CN108096184A - 一种天然产物凝胶载药体系的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种天然产物凝胶载药体系的制备方法，所述方法步骤如下：一、将一定重量的天然产物凝胶质溶解于乙醇中，构建5~20mg/ml的天然产物凝胶质乙醇溶液；二、将亲水性药物溶解于水中，配制5~20mg/ml亲水性药物水溶液；三、将天然产物凝胶质乙醇溶液和亲水性药物水溶液进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：0.2~2，静置5~60min，即成功构建载亲水性药物的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。本发明利用天然产物凝胶构建了一种具有增强抗肿瘤药物活性的凝胶药物载药体系，使用该药物体系能够起到增强抗肿瘤药物治疗效果，减少肿瘤药物给药周期的优点。

Description

一种天然产物凝胶载药体系的制备方法
技术领域
本发明涉及一种药物载体的制备方法，尤其涉及天然产物凝胶载药体系的制备方法。
背景技术
凝胶载药传递系统通常具有缓释性、控释性、载药量大、载体材料可生物降解等显著优点，因此在药物载体领域有着广阔的应用前景。近几十年来，由小分子凝胶质（小分子化合物，通常分子量低于3000）和溶剂通过自组装形成的小分子凝胶已经成为这一应用的一个潜在技术，因为它比传统使用的聚合物凝胶更具有优势，比如可控的药物释放、低的凝胶浓度（<2％）以及能够实现原位凝胶。
最近，一些天然产物（通常作为活性药物成分，即天然产物凝胶质）被发现在溶剂能通过自组装凝胶化溶剂以形成软材料，即天然产物凝胶。比如用于治疗肝炎的齐墩果酸、治疗神经衰弱的天麻素以及具有抗肿瘤活性的羽扇豆醇和路路通酸等。这些新发现的天然产物凝胶不仅具有小分子凝胶拥有的诸多优点，还由于其来源于天然产物，因而它们通常是具有生物活性的。因此，将这些具有生物活性的天然产物凝胶构建为具有增强生物活性的凝胶药物载体是有巨大吸引力的。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然产物凝胶载药体系的制备方法，该方法利用天然产物凝胶构建了一种能装载亲水性药物或者疏水性药物且具有增强抗肿瘤活性的凝胶载药体系。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种天然产物凝胶载药体系的制备方法，包括如下两种技术方案：
技术方案一：
一、将一定重量的天然产物凝胶质溶解于乙醇中，构建5~20mg/ml的天然产物凝胶质乙醇溶液；
二、将亲水性药物溶解于水中，配制5~20mg/ml的亲水性药物水溶液；
三、将天然产物凝胶质乙醇溶液和亲水性药物水溶液进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：0.2~2，静置5~60min，即成功构建载亲水性药物的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
技术方案二：
一、将一定重量的天然产物凝胶质与疏水性药物一起溶解于乙醇中，构建天然产物凝胶质与疏水性药物的乙醇溶液，控制天然产物凝胶质的含量为5~20mg/ml，疏水性药物的含量为5~20mg/ml；
二、向天然产物凝胶质与疏水性药物的乙醇溶液中加入水进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：0.2~2，静置5~60min，即成功构建载疏水性药物的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
本发明中，所述亲水性药物为亲水性抗肿瘤药物，以盐酸多柔比星（DOX）为代表。
本发明中，所述疏水性药物为疏水性抗肿瘤药物，以紫杉醇（PTX）为代表。
本发明中，所述天然产物凝胶质可以为如下五类，这5类天然产物凝胶质构建的乙醇水凝胶均能对DOX或者PTX进行装载。
1）三环二萜类天然产物凝胶质
其中，R为具有≥1个碳原子的直链或者支链烷基（包括饱和烷基和不饱和烷基），具体代表：
Abietic acid： ；
Pimaric acid：。
2）四环三萜类天然产物凝胶质
其中，R为具有≥5个碳原子的直链或者支链烷基（包括饱和烷基和不饱和烷基），具体代表：
Eburicoic acid：；
Dehydrotrametenolic acid：。
3）五环三萜类天然产物凝胶质
其中，R为具有≥0个碳原子的直链或者支链烷基（包括饱和烷基和不饱和烷基），具体代表：
Betulinic acid(白桦脂酸)：；
Oleanic acid(齐墩果酸)：。
4）甾体类天然产物凝胶质
其中，R为具有≥5个碳原子的直链或者支链烷基（包括饱和烷基和不饱和烷基），具体代表：
β-sitosterol： ；
Brassicasterol：。
5）糖苷类天然产物凝胶质
其中，R为具有≥0个碳原子的直链或者支链烷基，含氧烷基（包括饱和烷基和不饱和烷基），具体代表：
Gastrodin：。
对于不同类别的天然产物凝胶质，其凝胶溶剂种类不同。
1）三环二萜类天然产物凝胶质：此类凝胶质能够凝胶醇水混合溶剂、正烷烃类有机溶剂、醚类有机溶剂，例如：乙醇水混合溶剂、正己烷、乙醚、石油醚。
