CN105524134A - 一种新的羊毛甾烷型三萜化合物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

一种新的羊毛甾烷型三萜化合物及其制备方法和医药用途 Download PDF

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CN105524134A CN201610017523.6A CN201610017523A CN105524134A CN 105524134 A CN105524134 A CN 105524134A CN 201610017523 A CN201610017523 A CN 201610017523A CN 105524134 A CN105524134 A CN 105524134A
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Abstract

本发明公开了一种新的羊毛甾烷型三萜化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的羊毛甾烷型三萜化合物，可以从诃子的干燥成熟果实中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物能够抑制肾癌细胞株RC-2增殖，这种抑制呈浓度及时间依赖性。化合物(Ⅰ)在治疗肾癌方面具有潜在的应用价值，可以用来开发成治疗肾癌的药物。

Description

一种新的羊毛甾烷型三萜化合物及其制备方法和医药用途
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及从诃子的干燥成熟果实中分离得到的一种具有治疗肾癌作用的羊毛甾烷型三萜化合物及其制备方法。
背景技术
诃子为使君子科植物诃子(TerminaliachebulaRetz.)或绒毛诃子(TerminaliachebulaRetz.var.tomentellakurt)的干燥成熟果实。秋、冬二季果实成熟时采收，除去杂质，晒干。用时打碎。原产于印度、缅甸等地，我国云南、西藏、广东、广西等地也有分布。其味苦、酸、涩，性平，归肺、大肠经，具有涩肠止泻、敛肺止咳、降火利咽之功效。诃子在我国民间用药极其广泛，在藏药中甚至被视为“药中之王”，用于多种疾病的治疗。
诃子所含的化学成分丰富多样，主要包括鞣质类、酚酸类、三萜类、黄酮类、挥发油等成分。其中有部分研究提示诃子中的酚酸类、三萜类以及黄酮类化合物是诃子发挥药理活性的主要有效组分。
现代药理学研究表明，其提取物具有抗氧化、抗糖尿病、抗菌、抗病毒、抗炎、镇痛等多种药理活性。此外，诃子还具有抗胆碱酯酶活性、抗胃溃疡、抑制细胞色素P450酶等生物活性。诃子在我国资源丰富，在治疗、预防疾病以及食品开发等诸方面都具有广阔的应用前景和开发价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种从诃子的干燥成熟果实中分离得到的一种具有治疗肾癌作用的羊毛甾烷型三萜化合物及其制备方法。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)诃子的干燥成熟果实粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱12个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
进一步地，步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。
进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
一种药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。
所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗肾癌的药物中的应用。
所述的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
附图说明
图1为化合物(Ⅰ)结构式；
图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证
试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
诃子经鉴定为使君子科植物诃子(TerminaliachebulaRetz.)的干燥成熟果实。
制备方法：(a)将诃子的干燥成熟果实(8kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(363g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱12个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(145g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体积)、50:1(8个柱体积)、30:1(6个柱体积)、15:1(8个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(47g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、15:1(10个柱体积)和5:1(6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(26g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(39mg)。
