niveles saludables", o niveles terapéuticamente eficaces, del agente en el torrente sanguíneo. Sin embargo, la presente invención permite la redosificación del agente mientras los niveles en sangre del agente aún se encuentran en un rango terapéutico efectivo, por lo cual la invención provee un nivel terapéutico más consistente de una proteína en el torrente sanguíneo, lo cual es más idealmente conveniente para una profilaxis. Debido al suministro consistente del agente en el torrente sanguíneo a través del ducto torácico, se evita el problema de aumentar el agente en el torrente sanguíneo hasta niveles indeseablemente altos.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se provee una forma de dosificación de una composición farmacéutica con un factor de coagulación sanguíneo modificado para su administración por vía subcutánea que cuando se formula para una administración subcutánea a un sujeto provee una forma de dosificación para no más de una vez por mes que es suficiente para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa en dicho sujeto de no más de 20 minutos. También se provee una forma de dosificación líquida de un factor de coagulación sanguíneo PEGilado para su administración por vía subcutánea no más de una vez por mes, en donde dicha forma de dosificación tiene una Cmáx de por lo menos un 10% y no más de un 90% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa, para su uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea. Preferiblemente, la Cmáx comprende entre un 20% y un 80%, o entre un 30% y un 70% o entre un 40% y un 60%. Preferiblemente, el factor de coagulación sanguíneo puede ser FVII, FVIII o FIX.
El término "no más de" significa que la forma de dosificación puede administrarse con más frecuencia que el período de tiempo especificado, pero no necesariamente debe hacerse; el efecto de la administración por vía subcutánea de dicha forma de dosificación significa que los efectos por toda la duración de dicho período de tiempo. Sin embargo, debido a la Cmáx menor y más consistente, puede administrarse una dosificación más frecuente sin efectos adversos para el paciente.
Preferiblemente, la forma de dosificación de un factor de coagulación sanguíneo puede ser suficiente como para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa en dicho sujeto menor que 15 minutos o, preferiblemente, menor que 12 minutos. En una forma de realización, la forma de dosificación de un factor de coagulación sanguíneo es una forma de dosificación de por lo menos una vez por semana o es una forma de dosificación de por lo menos una vez por mes, por lo menos una vez cada dos semanas, por lo menos dos veces por semana.
Una forma de dosificación de acuerdo con la invención puede comprender un factor de coagulación sanguíneo seleccionado del grupo que consiste en el Factor Vlla, el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor XIII, el Factor V, el Factor de von Willebrand y la proteína C. Preferiblemente, el factor de coagulación sanguíneo puede ser FVII, FVIII o FIX.
La forma de dosificación de la invención se puede modificar con cualquier polímero biocompatible, según se define en la presente. Preferiblemente, la modificación es una PEGilación.
La forma de dosificación puede tener una Cmáx de por lo menos un 10% y no más de un 90% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa. En formas de realización particulares, la forma de dosificación puede tener una de entre un 10% y un 25% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa. En formas de realización particulares, la forma de dosificación puede tener una Cmáx de entre un 40% y un 60% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa. En formas de realización particulares, la forma de dosificación puede tener una Cmáx de entre un 75% y un 80% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa. En formas de realización particulares, la forma de dosificación puede tener una Cm_« de entre un 75% y un 78.8% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa. En una forma de realización, la Cmáx es de entre un 75 y un 80% y el factor sanguíneo puede ser FVII. En otra forma de realización, la Cmáx es de entre un 10% y un 25% y el factor sanguíneo puede ser FVIII. En aún otra forma de realización, la Cmáx es de entre un 40% y un 60% y el factor sanguíneo puede ser FIX.
También se provee una formulación de dosificación de acuerdo con la invención, en donde dicha dosificación comprende entre 1 y 1000 Ul/kg o entre 5 y 500 Ul/kg o entre 100 y 250 Ul/kg o entre 25 y 50 Ul/kg.
La forma de dosificación de la presente invención permite una dosificación menos frecuente de la forma de dosificación, que aún es suficiente para mantener el tiempo de coagulación de sangre completa en un sujeto de no más de 20 minutos o no más de 15 minutos o no más de 10 minutos. En una forma de realización, la forma de dosificación es suficiente para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa menor que 12 minutos. La forma de dosificación puede ser para no más de una vez cada quince días, no más de una vez por semana, no más de dos veces por semana, no más de una vez cada tres días, no más de una vez cada 2 días, no más de una vez por día o una forma de dosificación más o menos frecuente.
Es importante destacar que un beneficio de la presente invención es que la forma de dosificación, para el caso en que el agente es un factor de coagulación sanguíneo, no necesita administrarse al paciente con mayor frecuencia que estos intervalos con el fin de continuar manteniendo el tiempo de coagulación de sangre completa en un rango saludable, pero puede ser administrado más frecuentemente para ayudar a proporcionar un "estado estable" similar al de una formulación de liberación controlada. Un especialista en el arte generalmente considera que un tiempo de coagulación de sangre completa 'normal' es de entre 10 y 12 minutos, y se considera que cualquier valor inferior a 15 minutos es saludable en un ser humano no hemofílico. Cuando el tiempo de coagulación de sangre completa supera los 20 minutos, se considera que se encuentra en un rango no saludable. Se considera que valores entre 15 y 20 minutos indican que si bien la hemorragia está controlada, no es normal.
En otra forma de realización la forma de dosificación se administra con menos frecuencia que la que fuera posible predecir por la vida media en plasma con una inyección de bolo intravenosa. Por ejemplo, puede ser necesario aplicar una inyección de un bolo del Factor IX modificado una vez a semana, en tanto el mismo agente suministrado por vía subcutánea de acuerdo con la invención, solamente deberá administrarse una vez cada diez días o menos.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se provee una forma de dosificación de una composición farmacéutica de entre 25 y 50 Ul/kg de un factor de coagulación sanguíneo modificado para su administración por vía subcutánea a la misma frecuencia, o a una frecuencia menor, que el factor de coagulación sanguíneo administrado por vía intravenosa.
Por lo tanto, las formulaciones de la presente invención pueden mantener un valor normal de hemostasis por hasta siete días, donde un valor normal se define como un tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) menor que 15 minutos, preferiblemente de aproximadamente 12 minutos o menos.
Las formulaciones de la invención tienen una Cmáx de por lo menos un 10%, hasta no más de un 90% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa. En algunas formas de realización de la invención, el valor puede ser de por lo menos un 75%, 78% u 80%, y el factor sanguíneo puede ser FVII. En algunas formas de realización de la invención, el valor puede ser de por lo menos un 15%, 18% o 20%, y el factor sanguíneo puede ser FVII I. En algunas formas de realización de la invención el valor puede ser del 40%, 45% o 50% y el factor sanguíneo puede ser FIX.
Las formulaciones de formas de realización especificas de la invención, en donde el agente modificado es un factor sanguíneo PEGilado cuando se formulan para una administración subcutánea de no más de una vez por mes, comprenden una dosificación de entre 25 y 50 Ul/kg. En algunas formas de realización la dosificación puede ser de 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 Ul/kg. La dosificación puede ser de entre 25 Ul/kg y 30 Ul/kg, entre 35 Ul/kg y 40 Ul/kg o entre 40 Ul/kg y 50 Ul/kg.
En una forma de realización, cuando la forma de dosificación se prepara como una dosis de 150 Ul/kg, la formulación puede ser adecuada para su administración una vez cada dos semanas a un sujeto que lo necesita. Preferiblemente, la formulación puede ser para una administración de no más de una vez cada dos semanas.
De acuerdo con una forma de realización de la invención, una forma de dosificación de un factor de coagulación sanguíneo modificado cuando se formula para una administración por vía subcutánea, puede dar como resultado el mantenimiento de una hemostasis normal durante por lo menos la mitad de una semana.
Las formas de dosificación de acuerdo con la invención, cuando se administran por vía subcutánea, dan como resultado la necesidad de cantidades menores del factor de coagulación sanguínea (factor de coagulación) modificado para lograr el mismo punto final terapéutico proporcionando así productos más seguros para los sujetos que necesitan el tratamiento. En una forma de realización, la mitad de la dosis ajustada del factor de coagulación sanguíneo modificado administrado por vía intravenosa es suficiente para lograr una hemostasis normal durante por lo menos una semana en los sujetos, en particular cuando el factor de coagulación sanguíneo es el Factor Vlla o el Factor VIII. Un valor adecuado de hemostasis normal es un tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) de aproximadamente 12 minutos, como se describió precedentemente.
Las formulaciones de la invención preferiblemente pueden comprender menos que la mitad de la cantidad terapéuticamente eficaz ajustada para la dosis de una formulación de referencia formulada para una administración intravenosa que comprende al mismo factor de coagulación sanguíneo modificado con el fin de lograr el mismo efecto terapéutico. Por ejemplo, en una forma de realización el factor de coagulación sanguíneo es el Factor IX.
Por consiguiente, la invención también provee una forma de dosificación de un factor de coagulación sanguíneo modificado para su administración por vía subcutánea, en donde la forma de dosificación comprende un 50% de la cantidad ajustada de dosis necesaria para la administración intravenosa con el fin de lograr la misma duración de acción efectiva.
Una formulación adecuada para su administración por vía subcutánea preferiblemente se puede preparar como una formulación acuosa o sustancialmente acuosa. La formulación puede comprender sales, conservantes y estabilizantes y/o excipientes o adyuvantes adicionales, según necesidad. Las formas de dosificación de la invención se pueden proveer como polvos anhidros listas para una formulación extemporánea en un medio acuoso adecuado.
En general se prefiere formular tales formas de dosificación como una formulación acuosa de pH amortiguado. Las soluciones amortiguadoras adecuadas pueden incluir, pero en un sentido no taxativo, aminoácidos (por ejemplo, histidina), sales de ácidos inorgánicos y de metales alcalinos o de metales alcalino-térreos, (por ejemplo sales de sodio, sales de magnesio, sales de potasio, sales de litio o sales de calcio, por ejemplo como cloruro de sodio, fosfato de sodio). Puede contener otros componentes tales como detergentes o emulsionantes (por ejemplo, Tween 80® o cualquier otra forma de Tween®), así como estabilizantes (por ejemplo, benzamidina o un derivado de benzamidina). También puede contener excipientes tales como azúcares (por ejemplo, sacarosa). Los valores de pH adecuados son valores de pH fisiológicos, por ejemplo un pH de entre 6.8 y 7.4. Las formas de dosificación líquidas se pueden preparar listas para su uso en dichos vehículos de administración.
Un "factor de coagulación sanguíneo modificado" es un factor de coagulación sanguíneo (factor de coagulación) que fue ligado a uno o más agentes modificadores, como se describió precedentemente. En algunas formas de realización, la modificación es PEG. La molécula de PEG se puede unir directamente o indirectamente al factor de coagulación sanguíneo. El factor de coagulación sanguíneo PEGilado también se puede definir como un "factor de coagulación sanguíneo conjugado a una molécula de PEG" o como un "conjugado de un factor de coagulación sanguíneo-PEG".
Los factores de coagulación sanguíneo modificados (factores de coagulación) preferiblemente comprenden por lo menos uno entre el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor VI la, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand y la proteína C. En algunas formas de realización, el factor de coagulación sanguíneo preferiblemente es el Factor VII, el Factor VIII o el Factor IX.
Según se usa en la presente, el término "conjugado de un factor sanguíneo" se refiere a una proteína de un factor de coagulación sanguíneo que fue modificada para incluir una modificación, tal como una unidad PEG, distintos de una unidad conjugada, definida previamente.
Los términos Factor Vlla (FVIIa) y Factor VII (FVII) también se usan indistintamente a menos que el contexto especifique lo contrario. El FVIII se usa como una abreviatura para el Factor VIII y FIX se usa como una abreviatura para el Factor IX, y así sucesivamente para los factores sanguíneos que se describen en la presente.
El factor de coagulación sanguínea (factor de coagulación) puede ser de cualquier fuente adecuada y puede ser una proteína recombinante producida mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas de biología molecular o se puede sintetizar químicamente o se puede producir transgénicamente en la leche de un mamífero, o el factor se puede aislar de fuentes naturales (por ejemplo, se puede purificar a partir de plasma sanguíneo). Preferiblemente, el factor es un factor de coagulación sanguíneo de mamífero, tal como un factor de coagulación sanguíneo humano. Las referencias a un factor de coagulación sanguíneo incluyen un factor de formación de coágulos sanguíneos.
Según se indica aquí, la presente invención se relaciona con formulaciones de factores de coagulación sanguíneos que fueron modificadas por conjugación con uno o más agentes modificadores, tales como polímeros de polietilenglicol ("PEGilación"). La modificación del factor de coagulación sanguíneo puede efectuarse mediante cualquier medio conveniente.
Actualmente, Tween® se utiliza extensivamente en la formulación de productos sanguíneos. Tween® 80 es un ácido graso PEGilado cuyo peso molecular equivalente de PEG es de aproximadamente 0.8 kilo Daltons por molécula de Tween®.
Según se describió previamente, todos los factores sanguíneos se caracterizan, entro otros, por la propiedad de adhesión superficial. Esta es una característica necesaria de la cascada de coagulación que requiere que enzimas y cofactores se adhieran a otros participantes de la cascada, a la superficie de plaquetas y al tejido en el sitio de una lesión. Es más, es particularmente importante que el coágulo sanguíneo permanezca en el sitio de la lesión, sin posibles derivas que pudieran causar una trombosis peligrosa. Esta propiedad representa un desafío en la formulación de productos farmacológicos, dado que los factores sanguíneos, tales como Vlla VIII y IX, se adherirán excesivamente a cualquier superficie de vidrio y plástico. En términos prácticos, esto es mitigado por el uso extensivo de polisorbato (por ejemplo, Tween® 80).
En una forma de realización de la presente invención, el FVIII está conjugado con una unidad de polietilenglicol de cadena lineal de 20 kDa. La conjugación de PEG mitiga la propiedad de adhesión superficial de este factor hasta tal grado que ya no es necesario el uso adicional de Tween®.