2）四环三萜类天然产物凝胶质：此类凝胶质能够凝胶醇水混合溶剂、醇类有机溶剂、腈类有机溶剂、卤代烷烃类溶剂，例如：乙醇水混合溶剂、甲醇、乙腈。
3）五环三萜类天然产物凝胶质：此类凝胶质能够凝胶醇水混合溶剂、醇类有机溶剂、二醇类有机溶剂、卤代烷烃类有机溶剂、苯类有机溶剂，例如甲醇水混合溶剂、乙醇、乙二醇、三氯甲烷、苯。
4）甾体类天然产物凝胶质：此类凝胶质能够凝胶醇水混合溶剂、醇类有机溶剂、正烷烃类有机溶剂、醚类有机溶剂，例如乙醇水混合溶剂、甲醇、正庚烷、石油醚。
5）糖苷体类天然产物凝胶质：此类凝胶质能够凝胶醇水混合溶剂、醇类有机溶剂、正烷烃类有机溶剂、醚类有机溶剂，例如乙醇水混合溶剂、甲醇、正庚烷、石油醚。
本发明中，对于不同类别的天然产物凝胶质，乙醇水凝胶的浓度是不同的，具体如下：
1）三环二萜类天然产物凝胶质：5mg/ml；
2）四环三萜类天然产物凝胶质：10mg/ml；
3）五环三萜类天然产物凝胶质：10mg/ml；
4）甾体类天然产物凝胶质：7mg/ml；
5）糖苷类：20mg/ml。
本发明中，对于不同类别的天然产物凝胶质，乙醇与水的体积比是不同的，具体如下：
1）三环二萜类天然产物凝胶质：1：0.5；
2）四环三萜类天然产物凝胶质：1：1；
3）五环三萜类天然产物凝胶质：1：1；
4）甾体类天然产物凝胶质：1：0.2；
5）糖苷类天然产物凝胶质：1：2。
本发明中，对于不同类别的天然产物凝胶质，亲水性或者疏水性药物的浓度是不同的，具体如下：
1）三环二萜类天然产物凝胶质：最大载药量为5mg/ml；
2）四环三萜类天然产物凝胶质：最大载药量为10mg/ml；
3）五环三萜类天然产物凝胶质：最大载药量为10mg/ml；
4）甾体类天然产物凝胶质：最大载药量为7mg/ml；
5）糖苷类：最大载药量为20mg/ml。
本发明中，对于不同类别的天然产物凝胶质，静置的时间是不同的，具体如下：
1）三环二萜类天然产物凝胶质：15min；
2）四环三萜类天然产物凝胶质：25min；
3）五环三萜类天然产物凝胶质：5min；
4）甾体类天然产物凝胶质：25min；
5）糖苷类天然产物凝胶质：60min。
本发明中，所述天然产物凝胶质是从中药中分离获得的，具体获得方法如下：
一、中药浸膏的提取
将100g干燥的中药研磨成粉，使用等体积95％乙醇提取2~4次，每次1~3小时，过滤收集提取液进行减压浓缩，获得的提取物悬浮于水中，用等体积的氯仿萃取2~4次，得到氯仿浸膏；
二、具有凝胶能力的中药浸膏的筛选
（1）在测试管中，将氯仿浸膏与溶剂（包括正己烷、氯仿、甲醇和甲醇-水混合物）混合，配制浓度为50~150mg/ml的氯仿浸膏混合物；
（2）加热混合物，控制加热温度为溶剂沸点时的温度，加热时间为10分钟之内；
（3）将所得溶液冷却至10~30℃，然后在此温度下放置20~30小时，之后倒置测试管，此时如果溶液不流动，则判断该氯仿浸膏即为具有凝胶能力的中药浸膏；如果溶液流动，那么该氯仿浸膏则不具有凝胶能力；
三、具有凝胶能力的中药浸膏中天然产物凝胶质的活性跟踪分离
方法一：
（1）取中药浸膏，对其进行色谱分离；
（2）使用步骤二中的方法对步骤（1）中分离的洗脱组分进行凝胶能力筛选，将筛选获得的具有凝胶能力的组分进行色谱分离；
（3）使用步骤二中的方法对步骤（2）中分离的组分进行凝胶能力筛选，对获得的具有凝胶的组分进行色谱分离，最终即可得到具有凝胶能力的天然产物化合物。
方法二：
（1）取中药浸膏，对其进行色谱分离；
（2）使用步骤二中的方法对步骤（1）中分离的洗脱组分进行凝胶能力筛选，将筛选获得的具有凝胶能力的组分进行氯仿重结晶，即可获得具有凝胶能力的天然产物化合物。
本发明中，所述中药可以为思茅松、湿地松、茯苓、落叶松蕈、女贞子、白桦树、天南星、苦蘵、天麻等。
本发明中，对于不同类别的天然产物凝胶质，步骤三对应的方法是不同，具体如下：
1）三环二萜类天然产物凝胶质：方法一；
2）四环三萜类天然产物凝胶质：方法一；
3）五环三萜类天然产物凝胶质：方法一；
4）甾体类天然产物凝胶质：方法二；
5）糖苷类：方法一。
本发明中，所述天然产物凝胶质与其对应的中药如表1所示。
表1
类别 凝胶质名称（中药名称） 凝胶质名称（中药名称）
三环三萜 Abietic acid（思茅松） Pimaric acid（湿地松）
四环三萜 Dehydrotrametenolic acid（茯苓） Eburicoic acid（落叶松蕈）
五环三萜 Oleanic acid（女贞子） Betulinic acid（白桦树）
甾体类 β-sitosterol（天南星） Brassicasterol（苦蘵）
糖苷类 Gastrodin（天麻）
本发明具有如下优点：
1、本发明利用天然产物凝胶构建了一种具有增强抗肿瘤药物活性的凝胶药物载药体系，使用该药物体系能够起到增强抗肿瘤药物治疗效果，减少肿瘤药物给药周期的优点。
2、本发明从中药中分离获得新的天然产物凝胶质，能有效筛选出中药中存在的小分子凝胶质，为后续应用这些天然产物凝胶质奠定基础。
附图说明
图1为中药茯苓浸膏在溶剂氯仿中形成的凝胶；
图2为化合物1的氯仿凝胶的流变学测试结果（频率变化下）；
图3为化合物1的氯仿凝胶的形貌观察，a-光学显微镜；b-扫描电子显微镜；c-原子力显微镜；
