CN108853008A - 一种可注射天然产物凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可注射天然产物凝胶的制备方法及其应用。本发明以具有抗炎活性的三萜天然产物路路通酸作为凝胶质与乙醇水混合溶剂构建出了具有优异自修复性能的天然产物凝胶（1/NPG）。小鼠皮下注射1/NPG证实其能稳定存在于小鼠体内并且无急性和慢性炎症反应。体外释放表明装载了抗肿瘤药物盐酸多柔比星（DOX）的1/NPG（记为，DOX‑1/NPG）能够有效的延长药物的释放。体外抗肿瘤表明DOX‑1/NPG能够增强3倍游离药物的抗肿瘤活性。DOX‑1/NPG对荷瘤小鼠治疗后不仅最有效的控制了肿瘤生长，同时荷瘤小鼠的寿命还被延长了103%。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然产物凝胶的制备方法及其应用，具体涉及一种以天然产物凝胶为载体构建的具有降毒增效治疗肿瘤的局部给药系统。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康的恶性疾病之一，并且绝大多数的癌症是无法被完全治愈的，目前人们只能通过对癌症的治疗达到延长患者生存期的意图。患者在其延长的生存期内，其生活质量通常由于癌症治疗的副作用而大打折扣，这使得癌症患者通常在煎熬中渡过其所延长的寿命。如何能一方面治疗癌症，同时提高患者的生活质量，这是广大科研人员所不懈追求的。化学药物治疗是针对癌症最常规的一种治疗方式，然而化疗药物自身是具有毒性的，并且由于其在血液中的高清除率以及非特异性使得在临床应用时仍然要以高剂量给药，这会进一步加剧化疗的毒副作用。局部给药系统是一种能将化学药物直接递送到肿瘤部位且药物以持续释放的方式来进行精确癌症治疗的手段，它能有效的提高对癌症的治疗效果以及降低对正常组织和器官的全身毒性。
目前，最受人们关注的是以具有刺激响应性的小分子凝胶为载体构建的该系统。通常选择的载体是通过人工有机合成获得的小分子凝胶，它们具有酶响应、离子响应、温度和pH响应等。然而，无一例外，这些小分子凝胶均是人工合成的。最近，天然的小分子凝胶（即，天然产物凝胶，Natural product gel ，NPG）被发现并逐渐进驻到人们的视野，它是由天然产物凝胶质（即：天然产物）与溶剂通过非共价作用自组装形成的。与合成的小分子凝胶相比，天然产物凝胶不仅具有小分子凝胶的多种刺激响应性，还由于其来源于传统药物而拥有了多种药理活性。这种药理活性的存在使得天然产物凝胶相较于小分子凝胶而言具有了应用于药物传输领域更大的优势。在天然产物凝胶构建的药物传输体系中，凝胶不仅能作为一种载药基质（支架）材料，其自身还能作为药理活性成分来发挥治疗和辅助治疗的目的。这相当于使这些原本作为药理活性成分的天然产物增添了其作为材料的属性。
发明内容
鉴于天然产物凝胶的上述优点，本发明提供了一种可注射天然产物凝胶的制备方法及其应用。本发明以天然产物凝胶为载体，构建了一种具有降毒增效治疗肿瘤的局部给药系统。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种可注射天然产物凝胶的制备方法，包括如下步骤：
一、将2.5~30mg天然产物凝胶质路路通酸溶解在0.5ml乙醇中；
二、向步骤一得到的混合溶液中加入0.1~0.5ml的蒸馏水，充分摇动所得混合物并静置，得到可注射天然产物凝胶。
上述方法制备得到的可注射天然产物凝胶可作为载体装载抗肿瘤药物盐酸多柔比星（DOX）用于构建具有降毒增效治疗肿瘤的局部给药系统，具体制备方法如下：
一、首先将2.5~30mg天然产物凝胶质路路通酸溶解在0.5ml乙醇中；
二、向步骤一得到的混合溶液中加入0.1~0.5ml溶解了药物DOX的水溶液，充分摇动所得混合物并静置，即得到具有降毒增效治疗肿瘤的局部给药系统，其中：所述水溶液中药物DOX的浓度为0.1~10mg/ml。
本发明以具有抗炎活性的三萜天然产物路路通酸作为凝胶质与乙醇水混合溶剂构建出了具有优异自修复性能的天然产物凝胶（1/NPG）。小鼠皮下注射1/NPG证实其能稳定存在于小鼠体内并且无急性和慢性炎症反应。体外释放表明装载了抗肿瘤药物盐酸多柔比星（DOX）的1/NPG（记为，DOX-1/NPG）能够有效的延长药物的释放。体外抗肿瘤表明DOX-1/NPG能够增强3倍游离药物的抗肿瘤活性。DOX-1/NPG对荷瘤小鼠治疗后不仅最有效的控制了肿瘤生长，同时荷瘤小鼠的寿命还被延长了103%。