Cuando es activado en el proceso de coagulación, el conjugado PEG-FVIII aún se adhiere a la superficie de las plaquetas y es un componente pequeño del proceso de coagulación global. En este sentido, se formarán coágulos sanguíneos de manera normal sobre las plaquetas en el sitio de una lesión.
La disminución de la cantidad de polietilenglicol se puede lograr con un factor que está mono-PEGilado, lo cual omite el requerimiento de Tween® adicional en la formulación. Se condujeron cálculos usando Kogenate® FS (Bayer FVIII) para identificar la cantidad total de PEG por mol de FVIII usada en la formulación y efectuar una comparación con una unidad individual conjugada de 20 kDa que no requiere Tween® adicional en su formulación. Por lo tanto, sobre una base de dosis por dosis, una forma de realización de la presente invención provee una reducción de 25.8 veces del polietilenglicol, que, cuando también se tiene en cuenta la frecuencia de dosificación reducida, puede dar como resultado una reducción global en la administración de PEG de aproximadamente 80 veces.
Los inventores de la presente han encontrado que el aumento de la capacidad de carga de agua del producto terapéutico blanco (por ejemplo, por di-PEGilación de un producto versus la mono-PEGilación del mismo), acelera el pasaje del producto hacia el torrente sanguíneo, después de su administración por vfa subcutánea. A la inversa, una disminución de la capacidad de carga de agua (por ejemplo, por mono-PEGilación de los productos versus la di-PEGilación de los mismos), retarda el pasaje del producto hacia el torrente sanguíneo, después de su administración por vía subcutánea, proporcionando un efecto depot. Sin intención de vinculación alguna con la teoría, parecería que el mismo producto con una menor capacidad de carga de agua (por ejemplo, por una mono-PEGilación o con una molécula de PEG más pequeña) resiste la dispersión por el espacio subcutáneo por más tiempo que el mismo producto modificado para tener una mayor capacidad de carga de agua (por ejemplo, por multi-PEGilación o por la unión de una molécula de PEG más grande), proporcionando así el efecto depot mejorado.
Sin intención de vinculación alguna con la teoría, el diseño de un producto para que tenga una característica de mayor carga de agua (por ejemplo, por aumento de la cobertura con PEG mediante di- o multi-PEGilación, por aumento del tamaño del PEG o por uso de moléculas de PEG ramificadas versus lineales) parecería volverlo más dispersable en agua dentro del espacio subcutáneo, lo que conduce a una velocidad de entrada más rápida a través de los vasos linfáticos hacia el plasma; la hidrofilicidad reducida de los productos diseñado para tener una característica de menor carga de agua (por ejemplo, por mono-PEGilación o mediante el uso de moléculas de PEG más pequeñas), parecería dejar más del agente terapéutico hidrofóbico expuesto reduciendo así su dispersabilidad y retardando su entrada en el plasma a través del sistema linfático acuoso.
Esta capacidad para modificar las características de dispersión de una molécula para administración subcutánea, mediante un ajuste selectivo del balance entre hidrofilicidad y hidrofobicidad, provee un exquisito grado de control ante la liberación controlada de un producto desde el espacio subcutáneo hacia el plasma a través de la linfa, que se puede ajustar de acuerdo con las características del agente terapéutico, las necesidades y la fisiología del paciente o una combinación de estos u otros factores importantes.
En algunas formas de realización, cuando la modificación es PEG, el polietilenglicol (PEG) puede tener una estructura lineal o ramificada y se puede unir al agente terapéutico por cualquier ruta conveniente. Cuando el agente terapéutico es una protelna, por ejemplo un factor de coagulación sanguíneo u otra protelna terapéutica descrita en la presente, la conjugación de PEG puede ser por un residuo de serina o treonina en la protelna nativa, por un residuo hidroxilo sobre un residuo de azúcar unido a la protelna nativa o por uno o más residuos de cisteína. La unidad de PEG se puede unir a través de dichos residuos que aparecen en la forma nativa o en las formas recombinantes de la proteína. Las proteínas obtenidas por expresión recombinante permiten una manipulación mediante ingeniería genética específica del sitio para insertar los residuos de aminoácido deseados en una secuencia proteica y/o para controlar los patrones de glicosilación con enzimas glicosilasa específicas. Otras rutas de PEGilación incluyen PEGilación del grupo amida o amino N-terminal, o PEGilación del grupo carboxilo.
La unidad PEG también se puede conjugar con el factor de coagulación sanguíneo, es decir el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand o la proteína C, a través de uno o más enlaces disulfuro de cisteína reducida. Un residuo cisteína es el resultado de la reducción de un enlace disulfuro de cistina en la proteína. Por ejemplo, la conjugación puede ser por medio de un grupo conectar que forma un puente entre los azufre residuos de dos residuos cisteína que formaron un enlace disulfuro en el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand o la proteína C. Por lo tanto, el enlace disulfuro puede ser un enlace disulfuro nativo o un enlace disulfuro introducido de manera recombinante.
En una forma de realización de la invención, el grupo hidrofílico, tal como la cadena de polietilenglicol, está unido por medio de un grupo conectar bivalente entre dos residuos cisteina que normalmente forman un puente disulfuro en la forma nativa del factor de coagulación sanguíneo.
La molécula de PEG puede ser de cualquier peso molecular adecuado, por ejemplo de entre 1 kDa y 100 kDa, entre 10 y 500 kDa, preferiblemente entre 5 y 30 kDa o entre 20 y 30 kDa. Algunos pesos moleculares adecuados incluyen 5, 10, 20 ó 30 kDa. Preferiblemente, la molécula de PEG puede ser de entre 5 kDa y 40 kDa.
Existen diversos tipos de polímeros de polietilenglicol diferentes que formarán conjugados con el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor Xill, el Factor de von Willebrand o la proteína C. Hay polímeros de PEG lineales que contienen una sola cadena de polietilenglicol y hay polímeros de PEG ramificados o de múltiples brazos. El polietilenglicol ramificado contiene 2 o más cadenas de PEG lineales separadas unidas entre sí por un grupo unificador. Por ejemplo, dos polímeros de PEG pueden estar unidos entre sí por un residuo lisina. Una cadena de PEG lineal se une al grupo a-amino, en tanto la otra cadena de PEG se une al grupo e-amino. El grupo carboxilo remanente del núcleo de lisina queda disponible para una unión covalente a una proteína. Ambos tipos de polímeros de polietilenglicol lineales y ramificados se encuentran disponibles comercialmente en un rango de pesos moleculares.
En una forma de realización de la invención, el conjugado con el factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand o la proteína C contiene uno o más polímeros de polietilenglicol lineales unidos al Factor VII, al Factor VIII, al Factor IX, al Factor X, al Factor Xa, al Factor XI, al Factor Vlla, al Factor V, al Factor XIII, al Factor de von Willebrand y a la proteína C. En algunas formas de realización, el factor de coagulación sanguíneo es el Factor III, el Factor VIII o el Factor IX, en donde cada PEG tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa. En otro aspecto de la invención, un conjugado con el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand o la proteína C contiene uno o más polímeros de polietilenglicol lineales unidos al Factor VII, al Factor VIII, al Factor IX, al Factor X, al Factor Xa, al Factor XI, al Factor Vlla, al Factor V, al Factor XIII, al Factor de von Willebrand o a la proteína C, en donde cada PEG lineal tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 40 kDa. En determinadas formas de realización, cada PEG lineal tiene un peso molecular de entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 30 kDa. En determinadas formas de realización, cada PEG lineal tiene un peso molecular que es de aproximadamente 20 kDa. En determinadas formas de realización, cada PEG lineal tiene un peso molecular que es de aproximadamente 10 kDa. En determinadas formas de realización, cada PEG lineal tiene un peso molecular que es menor que 10 kDa. En formas de realización particulares, donde el factor sanguíneo conjugado contiene más de un polímero de PEG lineal unido a un factor de coagulación sanguíneo, por ejemplo dos, tres o hasta ocho polímeros de PEG lineales, unido al Factor VII, al Factor VIII, al Factor IX, al Factor X, al Factor Xa, al Factor XI, al Factor Vlla, al Factor V, al Factor XIII, al Factor de von Willebrand o a la proteína C. En algunas formas de realización, los conjugados con factores sanguíneos contienen múltiples polímeros de PEG lineales, donde cada PEG lineal tiene un peso molecular de aproximadamente 5-30 kDa.
El conjugado de factores sanguíneos de esta invención puede contener uno o más polímeros de PEG ramificados unidos al Factor VII, al Factor VIII, al Factor IX, al Factor X, al Factor Xa, al Factor XI, al Factor Vlla, al Factor V, al Factor XIII, al Factor de von Willebrand o a la proteína C, en donde cada PEG ramificado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa. En otro aspecto de la invención, un conjugado con factores sanguíneos contiene uno o más polímeros de polietilenglicol ramificados unidos al Factor VII, al Factor VIII, al Factor IX, al Factor X, al Factor Xa, al Factor XI, al Factor Vlla, al Factor V, al Factor XIII, al Factor de von Willebrand o a la proteína C, en donde cada PEG ramificado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa. En determinadas formas de realización, cada PEG ramificado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 40 kDa. En determinadas formas de realización, cada PEG ramificado tiene un peso molecular que es de aproximadamente 10 kDa, 20 kDa o aproximadamente 30 kDa. En determinadas formas de realización, cada PEG ramificado tiene un peso molecular que es menor que aproximadamente 10 kDa. En formas de realización particulares, donde el conjugado con factores sanguíneos contiene más de un polímero de PEG ramificado unido al Factor VII, al Factor VIII, al Factor IX, al Factor X, al Factor Xa, al Factor XI, al Factor Vlla, al Factor V, al Factor XIII, al Factor de von Willebrand o a la proteína C, por ejemplo dos, tres o hasta ocho polímeros de PEG ramificados unidos al Factor VII, al Factor VIII, al Factor IX, al Factor X, al Factor Xa, al Factor XI, al Factor Vlla, al Factor V, al Factor XIII, al Factor de von Willebrand o a la proteína C. En algunas formas de realización, los conjugados de PEG con el factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand o la proteína C contiene hasta ocho polímeros de PEG ramificados, donde cada PEG ramificado tiene un peso molecular de aproximadamente 5-40 kDa, preferiblemente de entre 10 y 30 kDa.
Los conjugados de factor sanguíneo-PEG se pueden purificar utilizando métodos cromatográficos conocidos en el arte, incluyendo, pero en un sentido no taxativo cromatográficos de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de afinidad, precipitación y separaciones basadas en membranas.
Preferiblemente, la unidad PEG del conjugado con el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand o la proteína C puede estar unido a dos residuos cisteína, que forman un enlace disulfuro en el factor de coagulación sanguíneo. Por ello, el conector que contiene PEG forma un puente con el enlace disulfuro. Los ejemplos de tales procedimientos de conjugación se describen en WO 2005/007197, WO 2009/047500 y WO 2010/010324.
Según se describió previamente, otras rutas de PEGilación pueden incluir los procedimientos estándar de glicoPEGilación que se describen en Stennicke et al {Thromb. Haemost. 2008, 100(5), 920-8) o la PEGilación de amida N-terminal que se describe en US 5644029.
En una forma de realización de la invención, se puede conjugar una unidad PEG con el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand o la proteína C de acuerdo con el esquema representado en la Figura 2. En la Figura 2, se muestra un grupo R1 entre la unidad PEG y el grupo conector que abarca los átomos de azufre del enlace disulfuro sobre la molécula del factor sanguíneo.
R1 representa un sustituyente que puede ser un enlace directo, un grupo alquileno (preferiblemente un grupo Ci-10 alquileno) o un grupo arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente, en donde los grupos arilo incluyen grupos fenilo, benzoílo y naftilo; en donde los grupos heteroarilo adecuados incluyen piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, pirimidina y purina; en donde la unión con el polímero puede ser por medio de un enlace hidrolíticamente lábil o por medio de un enlace no lábil.
Los sustituyentes particulares que pueden estar presentes sobre el grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido incluyen, por ejemplo, uno o más sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre -CN, -N02, -C02R, -COH, -CH2OH, -COR, -O, -OCOR, -OC02R, -SR, -SOR, -S02R, -NHCOR, -NRCOR, -NHC02R, -NR'C02R, -NO, -NHOH, -NR'OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR'COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, halógeno, por ejemplo flúor o cloro, -C=CR, -C=CR2 y 13C=CHR, en donde cada R o R' representa de manera independiente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (preferiblemente de Ci-e) o arilo (preferiblemente fenilo). Se prefiere especialmente la presencia de sustituyentes secuestrantes de electrones. En una forma de realización, el grupo arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente en R1 incluye grupos arilo o heteroarilo sustituidos con un grupo amida (NHCO) que conecta la unidad R1 con la unidad PEG.
Por ello, el grupo conector entre los dos átomos de azufre del enlace disulfuro original entre los cisteína residuos del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la proteína C puede comprender un puente de 3 carbonos. En una forma de realización, el grupo conector entre los dos átomos de azufre del enlace disulfuro original entre los residuos cisteína del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la proteína C es (CH2)2CHC(0)-.
En una forma de realización de la invención, la unidad PEG se puede conjugar como se describió precedentemente, en donde la composición que comprende al Factor VII, al Factor VIII, al Factor IX, al Factor X, al Factor Xa, al Factor XI, al Factor Vlla, al Factor V, al Factor XIII, al Factor de von Willebrand o a la proteína C que está conjugado con una unidad de PEG presenta la siguiente estructura: donde R1 es como se definió previamente y "Factor" representa un factor de coagulación sanguíneo.
En las formas de realización donde el grupo arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente en R1 como se definió previamente incluye grupos arilo o heteroarilo sustituidos por un grupo amida (NHCO), la estructura de la pro te (na conjugada, donde R3 es como se define más abajo, puede ser como sigue: R3 representa un sustituyente que puede ser un enlace directo, un grupo alquileno (preferiblemente un grupo C^o alquileno) o un grupo arilo o heteroarilo sustituido opcionalmente; en donde los grupos arilo incluyen grupos fenilo, benzoílo y naftilo; en donde los grupos heteroarilo adecuados incluyen piridina, pirrol, furano, pirano, imidazol, pirazol, oxazol, piridazina, pirimidina y purina; en donde la unión con el polímero puede ser por medio de un enlace hidroliticamente lábil o por medio de un enlace no lábil y el Tactor" representa un factor de coagulación sanguíneo.