图4为放大2万倍时的载DOX凝胶的扫描电子显微镜照片；
图5为放大5万倍时的载DOX-Betulinic acid凝胶；
图6为载DOX凝胶的流变学频率扫描-Betulinic acid凝胶；
图7为DOX的标准曲线；
图8为DOX的体外药物释放量-Betulinic acid凝胶；
图9为载DOX凝胶用于肿瘤模型小鼠时体重变化趋势图；
图10为载DOX凝胶用于肿瘤模型小鼠时实体瘤变化曲线；
图11为载PTX的照片；
图12为放大2万倍时的载PTX凝胶的扫描电子显微镜照片；
图13为放大5万倍时的载PTX-Betulinic acid凝胶；
图14为载PTX凝胶的流变学频率扫描-Betulinic acid凝胶；
图15为PTX的标准曲线；
图16为PTX的体外药物释放量-Betulinic acid凝胶；
图17为载PTX凝胶用于肿瘤模型小鼠时体重变化趋势图；
图18为载PTX凝胶用于肿瘤模型小鼠时实体瘤变化曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1：
本实施例提供了一种载DOX的四环三萜类天然产物凝胶质乙醇水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
一、中药浸膏的提取
将100g干燥的中药茯苓研磨成粉，使用等体积95％乙醇提取3次，每次2小时，过滤收集提取液进行减压浓缩，获得的提取物悬浮于水中，用等体积的氯仿萃取三次，得到氯仿浸膏。
使用氯仿提取物进行筛选的依据为：某小分子化合物能够凝胶溶剂意味着其首先要能溶解在该溶剂中，为了更高效的筛选出天然产物凝胶质，我们选择了中等极性的氯仿提取物作为研究对象。
二、具有凝胶能力的中药浸膏的筛选
在测试管（体积1.5mL，直径10mm）中，将50mg氯仿浸膏与0.5mL氯仿或甲醇-水混合物混合，即测试浓度为100mg/ml（纯的小分子凝胶通常以小于20mg/ml的浓度凝胶化。然而，由于浸膏的化学组成是复杂的并且具有凝胶能力的化合物含量低，所以测试浓度设定为100mg/ml），加热混合物直到浸膏尽可能地溶解。将所得溶液冷却至20℃，然后在此温度下放置24小时（由于不同小分子凝胶质的凝胶形成速率差异很大，从几分钟到几天，为了尽可能筛选出具有凝胶能力的浸膏，测试时间设定为24小时）。之后倒置测试管，此时如果溶液不流动，则判断该氯仿浸膏即为具有凝胶能力的浸膏（图1）。
三、具有凝胶能力的中药浸膏中天然产物凝胶质的活性跟踪分离
（1）取10g中药浸膏（茯苓氯仿提取物），上样于D101大孔树脂柱，流动相为乙醇-水，洗脱比例分别为10%、30%、50%、70%、90%和100％的乙醇，将不同洗脱比例下的流动相进行合并共得到6个洗脱组分组分，记为Fr. 1-6。
（2）使用步骤二中的方法分别对组分Fr. 1-6进行凝胶能力筛选，将筛选获得的具有凝胶能力的组分（结果显示组分3）进行硅胶柱色谱分离，流动相为二氯甲烷-甲醇，洗脱比例为0%、20%、40%、60%、80%和100的甲醇，合并相同比例下的流动相共得到6个洗脱组分，记为Fra. 1-6。
（3）使用步骤二中的方法分别对组分Fra. 1-6进行凝胶能力筛选，对获得的具有凝胶的组分Fra. 2进行硅胶柱色谱分离氯仿-甲醇（1：1）洗脱，最终即可得到具有凝胶能力的天然产物化合物1。
（4）将化合物1进行波谱分析（包括红外、核磁共振氢谱和碳谱、质谱），最终即可确定该具有凝胶能力的天然产物化合物（即天然产物凝胶质）的具体结构。
本实施例中获得的具有凝胶能力的天然产物凝胶质化合物1的结构式如下：
1, Dehydrotrametenolic acid
四、天然产物凝胶质的表征
1、天然产物凝胶质（具体指化合物1）临界胶凝浓度的确定
在测试管（体积1.5mL，直径10mm）中，加入100mg/ml的化合物1的氯仿溶液，之后对其进行加热，将所得溶液冷却至20℃，然后在此温度下放置24小时，观察是否凝胶。如果此浓度下能凝胶则降低化合物1的浓度，重复上述操作，直至获得能凝胶的最小浓度，此浓度记为化合物1在氯仿中的临界胶凝浓度。最终测试结果显示，15mg/ml为化合物1的临界胶凝浓度。
2、流变学测试
使用配有温度控制器和平行不锈钢板（直径20mm，间隙0.5mm）的Kinexus pro +流变仪进行测试。将化合物1的氯仿热溶液置于流变仪的剪切间隙中，并使其在20℃下孵育。随后测试凝胶在频率变化下的储能模量（G’）以及耗能模量（G’’）的变化。
如图2所示，凝胶的储能模量（G’）在频率变化范围内不随着频率发生变化（即斜率约等于1），同时储能模量（G’）的值高出耗能模量（G’’）约一个数量级，这符合小分子凝胶在流变学上的判断依据，即该凝胶为真的小分子凝胶。
3、形貌观察
光学显微镜：使用光学显微镜对凝胶质形貌进行观察，取适量制备好的凝胶于载玻片上，加盖玻片后进行观察。扫描电子显微镜：使用场发射扫描电子显微镜对干凝胶形貌进行观察，取适量制备好的干凝胶粘至导电胶上即可，样品观察前需进行喷金处理。测试加速电压为20kv，二次电子（SE）模式，束斑尺寸（spot size）为3.5。原子力显微镜：使用原子力显微镜对固体凝胶质形貌进行观察，取适量制备好的干凝胶质，悬浮于水中，吸取1滴，滴加于新剥离的云母片上，待溶剂完全挥发后观察。