结构确证：无色粉末；HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z475.3224，结合核磁特征可得分子式为C30H44O3，不饱和度为9。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，500MHz)：H-1(2.06，d)，H-1(2.29，d)，H-3(2.17，m)，H-3(2.41，m)，H-5(1.55，dd，J＝14.0，3.5)，H-6(1.84，m)，H-6(2.06，m)，H-7(1.85，m)，H-7(1.97，m)，H-11(1.28，m)，H-11(1.54，m)，H-12(1.46，m)，H-12(2.01，m)，H-15(1.27，m)，H-15(1.66，m)，H-16(1.74，m)，H-16(1.89，m)，H-17(1.45，m)，H-18(0.72，s)，H-19(1.08，s)，H-20(1.67，m)，H-21(0.98，d，J＝6.4)，H-22(1.29，m)，H-22(1.43，m)，H-23(4.91，ddd，J＝11.0，2.5，1.5)，H-24(6.92，d，J＝1.5)，H-27(1.85，s)，H-28(1.01，s)，H-29(0.85，s)，H-30(1.02，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，125MHz)：52.2(CH2，1-C)，209.7(C，2-C)，56.1(CH2，3-C)，38.9(C，4-C)，50.7(CH，5-C)，19.1(CH2，6-C)，25.8(CH2，7-C)，134.6(C，8-C)，132.8(C，9-C)，36.3(C，10-C)，20.5(CH2，11-C)，30.3(CH2，12-C)，44.2(C，13-C)，49.5(C，14-C)，30.5(CH2，15-C)，28.5(CH2，16-C)，50.4(CH，17-C)，15.7(CH3，18-C)，18.4(CH3，19-C)，33.2(CH，20-C)，18.3(CH3，21-C)，40.3(CH2，22-C)，78.5(CH，23-C)，149.3(CH，24-C)，129.2(C，25-C)，174.1(C，26-C)，10.3(CH3，27-C)，25.7(CH3，28-C)，20.8(CH3，29-C)，23.7(CH3，30-C)；碳原子标记参见图1。红外光谱表明该化合物含有α,β-不饱和-γ-内酯(1741cm-1)，羰基(1698cm-1)以及烯烃(1646cm-1)。1H和13CNMR谱显示出一个4-取代的-2-甲基-2-丁烯酸内酯环[δH1.85(s)，4.91(ddd，J＝11.0，2.5，1.5Hz)，6.92(d，J＝1.5Hz)；δC10.3(C-27)，78.5(C-23)，129.2(C-25)，149.3(C-24)和174.1(C-26)]，一个四取代双键[δC132.8(C-9)，134.6(C-8)]，一个羰基[δC209.7(C-2)]，五个单峰甲基[δH0.72，0.85，1.01，1.02，1.08，3H，s]，一个双峰甲基[δH0.98(d，J＝6.4Hz)]，以及九个亚甲基。上述侧链结构表明该化合物为羊毛甾烷型三萜化合物，HMBC谱中Me-27与C-24，C-25和C-26，Me-21与C-17，C-20和C-22，以及H-24与C-22，C-23和Me-27的相关性验证了上述推论。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验
一、材料和仪器
人肾癌RC-2细胞株购于ATCC细胞库(美国)。分析纯蔗糖购于国药集团化学试剂公司。重水(D2O)购于青岛腾龙微波科技有限公司。Tris、SDS、30％丙烯酰胺单体、Tween20购于重庆医科大学基础研究所实验室。小牛血清、RPMI-1640购于美国Gibco公司。Centriplus离心超滤管、AmiconUltra高回收率高流速切向流超滤离心管(100kD)、PVDF膜购于Millipore公司。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海安亭科学仪器厂。5×SDS-PAGE蛋白质上样缓冲液、BeyoECL荧光检测试剂、考马斯亮蓝G250、考马斯亮蓝R250购于碧云天生物技术研究所。化合物(Ⅰ)自制，HPLC归一化纯度大于98％。鼠抗人HSP70单克隆抗体、兔抗人ICAM-1单克隆抗体、兔抗人G250多克隆抗体购于Sigma公司。兔抗人Survivin多克隆抗体武汉博士德生物有限公司。
超净工作台(苏州华新空调净化有限公司)，自动平衡离心机(上海医用分析仪器厂)，光学显微镜(NIKON，日本)，透射电子显微镜(LeicaTCS-NT，德国)，低温高速离心机(日立公司，日本)，低温超高速离心机H-80B(日立公司，日本)。垂直电泳槽、电转槽(北京六一厂，中国)。台式高速离心机、酶标仪(上海安亭科学仪器厂，中国)。96孔培养板(Corning公司，美国)。凝胶仪、PCR扩增仪(BIO-RAD，美国)。
二、试验方法
1、MTT检测化合物(Ⅰ)不同浓度48h对肾癌细胞株RC-2增殖的影响
用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液(含有0.1％青霉素、链霉素)常规培养人肾癌细胞株RC-2，根据细胞生长密度1～2天换液一次，3天传代一次。取对数期生长细胞，按照如下步骤操作：(1)接种细胞：胰酶消化对数生长期的肾癌RC-2细胞，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液1mL制成单细胞悬液，混匀后用移液管按照体积100μL/孔，即接种肾癌细胞数目5×103个/孔，加入96孔培养板中。每组细胞设置3个复孔；(2)培养细胞：将培养板小心置入孵箱中(37℃、5％CO2)培养3天；(3)处理细胞：分别按空白组(加5μLDMSO液)、0.25、0.5、0.75、1μmol/L化合物(Ⅰ)处理组分组后加药处理48h；(4)显色：在各个时间点，予以每孔各加入MTT溶液20μL，之后继续放入孵箱中孵育4h，然后小心把孔内培养液用注射器吸去；对于当天接种的细胞而言，离心之后(1000rpm，5min)，然后将孔内培养液移除。之后把150μLDMSO加入每孔，使其充分振荡10min后，把结晶物溶解完全；(5)比色：在全自动酶标仪上检测各孔在580nm波长下的光密度值[(D580)]，按公式测定细胞活力：D(580)实验孔/D(580)对照孔×100％。
2、MTT检测0.5μM化合物(Ⅰ)不同时间对肾癌细胞株RC-2增殖的影响
接种和处理细胞及显色和比色步骤同上(1)、(2)、(4)、(5)，处理细胞：分别按空白组(加5μLDMSO液)、0.5μM化合物(Ⅰ)处理24h、48h、72h分组。
3、制备exosomes