Los sustituyentes particulares que pueden estar presentes sobre el grupo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido incluyen, por ejemplo, uno o más sustituyentes iguales o diferentes seleccionados entre -CN, -N02, -C02R, -COH, -CH2OH, -COR, -O, -OCOR, -OC02R, -SR, -SOR, -S02R, -NHCOR, -NRCOR, -NHC02R, -NR'C02R, -NO, -NHOH, -NR'OH, -C=N-NHCOR, -C=N-NR'COR, -N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R, halógeno, por ejemplo flúor o cloro, -C=CR, -C=CR2 y 13C=CHR, en donde cada R o R' representa de manera independiente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo (preferiblemente de Ci^) o arilo (preferiblemente fenilo). Se prefiere especialmente la presencia de sustituyentes secuestrantes de electrones.
En algunas formas de realización, las formas de dosificación de la presente invención pueden estar compuestas por formas PEGiladas de los factores de coagulación sanguíneos definidos en la presente, en donde la molécula de polietileneglicol es una forma (preferiblemente monodispersa) de cadena lineal. El PEG se puede conjugar con el factor de coagulación sanguíneo a través de una unidad de puente de tres carbonos. Por ejemplo, el PEG puede ser de entre 1 y 100 kDa; en algunas formas de realización, de entre 5 y 30 kDa; en algunas formas de realización es de 10 kDa y en otras formas de realización es de 20 kDa.
La forma de dosificación se puede preparar para la administración por vía subcutánea por formulación en un vehículo acuoso adecuado. En la mayoría de las formas de realización, la solución acuosa adecuada se lleva a pH fisiológico (por ejemplo, a pH 6.8) con una composición que comprende uno o más aminoácidos y/o sales (por ejemplo, histidina y NaCI) y en la presencia de un agente tensioactivo no iónico (por ejemplo, Tween® 80) y opcionalmente un estabilizante (por ejemplo, benzamidina o un derivado de benzamidina, véase, por ejemplo, US 7612066).
Los agentes tensioactivos no iónicos/emulsionantes que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen polisorbatos, tales como polioxietileno sorbitán monooleato (polisorbato 80, Tween® 80), polisorbato 65, polisorbato 65, polisorbato 61 , polisorbato 60, polisorbato 40, polisorbato 21 , polisorbato 20, polisorbato 81 , polisorbato 85 y polisorbato 120, y estearatos de polioxietileno tales como estearato de polioxílo 8 (monoestearato de PEG 400), estearato de polioxílo 2, estearato de polioxílo 4, estearato de polioxilo 6, estearato de polioxílo 12, estearato de polioxilo 20, estearato de polioxilo 30, estearato de polioxilo 40, estearato de polioxilo 50, estearato de polioxílo 100, estearato de polioxilo 150 y diestearato de polioxilo 4, diestearato de polioxilo 8, diestearato de polioxilo 12, diestearato de polioxilo 32, diestearato de polioxilo 150.
Los rangos de concentración adecuados para los componentes de la composición pueden comprender, por ejemplo, entre 5 mM y 25 mM de histidina (preferiblemente entre 10 mM y 15 mM de histidina), entre 10 mM y 50 mM de NaCI (preferiblemente entre 30 mM y 40 mM de NaCI) y entre 0.001 y 0.01 % de Tween® 80 (preferiblemente entre 0.005% y 0.008% de Tween® 80) y opcionalmente entre 0.5 mM y 5 mM de benzamidina (preferiblemente entre 1 mM y 2 mM de benzamidina).
Según se usa en la presente, el término "muteínas" se refiere a análogos del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la proteína C, en donde uno o más de los residuos de aminoácido de los componentes naturales del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de on Willebrand o de la protelna C se reemplazan por residuos de aminoácido diferentes, o se suprimen los mismos, o se agrega uno o más residuos de aminoácido a la secuencia original de un factor sanguíneo, sin cambios considerables de la actividad de los productos resultantes en comparación con el factor sanguíneo original. Estas muteínas se preparan utilizando técnicas conocidas de síntesis y/o mediante mutagénesis dirigida al sitio o con cualquier otra técnica conocida adecuada para ello.
Las mutefnas de acuerdo con la presente invención incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, que se hibridiza con ADN o ARN, que codifican al Factor VII, al Factor VIII, al Factor IX, al Factor X, al Factor Xa, al Factor XI, al Factor Vlla, al Factor V, al Factor XIII, al Factor de von Willebrand o a la proteína C de acuerdo con la presente invención, bajo condiciones severas. El término "condiciones severas" se refiere a las condiciones de hibridación y subsiguientes de lavado, designadas convencionalmente por el especialista en el arte como "severas" (Ausubel er al., Current Protocols in Molecular Biology, Interscience, N.Y., secciones 6.3 y 6.4 (1987, 1992); Sambrook et al., (Sambrook er al., Molecular Cloníng: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (1989)).
En un sentido no taxativo, los ejemplos de condiciones severas incluyen condiciones de lavado 12-20 °C por debajo de la Tm calculada del híbrido bajo estudio, por ejemplo, de SSC 2x y 0.5% de SDS durante 5 minutos, SSC 2x y 0.1% de SDS durante 15 minutos; SSC 0.1X y 0.5% de SDS a 37 "C durante 30-60 minutos y luego, SSC 0.1X y 0.5% de SDS a 68 °C durante 30-60 minutos. Los especialistas en este arte comprenderá que las condiciones de severidad también dependen de la longitud de las secuencias de ADN, las sondas de oligonucleótidos (tal como de 10-40 bases) o las sondas de oligonucleótidos mixtos. Si se usan sondas mixtas, se prefiere usar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de SSC.
Cualquiera de estas muteínas tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicada de la del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la proteína C, como para tener una actividad sustancialmente similar, o aún mejor, que la actividad del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la proteína C.
Una actividad característica del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la proteína C es su capacidad para participar en la cascada de la coagulación sanguínea y en ensayos para detectar al Factor VII, al Factor VIII, al Factor IX, al Factor X, al Factor Xa, al Factor XI, al Factor Vlla. al Factor V, al Factor XIII, al Factor de von Willebrand o a la proteína C. Mientras la mutefna tenga una actividad del factor sanguíneo sustancial, se puede considerar que tiene una actividad sustancialmente similar al factor sanguíneo. Por consiguiente, se puede determinar si cualquier muteína dada tiene por lo menos sustancialmente la misma actividad que el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand o la proteína C por medio de una experimentación de rutina que comprende someter dicha muteína a los ensayos que se describen en la presente.
En una forma de realización preferida, cualquiera de dichas muteínas tiene por lo menos un 40% de identidad o de homología con la secuencia de aminoácidos del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la proteína C. Más preferiblemente, tiene por lo menos un 50%, por lo menos un 60%, por lo menos un 70%, por lo menos un 80% o, con mayor preferencia, por lo menos un 90%, 95%, 98% o 99% de identidad u homología con la misma.
La identidad refleja la relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o de dos o más secuencias de polinucleótidos, determinada por comparación de las secuencias. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de los dos secuencias de polinucleótidos o de dos secuencias de polipéptidos, respectivamente, sobre la longitud de las secuencias que se están comparando.
En el caso secuencias que no presentan una correspondencia exacta, se puede determinar un "porcentaje de identidad". En general, se alinean las dos secuencias a comparar para obtener una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir insertar "huecos o faltas de coincidencia" ya sea en una o ambas secuencias, para mejorar el grado de alineamiento. El porcentaje de identidad se puede determinar sobre la longitud completa de cada una de las secuencias comparadas (el denominado alineamiento global), que es particularmente adecuada para secuencias de longitud igual o muy similar, o sobre longitudes más cortas, definidas (el denominado alineamiento local), que es más adecuada para secuencias de cuya longitud es desigual.
Los métodos de comparación de la identidad y la homología de dos o más secuencias son bien conocidos en el arte. Asi, por ejemplo, se pueden usar los programas disponibles en el Paquete de Análisis de Secuencias Wisconsin, versión 9.1 (Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12: 387 (1984)), por ejemplo, los programas BESTFIT y GAP, para determinar el porcentaje de identidad entre dos polinucleótidos y el porcentaje de identidad y el porcentaje de homología entre dos secuencias de polipéptidos. BESTFIT emplea el algoritmo de "homología local" de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2; 482-489 (1981)) y encuentra la mejor región de similitud individual entre dos secuencias. Hay otros programas para determinar la identidad y/o la similitud entre secuencias que también son conocidos en el arte, por ejemplo la familia de programas BLAST (Atschul et al., J. Molec. Biol., 215: 403 (1990), accesible a través de la página de inicio de NCBI, en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R, Methods in Enzymology, 183: 63-98 (1990)).
Las muteínas del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la proteína C, que se pueden usar de acuerdo con la presente invención, incluyen un conjunto finito de secuencias sustancialmente correspondientes como péptidos de sustitución que un especialista en el arte puede obtener rutinariamente, sin una experimentación excesiva, basado en las enseñanzas y los lineamientos presentados en la presente.
Los cambios preferidos para las muteínas de acuerdo con la presente invención se conocen como sustituciones "conservadoras". Las sustituciones de aminoácidos conservadoras del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la proteína C, pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo que presenta propiedades fisicoquímicas suficientemente similares como para que la sustitución entre miembros de dicho grupo conservará la función biológica de la molécula. Está claro que también se pueden efectuar inserciones y supresiones de aminoácidos en las secuencias definidas previamente sin alterar su función, en particular si las inserciones o supresiones solamente involucran unos pocos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta, y preferiblemente menos de diez, y si no eliminan o desplazan aminoácidos que son críticos para una conformación funcional, por ejemplo, residuos de cisteína.
Las proteínas y las muteínas producidas mediante dichas supresiones y/o inserciones se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
Por consiguiente, los aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina a menudo pueden sustituirse entre sí (aminoácidos con cadenas laterales alifáticas). Entre estas posibles sustituciones se prefiere usar glicina y alanina para sustituirlas entre sí (dado que tienen cadenas laterales relativamente cortas) y usar valina, leucina e isoleucina para sustituirlas entre sí (dado que tienen cadenas laterales más alifáticas que son hidrofóbicas). Otros aminoácidos que a menudo pueden sustituirse entre sí incluyen: fenilalanina, tirosina y triptofano (aminoácidos con cadenas laterales aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos con cadenas laterales básicas); aspartato y glutamato (aminoácidos con cadenas laterales ácidas); asparagina y glutamina (aminoácidos con cadenas laterales de amida); y cisteína y metionina (aminoácidos con cadenas laterales que contienen azufre). Las sustituciones de esta naturaleza a menudo se conocen como sustituciones de aminoácidos "conservadoras" o "semiconservadoras".
Los cambios de aminoácidos con relación a la secuencia de la proteína de fusión de la invención se pueden efectuar usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo usando mutagénesis dirigida al sitio.
Se podrá apreciar que las sustituciones o inserciones de aminoácidos dentro del alcance de la presente invención pueden efectuarse usando aminoácidos naturales o no naturales. Ya sea si se usan, o no, aminoácidos naturales o sintéticos, se prefiere la presencia de L-aminoácidos solamente.
Además, también se pueden usar proteínas de fusión que comprenden al Factor VII, al Factor VIII, al Factor IX, al Factor X, al Factor Xa, al Factor XI, al Factor Vlla, al Factor V, al Factor XIII, al Factor de von Willebrand o a la proteína C, fusionadas con otros péptido o fragmento de proteina siempre que la proteína de fusión retenga la actividad del Factor Vil, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor VI la, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la protelna C. El término "protelna de fusión", se refiere en este texto, en términos generales, a una o más proteínas unidas entre si por medios químicos, incluyendo puentes de hidrógeno o puentes salinos, o mediante uniones peptldicas por medio de síntesis de proteínas o ambos.
Los "derivados funcionales", según se usa este término en la presente, abarcan derivados del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Fáctor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la protelna C, y sus mutefnas, que se pueden preparar a partir de los grupos funcionales que aparecen en las cadenas laterales de los residuos o son adiciones de los grupos N- o C-terminales, utilizando medios conocidos en el arte, y están incluidos en la invención siempre que continúen siendo farmacéuticamente aceptables, es decir, que no destruyan la actividad de la protelna que es sustancialmente similar a la actividad de los factores sanguíneos, y que no confieran propiedades tóxicas a las composiciones que contienen a los mismos.
Estos derivados pueden incluir, por ejemplo, ésteres alifáticos de los grupos carboxiio, amidas de los grupos carboxiio por reacción con amoníaco o con aminas primarias o secundarias, derivados N-acilo de grupos amino libres de los residuos de aminoácidos formados con porciones acilo (por ejemplo, grupos alcanoílo o carboxílico arollo) o derivados O-acilo de grupos hidroxilo libres(por ejemplo, de los residuos de serilo o treonilo) formados con grupos acilo, incluyendo por ejemplo glicosilación de los residuos hidroxilo disponibles.
Un "fragmento activo de un factor sanguíneo" de acuerdo con la presente invención puede ser un fragmento del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la proteína C o una muteína ya definida en la presente. El término fragmento se refiere a cualquier subconjunto de la molécula, es decir, un péptido más corto que retiene la actividad biológica deseada. Los fragmentos se pueden preparar fácilmente eliminando aminoácidos de cualquiera de los extremos de la molécula del factor sanguíneo y luego se puede evaluar el fragmento resultante por sus propiedades como se describe en la presente. Las proteasas para eliminar un aminoácido por vez de cualquiera de los extremos N-terminal o C-terminal de un polipéptido son conocidas, y entonces la determinación de fragmentos, que retienen la actividad biológica deseada, sólo comprende experimentación de rutina.