由图3可知，凝胶的形貌均是由三维网络结构组成的，并且组成这些网络结构的低级结构均呈现为纳米水平的纤维。这些特征符合小分子凝胶的常见形貌。
五、载DOX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶的构建
（1）将一定重量的Dehydrotrametenolic acid溶解于乙醇中，构建10mg/ml的Dehydrotrametenolic acid乙醇溶液；
（2）将亲水性抗肿瘤药物盐酸多柔比星（DOX）溶解于水中，配制10mg/ml的DOX水溶液；
（3）将Dehydrotrametenolic acid乙醇溶液和DOX水溶液进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：1，静置25min，即成功构建载DOX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
实施例2：
本实施例提供了一种载DOX的三环二萜类天然产物凝胶质乙醇水凝胶的制备方法，与实施例1不同的是：
所述具有凝胶能力的中药浸膏的筛选过程中，将氯仿浸膏与正己烷混合物混合。
所述具有凝胶能力的中药浸膏中天然产物凝胶质的活性跟踪分离步骤如下：
（1）取10g中药浸膏（中药思茅松松塔氯仿提取物），上样于硅胶柱色谱分离，流动相为石油醚：氯仿，洗脱比例为0%、20%、40%、60%、80%和100的氯仿，合并相同比例下的流动相共得到6个洗脱组分，记为Fr. 1-6。
（2）分别对组分Fr. 1-6进行凝胶能力筛选，将筛选获得的具有凝胶能力的组分（结果显示组分1）进行硅胶柱色谱分离，流动相为石油醚：乙酸乙酯，洗脱比例为0%、20%、40%、60%、80%和100的乙酸乙酯，合并相同比例下的流动相共得到6个洗脱组分，记为Fra.1-6。
（3）分别对组分Fra. 1-6进行凝胶能力筛选，对获得的具有凝胶的组分Fra. 3 进行葡聚糖凝胶柱色谱分离，流动相为氯仿-甲醇（1：1），最终即可得到具有凝胶能力的天然产物化合物2。
（4）将化合物2进行波谱分析（包括红外、核磁共振氢谱和碳谱、质谱），最终即可确定该具有凝胶能力的天然产物化合物（即天然产物凝胶质）的具体结构。
本实施例中获得的具有凝胶能力的天然产物凝胶质化合物2的结构式如下：
2，Abietic acid
所述载DOX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶的构建方法如下：
（1）将一定重量的Abietic acid溶解于乙醇中，构建5mg/ml的Abietic acid乙醇溶液；
（2）将亲水性抗肿瘤药物盐酸多柔比星（DOX）溶解于水中，配制5mg/ml的DOX水溶液；
（3）将Abietic acid乙醇溶液和DOX水溶液进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：0.5，静置15min，即成功构建载DOX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
实施例3：
本实施例提供了一种载DOX的五环三萜类天然产物凝胶质乙醇水凝胶的制备方法，与实施例1不同的是：
所述具有凝胶能力的中药浸膏的筛选过程中，将氯仿浸膏与氯仿或甲醇混合。
所述具有凝胶能力的中药浸膏中天然产物凝胶质的活性跟踪分离步骤如下：
（1）取10g中药浸膏（白桦树的氯仿提取物），上样于聚酰胺柱色谱分离，流动相为乙醇-水，洗脱比例分别为10%、30%、50%、70%、90%和100％的乙醇，合并相同比例下的流动相共得到6个洗脱组分，记为Fr. 1-6。
（2）分别对组分Fr. 1-6进行凝胶能力筛选，将筛选获得的具有凝胶能力的组分（结果显示组分5）进行硅胶柱色谱分离，流动相为正己烷：乙酸乙酯，洗脱比例为0%、20%、40%、60%、80%和100的乙酸乙酯，合并相同比例下的流动相共得到6个洗脱组分，记为Fra.1-6。
（3）分别对组分Fra. 1-6进行凝胶能力筛选，对获得的具有凝胶的组分Fra. 4进行反相硅胶柱色谱分离，流动相为甲醇/水，洗脱比例为0%、20%、40%、60%、80%和100的甲醇，对获得组分进行甲醇重结晶，即获得具有凝胶能力的天然产物化合物3。
（4）将化合物3进行波谱分析（包括红外、核磁共振氢谱和碳谱、质谱），最终即可确定该具有凝胶能力的天然产物化合物（即天然产物凝胶质）的具体结构。
本实施例中获得的具有凝胶能力的天然产物凝胶质化合物3的结构式如下：
3, Betulinic acid
所述载DOX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶的构建方法如下：
（1）将一定重量的Betulinic acid溶解于乙醇中，构建10mg/ml的Betulinic acid乙醇溶液；
（2）将亲水性抗肿瘤药物盐酸多柔比星（DOX）溶解于水中，配制10mg/ml的DOX水溶液；
（3）将Betulinic acid乙醇溶液和DOX水溶液进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：1，静置5min，即成功构建载DOX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