(1)细胞分组：取6份细胞计数相近的人肾癌RC-2细胞株体外常规培养，其中三份为对照组(CE)，另外三份为实验组(CE2)，等细胞呈对数生长时，两组细胞株按照3×106/100mL重新传代至新的培养瓶，严格控制每组细胞培养基的体积一致；在实验组，等细胞培养48h后加入0.5μM的化合物(Ⅰ)处理细胞48h，之后收集培养上清液各150mL；对照组不加药物，加入与实验组等量的DMSO，48h后收集培养上清液各150mL，置于-20℃冰箱保存；(2)提取exosomes：培养上清液150mL，300g低温离心(4℃)10min去除细胞；800g低温离心30min获取上清l0000g低温离心30min获取上清通过100kDMWCOCentriplus离心超滤管浓缩超滤(MWCO：分子量截留)，以1000g离心30min，得到约20mL超滤液。将超滤液分别移至2mL含30g/L的蔗糖重水垫的10mL的离心管中，100000g低温超速离心lh。收集离心管底部的缓冲垫用PBS稀释，置于100kDMWCO高回收率高流速切向流超滤离心管中1000g离心30min，得到3mLexosome。0.22μm滤膜过滤除菌，-80℃保存备用设置对照组细胞(CE1)来源的exosomes为EX1组exosomes，实验组细胞(CE2)来源的exosomes为EX2组exosomes。
4、BCA法检测exosomes蛋白含量
(1)测定方法：取96孔酶标板，按下表加入试剂并绘制标准曲线：
管号 1 2 3 4 5 6 7 8
标准蛋白溶液(μL) 0 1 2 4 8 16 18 20
蒸馏水(μL) 20 19 18 16 12 4 2 0
BCA试剂(μL) 200 200 200 200 200 200 200 200
蛋白质浓度(mg/mL) 0 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3 0.45 0.5
上述试剂加完后，准确吸取10μL样品溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200μL，轻摇，于37℃保温30min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上562nm处比色，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质浓度；(2)计算方法：exosome浓缩液总蛋白质含量(mg)＝浓缩后的总体积×BCA法测定蛋白质浓度。重复6次实验，取平均值做统计分析。
5、统计学方法
使用软件GRAGHPADPRISM5.0进行图表制作及统计学分析，计量资料以x±s表示，比较组间差异使用方差分析或t检验。
三、结果及结论
1、MTT显示不同浓度化合物(Ⅰ)作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化
MTT结果显示当化合物(Ⅰ)浓度0.75μM作用细胞时，细胞活力(71.32±4.68％)与化合物(Ⅰ)浓度0.5μM及0.25μM作用细胞时细胞组(91.43±2.74％；94.67±1.21％)相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。
2、MTT显示0.5μM化合物(Ⅰ)不同时间作用肾癌细胞株RC-2后细胞活力变化
MTT结果显示当0.5μM化合物(Ⅰ)作用细胞72h组(71.34±1.64％)与作用48h组(91.04±6.23％)、24h组(94.56±1.13％)对比，细胞活力差异具有统计学意义(P<0.05)。
3、Exosomes计数和蛋白定量
电镜下实验组(EX2)和对照组(EX1)exosomes计数和exosomes蛋白定量结果：经化合物(Ⅰ)处理后，RC-2细胞产生的exosomes数量和exosome蛋白含量较未经药物处理组都明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。
结果说明，化合物(Ⅰ)能够抑制肾癌细胞株RC-2增殖，这种抑制呈浓度及时间依赖性。经化合物(Ⅰ)处理后，透射电镜观察肾癌细胞株RC-12源性exosomes形态未见明显改变，其分泌量和蛋白含量较处理前明显增加(P＜0.05)，这些说明化合物(Ⅰ)对肾癌细胞株RC-12的抑制作用与化合物(Ⅰ)引起的肾癌细胞RC-2表达野生型p53mRNA上调有关。
表1实验组和对照组分泌exosomes数量及蛋白含量对比
n EX2组(实验组) EX1组(对照组) P值
Exo数目 3 4.67×109±1.8×102 3.76×108±5.8×102 <0.05
Exo蛋白含量 3 1.67±0.18mg 0.57±0.11mg <0.05
实施例3
片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4
口服液制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例5
胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例6
注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例7
无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims (7)

1.具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将诃子的干燥成熟果实粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱12个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、50:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
3.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。
4.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。
5.一种药物组合物，其特征在于：该药物组合物含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。
6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗肾癌的药物中的应用。
7.权利要求5所述的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的应用。
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