Como fracciones activas del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand y de la protelna C, las muteínas y los fragmentos activos de los mismos, la presente invención abarca además a cualquier fragmento o precursor de la cadena de polipéptidos de la molécula proteica solo o junto con las moléculas asociadas o los residuos ligados a los mismos, por ejemplo, azúcares o residuos de fosfato, o agregados de la molécula proteica o los residuos de azúcares por sí mismos, siempre que dicha fracción tenga una actividad sustancialmente similar a la actividad del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la protelna C.
El término "sales" se refiere en la presente a las sales de los grupos carboxilo y a las sales de adición ácida de los grupos amino de la molécula del factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la protelna C o análogos de los mismos. Las sales de un grupo carboxilo se pueden formar con medios conocidos en el arte e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, de calcio, de amonio, férricos o de zinc, y semejantes, y sales con bases orgánicas como las formadas, por ejemplo, con aminas, tal como trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y semejantes. Las sales de adición ácida incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Por supuesto, cualquiera de dichas sales debe retener la actividad biológica de los factores sanguíneos que se describen en la presente.
El "área bajo la curva" o "AUC", según se usa en la presente en el contexto de la administración de un agente terapéutico a un paciente, se define como el área total bajo la curva que describe la concentración de un fármaco en la circulación sistémica del paciente en función del tiempo desde cero a infinito. Según se usa en la presente, el término "depuración" o "depuración renal" se define como el volumen de plasma que contiene a la cantidad de fármaco excretada por minuto.
Según se usa en la presente, el término "vida media" o "t1/2", en el contexto de la administración de un fármaco peptldico a un paciente, se define como el tiempo requerido para reducir a la mitad la concentración en plasma de un fármaco en un paciente. Puede haber más de una vida media asociada con el fármaco peptídico dependiendo de múltiples mecanismos de depuración, de redistribución y otros mecanismos bien conocidos en el arte. Habitualmente, las vidas medias alfa y beta se definen de manera tal que la fase alfa está asociada con la redistribución y la fase beta está asociada con la depuración. Sin embargo, con fármacos proteicos que mayormente están confinados al torrente sanguíneo, puede haber por lo menos dos vidas medias de depuración. El impacto preciso de la PEGilación sobre las vidas medias de la fase alfa y la fase beta varía dependiendo del tamaño y otros parámetros, como es bien sabido en el arte. Se puede consultar una explicación adicional de la "vida media" en Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin y RD Sindelar, eds., Harwood Publishers, Amsterdam, páginas 101-120).
Según se usa en la presente, el término "tiempo de residencia", en el contexto de la administración de un fármaco peptídico a un paciente, se define como el tiempo promedio que el fármaco permanece en el cuerpo del paciente después de administrar la dosis.
Según se usa en la presente, el término "inmunogenicidad", en el contexto de la administración de un fármaco peptídico a un paciente, se define como la tendencia de dicho fármaco peptídico a generar una respuesta inmune en el paciente después de la dosificación o después de repetir la dosificación.
Según se usa en la presente, el término "dimensiones moleculares" se refiere al peso, tamaño y/o forma de un agente. Por consiguiente, el término "aumentar las dimensiones moleculares por modificación" significa que las dimensiones moleculares han aumentado de manera tal que el agente es demasiado grande en cuanto a tamaño físico como para pasar a través de las paredes de los vasos sanguíneos y al flujo sanguíneo. Sin embargo, las dimensiones moleculares no se refieren necesariamente a un aumento del peso molecular, si, por ejemplo, un agente es truncado antes de la modificación. Las dimensiones moleculares pueden incluir peso, tamaño y/o conformación molecular siempre que el agente modificado retenga la actividad y no pueda pasar directamente a los vasos sanguíneos sin ser suministrados allí por el sistema linfático.
Según se usa en la presente, el término "administración subcutánea" o "administración por vía subcutánea" significa una administración por cualquier medio adecuado de manera tal que el agente terapéutico sea provisto a través de la piel directamente en el espacio subcutáneo.
Según se usa en la presente, "dosis ajustada", en el contexto de dosis subcutáneas del agente modificado, se refiere a la dosis intravenosa del agente modificado multiplicado por la Cmáx de la fracción intravenosa/Cmáx de la fracción subcutánea. Según se explica en la presente, los métodos de la presente invención permiten administrar una dosificación menos frecuente y/o dosis más altas a un paciente en comparación con el agente no modificado o modificado administrado por vía intravenosa. El término "dosis no ajustada", en el contexto de dosis subcutáneas, significa que se administra la misma dosis intravenosa del agente modificado que si la administración hubiera sido por vía intravenosa.
Según se usa en la presente, el término "espacio subcutáneo" se refiere al tejido conectivo que se encuentra debajo de la piel. No incluye vasos sanguíneos, el flujo sanguíneo y los órganos internos.
El "estado nativo" se refiere al estado en el cual existe un agente antes de la modificación y al estado en que generalmente es administrado por vía intravenosa a un paciente en una forma farmacéuticamente aceptable.
Las formas de dosificación subcutáneas de la invención pueden comprender además un diluyente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las formas de dosificación subcutáneas adaptadas para una administración subcutánea pueden incluir una o más soluciones para inyección acuosas y/o no acuosas estériles que pueden contener antioxidantes, soluciones amortiguadoras de pH, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea sustancialmente isotónica con respecto a la sangre del receptor al que se aplicará; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Los excipientes que se pueden usar para las soluciones inyectables incluyen, por ejemplo, agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales. Las composiciones se pueden presentar en recipientes de una dosis o múltiples dosis, por ejemplo ampollas selladas y ampolletas, y se pueden almacenar en un estado liofilizad requiriendo solamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos.
En general, las formas de dosificación subcutáneas pueden contener agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, colorantes, sales (las propias sustancias activas de la presente invención pueden suministrarse en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable), soluciones amortiguadoras o antioxidantes. También pueden contener agentes terapéuticamente activos además de la sustancia de la presente invención. Las formas de dosificación subcutáneas de la invención se pueden emplear en combinación con diluyentes, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales excipientes pueden incluir, pero en un sentido no taxativo, solución salina, solución salina amortiguada (tal como solución amortiguadora salina fosfato), dextrosa, liposomas, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.
La administración por vía subcutánea de las formas de dosificación subcutáneas descritas en la presente puede efectuarse de cualquier manera efectiva, conveniente para tratar la enfermedad de un paciente. La forma de dosificación puede ser una forma líquida o una forma sólida. Las formas liquidas pueden estar listas para usar o se pueden preparar como concentrados que luego se diluyen antes de su administración por vía subcutánea. Las formas sólidas preferiblemente se reconstituyen en un vehículo de administración apropiado para su administración por vía subcutánea. En terapias o como un profiláctico, el agente activo administrado a un individuo como una composición inyectable puede ser, por ejemplo, una dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.
De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se provee una forma de dosificación líquida de un factor de coagulación sanguíneo modificado para su administración por vía subcutánea no más de una vez por mes, en donde la forma de dosificación tiene una Cmáx de por lo menos un 10% y no más de un 90% de la obtenida por administración intravenosa del factor sanguíneo modificado para su uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea.
Este aspecto de la invención también incluye métodos de tratamiento de una enfermedad de coagulación sanguínea o traumatismo en un sujeto que comprende administrar por vía subcutánea una forma de dosificación de un factor de coagulación sanguíneo modificado como se define en la presente a un sujeto que lo necesita.
Por lo tanto, la invención también provee el uso de un factor de coagulación sanguíneo modificado en la elaboración de un medicamento que comprende una forma de dosificación definida en la presente para el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea en un sujeto, en donde dicho medicamento es para una administración por vía subcutánea y tiene una Cmáx de por lo menos un 10% y no más de un 90% de la obtenida por administración intravenosa del factor sanguíneo modificado. Preferiblemente, la Cmáx comprende entre un 20% y un 80%, o entre un 30% y un 70% o entre un 40% y un 60%. En una forma de realización, la Cmáx es de entre un 75 y un 80% y el factor sanguíneo puede ser FVII. En otra forma de realización, la Cmáx es de entre un 10% y un 25% y el factor sanguíneo puede ser FVIII. En aún otra forma de realización, la Cmáx es de entre un 40% y un 60% y el factor sanguíneo puede ser FIX.
Las enfermedades o los trastornos de la coagulación sanguínea se pueden caracterizar por una pérdida de función de un factor de coagulación sanguíneo, o la generación de auto-anticuerpos. Los ejemplos de enfermedades de la coagulación sanguínea incluyen hemofilia A y hemofilia B.
El Factor VI la se puede usar en el tratamiento de episodios de hemorragia en las hemofilias A o B, o en el tratamiento de pacientes que han desarrollado anticuerpos inhibidores contra FVIII o IX, respectivamente. El Factor Vill se puede usar en el tratamiento de episodios de hemorragia en pacientes con hemofilia A y el Factor IX se puede usar en el tratamiento de pacientes con hemofilia B.
Según se usa en la presente, el término "tratamiento" incluye cualquier régimen que pueda beneficiar a un mamífero humano o no humano. El tratamiento de "mamíferos no humanos" se extiende al tratamiento de mamíferos domésticos, incluyendo caballos y animales de compañía (por ejemplo, gatos y perros), y animales de granja/agrícolas, incluyendo miembros de las familias de ovinos, caprinos, porcinos, bovinos y equinos. El tratamiento puede ser para cualquier condición d trastorno existente, o puede ser profiláctico (tratamiento preventivo). El tratamiento puede ser de una enfermedad heredada o adquirida. El tratamiento puede ser de una condición aguda o crónica.
Las formas de dosificación subcutáneas de la invención se pueden emplear solas o junto con otros compuestos, tales como compuestos o moléculas terapéuticas, por ejemplo fármacos antiinflamatorios, analgésicos o antibióticos, u otros agentes farmacéuticamente activos que puedan promover o mejorar la actividad del Factor VII, del Factor VIII, del Factor IX, del Factor X, del Factor Xa, del Factor XI, del Factor Vlla, del Factor V, del Factor XIII, del Factor de von Willebrand o de la proteína C, por ejemplo otro factor de coagulación sanguíneo. Dicha administración con otros compuestos puede ser simultánea, separada o sucesiva. Los componentes se pueden preparar en la forma de un conjunto de elementos que puede comprender instrucciones, como sea apropiado.
Los niveles de actividad en la cascada de la coagulación sanguínea se pueden medir mediante cualquier ensayo adecuado, por ejemplo la prueba del tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) o del tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT).
En la prueba del tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) se mide el tiempo transcurrido en sangre completa hasta formar un coágulo en un ambiente externo, habitualmente en un tubo o disco de vidrio.
En la prueba del tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) se mide un parámetro de parte de la vía de coagulación sanguínea. Su valor es anormalmente elevado en la hemofilia y en una terapia con heparina intravenosa. El APTT requiere de unos pocos mililitros de sangre de una vena. El tiempo APTT es una medida de una parte del sistema de coagulación conocida como la "vía intrínseca". El valor del APTT es el tiempo en segundos medido de un proceso de coagulación específico en la prueba de laboratorio. Este resultado siempre se compara con una muestra "control" de sangre normal. Si la muestra de prueba toma más que la muestra control, indica una función de coagulación disminuida en la vía intrínseca. Las terapias médicas generales habitualmente buscan un rango de APTT en el orden de 45 a 70 segundos, pero el valor también se puede expresar como una relación de prueba a normal, por ejemplo 1.5 veces el valor normal. Un APTT elevado en la ausencia de un tratamiento con heparina puede deberse a una hemofilia, que requiere pruebas adicionales.
La invención también provee un conjunto de elementos de partes que comprenden una forma de dosificación subcutánea de la invención, y un vehículo de administración que incluye soluciones inyectables para una administración por vía subcutánea, donde dicho conjunto de elementos preferiblemente comprende instrucciones para el uso de la misma.
En una forma de realización de la invención, se provee una forma de dosificación de una composición farmacéutica con un factor de coagulación sanguíneo modificado (preferiblemente, el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand o la proteína C) para una administración subcutánea que cuando se formula para su administración por vía subcutánea a un sujeto provee una forma de dosificación para no más de una vez por mes suficiente para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa en dicho sujeto menor que 15 minutos. La formulación de dosificación convenientemente puede tener una Cmáx de por lo menos un 10% y no más de un 90% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa.
Por consiguiente, la invención provee una forma de dosificación de una composición farmacéutica con un factor de coagulación sanguíneo modificado seleccionado del grupo que consiste en el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor Vlla, el Factor V, el Factor XIII, el Factor de von Willebrand o la proteína C para una administración subcutánea que cuando se formula para su administración por vía subcutánea a un sujeto provee una forma de dosificación para no más de una vez por mes suficiente para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa en dicho sujeto menor que 12 minutos.
En una forma de realización, la invención provee entonces una forma de dosificación de una composición farmacéutica de entre 25 y 50 Ul/kg de un factor de coagulación sanguíneo PEGilado seleccionado del grupo que consiste en el Factor Vlla, el Factor VIII y Factor IX para su administración por vía subcutánea no más de una vez por semana.
Una forma de dosificación líquida de la invención puede comprender un factor de coagulación sanguíneo modificado definido en la presente para su administración por vía subcutánea no más de una vez por mes, en donde dicha forma de dosificación tiene una Cmáx de por lo menos un 10% y no más de un 90% para su uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea.
Estas composiciones son de particular utilidad en métodos de tratamiento de una enfermedad de la coagulación sanguínea o un traumatismo en un sujeto que comprende administrar por vía subcutánea una forma de dosificación de un factor de coagulación sanguíneo de acuerdo con la invención a un sujeto que lo necesita.
Las formas de dosificación de la invención, cuando se administran por vía subcutánea, tienen una biodisponibilidad y eficacia comparables a los niveles del respectivo factor de coagulación sanguíneo modificado análogo cuando se administra por vía intravenosa, tanto por su título en circulación como por su actividad de coagulación.
En otra forma de realización de la invención, se provee una forma de dosificación para su administración por vía subcutánea que comprende un factor de coagulación sanguíneo definido en la presente modificado con una molécula de polietileneglicol de cadena lineal, monodispersa unida por medio de un grupo puente de tres carbonos a un enlace disulfuro simple en la proteína.