一、载药凝胶的表征
1、载药凝胶的形貌
扫描电子显微镜：使用场发射扫描电子显微镜对干凝胶形貌进行观察，取适量制备好的干凝胶粘至到导电胶上即可，样品观察前需进行喷金处理。测试加速电压为20kv，二次电子（SE）模式，束斑尺寸（spot size）为3.5。
由图4和5可知，载药凝胶是由直径纳米尺度、长度微米尺度的纤维构成的。
2、流变学表征
使用配有温度控制器和平行不锈钢板（直径20mm，间隙0.5mm）的Kinexus pro +流变仪进行测试。将化合物1的氯仿热溶液置于流变仪的剪切间隙中，并使其在20℃下孵育。 随后测试凝胶在频率变化下的储能模量（G’）以及耗能模量（G’’）的变化。
由图6可知，凝胶的储能模量（G’）在频率变化范围内不随着频率发生变化（即斜率约等于1），同时储能模量（G’）的值高出耗能模量（G’’）约一个数量级，这表明凝胶在载药后仍然仍然保持了其原本的凝胶特性。
二、载药凝胶的体外释放曲线
1、DOX标准曲线的测定
取一定量DOX母液以等倍递减稀释，依次配制浓度为110.000、55.000、27.500、13.750、6.875、3.438、1.719、0.859、0.430、0.215μg/ml标准溶液，测试不同浓度下标准液在480nm波长下的吸光值，以吸光值为横坐标，浓度为纵坐标绘制标准曲线。由图6可知，DOX的在0.215～13.750μg/ml范围内的标准曲线为y = 38.307x + 0.111，相关系数R2为为0.9997。
2、载药凝胶中DOX的体外释放曲线测定
体外释放实验于溶出度测试仪中进行测试，释放介质为250ml，采用转篮法，温度为37摄氏度，转速为100r/mim，在一定时间间隔时，取出3ml的水介质溶液，同时补充相同体积的水介质，紫外分光光度法对DOX释放量进行测定。每个实验结果均为三次平行实验获得。
累积释放量E表达式：
其中，E为药物的累积释放量（率），V0为水介质的总体积，ml；Cn为第n次取样时所测紫杉醇药物浓度，mg/ml；Ve为每次的取样体积，ml；m0为药物总的含量，mg。
释药百分比：
其中，E为累积释放量mg；mT为DOX的质量，mg。
体外释放结果如图7所示：载药凝胶在24小时内的释放不到10%，具有显著的缓释效果。
三、载药凝胶的体内抗肿瘤活性
1、Balb/c小鼠移植型乳腺癌动物模型的建立
采用鼠源4T1乳腺癌细胞株来构建移植型乳腺癌动物模型，取对数生长期的4T1细胞，将细胞用胰酶消化后，用新鲜培养液将其从细胞培养瓶瓶壁上吹打下来，再制成单细胞悬液，并调整细胞浓度，取细胞悬液接种至小鼠右前肢腋部皮下。接种后每日观察小鼠生存状态及肿瘤生长情况，于肿瘤种植后一周左右选择肿瘤生长良好、瘤体积约150 mm3左右的小鼠，作为本实验动物模型。
2、肿瘤抑制实验
选取建模成功的小鼠15只，随机分为3组，分别为生理盐水组、游离药物组、凝胶载药组。给药方式为将100µl 的生理盐水，游离DOX以及载DOX凝胶分别注射于肿瘤周围。之后每天（共观察14天）每组小鼠的体重以及肿瘤大小进行测量。
如图8所示，对不同组别的小鼠称重发现，在三组实验组中，小鼠的体重均未发生明显的变化，这表明载DOX凝胶的对小鼠的整体健康的影响是不大的，即载DOX凝胶是比较安全的。
图9所示的治疗结果显示，载DOX凝胶组能显著的抑制肿瘤的生长。在给药后14天生理盐水组，游离DOX组以及载DOX凝胶组中肿瘤的平均体积分别分681、491和191mm3，载药凝胶组中肿瘤的体积是最小的，这证明了该种载DOX凝胶具有增强肿瘤药物生物活性的功能。
实施例4：
本实施例提供了一种载DOX的甾体类天然产物凝胶质乙醇水凝胶的制备方法，与实施例1不同的是：
所述具有凝胶能力的中药浸膏的筛选过程中，将氯仿浸膏与正己烷混合。
所述具有凝胶能力的中药浸膏中天然产物凝胶质的活性跟踪分离步骤如下：
（1）取10g中药浸膏（天南星的块茎氯仿提取物），上样于硅胶柱色谱分离，流动相为石油醚：乙酸乙酯，洗脱比例为0%、20%、40%、60%、80%和100的乙酸乙酯，合并相同比例下的流动相共得到6个洗脱组分，记为Fr. 1-6。
（2）分别对组分Fr. 1-6进行凝胶能力筛选，将筛选获得的具有凝胶能力的组分（结果显示组分3）进行氯仿重结晶，即可获得具有凝胶能力的天然产物化合物4。
（3）将化合物4进行波谱分析（包括红外、核磁共振氢谱和碳谱、质谱），最终即可确定该具有凝胶能力的天然产物化合物（即天然产物凝胶质）的具体结构。
本实施例中获得的具有凝胶能力的天然产物凝胶质化合物4的结构式如下：
4, Beta sitosterol
所述载DOX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶的构建方法如下：
（1）将一定重量的Beta sitosterol溶解于乙醇中，构建7mg/ml的Beta sitosterol乙醇溶液；
（2）将亲水性抗肿瘤药物盐酸多柔比星（DOX）溶解于水中，配制7mg/ml的DOX水溶液；
（3）将Beta sitosterol乙醇溶液和DOX水溶液进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：0.2，静置25min，即成功构建载DOX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