附图说明
图1为天然产物凝胶质的质谱图；
图2为天然产物凝胶质的红外光谱图；
图3为天然产物凝胶质的质谱1H-NMR（CD3Cl）图；
图4为天然产物凝胶质的质谱13C-NMR（CD3Cl）图；
图5为1/NPG的照片；
图6为DOX-1/NPG的照片；
图7为鲁米诺作为指示剂的急性炎症的体内生物发光成像；
图8为光泽精作为指示剂的的慢性炎症的体内生物发光成像（a为的多波长数据，b为的生物发光数据，圆圈对应于注射部位）；
图9为1/NPG的自修复过程；
图10为DOX-1/NPG的在频率扫描下的流变学结果（DOX为4 mg / ml，天然产物凝胶质1为4 mg / ml，乙醇：水= 1：1）；
图11为DOX-1/NPG的体外释放结果；
图12为游离DOX与DOX-1/NPG处理4T1鼠乳腺癌细胞的结果；
图13为游离DOX与DOX-1/NPG处理MCF-7人乳腺癌细胞的结果；
图14为生理盐水组和DOX-1/NPG组小鼠肿瘤体积的变化；
图15为生理盐水组和DOX-1/NPG组小鼠体重的变化；
图16为生理盐水组和DOX-1/NPG组小鼠生存率的考察。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本发明提供了一种可注射天然产物凝胶的制备方法及应用，具体内容如下：
一、天然产物凝胶质的分离以及结构鉴定：
中药路路通Liquidambar formosana的果序被风干并研磨成粉末，之后用95%的乙醇回流提取2次，路路通与提取溶剂的比例为1：6，得到粗提物。将得到的粗提物悬浮于水中用氯仿1：1萃取3次，得氯仿提取物。再将该提取物进行硅胶柱色谱分离，用石油醚：丙酮（100：0→0：100，v / v）梯度洗脱，得到7个洗脱部位（Fr.1-Fr.7）。对Fr.1-Fr.7进行凝胶活性的测试，对具有凝胶活性的Fr.2再进行硅胶柱色谱分离（正己烷：乙酸乙酯（100：0→0：100，v /v）为流动相进行梯度洗脱）、硅胶柱色谱（正己烷：丙酮，100：0→0：100，v / v）、SephadexLH-20柱色谱（氯仿：甲醇，1：1）和反相C18柱色谱（甲醇：水，100：0→0：100，v / v）洗脱，得到天然产物凝胶质。
天然产物凝胶质的结构通过红外光谱、质谱、核磁共振氢谱和碳谱被确定。结果如下：天然产物凝胶质的高分辨质谱HRESIMS m/z 477.3354 (计算值477.3339) [M+Na]+(C30H46O3)（图1）。红外光谱在1701.41 cm-1和1687.15 cm-1分别为酮羰基和羧羰基的吸收带（图2）。氢谱数据如下（图3）：1H-NMR (CD3Cl, 400MHz) δ 4.73(1H, s, H-29a), 4.60(1H,s, H-29b), 3.00(1H, m, H-19), 1.68, 1.06, 1.00, 0.98, 0.96, 0.91(6×-CH3)。碳谱数据如下（图4）： 13C-NMR(CD3Cl, 100MHz) δ39.7(C-1), 34.2(C-2), 218.3(C-3),47.5(C-4), 55.1 (C-5), 19.8(C-6), 33.7(C-7), 40.8(C-8), 50.0(C-9), 37.1(C-10), 21.5(C-11), 25.6(C-12), 38.7 (C-13), 42.6(C-14), 30.7(C-15), 32.2(C-16),56.6(C-17), 49.4(C-18), 47.0(C-19), 150.4(C-20), 29.8(C-21), 37.2(C-22), 26.8(C-23), 21.1(C-24), 16.1(C-25), 16.0(C-26), 14.8(C-27), 182.7(C-28), 110.0(C-29), 19.5 (C-30)。最终确定天然产物凝胶质为化合物路路通酸，结构式如下：
。
二、天然产物凝胶（1/NPG）以及其载抗肿瘤药物盐酸多柔比星的天然产物凝胶（DOX-1/NPG）的制备：
1/NPG的制备：首先将2.5~30mg天然产物凝胶质路路通溶解在0.5ml乙醇中，然后加入0.1~0.5ml的蒸馏水，充分摇动所得混合物并静置即可得到天然产物凝胶（1/NPG）（图5）。