La forma de dosificación líquida de la invención se puede preparar por formulación del factor de coagulación sanguíneo conjugado con PEG en una solución acuosa, amortiguada a pH fisiológico y en la presencia de un agente tensioactivo no iónico y opcionalmente un estabilizante.
Las características preferidas para el segundo aspecto y aspectos subsiguientes de la invención son las del primer aspecto mutatis mutandis.
Se ha demostrado que el impacto del producto con un agente modificado de acuerdo con la invención es superior a un producto con el mismo agente modificado suministrado por vía intravenosa. El impacto de producto se puede definir como la mejora, por ejemplo, en el WBCT. Se define como el WBCT inicial dividido por el WBCT en un punto de tiempo particular. Con este método, se mostró consistentemente que los agentes de coagulación sanguínea modificados suministrados por vía subcutánea tienen un mayor impacto de producto que el mismo producto suministrado por vía intravenosa en el mismo punto de tiempo.
De acuerdo con la presente invención, es menor la respuesta inmune generada por la administración por via subcutánea de agentes terapéuticos que fueron modificados, por ejemplo, por la adición de un polímero biocompatible. Este efecto es diametralmente opuesto a lo que hubiera esperado un especialista en el arte de la administración de farmacéuticos formulaciones antes de la presente invención. Por ejemplo, en el campo de las formulaciones de factores sanguíneos, está aceptado en general que sería esperable que la administración de un factor sanguíneo no modificado por vía subcutánea estimule una respuesta inmunogénica (creación de inhibidores del FVIII) o desencadene una respuesta inmune por la población existente de inhibidores de FVIII.
La respuesta inmune relativa a los factores de coagulación sanguíneos se puede medir en unidades Bethesda. Una unidad Bethesda (BU) es una medida de la actividad inhibidora de la coagulación sanguínea. De acuerdo con Practical Haemostasis, "1 unidad Bethesda (Bu) se define como la cantidad de inhibidor en una muestra de plasma que neutralizará el 50% de 1 unidad del Factor VIII:C en plasma normal después de 2 hr de incubación a 37°C" (Schumacher, Harold Robert (2000), Handbook of Hematologic Pathology, Informa Health Care, página 583).
En la presente invención, se ha encontrado un resultado muy sorprendente. Con el fin de disminuir la incidencia de respuestas inmunes (inhibidoras) se propone adoptar una administración por vía subcutánea, donde el nivel de respuesta inmune está relacionado directamente con el nivel de exposición sistémica. Con una administración subcutánea, la Cmáx se puede disminuir fácilmente y al hacerlo hay una disminución de la respuesta inmune.
A modo de ejemplo, la presente invención describe el sorprendente efecto depot observado con los factores sanguíneos cuando se conjugan con polímeros, tal como PEG. Aún más, los resultados muestran que es posible manipular la velocidad a la cual los factores sanguíneos se vuelven disponibles desde el espacio subcutáneo por manipulación del nivel de hidratación de la proteína debido al tamaño (o la cantidad) de PEG.
A partir de los resultados de la presente solicitud, se puede observar que con los agentes terapéuticos modificados con una cadena de polímero dichos agentes tendrán una menor velocidad de ingreso en el plasma que las correspondientes formas biconjugadas donde se agregan dos cadenas de polímero.
En otras palabras, los productos monoconjugados tendrían más proteína expuesta en comparación con los productos biconjugados. Esta condición significaría que las formas conjugadas de forma superior serían más díspersables en agua y por ello tendrían una velocidad de entrada rápida por los vasos linfáticos hacia el plasma.
Por ello, sorprendentemente, para alcanzar la mayor duración de liberación depot, se requiere un menor grado de modificación. Sin vinculación a ninguna teoría, se puede razonar que con un menor grado de modificación queda expuesto algo de agente terapéutico al tejido subcutáneo, lo cual confiere una velocidad lenta a la difusión a través de la linfa. Por el contrarío, un mayor grado de modificación cubre al agente terapéutico por completo dejando que el producto ingrese rápidamente a la circulación sanguínea.
En general, existe un efecto total muy sorprendente por el cual la combinación de una modificación seguida por una administración subcutánea, da como resultado un aumento observado de 35 veces de la vida media aparente después de una administración subcutánea (SQ)).
Finalmente, se puede observar en general que la biodisponibilidad favorece a las formas conjugadas de orden superior, confirmando así que el mayor nivel de modificación y los niveles de hidratación promueven un grado más alto de movilidad y por ello de biodisponibilidad.
Todas las características de cada aspecto son aplicables a todos los demás aspectos de la invención, mutatis mutandis.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En la presente también se hace referencia a las siguientes figuras en donde: En la Figura 1 se muestra la cascada de la coagulación sanguínea. Abreviaturas: HMWK: Quininógeno de alto peso molecular; PK: Precalicreína; PL: Fosfolípido.
En la Figura 2 se muestran los pasos involucrados en la química de conjugación con biopolímeros específica de disulfuro, utilizándose un reactivo de PEGilación como ejemplo de un reactivo de conjugación (de Shaunak etal., en Nat. Chem. Biol. 2006, 2(6). 312-313).
En la Figura 3 se muestran los tiempos de coagulación de sangre completa (WBCT) después de una administración subcutánea (SQ) de PEG rFIX al Perro 1 y hrFIX al Perro 2.
En la Figura 4 se muestran los valores de APTT (tiempo de tromboplastina parcial activado) con los tiempo después de la administración SQ.
En la Figura 5 se muestra el APTT de plasma retenido después de la administración SQ.
En la Figura 6 se muestran los valores relativos de APTT básales después de la administración SQ.
En la Figura 7 se muestra el WBCT del Perro 9 después de una administración SQ de 25 Ul/kg.
En la Figura 8 se muestran los perfiles PK y los parámetros del FVIIa después de 200 ug/kg de rFVIIa.
En la Figura 9 se muestran los perfiles PK y los parámetros del FVIIa después de 800 ug/kg de TheraPEG-rFVIIa.
En la Figura 10 se muestran los perfiles PK y los parámetros del FVIIa después de 1600 ug/kg de TheraPEG-rFVIIa.
En la Figura 11 se muestra la concentración del FVIII en plasma (todos perros).
En la Figura 12 se muestra la concentración del FVIII en plasma (solamente perros administrados SQ).
En las Figuras 13a-13d se muestran los datos inmunes (valor Bethesda) para PEGFVIII administrado por vía subcutánea (SQ) en comparación con la vía intravenosa (IV); el número de sujetos se expresa como "n".
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes Ejemplos que se incluyen a efectos ilustrativos solamente y no deberían considerarse limitantes. Las referencias a la administración por vía subcutánea de las formulaciones de dosificación de la invención se expresan como SQ (s.c.) y la administración intravenosa como IV (i.v.).
Ejemplo 1: Preparación de las formas de dosificación y administración por vía subcutánea El estudio incluye una evaluación de la biodísponibilidad y la eficacia del hrFIX después de su administración por vfa subcutánea. Se comparó el hrFIX desnudo (no PEGilado) con su análogo PEGilado tanto por su título en circulación como por su actividad de coagulación.
Se preparó hrFIX PEGilado de 10 kDa con la tecnología estándar, con lo cual se conjugó políetileneglicol monodisperso de cadena lineal, de 10 kOa, por medio de un puente de tres carbonos a un solo enlace disulfuro.
El artículo de prueba se preparó para la administración formando una solución acuosa adecuada, llevada a pH 6.8 con histidina 10 mM, NaCI 40 mM y Tween® 80 0.005%. Se agregó benzamidina 1 mM como estabilizante.
Sobre la base que los estudios de dilución del hrFIX mostraron tiempos de coagulación comparables con PEGrFIX al 25% de dilución, la potencia asignada para este estudio era de 4X equivalentes de proteína. El artículo de control se suministró como un polvo liofilizado y se preparó para la administración según las instrucciones de reconstitución adjuntas. El vehículo de administración es idéntico al que se describió previamente para PEG.
Como un punto adicional de este estudio se decidió explorar la posibilidad de una administración subcutánea (SQ) de rFIX. El prospecto de la forma PEGilada del rFIX como adecuada para la administración SQ surgió a partir de la observación anterior que el PEG proporcionaba un efecto protector de la proteína. Históricamente, se consideraba que la ruta SQ no estaba disponible para el FIX dado que había una preocupación que esto podría exacerbar la incidencia de producción de anticuerpos y que no se traduciría en cantidades significativas en sangre.
En esta parte del estudio se administró PEGhrFIX 50 Ul/kg por vía subcutánea a un animal de prueba adicional (Perro 1) y se comparó con 2 administraciones SQ de hrFIX desnudo a otros 2 sujetos de prueba, es decir, el Perro 6 y el Perro 2, respectivamente.
En esta representación particular, cada animal presentaba un valor basal ligeramente diferente, de modo que para facilitar la comparación, el nivel de APTT de preadministración se normalizó en 1. El Perro 1 y el Perro 2 fueron los sujetos de prueba en el ensayo previo con PEGrFIX en enero de 2010, a partir del cual se dispusieron de los títulos en plasma registrados después de la administración intravenosa para la comparación.
Se tomaron muestras de sangre sobre un transcurso de tiempo regular para seguir el decaimiento del título y el efecto sobre la coagulación sanguínea. La Tabla 1 es un resumen de los títulos medidos a las 22 horas como FIX en circulación después de una administración intravenosa.
Tabla 1 En la Tabla 2 se muestra una comparación del título medido de FIX en circulación a las 22 horas después de una administración subcutánea (SQ).
Tabla 2 Se puede observar que 25 Ul/kg de Benefix® por la ruta SQ no eran detectables en circulación y 50 Ul/kg del PEGhrFIX eran apenas detectables en plasma. Muy por el contrario, la administración SQ de PEGhrFIX se acercaba a un nivel (7.8) que se acercaba al del producto administrado por vía IV (9.9).
Luego se investigó el efecto de estos títulos sobre la corrección de los tiempos de coagulación. Primeramente, se registraron los tiempos de coagulación de sangre completa. El WBCT después de la administración por vía subcutánea se muestra en la Tabla 3 y en la Figura 3. Además, también se registró el APTT con Hemochron® Júnior y los valores se muestran a continuación en la Tabla 4 (sangre completa citrada) y en la Figura 4 después de la administración por vía subcutánea. Los valores de APTT para las muestras de plasma retenida se muestran en la Tabla 5 y en la Figura 5 también después de la administración por vía subcutánea.
Tabla 3 *Nota: el monitoreo se terminó a los 45 minutos debido a que no se hablan formado coágulos, de acuerdo con los procedimientos estándar. ** ambos perros eran perros nal've, lo cual significa que no hablan estado expuestos previamente al FIX.
Tabla 4 Tabla 5 Figura 6: Esta colección de datos muestra claramente que el rFIX desnudo no está biodisponible (prácticamente) con una inyección subcutánea. Esto resulta totalmente esperable a partir de la literatura publicada y el conocimiento general del arte. Más sorprendente fue entonces la detección de los altos títulos en circulación de rFIX después de una inyección subcutánea de PEGhrFIX. De hecho, en la Tabla 10 se puede observar que aproximadamente un 80% del PEGrFIX inyectado por vía subcutánea se encuentra disponible para su participación en el control hemostático.
El contraste es mayor en los tiempos de coagulación medidos, tanto WBCT como APTT para rFIX apenas se corrigen, en tanto los tiempos de coagulación con PEGhrFIX de la inyección subcutánea se corrigen inmediatamente. La duración de la hemostasis con estas mediciones es prolongada, hasta aproximadamente 1 semana, con una sola inyección subcutánea de 50 Ul/kg.
Ejemplo 2: Administración por vía subcutánea (SQ) de hrFIX al Perro 9 Dado el éxito de los estudios SQ precedentes, se decidió conducir una administración SQ individual adicional de PEGhrFIX y seguir de manera similar el control hemostático sobre un período extendido. El sujeto de prueba elegido era un sujeto na'íve, el Perro 9, para explorar la influencia de anticuerpos neutralizantes sobre la ruta de administración SQ.
Los estudios de factores sanguíneos humanos en perros son confusos por la respuesta del sistema inmune canino a la proteína humana. Por ello, el rFIX humano es una xenoproteína en los estudios con caninos y se deberá esperar la presencia de anticuerpos neutralizantes en algún momento después de la administración del artículo de prueba. De hecho, cuando en los sujetos de prueba se vuelven a introducir los factores sanguíneos humanos, la producción de anticuerpos es más pronunciada y más rápida. Los sujetos, Perro 1 y Perro 7, después de la administración subcutánea tienen un período de hemostasis acortado como consecuencia de ello.
El sujeto de prueba, el Perro 9, era un animal na'íve y se le administró una pequeña dosis subcutánea y por ello reveló la verdadera protección sostenida pueden proporcionar los factores sanguíneos PEGilados de esta invención. Dado que el Perro 9 no había estado expuesto previamente a factores sanguíneos humanos, se pudo observar el verdadero resultado subyacente (y muy sorprendente).
En la Figura 7 se muestran los resultados de WBCT después de 25 Ul/kg de administración subcutánea (SQ) de IB1001 PEGilado al Perro 9 en una dosis de 1 mi (volumen de 1 mi)) y también en la siguiente Tabla 6.
Tabla 6 Ejemplo 3: Ejemplo comparativo Comparación de la administración intravenosa y subcutánea de FIX y PEG-FIX.
Tabla 7* *: de McCarthy et al Thro b. Haemost. 87(5) 824-830, (2002).
Tabla 8 BFIX = Benefix® PEGFIX = PEG-hrFIX Los resultados muestran una Cmáx de la dosis subcutánea del 78.8% de la dosis intravenosa. Los valores en porcentaje para IV y SQ en comparación con los valores normales parecen ser bajo pero en verdad son artefactos experimentales. Se supone que en cada caso el FIX es centrifugado con las células cuando se preparan las muestras. Se puede observar que el valor de 9.9% para una dosis intravenosa es en realidad una buena representación de un buen resultado. En consecuencia, la comparación con el 7.8% para una dosis subcutánea es favorable como lo indica el valor de Cmáx calculado indicado.