实施例5：
本实施例提供了一种载DOX的糖苷类天然产物凝胶质乙醇水凝胶的制备方法，与实施例1不同的是：
所述具有凝胶能力的中药浸膏的筛选过程中，将氯仿浸膏与甲醇-水混合物混合。
所述具有凝胶能力的中药浸膏中天然产物凝胶质的活性跟踪分离步骤如下：
（1）取10g中药浸膏（天麻的氯仿提取物），上样于D101大孔树脂柱，流动相为乙醇-水，洗脱比例分别为10%、30%、50%、70%、90%和100％的乙醇，将不同洗脱比例下的流动相进行合并共得到6个洗脱组分组分，记为Fr. 1-6。
（2）分别对组分Fr. 1-6进行凝胶能力筛选，将筛选获得的具有凝胶能力的组分（结果显示组分1）进行反相硅胶柱色谱分离，流动相为流动相为甲醇/水，洗脱比例为0%、20%、40%、60%、80%和100的甲醇，合并相同比例下的流动相共得到6个洗脱组分，记为Fra.1-6。
（3）分别对组分Fra. 1-6进行凝胶能力筛选，对获得的具有凝胶的组分Fra. 4进行硅胶柱色谱分离，流动相为乙酸乙酯/乙醇，洗脱比例为0%、20%、40%、60%、80%和100的乙醇，最终即可得到具有凝胶能力的天然产物化合物5。
（4）将化合物5进行波谱分析（包括红外、核磁共振氢谱和碳谱、质谱），最终即可确定该具有凝胶能力的天然产物化合物（即天然产物凝胶质）的具体结构。
本实施例中获得的具有凝胶能力的天然产物凝胶质化合物3的结构式如下：
5，Gastrodin
所述载DOX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶的构建方法如下：
（1）将一定重量的Gastrodin溶解于乙醇中，构建20mg/ml的Gastrodin乙醇溶液；
（2）将亲水性抗肿瘤药物盐酸多柔比星（DOX）溶解于水中，配制20mg/ml的DOX水溶液；
（3）将Gastrodin乙醇溶液和DOX水溶液进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：2，静置60min，即成功构建载DOX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
实施例6：
本实施例提供了一种载PTX的四环三萜类天然产物凝胶质乙醇水凝胶的制备方法，与实施例1不同的是：
所述载PTX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶的构建方法如下：
一、将一定重量的Dehydrotrametenolic acid与PTX一起溶解于乙醇中，构建Dehydrotrametenolic acid与PTX的乙醇溶液，控制Dehydrotrametenolic acid的含量为10mg/ml，疏水性药物的含量为10mg/ml；
二、向Dehydrotrametenolic acid与PTX的乙醇溶液中加入水进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：1，静置25min，即成功构建载PTX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
实施例7：
本实施例提供了一种载PTX的三环二萜类天然产物凝胶质乙醇水凝胶的制备方法，与实施例2不同的是：
所述载PTX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶的构建方法如下：
一、将一定重量的Abietic acid与PTX一起溶解于乙醇中，构建Abietic acid与PTX的乙醇溶液，控制Abietic acid的含量为5mg/ml，疏水性药物的含量为5mg/ml；
二、向Abietic acid与PTX的乙醇溶液中加入水进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：0.5，静置15min，即成功构建载PTX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
实施例8：
本实施例提供了一种载PTX的五环三萜类天然产物凝胶质乙醇水凝胶的制备方法，与实施例3不同的是：
所述载PTX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶的构建方法如下：
一、将一定重量的Betulinic acid与PTX一起溶解于乙醇中，构建Betulinic acid与PTX的乙醇溶液，控制Betulinic acid的含量为10mg/ml，疏水性药物的含量为10mg/ml；
二、向Betulinic acid与PTX的乙醇溶液中加入水进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：1，静置5min，即成功构建载PTX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。图11中，左图为未载药凝胶的扫描电子显微镜照片，右图为载PTX-Betulinic acid凝胶。
一、载药凝胶的表征
1、载药凝胶的形貌