DOX-1/NPG的制备：首先将2.5~30mg天然产物凝胶质路路通溶解在0.5ml乙醇中，然后加入0.1~0.5ml溶解了药物DOX的水溶液（药物DOX的浓度为0.1~10mg/ml），充分摇动所得混合物并静置，即可得到载抗肿瘤药物盐酸多柔比星（DOX）的天然产物凝胶（DOX-1/NPG）（图6）。
三、1/NPG的安全性评价：
作为一种植入性的功能性材料，1/NPG在生物体内的安全性是首要进行考虑的。炎症是生物材料植入后的主要组织反应，并且过高强度的该反应会导致生物材料无法被用于临床治疗。因此，在包封药物以及体内实验之前，评估这个关键的生理反应是必须的。本发明利用活体成像技术选用急性炎症指示剂鲁米诺和慢性炎症指示剂光泽精对1/NPG的安全性进行了评价。具体方法见文献【J.-C. Tseng, A. L. Kung, In vivo imaging method todistinguish acute and chronic inflammation, J. Vis. Exp. 2013, 78, e50690.】。1/NPG被皮下注射到小鼠背部，并在注射后不同的时间记录小鼠生物发光的情况。由图7和图8可知：无论是急性炎症还是慢性炎症的动物实验中，均未检测到炎症产生的荧光信号，表明1/NPG具有较好的安全性，可用于进一步载药研究。
四、1/NPG 与DOX-1/NPG流变学的表征：
使用流变仪对1/NPG的自修复性能进行了研究，结果显示（图9）1/NPG的具有优异的自修复性能，能在10多破坏循环中恢复到原来的状态，这为将其应用于可注射凝胶奠定了基础。使用流变仪对DOX-1/NPG进行了表征（图10），结果显示1/NPG装载了DOX后其仍然表现了凝胶典型的特征，即在一定的频率范围内储能模量G’与频率的变化是独立的，储能模量G’为一条水平直线，并且储能模量G’的值是高于耗能模量G’’约一个数量级。这表明药物的装载不会对凝胶原先的性能造成较大的影响。同时对DOX-1/NPG可注射性的测试也表明，其具备优异的可注射性。
五、药物从DOX-1/NPG的体外释放：
为了评价DOX-1/NPG中DOX在肿瘤微环境时的释放（弱酸环境），我们测试了药物在pH4.5时缓冲液中的释放。结果显示抗肿瘤药物DOX从DOX-1/NPG中的释放持续了超过10天（图11），表明DOX-1/NPG优异的缓释能力。
六、 DOX-1/NPG的体外抗肿瘤活性：
载药凝胶对4T1鼠源乳腺癌细胞和MCF-7人源乳腺癌细胞的体外抗肿瘤活性被测定（使用MTT法）。结果显示DOX-1/NPG增强了游离药物DOX抗肿瘤活性的3倍左右（图12和图13，以IC50值相比较）。
七、DOX-1/NPG的体内治疗效果：
荷4T1肿瘤的BALB/c小鼠被用于验证瘤内注射DOX-1/NPG的治疗效果。其中一组小鼠通过瘤内注射DOX-1/NPG进行的治疗，另一组则给与瘤内注射生理盐水作为对照。肿瘤体积，小鼠体重以及生存期的考察结果显示，经DOX-1/NPG对荷瘤小鼠进行治疗后，肿瘤体积基本不再增大（图14）；小鼠的体重在在给药4天内出现了降低，但是1周时间即快速的恢复了正常（图15）；DOX-1/NPG治疗组小鼠的中位生存期与生理盐水组小鼠相比延长了103%（图16）。
Claims (4)
1.一种可注射天然产物凝胶的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：
一、将2.5~30mg天然产物凝胶质路路通酸溶解在0.5ml乙醇中；
二、向步骤一得到的混合溶液中加入0.1~0.5ml的蒸馏水，充分摇动所得混合物并静置，得到可注射天然产物凝胶。
2.一种权利要求1所述方法制备得到的可注射天然产物凝胶作为载体装载抗肿瘤药物盐酸多柔比星用于构建具有降毒增效治疗肿瘤的局部给药系统。
3.根据权利要求2所述的可注射天然产物凝胶作为载体装载抗肿瘤药物盐酸多柔比星用于构建具有降毒增效治疗肿瘤的局部给药系统，其特征在于所述具有降毒增效治疗肿瘤的局部给药系统的制备步骤如下：
一、首先将2.5~30mg天然产物凝胶质路路通酸溶解在0.5ml乙醇中；
二、向步骤一得到的混合溶液中加入0.1~0.5ml溶解了药物DOX的水溶液，充分摇动所得混合物并静置，即得到具有降毒增效治疗肿瘤的局部给药系统。
4.根据权利要求3所述的可注射天然产物凝胶作为载体装载抗肿瘤药物盐酸多柔比星用于构建具有降毒增效治疗肿瘤的局部给药系统，其特征在于所述水溶液中，药物DOX的浓度为0.1~10mg/ml。
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