Conclusiones: La administración de hrFIX por inyección subcutánea de 25 y 50 Ul/kg dio como resultado un titulo en circulación escasamente detectable y no corrigió la hemofilia en los sujetos caninos.
Muy contrariamente a lo anterior, la dosificación subcutánea de 50 Ul/kg de PEGhrFIX dio lugar a aproximadamente un 80% de biodisponibilidad y tiempos de coagulación corregidos dentro del rango normal para una duración de 1 semana.
Ejemplo 4: Factor Vlla con PEG de 20 kDa En este ejemplo se describe un estudio sobre la biodisponibilidad del factor sanguíneo PEGFVIIa a partir de una inyección subcutánea. Se trataron dos perros hemofílicos (HB) con cantidades equipotentes de PEGFVIIa en el tiempo 0; uno por vía intravenosa (IV), uno por vía subcutánea (SQ). Se tomaron muestras de sangre y se recuperó el plasma para medir la proteína FVIIa. En la tabla de resultados se muestra una biodisponibilidad a partir de una administración subcutánea del 89.5%.
Tabla 9 La presencia de PEG confiere una solubilidad acuosa que facilita la movilidad en los vasos linfáticos. Los datos muestran una infusión constante controlada de FVIIa en lugar de los picos y las depresiones de bolo asociados con la inyección IV.
El área bajo la curva indica un 89.5% de biodisponibilidad para el FVIIa PEGilado y un estado más estable del nivel de FVIIa cuando es suministró es por vía subcutánea.
Ejemplo 5: Productos farmacológicos con PEGFVIII Para la comparación, se hace referencia a Kogenate® FS (un FBI recombinante disponible comercialmente). Se usó el excipiente PEGilado, Tween® 80, en grandes cantidades.
El polisorbato, Tween® 80, tiene un peso molecular de 1310 g/mol, 880 g de los cuales derivan de la PEGilación (unidades monoméricas totales de 20, cada una de 44 g/mol, (CH2-CH2-o».
El cálculo es entonces: Equivalente de longitud molar de PEG: Referencia: Monografía del producto Ejemplo tomado, vial con 250 Ul Peso molecular de FVIII 3.00?+05 g/mol Ul/g 4.00+06 Ul/g Ul/vial 2.50E+02 Ul/vial Volúmenes de viales 2.50E+00 ml/vial Concentración de polisorbato 6.40E-05 g/ml Peso molecular de polisorbato 1.31 E+03 g/mol Peso molecular de PEG por mol de polisorbato 880 g/mol Tabla 10 Relación de Tween'VFVHI 5.86E+02 Peso molecular equivalente de PEG 5.16E+05 Por ello, en Kogenate® FS, cada molécula de FVIII representa el equivalente de un PEG asociado de 516 kDa. En comparación, la formulación de dosificación con PEGFVIII preparada de acuerdo con la presente invención tiene un solo PEG de 20 kDa.
Conclusiones: Sobre una base de dosis por dosis, hay una reducción de 25.8 veces de polietilenglicol; dado que la formulación de dosificación de PEG-FVIII de la presente invención puede administrarse una vez por semana versus el uso profiláctico de Kogenate® sobre una base tres veces por semana, hay una reducción potencial global de aproximadamente 80 veces en la administración de PEG; y la cantidad de PEG administrada con la formulación de dosificación de FVIII de la presente invención sobre un período de dosificación es de 1.25% del administrado por Kogenate®.
Ejemplo 6: Administración por vía subcutánea del FVIIa El objetivo de este estudio era investigar la farmacocinética del FVIIa recombinante humano TheraPEGilado y no TheraPEGilado (TheraPEGrFVIIa y FVIIa, respectivamente) después de una administración intravenosa y subcutánea en perros con hemofilia B.
La TheraPEGilación del FVIIa transgénico (rFVIIa) se llevó a cabo de acuerdo con WO 2011/135308. El TheraPEGrFVIIa se suministró en el sitio de prueba como un liófilo en múltiples lotes que, luego de su reconstitución con agua de gran pureza, dio como resultado 1 mg/ml de TheraPEGrFVIIa en una solución amortiguadora fisiológicamente aceptable que mantuvo la actividad de FVIIa.
Los animales experimentales eran perros de una cruza de Lhasa Apso-Basenji con hemofilia B congénita severa causada por una supresión de 5 bp y una transición de C— sT en el gen F9 que da como resultado un codón de terminación temprana y un transcripto FIX inestable.
Antes de la dosificación, todos los perros fueron evaluados para verificar el estado de salud normal, incluyendo química de sangre completa, fibrinógeno en el perfil químico de suero, péptidos derivados de fibrinógeno (FDPs), tiempo de trombina y análisis de orina. Los fármacos administrados por vía intravenosa (IV) se suministraron como una inyección de bolo en la vena cefálica. Las dosis subcutáneas (SQ) se administraron entre las escápulas como una dosis única.
Se reconstituyeron lotes individuales de TheraPEGrFVIIa y luego se combinaron con el fin de producir una solución de una sola dosis usada para administrar las dosis a los animales como se describe en la Tabla 11.
Tabla 11 Se determinó el protocolo para la extracción de una muestra de 5 mi de sangre de cada perro en los siguientes puntos de tiempo: Antes de la administración del fármaco y a los 10, 30 minutos, 1 , 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 y 240 horas de postdosis.
Se transfirieron 4 mi de la muestra de sangre a un tubo que contiene anticoagulante de citrato trisódico 0.109 M (9:1 v/v) sobre hielo. El plasma se preparó por centrifugación de la sangre citrada remanente y las muestras de plasma resultantes se guardaron como alícuotas a -80 CC. Una alícuota de plasma fue evaluada por la concentración de FVIIa con un ELISA.
El ensayo ELISA Stago Asserachrom VII:Ag es un procedimiento de inmunoensayo ligado a enzima para la determinación cuantitativa de la concentración de Factor Vll/Vlla en muestras de plasma. El ensayo es un ELISA sándwich que comprende pocilios de microtitulación prerrecubiertas con un anticuerpo anti-FVII humano de conejo. Dado que el anticuerpo tiene una afinidad diferente por FVIIa que por PEG-FVIIa, se preparó una curva estándar por dilución de una proteína apropiada para el FVIIa que está presente en el plasma de prueba, es decir rFVIIa (0.78 a 50 ng/ml) para el ensayo de plasma con perros que habían recibido rFVIIa, o PEG-rFVIIa (0.78 a 50 ng/ml) para el ensayo de plasma de perros que habían recibido PEG-rFVIIa.
Las muestras de plasma se diluyeron hasta una concentración apropiada dentro de la curva estándar. Se cargaron las muestras de plasma y los estándares diluidos y se incubaron a temperatura ambiente antes del lavado y subsiguiente desarrollo con un anti-FVII humano de conejo conjugado con HRP y OPD (un sustrato HRP colorimétrico). La placa se leyó a 492 nm y la concentración de las muestras de prueba (ng/ml) se leyó a partir de la curva estándar.
Tabla 12 Tabla 14 Farmacocinética Los perfiles IV y SQ y los parámetros PK para 200 ug/kg de FVIIa, 800 ug/kg de TheraPEG-rFVIIa y 1600 ug/kg de TheraPEG-rFVIIa se muestran en las Figuras 8, 9 y 10 (Tabla 12, Tabla 13 y Tabla 14). Se encontró que la vida media de TheraPEG-rFVIIa era de entre 14 y 27 horas, lo cual constituye una extensión clara ante las 2.3 horas de vida media del rFVIIa no PEGilado. El AUC de la dosis IV de 1600 ug/kg de TheraPEG-rFVIIa era 1.8x mayor que el de la dosis IV de 800 ug/kg. Sin embargo, con la dosis SQ de 1600 ug/kg solamente era 1.2x mayor que para la dosis de 800 ug/kg. Esto se refleja en los cálculos de biodisponibilidad del 67% y 45% para las dosis de 800 ug/kg y 1600 ug/kg, respectivamente, que representaban un aumento significativo sobre la biodisponibilidad SQ del 11% observada para el rFVIIa no PEGilado.
El AUC para la dosis IV de 800 ug/kg de TheraPEG-rFVIIa es 84x el valor del AUC después de 200 ug/kg IV del rFVIIa no PEGilado y el AUC para la dosis SQ de 800 ug/kg de TheraPEG-rFVIIa es 300x el valor del rFVIIa no PEGilado de 200 ug/kg SQ.
Ejemplo 7: Administración por vía subcutánea del FVIII El objetivo de este estudio fue investigar la farmacocinética y la farmacodinámica del FVIII derivado de plasma TheraPEGilado (TheraPEG-pdFVIII) cuando se administra por vía intravenosa y por vía subcutánea a perros con hemofilia A. El TheraPEG-pdFVIII se preparó como se describe en WO 2011/135307 con un PEG lineal de 20 kDa y se purificó adicionalmente para dar el TheraPEG-pdFVIII purificado.
Los animales experimentales eran perros de una cruza de galgos que sufrían de hemofilia A congénita severa y que habían recibido previamente plasma canino para el tratamiento de hemorragias espontáneas, pero eran na'íve para el tratamiento con el FBI humano. Antes de la dosificación, todos los animales fueron evaluados para verificar el estado de salud normal, incluyendo química de sangre completa, fibrinógeno en el perfil químico de suero, péptidos derivados de fibrinógeno, tiempo de trombina y análisis de orina.
En la Tabla 15 se muestra el peso de cada perro y las dosis de FVIII que fueron 5 administradas. Cada perro recibió una sola dosis de TheraPEG-pdFVIII a una dosis mayor (aproximadamente 0.14 mg/kg) o menor (0.07 mg/kg) o pdFVIII no PEGilado a 0.03 mg/kg. La administración intravenosa (IV) se suministró como una dosis de bolo por la vena cefálica. La administración subcutánea (SQ) se suministró como una dosis única entre las escápulas.
Tabla 15 Se determinó el protocolo para la extracción de una una muestra de sangre de cada perro en los siguientes puntos de tiempo: Antes de la administración del fármaco y a los 10, 30 minutos, 1 , 2, 4, 8, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 y 240 horas de postdosis. Se usó sangre completa (no citrada) para el ensayo de coagulación de sangre completa y el ensayo de tiempo de coagulación activado. La muestra de sangre remanente se transfirió a tubos que contienen anticoagulante de citrato trisódico 0.109 M (9:1 v/v) sobre hielo. El ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activado se condujo con sangre citrada. El plasma se preparó por centrifugación de la sangre citrada remanente y las muestras de plasma resultantes se guardaron como alícuotas a -80 °C para el ELISA con antígeno FVIII.
Ensayo de tiempo de coagulación de sanare completa (WBCT) Las muestras de sangre se dividieron entre 2 vacutubos, (2 X 0.5 mi) y se observaron cuidadosamente con nivelación periódica y juiciosa del tubo hasta que se determinó un coágulo por interrupción de flujo en la posición completamente horizontal. Luego se observó la calidad del coágulo sosteniendo el tubo en posición completamente invertida. El WBCT se registró como la media del tiempo total desde la extracción de la muestra hasta la observación visual del coágulo sanguíneo en ambas muestras y también se anotó la calidad del coágulo en la posición invertida.
Tiempo de coagulación activado (ACT) v tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) Las pruebas de ACT y APTT se llevaron a cabo usando un analizador de coagulación Haemachron Jr (International Technidyne Corps.) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
La concentración del antígeno de FVIII en las muestras de plasma se determinó mediante un ELISA usando el conjunto de elementos para el antígeno FVIII Visulize de Affinity Biologicals (Ancaster, Ontario, Canadá) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Resultados Tiempo de coagulación de sangre completa (WBCT) La hemostasis (WBCT <12 minutos) se mantuvo en todos los perros que habían recibido la dosis más alta de TheraPEG-pdFVIII (HA1-4) por entre 80-100 horas. Aparentemente no había diferencias en el perfil de WBCT entre la administración IV y SQ. Una dosis menor de TheraPEG-pdFVIII (HA6) administrada por vía SQ mantuvo la hemostasis por entre 56-75 horas. Por el contrario, aunque el FVIII no PEGilado administrado por vía SQ redujo el WBCT, no da como resultado un WBCT sostenido por debajo de 12 minutos.
Tiempo de coagulación activado fACT) El ACT se redujo al rango normal de menos que 200 segundos en todos los perros que habían recibido la dosis más alta de TheraPEG-pdFVIII (HA1-4) por aproximadamente 80 horas de postdosis. No había diferencias en el perfil ACT entre la administración IV y SQ.
Una menor dosis de TheraPEG-pdFVIII (HA6) administrada por vía SQ mantuvo el ACT por debajo de 200 segundos durante por lo menos 36 h. Por el contrario, aunque el FVIII no PEGilado administrado por vía SQ redujo el ACT, no dio como resultado un ACT sostenido por debajo de 200 segundos.
Tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) El APTT se redujo a menos que 60 segundos en todos los perros que habían recibido la dosis más alta de TheraPEG-pdFVIII (HA1-4) por aproximadamente 60 horas de postdosis. No había diferencias en el perfil de APTT entre la administración IV y SQ.
Una menor dosis de TheraPEG-pdFVIII (HA6) administrada por vía SQ mantuvo el APTT en menos que 60 segundos durante 40 h. Por el contrario, aunque el FVIII no PEGilado administrado por vía SQ redujo el APTT, el tiempo APTT más corto era de 80 segundos. La razón por la cual el APTT para este individuo permaneció por debajo del valor basal durante la duración del estudio de postdosis no es clara, pero puede deberse a variaciones entre perros.
Concentraciones en plasma y farmacocinética del FVIII En la Figura 11 se muestra la concentración plasmática de FVIII contra tiempo en todos los perros. Los datos de los perros dosificados por vía SQ solamente se muestran en la Figura 12. Los datos no procesados se muestran en las Tablas 23-28. Los parámetros PK clave se muestran en la Tabla 16.