由图12和13可知，载药凝胶是由直径纳米尺度、长度微米尺度的纤维构成的。
2、流变学表征
由图14可知，凝胶的储能模量（G’）在频率变化范围内不随着频率发生变化（即斜率约等于1），同时储能模量（G’）的值高出耗能模量（G’’）约一个数量级，这表明凝胶在载药后仍然仍然保持了其原本的凝胶特性。
二、载药凝胶的体外释放曲线
1、PTX标准曲线的测定
取一定量的PTX母液，以流动相为稀释溶液配置溶度为66.0-781.3ng/ml的标准溶液，分别对不同浓度标准溶液进行HPLC分析测定，计算不同浓度标准溶液的积峰面积，以积分面积为横坐标X，紫杉醇浓度为纵坐标Y，绘制标准曲线，对其进行线性回归，获得线性回归方程。
由图15可知，通过线性回归获得的标准曲线方程为y = 0.0364x + 0.0411（R² =0.999），线性拟合良好，线性范围为66.0～781.3ng/ml。
2、载药凝胶中PTX的体外释放曲线测定
体外释放结果如图16所示：载PTX凝胶在24小时内的释放不到5%，具有显著的缓释效果。
三、载药凝胶的体内抗肿瘤活性
如图17所示，对不同组别的小鼠称重发现，在三组实验组中，小鼠的体重均未发生明显的变化，这表明载PTX凝胶的对小鼠的整体健康的影响是不大的，即载PTX凝胶是比较安全的。
图18所示的治疗结果显示，载PTX凝胶组能显著的抑制肿瘤的生长。在给药后14天生理盐水组，游离PTX组以及载PTX凝胶组中肿瘤的平均体积分别分681、491和191mm3，载药凝胶组中肿瘤的体积是最小的，这证明了该种载PTX凝胶具有增强肿瘤药物生物活性的功能。
实施例9：
本实施例提供了一种载PTX的甾体类天然产物凝胶质乙醇水凝胶的制备方法，与实施例4不同的是：
所述载PTX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶的构建方法如下：
一、将一定重量的Beta sitosterol与PTX一起溶解于乙醇中，构建Beta sitosterol与PTX的乙醇溶液，控制Beta sitosterol的含量为7mg/ml，疏水性药物的含量为7mg/ml；
二、向Beta sitosterol与PTX的乙醇溶液中加入水进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：0.2，静置25min，即成功构建载PTX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
实施例10：
本实施例提供了一种载PTX的糖苷类天然产物凝胶质乙醇水凝胶的制备方法，与实施例5不同的是：
所述载PTX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶的构建方法如下：
一、将一定重量的Gastrodin与PTX一起溶解于乙醇中，构建Gastrodin与PTX的乙醇溶液，控制Gastrodin的含量为20mg/ml，疏水性药物的含量为20mg/ml；
二、向Gastrodin与PTX的乙醇溶液中加入水进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：2，静置60min，即成功构建载PTX的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。

Claims (10)

1.一种天然产物凝胶载药体系的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：
一、将一定重量的天然产物凝胶质溶解于乙醇中，构建5~20mg/ml的天然产物凝胶质乙醇溶液；
二、将亲水性药物溶解于水中，配制5~20mg/ml亲水性药物水溶液；
三、将天然产物凝胶质乙醇溶液和亲水性药物水溶液进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：0.2~2，静置5~60min，即成功构建载亲水性药物的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
2.根据权利要求1所述的天然产物凝胶载药体系的制备方法，其特征在于所述天然产物凝胶质为三环二萜类天然产物凝胶质、四环三萜类天然产物凝胶质、五环三萜类天然产物凝胶质、甾体类天然产物凝胶质或糖苷体类天然产物凝胶质。
3.根据权利要求2所述的天然产物凝胶载药体系的制备方法，其特征在于所述天然产物凝胶质为三环二萜类天然产物凝胶质、四环三萜类天然产物凝胶质、五环三萜类天然产物凝胶质或糖苷体类天然产物凝胶质时，其制备方法如下：
一、中药浸膏的提取
将100g干燥的中药研磨成粉，使用等体积95％乙醇提取2~4次，每次1~3小时，过滤收集提取液进行减压浓缩，获得的提取物悬浮于水中，用等体积的氯仿萃取2~4次，得到氯仿浸膏，所述中药为思茅松、湿地松、茯苓、落叶松蕈、女贞子、白桦树或天麻；
二、具有凝胶能力的中药浸膏的筛选
（1）在测试管中，将氯仿浸膏与溶剂混合，配制浓度为50~150mg/ml的氯仿浸膏混合物；
（2）加热混合物，控制加热温度为溶剂沸点时的温度，加热时间为10分钟之内；
（3）将所得溶液冷却至10~30℃，然后在此温度下放置20~30小时，之后倒置测试管，此时如果溶液不流动，则判断该氯仿浸膏即为具有凝胶能力的中药浸膏；
三、具有凝胶能力的中药浸膏中天然产物凝胶质的活性跟踪分离
（1）取中药浸膏，对其进行色谱分离；
（2）使用步骤二中的方法对步骤（1）中分离的洗脱组分进行凝胶能力筛选，将筛选获得的具有凝胶能力的组分进行色谱分离；
（3）使用步骤二中的方法对步骤（2）中分离的组分进行凝胶能力筛选，对获得的具有凝胶的组分进行色谱分离，最终即可得到具有凝胶能力的天然产物化合物。
4.根据权利要求2所述的天然产物凝胶载药体系的制备方法，其特征在于所述天然产物凝胶质为甾体类天然产物凝胶质时，其制备方法如下：
一、中药浸膏的提取
将100g干燥的中药研磨成粉，使用等体积95％乙醇提取2~4次，每次1~3小时，过滤收集提取液进行减压浓缩，获得的提取物悬浮于水中，用等体积的氯仿萃取2~4次，得到氯仿浸膏，所述中药为天南星或苦蘵；
二、具有凝胶能力的中药浸膏的筛选
（1）在测试管中，将氯仿浸膏与溶剂混合，配制浓度为50~150mg/ml的氯仿浸膏混合物；
（2）加热混合物，控制加热温度为溶剂沸点时的温度，加热时间为10分钟之内；
（3）将所得溶液冷却至10~30℃，然后在此温度下放置20~30小时，之后倒置测试管，此时如果溶液不流动，则判断该氯仿浸膏即为具有凝胶能力的中药浸膏；
三、具有凝胶能力的中药浸膏中天然产物凝胶质的活性跟踪分离
（1）取中药浸膏，对其进行色谱分离；
（2）使用步骤二中的方法对步骤（1）中分离的洗脱组分进行凝胶能力筛选，将筛选获得的具有凝胶能力的组分进行氯仿重结晶，即可获得具有凝胶能力的天然产物化合物。
5.根据权利要求1所述的天然产物凝胶载药体系的制备方法，其特征在于所述亲水性药物为亲水性抗肿瘤药物盐酸多柔比星。
6.一种天然产物凝胶载药体系的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：
一、将一定重量的天然产物凝胶质与疏水性药物一起溶解于乙醇中，构建天然产物凝胶质与疏水性药物的乙醇溶液，控制天然产物凝胶质的含量为5~20mg/ml，疏水性药物的含量为5~20mg/ml；
二、向天然产物凝胶质与疏水性药物的乙醇溶液中加入水进行混合并振摇，控制乙醇与水的体积比为1：0.2~2，静置5~60min，即成功构建载疏水性药物的天然产物凝胶质乙醇水凝胶。
7.根据权利要求6所述的天然产物凝胶载药体系的制备方法，其特征在于所述天然产物凝胶质为三环二萜类天然产物凝胶质、四环三萜类天然产物凝胶质、五环三萜类天然产物凝胶质、甾体类天然产物凝胶质或糖苷体类天然产物凝胶质。
8.根据权利要求6所述的天然产物凝胶载药体系的制备方法，其特征在于所述天然产物凝胶质为三环二萜类天然产物凝胶质、四环三萜类天然产物凝胶质、五环三萜类天然产物凝胶质或糖苷体类天然产物凝胶质时，其制备方法如下：
一、中药浸膏的提取
将100g干燥的中药研磨成粉，使用等体积95％乙醇提取2~4次，每次1~3小时，过滤收集提取液进行减压浓缩，获得的提取物悬浮于水中，用等体积的氯仿萃取2~4次，得到氯仿浸膏，所述中药为思茅松、湿地松、茯苓、落叶松蕈、女贞子、白桦树或天麻；
二、具有凝胶能力的中药浸膏的筛选
（1）在测试管中，将氯仿浸膏与溶剂混合，配制浓度为50~150mg/ml的氯仿浸膏混合物；
（2）加热混合物，控制加热温度为溶剂沸点时的温度，加热时间为10分钟之内；
（3）将所得溶液冷却至10~30℃，然后在此温度下放置20~30小时，之后倒置测试管，此时如果溶液不流动，则判断该氯仿浸膏即为具有凝胶能力的中药浸膏；
三、具有凝胶能力的中药浸膏中天然产物凝胶质的活性跟踪分离
（1）取中药浸膏，对其进行色谱分离；
（2）使用步骤二中的方法对步骤（1）中分离的洗脱组分进行凝胶能力筛选，将筛选获得的具有凝胶能力的组分进行色谱分离；
（3）使用步骤二中的方法对步骤（2）中分离的组分进行凝胶能力筛选，对获得的具有凝胶的组分进行色谱分离，最终即可得到具有凝胶能力的天然产物化合物。
9.根据权利要求6所述的天然产物凝胶载药体系的制备方法，其特征在于所述天然产物凝胶质为甾体类天然产物凝胶质时，其制备方法如下：
一、中药浸膏的提取
将100g干燥的中药研磨成粉，使用等体积95％乙醇提取2~4次，每次1~3小时，过滤收集提取液进行减压浓缩，获得的提取物悬浮于水中，用等体积的氯仿萃取2~4次，得到氯仿浸膏，所述中药为天南星或苦蘵；
二、具有凝胶能力的中药浸膏的筛选
（1）在测试管中，将氯仿浸膏与溶剂混合，配制浓度为50~150mg/ml的氯仿浸膏混合物；
（2）加热混合物，控制加热温度为溶剂沸点时的温度，加热时间为10分钟之内；
（3）将所得溶液冷却至10~30℃，然后在此温度下放置20~30小时，之后倒置测试管，此时如果溶液不流动，则判断该氯仿浸膏即为具有凝胶能力的中药浸膏；
三、具有凝胶能力的中药浸膏中天然产物凝胶质的活性跟踪分离
（1）取中药浸膏，对其进行色谱分离；
（2）使用步骤二中的方法对步骤（1）中分离的洗脱组分进行凝胶能力筛选，将筛选获得的具有凝胶能力的组分进行氯仿重结晶，即可获得具有凝胶能力的天然产物化合物。
10.根据权利要求6所述的天然产物凝胶载药体系的制备方法，其特征在于所述疏水性药物为疏水性抗肿瘤药物紫杉醇PTX。
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