La vida media de TheraPEG-FVIII administrada SQ era de 18.3 h y 16.6 h para HA1 y 2, respectivamente. Cuando se administra por vía IV, las vidas medias eran ligeramente más cortos a 15.2 h y 13.9 h para HA3 y 4, respectivamente. La biodisponibilidad se calculó a 32% después de la administración SQ. Las concentraciones de FVIII después de la administración SQ de FVIII no PEGilado (HA5) se encontraban fundamentalmente debajo del nivel de cuantificación y por ello no se pudieron calcular los parámetros PK.
Tabla 16 *: valor aproximado debido a la variabilidad de datos.
Conclusiones El suministro subcutáneo de la dosis más alta de TheraPEG-FVIII dio como resultado un control hemostático por 80-100 horas después de una dosis única, medido por los valores de WBCT, APTT y ACT. El perfil de SQ en este ensayos no se pudo diferenciar del perfil de una dosis equivalente de TheraPEG-FVIII administrada por vía IV. Esto demostró claramente la viabilidad de la administración SQ de TheraPEG-FVIII.
La vida media de TheraPEG-pdFVIII varió en un rango de entre 13.9 y 18.3 h. Esto demuestra una clara extensión de la vida media en comparación con el FVIII recombinante comercial cuya vida media informada es de 7-11 h en perros con hemofilia A (Karpf eí al., Haemophilia 17, 5 (2011)). Por ende, el TheraPEG-FVIII no solamente estaba biodisponible por vía SQ sino que también mostró una vida media extendida.
El perfil PK de FVIII después de la administración SQ de TheraPEG-pdFVIII tenía valores de Cmáx y AUC muy reducidos en comparación con la administración IV y se determinó que la biodisponibilidad era del 32%. Sin embargo, a este nivel de dosis, debido a la naturaleza de "liberación lenta" de la curva PK, las exposiciones se mantuvieron por encima del 5% del nivel normal después de la administración SQ por una cantidad similar de tiempo que después de la dosis IV, lo cual probablemente explica las respuestas funcionales equivalentes. La disminución de la Cmáx y el AUC, junto con el aumento en la duración de la acción para el TheraPEG-FVIII suministrado por vía SQ resaltó las potenciales características de seguridad adicionales de este producto y las opciones de dosificación.
La administración subcutánea de FVIII no PEGilado no dio como resultado FVIII detectable en plasma y aunque se habían reducido los tiempos de coagulación, no hubo un mantenimiento sustentable de la hemostasis. Esto demostró que el FVIII no PEGilado tenía una biodisponibilidad SQ muy baja, pero que cantidades muy pequeñas del FVIII pueden afectar la hemostasis. A diferencia del FVIII no PEGilado, una dosis baja de TheraPEG-pdFVIII dio como resultado niveles plasmáticos de hasta un 9% del normal y la hemostasis se mantuvo durante 56-75 horas. Por ello, la adición de TheraPEG al pdFVIII dio como resultado una mayor biodisponibilidad y respuesta funcional cuando se administra SQ. En conclusión, este estudio demostró claramente que la TheraPEGilación de FVIII dio como resultado un producto superior que puede administrarse por vía subcutánea con una duración de acción extendida.
Tabla 17 Perro 12 con HA1 (SQ, PEG-pdFVIII) Tabla 18 Perro 13 con HA2 (SQ, PEG-pdFVIII) Tabla 19 Perro 14 con HA3 (SQ, PEG-pdFVIII) Tabla 20 Perro 15 con HA4 (SQ, PEG-pdFVIII) Tabla 21 Perro 17 con HA5 (SQ, pdFVIII) Tabla 22 Perro 16 con HA6 (SQ, dosis baja de PEG-pdFVIII) Ejemplo 8: Respuesta inmune a la administración subcutánea en perros En la presente invención se ha observado que una menor respuesta inmune debida a la administración por vía subcutánea. Este efecto es diametralmente opuesto a lo que hubiera anticipado un especialista en el arte de la administración de factores sanguíneos. Se acepta en general que con la administración por vía subcutánea, se exacerbarla el nivel muy alto de respuesta inmune (frecuencia inhibidora del FVIII) existente.
En la presente invención, se ha encontrado un resultado muy sorprendente. Con el fin de disminuir la incidencia de respuestas inmunes (inhibidoras) se propone adoptar una administración por vía subcutánea, donde el nivel de respuesta inmune está relacionado directamente con el nivel de exposición sistémica. Con una administración subcutánea, la Cmá* se puede disminuir fácilmente y al hacerlo hay una disminución de la respuesta inmune.
En los ejemplos de la invención, el producto PEGilado es expuesto a pruebas de ambientes inmunes, es decir, el sistema en perros. Se puede observar que los valores Bethesda (unidades de cantidades inhibidoras) son más altas y aparecen primero cuando la administración es por vía intravenosa. Por el contrario, el suministro subcutáneo tiene una exposición sistémica mucho menor, como lo evidencia la Cmáx y una respuesta Bethesda menor y más tardío. De hecho, el valor más bajo de todos es para el FVIII desnudo administrado por vía SQ que casi no tiene exposición sistémica y nunca se observa un valor inhibidor. Véase la Figura 13/Tabla 23 por una representación de los datos obtenidos.
Tabla 23 Los gráficos de la Figura 13 demuestran cuanta actividad inhibidora se encontró en plasma sanguíneo en el tiempo, estimulada por los tratamientos. En el caso del tratamiento IV directo, se observa más rápidamente un nivel más alto de inhibidores, en comparación con el tratamiento SQ que drena hacia el sistema más lentamente y es menos provocativo para el sistema inmune.
Ejemplo 9: Estudios comparativos con la administración subcutánea en ratas En este ejemplo se describe el sorprendente efecto depot observado con los factores sanguíneos cuando se conjugan con polímeros, tal como PEG. Aún más, los resultados muestran que es posible manipular la velocidad a la cual los factores sanguíneos se vuelven disponibles desde el espacio subcutáneo por manipulación del nivel de hidratación de la proteína debido al tamaño (o la cantidad) de PEG.
Se estudió la farmacocinética relativa del Factor VI la PEGilado con 3 formas de PEGilación diferentes en ratas para comparar su desempeño en términos de suministro desde el espacio subcutáneo.
El Factor Vlla recombinante nativo se administró a ratas, así como 3 formas PEGiladas diferentes del FVIIa, ya sea por administración subcutánea (SQ) o intravenosa (IV): a) FVIIa TheraPEGilado: El FVIIa se mono-PEGiló con una molécula de PEG de 20 kDa usando la tecnología "TheraPEG" de Polytherics Ltd (descrita en otra parte y en WO 2011/135308); b) FVIIa GlicoPEGilado: El FVIIa se conjugó con PEG mediante una tecnología de glicoPEGilación estándar que da un producto de prueba dominado por biconjugados con PEG de 20 kDa, también con alguna cantidad significativa de productos de PEG superiores: c) FVIIa PEGilado catalizado por HATU: El FVIIa se monoPEGiló con un PEG de 20 kDa (usando un método de conjugación derivado de un método descrito en US 5644029).
TheraPEG-FVIIa Se dispersó PEG de 20 kDa a 10 mg/ml en fosfato de Na 5 mM, pH 8.0, NaCI 15 mM, EDTA 2 mM. Luego se incubó a 20 °C durante 3 horas. Se reconstituyó un vial (5.3 mg) de FVIIa a 0.8 mg/ml en citrato de sodio 20 mM, pH 6.0, NaCI 0.1 M, EDTA 10 mM. Se incubó a 20 °C durante 10 minutos. Luego se agregó TCEP, 1.5 equivalentes molares (ME) de 24 mM y 0.025 ME de 0.4 mM de SeCM y se incubó a 20 °C durante 1 hora. A continuación, se agregó 2 ME de PEG activado al FVIIa reducido. La mezcla se incubó a 20 °C durante 1 hora y luego a 5 °C durante 17 horas. Se condujo entonces una cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna Superdex 200 en solución amortiguadora de formulación con el fin de purificar el FVIIa PEGilado.
Para el análisis del producto, se corrió el rFVIIa reconstituido, PEG activado, mezcla de reacción y las fracciones Superdex seleccionadas (25, 30, 35, 39, 45, 51 , 80) sobre geles SDS-PAGE no reducido. Se agruparon las fracciones que contienen al FVIIa PEGilado y se concentraron hasta aproximadamente 3 mi antes de la liofílización. La agrupación SEC concentrada se evaluó por SDS-PAGE reducido y no reducido, actividad de coagulación y ensayos de HPLC de fase reversa, tanto antes como después de la liofílización.
FVIIa GlicoPEGilado Se reconstituyó un vial (5.3 mg) de rFVIIa en 2.5 mi de solución amortiguadora salina MOPS. El rFVIIa reconstituido se intercambió luego con solución amortiguadora sobre una columna de desalado PD10 en solución amortiguadora salina MOPS y se diluyó a 1 mg/ml. El rFVIIa intercambiado con solución amortiguadora se colocó sobre hielo y se agregó periodato de sodio 100 mM hasta una concentración final de 2.5 mM. La mezcla se incubó en oscuridad por un máximo de 30 minutos. Luego se agregó glicerol (50%) hasta una concentración final del 3%. A continuación, la mezcla se intercambió con solución amortiguadora usando para ello una solución amortiguadora de acetato de sodio 0.1 M y una columna Spin Zeba. Se elaboró una solución madre 50 mg/ml de amino-oxi-PEG y se agregaron 10 ME de este PEG al FVIIa desalado. La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 1-2 horas antes de una incubación adicional a 4 °C durante la noche. El FVIIa GlicoPEGilado se purificó luego por cromatografía SEC como se describió precedentemente.
Para el análisis del producto, se corrieron fracciones SEC seleccionadas (23, 27, 32, 35, 40 y 80) sobre un SDS-PAGE no reducido. Se agruparon las fracciones que contienen al FVIIa GlicoPEGilado y se concentraron hasta aproximadamente 3 mi antes de la liofílización. La agrupación SEC concentrada se evaluó por SDS-PAGE reducido y no reducido, actividad de coagulación y ensayos de HPLC de fase reversa, tanto antes como después de la liofílización.
PEG-FVIIa HATU Se reconstituyó un vial (5.3 mg) de rFVIIa en 2.5 mi de solución amortiguadora de borato, se intercambió con solución amortiguadora sobre una columna PD10 en solución amortiguadora de borato y se diluyó a 0.5 mg/ml. Se elaboró una solución madre de metoxi-PEG en acetonitrilo a 16 mg/ml. El rFVIIa intercambiado con solución amortiguadora se activó con 1.0 ME de HATU y 2.5 ME de DIEA durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la activación, se agregaron 8 ME de metoxi-PEG al rFVIIa activado sobre un período de 2-5 minutos. La mezcla de reacción se incubó luego a temperatura ambiente durante 80-100 minutos. A continuación, el FVIIa PEGilado HATU se purificó por cromatografía SEC como se describió precedentemente.
Para el análisis del producto, las fracciones SEC seleccionadas se corrieron sobre un SDS-PAGE no reducido. Se agruparon las fracciones que contienen al FVIIa PEGilado HATU y se concentraron hasta aproximadamente 3 mi antes de la liofilización. La agrupación SEC concentrada se evaluó por SDS-PAGE reducido y no reducido, actividad de coagulación y ensayos de HPLC de fase reversa, tanto antes como después de la liofilización.
Método Se administraron formulaciones a una dosis de 0.5 mg/kg, ya sea IV o SQ, a ratas sanas. Para la administración IV, se inyectó el volumen apropiado del artículo de prueba en la vena de la cola. Para la administración SQ, se inyectó el volumen apropiado del artículo de prueba en la parte posterior del cuello. Después de administrar los artículos de prueba control (rFVIIa nativo), se tomaron muestras de sangre a los siguientes intervalos de tiempo: Tabla 24 Después de administrar los artículos de prueba, se tomaron muestras de sangre siguientes intervalos de tiempo: Tabla 25 En cada punto de tiempo se preparó plasma a partir de la muestra de sangre y se determinó la concentración de FVIIa usando el ensayo de ELISA Stago Asserachrom VII:Ag. Este ensayo es un procedimiento de inmunoensayo ligado a enzima para la determinación cuantitativa de la concentración de Factor Vll/Vlla en muestras de plasma. El ensayo es un ELISA sándwich que comprende pocilios de microtitulación prerrecubiertas con un anticuerpo anti-FVII humano de conejo. Dado que el anticuerpo tiene una afinidad diferente por FVIIa que por PEG-FVIIa, se preparó una curva estándar por dilución de una proteína apropiada para el FVIIa que está presente en el plasma de prueba, es decir rFVIIa (0.78 a 50 ng/ml) para el ensayo de plasma con ratas que habfan recibido rFVIIa, o PEG-rFVIIa (0.78 a 50 ng/ml) para el ensayo de plasma de perros que habían recibido PEG-rFVIIa.
Las muestras de plasma se diluyeron hasta una concentración apropiada dentro de la curva estándar. Se cargaron las muestras de plasma y los estándares diluidos y se incubaron a temperatura ambiente antes del lavado y subsiguiente desarrollo con un anti-FVII humano de conejo conjugado con HRP y OPD (un sustrato HRP colorimétrico). La placa se leyó a 492 nm y la concentración de las muestras de prueba (ng/ml) se leyó a partir de la curva estándar. Los resultados del estudio se muestran en las Tablas 26(a) y (b), donde hay dos rutas de administración: intravenosa (IV) y subcutánea (SQ) para cada una de las moléculas FVIIa PEGiladas y un brazo control que era el FVIIa nativo.
Según se muestra en las Tablas 26(a) y (b), hay 2 rutas de administración, intravenosa (IV) y subcutánea (SQ) para cada una de las moléculas FVIIa PEGiladas y un brazo control que era el FVIIa nativo.
En este ejemplo se describe el sorprendente efecto depot observado con los factores sanguíneos cuando se conjugan con polímeros, tal como PEG. Aún más, los resultados muestran que es posible manipular la velocidad a la cual los factores sanguíneos se vuelven disponibles desde el espacio subcutáneo por manipulación del nivel de hidratación de la proteína debido al tamaño (o la cantidad) de PEG.
A partir de los resultados que se muestran en las Tablas 26(a) y (b), se puede observar que: • Todas las proteínas PEGiladas tenían vidas medias en plasma extendidas en comparación con la proteína desnuda Los productos mono-PEG, es decir las proteínas TheraPEG y PEGiladas HATU, tienen una menor velocidad de entrada en el plasma que el conjugado di-PEG (GlicoPEG) y por ello presenta un efecto depot más pronunciado. Esto se deduce por comparación de las diferencias en las vidas medias IV y SQ de cada producto.
• Para TheraPEG-FVIIa, la t1/2 IV era de 8.68 horas que se compara con las 23.2 horas para el mismo producto suministrado por vía SQ. Esto representa un aumento de 2.7 veces lo cual implica un efecto depot muy grande para este producto mono-PEGilado.
• De manera similar, para el PEG-FVIIa mono-PEGilado HATU, la SQ t1/2 presenta un efecto depot mejorado representado por un aumento de 1.7 veces con respecto a la t1/2 IV (24.3/14.07) • Por el contrario, para el producto muy PEGilado, GlicoPEG-FVIIa, las vidas medias para ambos productos son más cercanas a una paridad (22.3/19.34 = 1.15 veces), lo cual implica que la administración SQ de este producto tiene poco efecto depot en comparación con la administración IV.
En otras palabras, pareciera que los productos mono-PEGilados, cuando se administran por vía SQ, han resistido la dispersión por el espacio subcutánea por un lapso mayor que el producto di-PEGilado, proporcionando así el efecto depot mejorado. La cantidad reducida de PEG sobre los productos mono-PEGilados dejarían más proteína expuesta; la mayor cobertura de PEG sobre el producto GlicoPEG lo volverían más dispersable en agua dentro del espacio subcutáneo, lo cual conduce a una velocidad de entrada más rápida por los vasos linfáticos hacia el plasma.
Por ello, sorprendentemente, para alcanzar la mayor duración de liberación depot, se requiere un menor grado de PEGilación. Sin vinculación a ninguna teoría, se puede razonar que con una menor PEGilación queda expuesto algo de la proteína al tejido subcutáneo, lo cual confiere una velocidad lenta a la difusión a través de la linfa. Por el contrario, un mayor grado de PEGilación cubre a la proteína por completo dejando que el producto ingrese rápidamente a la circulación sanguínea.
Esto soporta la enseñanza de que la modificación de moléculas blanco, en este caso por PEGilación, permite un ajuste muy fino para modificar las características de liberación y de esa manera la concentración del producto en sangre en el tiempo, y también la biodisponibilidad.
En general, existe un efecto total muy sorprendente por el cual la combinación de una PEGilación seguido por una administración subcutánea, da como resultado un aumento observado de 35 veces de la vida media aparente (0.66 horas para el FVIIa desnudo a 23.2 horas después de la administración subcutánea (SQ)).
Finalmente, se puede observar en general que la biodisponibilidad favorece a la especie PEGilada mayor, es decir GlicoPEG, confirmando asi que el mayor PEG y los niveles de hidratación promueven un grado más alto de movilidad y por ello de biodisponibilidad.
Tabla 26 (a) Tabla 26 (b) Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (53)

REIVINDICACIONES
1. Un método de administración de un agente terapéutico a un paciente, que comprende administrar dicho agente terapéutico por vía subcutánea al paciente, de manera tal que la relación Cmáx:Cpromedio es menor que la relación Cmáx:Cpromedio del agente cuando se administra por vía intravenosa, y donde el agente terapéutico está modificado a fin de aumentar la hidrofilicidad y modificar las dimensiones moleculares con relación al estado nativo de dicho agente terapéutico.
2. Un método de administración de un agente terapéutico en el sistema linfático de un paciente, que comprende el paso de administrar dicho agente terapéutico por vía subcutánea, de manera tal que no ingresa directamente en el sistema circulatorio del paciente en el sitio de inyección, y en donde el agente terapéutico está modificado para aumentar la hidrofilicidad y para modificar las dimensiones moleculares con relación al estado nativo del agente terapéutico.
3. Un método para prevenir el ingreso de un agente terapéutico directamente en el sistema circulatorio local de un paciente luego de la administración por vía subcutánea del agente terapéutico a un paciente, donde dicho método comprende el paso de administrar por vía subcutánea al agente modificado al paciente y en donde el agente terapéutico está modificado para aumentar la hidrofilicidad y para modificar las dimensiones moleculares con relación al estado nativo del agente terapéutico, de manera tal que el agente terapéutico modificado no puede ingresar en la vasculatura local directamente desde el sitio de administración.
4. Un método para modular la velocidad de distribución de un agente terapéutico desde un depósito subcutáneo en un sujeto, que comprende modificar el agente terapéutico para alterar la hidrofilicidad de dicho agente, donde el nivel de hidrofilicidad es proporcional al nivel de biodisponibilidad.
5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la administración por vía subcutánea del agente terapéutico modificado permite administrar una dosis más alta de dicho agente modificado al paciente que la dosis administrada de manera segura con una sola inyección de bolo intravenoso.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la administración por vía subcutánea del agente terapéutico modificado permite volver a administrar una dosis al paciente antes que si dicho agente modificado se administrara por vía intravenosa.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la administración por vía subcutánea del agente terapéutico modificado produce una respuesta inmunogénica menor o equivalente que la administración intravenosa del agente en su forma modificada o nativa.
8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la hidrofilicidad del agente terapéutico aumenta en por lo menos un 50% con relación al estado nativo del agente terapéutico.
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el agente terapéutico es un antibiótico, un factor de coagulación sanguíneo, una hormona, otro péptido o proteína terapéutico, una molécula pequeña o un anticuerpo monoclonal.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el factor de coagulación sanguíneo se selecciona del grupo que consiste en el Factor VII, el Factor Vlla, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor XIII, el Factor V, el Factor de von Willebrand y la proteína C.
11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la modificación es una conjugación del agente terapéutico en un polímero biocompatible.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el polímero biocompatible es polietilenglicol (PEG), polifosfatidil colina (PC), polipropilenglicol (PPG), copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, óxido de polietileno (PEO), poliol polioxietiiado, alcohol poliolefínico, polihidroxialquilmetacrilato, polisacáridos, ácido poli a-hidroxi, alcohol polivinílico, polifosfaceno, poli N-acriloilmorfolina, polímeros de óxido de polialquileno, ácido polimaleico, poli DL-alanina, carboximetilcelulosa, dextrano, almidón o derivados de almidón, ácido hialurónico, quitina, polimetacrilatos, ácido polisiálico (PSA), polihidroxi alcanoatos, poliaminoácidos y combinaciones de los mismos.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en donde el polímero biocompatible es PEG
14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la modificación es una fusión a un polipéptido para producir una protefna de fusión; la incorporación en vehículos de administración vesiculares tales como liposomas, transferosomas o micelas; la incorporación o unión a dendrímeros o la formación de complejos de oligómeros del agente terapéutico.
15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el volumen de administración subcutánea del agente terapéutico no es mayor que 2 mi.
16. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el agente terapéutico modificado se puede administrar a una concentración mayor que la concentración de agente modificado que se puede administrar con seguridad por vía intravenosa.
17. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la administración subcutánea del agente terapéutico modificado provee un beneficio terapéutico al paciente por una duración de por lo menos 12 horas más que el beneficio terapéutico del agente modificado cuando se administra por vía intravenosa.
18. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde la administración subcutánea se efectúa mediante inyección subcutánea, aplicación tópica, parche transdérmico, abrasión microdérmica o administración de polvo seco a presión alta.
19. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la administración subcutánea se efectúa por lo menos una vez por día, por lo menos dos veces por día, por lo menos una vez por semana, por lo menos dos veces por semana, por lo menos una vez cada dos semanas o por lo menos una vez por mes.
20. Un agente modificado que comprende un agente terapéutico y una modificación, en donde dicha modificación aumenta la hidrofilicidad y modifica las dimensiones moleculares del agente con relación al estado nativo del agente terapéutico para su uso en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
21. Un agente modificado para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, en donde la modificación aumenta la hidrofilicidad del agente en por lo menos un 50% con relación al estado nativo del agente terapéutico.
22. Un agente modificado reivindicado en la reivindicación 20 o en la reivindicación 21 , en donde la modificación es un polímero biocompatible fusionado al agente terapéutico.
23. Un agente modificado reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde la administración subcutánea del agente modificado provee un beneficio terapéutico al paciente por una duración de por lo menos 12 horas más que el beneficio terapéutico del agente modificado cuando se administra por vía intravenosa.
24. Una forma de dosificación de una composición farmacéutica con un agente terapéutico modificado, en donde la administración subcutánea del agente modificado provee un beneficio terapéutico al paciente por una duración de por lo menos 12 horas más que el beneficio terapéutico del agente modificado cuando se administra por vía intravenosa.
25. Una forma de dosificación de una composición farmacéutica con un factor de coagulación sanguíneo modificado para su administración por vía subcutánea que cuando se formula para una administración subcutánea a un paciente provee una forma de dosificación para no más de una vez por mes que es suficiente para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa en dicho paciente de no más de 20 minutos.
26. Una forma de dosificación líquida de un factor de coagulación sanguíneo PEGilado para su administración por vía subcutánea no más de una vez por mes, en donde dicha forma de dosificación tiene una Cmáx de por lo menos un 10% y no más de un 90% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa, para su uso en el tratamiento de un trastorno de la coagulación sanguínea.
27. Una forma de dosificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en donde dicha forma de dosificación provee una dosificación para no más de una vez cada quince días, no más de una vez por semana, no más de dos veces por semana, no más de una vez cada dos días o no más de una vez por día.
28. Una forma de dosificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en donde la forma de dosificación es suficiente para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa menor que 15 minutos en dicho paciente.
29. Una forma de dosificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en donde la forma de dosificación es suficiente para mantener un tiempo de coagulación de sangre completa menor que 12 minutos en dicho paciente.
30. Una forma de dosificación reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, en donde el factor de coagulación sanguíneo se selecciona del grupo que consiste en el Factor Vlla, el Factor VII, el Factor VIII, el Factor IX, el Factor X, el Factor Xa, el Factor XI, el Factor XIII, el Factor V, el Factor de von Willebrand y la protelna C.
31. Una forma de dosificación reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 30, en donde la modificación es una PEGilación.
32. La forma de dosificación reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones 24 a 31 , en donde la forma de dosificación tiene una Cmáx de por lo menos un 10% y no más de un 90% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa.
33. La forma de dosificación reivindicada en la reivindicación 32, en donde la formulación tiene una Cméx de entre un 10% y un 20% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa.
34. La forma de dosificación reivindicada en la reivindicación 33, en donde el agente es el Factor VIII.
35. La forma de dosificación reivindicada en la reivindicación 32, en donde la formulación tiene una Cmáx de entre un 40% y un 60% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa.
36. La forma de dosificación reivindicada en la reivindicación 35, en donde el agente es el Factor IX.
37. La forma de dosificación reivindicada en la reivindicación 32, en donde la formulación tiene una Cmáx de entre un 75% y un 80% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa.
38. La forma de dosificación de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la formulación tiene una CmáX de un 75% en comparación con una forma de dosificación de referencia equivalente cuando se administra por vía intravenosa.
39. La forma de dosificación reivindicada en la reivindicación 37 o la reivindicación 38, en donde el agente es el Factor VII.
40. Una formulación de dosificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 39, en donde la dosificación es de entre 1 y 1000 Ul/kg.
41. Una formulación de dosificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 39, en donde la dosificación es de entre 5 y 500 Ul/kg.
42. Una formulación de dosificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 39, en donde la dosificación es de entre 100 y 250 Ul/kg.
43. Una formulación de dosificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 39, en donde la dosificación es de entre 50 y 200 Ul/kg.
44. Una formulación de dosificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 39, en donde la dosificación es de entre 25 y 50 Ul/kg.
45. Una formulación de dosificación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 39, en donde la forma de dosificación se administra por lo menos una vez por día, por lo menos dos veces por día, aproximadamente una vez por semana, aproximadamente dos veces por semana, aproximadamente una vez cada dos semanas o aproximadamente una vez por mes.
46. Una formulación de dosificación de un agente terapéutico, en donde la forma de dosificación se administra por vía subcutánea y en donde el agente terapéutico está modificado para alterar la hidrofilicidad de dicho agente, donde el nivel de hidrofilicidad es proporcional al nivel de biodisponibilidad.
47. Un método de tratamiento de una enfermedad en un paciente, que comprende administrar por vía subcutánea una forma de dosificación de un agente terapéutico modificado de acuerdo con la reivindicación 24.
48. Un método de tratamiento de una enfermedad de la coagulación sanguínea o de un traumatismo en un paciente que comprende administrar por vía subcutánea una forma de dosificación de un factor de coagulación sanguíneo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 46 a un paciente que lo necesita.
49. Un método de tratamiento de acuerdo con la reivindicación 47 o la reivindicación 48, en donde la forma de dosificación se administra por lo menos una vez por día, por lo menos dos veces por día, por lo menos aproximadamente dos veces por semana, por lo menos aproximadamente una vez por semana, por lo menos una vez cada dos semanas o por lo menos aproximadamente una vez por mes.
50. Un método de tratamiento de acuerdo con la reivindicación 47 o la reivindicación 48, en donde la forma de dosificación se administra por lo menos una vez por día.
51. Un método de tratamiento de acuerdo con la reivindicación 50, en donde la forma de dosificación se administra dos veces por día, donde el paciente recibe una primera forma de dosificación en una primera administración y una segunda forma de dosificación en una segunda administración.
52. Un método de tratamiento de acuerdo con la reivindicación 51, en donde la segunda forma de dosificación se administra separadamente, simultáneamente o sucesivamente con la primera forma de dosificación.
53. Un conjunto de elementos que comprende una forma de dosificación subcutánea de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 46, y un vehículo de administración.
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